ES2305545T3 - Procedimiento de reproduccion de pleuromutilinas. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento de preparación de una o más pleuromutilinas que comprende las etapas de: a) cultivo de un microorganismo que produzca pleuromutilinas en un medio de cultivo líquido; b) extracción de las pleuromutilinas del medio de cultivo no filtrado con un disolvente orgánico no miscible con agua que es 4-metil-2-pentanona (MIBK); c) concentración de las pleuromutilinas extraídas; d) cristalización directa de las pleuromutilinas en MIBK y un disolvente miscible no polar que es heptano.
Description
Procedimiento de reproducción de
pleuromutilinas.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la preparación de una o más pleuromutilinas, de
forma particular pleuromutilina.
La pleuromutilina, el compuesto de fórmula (1),
es un antibiótico de origen natural que tiene actividad
antimicoplasma y actividad antibacteriana modesta. La mutilina y
otros compuestos con un OH libre en el C-14 son
inactivos. Se ha investigado el impacto de modificación adicional en
el C-14 sobre la actividad de la pleuromutilina. Se
ha demostrado que la actividad antimicrobiana se puede mejorar
reemplazando el resto éster glicólico en la posición 14 por un
grupo R-X-CH_{2}CO_{2}, donde R
es un resto alifático o aromático y X es O, S o NR' (H Egger y H
Reinshagen, J. Antibiotics, 1976, 29, 923). La tiamulina, el
compuesto de fórmula (2), que se usa como un anticuerpo
veterinario, es un derivado de este tipo (G Hogenauer en
Antibiotics, volumen V, parte 1, ed. F E Hahn, editorial
Springer-Verlag, 1979, página 344).
En esta solicitud se usa el sistema de
numeración no convencional usado por lo general en la bibliografía
(G Hogenauer, loc. cit.).
Más recientemente se han descrito más
pleuromutilinas que tienen la fórmula general (3).
Por ejemplo, el documento WO 97/25309
(SmithKline Beecham) describe modificación adicional del grupo
aciloxi, describiendo derivados de
14-O-carbamoílo en los que el átomo
de N del grupo carbamoílo está no sustituido, mono- o
di-sustituido.
El documento WO 98/05659 (SmithKline Beecham)
describe derivados de
14-O-carbamoílo en los que el átomo
de N del grupo carbamoílo está acilado con un grupo que incluye un
resto azabicíclico.
El documento WO 99/21855 (SmithKline Beecham)
describe derivados adicionales en los que el resto éster glicólico
en la posición 14 está reemplazado por el grupo
R^{2}(CH_{2})_{m}X(CH_{2})_{n}CH_{2}COO-
en el que R^{2} es un grupo mono o bicíclico no aromático.
El documento WO 00/27790 (SmithKline Beecham)
describe derivados de acilcarbamato espirocíclico en
C-14, carboxilato de heteroarilalquilo o
carboxilato de arilalcoxialquilo.
El documento WO 00/37074 (SmithKline Beecham)
describe derivados adicionales que tienen un sustituyente acetato
de heteroarilo en la posición C-14.
El documento WO 00/73287 (SmithKline Beecham)
describe derivados adicionales que tienen un sustituyente
carboxilato de isoxazolina en la posición C-14.
El documento WO 01/14310 (SmithKline Beecham)
describe derivados adicionales que tienen un sustituyente
\beta-cetoéster en la posición C-14.
\beta-cetoéster en la posición C-14.
El documento WO 01/74788 (SmithKline Beecham)
describe derivados de carbamato de
2-hidroximutilina.
El documento WO 02/12199 (SmithKline Beecham)
describe derivados que tienen un sustituyente éster heterocíclico
en la posición C-14.
El documento WO 02/30929 (SmithKline Beecham)
describe derivados que tienen un sustituyente de carbamato de
oxicarbonilo en la posición C-14.
El documento WO 02/38528 (SmithKline Beecham)
describe derivados que tienen una malonamida o sustituyente éster
malónico en la posición C-14.
Además se describe
19,20-dihidro-2\alpha-hidroxi-mutilina
por parte de G. Schulz y H. Berner en Tetrahedron, 1984, volumen
40, páginas 905 a 917, y se describe una pluralidad de derivados
C-14 de éter, carbamato, amida y urea por parte de
Brooks y col. en Bioorg. Med. Chem., 2001, volumen 9, páginas 1221 a
1231.
Palma y col., Proceedings of European Congress
Biotechnology, volumen 1, 1984, páginas 533 a 542 describe el
aislamiento de metabolitos relacionados con pleuromutilina en
cultivos sumergidos de distintas especies de Clitopilus mediante
extracción y cromatografía líquida.
La pleuromutilina se puede producir mediante la
fermentación de microorganismos tales como especies de
Clitopilus, especies de Octojuga y especies de
Gerronema. Estos organismos pueden producir también una
pluralidad de pleuromutilinas relacionadas, por ejemplo,
14-acetato de mutilina. Esas otras pleuromutilinas
son producidas a niveles variables que dependen del organismo y de
las condiciones de cultivo (F. Knauseder y E Brandl, Pleuromutilins:
Fermentation, Structure and Biosynthesis, J. Antibiotics, 1976, 29,
125 a 131), pero de forma típica son menos abundantes que la
pleuromutilina.
Tras la fermentación la pleuromutilina y las
otras pleuromutilinas están presentes tanto en el medio de
fermentación como dentro de las células del microorganismo. Se
describen procedimientos conocidos para la extracción y
subsiguiente purificación de pleuromutilinas en las patentes de
Estados Unidos 4.092.424, 4.129.721, 4.247.542, patente de Gran
Bretaña 1.197.942 y publicados en documentos tales como Antibiotic
Substances de Basidiomycetes VIII, F. Kavanagh y col., Proc.
N.A.S., 1951, 570 a 574. Los procedimientos incluyen extracción del
caldo filtrado con un disolvente inmiscible con agua, por ejemplo,
tolueno, acetato de etilo o cloroformo. También se describen
extracciones de pleuromutilinas en el cultivo micelio con un
disolvente miscible con agua, por ejemplo, acetona, seguido de
extracción con un disolvente inmiscible con agua, por ejemplo,
acetato de etilo. Las pleuromutilinas se cristalizan
subsiguientemente en el disolvente orgánico. Las desventajas de
estos procedimientos es que requieren la separación del caldo de
fermentación cultivado en agregado micelial y líquido de cultivo
para extracción individual.
De acuerdo con lo anterior hay una necesidad de
proporcionar un procedimiento mejorado para la extracción de
pleuromutilinas, de forma particular pleuromutilina, seguido de
fermentación que proporcione una extracción eficiente adecuada a
las operaciones industriales a gran escala.
La solución a este problema se proporciona con
un procedimiento que comprende extracción de todo el medio de
cultivo no filtrado o caldo de fermentación, es decir, tanto el
líquido de fermentación como el micelio, con un disolvente orgánico
inmiscible con agua con gran especificidad por la extracción de
pleuromutilinas.
Esto da lugar a un producto de gran pureza que
se puede cristalizar directamente sin necesidad de etapas de
purificación intermedias. Así los beneficios y mejoras de este
procedimiento incluyen algunas etapas de procesamiento con altos
rendimientos ya que se recuperan las pleuromutilinas presentes tanto
en el micelio como en el sobrenadante.
Por tanto se describe un procedimiento para la
preparación de una o más pleuromutilinas que comprende las etapas
de:
- a)
- cultivo de un microorganismo que produce pleuromutilinas en un medio de cultivo líquido; y
- b)
- extracción de las pleuromutilinas del medio de cultivo no filtrado con un disolvente orgánico inmiscible con agua.
Las pleuromutilinas resultantes se purifican
preferiblemente adicionalmente, por ejemplo, mediante
cristalización. Por tanto la presente invención proporciona un
procedimiento para la preparación de una o más pleuromutilinas que
comprende las etapas de:
- a)
- cultivo de un microorganismo que produzca pleuromutilinas en un medio de cultivo líquido;
- b)
- extracción de las pleuromutilinas del medio de cultivo no filtrado con un disolvente orgánico inmiscible con agua que es 4-metil-2-pentanona (MIBK);
- c)
- concentración de las pleuromutilinas extraídas; y
- d)
- cristalización directa de las pleuromutilinas en MIBK y un disolvente no polar miscible que es heptano.
De forma adicional las pleuromutilinas extraídas
se pueden descolorear antes de la cristalización usando, por
ejemplo, carbón activado. La descolorización se puede llevar a cabo
bien después de haber extraído las pleuromutilinas del medio de
cultivo no filtrado (etapa b) o bien una vez se han concentrado las
pleuromutilinas extraídas (etapa c). Preferiblemente la
descoloración se lleva a cabo una vez se han concentrado las
pleuromutilinas extraídas (etapa c).
Los microorganismos que producen pleuromutilinas
pueden ser cualquier microorganismo capaz de producir una o más
pleuromutilinas. Preferiblemente el microorganismo que produce
pleuromutilinas usado en el procedimiento de la presente invención
es una especie de Clitopilus, por ejemplo Clitopilus
passeckerianus NRRL 3100/DSM 1602, Clitopilus
passeckerianus CBS 299.35, Clitopilus passeckerianus CBS
330.85, Clitopilus pinsitus CBS 623.70 o Clitopilus
hobsonii CBS 270.36 (también conocido como una especie de
Octojuga, por ejemplo Octojuga pseudopinsitus); una
especie de Gerronema, por ejemplo, Gerronema
josserandii CBS 309.36; o un mutante de cualquiera de estas
especies. El microorganismo que produce pleuromutilinas puede ser
también una especie de Pasthyrella, por ejemplo
Psathyrella subatrata CDS 325.39, o un mutante de tal
especie. Es particularmente preferida una especie de
Clitopilus o un mutante del mismo, especialmente
Clitopilus passeckerianus NRRL 3100 o un mutante del mismo.
Los mutantes se pueden preparar por medios convencionales, por
ejemplo mediante mutagénesis UV o química.
Los microorganismos se pueden cultivar mediante
técnicas de cultivo por fermentación bien conocidas por los
especialistas en la técnica tales como las descritas en la patente
de Estados Unidos 4.092.424.
En el procedimiento de la presente invención el
disolvente orgánico inmiscible con agua es una cetona alifática
inmiscible con agua que es
4-metil-2-pentanona
(MIBK).
La extracción se puede realizar de
aproximadamente 10ºC a aproximadamente 50ºC. Preferiblemente la
extracción se realiza a aproximadamente 20ºC. El pH de la solución
acuosa antes de la extracción debería estar en el intervalo de 3 a
9. Preferiblemente el pH está próximo a la neutralidad, por ejemplo,
pH 6 a 8, más preferiblemente pH 6,9 \pm 0,2. Se puede ajustar el
pH del medio mediante adición de un ácido o base adecuado, por
ejemplo, ácido acético o hidróxido de sodio.
Por lo general se pueden usar intervalos de
relación de 4:1 a 1:4 equivalentes en volumen de disolvente orgánico
a medio de cultivo no filtrado para la extracción. La relación
preferida es 1:2 de disolvente orgánico a medio de cultivo no
filtrado.
En una realización del presente procedimiento,
el disolvente y el medio de cultivo no filtrado se pueden mezclar
en línea mediante colisión de las dos corrientes y paso a través de
un tubo con deflectores o mezclador mecánico. Se pueden separar
luego las fases haciéndolas pasar a través de un separador
centrífugo tal como una centrífuga de discos apilados o
preferiblemente una decantador para extracción/separación combinado
tal como un decantador de espiral (contracorriente).
De forma alternativa la extracción se puede
llevar a cabo agitando las dos fases en un tanque y dejando que
sedimenten las fases reunidas con gravedad o usando una columna de
extracción en contracorriente o dispositivo similar que provoque el
contacto íntimo entre las dos fases y subsiguiente separación.
Después de la separación de la fase orgánica se
puede llevar a cabo la concentración del extracto mediante
reducción del volumen del disolvente a vacío o mediante otros
procedimientos bien conocidos por los especialistas en la técnica.
Después de la reducción del volumen se pueden cristalizar las
pleuromutilinas en el extracto concentrado. Las pleuromutilinas se
pueden cristalizar directamente en tolueno o MIBK. Las
cristalizaciones en MIBK de acuerdo con la invención se llevan a
cabo con la adición de un disolvente no polar miscible que es
heptano.
La concentración de la solución de tolueno usada
para cristalización puede ser de 10% a 50% en p/p. La temperatura
inicial del tolueno es preferiblemente de 60ºC a 70ºC, seguido de
enfriamiento de 0ºC a 5ºC durante 8 a 10 horas hasta cristalización
completa.
La concentración de la solución de MIBK usada
para cristalización puede ser de 20% a 50% en p/p, preferiblemente
de 35 a 40% en p/p. La temperatura inicial de MIBK es por lo general
de 45ºC a 60ºC, especialmente de 50 a 55ºC, se enfría de 25ºC a
35ºC, especialmente aproximadamente 30ºC, para iniciar la
cristalización. Se pueden añadir hasta aproximadamente 2 volúmenes
de heptano para ayudar en la cristalización. Preferiblemente se
añaden de 1 a 1,5 volúmenes. Se puede añadir heptano durante 15
minutos a 1 hora. Tras la adición de heptano se enfría
preferiblemente la mezcla de cristalización hasta 0 a 5ºC pero puede
mantenerse a temperatura ambiente.
Como se describió anteriormente, antes de la
cristalización, el extracto o concentrado de pleuromutilinas se
puede descolonizar opcionalmente usando carbón activado. Por
ejemplo, el concentrado de mutilina se puede tratar por lotes con
carbón vegetal en polvo o granulado, o ser pasado a través de un
cartucho, columna o lecho filtrante empaquetado con carbón vegetal.
Se usa normalmente una relación de hasta 1:15 de
carbono:pleuromutilinas en p/p. La concentración de pleuromutilinas
en MIBK para la etapa de descolorización puede ser de 1 a 40%,
preferiblemente de 7 a 20% en p/'p. En el caso de tratamiento por
lotes se puede usar un carbón activado tal como Norit GSK (Norit UK
Ltd., Clydesmill Place, G32 8RF, R.U.).
El producto cristalizado preparado de acuerdo
con el procedimiento de la presente invención puede comprender una
o más pleuromutilinas. Por lo general el producto cristalizado es
pleuromutilina que puede contener pleuromutilinas menos implicadas
además de pleuromutilina, de forma particular
14-acetato de mutilina. Se puede usar el producto
cristalizado para preparar derivados de pleuromutilinas
semi-sintéticos sin más purificación. Por ejemplo,
se puede hidrolizar una mezcla de pleuromutilina y
14-acetato de mutilina en mutilina, que se puede
usar luego como un material de partida sintético. No obstante el
procedimiento de la presente invención se usa preferiblemente para
producir pleuromutilina. De acuerdo con lo anterior, el producto de
pleuromutilinas cristalizadas se puede purificar adicionalmente
mediante procedimientos tales como recristalización, por ejemplo,
recristalización en acetato de etilo y heptano o en MIBK y
heptano.
En una realización de la presente invención se
puede eliminar de forma selectiva 14-acetato de
mutilina del producto de pleuromutilinas mediante recristalización
en acetato de etilo y heptano. La concentración de pleuromutilinas
en acetato de etilo para cristalización puede ser de 20 a 40% en
p/p, preferiblemente de 20 a 30% en p/p, especialmente
aproximadamente 30% en p/p. La temperatura inicial para el
procedimiento es preferiblemente de 45ºC a 50ºC, se enfría de 15ºC
a 25ºC, especialmente aproximadamente 20ºC, para iniciar la
cristalización, seguido de adición de heptano y enfriamiento
adicional hasta temperatura ambiente, o preferiblemente de 0 a 5ºC.
Se puede añadir de 0 a 2 volúmenes de heptano, preferiblemente de 1
a 1,5 volúmenes para ayudar a la cristalización. El heptano se
añade forma típica durante un periodo de 15 minutos a 1 hora, pero
se puede añadir más lentamente.
En una realización adicional de la presente
invención se puede eliminar de forma selectiva
14-acetato de mutilina del producto de
pleuromutilinas mediante recristalización en MIBK y heptano. Cuando
se ha llevado a cabo la extracción y cristalización inicial usando
MIBK, el uso de MIBK en la etapa de recristalización tiene la
ventaja de que la recristalización se puede llevar a cabo bien
sobre el producto seco o in situ sobre la torta húmeda (es
decir, el producto de pleuromutilinas obtenido directamente de la
cristalización, antes del secado) sin generar una mezcla compleja
de disolventes. La concentración de la solución de MIBK usada para
recristalización puede ser de 20% a 45% en p/p, preferiblemente de
35 a 45% en p/p. La temperatura inicial de MIBK es por lo general
de 45ºC a 65ºC, especialmente aproximadamente 60ºC. Se pueden añadir
hasta aproximadamente 2 volúmenes de heptano para ayudar a la
cristalización. Se añaden preferiblemente de 1 a 1,5 volúmenes. Se
puede añadir heptano durante 10 minutos a 1 hora, preferiblemente
durante 10 minutos a 30 minutos. Después de la adición de heptano
se enfría preferiblemente la mezcla de cristalización hasta 0 a
5ºC.
En una realización preferida del procedimiento
se usan las pleuromutilinas preparadas de acuerdo con el
procedimiento de la presente invención para preparar los derivados
de pleuromutilinas semi-sintéticos descritos en el
documento WO 99/21855. Por tanto las pleuromutilinas preparadas de
acuerdo con el procedimiento de la presente invención se usan
preferiblemente para preparar un derivado de pleuromutilinas
semi-sintético de fórmula general (4A) ó (4B):
en las
que:
- \quad
- cada n y m es independientemente 0, 1 ó 2;
- \quad
- X se selecciona de -O-, -S-, -S(O)-, -SO_{2}-, -CO-O-, -NH-, -CONH-, -NHCONH- y un enlace;
- \quad
- R^{7} es vinilo o etilo;
- \quad
- R^{8} es un grupo monocíclico o bicíclico no aromático opcionalmente sustituido que contiene uno o dos átomos de nitrógeno básicos y está unido por un átomo de carbono del anillo;
- \quad
- R^{9} es H o OH, o
- \quad
- el resto R^{8}(CH_{2})_{m}X(CH_{2})_{n}CH_{2}COO en la posición 14 de (4A) ó (4B) está reemplazado por R^{a}R^{b}C=CHCOO en la que uno de R^{a} y R^{b} es hidrógeno y el otro es R^{8} o R^{a} y
- \quad
- R^{b} conjuntamente forman R^{8-}; o
una sal farmacéuticamente aceptable
del
mismo.
Cuando R^{8} es monocíclico contiene de forma
típica de 4 a 8 átomos de anillo, y, cuando es bicíclico, contiene
de forma típica de 5 a 10 átomos de anillo en cada anillo, y está
opcionalmente sustituido con hasta 3 sustituyentes. Sustituyentes
adecuados incluyen alquilo, alquiloxi, alquenilo y alqueniloxi, cada
uno puede estar portado por un átomo de carbono cabeza de puente o
un átomo de carbono no cabeza de puente. Además el o cada átomo de
nitrógeno puede estar sustituido con oxígeno formando un N-óxido, o
con mono- o dialquilo, en cuyo caso se apreciará que se puede
formar un catión cuaternario. El contraión puede ser un ión haluro
tal como cloruro o bromuro, preferiblemente cloruro. El sistema de
anillo aza puede contener adicionalmente uno o más enlaces
dobles.
Grupos bicíclicos y monocíclicos representativos
para R^{8} incluyen piperidinilo, pirrolidilo, quinuclidinilo,
azabiciclo[2,2,1]heptilo,
azabiciclo[4,3,0]nonilo,
azabiciclo[3,2,1]octilo,
azabiciclo[3,3,0]octilo,
azabiciclo[2,2,2]octilo,
azabiciclo[3,2,1]octenilo,
azabiciclo[3,3,1]nonilo y
azabiciclo[4,4,0]decilo, todos ellos pueden estar
sustituidos o no sustituidos. Ejemplos preferidos para R^{8}
incluyen quinuclidinilo.
Preferiblemente n es 0. Preferiblemente m es 0 ó
1.
Compuestos preferidos son aquellos de fórmula
(4A).
Grupos alquilo y alquenilo designados en esta
invención con referencia a la fórmula (4A) ó (4B) incluyen grupos
de cadena lineal o ramificada que contienen hasta seis átomos de
carbono y están opcionalmente sustituidos con uno o más grupos
seleccionados del grupo constituido por arilo, heterociclilo, alcoxi
(C_{1-6}), alquil
(C_{1-6})-tio, arilalcoxi
(C_{1-6}), arilalquil
(C_{1-6})-tio, amino, mono- o
dialquil (C_{1-6})-amino,
cicloalquilo, cicloalquenilo, carboxi y ésteres de los mismos,
amidas de carboxi, ureido, carbamimidoílo (amidino), guanidino,
alquil-sulfonilo, amino-sulfonilacil
(C_{1-6})-oxi, acil
(C_{1-6})-amino, azido, hidroxi y
halógeno.
Grupos cicloalquilo y cicloalquenilo designados
en esta invención en referencia a la fórmula (4A) ó (4B) incluyen
grupos que tienen de tres a ocho átomos de carbono del anillo y
están opcionalmente sustituidos como se describe anteriormente en
esta invención para grupos alquilo y alquenilo.
Cuando se usa en esta invención en referencia a
la fórmula (4A) ó (4B), el término "arilo" significa anillos
simples o condensados que contienen de forma adecuada de 4 a 7,
preferiblemente 5 ó 6 átomos de anillo en cada anillo, tales
anillos pueden estar no sustituidos o sustituidos, por ejemplo, con
hasta tres sustituyentes. Un sistema de anillo condensado puede
incluir anillos alifáticos y necesita incluir sólo un anillo
aromático. Grupos arilo representativos incluyen fenilo y naftilo
tales como 1-naftilo o
2-naftilo.
De forma adecuada cualquier grupo arilo,
incluyendo fenilo y naftilo, pueden estar opcionalmente sustituidos
con hasta cinco, preferiblemente hasta tres sustituyentes.
Sustituyentes adecuados incluyen halógeno, alquilo
(C_{1-6}), arilo, arilalquilo
(C_{1-6}), alcoxi (C_{1-6}),
alcoxi (C_{1-6})-alquilo
(C_{1-6}), haloalquilo
(C_{1-6}), arilalcoxi (C_{1-6}),
hidroxi, nitro, ciano, azido, amino, mono- y
di-N-alquil
(C_{1-6})-amino, acilamino,
arilcarbonilamino, aciloxi, carboxi, sales de carboxi,
carboxiésteres, carbamoílo, mono- y
di-N-alquil
(C_{1-6})-carbamoílo, alcoxi
(C_{1-6})-carbonilo,
ariloxicarbonilo, ureido, guanidino, sulfonilamino, aminosulfonilo,
alquil (C_{1-6})-tio, alquil
(C_{1-6})-sulfinilo, alquil
(C_{1-6})-sulfonilo, heterociclilo
y heterociclilalquilo (C_{1-6}). Además pueden
estar unidos dos átomos de carbono del anillo adyacentes por una
cadena de alquileno (C_{1-6}) para formar un
anillo carbocíclico.
Cuando se usa en esta invención en referencia a
la fórmula (4A) ó (4B), los términos "heterociclilo" y
"heterocíclico" incluyen de forma adecuada, a menos que se
defina de otro modo, anillos aromáticos y no aromáticos, simples y
condensados, que contienen de forma adecuada hasta cuatro
heteroátomos en cada anillo, seleccionándose cada uno de ellos de
oxígeno, nitrógeno y azufre, tales anillos pueden estar no
sustituidos o sustituidos con, por ejemplo, hasta tres
sustituyentes. Cada anillo heterocíclico tiene de forma adecuada de
4 a 7, preferiblemente de 5 a 6 átomos de anillo. Un sistema de
anillo heterocíclico condensado puede incluir anillos carbocíclicos
y necesita incluir sólo un anillo heterocíclico.
\newpage
Se seleccionan sustituyentes preferidos para un
grupo heterocíclico de halógeno, alquilo
(C_{1-6}), arilalquilo
(C_{1-6}), alcoxi (C_{1-6}),
alcoxi (C_{1-6})-alquilo
(C_{1-6}), haloalquilo
(C_{1-6}), hidroxi, amino, mono- y
di-N-alquil
(C_{1-6})-amino, acilamino,
carboxi, sales de carboxi, carboxiésteres, carbamoílo, mono- y
di-N-alquil
(C_{1-6})-carbonilo,
ariloxicarbonilo, alcoxi
(C_{1-6})-carbonilo, alquilo
(C_{1-6}), arilo, grupo oxi, ureido, guanidino,
sulfonilamino, aminosulfonilo, alquil
(C_{1-6})-tio, alquil
(C_{1-6})-sulfinilo, alquil
(C_{1-6})-sulfonilo, heterociclilo
y heterociclilalquilo (C_{1-6}).
En una realización preferida adicional del
procedimiento, las pleuromutilinas preparadas de acuerdo con el
procedimiento de la presente invención se usan para preparar los
derivados de pleuromutilinas semi-sintéticos
descritos en el documento WO 01/74788. Por tanto las pleuromutilinas
preparadas de acuerdo con el procedimiento de la presente invención
se usan preferiblemente para preparar un derivado de pleuromutilinas
semi-sintético de fórmula general (5):
en la
que
- \quad
- R^{10} es un grupo heteroarilo opcionalmente sustituido de 5 ó 6 miembros; y
- \quad
- R^{11} es vinilo o etilo;
o una sal farmacéuticamente
aceptable del
mismo.
Ejemplos de grupos heteroarilo para R^{10}
incluyen aquellos que tienen un anillo simple de 5 ó 6 miembros,
que comprenden 1 ó 2 átomos de nitrógeno y opcionalmente comprenden
un heteroátomo adicional seleccionado de oxígeno o azufre, por
ejemplo, piridina, piridazina, pirimidina, pirazina, isoxazol,
tiazol, imidazol, pirazol; o un anillo de 5 ó 6 miembros que
comprende 3 átomos de nitrógeno, por ejemplo,
1,2,3-triazol, 1,2,4-triazol; o un
anillo de 5 ó 6 miembros que comprende 1 ó 2 átomos de nitrógeno
condensados con un anillo de benceno, por ejemplo, bencimidazol.
Ejemplos adicionales de grupos heteroarilo para R^{10} incluyen
aquellos que tienen un anillo de 5 ó 6 miembros que comprende 1 ó 2
átomos de nitrógeno condensados con un segundo anillo de
heteroarilo opcionalmente sustituido de 5 ó 6 miembros que comprende
1 ó 2 átomos de nitrógeno.
Ejemplos representativos de tales grupos
heteroarilo para R^{10} incluyen, por ejemplo, piridina, pirazina,
piridazina,
3-oxo-3,4-dihidropirido[2,3-b]pirazina,
pirazol[1,5-a]pirimidina, pirimidina y
tiazol. Ejemplos preferidos de tales grupos heteroarilo para
R^{10} incluyen, por ejemplo, piridina, pirimidina y tiazol.
Sustituyentes opcionales representativos para
R^{10} incluyen amino, mono- o di-alquil
(C_{1-6})-amino, alquilo
(C_{1-6}), alcoxi (C_{1-6}),
nitro y heterociclilo que contiene N tal como
piperidin-4-ilo que puede estar
opcionalmente sustituido. De forma típica R^{10} puede comprender
uno o dos sustituyentes.
Cuando se usa en esta invención con referencia a
la fórmula (5), el término "arilo" se refiere, a menos que se
defina de otro modo, fenilo o naftilo. Un grupo arilo sustituido
comprende hasta cinco, preferiblemente hasta tres
sustituyentes.
Sustituyentes adecuados para un grupo arilo,
incluyen fenilo cuando forma parte de un grupo bencilo, incluyen,
por ejemplo, y a menos que se defina de otro modo, halógeno, alquilo
(C_{1-6}), arilo, arilalquilo
(C_{1-6}), alcoxi (C_{1-6}),
alcoxi (C_{1-6})-alquilo
(C_{1-6}), haloalquilo
(C_{1-6}), arilalcoxi (C_{1-6}),
hidroxi, nitro, ciano, azido, amino, mono- y
di-N-alquil
(C_{1-6})-amino, acilamino,
arilcarbonilamino, aciloxi, carboxi, sales de carboxi,
carboxiésteres, carbamoílo, mono- y
di-N-alquil
(C_{1-6})-carbamoílo, alcoxi
(C_{1-6})-carbonilo,
ariloxicarbonilo, ureido, guanidino, alquil
(C_{1-6})-guanidino, amidino,
alquil (C_{1-6})-amidino,
sulfonilamino, aminosulfonilo, alquil
(C_{1-6})-tio, alquil
(C_{1-6})-sulfinilo, alquil
(C_{1-6})-sulfonilo,
heterociclilo, heteroarilo, heterocicilalquilo
(C_{1-6}) y heteroarilalquilo
(C_{1-6}). Además pueden estar unidos dos átomos
de carbono del anillo adyacentes por una cadena de alquileno
(C_{3-5}), para formar un anillo carbocíclico.
Cuando se usan en esta invención en referencia a
la fórmula (5), los términos "alquilo" y "alquenilo" se
refieren a (de forma individual o como parte de alcoxi o
alqueniloxi) grupos de cadena lineal o ramificada que contienen
hasta seis átomos de carbono.
Cuando se usan en esta invención en referencia a
la fórmula (5), los términos "cicloalquilo" y
"cicloalquenilo" se refieren a grupos que tienen de tres a
ocho átomos de carbono del anillo.
Cuando están sustituidos un grupo alquilo,
alquenilo, cicloalquilo o cicloalquenilo puede comprender hasta
cuatro sustituyentes, preferiblemente hasta dos sustituyentes.
Sustituyentes adecuados para grupos alquilo, alquenilo,
cicloalquilo o cicloalquenilo incluyen arilo, heteroarilo,
heterociclilo, alcoxi (C_{1-6}), alquil
(C_{1-6})-tio, arilalcoxi
(C_{1-6}), arilalquil
(C_{1-6})-tio, amino, mono- o
di-alquil
(C_{1-6})-amino, cicloalquilo,
cicloalquenilo, carboxi y ésteres de los mismos, amida, ureido,
guanidino, alquil
(C_{1-6})-guanidino, amidino,
alquil (C_{1-6})-amidino, acil
(C_{1-6})-oxi, azido, hidroxi y
halógeno.
Cuando se usan en esta invención en referencia a
la fórmula (5) los términos "heterociclilo" y
"heterocíclico" se refieren, a menos que se defina de otro
modo, a anillos no aromáticos, simples y condensados, que contienen
de forma adecuada hasta cuatro heteroátomos en cada anillo,
seleccionándose cada uno de ellos de oxígeno, nitrógeno y azufre.
Cada anillo heterocíclico tiene preferiblemente de 4 a 7,
preferiblemente 5 ó 6 átomos de anillo. Un sistema de anillo
heterocíclico condensado puede incluir anillos carbocíclicos y
necesita incluir sólo un anillo heterocíclico.
Cuando está sustituido un grupo heterociclilo
puede comprender hasta tres sustituyentes. Preferiblemente un
sustituyente para un grupo heterociclilo se selecciona de oxo, y el
grupo definido anteriormente como sustituyentes de arilo
adecuados.
Cuando se usa en esta invención en referencia a
la figura (5), el término "heteroarilo" incluye de forma
adecuada, a menos que se defina de otro modo, un sistema de anillo
heteroaromático mono- o bicíclico, que comprende hasta cuatro,
preferiblemente 1 ó 2 heteroátomos seleccionados cada uno de
oxígeno, nitrógeno y azufre. Cada anillo puede tener de 4 a 7,
preferiblemente 5 ó 6, átomos de anillo. Un sistema de anillo
heteroaromático bicíclico puede incluir un anillo carbocíclico.
Cuando está sustituido un grupo heteroarilo
puede comprender hasta tres sustituyentes. Preferiblemente se
selecciona un sustituyente para un grupo heteroarilo del grupo
definido anteriormente como sustituyentes de arilo adecuados.
Dependiendo de la posición de unión de los
sustituyentes puede ser posibles dos o más diastereoisómeros,
proporcionando así los diastereoisómeros individuales y mezclas de
los mismos.
Los compuestos 2-hidroxi de
fórmula (4A) pueden ser de la configuración (2S) o de la
configuración (2R), o proporcionarse como mezclas de los mismos. Se
prefiere la configuración (2S). Los compuestos sustituidos con
2-hidroxi de fórmula (5) son de la configuración
2-(S).
Cuando se usa en esta invención, el término
"pleuromutilinas" incluye pleuromutilina (compuesto de fórmula
(1) como se definió anteriormente) y compuestos relacionados con
pleuromutilina tales como, por ejemplo, ésteres de pleuromutilina
tales como 22-acetato de pleuromutilina o ésteres de
ácidos grasos, mutilina, o 14-acetato de mutilina.
De forma particular el término "pleuromutilinas" incluye
pleuromutilina y 14-acetato de mutilina,
especialmente pleuromutilina.
Cuando se usa en esta invención el término
"derivado de pleuromutilinas" incluye derivados
semi-sintéticos preparados a partir de las
pleuromutilinas producidas de acuerdo con el procedimiento de la
presente invención mediante, por ejemplo, interconversión de grupo
funcional.
Las pleuromutilinas producidas mediante el
procedimiento de la presente invención se pueden analizar por HPLC.
Las pleuromutilinas en muestras de caldo y de extracción se pueden
determinar usando una columna C18 S5 ODS2 Spherisorb de Waters, 4,6
x 250 mm, con una columna de guardia de 10 mm. La detección UV es a
205 nm. Se usan una fase móvil isocrática de 1 ml/min de MeCN al
45% en agua y un volumen de inyección de 20 \mul. Para las
muestras de caldo se somete a ultrasonidos 2 ml de caldo completo
durante 15 minutos con 4 ml de acetonitrilo y se filtra a través de
un papel de filtro de fibra de vidrio antes del ensayo.
La invención se ilustra con los siguientes
ejemplos.
Ejemplo de referencia
1
Se ajustó 1,364 l de caldo completo de
Clitopilus passeckerianus NRRL 3100 a 1,280 mg/l de
pleuromutilina (1,746 g) a pH 7 usando hidróxido de sodio al 20% y
se extrajo con la mitad de volumen de tolueno. Se llevó a cabo la
extracción y separación usando una centrífuga
SA-7-01 de Westfalia y una
centrífuga de discos apilados TA-7 de Westafalia.
Se ajustaron los flujos de la bomba dando 3 l/min de caldo completo
y 1,5 l/minuto de tolueno. Se obtuvo 681 l de extracto de tolueno a
2,573 mg/l (1,751 g de pleuromutilina) (100% de rendimiento de
fase).
Se concentró adicionalmente 6,76 l de extracto
de tolueno concentrado parcialmente preparado a partir del extracto
de pleuromutilina, que contiene 17,74 g/l de pleuromutilina (119,9
g), hasta 760 ml (15,8% en p/v de pleuromutilina) (a 60ºC, a
vacío). Se dejó enfriar el concentrado de tolueno hasta temperatura
ambiente con agitación y comenzó la cristalización. Se dejó la
suspensión a 5ºC durante la noche. Se recuperaron los cristales
mediante filtración en papel Whatman número 541, se lavaron con 2 x
20 ml de heptano frío y se secaron durante 48 h a 55ºC, 900 mBarg.
Se obtuvieron 89,6 g de pleuromutilina cristalina 100% pura (75% de
rendimiento de fase).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de referencia
2
Se extrajeron 2,600 l de caldo de fermentación
de Clitopilus passereckianus NRRL 3100, que contiene
pleuromutilina a 1500 ug/g con tolueno a una relación de
caldo/disolvente de 2:1 usando un decantador de espiral CA226 de
Westafalia. Se mantuvo el pH entre 6,8 y 7,5 (NaOH 1 M), y se llevó
a cabo la extracción a temperatura ambiente. Se usó el paso a
través de un separador TA-7 de Westfalia para pulir
la corriente rica en disolvente. Se recogieron 1,275 l de
disolvente rico, que contiene 2400 ug/ml de pleuromutilina.
(Rendimiento de extracción de disolvente del 76%).
Se concentraron 1,275 l de tolueno rico en
pleuromutilina hasta 22,5 l (16% en p/p) usando destilación a vacío,
60-75ºC y 635 mm de Hg. (93,5% de rendimiento de
concentración).
Se dividió los 22,5 l de concentrado de
pleuromutilina en dos alícuotas aproximadamente iguales y se
concentraron adicionalmente en un evaporador rotativo (70ºC) entre
40 y 50% en p/p (cristalización observada en aproximadamente 25% en
p/p). Se completó la cristalización durante la noche en un baño de
hielo/agua.
Se recuperó el producto mediante filtración a
través de un papel de filtro Whatman nº 54. Se suspendió el
producto húmedo pesado (1,83 kg, 2 veces) en 1 l de tolueno por kg
de producto húmedo durante 2 minutos y se recuperó de nuevo el
producto mediante filtración. Se lavó el lecho seco con 0,5 kg de
tolueno por kg de producto húmedo original. (rendimiento de
cristalización 86,7%).
Se secó 2 x 1,5 kg de producto húmedo durante la
noche a 45-50ºC, se sometió a vacío dando un total
de 2,9 kg de producto de pleuromutilina con pureza del 95,7%.
(61,5% de rendimiento total).
Ejemplo
3
Se ajustó 1,397 l de caldo completo de
Clitopilus passeckerianus NRRL 3100 que contiene 1,280 mg/l
de pleuromutilina (1,788 g) a pH 7 usando hidróxido de sodio al
20%. Se extrajo el caldo completo con la mitad del volumen de MIBK.
Se llevó a cabo la extracción y separación usando una centrífuga
SA-7-01 de Westfalia y una
centrífuga de discos apilados TA-7 de Westafalia. Se
ajustaron los flujos de la bomba dando 3 l/min de caldo completo y
1,5 l/minuto de MIBK. Se obtuvo 628 l de extracto de MIBK a 3,010
mg/l (1,890 g de pleuromutilina) (rendimiento de fase 100%).
Se concentró adicionalmente 2,82 l de extracto
de MIBK concentrado parcialmente preparado a partir del extracto de
pleuromutilina, que contiene 39,02 g/l de pleuromutilina (110 g),
hasta 0,275 l (40% en p/v de pleuromutilina). Se enfrió el
concentrado hasta 27ºC y comenzó la cristalización. Se añadió gota a
gota un volumen igual de heptano durante 20 minutos con agitación
vigorosa. Se mantuvo la suspensión a temperatura ambiente durante 1
hora y luego a 5ºC durante la noche. Se recuperaron los cristales
mediante filtración en papel Whatman número 541, se lavaron con 20
ml de heptano frío dos veces y se secaron durante 48 h a 55ºC, 900
mBarg. Se obtuvieron 98,6 g de pleuromutilina cristalina de 96% de
pureza (86,1% de recuperación de fase).
Ejemplo
4
Se extrajo un caldo de fermentación de 4500 l de
Clitopilus passeckerianus NRRL 3100 que contiene 4,08 kg de
pleuromutilina con la mitad del volumen de MIBK. Se llevó a cabo la
extracción y separación usando un decantador en contracorriente
CA226 de Westfalia, y centrífuga de discos apilados
TA-7 de Westfalia. Se premezclaron las fases usando
un mezclador estático de Sulzer. Manteniendo una relación 2.1 de
caldo a MIBK, se aumentaron los caudales en el proceso de 3 y 1,5
l/min, a 7 y 3,5 l/min. A estos flujos no se observó degradación de
la separación de fase o eficiencia de extracción. Se concentró a
vacío el extracto de MIBK hasta aproximadamente 10% en p/v de
pleuromutilina. Se recuperaron 3,62 kg de pleuromutilina en extracto
rico. (Rendimiento de fase de 89%) se concentró adicionalmente 1 l
de extracto de MIBK parcialmente concentrado, del ejemplo 3, que
contiene aproximadamente 100 g de pleuromutilina, hasta 35% en p/v
de pleuromutilina (a 60ºC, a vacío). Se transfirió el concentrado a
un matraz de 3 l y se agitó a 250 rpm. Se dejó enfriar el
concentrado hasta temperatura ambiente y se añadieron
aproximadamente 30 mg de cristales semilla. Se observó
cristalización después de aproximadamente 30 minutos. Se añadieron
luego 1,1 volúmenes de heptano a 10 ml/min, controlando la velocidad
del agitador para asegurar buena mezcla sin excesivo salpicamiento.
Después de 1,5 horas a temperatura ambiente se transfirió el
recipiente a un espacio a 5ºC durante 2 horas. Se recuperaron
cristales en un papel 541 de Whatman mediante filtración a vacío.
Se lavó la torta de cristales con 10 ml de heptano dos veces, y se
secó a 50ºC, 900 mbar durante 48 horas. Se obtuvieron 84 g de
cristales de pleuromutilina de 94% de pureza. (79% de rendimiento
de fase).
Ejemplo
5
Se trató 13 kg de
semi-concentrado de MIBK que contiene
aproximadamente 20% en p/p de pleuromutilinas con 173 g de carbono
en polvo Norit GSX [Norit UK Ltd, Clydesmill Place, G32 8 RF, RU] y
se agitó durante 5 minutos. El concentrado tratado con carbono se
filtró a través de un lecho de Celite [Harborlite UK Ltd,
Livingstone Rd, HU13 OEG, RU] para eliminar el carbono.
El color basado en medida del índice de
amarilleamiento (como se definió en normas para medida de las
soluciones ópticamente claras ASTM D 5386-93b y
EN1557), se redujo de 32,3 a 18,2 (eliminación del 47%).
Se redujo 12 kg del concentrado rico tratado con
carbono hasta 6 kg usando evaporación rotativa y se transfirió a un
reactor de vidrio de 30 l, previamente calentado hasta 50ºC usando
un serpentín de agua caliente y 8 l de MIBK calentado. Se drenó el
MIBK inmediatamente antes de la transferencia del concentrado.
El agua caliente estaba próxima al serpentín y
se añadió 7 l de heptano al concentrado, con agitación, durante 25
minutos. La temperatura inicial durante la adición de heptano estaba
entre 55 y 35ºC, seguido de enfriamiento natural. Tras completarse
la adición de heptano se introdujo glicol en el serpentín y se
redujo la temperatura hasta 4ºC durante la cristalización. Se
filtró la mezcla durante 60 minutos.
Se recuperaron los cristales mediante filtración
en Buchner y se lavó la torta con 2 l de heptano a temperatura
ambiente. Se secó el producto durante la noche en acero inoxidable a
vacío a temperatura ambiente dando crema pálida libre de cristales
granulares en flujo (97,7% de pleuromutilinas). (88,3% de
rendimiento de fase).
Ejemplo
6
Se disolvieron 12 g de cristales de
pleuromutilinas en 100 ml de acetato de etilo. Se concentró la
solución hasta 20% en p/p y se transfirió a un matraz de fondo
redondo de 50 ml contenido en un baño de agua a 50ºC. Se redujo la
temperatura del baño hasta 20ºC y se añadieron 45 ml de heptano con
agitación durante 30 minutos. Se agitaron luego los cristales en un
baño de hielo durante 60 minutos. Se recuperó el producto
recristalizado mediante filtración y se lavó la torta con 10 ml de
heptano a temperatura ambiente. Se secó el producto durante la
noche a temperatura ambiente a vacío dando cristales blancos, finos
que contienen 86,2% de pleuromutilina y 2,9% de
14-acetato de mutilina, la reducción en
14-acetato de mutilina fue de 77,0% (82,1% de
rendimiento de fase).
Ejemplo
7
Se disolvieron 30 g de pleuromutilinas que
contienen 14-acetato de mutilina en 80 ml de MIBK
con agitación, en un recipiente de reacción con camisa de vidrio
controlado a 60ºC. Se cerró el recipiente a la atmósfera durante la
disolución. Cuando se disolvió el sólido completamente se añadió 80
ml de heptano a temperatura ambiente desde un embudo de goteo
durante 15 a 20 minutos mientras se mantiene la temperatura de la
solución de pleuromutilina a 60ºC. Tras completarse la adición de
heptano se transfirió la suspensión a un vaso de precipitados de
vidrio de 600 ml, cubierto con película adhesiva y se agitó en un
baño de hielo durante 3 horas. Se recuperó el producto
recristalizado mediante filtración a vacío a través de un papel de
filtro Whatman nº 54 y se lavó la torta in situ con 40 ml de
una mezcla de heptano/MIBK 3:1. Se retiró en seco la torta en el
papel de filtro usando vacío antes de ser dispuesto en una bandeja y
se secó durante la noche en una estufa a temperatura ambiente a
vacío con un ligero soplo de aire. Este procedimiento dio 22,3 g de
un producto cristalino blanco que contiene 1,5% de
14-acetato de mutilina en p/p (74,5% de rendimiento
en peso, 81,2% de rendimiento como pleuromutilina, eliminación de
84% de acetato de 14-mutilina).
Claims (22)
1. Un procedimiento de preparación de una o más
pleuromutilinas que comprende las etapas de:
- a)
- cultivo de un microorganismo que produzca pleuromutilinas en un medio de cultivo líquido;
- b)
- extracción de las pleuromutilinas del medio de cultivo no filtrado con un disolvente orgánico no miscible con agua que es 4-metil-2-pentanona (MIBK);
- c)
- concentración de las pleuromutilinas extraídas;
- d)
- cristalización directa de las pleuromutilinas en MIBK y un disolvente miscible no polar que es heptano.
2. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que las pleuromutilinas extraídas (etapa b)
o las pleuromutilinas concentradas (etapa c) se descolorizan usando
carbón activado.
3. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 o la reivindicación 2 para la preparación de
pleuromutilina.
4. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, en el que el microorganismo que produce
pleuromutilinas es una especie de Clitopilus, una especie de
Octojuga, una especie de Gerronema, una especie de
Psathyrella.
5. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 4, en el que el microorganismo que produce
pleuromutilinas es Clitopilus passeckerianus NRRL 3100/DSM
1602, Clitopilus passeckerianus CBS 299.35, Clitopilus
passeckerianus CBS 330.85, Clitopilus pinsitus CBS
623.70, Clitopilus hobsonii CBS 270.36, Gerronema
josserandii CBS 309.36, Psathyrella subatrata CBS
325.39.
6. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 5, en el que el microorganismo que produce
pleuromutilinas es Clitopilus passeckerianus NRRL 3100.
7. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 6, en el que la extracción se lleva a cabo
a aproximadamente 10ºC a aproximadamente 50ºC.
8. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 7, en el que el pH de la solución acuosa
antes de la extracción está en el intervalo de pH 6 a 8.
9. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 8, en el que se usa una relación de 4:1 a
1:4 equivalentes en volumen de MIBK a medio de cultivo no filtrado
para la extracción.
10. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la concentración de la
solución de MIBK usada para la cristalización es de 20% a 45% en
p/p.
11. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 10, en el que la concentración de la solución de MIBK
usada para cristalización es de 35% a 40% en p/p.
12. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 10 o la reivindicación 11, en el que la temperatura
inicial del MIBK en la etapa d) es de 45ºC a 60ºC, seguido de
enfriamiento de 25ºC a 35ºC.
13. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 12, en el que la temperatura inicial es de 50ºC a
55ºC, seguido de enfriamiento hasta aproximadamente 30ºC.
14. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 10 a 13, en el que se añade de 1 a 1,5
volúmenes de heptano.
15. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 14, en el que las pleuromutilinas
cristalizadas se purifican además mediante cristalización.
16. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 15, en el que se elimina de forma selectiva
14-acetato de mutilina de las pleuromutilinas
cristalizadas mediante cristalización con acetato de etilo y
heptano.
17. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 16, en el que la concentración de pleuromutilinas
usada para la recristalización es de 20 a 40% en p/p.
18. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 16 o la reivindicación 17, en el que la temperatura
inicial es de 45ºC a 50ºC, seguido de enfriamiento de 15ºC a
25ºC.
\newpage
19. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 18 seguido de adición de heptano y enfriamiento
adicional de 0ºC a 5ºC.
20. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 15, en el que se elimina de forma selectiva
14-acetato de mutilina de las pleuromutilinas
cristalizadas mediante recristalización con MIBK y heptano.
21. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 20, en el que la concentración de pleuromutilinas
usada para recristalización es de 20% a 45% en p/p.
22. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 20 o la reivindicación 21, en el que la temperatura
inicial es de 45ºC a 65ºC.
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