ES2306080T3 - Procedimiento para el diagnostico de septicemina mediante determinacion selectiva de la concentracion de superoxidodismutasa cu/zn (sod cu/zn) en muestras de pacientes. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la determinación precoz del riesgo de mortalidad de pacientes en la unidad de cuidados intensivos para los que el diagnóstico clínico es septicemia, septicemia grave o shock séptico, caracterizado porque en una muestra de suero o plasma de un tal paciente, por medio de un procedimiento de determinación inmunoquímico específico para la superoxidodismutasa Cu/Zn (SOD Cu/Zn o SOD-1) se determina selectivamente la concentración de la SOD Cu/Zn y porque las concentraciones que se encuentran por encima de un valor umbral previamente fijado se correlacionan con un alto riesgo de mortalidad.

Description

Procedimiento para el diagnóstico de septicemia mediante determinación selectiva de la concentración de superoxidodismutasa Cu/Zn (SOD Cu/Zn) en muestras de pacientes.

La invención se refiere a un nuevo procedimiento pronóstico que puede aplicarse en el marco de la atención clínica de pacientes en las unidades de cuidados intensivos y de urgencias, en especial de pacientes con septicemia, y que permite hacer afirmaciones sobre el riesgo de mortalidad o la probabilidad de supervivencia de tales pacientes.

La presente invención tiene su punto de partida en los intensos trabajos de investigación del solicitante en relación con nuevas mejoras en el diagnóstico y el tratamiento de la septicemia.

Se designan en general como inflamaciones determinadas reacciones fisiológicas de un organismo frente a acciones exteriores, como p. ej. heridas, quemaduras, alergenos, infecciones por microorganismos tales como bacterias y hongos y virus, frente a tejidos extraños que desencadenan reacciones de rechazo, o frente a determinados estados endógenos del cuerpo que desencadenan inflamaciones, p. ej. en el caso de la enfermedades autoinmunes y el cáncer.

Las inflamaciones locales son por lo general parte de la reacción inmune sana del cuerpo frente a efectos perjudiciales, y por lo tanto forman parte del mecanismo de defensa del organismo para la conservación de la vida. Sin embargo, si las inflamaciones son parte de una reacción mal dirigida del cuerpo frente a procesos endógenos tales como p. ej. en el caso de las enfermedades autoinmunes y/o son de naturaleza crónica, o si alcanzan una medida sistémica como en el caso del síndrome de inflamación sistémica (Systemic Inflammatory Response Syndrome, SIRS) o en el caso de un septicemia atribuible a causas infecciosas, los procesos fisiológicos típicos para la reacción inflamatoria quedan fuera de control y se convierten en procesos patológicos verdaderos, a menudo amenazantes para la vida, que deben atenderse de manera correspondiente del modo característico en la unidad de cuidados intensivos de una clínica. En la descripción siguiente se designa a los pacientes de este tipo de modo general como pacientes septicémicos, aunque este término no presuponga necesariamente un diagnóstico previo de septicemia en los pacientes y deberá incluir en general pacientes con enfermedad crítica en unidades de cuidados intensivos para los que exista un riesgo de septicemia.

Se sabe hoy que la aparición y el curso de los procesos inflamatorios son controlados por un número considerable de sustancias que en su mayoría son de naturaleza proteínica o peptídica, o que van acompañados de la presencia en un tiempo más o menos limitado de determinadas biomoléculas. Entre las sustancias endógenas participantes en las reacciones inflamatorias se pueden incluir en especial aquellas que se cuentan entre las citoquinas, los mediadores, las sustancias vasoactivas, las proteínas de fase aguda y/o los reguladores hormonales. La reacción inflamatoria constituye una reacción fisiológica compleja, en la que participan tanto sustancias que activan el proceso inflamatorio (p. ej. TNF-\alpha) como también sustancias desactivadoras (p. ej. interleucina-10).

En las inflamaciones sistémicas como en el caso de una septicemia o un shock séptico, la cascada de reacciones específicas de la inflamación se extiende de manera incontrolada por todo el cuerpo y se convierte en amenazante para la vida en el sentido de una respuesta inmune excesiva. Sobre los conocimientos actuales acerca de la aparición y el posible papel de los distintos grupos de sustancias endógenas específicas de la inflamación se remite por ejemplo a A. Beishuizen et al. "Endogenous Mediators in Sepsis and Septic Schock", Advance in Clinical Chemistry, Vol. 33, 1999, 55-131; y C. Gabay, et al, "Acute Phase Proteins and Other Systemic Responses to Inflamation", The New England Journal of Medicine, Vol. 340, No. 6, 1999, 448-454. Ya que la comprensión de la septicemia, y con ello también de las definiciones admitidas, se ha modificado en los últimos años, se remite también a K. Reinhart, et al., "Sepsis und septischer Schock", en: Intensivmedizin, Georg Thieme Verlag, Stuttgart. New York, 2001,756-760, donde se da una definición moderna del concepto de septicemia. Se remite además al significado del cuadro clínico de la "septicemia grave" (34; las cifras entre paréntesis se refieren a las referencias bibliográficas en esta memoria, que aparecen bajo el mismo número en la lista de bibliografía del final de la memoria). Un resumen más reciente de los criterios y definiciones de una septicemia y cuadros clínicos estrechamente relacionados con ella se encuentran en http://www.talessin.de/-scripte/medizin/sepsis1.html. Dentro del marco de la presente solicitud el concepto de septicemia se utilizará en un sentido global apoyándose en las definiciones, tal como han podido tomarse de las publicaciones mencionadas, para cuadros clínicos sépticos de parientes gravemente enfermos en unidades de cuidados
intensivos.

Mientras que al menos en el ámbito europeo la infección bacteriana sistémica detectable mediante un cultivo positivo en sangre ha caracterizado durante mucho tiempo el concepto de septicemia, ésta se entiende hoy sobre todo como inflamación sistémica que tiene causas infecciosas, aunque como proceso patológico presenta grandes similitudes con las inflamaciones sistémicas desencadenadas por otras causas. Al mencionado cambio en la comprensión de lo que es la septicemia le corresponden modificaciones en el modo de abordarlo en el diagnóstico. Así, la detección directa de los agentes patógenos bacterianos se sustituye o se complementa por medio de una vigilancia completa de los parámetros de laboratorio y los parámetros hemodinámicos utilizando los llamados sistemas Score, asistidos por ordenador (p. ej. APACHE II SCORE; APACHE representa "Acute Phisiology and Chronic Health Evaluation"; cf. (33) así como la introducción de DE 42 27 454 C1), y en época más reciente también mediante la detección de determinados sucesos sépticos o de las sustancias endógenas participantes en los sucesos inflamatorios, es decir, "biomarcadores" específicos.

Del gran número de mediadores y de proteínas de fase aguda, para fines diagnósticos son especialmente adecuados aquellos cuya aparición es muy específica de la septicemia o de determinadas fases de la misma, cuyas concentraciones se modifican de manera drástica y diagnósticamente significativa y que, además, presentan estabilidades necesarias para las determinaciones de rutina y alcanzan elevados valores de concentración. Para fines diagnósticos se pone en un primer plano la correlación fiable entre el proceso patológico (septicemia) y los correspondientes biomarcadores, sin que sea necesario siempre conocer en detalle su papel en la cascada compleja de sustancias endógenas participantes en el proceso septicémico.

Una sustancia endógena especialmente apropiada como biomarcador de la septicemia es la procalcitonina. La procalcitonina es una prohormona cuyas concentraciones en suero alcanzan valores muy elevados bajo condiciones de inflamación sistémica de etiología infecciosa (septicemia), mientras que en personas sanas prácticamente no es detectable. Además, valores elevados de procalcitonina se alcanza en una fase relativamente temprana de la septicemia, de tal modo que la determinación de procalcitonina es adecuada también para la detección temprana de una septicemia y para diferenciar en fase inicial una septicemia de origen infeccioso de inflamaciones graves debidas a otras causas. La determinación de procalcitonina como marcador de la septicemia es objeto de la publicación M. Assicot, et al., "High serum procalcitonin concentrations in patients with sepsis and infection", The Lancet, vol. 341, No. 8844, 1993, 515-518, y de las patentes DE 42 27 454 C2 o EP 0 656 121 B1 o US 5,639,617 respectivamente. Para completar esta memoria se hace referencia expresa a las mencionadas patentes y a las anteriores citas bibliográficas señaladas en las publicaciones mencionadas.

La disponibilidad del marcador de septicemia procalcitonina ha dado un fuerte impulso a la investigación de la septicemia, y actualmente se están realizando grandes esfuerzos para encontrar más biomarcadores que puedan completar la determinación de la procalcitonina y/o que puedan proporcionar informaciones adicionales para fines de diagnóstico fino o diagnóstico diferencial. Sin embargo, la búsqueda de nuevos biomarcadores potenciales de la septicemia se ve dificultada por el hecho de que a menudo se sabe muy poco o nada acerca de la función precisa o de las razones concretas de la aparición de determinadas sustancias endógenas que participan en el proceso septicémico.

Los resultados de la verificación experimental de un enfoque fructífero puramente hipotético para determinar otros marcadores potenciales de la septicemia se encuentran en DE 198 47 690 A1 o WO 00/22439. Se muestra allí que en el caso de la septicemia no sólo aumenta la concentración de la prohormoma procalcitonina, sino que también para otras sustancias que pueden incluirse en las prohormonas peptídicas o que constituyen fragmentos de prohormonas de este tipo y que presentan una inmunoreactividad típica para tales prohormonas, pueden observarse aumentos significativos de la concentración. Mientras que el fenómeno descrito está bien documentado, las causas precisas del aumento detectable de las concentraciones de prohormonas o sus fragmentos en la septicemia sigue estando sin aclarar en la mayoría de los casos.

La presente solicitud es un resultado de otro enfoque fructífero y puramente experimental para la búsqueda de otras biomoléculas específicas de la septicemia. Se basa en que al administrar una endotoxina a primates (babuinos) se les provoca una septicemia artificial y después, comparando los modelos de manchas de proteína en electroforesis en gel de babuinos tratados y no tratados con endotoxina, se determinan las sustancias de naturaleza péptica o proteínica que sólo pueden encontrarse en los babuinos "\cdotsepticémicos" y que constituyen por consiguiente potenciales biomarcadores específicos de la septicemia. Se eligió el modelo de primates debido a la gran similitud de la fisiología de primates y seres humanos y a la elevada reactividad cruzada con muchos reactivos terapéuticos y diagnósticos humanos.

Tal como se indica con mayor exactitud en la parte experimental de solicitudes de patente más antiguas que la solicitante, tras desencadenar experimentalmente una septicemia artificial en babuinos mediante la administración de endotoxinas (LPS de Salmonella Typhimurium) y el tratamiento electroforético en gel de 2D de tejido hepático de los animales tratados, se encontró un cierto número de manchas de proteína identificables sólo en los animales tratados. Los productos proteínicos correspondientes a las manchas se aíslan a partir del gel de electroforesis y se analizan mediante espectrometría de masas (en muchos casos también mediante espectrometría de masas en tándem).

Después del procedimiento mencionado, igual que se describió por primera vez en solicitudes de patente alemana y europea anteriores a la solicitante, se identificaron como nuevos marcadores de septicemia, entre otros, las proteínas "inflamina" (WO 02/085937), CHP (WO 03/005035), fragmentos solubles de citoqueratina-1 (sCY1F; WO 03/002600), la proteína LASP-1 (WO 03/089934) así como enzimas tales como aldosa-1-epimerasa (mutarotasa; WO 03/048780), glicina-N-acil-transferasa (GNAT; WO 03/048781) y carbamoilfosfato sintetasa 1 soluble (CPS 1; WO 03/089933).

El contenido de las citadas solicitudes anteriores debe considerarse, debido a la referencia expresa de estas solicitudes, como parte de la exposición de la presente solicitud.

En los análisis descritos se encontraron como manchas de proteínas específicas de la septicemia también numerosas sustancias que ya eran conocidas como las denominadas "proteínas de fase aguda" o para las que una investigación bibliográfica posterior ya había señalado que su presencia ya se había discutido en relación con inflamaciones o septicemias.

Una mancha proteica de este tipo fue también la mancha que en su preparación analítica resultó ser una enzima superoxidodismutasa, en concreto la enzima superoxidodismutasa dependiente de Cu y Zn (Cu/Zn SOD; SOD-1).

Las superoxidodismutasas (SOD, EC 1.15.1.1) son enzimas con función antioxidante que están en condiciones de transformar el anión superóxido O_{2}^{-} en especies menos reactivas. Las células eucarióticas contienen dos tipos SOD distintos, en concreto Cu/Zn SOD (conocido también como SOD-1) y Mn SOD. La Cu/Zn SOD humana se encuentra principalmente en citosol. Cu/Zn es un dímero formado por dos subunidades distintas con una masa molar de aproximadamente 33 kDA. La Mn SOD (SOD-2) humana, que se encuentra sobre todo en las mitocondrias, es un homotetrámero y presenta una masa molar de aproximadamente 80 kDA. Se identificó además una SOD extracelular o EC-SOD que está presente, entre otros, en los fluidos extracelulares tales como plasma, linfa y líquido sinovial. Las secuencias de ADNc o aminoácidos de los tres tipos de SOD anteriormente indicados son conocidas (véase p. ej. (27), (28), (29)) y se diferencian considerablemente. Pueden verse en bancos de datos pertinentes (p. ej. http://www.expasy.org/cgi-bin/niceprot) (Cu/Zn SOD o SOD1: Swiss-Prot Accession Number: P00441; Mn SOD o SOD2: Swiss-Prot Accession Number: P04179; SOD extracelular o ECSOD o SOD3; Swiss-Prot Accession Number: P08294). Cuando en la descripción siguiente sólo se utiliza la abreviatura SOD no se diferencia entre los distintos tipos de SOD, es decir, por lo general se trata de la discusión de encontrar y hacer afirmaciones en las que el efecto enzimático está en un primer plano.

Debido a las distintas secuencias de sus subunidades, los tres tipos de SOD presentan inmunorreactividades diferentes y pueden determinarse selectivamente con ayuda de inmunoensayos de reacción no cruzada (véase p. ej. (2)). Tanto la SOD Cu/ZN humana como también la SOD Mn humana se prepararon ya en forma recombinante para fines/ensayos terapéuticos (véase (5) y las referencias bibliográficas allí mencionadas).

En especial para SOD-1 y SOD-2 existe una amplia literatura científica, que sin embargo ofrece una imagen compleja y en parte contradictoria del proceso fisiológico y del papel de los distintos tipos de SOD en diferentes estados patológicos, en diversas especies y órganos o tejidos y bajo distintas influencias externas. Entre otras cosas, se sabe desde hace bastante tiempo que mediante endotoxinas (LPS) puede influirse sobre la expresión o traducción de SOD y que el efecto de las LPS depende, al menos en ratas, entre otras cosas del porcentaje de oxígeno en el aire respiratorio (véase p. ej. (1) y (3)). No obstante, los resultados experimentales se diferencian de manera considerable según el origen del tejido estudiado o el cultivo celular analizado y dependen de si se consideran a nivel de ARNm o de proteínas, desempeñando además un papel adicional el intervalo de tiempo de la observación (véase p. ej. (1) a (4); (6), (7), (9); (10), (12), (13), (14)). Sin embargo, puede afirmarse generalizando que en la mayoría de los casos se informa sobre un aumento de la expresión/traducción de SOD Mn bajo la influencia de LPS, mientras que un efecto correspondiente con respecto a SOD Cu/Zn no se observa o sólo con una intensidad claramente inferior. En la mayoría de los casos se informa incluso de una disminución de SOD Cu/Zn bajo la influencia de LPS (véase p. ej. (1) a (4), (7), (9), (10), (12) a (14)). Se ha discutido el aumento de la formación de SOD en distintas enfermedades inflamatorias como parte de un mecanismo de protección frente a las especies reactivas de oxígeno (ROS) y en consecuencia se usó SOD también como agente terapéutico, entre otras cosas, para inhibir la inflamación (véase (5)).

El hecho de que muchos de los resultados se obtuvieron con modelos animales distintos complica adicionalmente la imagen. Así, los efectos protectores de una administración de LPS observados en ratas no pudieron verificarse, p. ej., en el ganado bovino (véase p. ej. (13) y las citas bibliográficas allí indicadas). No obstante, existe unanimidad en que la SOD, junto entre otras cosas con un estrés de oxígeno y reacciones inflamatorias del cuerpo, desempeña un papel fisiológico importante.

Por consiguiente, la SOD ya se ha discutido junto con la septicemia o las complicaciones típicas de la misma. En la publicación (8) o en la solicitud de patente WO 94/22016 A1 respectiva ligada a ella, se comunica que los pacientes con septicemia presentan niveles aumentados de SOD Mn y que con niveles de SOD Mn superiores a un determinado valor umbral aumenta mucho el riesgo de desarrollar una insuficiencia respiratoria aguda (ARDS; adult respiratory distress syndrome), muy temida como complicación. La SOD Mn se midió inmunológicamente mediante un ensayo ELISA selectivo.

A partir de estos resultados y tomándolos como referencia se estudió a continuación varias veces el papel de la SOD en la septicemia y en concreto, entre otras cosas, también con la esperanza de obtener mediante la determinación de SOD puntos de referencia tempranos para el curso esperado de una septicemia (véase (11), (15) a (17), (19, (20)). Sin embargo, en ninguno de los estudios se produjo una determinación selectiva de los distintos tipos de SOD, sino que se determinó en conjunto la actividad enzimática de la SOD con procedimientos ((30), (31)) que no permiten hacer afirmaciones sobre a qué tipo de SOD es atribuible la actividad enzimática detectada en la muestra. Sin embargo, sobre el trasfondo de la publicación básica anteriormente citada (8) o WO 94/22016 A1 se tuvo que suponer que la actividad enzimática de SOD medida debe atribuirse, como mínimo de forma mayoritaria, al aumento de los valores de SOD Mn y posiblemente de modo adicional de los de SOD-EC. En ninguna de las publicaciones anteriormente mencionada se discutió el papel específico de la SOD Cu/Zn o una especial utilidad de la determinación selectiva de SOD Cu/Zn en relación con la septicemia. Hay que reseñar en este contexto que la medición de una actividad enzimática no puede equipararse a la medición de la concentración de una biomolécula responsable del efecto enzimático, o de un grupo de moléculas de este tipo, ya que en las muestras analizadas el efecto enzimático p. ej. puede inhibirse o intensificarse sin que necesariamente deba cambiar la concentración de la enzima/de las enzimas. Para la SOD se ha descrito p. ej. una reducción del efecto enzimático debido a la especie de nitrógeno reactiva (RNS) (24).

M. Galikowski et al., en: Research in Surgery, Vol. 6, No. 1, abril 1994, págs. 31 a 34 describen un estudio en un modelo de conejo en el que, entre otras cosas, se midió cómo un determinado antibiótico de amplio espectro (cefoperazona) influye sobre la actividad enzimática de SOD-1 en el caso de una extirpación quirúrgica de la vesícula biliar (colecistectomía) por un lado y, por otro lado, una septicemia artificial desencadenada por la administración de LPS.

En el caso de la septicemia artificial desencadenada por la administración de LPS, la actividad de la SOD (designada como actividad enzimática de SOD-1) aumenta de una manera en sí conocida. No se establece una relación de la actividad SOD medida y las mortalidades en conejos a consecuencia de la administración de LPS.

Tampoco en publicaciones más recientes que muestran que la expresión del gen para SOD Cu/Zn parece estar controlada por el nitrógeno ((14), (18), se establece una relación entre la concentración de la SOD Cu/Zn medible en pacientes septicémicos y el curso esperable de una septicemia. Se discute el aumento de la expresión de SOD Cu/Zn como mecanismo protector.

En vista de la clara detección de la SOD Cu/Zn en el modelo de septicemia en babuinos de la solicitante y en vista del hecho de que los datos que aparecen en la literatura sobre la aparición de SOD en caso de septicemia con respecto al papel de la SOD humana en el marco del proceso septicémico y la utilizad diagnóstica de una determinación específica de SOD Cu/Zn en muestras de suero o plasma de pacientes septicémicos no daban ningún punto de referencia seguro, el solicitante decidió comprobar mediante la medición de muestras de suero o plasma de un gran colectivo de pacientes septicémicos si existe alguna relación entre las concentraciones medibles de SOD Cu/Zn humana en las muestras y el desarrollo documentado de la enfermedad de los pacientes de los que procedían las muestras analizadas.

Detrás seguía la carencia dolorosamente percibida de que a pesar del marcador diagnóstico de septicemia de la procalcitonina, introducido entretanto en la práctica clínica y bien acreditado, seguía existiendo una necesidad urgente de biomarcadores complementarios para el diagnóstico fino de la septicemia y en especial para el diagnóstico precoz de la misma que presenten un potencial diagnóstico y sobre todo pronóstico que pueda completar de manera lógica la vigilancia clínica continua de parámetros múltiples (p. ej. según APACHE II SCORE) o que incluso pueda ser eventualmente equivalente a una vigilancia de este tipo.

De las mediciones realizadas por el solicitante de la SOD Cu/Zn en las muestras de suero o plasma de pacientes de unidades de cuidados intensivos o de urgencias resultó sorprendentemente que los valores medidos presentan una excelente correlación con el curso observado de la enfermedad o septicemia y, en especial, que permiten una asignación temprana segura de los pacientes enfermos críticos a los grupos de pacienten que probablemente sobrevivirán o que no sobrevivirán. La determinación cuantitativa de la SOD Cn/Zn indicó, con una notable especificidad y sensibilidad diagnóstica no superada por ninguno de los otros marcadores bioquímicos estudiados, la probabilidad de supervivencia de pacientes que fueron ingresados en la unidad de cuidados intensivos, por lo general con sospecha o diagnóstico de septicemia. Permite con ello la identificación de un grupo de pacientes de riesgo especial entre los pacientes de septicemia.

Por consiguiente, la presente invención se refiere conforme a la reivindicación 1 a un procedimiento para el cálculo precoz del riesgo de mortalidad de pacientes de la unidad de cuidados intensivos para los que el diagnóstico clínico indica septicemia, septicemia grave o shock séptico, en el que en una muestra de suero o plasma de un tal paciente, por medio de un procedimiento de determinación inmunoquímico específico para la superoxidodismutasa Cu/Zn (SOD Cu/Zn o SOD-1) se determina selectivamente la concentración de la SOD Cu/Zn medida -cuantita o semicuantitativamente- y las concentraciones que se encuentran por encima de un valor umbral previamente fijado se correlacionan con un alto riesgo de mortalidad (una baja probabilidad de supervivencia).

Son objeto de las reivindicaciones 2 a 9 configuraciones ventajosas o habituales en el campo especializado de un procedimiento de este tipo.

A continuación se explicará con más detalles el procedimiento según la invención tomando como referencia los resultados de medición y las representaciones gráficas que muestran estos resultados de medición.

Las Figuras muestran:

Figura 1: los valores de la medición de las concentraciones de SOD Cu/Zn para un colectivo de pacientes septicémicos, habiéndose realizado las mediciones con ayuda de un inmunoensayo enzimático específico para SOD Cu/Zn. Teniendo en cuenta la documentación correspondiente del curso de la enfermedad, las muestran se asignaron a un grupo de pacientes fallecidos y a un grupo de supervivientes;

Figura 2: los resultados de las mediciones de la actividad enzimática de la SOD para las mismas muestras que en la Fig. 1, en la misma división entre pacientes fallecidos y supervivientes;

Figura 3: una evaluación de los resultados de medición mostrados en las Figs. 1 y 2 en la forma de un ROC-Plot, cotejándose los resultados de las mediciones inmunoquímicas de la SOD Cu/Zn (línea continua gruesa) con los resultados de la medición de la actividad enzimática de la SOD (línea de puntos).

Tal como resulta de los ejemplos que siguen a continuación, se realizaron las mediciones inmunoquímicas de la SOD Cu/Zn en plasmas de pacientes de unidades de cuidados intensivos (pacientes septicémicos) con un ensayo ELISA disponible comercialmente para fines de investigación (31), siguiendo las instrucciones del fabricante.

Se entiende, no obstante, que supuesta la sensibilidad y especificidad necesarias también puede usarse cualquier otro inmunoensayo para la determinación de SOD Zn/Cu que funcione según principios conocidos. Ejemplos de ensayos de este tipo se encuentran, entre otros, en (2) y en solicitudes de patentes tales como EP 217 542 A2, EP 327 337 A2 y WO 90/06513 A1.

Para la medición pueden usarse en principio todos los procedimientos inmunoquímicos apropiados para la determinación selectiva cuantitativa, o al menos semicuantitativa, de SOD Cu/Zn.

En una forma de realización preferida el procedimiento se realiza como inmunoensayo sandwich heterogéneo, en el que un anticuerpo específico para SOD Cu/Zn está inmovilizado en una fase sólida cualquiera, por ejemplo las paredes de tubos de ensayo revestidas (p. ej. de poliestireno, "Coated Tubes", CT) o en placas de microtitulación, por ejemplo de poliestireno, o en partículas, por ejemplo partículas magnéticas, mientras que otro anticuerpo lleva un resto que representa una etiqueta detectable directamente o permite una unión selectiva con una etiqueta y que sirve para la detección de las estructuras sandwich formadas. Usando fases sólidas apropiadas también es posible una inmovilización temporalmente retrasada o pospuesta.

Pueden aplicarse fundamentalmente todas las técnicas de marcación utilizables en ensayos del tipo descrito, entre las que se encuentran marcajes con radioisótopos, enzimas, etiquetas de fluorescencia, de quimioluminiscencia o de bioluminiscencia y marcaciones cromáticas detectables ópticamente, como por ejemplo átomos de plata y partículas de colorante tal como se usan en especial para los llamados Point-of-Care (POC) o test rápidos. Por lo tanto, dentro del marco de la presente invención también está configurar el procedimiento según la invención como test rápido.

En el caso del inmunoensayo heterogéneo ambos anticuerpos pueden presentar también partes de un sistema de detección del tipo descrito a continuación junto con los ensayos homogéneos. De este modo, el procedimiento según la invención puede llevarse a cabo también empleando un procedimiento de detección homogéneo en el que los complejos tipo sandwich formados a partir de ambos anticuerpos y la SOD Cu/Zn que hay que detectar quedan suspendidos en la fase líquida. En un caso de este tipo es preferible marcar ambos anticuerpos con partes de un sistema de detección que entonces, cuando ambos anticuerpos se integren en un único sandwich, permite generar o desencadenar una señal. Las técnicas de este tipo se pueden configurar especialmente como procedimientos de detección con intensificación o atenuación de la fluorescencia. Un procedimiento de este tipo especialmente preferido se refiere al uso de reactivos de detección que deben usarse por pares, tal como se describen en US-A-4 822 733, EP-B1-180 492 o EP-B1-539 477 y en el estado de la técnica allí citado. Permiten una medición directamente en la mezcla de reacción que abarca selectivamente sólo productos de reacción que contienen los dos componentes de marcaje en un único inmunocomplejo. A modo de ejemplo se remite a la tecnología ofrecida bajo las marcas comerciales TRACE® (Time Resolved Amplified Cryptate Emission) o KRYPTOR®, que ponen en práctica las teorías de las solicitudes anteriormente indicadas.

En el ejemplo siguiente se calculó como valor umbral preferido (Cut-off) para los pronósticos "100% de riesgo de mortalidad" o "alta probabilidad de supervivencia" un valor de 310 ng/ml. Sin embargo, este valor umbral puede variarse dependiendo del objetivo pronóstico. Hay que reseñar además que el valor umbral óptimo indicado en el ejemplo se calculó con el ensayo que puede adquirirse comercialmente (31). Sin embargo, los valores umbral dependen siempre del calibrado del procedimiento inmunoquímico usado para la determinación. Si se usa otro inmunoensayo pueden obtenerse otros valores umbral absolutos para las concentraciones de Cu/Zn medibles. Sin embargo, siempre deberá ser posible una adaptación del valor umbral aquí indicado mediante un calibrado apropiado del correspondiente ensayo especial usado (31). Siempre que en las revindicaciones aparezca un valor umbral anteriormente indicado debe entenderse en el sentido anteriormente indicado y no puede interpretarse como criterio absoluto en derecho de patentes para una aplicación del procedimiento según la invención.

Por consiguiente, los valores umbral usados en un entorno clínico concreto dependen del calibrado. Sin embargo esto no constituye ningún problema para el médico práctico.

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Resultados de los ensayos 1. Materiales y métodos

A continuación se describirá la evaluación estadística de la medición de las concentraciones de SOD Cu/Zn en plasmas de pacientes de unidades de cuidados intensivos. Inmediatamente después de la recogida (sangre venosa), cada una de las muestras medidas se trató inmediatamente de un modo habitual en la técnica obteniéndose un plasma-EDTA, y después se congelaron inmediatamente las muestras de plasma-EDTA a -20ºC. Las muestras congeladas se guardaron para fines de medición lo mismo que las correspondientes documentaciones del curso de la enfermedad. Además de para las determinaciones posteriores, las muestras descongeladas se usaron también en el marco de otras determinaciones distintas que no deben explicarse con más detalles en el presente contexto.

La determinación de las concentraciones de SOD Cu/Zn en los distintos plasmas se realizó usando un ensayo ELISA que puede adquirirse comercialmente para fines de investigación ("human Cu/Zn SOD ELISA BMS222", Bender MedSystems, MedSystems Diagnostics GmbH, Rennweg 95b, A-1030 Viena, Austria), según los procedimientos de trabajo del fabricante en el correspondiente manual (32).

La determinación de la actividad enzimática de la SOD en las muestras, realizada con fines de comparación, se hizo análogamente a (11) conforme al procedimiento según (30).

Para la evaluación estadística de las mediciones se usó el correspondiente software comercial (Prism 4.0, Graphpad.com).

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2. Mediciones de plasmas de un colectivo de pacientes 2a. Mediciones primarias

Para obtener valores de referencia para las mediciones posteriores se midieron las concentraciones de SOD Cu/Zn en muestras de probandos sanos. Los valores se dispersaban notablemente en el intervalo de 114,1 ng/ml a 352,1 ng/ml alrededor de un valor de media de 224 ng/ml (desviación estándar 49,70 ng/ml). No se observaron diferencias entre probandos masculinos y femeninos.

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2b. SOD Cu/Zn y el riesgo de mortalidad o la probabilidad se supervivencia de pacientes de unidades de cuidados intensivos con los diagnósticos de septicemia, septicemia grave y shock séptico

Para las mediciones posteriores se usaron 103 muestras de plasma de un banco de muestras de pacientes septicémicos de distintas unidades de cuidados intensivos, disponible por el solicitante (diagnóstico de septicemia, septicemia grave y shock séptico). La recogida de sangre se realizó en el plazo de las 48 horas siguientes al ingreso en la unidad de cuidados intensivos.

Las mediciones de las concentraciones de SOD Cu/Zn y la evaluación de las mediciones se realizó tal como se explica. En vista de que en (8) se propone en relación a la septicemia o al desarrollo de ARDS la determinación de SOD Mn y partiendo de ello en (11) se discute la determinación de la actividad enzimática de la SOD en muestras de pacientes septicémicos como marcador de pronóstico, los valores de medición obtenidos para la SOD Cu/Zn y su significancia pronóstica según la presente invención se compararon con los resultados que se obtiene para las mismas muestras en una determinación de la actividad enzimática de SOD (kU/L) según el procedimiento aplicado en (11) conforme a (30).

Los resultados de los dos tipos de mediciones se muestran en las Figuras 1, 2 y 3. Sobre la base de un agrupamiento de las muestras analizadas en los grupos de pacientes fallecidos (79 pacientes) y de supervivientes (24 pacientes) se calculó como valor umbral (Cut-off) adecuado un valor de aproximadamente 310 ng/ml y se usó para la evaluación.

Una comparación de las Figs. 1 y 2 muestra que una determinación inmunoquímica de las concentraciones de SOD Cu/Zn en el plasma de pacientes de unidades de cuidados intensivos (pacientes septicémicos) no puede equipararse a una determinación de una actividad enzimática de la SOD en las mismas muestras, ya que se obtienen unos resultados cualitativamente distintos.

Se determinaron además los resultados de las mediciones de las concentraciones de SOD Cu/Zn y de las mediciones de la actividad enzimática, realizadas con fines de comparación, mediante las llamadas curvas ROC (Receiver Operating Characteristic Plots) que relacionan las sensibilidades y especificidades de la determinación de SOD Cu/Zn para el colectivo de pacientes. Se calculó la sensibilidad como porcentaje de fallecidos posteriormente que se reconocieron correctamente referido a todos los fallecidos posteriormente. La especificidad se calculó como porcentaje de los supervivientes que se reconocieron correctamente referido al número total de supervivientes.

En las curvas ROC se puede tomar como magnitud característica de la relevancia estadística de una determinación la superficie entre la curva correspondiente y una recta que discurre bajo un ángulo de 45º ("area under the ROC function" o "area under the curve", AUC). Cuanto mayor es esta superficie, mayor es la significancia diagnóstica o pronóstica.

En una evaluación ROC de los valores según las Figs. 1 y 2 se muestra según la Fig. 3 que la determinación inmunoquímica específica de la SOD Cu/Zn (línea gruesa continua) proporciona resultados mucho más significativos y con valor afirmativo que una determinación de la actividad enzimática SOC (línea de puntos) en las mismas muestras.

Debido a los resultados anteriormente indicados de la evaluación estadística de la medición de SOD Cu/Zn en plasmas de pacientes de unidades de cuidados intensivos, de manera sorprendente se abre una nueva posibilidad de obtener, mediante la medición de la concentración de este biomarcador SOD Cu/Zn, una previsión rápida de las posibilidades de supervivencia de pacientes ingresados en una unidad de cuidados intensivos. Una medición de este tipo tiene sentido para el diagnóstico de septicemia en especial combinada con una medición de la procalcitonina. Los pacientes con altas concentraciones de SOD Cu/Zn se constituyen entonces como grupo de riesgo especial entre los pacientes septicémicos, que justifica un tratamiento y una intervención terapéutica especiales. En este contexto se ha conseguido hace poco tiempo en los EE.UU. una autorización de proteína C activada (drotrecogina o xigris de Eli Lilly) para el tratamiento de la septicemia, aunque sólo para esa población parcial de los pacientes septicémicos para los que existe un alto riesgo de mortalidad. Se plantea así como un reto la cuestión de cómo puede calcularse correctamente esta población parcial. La aplicación prevista, debida a la falta de alternativas, de APACHE II SCORES se discute de modo controvertido en la literatura (35), (36), (37). La disponibilidad del marcador pronóstico SOD Cu/Zn como instrumento adicional o alternativo para la identificación de pacientes septicémicos de riesgo constituye en este contexto un importante avance.

Lista de bibliografía

1. Michael A. Hass et al., The Effect of Bacterial Endotoxin on Synthesis of (Cu, Zn) Superoxide Dismutase in Lungs of Oxygen- exposed Rats, en: J. Biol. Chem. 257, 9379-9383, 1982

2. K. Asayama et al., Selective induction of manganous superoxide dismutase in human monocytes, en: Am. J. Physiol. 249, C393-C397, 1985

3. Jawaid Iqbal et al., Endotoxin increases lung Cu, Zn superoxide dismutase mRNA: O2 raises enzyme synthesis, en: Am. J. Physiol 257, L61-L64, 1989

4. Gary A. Visner et al., Regulation of Manganese Superoxide Dismutase by Lipopolysaccharide, Interleukin-1, and Tumor Necrosis Factor, en: J. Biol. Chem. 265, 2856-2864, 1990

5. Marian Gorecki et al., Recombinant Human Superoxide Dismutases: Production and Potential Therapeutical Uses, en: Free Rad. Res. Comms., Vols. 12-13, 401-410, 1991

6. Xue-Jun Kong et al., Regulation of Cu, Zn- Superoxide Dismutase in Bovine Pulmonary Artery Endothelial Cells, en: J. Cell. Physiol., 153: 491-497 (1992)

7. Lester S. Gibbs et al., Mn and Cu/Zn SOD Expression in Cells from LPS- sensitive and LPS- resistant Mice, en: Free Rad. Biol. Med. Vol. 12, 107-11, 1992

8. Jonathan A. Leff et al., Serum Antioxidants as predictors of adult respiratory distress syndrome in patients wit sepsis, en: Lancet 1993; 341: 777-780

9. Kenji Mokuno et al., Induction of Manganese Superoxide Dismutase by Cytokines and Lipopolysaccharides in Cultured Mouse Astrocytes, en: J. Neurochem. 63, 612-616 (1994)

10. Reishi ABE et al., Lipopolysacharide Induces Manganese Superoxide Dismutase in the Rat Pancreas: Its Role in Caerulin Pancreatitis, en: Biochem. Biophys. Res. Comm., Vol. 217, No. 3, 1216-1222, 1995

11. Ann Warner et al., Prognostic Role of Antioxidant Enzymes in Sepsis: Preliminary Assessment, en: Clin. Chem. 41/6, 867-871 (1995)

12. Bidyut Ghosh et al., Tissue Differences in Antioxidant Enzyme Gene Expression in Response to Endotoxin, en: Free Rad. Biol. Med., Vol. 21, No. 4, 533-540, 1996

13. Mary Leach et al., Decline in the expression of copper/zinc superoxide dismutase in the kidney of rats with endotoxin shock: Effects of the superoxide anion radical scavenger, tempol, on organ injury, en: Br. J. Pharmacol., 125, 817-825 (1998)

14. Stefan Frank et al., Identification of copper/zinc superoxide dismutase as a novel nitric oxide-regulated gene in rat glomerular mesangial cells and kidneys of endotoxemic rats, en: FASEB J. 13, 869-882 (1999)

15. Seema et al., Serum TNF-Alpha and Free Radical Scavengers in Neonatal Septicemia, en: Indian J Pediatr. 1999; 66: 511-516

16. N.K. Dubey et al., Free Oxygen radicals in acute renal failure, en: Indian Pediatrics 2000; 37: 153-158

17. Simmi Kharb et al., Role of Oxygen Free Radicals in Shock; JAPI 2000; 48: 956-957

18. Stefan Frank et al., Identification of copper/zinc dismutase as a nitric oxide- regulated gene in human (HaCaT) keratinocytes: Implications for keratinocyte proliferation, en: Biochem. J. (2000) 346, 719-728

19. Sanjay Batra et al., Alterations in antioxidant status during neonatal sepsis, en: Ann. Trop. Paediatrics (2000) 20, 27-33

20. P. Bela et al., Oxidative stress status: possible guideline for clinical management of critically ill patients; en: Panminerva Med 2001, 43 (1) : 27-31

21. Yasuda M. et al., Prognostic significance of serum superoxide dismutase activity in patients with gastric cancer, en: Gastric Cancer 2002; 5 (3): 148-53

22. Taysi S, et al., Lipid peroxidation, some extracellular antioxidants, and antioxidant enzymes in serum of patients with rheumatoid arthritits, en: Rheumatol Int 2002 21 (5): 200-204;

23. Taysi S et al., Serum oxidant/antioxidant status of patients with systemic lupus erythematosus, Clin Chem Lab Med 2002, 40 (7): 684-688

24. John M. Lawler et al., Specificity of antioxidant enzyme inhibition in skeletal muscle to reactive nitrogen species donors, en: Biochem. Biophys. Res. Commun. 294 (2002) 1093-1100

25. Paolo Mondola et al., The Cu, Zn superoxide dismutase in neuroblastoma SK- N- BE cells is exported by a microvesicles dependent pathway, en: Mol. Brain Res. 110 (2003) 45-51

26. Moshe Marikovsky et al., Cu/Zn Superoxide Dismutase Plays Important Role in Immune Response; J. Immunol., 2003, 170: 2993-3001

27. Barra D., et al., The complete amino acid sequence of human Cu/Zn superoxide dismutase; FEBS Letters 120, 53-56 (1980)

28. Beck Y. et al., Human Mn superoxide dismutase cDNA sequence; Nucleic Acids Res. 16: 6224 (1988)

29. Hjalmarsson K. et al., Isolation and sequence of complementary DNA encoding human extracellular superoxide dismutase; Proc. Natl. Acad, Sci. U.S.A. 84: 6340-6344 (1987)

30. Joseph BZ et al., Activities of SODs and NADPH oxidase in neutrophils obtained from asthmatic and normal donors; Inflammation 1993; 174: 331-336

31. Mishra HP et al., The role of superoxide anion in the antioxidation of the epinephrine and simple assay for superoxide dismutase; J. Biol. Chem. 1971; 247: 3170-3175

32. Product Information and Manual: human Cu/Zn SOD ELISA BMS222, Bender MedSystems, MedSystems Diagnostics GmbH, Rennweg 95b, A-1030 Viena, Austria (3.9.1997)

33. G. Pilz et al., Krankenpflege- Journal 29 (1991), pág. 483-492

34. Niels C. Riedemann et al., The enigma of sepsis, J. Clin. Invest. 112: 460-467 (2003)

35. Manns Bj et al., An economic evalutation of activated protein C treatment for severe sepsis, N Engl J Med 2002; 347: 993-1000

36. Warren HS et al., Risks and benefits of activated protein C treatment for severe sepsis, N Engl J Med 2002; 347: 1027-1030

37. Siegel JP, Assessing the use of activated protein C in the treatment of severe spesis, N Engl J Med 2002; 347: 1030-1034

Claims (9)

1. Procedimiento para la determinación precoz del riesgo de mortalidad de pacientes en la unidad de cuidados intensivos para los que el diagnóstico clínico es septicemia, septicemia grave o shock séptico, caracterizado porque en una muestra de suero o plasma de un tal paciente, por medio de un procedimiento de determinación inmunoquímico específico para la superoxidodismutasa Cu/Zn (SOD Cu/Zn o SOD-1) se determina selectivamente la concentración de la SOD Cu/Zn y porque las concentraciones que se encuentran por encima de un valor umbral previamente fijado se correlacionan con un alto riesgo de mortalidad.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el procedimiento de determinación inmunoquímica específico es un ensayo de fijación de ligados de tipo competitivo o de tipo Sándwich.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque el ensayo de fijación de ligandos es un inmunoensayo homogéneo o heterogéneo de tipo sandwich, en el que para detectar SOD Cu/Zn se usa como mínimo un anticuerpo monoclonal o policlonal marcado y el marcaje se selecciona de entre marcajes con radioisótopos, de fluorescencia, de quimioluminiscencia, enzimáticos y partículas de colorantes detectables ópticamente de manera directa.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque como valor umbral óptimo para la concentración de SOD Cu/Zn medida se elige un valor de 310 ng/ml o más.

5. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque se realiza como parte de una determinación multiparámetros en la que se realiza al mismo tiempo una determinación cuantitativa o cualitativa de cómo mínimo otro parámetro de pronóstico de septicemia.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado porque como parte de la determinación multiparámetros, junto a SOD Cu/Zn se determina como mínimo otro parámetro que se elige del grupo formado por procalcitonina, CA 19-9, CA 125, S100B, proteínas S100A, fragmentos de citoqueratina soluble, en particular CYFRA 21, TPS y/o fragmentos de citoqueratina-1 soluble (sCY1F), los péptidos inflamina, CHP, LASP-1, GNAT, mutarotasa, CPS 1 y las prohormonas de péptidos proANP, proBNP, proADM y la proteína reactiva C (CRP).

7. Procedimiento según las reivindicaciones 5 ó 6, caracterizado porque la determinación de multiparámetros se produce como determinación simultánea mediante un dispositivo de medición de tecnología de chips o un dispositivo de medición inmunocromatográfico.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado porque la evaluación del resultado de medición complejo obtenido con el dispositivo de medición se realiza con ayuda de un programa informático.

9. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque se realiza como procedimiento Point-of-Care inmunocromatográfico (test rápido).