ES2305094T3 - Termoplasticos basados en soja utilizados como biomateriales. - Google Patents

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Abstract

Uso como biomaterial de un producto termoendurecido compacto o poroso constituido de tofú desgrasado de soja.

Description

Termoplásticos basados en soja utilizados como biomateriales.
La presente invención se refiere a biomateriales basados en soja termoendurecibles. Estos se producen por un procedimiento que comprende el termoendurecimiento del tofú desgrasado de soja. Los biomateriales son útiles en diversas aplicaciones biomédicas, incluyendo, materiales de relleno óseo, vendajes para heridas y barreras temporales para prevenir la adherencia posquirúrgica de tejido.
Antecedentes
La producción de nuevos materiales biodegradables, de fuentes tanto sintéticas como naturales, es una meta importante en las aplicaciones biomédicas en las que el implante ha de desempeñar una función temporal en el cuerpo. El crecimiento de tejido y el suministro de fármacos se asocian normalmente al uso de biomateriales completamente biodegradables a menos que se requiera una acción de estructura prolongada. Sin embargo, el biomaterial no se ha conseguido aun a causa de dos inconvenientes principales: (a) la difícil modulación del tiempo de degradación; (b) los posibles efectos tóxicos de los productos de degradación.
La degradación de los materiales se basa generalmente en tres eventos principales: (1) la hidrólisis espontánea de los enlaces químicos que soportan la estructura polimérica; (2) la acción mecánica ejercida por el crecimiento de los tejidos circundantes; (3) la respuesta inflamatoria producida por el material extraño.
La modulación de la degradación es a menudo muy difícil de obtener ya que puede verse afectada por la variabilidad individual de pacientes. Por ejemplo, el crecimiento tisular de un individuo joven es más rápido que la regeneración tisular de una persona de edad avanzada y los pacientes con enfermedades particulares pueden producir respuestas inflamatorias modificadas. Los problemas de toxicidad a menudo relacionados con productos de degradación de materiales sintéticos se han evitado utilizando polímeros^{2} naturales. Sin embargo, estos materiales conllevan otros tipos de desventajas como los costes de purificación y los riesgos de enfermedades transmisibles o alergias relacionadas con su uso.
El polímero biodegradable ideal debería ser un polímero que se degrada en moléculas naturales y compatibles por hidrólisis espontánea. Además, la superficie expuesta del material debería soportar la adhesión de células tisulares para facilitar el crecimiento tisular. Se debería asociar una respuesta inmunitaria reducida tanto a la implantación del material como a su procedimiento de degradación.
El poli(ácido láctico), el poli(ácido glicólico) y el poli(lactida-co-glicólida) son una clase especial de poliéster alifático que se puede sintetizar a partir de ácido^{3} láctico y glicólico. La ventaja de usar esta clase de biomateriales es que, aunque sintéticos, se degradan dentro de las moléculas que son normalmente producidas por el metabolismo del cuerpo, y por lo tanto, no son nocivas. Además, estos materiales se procesan fácilmente en películas e hilos así como en micro- y nanopartículas. La degradación fisicoquímica de los copolímeros de (lactida-co-glicólida) también se puede modular mediante el porcentaje de los dos monómeros y el peso molecular del polímero
final.
Se puede considerar esta clase de polímeros como los mejores materiales biodegradables desde el punto de vista de la biocompatibilidad, aunque son caros y producen una respuesta inflamatoria que puede ser más o menos pronunciada dependiendo de su peso molecular. Además, estos materiales no favorecen el crecimiento celular a menos que se funcionalicen apropiadamente y algunos estudios sugieren un cierto grado de citotoxicidad cuando se añade poli(ácido láctico) a los cultivos celulares a concentraciones^{3} relativamente elevadas.
Sin embargo, los productos basados en poli(ácido láctico) y poli(ácido glicólico) son considerados como los mejores biomateriales biodegradables en el mercado para diversas aplicaciones biomédicas. Por ejemplo, los materiales biodegradables de sutura y las barreras biodegradables en la práctica dental se obtienen a partir de estos polímeros.
Las proteínas de soja se han incluido recientemente entre los polímeros naturales y biodegradables que se pueden procesar en películas para aplicaciones de ingeniería- Una patente ha reivindicado la producción de termoplásticos a partir de proteínas^{4} de soja y solamente se ha sugerido recientemente su uso como biomateriales.
Cuando se le priva de su componente de aceite, la harina de soja es un compuesto natural principalmente constituido por proteínas e hidratos de carbono. La producción de la leche de soja a partir de la harina molida y su procesamiento en queso de diferente textura por soluciones de calcio han sido explorados en la industria alimentaria para proporcionar productos^{6} alimentarios saludables. Según nuestro conocimiento no se ha publicado ningún informe acerca de la producción de materiales termoplásticos y termoendurecibles a partir de queso de soja (tofú) y su uso en el campo biomédico. Dependiendo del saber-hacer de la industria alimentaria, se pueden aplicar fácilmente procedimientos para la producción y la esterilización de termoplásticos materiales termoendurecibles basados en tofú a la preparación de nuevos biomateriales^{6,7}.
La invención
La invención se basa en el descubrimiento de que las películas de un material de tipo soja pueden inducir una inhibición de la respuesta inflamatoria y por lo tanto degradarse en el entorno fisiológico sobre la base de su hidrólisis. Los termoplásticos y los materiales termoendurecibles, hechos de tofú desgrasado extrafirme, también pueden inducir una formación rápida (2 días) de una fase mineral con una composición química similar a la hidroxiapatita ósea cuando se incuba con una composición salina similar a la de los exudados óseos. Este proceso de mineralización precede la biodegradación de la película que empieza solamente después de 3 días de incubación y sigue adelante con la formación de una porosidad distribuida regularmente por toda la superficie expuesta. Aunque los inventores han demostrado estos efectos solamente in vitro, la congruencia de los datos obtenidos a partir de diferentes procedimientos experimentales permite predecir un comportamiento similar in vivo. La posibilidad de modificar tanto la composición química como la morfología de los materiales también se reivindica en la presente invención ofreciendo una serie de enfoques para hacerlos apropiados para muchas aplicaciones biomédicas. Estas modificaciones tienen como objetivo modular el tiempo de degradación del material variando su porosidad y su composición química de superficie, así como mejorar la biocompatibilidad y las propiedades mecánicas de los materiales. La inhibición de la activación celular inflamatoria por los termoplásticos, los materiales termoendurecibles y sus productos de degradación indica que la degradación del material in vivo se verá afectada solamente por su hidrólisis espontánea y por el crecimiento tisular ambos guiados por la superficie expuesta del implante. Los termoplásticos hechos de tofú también favorecen la adhesión y proliferación celular. Los termoplásticos hechos de tofú se pueden usar, por lo tanto, tanto como monolito y como material de revestimiento para favorecer la formación de nuevos tejidos y la inhibición de la inflamación relacionada con implante.
Los productos termoendurecibles derivados de o basados en tofú de la presente invención son biomateriales. Tal como lo entiende el experto en la técnica, un biomaterial es un material no viable usado en un dispositivo médico para interactuar con sistemas biológicos.
Los biomateriales termoendurecibles de la presente invención se pueden producir mediante un procedimiento que comprende el termoendurecimiento de tofú desgrasado de soja. En una realización del procedimiento, la cuajada de soja (tofú) se prepara a partir de leche de soja desgrasada por un procedimiento de coagulación (por ejemplo un procedimiento de coagulación inducido por calcio). El tofú desgrasado se puede moldear o cortar a la forma y dimensión deseada y a continuación se incuba a temperatura elevada, o alternativamente se somete a autoclave a temperatura elevada, hasta que se completa el termoendurecimiento.
Las principales áreas de aplicación de estos materiales serán la cicatrización de heridas, la osteointegración esquelética y dental, la adherencia tisular posquirúrgica, las barreras temporales para evitar la adherencia tisular posquirúrgica, los materiales de relleno o de revestimiento con agentes potencialmente osteointegradores (es decir, que se pueden llegar a integrar en el hueso) y agentes antiinflamatorios.
La presente invención se ilustrará ahora con más detalle mediante los siguientes ejemplos y con referencia a las figuras anexas, en las cuales.
La figura 1 muestra microscopía electrónica de barrido de termoplástico de tofú compacto en una superficie de fractura de estado seco (a) (ampliación de 12.000 aumentos); (b) superficie expuesta (ampliación de 3.000 aumen-
tos).
La figura 2 muestra una microscopía electrónica de barrido de termoplásticos de tofú hinchado en PBS y sometido a autoclave a diferentes valores. (a) superficie de fractura de 0,1 bar; (b) superficie de fractura de 0,6 bar; (c) superficie de fractura de 1 bar; (d) superficie expuesta de 0,1 bar; (e) superficie expuesta de 9 bares; (1) superficie expuesta de 1 bar. Ampliación de 12.000 aumentos.
La figura 3 muestra una microscopía electrónica de barrido de termoplástico de tofú liofilizado e hinchado en PBS. Ampliación de 12.000 aumentos.
La figura 4 muestra la absorción de agua de las películas termoplásticas de tofú después de una incubación en una solución fisiológica. Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado.
La figura 5 muestra un perfil de degradación de una película termoplástica de tofú en tampón fisiológico. Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado.
La figura 6 muestra una microscopía electrónica de barrido de termoplásticos de tofú de degradación en tampón fisiológico. (a) piel del polímero de degradación; (b) masa de material subyacente. Ampliación de 200 aumentos.
La figura 7 muestra una microscopía electrónica de criobarrido de la superficie de la película termoplástica de tofú. (a) película de control; (b) incubación de 2 días en fluido corporal simulado a 37ºC. Ampliación de 3.000 aumentos.
La figura 8 muestra análisis por rayos X dispersivos elementales de películas termoplásticas de tofú. (a) control; (b) incubación de 2 días en fluido corporal simulado a 37ºC.
La figura 9 muestra niveles absorbidos de proteínas implicados en el proceso de cicatrización de herida. (a) fragmento C3 de sistema complementario; (b) fibrinógeno; (c) inmunoglobulinas; (d) fibronectina. Los datos se expresan como desviación estándar \pm media de n=6. El asterisco indica material notablemente diferente de tofú a p<0,05. el doble asterisco indica material notablemente diferente de tofú a p<0,01.
La figura 10 muestra el efecto de los termoplásticos de tofú y sus extractos sobre la producción de radicales libres por células mononucleares. El control es la activación espontánea de las células obtenidas durante el experimento. Los datos se expresan como desviación estándar \pm media de n=6. Las muestras son notablemente diferentes de las células de control a p<0,01.
La figura 11 muestra adhesión de monocitos/macrófagos sobre películas de tofú analizadas por microscopía electrónica de barrido. (a) células redondas aisladas; (b) agrupación de células; células de difusión aisladas. Bares = 
\hbox{3  \mu m.}
La figura 12 muestra adhesión y proliferación de fibroblastos murinos 3T3 sobre termoplásticos basados en soja. (a) control 3 horas; (b) tofú 6 horas; (c) control 24 horas; (d) tofú 6 horas; (e) control 48 horas; (f) tofú 48 horas. Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado.
La figura 13 muestra la difusión de fibroblasatos murinos 3T3 sobre termoplástico basado en tofú después de un tiempo de incubación de 24 horas.
Ejemplo 1 Preparación de especímenes compactos a temperatura elevada Procedimiento
Las rodajas de queso extrafirme de soja desgrasado, que se prepara por procedimientos convencionales de coagulación con soluciones de CaCl_{2} (10-40 mM)^{8} o se obtienen a partir de tofú comercial, se cortan mediante una cuchilla afilada a espesores uniformes (1,0 cm).
Las películas obtenidas se incuban en un horno a 90ºC hasta el termoendurecimiento completo.
En un procedimiento alternativo, el termoendurecimiento se obtuvo por cocción por microondas.
El procedimiento se puede aplicar también a la preparación de especímenes con diferentes morfologías preparando queso de soja en moldes apropiados. Se pueden obtener cubos, discos, membranas o fibras extruídas. Se pueden preparar también micropartículas desmenuzando bien tofú fresco o sus termoplásticos en un mezclador. En el primer caso el material desmenuzado experimenta el termoendurecimiento como se indica en este Ejemplo y en el Ejemplo 2.
Los especímenes, preparados según este procedimiento, se revistieron por pulverización iónica con oro y se analizaron por microscopía electrónica de barrido con 3.000 y 12.000 aumentos, a 5 kV.
Resultados
Se obtuvieron películas rígidas de 1.0 \pm 0,2 mm de espesor. La morfología de la superficie de fractura de la película parecía ser muy compacta con una rugosidad visible solamente a ampliación elevada (figura 1 a). La superficie expuesta mostró una rugosidad en la cual eran visible picos y valles ya visibles a 3 una ampliación de 3.000 aumentos (figura 1b).
Ejemplo 2 Preparación de geles de tofú expandido a diferentes presiones Procedimiento
Se sumergieron rodajas de tofú en solución salina de tampón fosfato de pH 7,2 (PBS) durante 24 horas a temperatura ambiente y se sometió a autoclave a diferentes temperaturas (100, 115; 121ºC). Cada valor de temperatura correspondió a una presión diferente (100ºC = 0,1 bar); 115ºC = 0,6 bar); 121ºC = 1 bar)). Las rodajas de gel se mantuvieron durante 5 minutos a temperatura de sedimentación y la presión del autoclave se fue reduciendo gradualmente. Las películas finalmente se liofilizaron durante una noche.
Se aplicó el mismo procedimiento a los especímenes^{8} de queso de tofú fresco.
En un procedimiento alternativo, se liofilizaron durante una noche las películas húmedas.
Todos los especímenes se revistieron por pulverización iónica con oro y se analizaron por microscopía electrónica de barrido a 12.000 aumento a 5 kV.
Resultados
Por los procedimientos de autoclave adoptados se obtuvieron geles de diferente porosidad. La densidad de poro incrementada con el aumento de la temperatura de autoclave y la presión tanto sobre las fractura como las superficies expuestas, pero las superficies expuestas fueron menos porosas que las fracturas (figura 2 a-f). No se encontraron diferencias desde el punto de vista del diámetro de poro (aproximadamente 200 nm) a las diferentes condiciones de autoclave.
La superficie expuesta de los materiales sometidos a autoclave e hinchados en PBS perdieron la morfología rugosa observada en el control seco (figura 1) quizás como consecuencia del proceso de hinchado.
La liofilización simple de las películas produjo una morfología diferente donde no eran visible poros, pero se resaltó la rugosidad de la superficie expuesta mediante la formación de perlas sobresalientes (figura 3).
Se pueden obtener especímenes porosos de diferentes tamaños y morfologías como se indica en el Ejemplo 1 (es decir, cubos, membranas, partículas, varillas, discos).
Ejemplo 3 Preparación de termoplásticos de tofú funcionalizados por polipéptidos Procedimiento
Se funcionalizaron termoplásticos derivados de tofú injertando péptidos bioactivos específicos a polímeros de soja por la reacción de aldehídos con grupos amino de las proteínas de soja (formación de bases de Schiff). Las películas se sumergieron en una solución de glutaraldehído al 0,25% (p/v) en tampón fosfato que contiene diferentes concentraciones de los péptidos bioactivos durante 1 hora a temperatura ambiente. Alternativamente, se usó formaldehído al 0,38% (p/v) como agente acoplador. En ambos protocolos, se llevó a cabo una etapa de reducción de los enlaces dobles C=N por 10 mM CNBr.
Alternativamente, el injerto se puede llevar a cabo por puentes disulfido o por esterificación de alcohol o por otros procedimientos biomédicos clásicos.
Todos los péptidos con funciones específicas receptoras de células, propiedades de enlace de calcio así como factores de crecimiento se incluyen en esta invención como moléculas de funcionalización de los termoplásticos derivados de tofú.
Ejemplo 4 Materiales compuestos termoendurecidos/termoplásticos de tofú Procedimiento
La síntesis de los biomateriales compuestos basados en termoplásticos de tofú se basa en técnicas tales como mezclar, interpenetrar redes poliméricas e injertar con polímeros biocompatibles sintéticos y naturales que se pueden conferir a los termoplásticos de tofú:
(i)
mayor plasticidad (baja temperatura de transición vítrea) en estado seco;
(ii)
mayor hidrofobicidad;
(iii)
mayor hidrofilicidad (propiedades de hinchado aumentadas en entorno acuoso);
(iv)
reticulación física y química;
(v)
propiedades físicas y biológicas (osteointegración).
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(i) e (ii) la pasta extrafirme de queso de tofú se mezcla a 90ºC con policaprolactona derretida al 1% (p/v) de diferentes pesos moleculares.
(iii) Los termoplásticos porosos derivados de tofú, preparados como se indica en el Ejemplo 2, son interpenetrados por materiales hidrófilos tales como polietilenglicol, poli(alcohol de vinilo), poli(2-hidroxietil metacrilato), alginato, chitosán a través del hinchado de los termoplásticos de tofú de los Ejemplos 1 y 2 en agua o soluciones aditivas de alcohol. Después de la interpenetración se llevó a cabo otra etapa de deshidratación para permitir interacciones físicas entre los dos componentes del material compuesto. La deshidratación se lleva a cabo a diferentes temperaturas según la estabilidad del aditivo. Los especímenes obtenidos se pueden funcionalizar como se indica en el Ejemplo 3.
(iv) La reticulación física se puede obtener introduciendo conjuntos de valores hidrófobos en la pasta bien como se ha descrito en el punto (i) o como se ha descrito en el Ejemplo 3. Como alternativa, se pueden generar puentes de sal introduciendo moléculas de cargas opuestas. En el primer caso, se llevan a cabo mezclas del queso fresco de tofú con polímero sintéticos y naturales capaces de formar interacciones hidrófobas o enlaces de hidrógeno como se indica en los puntos (i) y (iii). El injerto de monaldehídos que llevan grupos hidrófobos, hidrófilos o cargados se puede llevar a cabo como se indica en el Ejemplo 3.
(v) la mezcla de la pasta de tofú con fosfatos de hidroxiapatita y calcio a diferentes relaciones antes del termoendurecimiento se puede llevar a cabo para aumentar las propiedades osteointegradoras de los termoplásticos basados en tofú y los productos termoendurecidos.
Ejemplo 5 Biomateriales termopláticos/termoendurecidos de tofú para vendaje para heridas y otras aplicaciones Procedimiento
Se preparan esponjas basadas en tofú con diferente porosidad como se indica en los Ejemplos 1, 2 y 4. Se incubaron muestras compactas rectangulares (1,0 cm x 0,5 cm) en tampón fosfato a 37ºC y se determinó su peso en diferentes momentos después de la retirada del exceso de tampón de la superficie por capilaridad.
Después del hinchado completo, se ensayaron los especímenes en cuanto a sus propiedades mecánicas por Instron según las normas ISO.
Resultados
Las películas con una porosidad baja y un espesor de 1,0 mm tienen un tiempo de relación relativamente rápido y permiten adsorber exudados de herida durante un largo periodo de tiempo (aproximadamente 24 horas) (figura 4).
La absorción de agua se puede modular cambiando las propiedades fisicoquímicas de las esponjas como se indica en los ejemplos 1,2 y 4.
Las propiedades mecánicas de las películas termoplásticas húmedas se reúnen en la Tabla 1. Se subrayan las buenas propiedades elásticas de este material en condiciones húmedas.
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TABLA 1 Propiedades mecánicas de las películas termoplásticas de tofú húmedo
1 
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Ejemplo 6 Biomateriales termoplásticos/termoendurecidos de tofú como barreras biodegradables para prevenir la adherencia tisular posquirúrgica y otras aplicaciones Procedimiento
Las películas biodegradables basadas en tofú que se funcionalizan como barrera temporal para prevenir la adherencia tisular posquirúrgica y otras aplicaciones en las cuales se requiere degradación se pueden obtener por los procedimientos de preparación descritos en los Ejemplos 1, 2 y 3. Las membranas tal cual o modificadas con grupos específicos funcionales como se indica en los Ejemplos 3 y 4, se pueden aplicar también en la práctica dental, cirugía estética y otros tipos de aplicaciones donde se ha de modular el crecimiento de tejidos blandos y óseos.
Se incubaron especímenes rectangulares (1,0 cm x 0,5 cm) en tampón fosfato durante 9 días a 37ºC. Los especímenes se pesaron en diferentes momentos después de la retirada del exceso de tampón de la superficie por capilaridad.
Después de 7 días de incubación en tampón, se lavaron los especímenes en agua desionizada, se liofilizaron durante una noche, se revistieron por pulverización iónica con oro y se analizaron por microscopía electrónica de barrido a 200 aumento a 5 kV.
Resultados
Las películas compactas producidas siguiendo el procedimiento descrito en el ejemplo 1 mostraron una degradación lenta y espontánea en un entorno acuoso (figura 5). La degradación inducida por hidrólisis espontánea es muy lenta, representando al 30% del peso de espécimen después de 9 días.
La degradación de la película después de 7 días condujo a la formación de una película de tipo gel altamente porosa (figura 6) fácilmente eliminada de la masa de material que mostró un grado diferente de porosidad (figura 6). Ambos grados de la porosidad obtenida se encontraron en el intervalo requerido para el crecimiento tisular (100-500 \mum).
La biodegradación intrínsecamente lenta de los termoplásticos de tofú de diferentes morfologías también sugiere su uso como vehículo para distribución lenta de antibióticos y fármacos.
Ejemplo 7 Productos termoplásticos/termoendurecidos de tofú como biomateriales osteointegradores Procedimiento
La presencia de cantidades relativamente elevada de calcio usadas como agente coagulante en la preparación de queso de tofú (Ejemplo 1), la porosidad modulada de los hidrogeles (Ejemplo 2) y su funcionalización con péptidos bioactivos (Ejemplo 3) sugieren el uso de estos materiales como sustrato para osteointegración.
Las películas compactas de tofú se incubaron en una solución tampón con una composición salina que simula exudados óseos durante 2 días, a 37ºC. Los discos de control se incubaron en PBS durante el mismo periodo de tiempo. Los especímenes se lavaron en agua desionizada y se congelaron. La fase acuosa de las muestras se subliminó en una cámara de preparación de criostato, y el material secado se revistió por pulverización iónica con paladio y se analizó en estado congelado por microscopía electrónica de criobarrido. Se analizó la morfología a 3.000 aumentos a 5 kV; se llevo a cabo el análisis elemental a 15 kV.
Resultados
La formación de una fase mineral consistente sobre la superficie de una película termoplástica de tofú no modificada ya fue visible después de la incubación de 2 días en tampón de fluido corporal simulado (figura 7 b). en las mismas condiciones experimentales, un potente material osteointegrador tal como Polyactive® (CAM, Holanda) no mostró ninguna mineralización detectable (datos no mostrados).
El análisis elemental permitió la caracterización de la fase mineral como fosfato de calcio en el cual la relación Ca/P fue de 1,05 (figura 8). Sin tener en cuenta el procedimiento de preparación de película no se encontraron picos detectables de fósforo y calcio en el control (figura 8 a). Los picos de los átomos de carbono y oxígeno, típicos de los polímeros orgánicos de soja, se redujeron cuando se incubó el material en fluido corporal simulado indicando que la fase mineral formada alcanzó un espesor notable (Figuras 8 a y b).
El espécimen de control (figura 7 a) expuesto a un medio de PBS mostró un cambio de la morfología de superficie que se volvió relativamente más lisa que el material secado (figura 1 b) al igual que los materiales expandidos por presión (figuras 2 d-f).
Ejemplo 8 Propiedades antiinflamatorias de termoplásticos de tofú Procedimiento
Las películas de tofú, previamente humedecidas en solución fisiológica y a continuación acondicionadas con plasma humano durante 30 minutos en condiciones estáticas a 37ºC, se analizaron mediante inmunoensayo enzimático (ELISA) para la adsorción de proteínas con una función clave en el proceso de cicatrización de herida. Los resultados se compararon con los obtenidos a partir de dos materiales sintéticos, poliestirena (PST) y poli(2-hidroxietil metacrilato) (PHERMA), con propiedades de superficie fisicoquímicas completamente diferentes.
El efecto de los termoplásticos basados en tofú y sus productos de degradación sobre las células inflamatorias también se evaluó. Se añadieron células mononucleares (10^{5}/ml) separadas del cuerpo periférico humano por el método^{9} de Boyum a 3 ml de tampón fosfato en el cual se colocó previamente un espécimen rectangular hinchado (1,0 cm x 0,5 cm). El efecto de los productos de degradación también se evaluó añadiendo al tampón 100 \mul del medio de incubación en el cual se llevo a cabo la degradación de película durante 3 días. En ambos casos se añadió previamente Luminol 1,0 mM al medio de incubación. Se detecto continuamente quimioluminiscencia, inducida por la producción de radicales libres por las células durante 1 hora.
En un procedimiento alternativo, se incubaron las células mononucleares (10^{5}) en presencia de un disco de material de diámetro de 1,7 cm, previamente acondicionado con plasma humano, durante 20 horas, a 37ºC, 95% de aire, 5% de CO_{2}. Los sobrenadantes se retiraron, se centrifugaron a 1.000 f para evitar la contaminación de la célula no enlazada, y se ensayaron por un kit de ELISA para interleuquina-1\beta.
En un experimento similar, las células que se adhieren al material acondicionado de plasma se fijaron a la superficie mediante una solución de glutaraldehídulo al 2,5% (p/v) en PBS. Después de su fijación, el material se deshidrato gradualmente por incubación en soluciones de etanol/PBS de concentración crecientes de alcohol (25%, 50%, 75% en volumen). Se llevaron a cabo finalmente dos etapas finales en etanol absoluto. Todas las etapas duraron 15 minutos a 4ºC. Los especímenes se liofilizaron durante una noche, se revistieron por pulverización iónica con oro y se analizaron por microscopía electrónica de barrido, a diferentes aumentos, 5 kV.
Resultados
El ensayo ELISA mostró los niveles de unión de superficie de los termoplásticos basados en tofú del fragmento C3 del sistema complementario son niveles considerablemente inferiores a PST (figura 9 a). La fibronectina también absorbida a niveles que fueron considerablemente inferiores a PST (figura 9 d), mientras que no se encontró ninguna diferencia considerable cuando se evaluaron los niveles de inmunoglobulinas (IgG) (figura 9 c). Se encontró una reducción considerable de Fibrinógeno respecto de los dos materiales sintéticos (figura 9 b).
La activación de células mononucleares aisladas a partir de sangre humana periférica también se vio afectada. Las películas de tofú, cuya superficie se preacondicionó con plasma humano, indujeron una producción muy baja de interleuquina-1\beta comparado con PST y PHEMA (Tabla 2).
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TABLA 2 Síntesis inducida por material de interleuquina-1\beta por células mononucleares Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado
2
La evaluación de la producción de radicales libres por las células mononucleares por un procedimiento de quimioluminiscencia mostró que los termoplásticos de tofú así como sus productos de degradación suprimían considerablemente la activación espontánea de células mononucleares (figura 10). La incubación de los monocitos con los extractos de tofú derivados de experimentos de degradación en solución fisiológica mostró un mayor efecto inhibitorio sobre la producción de radicales libres.
Finalmente, la adhesión de los monocitos/macrofagos sobre películas termoplásticas derivadas de tofú también se limitó a células redondas con una superficie lisa que indica su estado quiescente (Figuras 11 a-c). La adhesión de las células fue pobre con solamente diminutas seudópodos que establecen contactos con la superficie de los materiales (figuras 11 a y 11 b). Raramente se observó una buena difusión celular (figura 11 c), pero los macrófagos seguían mostrando una superficie lisa típica de las células no activas.
Ejemplo 9 Termoplásticos de tofú como esqueleto ingeniería tisular Procedimiento
Los discos termoplásticos de tofú (diámetro de 1 cm en estado seco) se desinfectaron con etanol al 90% durante 15 minutos. Los especímenes se equilibraron durante 1 hora en un medio de cultivo celular enriquecido con suero fetal bovino al 10% /v/v) y se sembraron fibroblastos murinos 3T3 (2,5 x 10 10^{5}) sobre cada disco. La adhesión/proliferación celular se detuvo al tiempo de incubación de 6 horas, 24 horas y 48 horas a 37ºC, 95% de aire, 5% de CO_{2}. Para cada tiempo de incubación se llevaron a cabo controles en placas de cultivo de tejido (TCP). Se fijaron células de adherencia y se deshidrataron como se indica en el ejemplo anterior y las muestras se revistieron por pulverización iónica con oro y se analizaron por microscopía electrónica de barrido a diferentes aumentos a 5 kV.
Resultados
Las figuras 12 a y b muestran el grado de adhesión y proliferación de los fibroblastos sobre el TCP (a) y los termoplásticos basados e soja (b) después de 6 horas de incubación. Se detectó un pobre grado de difusión celular sobre los materiales basados en tofú; Los fibroblastos parecían seguir teniendo forma redonda y solamente unos lamelipodios diminutos establecían contacto con la superficie. Por el contrario, la difusión de las células sobre los TCP ya se había terminado después del mismo periodo de tiempo.
Sin embargo, a las 24 horas y las 48 horas, los fibroblastos alcanzaron un grado de difusión sobre los termoplásticos de tofú (figuras 12 d y f) comparable con el del control (c y e). Las células formaron capas confluentes con una nueva matriz extracelular que cubre la superficie del biomaterial. Pocas áreas de células aisladas permitieron destacar el alto grado de difusión llevado a cabo por las células sobre los biomateriales basados en tofú después de 24 horas
(figura 13).
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9. Boyum A. 1968 Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Scand J Clin Lab Invest; 21: 77-89.

Claims (6)

1. Uso como biomaterial de un producto termoendurecido compacto o poroso constituido de tofú desgrasado de soja.
2. Uso de un producto termoendurecido compacto poroso constituido de tofú desgrasado de soja para la fabricación de un biomaterial.
3. Uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el cual el biomaterial está en forma de o para ser usado en un vendaje para heridas.
4. Uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 en el cual el biomaterial está en forma de o para ser usado en una barrera temporal para prevenir la adherencia posquirúrgica.
5. Uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el cual el biomaterial está en forma de o para ser usado en un material de relleno o de revestimiento con capacidad osteointegradora.
6. Uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el cual el biomaterial o un producto de degradación del mismo está en forma de o para ser usado en un agente antiinflamatorio.
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