ES2306079T3 - Granulados que contienen formulaciones de fitasa estabilizantes. - Google Patents

Abstract

Una formulación enzimática estabilizada, sólida o líquida que comprende al menos una fitasa y al menos un agente estabilizante, en donde el agente estabilizante es al menos una proteína de animal estabilizante, con la condición de que si se utiliza la gelatina en gránulos como formulaciones sólidas, como el único agente estabilizante, los gránulos se recubren posteriormente.

Description

Gránulos que contienen formulaciones de fitasa estabilizadas.

Campo de la invención

La presente invención se relaciona con formulaciones sólidas o líquidas de fosfatasa que tienen una estabilidad incrementada, preferiblemente termoestabilidad, que se obtiene por la adición de agentes estabilizantes

La presente invención se relaciona con la formulación de fitasas, en carbohidrato (por ejemplo, almidón-) que contiene granulados y/o formulaciones líquidas, y se relaciona con procesos para la preparación de tales granulados y formulaciones líquidas que contienen enzimas. Estos granulados y formulaciones líquidas (comestible) luego se pueden utilizar en piensos para animales y/o nutrición humana. Los granulados y las formulaciones líquidas que contienen enzimas muestran una mejorada estabilidad de almacenamiento y elaboración.

Antecedentes de la invención

El uso de las fosfatasas en nutrición humana o animal, por ejemplo, ganado, en pienso se ha convertido casi en una práctica común. Estas enzimas usualmente se producen por cultivo de microorganismos en fermentadores a gran escala operados por procedimientos industriales de enzimas. En el final de la fermentación el "caldo" resultante usualmente se somete a una serie de etapas de filtración para separar la biomasa (los microorganismos) de la enzima deseada (en-solución). La solución de enzimas es ya sea vendida como un líquido o procesada a una formulación seca.

Las formulaciones secas y líquidas de enzimas que comprenden fosfatasas, preferiblemente fitasas, se utilizan en una escala comercial por la industria de alimentos y pienso. Las formulaciones líquidas se pueden adicionar al pienso o al alimento después de la granulación con el fin de evitar la inactivación por calor de la(s) enzima(s) que podría ocurrir durante el proceso de granulación. Sin embargo las cantidades de enzima en las preparaciones finales de pienso o alimento usualmente son tan pequeñas que hace difícil lograr una distribución homogénea de la enzima en el pienso o alimento, y los líquidos son notablemente más difíciles de mezclar uniformemente que los ingredientes secos. Además se necesita equipo especializado (costoso) para adicionar los líquidos al pienso después de la granulación que actualmente no está disponible en la mayoría de las fábricas de pienso (debido al costo extra). Aún cuando aplicando las formulaciones líquidas que contienen las enzimas, la estabilidad de almacenamiento de tales formulaciones generalmente es un problema.

Las formulaciones secas de fosfatasas, especialmente fitasas, por otra parte, tienen la desventaja de la inactivación por calor de las enzimas durante la granulación. Los protocolos de fabricación preferidos en la industria de alimentos y pienso involucran granulación de vapor donde el pienso o alimento se somete a la inyección(s) de vapor antes de la granulación. En la posterior etapa de granulación, el pienso o alimento se forzó a través de una matriz o troquel y las bandas resultantes se cortan en pellets apropiados de longitud variable. El contenido de humedad inmediatamente antes de la granulación generalmente es entre 10% y 20%. Durante este proceso las temperaturas pueden subir a 60-95ºC. El efecto combinado de alto contenido de humedad y alta temperatura es perjudicial a la mayoría de las enzimas. Estas desventajas también se encuentran en otros tipos de tratamientos termomecánicos tales como extrusión y expansión.

Varios fabricantes de enzimas han desarrollado métodos de formulación alternativos para tratar de mejorar la estabilidad de productos sólidos y líquidos de enzimas durante la granulación y almacenamiento.

EP 0 758 018 A1 revela un método para mejorar la estabilidad de almacenamiento y procedimiento de preparaciones secas de enzimas adicionando sales inorgánicas.

GB 2167 758 revela un método de granulación de enzimas y una composición granular que contiene una enzima que comprende 1 a 35% en peso de una enzima y de 0.5 a 30% en peso de un trozo o pulpa de fibra sintética.

EP 1 069 832 A1 (WO 00/47060) describe un proceso para la preparación de enzimas que contiene granulados donde un líquido acuoso que contiene enzimas se mezcla con un portador sólido y opcionalmente ingredientes aditivos y se procesa mecánicamente en gránulos, se seca y posteriormente se recubre con polietilenglicol.

EP 858 266 (WO 97/16076) revela una preparación particulada, que contiene enzimas apropiadas para el uso en la fabricación de composiciones de piensos para animales.

EP 862 623 A1 (WO 97/12958) revela una composición microgranular de enzimas que tiene una media de tamaño de partícula de cerca de 20 a 400 micrones.

Ninguna de las referencias citadas revela formulaciones que contienen fosfatasas que se estabilizan con las gomas especificadas aquí o proteínas de animales.

DE 1 958 104 describe un proceso para la preparación de granulados que contienen enzimas apropiados para composiciones de detergentes y lavandería en donde las sales alcalinas de ácidos inorgánicos u orgánicos se utilizan como portador.

DE 2137 043 y DE 2 137 042 revela una composición que contiene enzimas apropiada para composiciones de detergentes en donde el portador está compuesto de una sal inorgánica.

EP 716 685 revela granulados de enzimas múltiples apropiados para la incorporación en composiciones de detergentes y de limpieza que contienen una enzima y material portador orgánico y/o inorgánico.

WO 00/36927 revela un método para producir granulados que contienen enzimas y que son apropiados para la alimentación de animales.

WO 03/059087 describe un proceso para la preparación de un granulado que contiene enzima en donde un líquido acuoso que contiene enzima, opcionalmente suplementado con un portador sólido y/o ingredientes aditivos, se procesa en gránulos, se seca y posteriormente se recubre con una poliolefina.

WO 03/059086 describe un proceso para la preparación de un granulado que contiene enzimas en donde un líquido acuoso que contiene enzimas, opcionalmente suplementado con un portador sólido y/o ingredientes aditivos, se procesa en gránulos, se seca y posteriormente se recubre con una dispersión que contiene partículas de una sustancia hidrófoba, preferiblemente una poliolefina.

Para la aplicación de pienso una fosfatasa estable, preferiblemente termoestable, es de interés general con el fin de evitar problemas que pueden ocurrir durante la formulación (por ejemplo, granulación, seca atomizada) y procesos de tratamiento del pienso (por ejemplo, granulación, extrusión, expansión) donde provisionalmente las altas temperaturas (hasta 80-120ºC), humedad y estrés de cizalla pueden afectar la estructura de la proteína y conducir a una indeseable pérdida de actividad.

Las fosfatasas generalmente se adicionan a preparaciones de pienso y alimento por varias razones. En fosfatasas de aplicaciones de alimento se adicionan por ejemplo, en la cocción o en la destilería. La función de las fosfatasas, especialmente fitasas en la aplicación de pienso generalmente es mejorar velocidad de conversión del pienso, por ejemplo, reduciendo la viscosidad de la digesta o reduciendo el efecto antinutricional de ciertos compuestos de pienso. Las fosfatasas, preferiblemente fitasas también se pueden utilizar, como para reducir la cantidad de compuestos en el abono, los cuales son perjudiciales al ambiente.

En todas las diversas aplicaciones, estas enzimas generalmente se exponen al desafío térmico, por ejemplo, exposición al calor, humedad o temperatura, que puede conducir a una inactivación de la enzima parcial o completa.

Aunque una gran cantidad de fosfato está presente en el pienso en forma de fósforo fitato, animales monogástricos, como cerdos y aves de corral, carecen de la habilidad de usar esta forma de fosfato. Las sales alcalinas o alcalinotérreas del ácido fítico se presentan naturalmente principalmente en cereales. Dado que los animales monogástricos no son capaces de usar esta forma de fosfato, es una práctica común adicionar fosfatos inorgánicos a los piensos para animales.

Por otra parte una enzima llamada fitasa (mio-inositol hexakisfosfato fosfohidrolasa) se sabe que se produce en plantas y en algunos microorganismos. Dado que la fitasa se puede producir por fermentación se conoce en el arte de emplear la fitasa como un aditivo en piensos para animales con el fin de mejorar el valor nutritivo del material vegetal por liberación del fosfato inorgánico del ácido fítico (mio-inositol hexakisfosfato). Adicionando la fitasa en los piensos para animales el nivel de contaminación de fósforo del ambiente se puede reducir ya que el animal es capaz de hacer uso del fosfato liberado del fitato por el uso de la fitasa.

La aplicación de la patente internacional WO 93/16175 (EP 626 010) de Gist-Brocades describe formulaciones líquidas estabilizadas de fitasa. Se sugiere utilizar como agente estabilizante la urea y un poliol soluble en agua por lo cual se mencionan el sorbitol, glicerol y polietilenglicol que tienen un peso molecular de 6000.

La aplicación de la Patente Europea EP-A1 0 969 089 de Hoffmann-La Roche describe una formulación de enzima estabilizada que comprende fitasa y al menos un agente estabilizante seleccionado del grupo que consiste de a) polioles que contienen cinco átomos de carbono, preferiblemente azúcares C5, más preferiblemente xilitol o ribitol, b) polietilenglicol que tiene un peso molecular de 600 a 4000 Da, c) las sales disódicas de ácido malónico, glutárico y succínico, d) carboximetilcelulosa, y e) alginato de sodio. Adicionalmente describe la formulación de fitasa estabilizada por un enlace cruzado ya sea por reacciones químicas con glutaraldehido; o por b) oxidación con peryodato de sodio y posterior adición de dihidrazida del ácido adípico.

WO 98/54980 describe gránulos que contienen fitasa y WO 98155599 describe las preparaciones líquidas y de pienso con fitasa de alta-actividad que las contiene.

A pesar de las diferentes metodologías en la condición del arte, todavía hay una necesidad para las formulaciones de fosfatasa estabilizada que son apropiadas para la nutrición humana y/o animal y que muestran una estabilidad mejorada durante la elaboración, granulación y almacenamiento. Las formulaciones serían fácilmente obtenibles, así como fácilmente compatibles con ingredientes comunes de alimentos y/o piensos. Además las formulaciones, especialmente las formulaciones sólidas serían fácilmente procesables, por ejemplo, proporcionan propiedades de bajo polvo, ser de fácil dispersión o mezcla en la matriz deseada.

Es un objetivo de la presente invención proporcionar agentes estabilizantes alternos así como mejorar la estabilidad, preferiblemente termoestabilidad de las fitasas por lo cual la estabilidad se define como la habilidad para retener la actividad bajo diversas condiciones. Este aspecto de estabilidad se relaciona con el ciclo de vida total de la enzima, que comprende producción (fermentación, elaboración desde su origen y formulación), distribución (transporte y almacenamiento) y aplicación final (producción y almacenamiento de pienso y/o alimento). Para una enzima interesante comercialmente, por ejemplo, para la fitasa, es importante que resista las altas temperaturas y la alta humedad alcanzada durante los diversos procesos de tratamiento del pienso y/o el alimento como granulación, extrusión y expansión (hasta 80-120ºC) y que sea estable durante el almacenamiento después de la adición al pienso y/o alimento, especialmente durante el almacenamiento a largo plazo. Es otro objetivo de la invención proporcionar estabilizadores alternos, que se pueden utilizar en una cantidad más pequeña que aquellos estabilizadores conocidos en el arte, como la cantidad de estabilizador en las formulaciones finales limita los otros ingredientes que se pueden adicionar a una formulación que contiene enzimas. Es otro objetivo de la invención proporcionar estabilizadores que se puedan utilizar especialmente para mezclas de enzimas. Sí una preparación de enzimas se hace a partir de más de un caldo de fermentación, la cantidad de estabilizador que se puede adicionar a la formulación final se limita. Es de especial preocupación si una alta concentración de enzimas se desea en el producto final y de este modo la cantidad de diluente que se puede adicionar a la formulación final se limita. En otro aspecto de la invención, si una mezcla de enzimas se utiliza, el estabilizador también preferiblemente debería estabilizar no solo una enzima, sino todas las enzimas en la mezcla.

El término "estabilidad" como se utiliza en la presente invención se relaciona con todas las especificaciones de una enzima industrial, que comprende aspectos tales como actividad, especificidad, estabilidad de vida útil, estabilidad mecánica, estabilidad microbiana, toxicidad, composición química y parámetros físicos tales como densidad, viscosidad, higrometría, pero también color, olor y polvo. Un aspecto preferido de la presente invención se relaciona con la estabilidad de una enzima, preferiblemente una fosfatasa y/o una glicosidasa contra la inactivación térmica durante la formulación y los procesos de tratamiento de pienso y/o alimento tales como granulación, extrusión y expansión.

Una barrera principal al amplio uso de las fosfatasas, especialmente fitasas, es la limitación de la estabilidad térmica (80-120ºC) necesaria para estas enzimas para resistir la inactivación durante procesos de tratamiento de pienso y/o alimento. La mayoría de las fosfatasas industriales disponibles actualmente para las aplicaciones de pienso y/o alimento tienen una resistencia intrínseca insuficiente a la inactivación por calor. Como una alternativa o además a las metodologías de biología molecular la presente invención mejora la estabilidad, preferiblemente la termoestabilidad de una fosfatasa, especialmente fitasa por la adición de diferentes aditivos.

Descripción de la invención

En un primer aspecto de la presente invención, se proporciona una formulación enzimática estabilizada, sólida o líquida que comprende al menos una fitasa y al menos un agente estabilizante seleccionado del grupo que consiste de agar, algina, carragenina, furcelarano, goma ghatti, goma tragacanto, goma karya, guarana, goma de algarrobilla (= goma de algarroba), goma de semilla de tamarindo, arabinogalactana, xantana (goma), al menos una proteína de animal y mezclas de estas, con la condición de que si la gelatina se utiliza en gránulos, como formulaciones sólidas como el único agente estabilizante, los gránulos se recubren posteriormente.

El término "formulación enzimática" comprende todas las formulaciones líquidas y sólidas en las cuales las fitasas se puedan comercializar. Preferiblemente, la fuente de la(s) enzima(s) para tal formulación es una preparación líquida obtenida preferiblemente cruda, a partir del caldo de fermentación. Para la preparación de una formulación líquida enzimática de acuerdo con la invención de los agentes estabilizantes seleccionados se puede adicionar directamente al caldo de fermentación o el caldo de fermentación se puede purificar, por ejemplo, por filtración o ultrafiltración y el agente estabilizante luego se adiciona después de las etapas de filtración.

Para obtener una formulación sólida de la(s) enzima(s) estabilizada, preferiblemente termoestabilizada se puede secar-atomizar o granular en la presencia de los agentes estabilizantes seleccionados. Una formulación sólida preferiblemente es una formulación, que contiene menos del 15% (peso/peso), preferiblemente menos del 10% (peso/peso), especialmente menos del 8% (peso/peso) de agua.

En una modalidad preferida de la invención la formulación de la enzima estabilizada es sólida, preferiblemente en la forma de un gránulo(s).

En otro, aspecto de la presente invención se proporciona un proceso para la preparación de gránulo(s) que contienen fitasa, el proceso que comprende la elaboración al menos de una fitasa, un portador sólido que comprende al menos 15% (peso/peso) de un polímero de carbohidrato comestible, y al menos un agente estabilizante, en donde el agente estabilizante se selecciona del grupo que consiste de agar, algina, carragenina, furcelarano, goma ghatti, goma tragacanto, goma karya, guarana, goma de algarrobilla (= goma de algarroba), goma de semilla de tamarindo, arabinogalactana, xantana (goma), al menos una proteína de animal y mezclas de estos, con la condición de que si se utiliza gelatina como el único agente estabilizante, los gránulos se recubren posteriormente. En otro aspecto de la invención se proporcionan gránulo(s) que contiene la enzima, obtenibles por tal proceso.

En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un gránulo que comprende al menos una fitasa, un portador sólido que comprende al menos 15% (peso/peso) de un polímero de carbohidrato comestible, y al menos un agente estabilizante, en donde el agente estabilizante se selecciona del grupo que consiste de agar, algina, carragenina, furcelarano, goma ghatti, goma tragacanto, goma karya, guarana, goma de algarrobilla (= goma de algarroba), goma de semilla de tamarindo, arabinogalactana, xantana (goma), al menos una proteína de animal y mezclas de estos, con la condición de que si se utiliza gelatina como el único agente estabilizante, los gránulos se recubren posteriormente.

En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un gránulo(s) que comprende al menos una fitasa, un portador sólido que comprende al menos 15% (peso/peso) de un polímero de carbohidrato comestible, y al menos un agente estabilizante, en donde el agente estabilizante se selecciona del grupo que consiste de agar, algina, carragenina, furcelarano, goma ghatti, goma tragacanto, goma karya, guarana, goma de algarrobilla (= goma de algarroba), goma de semilla de tamarindo, arabinogalactana, xantana (goma), al menos una proteína de animal y mezclas de estos, en donde el gránulo se recubre.

Los términos "gránulos" o "gránulo(s)" utilizados a lo largo de la descripción de la invención, ambos términos abarcan un único gránulo así como una pluralidad de gránulos sin distinción. Los términos gránulos y granulados se utilizan sinónimamente.

El o los gránulos que contienen fitasa obtenibles por este proceso buscan resolver o al menos mitigar los problemas encontrados en el arte precedente. La invención puede de este modo proporcionar procesos para la preparación de formulaciones de enzimas estabilizadas en la forma de granulados que usan el carbohidrato como un portador. El portador puede ser en la forma de polvo o partículas.

Al menos 15% (peso/peso) del portador sólido está compuesto de un polímero de carbohidrato comestible (tales como almidón). Preferiblemente, sin embargo, al menos 30% (peso/peso) del portador sólido comprende el carbohidrato, opcionalmente al menos 40% (peso/peso). Ventajosamente el componente principal del portador sólido es el carbohidrato (por ejemplo, almidón), por ejemplo más del 50% (peso/peso), preferiblemente al menos 60% (peso/peso), en conformidad al menos 70% (peso/peso), y opcionalmente al menos 80% (peso/peso). Estos porcentajes en peso se basan en el peso total de los componentes no-enzimáticos en el granulado seco final.

El polímero de carbohidrato comestible debería ser seleccionado a fin de que sea comestible por el animal o humano para quien el pienso o alimento, respectivamente se propone, y preferiblemente al menos en parte digerible. El polímero preferiblemente comprende glucosa (por ejemplo, un polímero que contiene glucosa), o (C_{6}H_{10}O_{5})_{n}, unidades. Preferiblemente el polímero de carbohidrato comprende unidades \alpha- D-glucopiranosa, amilosa (un polímero lineal (1->4) \alpha-D-glucano) y/o amilopectina (un D-glucano ramificado con enlaces \alpha- D-(1->4) y \alpha-D-(1->6)). El almidón es el polímero de carbohidrato preferido. Otros polímeros que contienen glucosa apropiados, que se pueden utilizar en lugar de, o además del almidón, incluyen \alpha-glucanos, \beta-glucanos, pectina (tal como proto-pectina), y glucógeno. Los derivados de estos polímeros de carbohidratos, tales como éteres y/o ésteres de estos, también se contemplan aunque el almidón gelatinizado, mejor se evita y de este modo puede no estar presente. En conformidad el polímero de carbohidrato es insoluble en agua.

Los polímeros de carbohidratos apropiados son almidón de maíz, patata y arroz. Sin embargo, el almidón obtenido de otras fuentes (por ejemplo, plantas, tales como vegetales o cosechas) tales como tapioca, yuca, trigo, triticale, maíz, sagú, arroz, avena, cebada, batata, sorgo, o arrurruz es aplicable igualmente. De manera similar ambos tipos de almidón nativo o modificado (por ejemplo, dextrina) se pueden utilizar en la invención. Preferiblemente el carbohidrato (por ejemplo, almidón) contiene poca o ninguna proteína, por ejemplo, menos del 5% (peso/peso), tal como menos del 2% (peso/peso) preferiblemente menos del 1% (peso/peso). No obstante del tipo de almidón (u otro polímero de carbohidrato) debería ser en una forma que le permita ser utilizado en un pienso para animales, en otras palabras una forma comestible o al menos en parte digerible.

Se puede adicionar agua al proceso. En otra modalidad de la invención, los gránulos se secan después del proceso. Se entiende que en una modalidad los gránulos se pueden secar sin tener en cuenta, si el agua se adicionó al proceso o no.

La enzima y el agua preferiblemente se proporcionan como un líquido que contiene enzimas (preferiblemente acuoso), tales como una solución o una suspensión, que se puede mezclar con el portador sólido y permitir que se absorba en el portador. Durante o después de la mezcla, el líquido que contiene la enzima y el portador se procesan en un gránulo, que luego posteriormente se puede secar. El uso del portador de carbohidrato puede permitir la absorción de grandes cantidades de líquido que contiene la enzima (y por consiguiente la enzima). La mezcla se puede utilizar para formar una pasta plástica o no-elástica, masa que puede fácilmente ser procesada en gránulos, por ejemplo se puede formar por extrusión.

En el proceso de la invención la enzima y el agua se pueden presentar en la misma composición antes del contacto con el portador sólido. En este sentido, se puede proporcionar un líquido acuoso que contiene la enzima. Este líquido puede ser una solución o suspensión que es, o se derivada de, un proceso de fermentación. Este proceso de fermentación suele ser aquel en el cual la enzima se produce. El proceso de fermentación puede resultar en un caldo que contiene los microorganismos (que producen la enzima deseada) y una solución acuosa. Esta solución acuosa, una vez separada de los microorganismos (por ejemplo, por filtración) puede ser el líquido acuoso que contiene la enzima utilizada en la invención. De este modo en las modalidades preferidas el líquido acuoso que contiene la enzima es un filtrado, especialmente un filtrado derivado de un proceso de fermentación lo que resulta en la producción de la enzima. Dependiendo del proceso de separación que se utilice para aislar la enzima del caldo de fermentación, la enzima también se puede presentar en un concentrado.

La cantidad de líquido que contiene la enzima (y por lo tanto la enzima) que se puede absorber en el portador usualmente se limita por la cantidad de agua que se puede absorber. Preferiblemente la cantidad de líquida agregado al portador sólido es tal que (sustancialmente) toda el agua en el líquido (acuoso) se adsorbe por el carbohidrato presente en el portador sólido.

A temperaturas elevadas el almidón y otros polímeros de carbohidratos pueden absorber muchas más grandes cantidades de agua bajo el hinchamiento. Por esta razón el polímero de carbohidrato deseablemente es capaz de absorber agua (o líquidos acuosos que contienen la enzima). Por ejemplo, el almidón de maíz puede absorber hasta tres veces su peso de agua a 60ºC y hasta diez veces a 70ºC. El uso de temperaturas más altas con el fin de absorber una mayor cantidad de líquido que contiene la enzima es de este modo contemplado por la presente invención, y actualmente se prefiere especialmente cuando se trata de enzimas termoestables. Para estas enzimas por consiguiente la mezcla portador sólido y líquido (o enzima y agua) y el estabilizador se pueden conducir a elevadas temperaturas (por ejemplo, por encima de la temperatura ambiente), tal como arriba de 30ºC, preferiblemente arriba de 40ºC y opcionalmente arriba de 50ºC. De manera alterna o además el líquido se puede proporcionar a esta temperatura.

Sin embargo, en general, se prefieren condiciones sin hinchamiento a temperaturas más bajas (por ejemplo, ambiente). Esto puede minimizar la pérdida de actividad derivada de la inestabilidad de las enzimas (sensible al calor) a las temperaturas más altas. En conformidad la temperatura durante la mezcla de la enzima y agua es de 10 a 60ºC, tal como 10 a 50ºC, preferiblemente 20 a 40ºC, preferiblemente 20 a 25ºC.

La elaboración mecánica utilizada en la presente invención para hacer la mezcla de la enzima, opcionalmente agua (por ejemplo, un líquido que contiene la enzima), el agente estabilizante y el portador sólido en gránulos (en otras palabras la granulación) puede emplear técnicas conocidas frecuentemente utilizadas en procesos de alimentos, piensos y formulaciones enzimáticos. Este puede comprender la expansión, extrusión, esferonización, granulación, granulación de cizallamiento alto, granulación en tambor, aglomeración de lecho fluido o una combinación de estos. Estos procesos usualmente se caracterizan por una entrada de energía mecánica, tales como la conducción de un tornillo, la rotación de un mecanismo de mezcla, la presión de un mecanismo de rodillo de un aparato de granulación, el movimiento de partículas por un placa en el fondo rotatoria de un aglomerador de lecho fluido o el movimiento de las partículas por un corriente gaseosa, o una combinación de estos. Estos procesos permiten que el portador sólido (por ejemplo, en la forma de un polvo), que sea mezclado con la enzima y opcionalmente agua, por ejemplo un líquido que contiene la enzima (una solución acuosa o suspensión), el estabilizador, y para que posteriormente sea granulado.

De manera alterna el portador sólido se puede mezclar con la enzima (por ejemplo, en una forma de polvo) y el agente estabilizante, para que opcionalmente agua, tales como un líquido (o suspensión) luego se puede adicionar (que puede actuar como líquido de granulación).

En aún otra modalidad de la invención los gránulos (por ejemplo, un aglomerado) se forman por atomizado o recubrimiento del líquido que contiene la enzima en el portador, que previamente fue mezclado con el agente estabilizante, tal como en un aglomerador de lecho fluido. Aquí los gránulos resultantes pueden incluir un aglomerado como se puede producir en un aglomerador de lecho fluido.

Preferiblemente la mezcla del líquido que contiene la enzima, el portador sólido y el agente estabilizante, adicionalmente comprende el amasamiento de la mezcla. Esto puede mejorar la plasticidad de la mezcla con el fin de facilitar la granulación (por ejemplo, extrusión).

En una modalidad preferida el granulado se forma por la extrusión, preferiblemente por extrusión a presión baja. Esto puede ofrecer la ventaja de que la temperatura de la mezcla que se someterá a extrusión no, o solo ligeramente, incremento. La extrusión a baja presión incluye extrusión por ejemplo en una extrusora Fuji Paudal de canasta- o domo-. La extrusión puede producir naturalmente gránulos (los gránulos se pueden romper después de pasar a través de un troquel) o se puede emplear un cortador.

En conformidad los gránulos tendrán un contenido de agua de 15 a 50%, tal como 20 a 40%, tal como de 25 a 35%, preferiblemente 33 a 37% antes de secar. El contenido de enzima de los gránulos pueden ser de 1 a 85%, especialmente de 1 a 70%, tal como 2 a 60%, preferiblemente de 1 a 50%, preferiblemente 2 a 25%, tal como 3 a 15%, tal como 5 a 12% (por ejemplo, al menos 50,000 ppm) antes de secar (siempre calculado como % en peso basándose en el peso total del gránulo).

Los gránulos obtenidos se pueden someter a redondeo (por ejemplo, esferonización), tal como en un esferonizador, por ejemplo, una máquina MARUMERISER^{TM} y/o compactación. Sí los gránulos obtenidos se secan, la esferonización preferiblemente se conduce antes del secado. Los gránulos se pueden esferonizar antes del secado ya que esto puede reducir la formación de polvo en el granulado final y/o puede facilitar cualquier recubrimiento del granulado.

Los gránulos luego se pueden secar, tal como en un secador de lecho fluido o, en caso de la aglomeración de lecho fluido, se puede secar inmediatamente (en el aglomerador) para obtener gránulos (secos sólidos). Otros métodos conocidos para el secado de los gránulos en la industria de alimento, pienso o enzima se pueden utilizar por alguien de habilidad. En conformidad el granulado es autosuspensible. El secado preferiblemente tiene lugar a una temperatura de 25 a 60ºC, tal como 30 a 50ºC. Aquí el secado puede por último de 10 minutos a varias horas. La longitud de tiempo necesario por supuesto dependerá de la cantidad de gránulos que se secan.

Después del secado de los gránulos, los gránulos secos resultantes preferiblemente tienen un contenido de agua de 3 a 10%, tal como de 5 a 9% en peso.

En una modalidad preferida de la invención se proporciona un proceso en donde el proceso comprende:

a) mezcla de un líquido acuoso que contiene la enzima con el portador sólido y el agente estabilizante;

b) elaboración mecánicamente de la mezcla obtenida en a) para obtener gránulos que contienen enzimas; y

c) secado de los gránulo(s) que contienen las enzimas obtenidas en b).

en donde el agente estabilizante se selecciona del grupo que consiste de agar, algina, carragenina, furcelarano, goma ghatti, goma tragacanto, goma karya, guarana, goma de algarrobilla (= goma de algarroba), goma de semilla de tamarindo, arabinogalactana, xantana (goma), al menos una proteína de animal y mezclas de estas, con la condición de que si se utiliza gelatina como el único agente estabilizante, los gránulos se recubren posteriormente.

En otra modalidad de la invención los gránulos se recubren. Un recubrimiento se puede aplicar al gránulo para dar características o propiedades adicionales (por ejemplo, favorecido), como bajo contenido de polvo, color, protección de la enzima del ambiente circundante, diferentes actividades de la enzima en un granulado o una combinación de estos. Los gránulos se pueden recubrir con o sin secado previo. Los gránulos se pueden recubrir con una grasa, cera, polímero, sal, ungüento y/o unción o un recubrimiento (por ejemplo, líquido) que contiene una enzima (segunda) o una combinación de estos. Será aparente que si se desea, varias capas de (diferentes) cubiertas se pueden aplicar. Para aplicar el recubrimiento(s) en los granulados un número de métodos conocidos están disponibles que incluyan el uso de un lecho fluidizado, un granulador de cizallamiento alto, un granulador mezclador, o un mezclador
Nauta.

En una modalidad los gránulos se recubren, preferiblemente después de secado, por ejemplo a una humedad residual de menos de cerca de 10% en peso, con un polímero orgánico que es apropiado para piensos, por (a) atomizado de los gránulos en un lecho fluidizado con, una fusión de una solución o una dispersión de polímero orgánico o realizando en un recubrimiento de lecho fluidizado del polvo con el polímero orgánico; o (b) recubrimiento de los gránulos en un mezclador por fusión sobre el polímero orgánico, o atomizado el granulado crudo con una fusión de una solución o una dispersión de polímero orgánico o realizando un recubrimiento del polvo con el polímero orgánico; y si es necesario el pos-secado, enfriamiento y/o liberación de las fracciones toscas del respectivos resultantes gránulos recubiertos del polímero.

De acuerdo con una modalidad preferida del proceso de la invención, los gránulos se cargan en un lecho fluidizado, se fluidizan y recubren con una solución acuosa o no-acuosa, preferiblemente acuosa, o dispersión de polímero orgánico por atomizado. Para este propósito se utiliza un líquido que es altamente concentrado y todavía es capaz de atomizar, por ejemplo una solución acuosa o no- acuosa o dispersión que contiene de 10 a 50% en peso de al menos un polímero que se selecciona del grupo que consiste de

a) polialquileno glicoles, en particular polietilenglicoles que tienen un número promedio de peso molecular de cerca de 400 a 15,000, por ejemplo de cerca de 400 a 10, 000;

b) polímeros de óxido de polialquileno o copolímeros que tienen un número media de peso molecular de cerca de 4000 a 20,000, por ejemplo de aproximadamente 7700 a 14,600; en particular copolímeros en bloque de polioxietileno y polioxipropileno;

c) polivinilpirrolidona que tiene un número promedio de peso molecular de aproximadamente 7000 a 1,000,000, por ejemplo de aproximadamente 44,000 a 54,000

d) copolímeros vinilpirrolidona/vinilacetato que tienen un número promedio de peso molecular de aproximadamente 30,000 a 100,000, por ejemplo de aproximadamente 45,000 a 70,000;

e) polivinil alcohol que tiene un número promedio de peso molecular de aproximadamente 10,000 a 200,000, por ejemplo de aproximadamente 20,000 a 100,000; y

f) derivados de celulosa, tal como hidroxipropil metilcelulosa que tiene un número promedio de peso molecular de aproximadamente 6000 a 80,000, por ejemplo de aproximadamente 12,000 a 65,000.

De acuerdo con otra variante del proceso preferida, para el recubrimiento de un atomizado en una solución acuosa o no- acuosa o dispersión capaz de atomizar se utiliza, que contiene de 10 a 40% en peso, preferiblemente cerca de 20 a 35% en peso de al menos un polímero que se selecciona del grupo que consiste de:

g) polímeros y copolímeros de alquil (met)acrilato que tiene un número promedio de peso molecular de aproximadamente 100,000 a 1,000,000; en particular copolímeros etil acrilato/metil metacrilato y copolímeros metil acrilato/etil acrilato; y

h) polivinil acetato que tiene un número promedio de peso molecular de aproximadamente 250,000 a 700,000, posiblemente estabilizada con polivinilpirrolidona se utiliza.

Generalmente, se da preferencia a las soluciones acuosas o dispersiones acuosas para las siguientes razones: Ninguna de las mediciones especiales son necesarias para el trabajo o recuperación de los solventes; algunos materiales de recubrimiento se ofrecen preferencialmente como soluciones acuosas o dispersiones.

Sin embargo, en casos especiales, el uso de una solución no- acuosa o dispersión también puede ser ventajoso. El material de recubrimiento disuelve muy fácilmente o una proporción alta ventajosamente del material de recubrimiento se puede dispersar. De esta manera un líquido atomizado que tiene un alto contenido de sólidos puede ser atomizado, que conduce a tiempos de proceso más cortos. La entalpía de evaporación inferior del solvente no-acuoso también conduce a tiempos de proceso más cortos.

Las dispersiones que se pueden utilizar de acuerdo con la invención se obtuvieron por dispersión arriba polímeros en una fase líquida acuosa o no-acuosa, preferiblemente acuosa, con o sin un dispersante convencional. Una solución o dispersión del polímero preferiblemente se atomizan de tal manera que los gránulos se cargan en un equipo o un mezclador de lecho fluidizado y el material rociado se atomiza con calentamiento simultáneo de la carga. La energía se suministra en el equipo de lecho fluidizado por contacto con secado con gas caliente, frecuentemente aire, y en el mezclador por contacto con la pared caliente y, si es apropiado, con instrumento de calentamiento de la mezcla. Puede ser conveniente para precalentar la solución o dispersión si como un material rociado resultar puede ser atomizado con un alto contenido de materia seca. Cuando las fases líquidas orgánicas se utilizan, la recuperación del solvente es conveniente. La temperatura del producto durante el recubrimiento debería ser en el rango de cerca de 35 a 50ºC. El recubrimiento se puede realizar en el equipo de lecho fluidizado en principio en el proceso de atomización inferior (la boquilla es en la placa de distribuidor de gas y atomización ascendente) o en el proceso atomización superior (el recubrimiento se atomiza de la parte superior en el lecho fluidizado).

Ejemplos de apropiados polialquileno glicoles a) son: los polipropilenglicoles, y en particular polietilenglicoles de diversas masas molares, por ejemplo PEG 4000 o PEG 6000, obtenibles de BASF AG bajo las marcas comerciales Lutrol E 4000 y Lutrol E 6000.

En una modalidad preferida el recubrimiento de polialquilenglicol se realiza como se describe en WO 00/47060, página 4, más fino a 14 y página 10, líneas 28 a página 11, línea 9, que se incorpora aquí por referencia.

Ejemplos de los polímeros anteriores b) son: óxidos de polietileno y óxidos de polipropileno, polímeros y copolímeros mezclados de óxidos de etileno/óxidos de propileno en bloque hechos de bloques de óxido de polietileno y óxido de polipropileno, por ejemplo polímeros que se obtienen de BASF AG bajo las marcas comerciales Lutrol F 68 y Lutrol F127. De los polímeros a) y b), preferiblemente, soluciones altamente concentradas de hasta cerca del 50% en peso, por ejemplo de aproximadamente 30 a 50% en peso, basándose en el peso total de la solución, se puede utilizar ventajosamente.

Ejemplos de los polímeros anteriores c) son: polivinipirrolidonas, como se comercializan, por ejemplo, por BASF AG bajo las marcas comerciales Kollidon o Luviskol. De estas soluciones de polímeros altamente concentradas que tienen un contenido de sólidos de cerca de 30 a 40% en peso, basándose en el peso total de la solución, se pueden utilizar ventajosamente.

Un ejemplo de los polímeros antes mencionados d) es un copolímero de vinilpirrolidona/vinil acetato que se comercializa por BASF AG bajo la marca comercial Kollidon VA64. Las soluciones altamente concentradas de cerca de 30 a 40% en peso, basándose en el peso total de la solución, de estos copolímeros en particular, se pueden utilizar ventajosamente.

Ejemplos de los polímeros anteriores e) son: productos tales como se comercializaron, por ejemplo, por Hoechst bajo la marca comercial Mowiol. Las soluciones de estos polímeros que tienen un contenido de sólidos en el rango de aproximadamente 8 a 20% en peso se pueden utilizar ventajosamente.

Ejemplos de apropiados polímeros f) son: hidroxipropilmetil-celulosas, por ejemplo según se comercializa Shin Etsu bajo la marca comercial Pharmacoat.

Ejemplos de los polímeros antes mencionados g) son: polímeros y copolímeros alquil (met)acrilato cuyo grupo alquilo tiene de 1 a 4 átomos de carbono. Ejemplos específicos de copolímeros apropiados son: copolímeros de etil acrilato/metil metacrilato, que se comercializan, por ejemplo, bajo las marcas comerciales Kollicoat EMM 30D por BASF AG o bajo las marcas comerciales Eutragit NE 30 D por Röhm; también copolímeros metacrilato/etil acrilato, como se comercializan, por ejemplo, bajo las marcas comerciales Kollicoat MAE 30DP by BASF AG o bajo las marcas comerciales Eutragit 30/55 por Röhm. Los copolímeros de este tipo se pueden procesar de acuerdo con la invención, por ejemplo, como de 10 a 40% en peso de las dispersiones.

Ejemplos de los polímeros anteriores h) son: dispersiones de polivinil acetato que se estabilizan con polivinilpirrolidona y se comercializan, por ejemplo, bajo la marca comercial Kollicoat SR 30D por BASF AG (contenido de sólidos de la dispersión de aproximadamente 20 a 30% en peso).

De acuerdo con otra modalidad preferida del proceso de la invención, los gránulos se cargan en un lecho fluidizado y se recubre el polvo. El recubrimiento del polvo preferiblemente se realiza utilizando un polvo de un polímero sólido que se selecciona del grupo que consiste de hidroxipropil metilcelulosa (HPMC) que tiene un número promedio de peso molecular de cerca de 6000 a 80,000; en una mezcla con un plastificante. Los materiales apropiados para un recubrimiento del polvo también son todos otros materiales de recubrimiento que pueden estar presentes en la forma pulverulenta y no se pueden aplicar ni como una solución fundida ni como una solución altamente concentrada (por ejemplo el caso con HPMC).

El recubrimiento del polvo preferiblemente se realiza de tal manera que el material de recubrimiento continuamente se adiciona a los gránulos cargados en el lecho fluidizado. Las partículas finas del material de recubrimiento (tamaño de partícula en el rango de cerca de 10 a 100, um) consisten de la superficie relativamente áspera del crudo granulado. Atomizando en una solución plastificante, las partículas del material de recubrimiento se pegan la una a la otra. Los ejemplos de plastificantes apropiados son soluciones de polietilenglicol, trietil citrato, soluciones de sorbitol, aceite de parafina y similares. Para retirar el solvente, el recubrimiento se realiza con calentamiento ligero. La temperatura del producto en este caso está por debajo de 60ºC, por ejemplo de aproximadamente 40 a 50ºC. En principio, el recubrimiento del polvo también se puede realizar en un mezclador. En este caso, el polvo se adiciona a la mezcla y el plastificante también se inyecta vía una boquilla. El secado se realiza por el suministro de energía vía la pared del mezclador y si es apropiado vía el instrumento de la mezcla. Aquí también, como en el recubrimiento y secado en el lecho fluidizado, la baja temperatura del producto se debe mantener.

De acuerdo con otra modalidad preferida del proceso de la invención, los gránulos se cargan en un lecho fluidizado o recubiertos en un mezclador utilizando una fundida de al menos un polímero que se selecciona del grupo que consiste de a) polialquilenglicoles, en particular polietilenglicoles, que tiene un número promedio de peso molecular de cerca de 1000 a 15,000; y b) polímeros o copolímeros de óxido de polialquileno que tiene un número promedio de peso molecular de cerca de 4000 a 20,000, en particular copolímeros en bloque de polioxietileno y polioxipropileno.

El recubrimiento fundido se realiza en un lecho fluidizado preferiblemente de tal manera que el granulado que sea se recubre se carga en el equipo de lecho fluidizado. El material de recubrimiento se funde en un estanque externo y se bombea a la boquilla de aspersión, por ejemplo, vía una línea calentable. El calentamiento de gas de boquilla es conveniente. La velocidad de aspersión y la temperatura de entrada fundida se deben colocar de tal manera que el material de recubrimiento todavía corra fácilmente sobre la superficie del granulado y las capas equitativamente. Es posible para precalentar el granulado antes de las fusiones se atomizan. En el caso de materiales de recubrimiento que tienen un alto punto de fusión, la atención se debe pagar al hecho que la temperatura del producto no se debe colocar muy alto con el fin de minimizar la pérdida de la actividad de la enzima. La temperatura del producto debería estar en el rango de cerca de 35 a 50ºC. El recubrimiento fundido también se puede realizar en principio por el proceso atomizado inferior o por el proceso atomizado superior. El recubrimiento fundido se puede realizar en un mezclador de dos diferentes maneras. Ya sea el granulado recubierto se carga en un mezclador apropiado y un material de recubrimiento fundido se atomiza en el mezclador, o, en otra posibilidad, el material de recubrimiento en forma sólida es que sea mezclado con el producto, suministrando la energía vía el recipiente de la pared o vía el instrumento de la mezcla, el material de recubrimiento se funde y de este modo las capas del granulado crudo. Si se requiere, algún agente de liberación se puede adicionar de vez en cuando. Los agentes de liberación apropiados son, por ejemplo, ácido salicílico, talco, estearatos y fosfato tricálcico.

La solución del polímero, dispersión del polímero o fusión del polímero utilizada para el recubrimiento puede recibir otras adiciones, por ejemplo de celulosa cristalina, talco o caolín.

En otra modalidad de la invención los gránulos se pueden recubrir con una poliolefina como se describe en WO 03/059087, página 2, líneas 19 a página 4, línea 15.

En otra modalidad de la invención los gránulos se pueden recubrir con una dispersión que comprende las partículas de una sustancia hidrófoba dispersa en un solvente apropiado como se describe en WO 03/059086, página 2, línea 18 a la página 4 línea 8. En una modalidad preferida de este recubrimiento, se utiliza una poliolefina, se prefieren especialmente el polietileno y/o el polipropileno.

Preferiblemente los gránulos tienen una distribución del tamaño relativamente estrecha (por ejemplo, son monodispersas). Esto puede facilitar una distribución homogénea de la enzima en los gránulos en los piensos para animales. El proceso de la invención tiende a producir granulados con una estrecha distribución del tamaño. Sin embargo, si es necesario, una etapa adicional se puede incluir en el proceso para limitar aún más la distribución del tamaño de los gránulos, tal como cribado. La media de distribución del tamaño de partícula del granulado es en conformidad entre 100 \mum y 2000 \mum, preferiblemente entre 200 \mum y 1800 \mum, preferiblemente entre 300 \mum y 1600 \mum. Los gránulos pueden ser de forma irregular (pero preferiblemente regular), por ejemplo aproximadamente esférica. En una modalidad preferida los gránulos tienen una media de distribución del tamaño de partícula entre 500 y 2000 \mum, preferiblemente entre 500 y 1800 \mum, preferiblemente entre 600 y 1000 \mum. La media de distribución del tamaño de partícula se puede determinar utilizando Mastersizer S, una máquina de Malvem Instruments GmbH, Serial No., 32734-08. La media de distribución del tamaño de partícula se caracteriza por los valores de D(v,0.1), D(v,0.5) y D(v,0.9) así como el tamaño de partícula promedio de la distribución D(4,3). La media de distribución del tamaño de partícula se puede determinar tamizando, por ejemplo, con un equipo de tamizado Typ Vibro VS 1000 distribuido por Fa. Retsch.

Un proceso preferido de acuerdo con la invención por consiguiente comprende:

a) mezcla del agua (opcional), enzima, agente estabilizante y portador sólido que comprende al menos 15% (peso/peso) de un polímero de carbohidrato comestible, por ejemplo la mezcla del portador sólido y al menos un agente estabilizante con un líquido acuoso que contiene enzimas;

b) opcionalmente amasamiento de la mezcla resultante;

c) granulación, por ejemplo por elaboración mecánica, de la mezcla con el fin de obtener gránulos que contienen enzimas, por ejemplo, utilizando un granulador o por extrusión;

d) opcionalmente esferonización de los gránulos;

e) secado de los gránulos resultantes para obtener un granulado que contiene la enzima.

en donde el agente estabilizante se selecciona del grupo que consiste de agar, algina, carragenina, furcelarano, goma ghatti, goma tragacanto, goma karya, guarana, goma de algarrobilla (= goma de algarroba), goma de semilla de tamarindo, arabinogalactana, xantana (goma), al menos una proteína de animales y mezclas de estas, con la condición de que si gelatina se utiliza como el único agente estabilizante, los gránulos se recubren posteriormente.

En una modalidad preferida el granulado que contiene la enzima obtenida en la etapa e) adicionalmente se recubre.

En una modalidad preferida, se tratará de mantener la máxima temperatura a la que la(s) enzima(s) se expone sea inferior de 80ºC durante el proceso total.

El agua o líquido que contiene la enzima puede comprender una o más enzima(s) además de la fitasa. Las enzimas (incluyendo la fitasa) y son usualmente de origen microbiano, por ejemplo, obtenidas de una fermentación microbiana. Usualmente la(s) enzima(s) tendrán en una forma activa (por ejemplo podría tener actividad fisiológica o catalítica). Preferiblemente el líquido esta en una forma concentrada, tal como un ultra-filtrado (UF) o un concentrado, que puede permitir la producción de un granulado con un nivel de actividad deseado.

En otro aspecto de la invención se proporciona una formulación líquida que comprende al menos una fosfatasa y al menos un agente estabilizante, en donde el agente estabilizante se selecciona del grupo que consiste de agar, algina, carragenina, furcelarano, goma ghatti, goma tragacanto, goma karya, guarana, goma de algarrobilla (= goma de algarroba), goma de semilla de tamarindo, arabinogalactana, xantana (goma), al menos una proteína de animal y mezclas de estos.

La formulación líquida se puede preparar utilizando técnicas comúnmente utilizadas en procesos de alimento, pienso y formulación enzimática. En una modalidad, el agente estabilizante(s) se puede adicionar directamente al líquido en el cual la enzima se disolvió o dispersó. En otra modalidad de la invención el agente estabilizante(s) primero se disuelve en agua adicional, opcionalmente el pH de la solución obtenida se puede ajustar y la solución así obtenida posteriormente se mezcla con la enzima o el concentrado de enzima o la preparación líquida de enzimas. Un pH ajustado de la mezcla así obtenida es opcional. El pH se puede ajustar con sales orgánicas o inorgánicas y/o ácidos.

En una modalidad preferida la formulación líquida comprende al menos como una fosfatasa una fitasa.

El agente estabilizante se selecciona del grupo que consiste de agar, algina, carragenina, furcelarano, goma ghatti, goma tragacanto, goma karya, guarana, goma de algarrobilla (= goma de algarroba), goma de semilla de tamarindo, arabinogalactana, xantana (goma), al menos una proteína de animal y mezclas de estas. Se entiende que el agente estabilizante se puede seleccionar de un agente, por ejemplo, solo una goma, por ejemplo, guarana o estar compuesto de una mezcla de por ejemplo, una proteína de animal (por ejemplo, albúmina) y una goma (por ejemplo, tragacanto) o una mezcla de dos o tres o más diferentes proteínas de animales o gomas.

En una modalidad preferida el agente estabilizante se selecciona de agar, algina, carragenina, furcelarano, goma ghatti, goma tragacanto, goma karya, guarana, goma de algarrobilla (= goma de algarroba), goma de semilla de tamarindo, arabinogalactana, xantana (goma) o mezclas de estos.

En una modalidad preferida el agente estabilizante se selecciona de goma tragacanto, guarana, xantana y/o goma de algarrobilla.

En una modalidad el agente estabilizante es agar. Agar (o Agar-agar) es un heteropolisacarido a partir de algas rojas (Rhodophyceae). Se registra bajo el CAS no. 9002-18-0. El Agar-agar se registra como un aditivo para alimentos E 406.

En una modalidad el agente estabilizante es una algina. El término "algina" abarca el ácido algínico (CAS No.9005-32-7) y los alginatos, que son sales de ácido algínico. La algina es un polisacárido de las algas pardas (Phaeophyceae). El ácido algínico se registra como E 400; el alginato de sodio se registra como el CAS No. 9005-38-5, E 401, Potassiumalginat como E 402, Ammoniumalginat como E 304, Calciumalginat como E 404 y propilenglikolalginato como E 405.

En una modalidad el agente estabilizante es la carragenina. La carragenina es un polisacárido de las algas rojas (Rhodophyceae).

En una modalidad el agente estabilizante es el furcelarán (= agar Danés). El furcelarán es un polisacárido de la algas rojas Furcellaria fastigiata (CAS No. 9-000-21-9.

En una modalidad el agente estabilizante es la goma ghatti. La goma ghatti es un polisacárido a partir del exudado de la corteza del árbol Anogeissus latifolia (Combretaceae. Se registra bajo el CAS no. 9000-28-6.

En una modalidad el agente estabilizante es la goma tragacanto. La goma tragacanto es el nombre para un exudado del los troncos y ramas de arbustos de la familia Astragalus (Familie Fabaceae), especialmente del Astralagus gummifer. Se registra bajo el CAS no. 9000-65-1, registrado como un aditivo para alimentos bajo E.413.

En una modalidad el agente estabilizante es la goma karya (= goma sterculia). La goma karya es el nombre para el exudado del árbol Sterculia urens.

En una modalidad el agente estabilizante es guarana. El guarana es un polisacárido de la grano guar (Cyamopsis tetragonobolus).

En una modalidad el agente estabilizante es la goma de algarrobilla (= goma de algarroba, carubin). La goma del grano de algarroba es un polisacárido de la semilla de los árboles de grano de algarroba. (Ceratonia siliqua) Se registra como un aditivo para alimentos E 410.

En una modalidad el agente estabilizante es la goma de la semilla de tamarindo. La goma de la semilla de tamarindo es un polisacárido que se extrae de la semilla molida de las frutas del árbol del tamarindo (Tamarindus indica L.).

En una modalidad el agente estabilizante es la arabinogalactana. La arabinogalactana es un polisacárido de la L-Arabinosa y D-Galactosa. Se registra bajo el CAS No. 9036-66-2.

En una modalidad el agente estabilizante es la xantana (goma). La xantana es un polisacárido aniónico, microbiano, que se extrae del Xanthomonas campestris. CAS No. 111 38-66-2. Se registra como un aditivo para alimentos E 415.

En una modalidad el agente estabilizante es al menos una proteína de animal. En una modalidad preferida el agente estabilizante es al menos una proteína de animal seleccionada del grupo que consiste de proteínas de aves de corral, carne de vaca, cerdo, pescado y mezclas de estas.

Una proteína de animal de acuerdo con la invención se puede obtener a partir de cualquier animal, por ejemplo, de aves de corral, carne de vaca, cerdo o pescado. Los animales incluyen no-rumiantes o animales monogástricos (cerdos, aves de corral, carne de aves de corral, animaes marinos tales como pescado), rumiantes (bovino u ovino, por ejemplo, vacas, ovejas, cabras, ciervos, becerros, corderos). Las aves de corral incluyen pollo, gallinas, pavos, gansos y patos.

La proteína de animal se puede aislar de cualquier parte del animal, por ejemplo, también de la leche. Como una proteína de animal siempre será aislada de un animal, esta puede contener hasta 20% (en peso), de componentes no- proteínicos preferiblemente hasta el 15%, preferiblemente hasta el 10%, especialmente hasta el 5%. Una proteína de animal de acuerdo con la invención también puede ser un hidrolizado completo o parcial obtenido de una proteína de animal.

En una modalidad preferida la proteína de animal se selecciona del grupo que consiste de gelatina, caseína, albúmina, y mezclas de estas.

Las proteínas de animal apropiadas como estabilizadores incluyen, pero no se limitan a caseína, albúmina, proteína de leche, gelatina.

La gelatina (CAS No 9000-70-8, EINECS 232-554-6) se puede obtener por ejemplo de Stoess con el nombre 100 BL A.

La caseína (CAS No. 900-71-9, EG-Nr. 232-555-1) por ejemplo se puede obtener de Merck.

La albúmina es un término que abarca proteínas de suero de diferentes fuentes. Incluye lactalbumin (a partir de la leche), ovalbumin (a partir de los huevos) albúmina de suero, especialmente albúmina de suero de bovino.

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El agente estabilizante usualmente se adiciona en una cantidad de 0.01 a 50%, tal como 1 a 30% tal como 1 a 20%, tal como 3 a 10% en peso basándose en el peso total de la mezcla que sea procesada (para las formulaciones sólidas) o basándose en el final de la formulación líquida. El agente estabilizante(s) puede ya sea ser mezclado con el portador o con la enzima o se puede adicionar directamente a las formulaciones líquidas.

En otras modalidades, los ingredientes adicionales se pueden incorporar en la enzima para la formulación por ejemplo, como auxiliares de elaboración, para una adicional mejora de la estabilidad de la granulación y/o la estabilidad de almacenamiento. Un número preferido de dichos aditivos se discute a continuación.

Las sales se pueden incluir en la formulación enzimática estabilizada, sólida o líquida, (por ejemplo, con el portador sólido o agua). Preferiblemente (según se sugiere en EP-A-0,758,018) sal(s) inorgánica(s) se puede adicionar, que pueden mejorar la estabilidad de almacenamiento y procedimiento. Las sales inorgánicas preferidas son solubles en agua. Pueden comprender un catión divalente, tal como zinc (en particular), magnesio, y calcio o un cation monovalente tal como sodio o potasio. El sulfato es el anion más favorecido aunque otros aniones que resultan en solubilidad en agua, se pueden utilizar (por ejemplo, carbonato). Las sales se pueden adicionar (por ejemplo, a la mezcla) en forma sólida. Sin embargo, la(s) sal(s) se pueden disolver en el agua o líquido que contiene la enzima antes de mezcla con el portador sólido.

Para las formulaciones líquidas la(s) sal(s) se puede adicionar directamente a las formulaciones líquidas de enzimas. En conformidad la sal se suministra en una cantidad que es a partir de 0.1 a 40% en peso, preferiblemente 0.5 a 30, especialmente 1 a 25, preferiblemente 1 a 20. (% en peso, basándose en la formulación líquida final).

La formulación sólida, por ejemplo, gránulos, por consiguiente puede comprender menos del 25% (peso/peso) de la sal, preferiblemente menos del 12%, por ejemplo a partir de 2.5 a 7.5%, por ejemplo, a partir de 4 a 6%. (% en peso, basándose en la formulación sólida final).

Adicionalmente se contempla que agente(s) estabilizante(s) conocidos se pueden adicionar a las formulaciones sólidas y/o líquidas de enzimas, tales como urea, glicerol, polietilenglicol, preferiblemente polietilenglicol que tiene un peso molecular de 6000 Da o mezclas de estos. Otro ejemplo de agente(s) estabilizante(s) adicionales, que se pueden adicionar a las formulaciones sólidas o líquidas son los azúcares C5, preferiblemente xilitol o ribitol, o sorbitol, polietilenglicoles que tiene un peso molecular de 600 a 4000 Da, preferiblemente 1000 a 3350 Da, las sales disódicas de ácido malónico, glutárico y succínico y carboximetilcelulosa.

Otras mejoras de la estabilidad de la granulación se pueden obtener por la incorporación de compuestos hidrófobos, que forman el gel o se disuelven lentamente (por ejemplo, en agua). Estos se pueden proporcionar a partir de 1 a 10%, tal como 2 a 8%, y preferiblemente de 4 a 6% en peso (basándose en el peso de agua y los ingredientes del portador sólido para formulaciones sólidas) o 1 a 20% basándose en el peso de la formulación líquida. Las sustancias apropiadas incluyen celulosas derivatizadas, tales como HPMC (hidroxipropil- metil-celulosa), CMC (carboximetil-celulosa), HEC (hidroxi-etil-celulosa), microcristalina celulosa; polivinil alcoholes (PVA); y/o aceites comestibles. Los aceites comestibles, tales como aceite de soja o aceite de canola, se puede adicionar (por ejemplo, a la mezcla que sea granulada) como un auxiliar de elaboración.

Los términos "enzima" "enzima(s)" y "enzimas" como se utiliza aquí incluyen enzimas solas así como las mezclas de diferentes enzimas (por ejemplo, una fitasa y una fosfatasa ácida así como mezclas de la misma enzima de diferente origen (por ejemplo, una fitasa fúngica y una fitasa bacteriana).

Las formulaciones de enzimas de acuerdo con la invención comprenden al menos una fitasa. Las fitasas abarcan ambas 3-fitasas y 6-fitasas.

El término "fitasa" significa no solo enzimas fitasa que ocurren naturalmente, sino cualquier enzima que posee actividad de fitasa, por ejemplo la habilidad para catalizar la reacción que involucra la eliminación o liberación del fósforo inorgánico (fosfato) a partir de fosfatos de mio-inositol. Preferiblemente la fitasa pertenecerá a la clase EC 3.1.3.8. La fitasa puede ser una 3-fitasa y/o una 6-fitasa.

Una unidad de la actividad de fitasa (= FTU) se define como la cantidad de enzima que libera 1 micromol de fósforo inorgánico por minuto a partir de 0.0051 mol/I de fitato de sodio a ph 5.5 y 37ºC.

El método analítico se basa en la liberación del fosfato inorgánico a partir de fitato de sodio adicionado en exceso. El tiempo de incubación a pH 5.5 y 37ºC es 60 min. El fosfato liberado se determina vía un complejo amarillo molibdeno vanadio y se evalúa fotométricamente a una longitud de onda de 415 nm. Un estándar de fitasa de actividad conocida se corre en paralelo por comparación. La medida incrementa en la absorbancia sobre la muestra del producto se expresa como una relación con el estándar (método relativo, el método oficial AOAC).

La actividad de fitasa se puede determinar de acuerdo con "Determination of Phytase Activity in Feed by a Colorimetric Enzymatic Method": Collaborative Interlaboratory Study Engelen et al.: Journal of AOAC International Vol.84, No. 3, 2001.

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La fitasa de acuerdo con la invención puede ser de origen microbiano y/o se puede obtener por modificación genética de las fitasas que ocurren naturalmente y/o por construcción de-novo (ingeniería genética).

En una modalidad preferida la fitasa es una fitasa vegetal, una fitasa fúngica, una fitasa bacteriana o una fitasa producible por una levadura.

Las fitases preferiblemente se derivan de una fuente microbiana tales como bacteria, hongos y levaduras, pero también pueden ser de origen vegetal. En una modalidad preferida, la fitasa se deriva de una cepa fúngica, en particular una cepa de Aspergillus, por ejemplo, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus ficuum, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus nidulans y Aspergillus terreus. Se prefiere más una fitasa derivada de una cepa de Aspergillus niger o una cepa de Aspergillus oryzae.

En otra modalidad preferida, la fitasa se deriva de una cepa bacteriana, en particular una cepa de Bacillus o una cepa de Pseudomonas. Preferiblemente la enzima fitasa se deriva de una cepa de Bacillus subtilis.

En otra modalidad preferida, la fitasa se deriva de una cepa bacteriana, en particular una cepa de E. coli.

En aún otra modalidad preferida, la fitasa se deriva de una levadura, en particular una cepa de Kluveromyces o una cepa de Saccharomyces. Preferiblemente la fitasa se deriva de una cepa de Saccharomyces cerevisiae.

En el contexto de esta Invención "una enzima derivada de" abarca una enzima se produce naturalmente por la cepa particular, ya sea recuperada a partir de esa cepa o codificada por una secuencia de ADN aislada a partir de esta cepa y producida en un organismo huésped transformada con dicha secuencia de ADN.

La fitasa se puede derivar del microorganismo en cuestión mediante el uso de cualquier técnica apropiada. En particular, la enzima fitasa se pueden obtener por fermentación de un microorganismo que produce una fitasa en un medio nutriente apropiado, seguido por el aislamiento de la enzima por métodos conocidos en el arte.

El caldo o medio utilizado para el cultivo puede ser cualquier medio convencional apropiado para el crecimiento de la célula huésped en cuestión, y se puede componer de acuerdo con los principios del arte precedente. El medio preferiblemente contiene fuentes de carbono y nitrógeno y otras sales inorgánicas. Los medios apropiados, por ejemplo, medio mínimo o complejo, son disponibles a partir de proveedores comerciales, o se pueden preparar de acuerdo con recetas publicadas, por ejemplo, el Catálogo de cepas American Type Culture Collection (ATCC).

Después del cultivo, la enzima fitasa se recupera por un método convencional por aislamiento y purificación de proteínas a partir de un caldo de cultivo. Los procedimientos de purificación bien conocidos incluyen la separación de las células del medio por centrifugación o filtración, precipitando los componentes proteínicos del medio por medio de una sal tal como sulfato de amonio, y métodos cromatográficos tales como por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtración por gel, cromatografía de afinidad, etc.

De manera alterna, la enzima fitasa preferiblemente se produce en grandes cantidades utilizando técnicas de ADN recombinante, por ejemplo, como se describe en EP-A1 -0 420 358, publicación que se incorpora aquí por referencia.

Preferiblemente, un hongo de la especie Aspergillus que ha sido transformada con el gen que codifica la fitasa obtenida de la especie Aspergillus ficuum o Aspergillus niger, se cultiva bajo condiciones conducentes a la expresión del gen que codifica la fitasa como se describe en EP-A1-0 420 358.

El caldo de fermentación que contiene la fitasa preferiblemente se trata por medio de ambas filtración y ultra-filtración antes de ser utilizado en la formulación de la presente invención.

En otra modalidad preferida de la invención, las fitasas derivadas por ingeniería molecular se utilizan, por ejemplo, fitasas modificadas genéticamente como se describe en WO 94/03072 (Röhm), en WO 99/49022 (Novozymes), en WO 00/43503 (Novozymes) o en WO 03/102174 (BASF AG).

Otra fitasa preferiblemente utilizada en esta invención es la así-llamada fitasa de consenso. Esta es una fitasa desarrolla de acuerdo con un metodología de biología molecular teórica, que tiene una más alta estabilidad intrínseca comparada con las fitasas de Aspergillus, ver Publicación de la Aplicación de la Patente Europea No. 897 985. En la práctica de la presente invención, las fitasas consenso específicamente descritas en los ejemplos 3-13 también se pueden utilizar.

También es posible producir tales fitasas por ingeniería genética por lo cual el gen obtenido a partir de un hongo se transfiere a un organismo huésped como una bacteria (por ejemplo, E. coli), una levadura u otro hongo, para más detalles, ver por ejemplo, Publicación de la Aplicación de la Patente Europea No. 68431 3 y Publicación de la Aplicación de la Patente Europea No. 897 010.

En una modalidad preferida de la presente invención una fitasa de acuerdo con EP-B1 420 358 se puede utilizar.

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En una modalidad preferida de la invención la formulación enzimática de la invención además comprende una enzima(s) adicional(es).

Las enzimas adicionales preferidas para las formulaciones de la presente invención incluyen aquellas enzimas útiles en las industrias de alimento (incluyendo cocción) y pienso.

Tales enzimas incluyen pero no se limitan a proteasas (bacteriana, fúngica, ácido, neutro o alcalino), preferiblemente con un pH óptimo neutro y/o ácido.

La proteasa (enzima proteolítica) puede ser una enzima microbiana, preferiblemente una proteasa derivada de una cepa bacteriana o fúngica o la proteasa puede ser tripsina o pepsina. En una modalidad preferida, la enzima proteolítica es una proteasa bacteriana derivada de una cepa de Bacillus, preferiblemente una cepa de Bacillus subtilis o una cepa de Bacillus licheniformis. Las proteasas de Bacillus comercialmente disponibles son Alcase^{TM} y Neutrase^{TM} (Novozymes, Denmark). En otra modalidad preferida, la enzima proteolítica es una proteasa fúngica derivada de una cepa de Aspergillus, preferiblemente una cepa de Aspergillus aculeatus, una cepa de Aspergillus niger, una cepa de Aspergillus oryzae. Una proteasa de Aspergillus comercialmente disponible es Flavourzyme^{TM} (Novozymes, Denmark).

Tales enzimas incluyen pero no se limitan a lipasas (fúngica, bacteriana, mamífera), preferiblemente fosfolipasas tal como la fosfolipasas pancreáticas mamíferas A2 o cualquier lipasa triacilglicerol (E.C. 3.1.1.3).

Tales enzimas incluyen pero no se limitan a glucosas oxidasa.

Tales enzimas incluyen pero no se limitan a glicosidasas (E.C. 3.2, también conocidas como carbohidrasas), por ejemplo, amilasas (alfa o beta), celulasas (toda la celulasa o componentes funcionales de estos), en particular xilanasas, glucanasas, preferiblemente \beta-glucanasas, galactosidasas, pectinasas, y galactosidasas, tales como \alpha- o \beta-galctosidasas.

La enzima glicosidasa puede ser cualquier enzima glicosidasa (EC 3.2.1, también conocida como carbohidrasa). Preferiblemente, la enzima glicosidasa es una amilasa, en particular una \alpha-amilasa o una \beta-amilasa, una celulasa, una glucanasa, en particular una endo-1,4-\beta-glucanasa (E.C. 3.2.1.4) o una endo-1,3-\beta-glucanasa (E.C. 3.2.1.6), una xilanasa, en particular una endo-1,4-\beta-xilanasa (E.C. 3.2.1.8) o una xilan-endo-1,3-\beta-xilosidasa (E.C. 3.2.1.32), una \alpha-galactosidasa (E.C. 3.2.1.22), una poligalacturonasa (E.C.3.2.1.15, también conocida como pectinasa), una celulosa-1,4-\beta-cellobiosidase (E.C. 3.2.1.91, también conocida como celobiohidrolasas), una endo-glucanasa, en particular una endo-1,6-\delta-glucanasa (E.C. 3.2.1.75), una endo-1,2-\beta-glucanasa (E.C. 3.2.1.71), una endo-1,3-\beta-glucanasa (E.C. 3.2.1.39) o una endo-1,3-\alpha-glucanasa (E.C. 3.2.1.59). También incluyen mananasas, tales como \beta-Manosidasa (EC 3.2.1.25) y Manan-Endo-1, 4-\beta-Manosidasa (EC 3.2.1.78).

Una endo-1,4-\beta-glucanasa (E.C. 3.2.1.4) preferida de acuerdo con esta invención es la endo-1,4-\beta-glucanasa descrita en WO 01/70998 (BASF AG), que se incorpora aquí por referencia.

En una modalidad preferida la enzima adicional se selecciona del grupo que consiste de glicosidasas, fosfolipasas y glucosas oxidasa.

En una modalidad preferida la enzima adicional se selecciona del grupo que consiste de glicosidasas.

En una modalidad preferida la enzima adicional se selecciona del grupo que consiste de xilanasas, glucanasas y mezclas de estas.

En una modalidad preferida de la invención la enzima adicional es al menos una xilanasa. Las xilanasas se pueden obtener a partir de una fuente microbiana, por ejemplo, tales como Aspergillus niger, Clostridium thermocellum, Trichoderma reesei, Penicillium janthinellum, así como especie de Bacillus y Streptomyces. La xilanasa también se puede obtener por expresión recombinante por ejemplo, como se describe en EP 121 138. En una modalidad preferida una xilanasa como se describe en EP 0 463 706 B1 (BASF AG) y/o en WO 02/24926 A1 (BASF AG) se puede utilizar de acuerdo con la invención.

Las xilanasas apropiado de acuerdo con la invención pueden ser endo-xilanasas y/o exo-xilanasas, preferiblemente endoxilanasas, especialmente endo-\beta-xilanasas.

La(s) enzima(s) adicional(es) apropiada(s) son aquellas que se incluyen en piensos para animales que incluye(n) alimento para mascotas y/o en nutrición humana. La función de estas enzimas generalmente es mejorar la velocidad de conversión del pienso, por ejemplo, reduciendo la viscosidad o reduciendo el efecto anti-nutricional de ciertos compuestos de pienso. Las enzimas para alimentación también se pueden utilizar, tal como para reducir la cantidad de compuestos en el abono que son perjudiciales al ambiente.

Cuando las formulaciones de enzimas de la presente invención son para ser utilizadas en aplicaciones alimenticias, la(s) enzima(s) debe(n) ser calidad de alimentos.

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Esta dentro del alcance de la invención que al menos una, preferiblemente dos, preferiblemente tres o más diferentes enzimas se utiliza. Estos pueden ser enzimas de la misma clase, por ejemplo, dos diferentes fitasas o enzimas a partir de diferentes clases, por ejemplo, una fitasa y una xilanasa. Se debe entender que en cualquier momento que se refiera a la enzima o una enzima, también mezclas de enzimas se incluyen en estos términos, sin tener en cuenta sí tales mezclas se obtienen directamente en una sola fermentación o por mezcla de enzimas obtenibles en diferentes fermentaciones; y además incluyendo enzimas obtenibles por fermentación de organismos recombinantes.

Sí la fosfatasa es una fitasa, luego preferiblemente la formulación sólida o líquida enzimática tendrá una actividad de 1,000 a 80,000, tal como 2,000 a 70,000, tal como 3,000 a 60,000, preferiblemente 4,000 a 50,000, tal como 5,000 a 25,000, tal como a partir de 5,000 a 15,000, tal como 5,000 a 10,000 tal como a partir de 6,000 a 8,000, FTU/g.

Sí la enzima adicional es una enzima de degradación de la pared de la célula vegetal, tal como xilanasa, luego la formulación sólida o líquida final puede tener una actividad de la enzima fluctuando de 3,000 a 500,000, preferiblemente de 4,000 a 250,000, preferiblemente de 5,000 a 100,000, preferiblemente de 6,000 a 80,000, y opcionalmente de 8,000 a 70,000, EXU/g.

Si la enzima adicional es una celulasa, tal como una glucanasa, preferiblemente una J3-glucanasa, luego la formulación sólida o líquida enzimática puede tener una actividad de la enzima de 100 a 150,000, tal como 500 a 100,000, preferiblemente 750 a 50,000, preferiblemente de 1,000 a 10,000, y opcionalmente a partir de 1,500 a 7,000, BGU/g.

Una actividad de la endo-xilanasa (EXU) se define como la cantidad de enzima que libera 1.00 micromoles de azúcares reductores, medida como equivalentes de xilosa, por minuto bajo las condiciones de la prueba (pH 3,5 y 55ºC).

Una unidad de beta-glucanasa (BGU) se define como la cantidad de enzima que libera 0.258 micromoles de azúcares reductores expresados como glucosa equivalente por minuto bajo las condiciones de la prueba (pH 3,5 y 40ºC).

La actividad de la endo-xilanasa (EXU) y la actividad de la \beta-glucanasa (BGU) se puede determinar de acuerdo con Engelen et al: Journal de AOAC International Vol. 79, No. 5, 1019 (1996).

Las formulaciones sólidas, por ejemplo, los gránulos pueden comprender de 1 a 20, por ejemplo, de 5 a 20, por ejemplo, de 7 a 15% en peso de la enzima(s) (fosfatasa más enzimas adicionales).

Las formulaciones líquidas pueden comprender de 0.5 a 20, por ejemplo, de 5 a 15% en peso de la(s) enzima(s) (fosfatasa más enzimas adicionales).

Otro aspecto de la presente invención se relaciona con un proceso para la preparación de piensos para animales, o una pre-mezlca o precursor para un pienso para animal, el proceso que comprende una mezcla de una formulación sólida y/o líquida enzimática como se define en cualquier de la reivindicaciones 1 a 10 y/o la reivindicación 26 con una o más sustancias de piensos para animales (por ejemplo, semillas) o ingredientes. Este luego se puede esterilizar, por ejemplo, sometiendo al tratamiento con calor. La composición resultante puede luego en conformidad ser procesada en pellets y opcionalmente secar.

El pienso suplementado con la enzima se puede someter a varios métodos de elaboración del pienso como extrusión, expansión y granulación, donde provisionalmente pueden suceder altas temperaturas y la termoestabilización es una ventaja.

La formulación de la enzima estabilizada de la presente invención se puede aplicar por ejemplo sobre pellets de pienso. La formulación líquida enzimática termo-estabilizada se puede diluir con agua del grifo para producir una solución que tiene la actividad deseada de la enzima. En caso la fosfatasa es fitasa, la solución es preferiblemente diluida a fin de una actividad de 100 a 1000, preferiblemente 200 a 700 FTU/g, especialmente 300 a 500 F1'U/g solución se obtiene. Los pellets de pienso se pueden transferir a un mezclador mecánico y la formulación enzimática diluida se atomiza en los pellets de pienso mientras que se agitan con el fin de producir un producto homogéneo con una actividad de la enzima adicionada. Ejemplos para la fitasa que contienen pellets de pienso preferiblemente resultaran en actividades de cerca de 500 FTU/kg de pellets de pienso.

De manera alterna la formulación sólida o líquida enzimática se puede mezclar directamente con el pienso amasado antes de esta mezcla, luego se somete a un proceso tal como granulación, expansión o extrusión.

Otro aspecto de la presente invención se relaciona con un proceso para la preparación de una composición, o una pre-mezlca o un precursor apropiado para nutrición humana, el proceso que comprende una mezcla de una formulación enzimática sólida y/o líquida como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y/o la reivindicación 26 con una o más sustancia(s) o ingrediente(s) de alimento. Este luego se puede esterilizar, por ejemplo, sometido al tratamiento con calor. La composición resultante puede luego en conformidad ser procesada en pellets y opcionalmente secada.

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Preferiblemente las formulaciones sólidas (por ejemplo, gránulos) y pienso o sustancia(s) o ingrediente(s) de alimento se mezclan en una relación de gránulos: pienso o alimento sustancia(s) o ingredientes que es una más bajas de 1 g:1 kg, preferiblemente inferior de 0.5 g : 1 kg, especialmente inferior de 0.1 g : 1 kg, preferiblemente inferior de 0.05 g : 1 kg.

Otro aspecto de la invención se relaciona con el uso de una formulación enzimática sólida y/o líquida como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y/o la reivindicación 26 para la nutrición humana y/o animal. La invención por consiguiente abarca composiciones tales como composiciones de piensos para animales o composiciones apropiadas para la nutrición humana. Estas composiciones preferiblemente son en la forma de pellets (ahí puede ser 1-5, por ejemplo, 2-4 gránulos secos por pellet). Esta composición puede tener un contenido de agua de 8 a 20%, por ejemplo, a partir de 12-15%. La cantidad de enzima(s) pueden ser de 0.0001 a 0.005% en peso, en conformidad a partir de 0.0005 a 0.0012% en peso, tal como al menos 5 ppm.

En otro aspecto la presente invención concierne a un método para proporcionar a un animal monogástrico con su requisito dietético de fósforo en donde el animal se alimenta con un pienso de acuerdo con la presente invención y por lo cual ningún fosfato adicional se adiciona al pienso.

Otro aspecto se relaciona con un proceso para promover el crecimiento de un animal y/o mejora de la velocidad de conversión del pienso, el proceso que comprende la alimentación de un animal con una dieta que comprende una formulación enzimática sólida y/o líquida como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y/o la reivindicación 26.

En conformidad la composición comprende de 0.05 a 2.0, tal como 0.3 a 1.0, opcionalmente 0.4 a 0.6 FTU/g de una fosfatasa, por ejemplo, una fitasa. Una xilanasa se puede presentar a partir de 0.5 a 50, por ejemplo, 1 a 40 EXU/g, preferiblemente 2 a 25, especialmente 2 a 15 EXU/g. De manera alterna o además una celulasa se puede presentar a partir de 0.05 a 1.5, por ejemplo, 0.1 a 1,0, por ejemplo, 0.2 a 0.6 BGU/g.

Otro aspecto de la presente invención se relaciona con el uso de una formulación enzimática sólida y/o líquida como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y/o la reivindicación 26 en, o como un componente de, un pienso para animales o por uso en dieta animal.

La formulación enzimática sólida y/o líquida como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y/o la reivindicación 26, cuando se alimenta a animal y/o humano, contribuye a la reacción de la contaminación ambiental. Adicionalmente, cuando se alimenta unos animales mejoran la calidad del producto derivado del animal (por ejemplo, carne, huevos) obtenido a partir de un animal alimentado con una formulación enzimática sólida y/o líquida como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y/o la reivindicación 26.

Los animales apropiados incluyen animales de fincas (cerdos, aves de corral, ganado), no-rumiantes o animales monogástricos (cerdos, aves de corral, aves de corral, animaes marinos tales como pescado), rumiantes (bovino u ovino, por ejemplo, vacas, ovejas, cabras, ciervos, becerros, corderos). Las aves de corral incluyen pollo, gallinas, pavos, gansos y patos. Otro aspecto de la invención se relaciona con el uso de al menos un agente estabilizante seleccionado del grupo que consiste de agar, algina, carragenina, furcelarano, goma ghatti, goma tragacanto, goma karya, guarana, goma de algarrobilla (= goma de algarroba), goma de semilla de tamarindo, arabinogalactana, xantana (goma), al menos una proteína de animal y mezclas de estos en una composición que contiene fosfatasa, para mejorar la estabilidad de la enzima de la granulación.

Otro aspecto de la invención se relaciona con el uso de al menos un agente estabilizante seleccionado del grupo que consiste de agar, algina, carragenina, furcelarano, goma ghatti, goma tragacanto, goma karya, guarana, goma de algarrobilla (= goma de algarroba), goma de semilla de tamarindo, arabinogalactana, xantana (goma), al menos una proteína de animal y mezclas de estas como aditivos para la producción de formulaciones de enzimas sólidas y/o líquidas, preferiblemente para formulaciones de enzimas sólidas. En esta modalidad de la presente invención el o los agentes estabilizantes son preferiblemente adicionados como compuestos sólidos a una mezcla de granulación estándar. Tal formulación puede resultar en un recuperación incrementada (hasta 20%) de por ejemplo, actividad de fitasa determinada después de un proceso de granulación de cizallamiento alto que incluye una etapa de secado de los granulados sobre un secador de lecho fluidizado a 45ºC por 15 min. Además de dichos granulados que contienen el agente estabilizante(s) de acuerdo con la invención pueden mostrar, cuando el mezclado con pienso y/o alimento, una recuperación incrementada de la actividad enzimática después del tratamiento del pienso y/o alimento (por ejemplo, un proceso de granulación a 85ºC) comparada con un granulado sin dichos aditivos.

Los rasgos y características preferidos de un aspecto de la invención son aplicables igualmente a otros mutatis mutandis.

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Ejemplos

Todos los porcentajes son (peso/peso) a menos que se especifique de otra manera.

Ejemplo V 1

(Comparación)

La preparación de gránulos de enzimas basados en almidón de maíz por amasamiento, extrusión, esferonización y secado.

En una primera etapa el almidón de maíz se llena en un mezclador de laboratorio (Loedige Typ M5 RMK) y agitar lentamente. Una mezcla de un ultra-filtrado que contiene fitasa, ZnSO_{4} x 6 H_{2}O, PVA (polivinil alcohol) y agua adicional se vertió en un vaso de precipitados y se disuelve/dispersa. Esta mezcla se vertió en el almidón de maíz en el mezclador Loedige.

De este modo, una pasta que contiene la enzima se obtuvo, mezclando y amasando el 66% (peso/peso) de almidón de maíz, 20% (peso/peso) de un ultra-filtrado que contiene fitasa, 1% (peso/peso) de PVA, 0,3% (peso/peso) de ZnSO_{4} x 6 H_{2}O y 12,7% (peso/peso) de agua adicional a 100 - 250 rpm en el mezclador Loedige.

En una segunda etapa, esta pasta que contiene la enzima se sometió a extrusión utilizando una extrusora de laboratorio Fuji Paudal, tipo DG-L1, para obtener un extruido húmedo que luego se redondea en un esferonizador de laboratorio para obtener partículas redondas de un diámetro medio de 500 - 800 \mum.

Estas partículas se secaron posteriormente en un secador de lecho fluido (Niro-Aeromatic, tipo MP-1) por 60 - 90 minutos a una temperatura de aproximadamente 40ºC. Aproximadamente 1,5 kg de los gránulos húmedos se secaron y posteriormente se enfriaron. Los gránulos de enzima secos, obtenidos tienen una actividad de 8920 FTU/g.

1

Ejemplo 1 Caseína como estabilizador

En una primera etapa el almidón de maíz y la caseína (obtenida a partir de Merck, Darmstadt, CAS No. 900-71-9 se llena en un mezclador de laboratorio (Loedige Typ M5 RMK) y se agita lentamente. Una mezcla de un ultra-filtrado que contiene fitasa, ZnSO_{4} x 6 H_{2}O y agua adicional se vertió en un vaso de precipitados y se disuelve/dispersa. Esta mezcla se vertió en el almidón de maíz y la caseína en el mezclador Loedige. De este modo, una pasta que contienen fitasa se obtuvo mezclando y amasando los ingredientes a 100 - 250 rpm en el mezclador Loedige.

Como se describe en el ejemplo V1 gránulos que contienen enzimas se obtuvieron mediante la extrusión de la pasta, esferonización, secado y enfriamiento. Los gránulos de enzima secos obtenidos tienen una actividad de
7690 FTU/g.

2

Ejemplo 2 Caseína como estabilizador

Los gránulos que contienen la enzima (fitasa) se obtuvieron de acuerdo con el ejemplo 1. Los gránulos de la enzima secos obtenidos tienen una actividad de 7580 FTU/g.

3

Comparación de estabilidad de granulación

Los gránulos de fitasa de la invención se sometieron a una prueba de granulación y sus estabilidad de la granulación se comparó con los gránulos fabricados de acuerdo con la receta estándar (= Ejemplo V1. La prueba de granulación consiste de la mezcla de los diferentes gránulos de la enzima con una dieta estándar de la parrilla a un nivel de 1 g/kg de pienso. Este pienso que contiene la enzima se trató por inyección de vapor en un comprimido acondicionado e inmediatamente después en una prensa de granulación para obtener los pellets de pienso, que posteriormente se enfriaron. La medición de la temperatura del pellet directamente después de la prensa de granulación fue 78ºC. Este tipo de proceso usualmente se utiliza en la industria de piensos para obtener pellets de pienso. El ejemplo 1 así como el ejemplo 2 mostraron un incremento de al menos 10% en la estabilidad de la granulación en comparación con el ejemplo V1.

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Referencias citadas en la descripción Esta lista de referencias citadas por el aspirante es solamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento de patente Europea. Aún cuando se ha tenido gran cuidado en recopilar las referencias, los errores u omisiones no se pueden excluir y la EPO desconoce toda responsabilidad a este respecto. Documentos de las patentes citadas en la descripción

\bullet EP 0758018 A1 [0007]

\bullet GB 2167758 A [0008]

\bullet EP 1069832 A1 [0009]

\bullet WO 0047060 A [0009] [0067]

\bullet EP 858266 A [0010]

\bullet WO 9716076 A [0010]

\bullet EP 862623 A1 [0011]

\bullet WO 9712958 A [0011]

\bullet DE 1958104 [0013]

\bullet DE 2137043 [0014]

\bullet DE 2137042 [0014]

\bullet EP 716685 A [0015]

\bullet WO 0036927 A [0016]

\bullet WO 03059087 A [0017] [0080]

\bullet WO 03059086 A [0018] [0081]

\bullet WO 9316175 A [0024]

\bullet EP 626010 A [0024]

\bullet EP 0969089 A1 [0025]

\bullet WO 9854980 A [0026]

\bullet WO 98155599 A [0026]

\bullet EP 0758018 A [0115]

\bullet EP 0420358 A1 [0136] [0137]

\bullet WO 9403072 A [0139]

\bullet WO 9949022 A [0139]

\bullet WO 0043503 A [0139]

\bullet WO 03102174 A [0139]

\bullet EP 897985 A [0140]

\bullet EP 684313 A [0141]

\bullet EP 897010 A [0141]

\bullet EP 420358 B1 [0142]

\bullet WO 0170998 A [0151]

\bullet EP 121138 A [0155]

\bullet EP 0463706 B1 [0155]

\bullet WO 0224926 A1 [0155].

Literatura no-patente citada en la descripción

\bulletENGELEN et al. Determination of Phytase Activity in Feed by a Colorimetric Enzymatic Method'': Collaborative Interlaboratory Study. Journal of AOAC International, 2001, vol. 84 (3 [0125]

\bulletENGELEN et al. Journal of AOAC International, 1996, vol. 79 (5), 1019 [0165].

Claims (32)

1. Una formulación enzimática estabilizada, sólida o líquida que comprende al menos una fitasa y al menos un agente estabilizante, en donde el agente estabilizante es al menos una proteína de animal estabilizante, con la condición de que si se utiliza la gelatina en gránulos como formulaciones sólidas, como el único agente estabilizante, los gránulos se recubren posteriormente.

2. Formulación enzimática de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la fitasa es una fitasa vegetal, una fitasa fúngica, una fitasa bacteriana, una fitasa producible por una levadura o una fitasa de consenso.

3. Formulación enzimática de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la proteína de animal se selecciona del grupo que consiste de las proteínas de las aves de corral, carne de vaca, cerdo, pescado y mezclas de estos.

4. Formulación enzimática de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la proteína de animal se selecciona del grupo que consiste de gelatina, caseína, albúmina y mezclas de estas.

5. Formulación enzimática de acuerdo con cualquier Reivindicación precedente que comprende al menos un agente estabilizante adicional seleccionado del grupo que consiste de agar, algina, carragenina, furcelarano, goma ghatti, goma tragacanto, goma karya, guarana, goma de algarrobilla (= goma de algarroba), goma de semilla de tamarindo, arabinogalactana y xantana (goma).

6. Formulación enzimática de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 caracterizada porque la formulación es líquida.

7. Formulación enzimática de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque la formulación es sólida.

8. Formulación enzimática de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado porque la formulación sólida es en la forma de gránulo(s).

9. Formulación enzimática de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el gránulo(s) comprende un portador sólido que comprende al menos 15% (peso/peso) de un polímero de carbohidrato comestible.

10. Formulación enzimática de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el gránulo(s) se recubre.

11. Un proceso para la preparación de gránulo(s) que contienen fitasa, el proceso que comprende procesar

(i) al menos una fitasa,

(ii) un portador sólido que comprende al menos 15% (peso/peso) de un polímero de carbohidrato comestible, y

(iii) al menos un agente estabilizante, en donde el agente estabilizante es al menos una proteína de animal, con la condición de que sí la gelatina se utiliza como el único agente estabilizante, los gránulos se recubren posteriormente.

12. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 11 en donde se adiciona agua al proceso.

13. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 12 en donde el agua y la fitasa se suministran como líquido(s) acuoso(s) que contiene la enzima.

14. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 13 en donde el líquido es un filtrado derivado de un proceso de fermentación que resulta en la producción de la fitasa.

15. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 en donde los gránulos se secan después del proceso.

16. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15 en donde la proteína de animal se selecciona del grupo que consiste de proteínas a partir de las aves de corral, carne de vaca, cerdo, pescado y mezclas de estos.

17. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16 en donde la proteína de animal se selecciona del grupo que consiste de gelatina, caseína, albúmina y mezclas de estas.

18. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 17 en donde el agente estabilizante comprende al menos un agente estabilizante adicional seleccionado del grupo que consiste de agar, algina, carragenina, furcelarano, goma ghatti, goma tragacanto, goma karya, guarana, goma de algarrobilla (= goma de algarroba), goma de semilla de tamarindo, arabinogalactana y xantana (goma).

19. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 18 en donde el proceso comprende:

a) mezcla de un líquido acuoso que contiene la fitasa con el portador sólido y el agente estabilizante;

b) procesar mecánicamente la mezcla obtenida en a) para obtener gránulos que contienen fitasa; y

c) secado de los gránulo(s) que contienen fitasa obtenidos en b).

20. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 19 en donde el procedimiento es mecánico y comprende extrusión, granulación, granulación de cizallamiento alto, expansión, aglomeración de lecho fluido, esferonización, granulación en tambor o una combinación de estos.

21. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 20 en donde la fitasa-que contiene líquido acuoso, el portador sólido y el agente estabilizante se mezclan y la mezcla obtenida se amasa antes de la granulación.

22. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 21 en donde el procedimiento es la extrusión realizada a presión baja y/o en una extrusora de canasta- o domo.

23. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 22 en donde el o los gránulos son esferonizados.

24. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 23 en donde el o los gránulos se recubren.

25. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 24 en donde la fitasa es una fitasa vegetal, una fitasa fúngica, una fitasa bacteriana, una fitasa producible por una levadura o una fitasa de consenso.

26. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 25, en donde el o los gránulos tendrán una actividad de fitasa fluctuando de 1,000 a 80,000 FTU/g, preferiblemente de 2,000 a 70,000 FTU/g, preferiblemente 3,000 a 60,000 FTU/g, más preferiblemente 4,000 a 50,000 FTU/g y más preferiblemente de 5,000 a 15,000 FTU/g.

27. Los gránulos que contienen fitasa, obtenidos por un proceso como se define en cualquiera de las reivindicaciones 11 a 26.

28. Un proceso para la preparación de un pienso para animales, o una pre-mezcla o precursor para unos piensos para animales, el proceso que comprende una mezcla de una formulación estabilizada sólida y/o líquida de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y/o la reivindicación 27 con una o más sustancia(s) o ingrediente(s) de piensos para animales.

29. Un proceso para la preparación de una composición, o una pre-mezcla o un precursor apropiado para la nutrición humana, el proceso que comprende la mezcla de una formulación estabilizada sólida y/o líquida de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y/o la reivindicación 27 con una o más sustancia(s) o ingrediente(s) de alimento.

30. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 29 en donde la mezcla de sustancia(s) de piensos o alimentos y formulación estabilizada sólida y/o líquida de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y/o la reivindicación 27 se esteriliza o trata con vapor, se peletiza y opcionalmente se seca.

31. Uso de la formulación estabilizada sólida y/o líquida de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y/o la reivindicación 27 para la nutrición humana y/o animal.

32. Un proceso para promover el crecimiento de un animal y/o mejorar la velocidad de conversión de los piensos, el proceso que comprende la alimentación de un animal con una dieta que comprende la formulación estabilizada sólida y/o líquida de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y/o la reivindicación 27.