ES2305246T3 - Composiciones para la administracion sistemica de secuencias que codifican proteinas oseas morfogeneticas. - Google Patents
Composiciones para la administracion sistemica de secuencias que codifican proteinas oseas morfogeneticas. Download PDFInfo
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Abstract
Utilización de una composición que comprende una secuencia de ADN que codifica una proteína ósea morfogenética (BMP) en la preparación de un medicamento para estimular la osteogénesis en un paciente mediante la administración sistémica del mismo.
Description
Composiciones para la administración sistémica
de secuencias que codifican proteínas óseas morfogenéticas.
La presente invención se refiere al campo de la
reparación tisular. Más específicamente, la presente invención se
refiere a composiciones para la administración sistémica de
secuencias que codifican proteínas osteógenas. La invención incluye
también composiciones para la administración sistémica de proteínas
osteógenas para la estimulación de la osteogénesis. Las
composiciones estimulan la osteogénesis y por consiguiente las
utilizaciones incluyen la curación de fracturas y la reparación y
aceleración de la curación de la fractura. Estas composiciones
pueden utilizarse también para el tratamiento del hueso osteoporoso
y/o la prevención y el tratamiento de la osteopo-
rosis.
rosis.
Como ilustrativa de la técnica anterior,
Human Gene Therapy, vol. 10, 1999, 2245-2253
da a conocer la administración de un vector adenovírico que
codifica BMP2 en la musculatura del muslo de ratas lampiñas atímicas
y la generación de huesos endocondrial en el punto de
inyección.
La presente invención se refiere a composiciones
para la administración sistémica de secuencias de ADN que codifican
las proteínas osteógenas. La invención incluye también la
utilización de estas secuencias de ADN para la preparación de
composición para su utilización en la administración sistémica de
proteínas o péptidos osteógenos para la estimulación de la
osteogénesis. Las composiciones pueden utilizarse para estimular la
curación de fracturas y la reparación y aceleración de la curación
de fracturas. Estas composiciones pueden utilizarse también para el
tratamiento del hueso osteoporoso u osteógeno y/o la prevención del
tratamiento de la osteoporosis.
Las secuencias de ADN que codifican las
proteínas osteógenas son proteínas óseas morfogenéticas (BMP). Las
BMP se han dado a conocer por su actividad osteógena, y otras
actividades de tipo crecimiento y diferenciación. Las BMP incluyen
las proteínas BMP BMP-2, BMP-3,
BMP-4, BMP-5 y
BMP-7, BMP-10,
BMP-12 y BMP-13,
BMP-15, BMP-16, descritas con mayor
detalle a continuación. El agente osteógeno es más preferentemente
las secuencias de ADN que codifican BMP-6 o las
proteínas o péptidos BMP-6. La secuencia de ADN y de
la proteína y los métodos para producir BMP-6 se
dan a conocer en las patentes US nº 5.187.076, US nº 5.459.047 y US
nº 5.849.880 y en USSN 09/189.157.
La invención proporciona por lo tanto
composiciones para estimular la osteogénesis en la que la
composición que comprende una secuencia de ADN que codifica una
proteína osteógena en una formulación inyectable adecuada para la
administración sistémica. La proteína osteógena es una proteína
morfogenética ósea (BMP). Dichas composiciones son útiles para la
curación y reparación de la fractura. Estas composiciones pueden
utilizarse para aumentar la densidad mineral ósea. El hueso
osteoporoso u osteógeno se caracteriza con frecuencia por una
densidad ósea subóptima y las composiciones y procedimientos pueden
por lo tanto utilizarse para aumentar la densidad mineral ósea y
tratar la osteoporosis.
En una forma de realización preferida, la
invención describe una composición para estimular la reparación de
la fractura en la que la composición comprende una secuencia de ADN
que codifica BMP-6 y se utiliza en un procedimiento
que implica la administración sistémica a un paciente necesitado de
la reparación de la fractura. La secuencia del ADN y de la proteína
y los procedimientos para producir BMP-6 se dan a
conocer en los documentos US nº 5.187.076, US nº 5.5459.047, US nº
5.849.880 y en el documento USSN 09/189.157. En otras formas de
realización, las BMP siguientes pueden ser adecuadas:
BMP-2, BMP-3, BMP-4,
BMP-5, BMP-7,
BMP-10, BMP-12 y
BMP-13, BMP-15 y
BMP-16, descritas con mayor detalle a
continuación.
En la presente invención, los vectores
utilizados para la incorporación y expresión del ADN son
preferentemente de origen vírico, particularmente adenovirus, así
como retrovirus. Los adenovirus presentan ventajas porque no
requieren células en estado de proliferación, y presentan una tasa
de eficacia de infección elevada tanto in vitro como in
vivo, mientras que los retrovirus resultan con más frecuencia
adecuados para la infección in vitro. Los adenovirus también
ofrecen elevados niveles de expresión transgénica y capacidad para
conseguir altas valoraciones. Estas ventajas convierten a los
adenovirus en más adecuados para las células primarias, las
estirpes celulares y la transducción directa in vivo. Además,
la expresión del transgén es transitoria y el vector adenovírico no
se integra en el genoma celular, proporcionando seguridad a los
vectores para su utilización. Todas las generaciones de adenovirus
recombinantes son adecuadas, incluyendo la presente generación (E1
eliminada) y nuevas generaciones que han reducido antigenicidad
(virus eliminados E1, E3, E4 o E1, E4 eliminados y E3
sobreexpresado). Smith (1995); Dunbar (1996); Roemer (1992); Graham
(1991); Kozarsky (1993); e Ilan (1997).
La expresión de los genes que se expresan en la
presente invención puede ser constitutiva o controlada. Controlar
la expresión puede conseguirse mediante el control externo por medio
de elementos reguladores, tal como con un activador controlado de
manera inducible, por ejemplo, un activador controlado por
tetraciclina, como se describe con mayor detalle en la presente
memoria, o utilizando elementos reguladores del tejido específico o
genes específicos temporalmente para dirigir la expresión solamente
a determinadas series de reacciones de diferenciación especificadas
o a determinadas etapas en la diferenciación. Por ejemplo, puede
utilizarse activador de osteocalcina para la inducción en las
etapas tardías de la formación y calcificación del hueso.
En una forma de realización preferida la
secuencia del ADN de la BMP, preferentemente la
BMP-6 está contenida en un vector adenovírico que
comprende una formulación inyectable adecuada para la administración
sistémica. Esta composición puede utilizarse en un procedimiento
que comprende la administración sistémica de una cantidad
terapéuticamente eficaz de la composición a un paciente necesitado
de reparación de la fractura.
El agente activo es una proteína morfogenética
ósea (BMP). Las proteínas osteógenas, las secuencias de ADN, las
composiciones y procedimientos para producirlas, útiles en la
presente invención son las que comprenden las proteínas BMP
BMP-2, BMP-3, BMP-4,
BMP-5, BMP-6 y
BMP-7, dadas a conocer por ejemplo en las patentes
US nº 5.108.922; nº 5.013.649; nº 5.116.738; nº 5.106.748; nº
5.187.076; nº 5.459.047; nº 5.849.880 y nº 5.141.905;
BMP-8, dada a conocer en la publicación PCT WO
91/18098; y la BMP-9, dada a conocer en la
publicación PCT WO 93/00432, BMP-10, dada a conocer
en la solicitud PCT WO 94/26893; BMP-11, dada a
conocer en la solicitud PCT WO 94/26892 o BMP-12 o
BMP-13, dada a conocer en la solicitud PCT WO
95/16035, o BMP-15, dada a conocer en la solicitud
PCT WO 96/36710 o BMP-16, dada a conocer en la
solicitud de patente en trámite número de serie 08/715/202,
presentada el 18 de septiembre de 1996.
Otras moléculas de ADN y las proteínas que
codifican que pueden ser útiles, además del ADN que codifica una
proteína BMP, incluyen moléculas de ADN que codifican otros agentes
terapéuticamente útiles incluyendo los factores de crecimiento tal
como el factor de crecimiento epidérmico (EGF), el factor de
crecimiento de fibroblastos (FGF), el factor de crecimiento
transformante (TGF-\alpha y
TGF-\beta), las proteínas del erizo tales como
del erizo sónico, indio y del desierto, la hormona del paratiroides
y el péptido relacionado con la hormona del paratiroides,
cadherinas, activitas, inhibinas e IGF, FSH, proteínas frizzled,
frzb o frazzled, PDGF y otros factores de crecimiento
endoteliales, proteínas de unión a BMP tales como cordina y fetuina,
estrógeno y otros esteroides así como versiones truncadas de los
mismos y factores de transcripción tales como proteínas wnt,
genes mad y cbfa.
Las únicas actividades inductivas de estas
proteínas, junto con su presencia en el hueso, sugieren que son
importantes reguladores de los procesos de reparación de huesos y
cartílagos y pueden estar implicadas en el mantenimiento normal del
tejido óseo.
La Figura 1 es una ilustración del aparato de
fractura utilizado en el modelo de fractura cerrada de fémur.
La invención proporciona la utilización de
secuencias de ADN que codifican las BMP en la preparación de la
composición para estimular la osteogénesis. Las composiciones de la
invención comprenden una secuencia de ADN que codifica una proteína
osteógena en una formulación inyectable adecuada para la
administración sistémica. La proteína osteógena es una proteína
morfogenética ósea (BMP). Dichas composiciones son útiles para la
curación y reparación de la fractura. Estas composiciones pueden
utilizarse para aumentar la densidad mineral ósea. El hueso
osteoporoso u osteógeno se caracteriza con frecuencia por la
densidad ósea subóptima y por consiguiente las composiciones pueden
utilizarse para aumentar la densidad mineral ósea y tratar la
osteoporosis.
En una forma de realización preferida, la
invención se refiere a una composición para estimular la reparación
de la fractura en la que la composición comprende una secuencia de
ADN que codifica a BMP-6 y se utiliza en un
procedimiento que implica la administración sistémica a un paciente
que requiere la reparación de la fractura. La secuencia de ADN y de
la proteína y los procedimientos para producir BMP-6
se dan a conocer en las patentes US nº 5.187.076, US nº 5.459.047 y
US nº 5.849.880 y en el documento USSN 09/189.157. En una forma de
realización más preferida la secuencia de BMP ADN está contenida en
un vector adenovírico.
En otras formas de realización, pueden ser
adecuadas las siguientes BMP: BMP-2,
BMP-3, BMP-4, BMP-5,
BMP-6 y BMP-7,
BMP-8, BMP-9,
BMP-10, BMP-12 y
BMP-13, BMP-15,
BMP-16, descritas con mayor detalle en la presente
memoria.
La invención por consiguiente proporciona
composiciones para estimular la osteogénesis en la que la
composición comprende una secuencia de ADN que codifica una
proteína osteógena. La proteína osteógena es una proteína
morfogenética ósea (BMP). Dichas composiciones son útiles para la
curación y reparación de la fractura. Estas composiciones pueden
utilizarse para aumentar la densidad mineral ósea. El hueso
osteoporoso u osteógeno se caracteriza con frecuencia por la
densidad ósea subóptima y por consiguiente las composiciones pueden
utilizarse para aumentar la densidad mineral y tratar la
osteoporosis. Las composiciones pueden aumentar la densidad de la
masa ósea y minimizar o reducir la frecuencia de las fracturas
relacionadas con la osteoporosis. Las composiciones son útiles en
los procedimientos que comprenden administrar una formulación
inyectable de una secuencia de ADN que codifica una proteína
osteógena adecuada para la administración sistémica en una cantidad
eficaz para la reparación de la fractura. Las composiciones pueden
administrarse mezcladas con un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
aceptable.
En una forma de realización preferida, la
invención se refiere a una composición para estimular la reparación
de la fractura en la que la composición comprende una secuencia de
ADN que codifica BMP-6 y se emplea en un
procedimiento que implica la administración sistémica a un paciente
necesitado de la reparación de la fractura. En otra forma de
realización preferida, la secuencia BMP ADN está contenida en un
vector adenovírico.
En otras formas de realización pueden resultar
adecuadas las BMP siguientes: BMP-2,
BMP-3, BMP-4, BMP-5,
BMP-6 y BMP-7,
BMP-10, BMP-12 y
BMP-13, BMP-15,
BMP-16, descritas con mayor detalle a
continuación.
Las composiciones por consiguiente como agente
inyectable serían útiles en la prevención de fractura y el
tratamiento sin intervención quirúrgica. Las composiciones
disminuirían la aparición y/o gravedad de la fractura para el hueso
osteoporósico.
Las secuencias codifican proteínas osteógenas
que son proteínas morfogenéticas óseas (BMP). El agente activo
incluye por lo menos una proteína seleccionada de entre la subclase
de proteínas conocidas generalmente como BMP, que han sido dadas a
conocer por presentar actividad osteógena y otras actividades de
tipo crecimiento y diferenciación. Estas BMP incluyen las proteínas
BMP: BMP-2, BMP-3,
BMP-4, BMP-5 y
BMP-7, BMP-10,
BMP-12 y BMP-13,
BMP-15, BMP-16, descritas con mayor
detalle a continuación. El agente osteógeno es aún más
preferentemente las secuencias de ADN que codifican a
BMP-6 o a las proteínas o péptidos
BMP-6. La secuencia de ADN y de proteína y los
procedimientos para producir BMP-6 se dan a conocer
en las patentes US nº 5.187.076, US nº 5.459.047 y US nº 5.849.880
y en el documento USSN 09/189.157.
Entre las moléculas útiles en la presente
invención están las que comprenden las secuencias de codificación
para una o más de las proteínas BMP siguiente:
BMP-2, BMP-3, BMP-4,
BMP-5, BMP-6 y
BMP-7, dadas a conocer por ejemplo en las patentes
US nº 5.108.922; nº 5.013.649; nº 5.116.738; nº
5.106.748; nº 5.187.076 y nº 5.141.905; BMP-8, dada
a conocer en la publicación PCT WO 91/18098; y
BMP-9, dada a conocer en la publicación PCT WO
93/00432, BMP-10, dada a conocer en la solicitud PCT
WO 94/26893, BMP-11, dada a conocer en la solicitud
PCT WO 94/26892, o BMP-12 o BMP-13,
dadas a conocer en la solicitud PCT WO 95/16035, o
BMP-15, dada a conocer en la solicitud PCT WO
96/36710 o BMP-16, dada a conocer en la solicitud de
patente en trámite número de serie 08/715/202, presentada el 18 de
setiembre de 1996.
Otras moléculas de ADN que pueden ser útiles,
además del ADN que codifica una proteína BMP, incluyen moléculas de
ADN que codifican otros agentes terapéuticamente útiles incluyendo
los factores de crecimiento tal como el factor de crecimiento
epidérmico (EGF), el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), el
factor de crecimiento transformante (TGF-\alpha y
TGF-\beta), las proteínas hedgehog tales
como hedgehog sónica, india y del desierto, la hormona del
paratiroides y el péptido relacionado con la hormona del
paratiroides, cadherinas, activinas, inhibinas e IGF, FSH,
proteínas frizzled, frzb o frazzled, PDGF y otros
factores de crecimiento endoteliales, proteínas de unión a BMP
tales como cordina y fetuina, estrógeno y otros esteroides así como
versiones truncadas de los mismos y factores de transcripción tales
como proteínas wnt, genes mad y cbfa.
En la presente invención, los vectores
utilizados para la incorporación y expresión del ADN son
preferentemente de origen vírico, particularmente adenovirus, así
como retrovirus. Los adenovirus presentan ventajas porque no
requieren células en estado de proliferación, y tienen una tasa de
eficacia de infección elevada tanto in vitro como in
vivo, mientras que los retrovirus son con más frecuencia
adecuados para la infección in vitro. Los adenovirus también
ofrecen elevados niveles de expresión transgénica y capacidad para
conseguir altas valoraciones. Estas ventajas convierten a los
adenovirus en más adecuados para las células primarias, las
estirpes celulares y la transducción directa in vivo. Además,
la expresión del transgén es transitoria y el vector adenovírico no
se integra en el genoma celular, proporcionando seguridad a los
vectores para su utilización. Todas las generaciones de adenovirus
recombinantes son adecuadas, incluyendo la presente generación (E1
eliminada) y nuevas generaciones que han reducido antigenicidad
(virus eliminados E1, E3, E4 o E1, E4 eliminados y E3
sobreexpresado). Smith (1995); Dunbar (1996); Roemer (1992); Graham
(1991); Kozarsky (1993); e Ilan (1997).
La expresión de los genes que se expresan en la
presente invención puede ser constitutiva o controlada. Controlar
la expresión puede conseguirse mediante el control externo por medio
de elementos reguladores, tal como con un activador controlado de
manera inducible, por ejemplo, un activador controlado por
tetraciclina, como se describe con mayor detalle en la presente
memoria, o utilizando elementos reguladores del tejido específico o
genes específicos temporalmente para dirigir la expresión solamente
a determinadas series de reacciones de diferenciación especificadas
o a determinadas etapas en la diferenciación. Por ejemplo, puede
utilizarse activador de osteocalcina para la inducción en las
etapas tardías de la formación y calcificación del hueso.
Las secuencias de ADN que codifican proteínas
BMP útiles en la presente invención, tales como las dadas a conocer
en las solicitudes a las que se ha hecho referencia y en las
patentes mencionadas anteriormente, incluyen también las secuencias
de ADN dadas a conocer, libres de asociación con secuencias de ADN
que codifican otros materiales proteicos y que codifican la
expresión para las proteínas de la invención. Se incluyen además las
secuencias que se hibridan en condiciones de hibridación severas
[véase, T. Maniatis et al., Molecular Cloning (A
Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory (1982), páginas
387 a 389] para la secuencia de ADN específica y demuestran
actividad de formación de cartílago y/o hueso. Dicha actividad de
formación de cartílago y/o hueso puede estar en el ensayo de
formación del hueso de rata. Un ejemplo de un tal estado de
hibridación severo es la hibridación a 4 \times SSC a 65ºC,
seguido de un lavado en 0,1 \times SCC a 65ºC durante una hora.
Alternativamente, un estado de hibridación severo a título de
ejemplo es la formamida al 50%, 4 \times SCC a 42ºC.
Asimismo, las secuencias de ADN que codifican
proteínas similares a la proteína codificada por la secuencia dada
a conocer, pero que se diferencian en la secuencia del codón debido
a las degeneraciones del código genético o a variaciones alélicas
(cambios de bases que se producen en la naturaleza en la población
de la especie que puede o no puede producir un cambio de
aminoácido) codifican también las proteínas de la invención
descritas en la presente memoria. Las variaciones en las secuencias
de ADN que se producen por mutaciones puntuales o por
modificaciones inducidas (incluyendo la inserción, deleción y
sustitución) para aumentar la actividad, la vida media o la
producción de los polipéptidos codificados por éstas están también
comprendidos en la invención.
Asimismo, las proteínas proporcionadas en la
presente memoria incluyen también factores codificados por las
secuencias similares a las proteínas relacionadas con BMP naturales,
tales como BMP-6, pero en las que las
modificaciones se proporcionan de manera natural (por ejemplo
variaciones alélicas en la secuencia nucleotídica que puede
producir cambios de aminoácidos en el polipéptido) o modificadas
genéticamente de manera deliberada. Por ejemplo, los polipéptidos
sintéticos pueden duplicar total o parcialmente secuencias continuas
de restos de aminoácidos del BMP específico. Estas secuencias, en
virtud de la compartición de estructura primaria, secundaria o
terciaria y de características de la configuración con polipéptidos
inductores del hueso de BMP natural pueden poseer propiedades
biológicas en común con éstas.
En otras formas de realización, las
composiciones de la presente invención pueden comprender, además de
las secuencias de ADN que codifican una proteína BMP, una secuencia
de ADN que codifica proteínas adicionales, tales como los elementos
adicionales de la superfamilia TGF-\beta de
proteínas, descritas anteriormente.
Estas composiciones pueden utilizarse para
estimular la osteogénesis y en la reparación de fracturas. Las
composiciones pueden también utilizarse para aumentar la densidad de
la masa ósea.
Es de esperar que las proteínas osteógenas
puedan actuar conjuntamente o quizás de manera sinérgica con otras
proteínas y factores de crecimiento relacionados. Por consiguiente,
además las composiciones terapéuticas de la invención comprenden
una cantidad terapéutica de una secuencia que codifica la proteína
osteógena con una cantidad terapéutica de por lo menos una de las
proteínas BMP descritas anteriormente. Dichas composiciones pueden
comprender moléculas separadas de proteínas BMP o heteromoléculas
compuestas por diferentes restos BMP.
Las composiciones de la presente invención
pueden combinarse con otros agentes beneficiosos para el tratamiento
del defecto, herida o tejido en cuestión.
En la presente invención, los vectores
utilizados para la incorporación y expresión del ADN son
preferentemente de origen vírico, particularmente adenovirus, así
como retrovirus. Los adenovirus presentan ventajas porque no
requieren células en estado de proliferación, y tienen una tasa de
eficacia de infección elevada tanto in vitro como in
vivo, mientras que los retrovirus son con más frecuencia
adecuados para la infección in vitro. Los adenovirus también
ofrecen elevados niveles de expresión transgénica y capacidad para
conseguir altas valoraciones. Estas ventajas convierten a los
adenovirus en más adecuados para las células primarias, las
estirpes celulares y la transducción directa in vivo. Además,
la expresión del transgén es transitoria y el vector adenovírico no
se integra en el genoma celular, haciendo los vectores seguros para
su utilización. Todas las generaciones de adenovirus recombinantes
son adecuadas, incluyendo la presente generación (E1 eliminada) y
nuevas generaciones que han reducido antigenicidad (virus eliminados
E1, E3, E4 o E1, E4 eliminados y E3 sobreexpresado). Smith (1995);
Dunbar (1996); Roemer (1992); Graham (1991); Kozarsky (1993); e Ilan
(1997).
La expresión de los genes que se expresan en la
presente invención puede ser constitutiva o controlada. Controlar
la expresión puede conseguirse mediante el control externo por medio
de elementos reguladores, tal como con un activador controlado de
manera inducible, por ejemplo, un activador controlado por
tetraciclina, como se describe con mayor detalle en la presente
memoria, o utilizando elementos reguladores del tejido específico o
genes específicos temporalmente para dirigir la expresión solamente
a determinadas series de reacciones de diferenciación especificadas
o a determinadas etapas en la diferenciación. Por ejemplo, puede
utilizarse activador de osteocalcina para la inducción en las
etapas tardías de la formación y calcificación del hueso.
Las composiciones de la invención deben
administrarse de forma generalizada como inyectables. La composición
puede implicar además un implante o dispositivo. Cuando se
administra, la composición terapéutica para su utilización en la
presente invención está, desde luego, en una forma exenta de
pirógenos, fisiológicamente aceptable. Además, la composición puede
encapsularse de forma deseable o inyectarse en una forma viscosa
para la administración al punto o tejido dañado. Agentes
terapéuticamente útiles que pueden también opcionalmente estar
incluidos en una composición como la descrita anteriormente, pueden
alternativa o adicionalmente, administrarse de forma simultánea o
sucesiva con la composición de la invención. Además, las
composiciones de la presente invención pueden utilizarse junto con
los tratamientos disponibles actualmente.
En las formas de realización por ejemplo para el
tratamiento de enfermedades osteoporósicas, los materiales que
pueden ser útiles como portadores en la puesta en práctica de la
presente invención incluyen materiales farmacéuticamente aceptables
con viscosidad y polaridad de modo que, cuando se añaden a la
proteína morfogenética ósea, forman una composición que posee
características de manipulación apropiadas para la aplicación
inyectable al punto del hueso osteoporósico u osteopénico. Añadir
el portador a la proteína morfogenética ósea permite que la
proteína permanezca en el punto enfermo o lesionado durante un
tiempo suficiente para permitir que la proteína aumente la de otro
modo cantidad natural de actividad osteogénica regenerativa de las
células precursoras de mamífero que se infiltran o de otras, y
formar un espacio en el que el nuevo tejido puede crecer y permitir
el crecimiento hacia dentro de las células. El portador puede
también dejar que la proteína morfogenética ósea se libere del
punto de enfermedad o lesión durante un intervalo de tiempo
apropiado para aumentar óptimamente la tasa de actividad osteógena
regenerativa de las células precursoras. El portador puede también
suministrar un marco en el que se produzca nueva formación en el
hueso gravemente osteoporósico.
La familia más preferida de portadores comprende
los materiales colágenos. Existen preferentemente en forma adecuada
para inyectables, tal como un gel. Dichos geles pueden estar
reticulados o no reticulados. Otras formas de colágeno, tales como
las dispersiones o el colágeno fibrilar pueden ser también útiles en
los procedimientos de la presente invención. Otra familia preferida
de portadores en los materiales celulósicos tales como
alquilcelulosa, incluyendo la hidroxialquilcelulosa, metilcelulosa,
etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa,
hidroxipropilmetilcelulosa y carboximetilcelulosa, siendo los más
preferidos las sales catiónicas de la carboximetilcelulosa
(CMC).
(CMC).
En el caso de portadores celulósicos y geles de
colágeno, resulta preferido que el portador esté en forma de un gel
viscoso celulósico hidratado. La viscosidad puede aumentarse por
medios mecánicos, tal como por elevada agitación durante un periodo
adecuado de tiempo, seguido de autoclavado o químicamente. El agente
activo y el portador celulósico está preferentemente en una
solución de tampón adecuado. Una solución de tampón preferida es
una composición que comprende, además del agente activo,
aproximadamente 1,0 a aproximadamente 10,0% (p/v) de glicina,
aproximadamente 0,1 a aproximadamente 5,0% (p/v) de un azúcar,
preferentemente sacarosa, hidrocloruro de ácido glutámico
aproximadamente 1 a aproximadamente 20 mM y opcionalmente
aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,1% de un tensioactivo no
iónico, tal como polisorbato 80. Las soluciones preferidas son
desde aproximadamente 1% a aproximadamente 20% p/v de portador
celulósico/tampón. Si se desea, puede añadirse una sal. Un portador
de gel viscoso preferido se describe en el Ejemplo 2 a continuación.
La cantidad de proteína osteógena útil con el portador de gel
viscoso está comprendida generalmente en el intervalo desde
aproximadamente 0,1 a aproximadamente 100 mg, preferentemente
aproximadamente 1 a aproximadamente 100 mg; más preferentemente
aproximadamente 10 a aproximadamente 80 mg por centímetro cúbico de
material de implante requerido.
Otra clase de materiales de interés específico
para portadores inyectables son los hidroxiapatitos reabsorbibles
así como los minerales, cerámicas y fosfatos. Los hidroxiapatitos
reabsorbibles, por ejemplo, pueden formularse a varias porosidades
variando las velocidades de reabsorción; sus características de
manipulación varían desde tipos implantables duros, a consistencia
de tipo gel, para los que son inyectables pero endurecen a la
temperatura del cuerpo. Portadores de hidroxiapatitos y cerámica
adecuados se describen por ejemplo en el documento WO 96/36562; y
en las patentes US nº 5.543.019; nº 5.306.305; nº 5.258.044; nº
5.496.399; nº 5.455.231; nº 5.336.264; nº 5.178.845; nº 5.053.212;
nº 5.047.031; nº 5.129.905; nº 5.034.059; nº 4.880.610; nº 5.290.763
y nº 5.563.124; cuyas descripciones están incorporadas a la
presente memoria como referencia.
Otra familia de portadores preferida para la
administración del agente activo de la presente invención son los
polímeros inyectables, que pueden ser viscosos y que pueden incluir
opcionalmente también un agente secuestrante. Los polímeros y los
agentes secuestrantes adecuados incluyen los descritos en la patente
US nº 5.171.579, cuya descripción completa está incorporada a la
presente memoria como referencia. Otros polímeros incluyen los
plurónicos, tal como el gel Poloxamer 407. Los plurónicos son una
clase de copolímeros tensioactivos de bloque de tipo ABA solubles
en agua que presentan una única propiedad de gelificación térmica
inversa. Son líquidos (y por consiguiente inyectables) a 4ºC y
geles a la temperatura corporal. El Poloxamer 407, P.M.12.500, se
excreta sin carga en la orina después de la absorción generalizada y
supuestamente ha demostrado que no es tóxico en los animales. Las
poliactidas y/o los polietilenglicoles, que incluyen los geles de
poli(lactida)/poli(etilenglicol). Las polilactidas
pueden disolverse en polietilenglicoles tales como PLA de bajo peso
molecular (2000) disuelto en PEG para producir una solución
inyectable que precipita PLA en inyección en un medio acuoso, dando
como resultado un gel relativamente firme. Además, la bibliografía
menciona conjugados, tales como los conjugados de poli(ácido
láctico)-poli(etilenglicol), como portadores
apropiados para BMP (Miyamoto et al., Clin. Orthop. Rel.
Res. 294:333 (1993)). Entre los materiales útiles como agentes
secuestrantes están el ácido hialurónico, el alginato sódico, el
poli(etilenglicol), el óxido de polioxietileno, el polímero
de carboxivinilo y poli(alcohol vinílico) y materiales
celulósicos, tales como las hidroxicelulosas. Un tal agente
preferido es la carboximetilcelulosa.
Los materiales anteriores dados a conocer que
son útiles como agentes secuestrantes pueden utilizarse como
portadores para inyectables. Además, pueden utilizarse las
combinaciones de los materiales descritos anteriormente.
En los casos en los que el portador puede ser de
viscosidad mayor de la óptima, el portador puede combinarse
opcionalmente con un diluyente, tal como glicerol acuoso,
preferentemente el diluyente portador estaría presente en
concentraciones de aproximadamente 10 a aproximadamente 80% (v/v).
Asimismo, los materiales anteriores pueden combinarse en formas de
realización específicas de la presente invención. Por ejemplo,
polímeros, tales como los polímeros porosos en partículas, pueden
disolverse o ponerse en suspensión en portadores celulósicos o de
gel para aumentar la viscosidad.
En una forma de realización preferida de la
presente invención, los agentes activos se administran por vía
local mediante inyección utilizando solamente un tampón adecuado
como portador. Un tampón adecuado comprende la glicina, la sacarosa
y el hidrocloruro del ácido glutámico a un pH inferior a 6,0. Las
composiciones preferidas de las soluciones tampón comprenden de
aproximadamente 1,0 a aproximadamente 10,0% (p/v) de glicina,
aproximadamente de 0,1 a aproximadamente 5,0% (p/v) de un azúcar,
preferentemente sacarosa, glutamina de aproximadamente 1 a
aproximadamente 20 mM, ácido glutámico o hidrocloruro de ácido
glutámico, y opcionalmente de aproximadamente 0,01 a
aproximadamente 0,1% de un tampón no iónico, tal como el polisorbato
80. En una forma de realización preferida de la invención, esta
formulación comprende glicina a aproximadamente 2,5% (g/100 ml
(p/v)), sacarosa a aproximadamente 0,5% (p/v), aproximadamente
hidrocloruro de ácido glutámico 5 mM (aproximadamente 0,1% p/v) y
polisorbato 80 aproximadamente 0,01% (p/v), a un pH de
aproximadamente 4,5. Este tampón ha sido descrito como MFR 842. En
la patente US nº 5.385.887, cuya descripción está incorporada a la
presente memoria como referencia, se describen más tampones
adecuados para su utilización en la presente invención. Las
soluciones preferidas pueden incluir también combinaciones de
tampón y otro portador, tal como una combinación de tampón y
portador celulósico. Los intervalos preferidos para esta combinación
están comprendidos entre aproximadamente el 1% a aproximadamente el
20% p/v de portador celulósico/tampón. Si se desea, puede añadirse
una sal.
En determinadas formas de realización, las
composiciones pueden incluir una matriz apropiada y/o un agente
secuestrante tal como un portador. Por ejemplo, la matriz puede
soportar la composición o proporcionar una superficie para la
formación del tejido cartilaginoso y/o del óseo y/o otra formación
de tejido. La matriz puede proporcionar la liberación lenta de la
proteína y/o el medio apropiado para la presentación de la misma.
El agente secuestrante puede ser una sustancia que ayude a la
facilidad de administración por inyección u otros medios, o puede
ralentizar la migración de la proteína desde el punto de
aplicación.
En algunas formas de realización, las células
modificadas genéticamente pueden administrarse en combinación con
una matriz apropiada, por ejemplo, para soportar la composición y
proporcionar una superficie para el crecimiento del tejido óseo, de
cartílago y/u otro tejido conectivo. La matriz puede estar en forma
de materiales con matriz tradicional. La matriz puede proporcionar
la liberación lenta de la proteína expresada y células
diferenciadas y/o el medio apropiado para su presentación. En
algunas formas de realización, son de esperar varias proteínas
cartilaginosas y no cartilaginosas que estén reguladas por
incremento y segregadas de células madre multipotentes. Este
fenómeno acelera la regeneración del tejido potenciando la
deposición de la matriz. Las proteínas de la matriz pueden
expresarse también en células modificadas genéticamente y aumentar
el injerto y acoplamiento de las células trasplantadas en el área
del trasplante.
La elección de un material portador se basa en
propiedades de biocompatibilidad, biodegradabilidad, propiedades
mecánicas, aspecto cosmético y propiedades de interfase. La
aplicación específica de las composiciones definirá la formulación
apropiada. Las matrices potenciales para las composiciones pueden
ser biodegradables y definidas químicamente. Otras matrices están
comprendidas por proteínas puras o componentes de la matriz
extracelular. Otras matrices potenciales son no biodegradables y
definidas químicamente. Las matrices preferidas incluyen materiales
a base de colágeno, incluyendo esponjas, tal como Helistat^{7}
(Integra LifeSciences, Plainsboro, N.J.), o colágeno en forma
inyectable, así como agentes secuestrantes, que pueden ser
biodegradables, por ejemplo el derivado del ácido hialurónico. Los
materiales biodegradables tales como películas de celulosa, o
mallas quirúrgicas, pueden servir también como matrices. Dichos
materiales pueden saturarse en un punto de lesión o envolverse
alrededor del cartílago.
Otra clase preferida de portador son las
matrices poliméricas, incluyendo los polímeros de poli(ácido
láctico), poli(ácido glicólico) y copolímeros del ácido láctico y
ácido glicólico. Estas matrices pueden estar en forma de esponja o
en forma de partículas porosas y pueden también incluir un agente
secuestrante. Las matrices de polímero adecuadas están descritas,
por ejemplo, en el documento WO 93/00050, cuya descripción está
incorporada a la presente memoria como referencia.
Las familias preferidas de agentes secuestrantes
incluyen la sangre, el coágulo de fibrina y materiales celulósicos
tales como alquilcelulosas (incluyendo las hidroxialquilcelulosas),
incluyendo la metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa,
hidroxipropilcelulosa, hidroxipropil-metilcelulosa y
carboximetilcelulosa, siendo las más preferidas las sales
catiónicas de carboximetilcelulosa (CMC). Otros agentes
secuestrantes preferidos incluyen el ácido hialurónico, el alginato
sódico, poli(etilenglicol), óxido de polietileno, polímero
carboxivinílico y poli(alcohol vinílico). La cantidad de
agente secuestrante útil en la presente memoria está comprendida
entre 0,5 y 20% en peso, preferentemente de 1 a 10% en peso con
respecto al peso total de la formulación, que representa la
cantidad necesaria para impedir la desorción de la proteína de la
matriz polimérica y proporcionar la manipulación apropiada de la
composición, todavía no en tal medida que las células precursoras
impidan la infiltración de la matriz, proporcionando de este modo a
la proteína la oportunidad de ayudar a la actividad de las células
precursoras.
Los componentes opcionales adicionales útiles en
la puesta en práctica de la presente solicitud incluyen, por
ejemplo, protectores criogénicos tales como manitol, sacarosa,
lactosa, glucosa o glicina (para proteger la proteína de la
degradación durante la liofilización), conservantes antimicrobianos
tales como parabenos de metilo y propilo y alcohol bencílico;
antioxidantes tales como EDTA, citrato y BHT (hidroxitolueno
butilado); y tensioactivos tales como poli(sorbatos) y
poli(oxietilenos).
La identificación de los pacientes que necesitan
tratamiento para varias enfermedades incluyendo las enfermedades
osteoporosas u osteopénicas puede realizarse por los procedimientos
que son bien conocidos en la materia. Estos procedimientos incluyen
la medición de la masa/densidad ósea utilizando absorciometría de
energía de rayos X doble (DEXA), Kilgus et al., J. Bone
& Joint Surgery,
75-B:279-287 (1992); Markel et
al., Acta Orthop. Scand., 61:487-498
(1990); y tomografía cuantitativa computerizada (QCT),
Laval-Jeantet et al., J. Comput. Assist.
Tomogr. 17:915-921 (1993); Markel, Calcif.
Tissue Int., 49:427-432 (1991); absorciometría
de un solo fotón, Markel et al., Calcif. Tissue Int.,
48:392-399 (1991); velocidad de transmisión de
ultrasonidos (UTV); Heaney et al., JAMA,
261:2986-2990 (1989); Langton et al.,
Clin. Phys. Physiol. Meas., 11:243-249
(1990); y evaluación radiográfica, Gluer et al., J. Bone
& Mineral Res., 9:671-677 (1994). Otros
métodos de identificación de pacientes en riesgo de fractura ósea
incluyen la evaluación de los factores relacionados con la edad, tal
como el conocimiento, así como la aparición anterior de fracturas
relacionadas con la osteoporosis. Porter et al., BMJ, 301:
638-641 (1990); Hui et al., J. Clin.
Invest. 81:1804-1809 (1988). Las publicaciones
anteriores están incorporadas por la presente memoria como
referencia en la presente memoria.
El régimen de dosificación será determinado por
el médico considerando varios factores que modifican la acción de
la composición, por ejemplo, cantidad de tejido deseado que debe
formarse, el punto de lesión del tejido, el estado del tejido
dañado, el tamaño de la herida, el tipo de tejido dañado, la edad,
sexo y dieta del paciente, la gravedad de cualquier infección, el
tiempo de administración y otros factores clínicos. La dosis puede
variar con el tipo de portador o matriz del vehículo utilizado en la
reconstitución y los tipos de proteínas adicionales o de secuencias
de ADN en la composición. La adición de otros factores de
crecimiento conocidos a la composición final, puede también verse
afectada por la dosis.
La preparación y formulación de dichas
composiciones nucleicas o proteicas fisiológicamente aceptables, con
la debida consideración al pH, isotonicidad, estabilidad y
similares, está dentro de las posibilidades de la técnica. Las
composiciones terapéuticas son también actualmente valiosas para
aplicaciones veterinarias debido a la carencia de la especificidad
de la especie en proteínas TGF-\beta. Los animales
domésticos particularmente y los caballos de cría además de los
seres humanos son los pacientes deseados para dicho tratamiento con
las composiciones de la presente invención.
La evolución puede controlarse mediante
evaluación periódica del crecimiento y/o reparación de la formación
del tejido. La evolución puede controlarse por métodos conocidos en
la materia, por ejemplo, rayos X, artroscopia, determinación
histomorfométricas y marcado con tetraciclina y varios
procedimientos señalados en los ejemplos a continuación.
La invención se ilustra mediante los ejemplos
siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
I
El clon BMP-6 completo define un
marco de lectura abierto de 1539 pares de bases que codifica el
aminoácido 513 hBMP-6. El ADNc de
BMP-6 humano se aisló de un fragmento SalI
del vector BMP-6EMC, y los extremos se
completaron con Vent Polimerasa (New England Biolabs, Beverly, MA).
El vector Adori 1-1 BMP-6 se creó
con la inserción del BMP-6 ADNc en la secuencia de
restricción EcoRV del vector adenovírico Adori
1-1. El montaje final se verificó por la
cartografía de restricción extensa y el secuenciado completo de la
inserción BMP-6. El vector Adori
1-1 EGFP (proteína de fluorescencia verde aumentada)
derivada de un digesto de pEGFP-N1 (CLONTECH
Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) con EcoR1 y Not1 y
el ADNc de EGFP se insertó entre las secuencias EcoR1 y
Not1 de Adori 1-1. El montaje Adori
1-1 EGFP se confirmó por cartografía de restricción
y secuenciado del extremo 5'. La expresión de las transcripciones
hBMP-6 y GFP ARNm se conduce desde el activador
precoz inmediato de citomegalovirus (CMV) y la secuencia
potenciadora. La casete de expresión está situada corriente abajo
del origen SV40 y del potenciador, y las unidades de 0 a 1 map de
tipo adenovírico 5(Ad5). La secuencia donante y aceptora de
corte y empalme de SV40 está situada entre el activador CMV y el
ADNc. Tras la inserción existe un punto poli A de SV40, 9 a 16
unidades map de Ad5 y el origen puc 19.
El adenovirus recombinante E1 y E3 menos de
duplicación defectuosa, tipo 5 (del327) se generó por recombinación
homóloga en células 293 de riñón embrionario humano (ATCC,
Rockville, Maryland). Se generó el virus por cotransfección de los
plásmidos de expresión Adori, descritos anteriormente, y 9 a 36
unidades map del eje central del adenovirus. Se amplió el
adenovirus recombinante y se liberó de las células 293 mediante tres
ciclos de congelación-descongelación. Se purificó
más el virus por centrifugación mediante dos gradientes de cloruro
de cesio y se dializó hasta el equilibrio frente a solución salina
tamponada con fosfato, pH 7,2 a 4ºC. Después de la diálisis, se
añadió glicerol hasta una concentración final del 10% y se almacenó
el virus a -80ºC hasta su utilización. Se determinó la
concentración de virus, expresada en partículas/ml, midiendo la
densidad óptica a 260 mm. Se midieron las concentraciones de
endotoxina mediante la utilización de un kit Limulus Amebocyte
Lysate (BioWhittaker, Walkersville, MD). Se caracterizó más el
virus por ampliación por PCR de la inserción utilizando cebadores
específicos para el vector:
(SEC. ID. nº: 1) Cebador transcrito:
5'-TGGATGTTGCCTTTACTTCTA-3'
(SEC. ID. nº: 2) Cebador complementario:
5'-TTCACTGCATTCTAGTTGTG-3' o
cebadores específicos para BMP-6:
(SEC. ID. nº: 3) Cebador transcrito:
5'-TGTGAACCTGGTGGAGTACG-3'
(SEC. ID. nº: 4) Cebador complementario:
5'-AAGAACCGAGATGGCATTTAGC-3'
Se secuenciaron los productos de PCR para
confirmar la totalidad de la inserción.
La expresión del transgén y la secreción de
BMP-6 madura se confirmaron por marcado metabólico
de las células 293 e inmunoprecipitación con anticuerpo monoclonal
selectivo BMP-6.
Se anestesiaron con pentobarbital (60 mg/kg, IP)
ratones macho C57BU6 (Jackson Lab.) de entre 12 y 16 semanas de
vida. Se aplicó una pomada ocular esterilizada a ambos ojos para su
protección. Se rasuró la extremidad trasera superior derecha hasta
la piel y la piel expuesta se restregó sucesivamente con etanol y
almohadillas Duraprep.
Después de las preparaciones quirúrgicas, se
colocaron los ratones en un área quirúrgica esterilizada. Se
realizó una incisión de 5 a 10 mm dorsal a la cabeza del fémur. Se
insertó una aguja de 1 pulgada de calibre 25 a través de la fosa
del trocante y se impulsó hacia el canal de la médula hasta el fémur
distal. Tras la inserción de la aguja, la aguja practicó una
incisión justo por debajo de la piel. Se cerró la incisión mediante
la utilización de adhesivo quirúrgico Nexaband. Se controló a los
ratones durante el procedimiento quirúrgico para mantener la
anestesia y la temperatura corporal.
Se crearon fracturas de fémur cerradas de manera
similar a la descrita por Bonnarens y Einhom (J. Orthop.
Res. 2:97-101, 1984). El aparato de fractura se
presenta en la Figura 1.
La pata derecha, previamente prendida con
alfileres, de un ratón se colocó fijamente de modo que la mitad del
fémur quedaba entre la etapa de soporte del animal pinchado dos
veces y la cuchilla roma. Se alcanzó un peso de 150 gramos para una
altura de 7,5 cm y a continuación se descendió por debajo del salto.
Se ajustó el aparato de fractura de modo que el desplazamiento del
impacto de la cuchilla roma hacia el fémur fue aproximadamente de 1
mm.
Se retiró cada ratón del aparato de fractura
después de un único traumatismo por impacto y se sometió a análisis
radiográfico mediante la utilización de una cabina de rayos X con
cámara digital (Faxitron X-Ray Corporation;
MX-20). Se radiografiaron los animales para evaluar
tanto la colocación del alfiler intramedular como la calidad de la
fractura. La colocación del alfiler se interpretaba lograda si: i)
la inserción quirúrgica no excedía de cinco minutos por ratón o
necesitaba manipulación animal excesiva; ii) se colocaba el alfiler
en mitad del canal medular; y iii) el alfiler no se doblaba ni se
pegaba en otra parte del fémur. Las fracturas se consideraban
logradas si: i) se producía fractura en el fémur medio; ii) la
fractura era transversal y no fragmentada. A los animales que no
reunían estos criterios se les practicó la eutanasia
inmediatamente.
A los animales que reunían los criterios
radiográficos se les dejó recuperar de una inertización en caliente,
mientras se les controlaba.
A los ratones con fracturas de fémur se les
asignó al azar en dos grupos antes de que se recuperaran de la
anestesia quirúrgica. Los ratones en el grupo 1 recibieron una
inyección de 50 \mul de adenovirus-GFP en la vena
de la cola. Los ratones del grupo 2 recibieron una inyección de 50
\mul de adenovirus-BMP-6 en la
vena de la cola. El número de partículas víricas administradas a
cada animal fue de 5\times10^{10} partículas/inyección. Los
ratones se controlaron dos veces al día antes de la eutanasia
programada los días 5, 7 y 10. En los momentos programados, se
practicó la eutanasia a los ratones y se les sometió a análisis
radiográfico para evaluar la colocación del alfiler y la calidad de
la fractura. Los animales en los que no aparecía la fractura que
han de estabilizarse por el alfiler se descartaron del estudio. Se
extirparon las patas derechas de los restantes ratones. Los
alfileres intramedulares no se retiraron en este periodo y las patas
(menos la piel y el pelo) se fijaron en una solución de formalina
neutra tamponada al 10% (Hidrol. Chemical Co., Yeadon, PA).
Se seccionaron los tejidos y se tiñeron con
hematoxilina y eosina.
\vskip1.000000\baselineskip
Día
5
Un fémur representativo de cada uno de los dos
grupos presentaba los comienzos de un proceso de reparación de la
fractura. El proceso de reparación se manifestó por áreas en la
sección (a una ampliación 2\times) de proliferación celular del
periostio junto a la fractura. A una concentración mayor
(20\times), las áreas de condrogénesis activa, determinadas por
la presencia de condrocitos hipertróficos, eran fácilmente visibles
en el fémur del grupo BMP-6. En cambio, los
condrocitos hipertróficos no se detectaron fácilmente en las áreas
adyacentes a la fractura del grupo GFP. No estaban bien definidas
las callosidades externas el día 5 en ambos grupos.
\vskip1.000000\baselineskip
Día
7
No existía ninguna callosidad externa bien
definida en torno al área de la fractura en un fémur del grupo GFP.
Esta sección parecía similar a la del fémur GFP del día 5. En
cambio, no existía un callo evidente y externo bien definido
alrededor del hueso fracturado del grupo BMP-6.
\vskip1.000000\baselineskip
Día
10
No existía ningún callo externo bien definido en
torno al área de la fractura en un fémur del grupo GFP. A baja
ampliación, esta sección parecía similar a los fémures GFP de los
días 5 y 7. Sin embargo, a mayor ampliación, fue posible observar
que números limitados de células de periostio, junto a la fractura,
eran condrocitos hipertróficos. En cambio, no existía callo externo
obvio y bien definido alrededor del hueso fracturado del grupo
BMP-6. Este callo presentaba pruebas de buena
formación y neovascularización.
Otras áreas del hueso se dañaron durante la
creación de la fractura. Por ejemplo, la cabeza del fémur se pinchó
durante el proceso de inserción del alfiler. Estas áreas adicionales
de hueso dañado también presentaban signos evidentes de un proceso
de reparación/formación del hueso en los fémures del grupo
BMP-6, pero no en los del grupo
GFP.
GFP.
Los datos histológicos demuestran que
BMP-6 generalizada, segregada principalmente de
hepatocitos, puede acelerar la reparación de la fractura.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
II
(Anterior a la presente invención y
no ilustrativo de la misma pero necesario para comprender la
utilidad de la
invención)
Se realizaron varios experimentos independientes
para evaluar los efectos osteógenos de un vector adenovírico
hBMP-6. En estos experimentos, se inyectó por vía
intramuscular a ratones hembra C57BI/6 SCID o inmunocompetentes, en
ambos músculos de los cuádriceps, una sola dosis de adenovirus que
codifica a hBMP-6 o GFP (1 a 2,5\times10^{10}
partículas/inyección). Se sacrificaron los ratones de cada grupo
experimental en varios puntos de tiempo (normalmente uno o dos)
después de la inyección. Se recogieron los tejidos, se fijaron en
formalina y se tiñeron con hematoxilina y eosina para la
histopatología. En todos los experimentos, hBMP-6
produjo formación del hueso endocondrial en los músculos
procedentes de ratones inmunodeficientes y en menor extensión
inmunocompetentes. Lo expuesto a continuación describe los
resultados obtenidos a partir de un experimento en el que se
utilizaron ratones inmunodeficientes y se recogieron los tejidos en
cinco puntos de tiempo tras la inyección.
Se dividieron en dos grupos los ratones C57BU6
SCID hembra (Jackson Lab.) para estudiar los efectos anabólicos de
hBMP-6 sobre el hueso. Se anestesió brevemente a
todos los ratones con inhalación de isoflurano. La anestesia fue
seguida de una inyección intramuscular de
adenovirus-GFP o
adenovirus-BBMP-6 en ambos músculos
de los cuádriceps de cada ratón. Se inyectó a cada músculo del
cuádriceps 1,25\times10^{10} partículas de virus en un volumen
de 25 microlitros. Los ratones se enjaularon de cinco en cinco en
una jaula con una dieta normal de pienso y agua y se sometieron a
eutanasia grupos de animales los días 2, 3, 4, 7 y 14. Se disecaron
ambos músculos de los cuádriceps y se extirparon de los animales y
se fijaron en una solución de formalina al 10% tamponada neutra
(Hydrol Chemical Co., Yeadon, PA). El día 14 se sometió a los
ratones a análisis por rayos X mediante la utilización de una
cabina de rayos X con cámara digital (Faxitron X-Ray
Corporation; MX-20). Este grupo de animales se
radiografió para evaluar la formación del hueso ectópico en los
músculos de los cuádriceps.
Se colocaron muestras de músculo seleccionadas
aparte y se aisló el ARN completo mediante la utilización de los
kits RNAgents y RNeasy (Promega y Qiagen, respectivamente). Se
utilizó el kit RNAgents según la recomendación del fabricante hasta
e incluyendo la precipitación del ARN mediante la utilización de
isopropanol. Se lavó el isopropanol del sedimento de ARN mediante
la utilización de una solución de etanol al 75%. Se recogió el ARN
completo mediante la utilización de una microcentrifugadora y se
disolvió el sedimento en tampón de lisis del kit RNeasy. Se realizó
la purificación del ARN según las recomendaciones del fabricante. El
ARN completo se eluyó con agua y se determinó la concentración
mediante la utilización de un espectrofotómetro.
Se utilizó RT-PCR para medir las
concentraciones relativas de GFP y BMP-6. Se realizó
la RT-PCR mediante la utilización de un ABI PRISM
7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Los cebadores y
las sondas estaban basados en una secuencia nucleotídica, situada
dentro de la secuencia SV40 poly A, común tanto a los montajes
adenovíricos GFP como BMP-6. Los cebadores y sondas
utilizados fueron los siguientes:
(SEC. ID. nº: 5) Cebador transcrito:
5'-GACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGG-3'
\vskip1.000000\baselineskip
(SEC. ID. nº: 6) Cebador complementario:
5'-GCAATAGCATCACAAATTTCACAAAT-3'
\vskip1.000000\baselineskip
(SEC. ID. nº: 7) Sonda Taqman:
5'-CAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTT-3'
\vskip1.000000\baselineskip
Antes de llevar a cabo la
RT-PCR, todas las muestras de ARN completo se
sometieron al tratamiento con ADNasa exenta de ARNasa para eliminar
las cantidades residuales de ADN genómico. Se utilizó el kit Taqman
EZ RT-PCR CORE REAGENTS (Perkin Elmer) según las
instrucciones del fabricante. La PCR tuvo lugar en soluciones de 50
\mul que contenían 50 ng de ARN completo y 5 \muM de sonda y
cebadores. Las condiciones de la PCR fueron las siguientes:
- Etapa 1:
- 50ºC durante 2 min.
- \quad
- 60ºC durante 30 min.
- Etapa 2:
- 95ºC durante 5 min.
- Etapa 3:
- 95ºC durante 15 s. \times 40
- \quad
- 60ºC durante 1 min.
Este análisis demostró la expresión local de
ARNm para GFP y BMP-6 en músculos de los
cuádriceps.
Se seccionaron los tejidos y se tiñeron con
hematoxilina y eosina.
La inyección de adenovirus-GFP
no condujo a la formación de hueso ectópico en el músculo como se
evaluó por inspección visual del músculo, radiografías por rayos X
e histología. El análisis histológico de las secciones de tejido
pusieron de manifiesto inflamación aguda y subaguda que estaba
caracterizada por infiltración de neutrófilos, linfocitos y
macrófagos. Esta infiltración celular se detectó tan pronto como el
día 2, apareció un pico los días 4 y 7 y pareció que estaba
resuelta el día 14. Además de la infiltración celular, existían
también pruebas de edema y de generación de la fibra del músculo
esquelético los días 3 y 4 y regeneración de la fibra del músculo
los días 7 y 14.
La inyección de
adenovirus-BMP-6 condujo a la
formación de hueso ectópico en el músculo evaluada por inspección
visual del músculo, radiografías por rayos X e histología. Fue
posible detectar un aumento de tamaño del músculo tan pronto como
el día 4 tras la inyección. Las imágenes por rayos X mostraron la
presencia de masas radio-opacas en los músculos de
los animales el día 14. El análisis histológico de las secciones de
tejido puso de manifiesto inflamación aguda los días 2 y 3. Se
observó proliferación de células mesenquimáticas los días 4, 7 y 14.
El tejido cartilaginoso resultaba patente los días 7 y 14 y la
formación de hueso notable se identificó claramente el día 14.
Estos datos demuestran que la administración
intramuscular de adenovirus-BMP-6
produce formación de hueso endocondrial.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
III
Se utilizó el modelo de conejo ulna para
determinar si podría utilizarse la inyección percutánea de
adenovirus que contiene ADNc de BMP-6 para acelerar
la curación de la osteotomía. Este modelo se ha utilizado como
modelo de identificación para demostrar la aceleración de la
curación de la osteotomía en respuesta a la implantación quirúrgica
del rhBMP-2 en una esponja de colágeno y en un
portador de fosfato cálcico.
Se crearon osteotomías de 1 a 2 mm ulna
medio-diafíticas bilaterales en 18 conejos macho
adultos. Después de la intervención quirúrgica, se inyectaron por
vía percutánea 200 ml que contenían 1 \times 10^{12} partículas
de adenovirus/BMP-6 en una osteotomía en 12
animales. Un volumen similar que contiene el mismo número de
partículas de adenovirus/GFP se inyectó en una osteotomía en los 6
animales restantes. Los animales con adenovirus/GFP sirvieron como
referencia para el efecto de administrar adenovirus sin ADNc de
BMP-6. En ambos grupos la osteotomía contralateral
sirvió como referencia quirúrgica sin tratar. Se administraron
también inyecciones intramusculares de adenovirus/GFP en numerosos
animales para validar la eficacia del sistema de vector vírico para
expresar el ADNc administrado. A seis de los animales en el grupo de
adenovirus/BMP-6 se les practicó la eutanasia 6
semanas y 8 semanas después de la intervención quirúrgica. Se
practicó la eutanasia a los animales del grupo de adenovirus/GPF 6
semanas después de la intervención quirúrgica. Las medidas
resultantes incluían radiografía en serie, biomecánica de torsión,
histología y expresión de GFP.
La evaluación histológica de las inyecciones
intramusculares de adenovirus-GFP verificaron que
existía expresión de ADNc después de la inyección vírica. Las
radiografías en serie pusieron de manifiesto la presencia de callo
mineralizado ya a las dos semanas después de la inyección de
adenovirus/BMP-6 (tres semanas después de crear la
osteotomía). A las 6 semanas después de crear la osteotomía existía
un puente de callo mineralizado a través de la zona de la
osteotomía en todos los animales inyectados con
adenovirus/BMP-6. La osteotomía se puenteó y la
osteotomía ya no resultó visible en las patas con
adenovirus/BMP-6 8 semanas después de crear la
osteotomía. La aparición de hueso mineralizado y de callo
cruzándolo se retardó en las osteotomías quirúrgicas de control y
las osteotomías inyectadas con adenovirus/GFP. Todo el control
quirúrgico y los limbos inyectados con adenovirus/GFP presentaban
líneas de osteotomía visibles a las 8 semanas.
La resistencia a la torsión máxima y las
osteotomías con rigidez fueron mayores en las patas con
adenovirus/BMP-6 en comparación con las patas de
control quirúrgico contralaterales en ambas semanas 6 y 8 después de
crear la osteotomía (Tabla 1 y 2). La resistencia máxima a la
torsión y la rigidez en las osteotomías con
adenovirus/BMP-6 eran equivalentes al modelo ulna
de conejo normal en ambos puntos de tiempo. La resistencia a la
torsión máxima para los controles quirúrgicos contralaterales fue
del 44% y del 66% del valor para modelos ulnas de conejo 6 y 8
semanas después de crear la osteotomía. La resistencia a la torsión
fue del 56% y del 72% del valor para modelos ulnas de conejo 6 y 8
semanas después de crear la osteotomía. La resistencia a la torsión
y la rigidez fueron similares en las patas con adenovirus/GFP en
comparación con los controles quirúrgicos contralaterales a las 6
semanas después de crear la osteotomía.
Los resultados de este estudio indican que la
inyección percutánea de adenovirus/BMP-6
administrada una semana después de la intervención quirúrgica
acelera la curación de la osteotomía en el modelo ulna de conejo. No
existió ningún efecto de administración de adenovirus sin
BMP-6. La utilización de adenovirus que contiene
ADNc para BMP-6 representa un tratamiento potencial
inyectable para acelerar la reparación de la fractura cerrada en
seres humanos.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
<110> Wyeth
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> COMPOSICIONES PARA LA ADMINISTRACIÓN
SISTÉMICA DE SECUENCIAS QUE CODIFICAN PROTEÍNAS ÓSEAS
MORFOGENÉTICAS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130>
08702-0095-00304
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2002-05-31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/295,153
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2001-06-01'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> citomegalovirus
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggatgttgc ctttacttct a
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de simio 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttcactgcat tctagttgtg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtgaacctg gtggagtacg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipaagaaccgag atggcattta gc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 5
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<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de simio 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgacatgataa gatacattga tgagtttgg
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de simio 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipgcaatagcat cacaaatttc acaaat
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de simio 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaaaccacaa ctagaatgca gtgaaaaaaa tgctt
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (9)
1. Utilización de una composición que comprende
una secuencia de ADN que codifica una proteína ósea morfogenética
(BMP) en la preparación de un medicamento para estimular la
osteogénesis en un paciente mediante la administración sistémica
del mismo.
2. Utilización de una composición que comprende
una secuencia de ADN que codifica una proteína ósea morfogenética
(BMP) en la preparación de un medicamento para la curación de una
fractura en un paciente mediante la administración sistémica del
mismo.
3. Utilización de una composición que comprende
una secuencia de ADN que codifica una proteína ósea morfogenética
(BMP) en la preparación de un medicamento para aumentar la densidad
mineral ósea en un paciente mediante la administración sistémica de
una cantidad eficaz del mismo.
4. Utilización de una composición que comprende
una secuencia de ADN que codifica una proteína ósea morfogenética
(BMP) en la preparación de un medicamento para tratar la
osteoporosis en un paciente mediante la administración sistémica de
una cantidad eficaz del mismo.
5. Utilización de una secuencia de ADN que
codifica una proteína 6 ósea morfogenética (BMP-6)
en un vector adecuado en la preparación de una composición para
estimular la reparación de una fractura en un paciente necesitado
de la misma, en la que dicho medicamento se administra
sistemáticamente.
6. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en la que dicha proteína ósea morfogenética
se selecciona de entre el grupo constituido por
BMP-2, BMP-4, BMP-5,
BMP-6, BMP-7,
BMP-10, BMP-12,
BMP-13, BMP-15,
BMP-16 y las combinaciones de las mismas.
7. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en la que dicha proteína ósea morfogenética
es la BMP-6.
8. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en la que dicha secuencia de ADN está
contenida en un vector de adenovirus.
9. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en la que dicha proteína ósea morfogenética
resulta adecuada para la administración sistémica.
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