ES2306453T3 - Metodo para ensayar una muestra biologica. - Google Patents
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Abstract
SE DESCRIBE UN PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR ADP CONTENIDO EN UNA MUESTRA LIQUIDA POR MEDIO DE UNA REACCION ENZIMATICA, QUE INCLUYE HACER REACCIONAR LA MUESTRA DESDE 15 A 45 (GRADOS) C AL MENOS EN PRESENCIA DE GLUCOSA, HEXOQUINASA DEPENDIENTE DE ADP, Y NAD(P) OXIDADA, UNA GLUCOSA - 6 - FOSFATO DESHIDROGENASA, Y UNA O MAS SALES QUE LIBERAN IONES SELECCIONADOS ENTRE IONES MAGNESIO, COBALTO Y MANGANESO, Y DESPUES DETERMINAR EL ADP CONTENIDO EN LA MUESTRA, JUNTO CON EL ADP RESULTANTE DE LA REACCION BASADA EN LA CANTIDAD DE NAD(P) OXIDADO PRODUCIDA. ESTE PROCEDIMIENTO PRESENTA LA VENTAJA DE QUE EL LIMITE DE DETERMINACION ES ELEVADO, PORQUE EL ADP SE DETERMINA BASANDOSE EN LA CANTIDAD DE NAD(P) OXIDADO PRODUCIDA, Y PUESTO QUE EL NAD(P) REDUCIDO PRESENTA UN COEFICIENTE DE EXTINCION MOLECULAR DEFINIDO, EL VALOR HALLADO ES MUY FIABLE Y NO ESTA INFLUIDO POR LAS SUSTANCIAS REDUCTORAS, ETC., CONTENIDAS EN LA MUESTRA.
Description
Método para ensayar una muestra biológica.
Este invento se refiere a un método para
determinar el difosfato de adenosina (ADP; del inglés, adenosine
diphosphate) contenido en una muestra líquida por medio de una
reacción enzimática, que comprende hacer reaccionar la muestra a
una temperatura de 15 a 45ºC al menos en presencia de glucosa,
hexoquinasa (HK; del inglés, hexokinase) dependiente de ADP
(ADP-HK), nicotinamida adenina dinucleótido
(fosfato) [NAD(P); del inglés, nicotinamide adenine
dinucleotide (phosphate)] oxidado,
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa
(G6PDH), y una o más sales liberadoras de iones seleccionadas del
grupo que consiste en sales liberadoras de iones magnesio, cobalto y
manganeso, y determinar el ADP contenido en la muestra junto con el
monofosfato de adenosina (AMP; del inglés, adenosine monophosphate)
que resulta de la reacción basándose en la cantidad del
NAD(P) reducido producido. El presente invento se refiere
también a un método para determinar una enzima para generar ADP o un
sustrato de la misma en una muestra líquida por medio de una
reacción enzimática, que comprende hacer reaccionar la muestra que
contiene la enzima para generar ADP o el sustrato de la misma en la
muestra líquida a una temperatura de 15 a 45ºC al menos en
presencia de un reactivo de reacción que está implicado en la
reacción basada en la enzima para generar ADP y el sustrato de la
misma, trifosfato de adenosina (ATP; del inglés, adenosine
triphosphate), glucosa, ADP-HK, NAD(P)
oxidado, G6PDH y una o más sales liberadoras de iones magnesio,
iones cobalto o iones manganeso, y determinar la enzima para
generar ADP o el sustrato de la misma contenidos en la muestra junto
con el AMP que resulta de la reacción basándose en la cantidad del
NAD(P) reducido producido. El invento es aplicable en la
química clínica. El método resulta ventajoso para el ensayo de
muestras y el ensayo exacto del ADP en muestras tales como suero,
plasma, orina y líquido cefalorraquídeo, por medio de una cantidad
de generación o aumento del NAD(P) reducido.
Se conocen métodos para ensayar el ADP en una
muestra biológica o una enzima, que genera ADP, o un sustrato de la
misma. Dichos métodos incluyen un método en que se usa una
combinación de la enzima y otra deshidrogenasa u oxidasa para el
producto de reacción a partir del sustrato y la enzima (por ejemplo,
en el caso de la reacción enzimática con glicerol y gliceroquinasa,
un método en que se hace reaccionar gliceroquinasa con glicerol en
presencia de ATP para generar ADP y
glicerol-fosfato, que es ensayado por una acción de
la glicerol-fosfato deshidrogenasa o la
glicerol-fosfato oxidasa), y un método para ensayar
el ADP que se genera por la acción enzimática.
Sin embargo, en el método de ensayo por
combinación con otra deshidrogenasa u oxidasa, debe cambiarse la
combinación de cada enzima dependiendo de la enzima para generar
ADP. Esto no es adecuado para un uso general; además, hay
posibilidades de falta de enzimas con la combinación preferible para
el sustrato o la enzima.
Un método para ensayar ADP, que se genera por
reacción enzimática, incluye un ensayo por medio de cromatografía
en fase líquida. Esto presenta las desventajas debidas a una
operación cromatográfica complicada.
Se conocen métodos de ensayo enzimáticos para
ADP que presentan una buena operatividad (Publicación no revisada
7-8297 de Patente Japonesa). Estos incluyen: un
método que permite medir un NAD reducido (NADH + H^{+})
disminuido usando piruvato quinasa [PK (EC 2.7.1.40)] y lactato
deshidrogenasa [LDH (1.2.3.3)] (método disminuido; Reacción 1); un
método en que se usan piruvato quinasa y piruvato oxidasa (método de
la oxidasa; Reacción 2); y un método que permite medir un aumento
de NAD(P) reducido [NAD(P)H + H^{+}) usando
piruvato quinasa, piruvato descarboxilasa y aldehído deshidrogenasa
(método aumentado; Reacción 3).
A continuación se muestran las reacciones de
estos métodos.
En la ecuación: PEP = fosfoenolpiruvato; Pi =
fosfato; PDC = piruvato descarboxilasa; AlDH = aldehído
deshidrogenasa; y TPP = pirofosfato de tiamina.
En el método disminuido de NAD reducido (NADH +
H^{+}) mostrado en la Reacción 1, se debe añadir una cantidad
alícuota previa de NAD reducido a la mezcla de reacción y, una vez
terminada la reacción, se mide la cantidad residual de NAD reducido
en la mezcla de reacción. En consecuencia, este método disminuido
presenta diversos problemas, como los siguientes:
- (1)
- El valor del ensayo no es exacto en el caso de una pequeña cantidad de componentes para el ensayo.
- (2)
- El límite superior de una cantidad de componentes mensurables viene limitado por la cantidad de NAD reducido añadido en la mezcla de reacción.
- (3)
- La cantidad de la adición del NAD reducido en la mezcla de reacción antes del ensayo debe ser controlada dependiendo del tipo de espectrofotómetro para la medición del NAD reducido.
- (4)
- El NAD reducido es inestable en el reactivo para análisis.
Se conoce el ensayo cuantitativo de piruvato por
medio de un reactivo indicador colorante de peróxido de hidrógeno,
que se genera en la reacción al utilizar piruvato quinasa y piruvato
como se muestra en la Reacción 2.
- (5)
- El método resulta afectado por una sustancia interferente (sustancia reducida; tal como ácido úrico o ascorbato) o una sustancia colorante (bilirrubina, hemoglobina, etc.) presente en las muestras biológicas. En consecuencia, el resultado del ensayo no es tan exacto ni es satisfactorio.
Como se muestra en la Reacción 3, el método
aumentado de NAD(P) reducido en que se usa piruvato quinasa,
piruvato descarboxilasa y aldehído deshidrogenasa se utiliza para
aplicar la reacción inversa de la piruvato quinasa.
- (6)
- El pH óptimo de la reacción inversa es 7,5. El pH óptimo de la piruvato descarboxilasa es 6,0-6,4 y el de la aldehído deshidrogenasa es 9,0. Los pHs óptimos de estas enzimas son diferentes. Esto llevó a determinar el pH óptimo de la Reacción 3.
- (7)
- Puesto que el valor de Km de la piruvato descarboxilasa para el piruvato es ligeramente elevado, tal como 3,6-30 mM, se debe utilizar una gran cantidad de sustrato, que además es caro, para generar el piruvato.
- (8)
- Se requiere una gran cantidad de enzima para acortar el tiempo de reacción. Estos resultados indican que el método de la Reacción 3 hace complicada la operación.
En el organismo supertermófilo Pyrococcus
furiosus DSM 3638 se conoce una hexoquinasa intracelular
dependiente de ADP que puede ser utilizada en el presente invento
[J. Biol. Chem. 269, 17.537-17.541 (1994); Patente
Holandesa Abierta nº 9400836]. Sin embargo, no se han comunicado
propiedades físicoquímicas ni bioquímicas. Más aún, la enzima no
está aislada ni purificada. Además, la temperatura de crecimiento de
la cepa del microorganismo es 90-105ºC. Puesto que
el pH óptimo de la enzima se encuentra por encima de 90ºC, el ensayo
de actividad enzimática se lleva a cabo a 50ºC al considerar la
estabilidad térmica de la G6PDH, que procede de levadura. Esto
indica que el ensayo de acción enzimática se lleva a cabo a una
temperatura óptima para ADP-HK diferente y que, a
la vista de la temperatura óptima para la ADP-HK,
las condiciones de reacción son completamente diferentes de las
condiciones de ensayo de la diagnosis clínica general para el
análisis de muestras biológicas.
- (6)
- Si, como en esta referencia previa, la reacción se lleva a cabo a 50 ºC, no es preferible en la química clínica para un ensayo exacto a causa de la desnaturalización de la combinación de las enzimas.
- (7)
- Se produce turbiedad de la mezcla de reacción a causa de la desnaturalización térmica de los componentes biológicos.
Como resultado, estos métodos de la técnica
previa presentan diversos problemas, y el ensayo exacto es
imposible.
Hemos cultivado una cepa de Pyrococcus
furiosus DSM 3638, y hemos purificado la ADP-HK,
medido su temperatura óptima y determinado que es
80-100ºC. Además, hemos hallado que la actividad
relativa de la enzima a 37ºC era aproximadamente el 10% de la
actividad a 100ºC. En consecuencia, se ha considerado que la
reacción enzimática exacta a 37ºC utilizando la enzima podría ser
imposible. Sin embargo, bastante inesperadamente, como resultado de
la reacción enzimática a 37ºC, hemos hallado que el ADP de una
muestra tal como una composición biológica podría ser exacta y
sencillamente ensayado como una cantidad aumentada y una generación
de NAD(P) reducido a 15-45ºC, lo que incluía
la temperatura experimental a 37ºC dentro de la temperatura de
reacción general para la determinación de muestras biológicas.
Hemos hallado un método para ensayar el ADP en
una muestra biológica, o la enzima que generaba ADP en la muestra
biológica o su sustrato, utilizando la reacción enzimática ilustrada
más adelante (Reacciones 4 y 5). Por ejemplo en el caso de que la
muestra biológica sea una muestra líquida para ensayar actividad
enzimática que genera ADP, se utilizan reactivos de reacción que
están implicados en la reacción, incluyendo la enzima que genera
ADP y su sustrato, en presencia del sustrato de la enzima y de ATP,
o, en el caso de que la muestra biológica sea una muestra líquida
para un ensayo de cantidad de sustrato, se utilizan reactivos de
reacción que están implicados en la reacción, incluyendo la enzima
que genera ADP y su sustrato, en presencia de la enzima que genera
ADP por reacción con el sustrato, y ATP. La citada muestra líquida
es tratada con los citados reactivos de reacción. La reacción se
desarrolla basándose en una reacción en que están implicados
glucosa, ADP-HK, NAD(P) oxidado, G6PDH e
iones magnesio, iones cobalto o iones manganeso, para generar AMP a
partir de ADP, y generar simultáneamente NAD(P) reducido
mediante una reacción de reducción del NAD(P) oxidado. Hemos
hallado que el ensayo cuantitativo de la enzima que genera ADP o de
su sustrato en la muestra biológica basándose en el ensayo del
NAD(P) reducido generado era bastante útil y que esta
reacción enzimática podía ser aplicada en general a la enzima que
genera ADP o a su sustrato en la muestra biológica, y hemos
completado el presente invento.
Un objeto del presente invento es proporcionar
un método para ensayar ADP en una muestra biológica, que comprende
medir el citado ADP como una cantidad generada y aumentada de
NAD(P) reducido, utilizando glucosa, ADP-HK,
NAD(P) oxidado, G6PDH e iones magnesio, iones cobalto o iones
manganeso.
Otro objeto del presente invento es proporcionar
un método para el ensayo sencillo y preciso de una enzima que
genera ADP, o de su sustrato, en una muestra biológica que se va a
ensayar, que comprende utilizar reactivos de reacción que están
implicados en una reacción basada en la enzima que genera ADP y en
su sustrato, y hacer reaccionar la enzima que genera ADP y un
sustrato de la misma en presencia de ATP, glucosa,
ADP-HK, NAD(P) oxidado, G6PDH e iones
magnesio, iones cobalto o iones manganeso.
El presente invento ha sido completado mediante
los conocimientos anteriores. El presente invento se refiere a un
método para determinar el ADP contenido en una muestra líquida por
medio de una reacción enzimática, que comprende hacer reaccionar la
muestra, a una temperatura de 15 a 45ºC, al menos en presencia de
glucosa, ADP-HK, NAD(P) oxidado, G6PDH y una
o más sales liberadoras de iones seleccionadas del grupo que
consiste en sales liberadoras de iones magnesio, cobalto y
manganeso, y determinar el ADP contenido en la muestra junto con el
AMP que resulta de la reacción basándose en la cantidad de
NAD(P) reducido producido. El presente invento se refiere
además a un método para determinar una enzima para generar ADP, o un
sustrato de la misma, en una muestra líquida por medio de una
reacción enzimática que comprende hacer reaccionar la muestra que
contiene la enzima para generar ADP, o un sustrato de la misma, en
la muestra líquida a una temperatura de 15 a 45ºC al menos en
presencia de un reactivo de reacción que está implicado en la
reacción basada en la enzima para generar ADP y el sustrato de la
misma, ATP, glucosa, ADP-HK, NAD(P) oxidado,
G6PDH y una o más sales liberadoras de iones magnesio, iones
cobalto o iones manganeso, y determinar la enzima para generar ADP o
el sustrato de la misma contenidos en la muestra junto con el AMP
que resulta de la reacción basándose en la cantidad del
NAD(P) reducido producido.
En las Reacciones 4 y 5 siguientes se muestran
las reacciones enzimáticas que generan el NAD(P) reducido a
partir del NAD(P) oxidado en presencia de glucosa,
ADP-HK, NAD(P) oxidado, G6PDH y una o más
sales liberadoras de iones seleccionadas del grupo que consiste en
sales liberadoras de iones magnesio, cobalto y manganeso, utilizadas
en el presente invento.
A continuación se explicará el presente invento
con detalle.
La ADP-HK del presente invento
es una enzima ADP-HK que utiliza al menos glucosa
como sustrato y consume ADP para generar
glucosa-6-fosfato y AMP, como se
muestra en la Reacción 4 anterior, y no se limita a la misma. Un
ejemplo de microorganismo productor de ADP-HK es la
bacteria supertermófila Pyrococcus furiosus DSM3638, que ha
sido depositada en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen GmbH (DSM) y mencionada en el catálogo de DSM (1993),
y puede ser obtenida por cualquier persona. La
ADP-HK supertermófila es un ejemplo preferible de la
enzima.
La G6PDH usada en la reacción enzimática de la
Reacción 5 anterior es distribuida en el mercado (Boehringer
Mannheim Inc.: Leuconostoc mesenteroides; Sigma Corp.:
levadura de panadero, Bacillus strearothermophilus y
Leuconostoc mesenteroides) y es fácilmente obtenible.
En la Reacción 4, la reacción enzimática
catalizada por ADP-HK, la sal liberadora de iones
magnesio puede ser sustituida por una o más sales liberadoras de
iones cobalto o manganeso. Los ejemplos de la sal incluyen cloruro
y sulfato, y la sal es preferiblemente cloruro de magnesio, cloruro
de cobalto o cloruro de manganeso, pero no se limita a estos
ejemplos.
El NAD(P) oxidado, que es una coenzima
utilizada en la reacción enzimática catalizada por la G6PDH
anterior, como se ejemplifica en la Reacción 5, incluye
tio-NAD(P) oxidado,
3-acetil-NAD(P) oxidado y
desamino-NAD(P) oxidado, pero no se limita a
estos ejemplos.
En el presente invento, la cantidad de
ADP-HK, G6PDH, glucosa, NAD(P) oxidado e
iones magnesio, iones cobalto o iones manganeso utilizados puede
ser la cantidad para un buen proceso de la reacción enzimática.
Puede ser ajustada dependiendo de los tipos de sustancias en la
muestra que se va a ensayar, el contenido de la muestra, los tipos
de reacciones enzimáticas de asociación, el tiempo de reacción y la
temperatura. Un ejemplo de concentración de ADP-HK
y G6PDH es 0,1-100 U/ml y preferiblemente
1-50 U/ml. La concentración de glucosa y de
NAD(P) oxidado puede ser del nivel suficiente para la
reacción enzimática. Un ejemplo de concentración de glucosa es
0,5-100 mM, preferiblemente 1-50
mM. Un ejemplo de concentración de NAD(P) oxidado es
0,5-50 mM, preferiblemente 1-10 mM.
Un ejemplo de concentración de iones magnesio, iones cobalto o iones
manganeso es 0,1-50 mM, preferiblemente
0,5-10 mM.
El método del presente invento se desarrolla con
el uso de una disolución tampón preferible que no ejerce acción
perjudicial alguna sobre la reacción enzimática. Son ejemplos de la
disolución tampón: una disolución tampón de
Tris-HCl, una disolución tampón de fosfato, una
disolución tampón de mono- o di-etanolamina y una
disolución tampón de Good. Los procedimientos de ensayo no están
limitados. Son ejemplos de los mismos el método de ensayo del punto
final y el método de ensayo de la velocidad. Son ejemplos de la
disolución de muestra que se va a ensayar las muestras biológicas
que contienen ADP (existente o generado), y son muestras tales como
suero, plasma, orina y líquido cefalorraquídeo. El volumen de la
muestra utilizada en el ensayo puede ser 5-200
\mul. La reacción puede desarrollarse a una temperatura de
15-45ºC, preferiblemente de 20-40ºC.
El tiempo de reacción en el ensayo del punto final es
1-60 minutos, preferiblemente 1-10
minutos. En el método del ensayo de la velocidad, la medición se
lleva a cabo dentro de un tiempo para una reacción lineal,
preferiblemente en el intervalo de 2-3 minutos.
En la reacción del presente invento, el ADP de
la muestra se convierte en AMP, lo que va acompañado de la
generación del NAD(P) reducido. El NAD(P) reducido
puede ser ensayado por diversos métodos, normalmente por absorción
óptica, que es preferiblemente para mediciones sencillas y precisas.
La longitud de onda para la medición puede ser seleccionada
dependiendo del tipo de NAD(P) reducido. El NAD(P)
reducido, el 3-acetil-NAD(P)
reducido y el desamino-NAD(P) reducido pueden
ser medidos a 340 nm, y el tio-NAD(P)
reducido se mide a 405 nm. Otro método para la medición del
NAD(P) reducido incluye la generación de formazán por la
acción de un aceptor de electrones tal como metosulfato de fenazina
(PMS) o diaforasa (EC 1.6.4.3) utilizando una sal de tetrazolio tal
como indonitro de tetrazolio (INT) o nitroazul de tetrazolio (NBT),
midiéndose colorimétricamente dicho formazán. El NAD(P)
reducido también se mide por fluorometría.
La muestra, como una muestra biológica del
presente invento, se usa para el ensayo de ADP en la muestra
biológica o para el ensayo del sustrato para la enzima que genera
ADP en la muestra biológica o para el ensayo de la actividad
enzimática en la muestra biológica. En el ensayo del sustrato para
una enzima que genera ADP en la muestra biológica o el ensayo de la
actividad enzimática, especialmente en el ensayo de la enzima que
genera ADP o del sustrato de la misma en presencia de ATP, el
sustrato de la quinasa, sintetasa, hidratasa o carboxilasa en la
muestra puede ser convertido en ADP por la acción de la quinasa,
sintetasa, hidratasa o carboxilasa. En consecuencia, la actividad
enzimática o el sustrato de la enzima en la muestra, a los que se
introduce ADP, se puede ensayar como una cantidad generada de
NAD(P) reducido al asociar estas reacciones enzimáticas con
las reacciones enzimáticas de las Reacciones 4 y 5. En la Tabla 1,
se muestran ejemplos de sustratos y enzimas utilizados. Se puede
medir el sustrato o la actividad enzimática utilizando la enzima o
el sustrato como un reactivo de reacción (el ATP no es un objetivo
del ensayo).
Estas reacciones se ilustran del modo
siguiente.
En el ensayo de urea o urea amidohidrolasa en la
muestra, una reacción en que se usan los reactivos de reacción
implicados en la reacción se ilustra del modo siguiente. En este
ensayo se mide el ADP que es generado por la reacción enzimática.
Los reactivos de reacción implicados en la reacción se representan
mediante los componentes mostrados en la parte izquierda del
esquema de reacción y en la parte de la flecha. En un ensayo de urea
en la muestra biológica, los reactivos de reacción incluyen urea
amidohidrolasa, agua, iones magnesio (cloruro de magnesio) e
hidrogenocarbonato de potasio. En un ensayo de actividad urea
amidohidrolasa en la muestra biológica, los reactivos de reacción
incluyen urea, agua, iones magnesio (cloruro de magnesio) e
hidrogenocarbonato de potasio. En estas reacciones, el agua es
sustituida por el agua del medio de reacción.
En el ensayo de creatinina o creatinina
amidohidrolasa en la muestra biológica, las reacciones en que se
usan los reactivos de reacción implicados en las reacciones se
ilustran del modo siguiente. En dichas reacciones enzimáticas
consecutivas, en el caso de que un componente del lado izquierdo de
la reacción sea idéntico al del lado derecho de la reacción, esos
componentes están implicados en la reacción pero aparentemente no es
necesario añadirlos.
En las reacciones \ding{172} y \ding{173}
ilustradas más adelante, y en el ensayo de creatinina o creatinina
amidohidrolasa en la muestra biológica, la creatina que se genera
por una reacción enzimática puede ser ensayada midiendo el ADP
generado en la reacción \ding{172} o en la reacción
\ding{173}.
En un ensayo de creatinina en la muestra
biológica, los reactivos de reacción implicados en la reacción son
creatinina amidohidrolasa, agua, creatina quinasa (CK) e iones
magnesio para la reacción \ding{172}, y creatinina
amidohidrolasa, agua, creatina amidohidrolasa, urea, ureido
amidohidrolasa e iones magnesio para la reacción \ding{173}.
En el ensayo de creatinina o creatinina
desiminasa en la muestra biológica, las reacciones en que se usan
los reactivos de reacción implicados en las reacciones se ilustran a
continuación. En esta reacción, se mide el ADP generado por la
acción de una enzima. Los reactivos de reacción para el ensayo de
creatinina en la muestra biológica son creatinina desiminasa, agua
y N-metilhidantoinasa. Los reactivos de reacción
para el ensayo de actividad creatinina desiminasa en la muestra
biológica son creatinina, agua y
N-metilhidantoinasa.
\newpage
En el ensayo de creatina o creatina quinasa en
la muestra biológica, la reacción en que se usa el reactivo de
reacción implicado en la reacción se ilustra a continuación. En esta
reacción, se mide ADP, que es generado por la reacción enzimática.
Los reactivos de reacción utilizados para ensayar la creatina son
creatina quinasa e iones magnesio. Los reactivos de reacción
utilizados para el ensayo de actividad creatina quinasa en la
muestra biológica son creatina e iones magnesio.
La creatina de la Reacción 9 puede ser la
creatina generada en la Reacción 7 anterior.
En el ensayo de glicerol o glicerol quinasa (GK)
en la muestra biológica, del que se muestra a continuación el
esquema de reacción, se mide el ADP generado por la acción
enzimática. En la reacción, los reactivos usados son glicerol
quinasa e iones magnesio.
El glicerol de la reacción anterior puede ser el
glicerol liberado de triglicéridos, monoglicéridos o diglicéridos
por la acción de una lipasa o de lipasa pancreática, a la que se
añade el agente activante colipasa, o el glicerol liberado de
fosfatidilglicerol por la acción de la fosfolipasa D.
La reacción es preferible para el ensayo de
triglicéridos y para el ensayo de actividad lipasa pancreática
usando un sustrato sintético de triglicérido o diglicérido en la
prueba bioquímica de la muestra.
Por ejemplo, los reactivos usados para un ensayo
de triglicéridos en la muestra biológica son lipasa, agua, glicerol
quinasa e iones magnesio. Los reactivos usados para ensayar la
lipasa pancreática son un sustrato sintético tal como un
triglicérido o un diglicérido, agua, glicerol quinasa, iones
magnesio, colipasa y un agente tensioactivo para solubilizar el
sustrato sintético.
Del ensayo de colina o colina quinasa, se
muestra a continuación el esquema de reacción. En esta reacción se
puede medir el ADP enzimáticamente generado.
La colina de la reacción puede ser una colina
liberada a partir de fosfatidilcolina (un componente de
fosfolípidos) por la acción de la fosfolipasa D y a partir de un
sustrato sintético de éster de colina, tal como benzoilcolina u
o-toluoilcolina, por la acción de la colina
esterasa.
El método es preferible para el ensayo de
actividad colina esterasa en un ensayo de componentes de
fosfolípidos en la prueba bioquímica usando un sustrato
sintético.
Los reactivos de reacción utilizados para el
ensayo de componentes de fosfolípidos son fosfolipasa D, agua e
iones magnesio, y los reactivos utilizados para el ensayo de
actividad colina esterasa son un sustrato sintético, tal como
benzoilcolina u o-toluoilcolina, agua e iones
magnesio.
Del ensayo del sustrato o la enzima que generan
ADP en la muestra biológica, se ilustran más adelante los esquemas
de reacción en que, como reactivos de reacción, se usan los
componentes implicados en la citada reacción. En esta reacción se
puede medir el ADP generado por la reacción enzimática.
En el método de ensayo del presente invento, los
reactivos de reacción de los componentes implicados en la reacción
del presente invento resultan obvios a la vista de los esquemas de
reacción ilustrados anteriormente y más adelante. Además, dichos
reactivos pueden ser preferiblemente preparados dependiendo
opcionalmente de la muestra que se va a ensayar y no se limitan a
los reactivos descritos en la memoria descriptiva.
\vskip1.000000\baselineskip
En la reacción anterior, el amoniaco que se va a
ensayar puede ser generado por una reacción con urea y urea
amidohidrolasa, como se ilustra en la Reacción 6, o mediante una
reacción con creatinina y creatinina amidohidrolasa, como se
ilustra en la reacción \ding{173} de la Reacción 7, o mediante un
paso previo de la reacción con creatinina y creatinina desiminasa,
como se ilustra en la Reacción 8. El origen del amoniaco en estas
reacciones no está limitado.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La reacción anterior se usa preferiblemente en
un ensayo de actividad GOT.
La reacción anterior es preferible para uso en
un ensayo de actividad GPT.
En estas reacciones, la cantidad de ATP añadido
es, por ejemplo, 0,1-50 mM, preferiblemente
0,5-10 mM. La cantidad de enzima añadida para un
ensayo de sustrato es, por ejemplo, 1-100 U/ml. El
sustrato que se va a añadir en un ensayo de actividad enzimática
es, por ejemplo, 1-100 mM. Para reactivos distintos
de estos sustratos y estas enzimas, la cantidad de componentes que
se consumen por reacción con el sustrato es igual a 2 veces la
cantidad de los anteriores sustratos utilizados. La concentración de
iones magnesio es, por ejemplo, 0,1-50 mM como
cloruro de magnesio, preferiblemente 0,5-10 mM; sin
embargo, no queda excluido un uso en exceso a menos que tenga lugar
una inhibición de la reacción.
Estas reacciones pueden ser asociadas con las
Reacciones 4 y 5 o no. La reacción preferible se desarrolla por
asociación de estas reacciones.
En el anterior y conocido método de ensayo de la
urea, la reacción se desarrolla de acuerdo con la Reacción 38 del
modo siguiente.
Como se muestra en la Reacción 38, el método
incluye la medición de la cantidad disminuida de NAD(P)
reducido. En esta reacción hay muchas desventajas, que se indican a
continuación.
- (8)
- El resultado del ensayo puede ser incorrecto en el caso de pequeñas cantidades de los componentes que se van a ensayar.
- (9)
- El límite superior de los componentes mensurables está limitado dependiendo del NAD(P) reducido añadido en la reacción (rango estrecho de la medición).
- (10)
- La cantidad de NAD(P) reducido en la mezcla de reacción antes del ensayo debería ser cambiada dependiendo del tipo de espectrofotómetro que se utilice para la medición del NAD(P) reducido.
- (11)
- El NAD(P) reducido es inestable en el reactivo.
- (12)
- La aplicación a la química en estado seco es imposible.
- (13)
- En principio, la reacción consiste en un método para la medición de amoníaco, y el amoniaco presente en la muestra o en los reactivos debe ser previamente eliminado.
\newpage
El método de ensayo del presente invento es:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Como se muestra en las Reacciones 39, 40 y 41
anteriores, puesto que la reacción es el método aumentado del
NAD(P) reducido, no existen las desventajas del método
disminuido ni la necesidad de eliminar el amoniaco. Por lo tanto, el
método presente es superior.
A continuación se ilustra el anterior y conocido
método de ensayo convencional para creatina quinasa.
En este sistema de reacción, el sustrato fosfato
de creatina es bastante caro, lo que conduce a un total de reactivos
caros.
\newpage
El método del presente invento puede ser
ilustrado de la manera siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Como se muestra en las Reacciones 43, 44 y 45,
se usa creatina como sustrato, lo que da lugar a la proporción de
reactivos para ensayo a bajo precio.
A continuación se ilustra el conocido método
convencional para el ensayo de creatinina.
Como se muestra en el anterior Esquema de
Reacción 46, el ensayo requiere el método de la oxidasa. La reacción
resulta afectada por la sustancia reductora (ascorbato) para dar
lugar a un ensayo imprevisto. Además, la sarcosina oxidasa
reacciona con la prolina presente en la muestra; en consecuencia, la
reacción resulta afectada por la prolina de la muestra.
\newpage
Los métodos del presente invento pueden ser
ilustrados de la manera siguiente:
\newpage
Como se muestra en las Reacciones 47, 48 y 49 y
en las Reacciones 50, 51 y 52, éstas son el método aumentado del
NAD(P) reducido. Las reacciones no resultan afectadas por la
sustancia reductora (ascorbato) ni por la prolina.
En consecuencia, a continuación se muestra el
método de ensayo para triglicéridos.
Como se muestra en el anterior Esquema de
Reacción 53, la reacción consiste en el método de la oxidasa, método
que resulta afectado por la sustancia reductora (ascorbato) presente
en la muestra, y el resultado del ensayo puede ser inexacto.
El método del presente invento es ilustrado
mediante las reacciones siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Como se muestra en las Reacciones 54, 55 y 56
anteriores, el método del presente invento es un método aumentado
de NAD(P) reducido y no resulta influido por la sustancia
reductora presente en la muestra.
Al sustituir el triglicérido de la anterior
Reacción 54 por un diglicérido o monoglicérido, reacción que se
desarrolla con consumo de 2 moles o 1 mol de agua para liberar 2
moles o 1 mol de ácido graso, el resultado es idéntico al
anterior.
A continuación se ilustra el método de ensayo
convencional para fosfatidilcolina.
Como se muestra en el anterior Esquema de
Reacción 57, el método es el método de la oxidasa, método que
resulta influido por una sustancia reductora (ascorbato) y que
produce un resultado inexacto.
El método del presente invento se ilustra del
modo siguiente:
Como se muestra en las Reacciones 58, 59 y 60,
el método del presente invento es el método aumentado de
NAD(P), que no resulta influido por una sustancia
reductora.
Mediante la Reacción 61 se ilustra el método de
ensayo convencional para aspartato aminotransferasa (GOT).
Como se muestra en el Esquema de Reacción 61, el
método es el método disminuido de NAD. El método tiene las
desventajas siguientes.
- (14)
- El resultado del ensayo es incorrecto en el caso de pequeñas cantidades de los componentes que se van a ensayar.
- (15)
- El límite superior de los componentes mensurables está limitado dependiendo del NAD reducido añadido en la reacción (rango estrecho de la medición).
- (16)
- La cantidad de NAD reducido en la mezcla de reacción antes del ensayo ha de ser cambiada dependiendo del tipo de espectrofotómetro utilizado para la medición del NAD reducido.
- (17)
- El NAD reducido es inestable en el reactivo.
- (18)
- La aplicación a la química en estado seco es imposible.
\vskip1.000000\baselineskip
Además, el método está influido por la lactato
deshidrogenasa presente en la muestra, lo que indica la
imposibilidad de desarrollar un ensayo exacto.
A continuación se muestra el método del presente
invento.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Como se muestra en las Reacciones 62, 63 y 64,
el método presente es el método aumentado de NAD(P) reducido.
El método no presenta desventajas como el método reducido
convencional. Además, no es necesario eliminar la lactato
deshidrogenasa de la muestra. Como resultado, el presente método
muestra resultados superiores.
A continuación se ilustra el anterior y conocido
método convencional de la alanina aminotransferasa (GPT).
Como se muestra en el anterior Esquema de
Reacción 65, el método es el método disminuido de NAD. El método
tiene las desventajas siguientes.
- (19)
- El resultado del ensayo es incorrecto en el caso de pequeñas cantidades de los componentes que se van a ensayar.
- (20)
- El límite superior de los componentes mensurables está limitado dependiendo del NAD reducido añadido en la reacción (rango estrecho de la medición).
- (21)
- La cantidad de NAD reducido en la mezcla de reacción antes del ensayo ha de ser cambiada dependiendo del tipo de espectrofotómetro utilizado para la medición del NAD reducido.
- (22)
- El NAD reducido es inestable en el reactivo.
- (23)
- La aplicación a la química en estado seco es imposible.
\vskip1.000000\baselineskip
Además, el método está influido por la lactato
deshidrogenasa presente en la muestra, lo que indica la
imposibilidad de desarrollar un ensayo exacto.
A continuación se muestra el método del presente
invento.
Como se muestra en las Reacciones 66, 67 y 68
anteriores, el método presente es el método aumentado de
NAD(P) reducido. El método no presenta desventajas como el
método reducido convencional. Además, no es necesario eliminar la
lactato deshidrogenasa de la muestra. Como resultado, el presente
método muestra resultados superiores.
Los métodos del presente invento para el ensayo
de una enzima que genera ADP en la muestra, o de su sustrato, se
explican en los ejemplos siguientes pero no se limitan a esos
ejemplos.
Figura 1: Curva patrón para ensayar ADP usando
iones magnesio a 37ºC en este invento.
Figura 2: Curva patrón para ensayar ADP usando
iones cobalto a 37ºC en este invento.
Figura 3: Curva patrón para ensayar ADP usando
iones manganeso a 37ºC en este invento.
Figura 4: Curva patrón para ensayar ADP usando
iones magnesio a 20ºC en este invento.
Figura 5: Curva patrón para ensayar ADP usando
iones magnesio a 40ºC en este invento.
Figura 6: Curva patrón para ensayar urea usando
iones magnesio a 37ºC en este invento.
Figura 7: Curva patrón para ensayar creatinina
usando iones magnesio a 37ºC en este invento.
Figura 8: Curva patrón para ensayar creatinina
usando iones magnesio a 37ºC en este invento.
Figura 9: Curva patrón para ensayar creatina
usando iones magnesio a 37ºC en este invento.
Figura 10: Curva patrón para ensayar glicerol
usando iones magnesio a 37ºC en este invento.
Figura 11: Curva patrón para ensayar colina
usando iones magnesio a 37ºC en este invento.
Figura 12: Curva patrón para ensayar glutamato
utilizando iones magnesio a 37ºC en este invento.
Figura 13: Curva patrón para ensayar urea usando
iones cobalto a 37ºC en este invento.
Figura 14: Curva patrón para ensayar creatinina
utilizando iones manganeso a 37ºC en este invento.
Figura 15: Curva patrón para ensayar creatina
usando iones magnesio a 20ºC en este invento.
Figura 16: Curva patrón para ensayar glicerol
usando iones magnesio a 40ºC en este invento.
Figura 17: Curva de ensayo cualitativa para
ensayar ADP a 50ºC en lugar de este invento.
\vskip1.000000\baselineskip
El presente invento se explica con detalle
mediante Ejemplos y Ejemplos de referencia, pero el presente invento
no está limitado por estos Ejemplos y Ejemplos de referencia.
Después de precalentar a 37ºC durante 1 minuto
el reactivo para ensayo, se añadieron 0,02 ml de disolución
enzimática y se dejó reaccionar la mezcla de reacción durante 10
minutos. Se detuvo la reacción por adición de 2 ml de HCl 0,1 N y
se midió durante 5 minutos la densidad óptica de la mezcla de
reacción a 550 nm usando un camino óptico de 1,0 cm (As). Se midió
la absorción óptica del blanco usando 0,02 ml de agua destilada en
lugar de la disolución enzimática (Ab). Para medir la actividad
enzimática, se usa la diferencia de las absorciones en uso de la
disolución enzimática (As) y de su blanco (Ab), es decir
(As-Ab). Se define la unidad de enzima como la
cantidad de enzima que genera 1 micromol de NADP reducido en 1
minuto a 37ºC, como se muestra en la ecuación
siguiente.
siguiente.
Unidad de enzima (U/ml) =
(As-Ab) x 0,795 x índice de dilución de la
enzima
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Se vertieron 500 ml de medio líquido (pH de 7)
que contenía la composición para cultivo anterior en diez matraces
Erlenmeyer de 500 ml de capacidad y se esterilizaron a 120ºC durante
20 minutos. Se inocularon 10 ml de una suspensión de Pyrococcus
furiosus DSM3638 en el medio y se cultivó éste a 95ºC durante 20
horas, con agitación, para preparar el cultivo de siembra. Se
esterilizó el depósito para medios líquidos de 200 litros/300 litros
de capacidad que contenía la anterior composición para cultivo, se
inoculó el cultivo de siembra en el mismo, y luego se cultivó a
95ºC durante 15 horas, con agitación, el medio que había recibido el
inóculo para obtener 200 litros de líquido cultivado con 5
mU/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
Los 200 litros de líquido cultivado obtenidos
fueron centrifugados. Las células microbianas obtenidas fueron
lavadas con tampón de Tris-HCl 20 mM (pH de 7,5) que
contenía NaCl al 0,9%. Las células lavadas fueron resuspendidas en
tampón de Tris-HCl 20 mM (pH de 7,5) hasta ajustar a
un volumen de 2 litros. La suspensión fue sonicada utilizando un
sonicador (KUBOTA Inc., INSONATOR 201M) a 180 W durante 30 minutos
para obtener una suspensión de células sonicadas.
La suspensión sonicada fue centrifugada a 8000
rpm durante 30 minutos para obtener 1,8 litros de disolución
sobrenadante (980 U de actividad enzimática). El sobrenadante fue
dializado a 5ºC durante la noche, utilizando un tubo de diálisis
frente a 8 litros de tampón de Tris-HCl (pH de 7,5).
El producto de la diálisis fue aplicado a una columna (2,6 x 38 cm)
de 200 ml de DEAE-Sepharose FF (Pharmacia Inc.)
tamponada con tampón de Tris-Hcl 10 mM (pH de 7,5)
y fue eluido mediante una elución en gradiente lineal de
0-1 moles de NaCl. La fracción activa (950 U)
resultó eluida a la concentración de 0,08-0,1 moles
de NaCl. Se disolvió NaCl hasta 4 M en la fracción activa obtenida
y se aplicó la disolución a una columna (2,6 x 38 cm) de 200 ml de
Phenyl-Sepharose FF (Pharmacia Inc.) tamponada con
NaCl 4 M, realizándose la elución mediante un gradiente lineal de
4-0 moles de NaCl.
La fracción activa (900 U) se obtuvo en una
concentración de NaCl de 0,02-0,07 moles. La
fracción activa así obtenida fue dializada a 5ºC durante la noche
frente a 8 litros de tampón de Tris-HCl 10 mM (pH de
7,5). El producto de la diálisis fue aplicado a una columna (2,6 x
19 cm) de 100 ml de hidroxiapatito (Pentax Inc.) tamponada con
tampón de Tris-HCl 10 mM (pH de 7,5) y fue eluido
mediante una elución en gradiente lineal de 0-0,5
moles de tampón de fosfato (pH de 7,5). La fracción activa (850 U)
resultó eluida a la concentración de 0,02-0,03
moles de tampón de fosfato. La disolución enzimática así obtenida
fue liofilizada para obtener 5 mg (170 U/mg) de enzima en polvo.
Las propiedades bioquímicas de la
ADP-HK eran las siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
(1) Acción enzimática
A continuación se muestra la acción enzimática
al utilizar glucosa como sustrato.
(2) Peso molecular
El peso molecular de la ADP-HK
medido por filtración en gel utilizando una columna (0,75 x 30 cm)
de TSK-G3000SW XL (Toso Corp.) resultó 100.000 \pm
5000.
(3) pH óptimo: 6,0 - 7,0 (tampón de fosfato)
(4) Temperatura óptima: 80 - 100ºC.
En consecuencia, el microorganismo fue definido
como ADP-HK supertermófila.
Para preparar la muestra de ADP, se preparó una
disolución acuosa de ADP en concentraciones de 2,6 mM, 5,2 mM, 7,8
mM, 10,4 mM y 13 mM. Se añadieron 20 \mul de muestra de ADP a 1 ml
de los reactivos para ensayo y se midió la absorción óptica a 340
nm después de una incubación a 37ºC durante 5 minutos, usando la
disolución de blanco como testigo. Como se muestra en la Figura 1
(eje horizontal mostrado como concentración final), el ADP pudo ser
ensayado cuantitativamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Para preparar la muestra de ADP, se preparó una
disolución acuosa de ADP en concentraciones de 2,3 mM, 4,6 mM, 6,9
mM, 9,2 mM y 11,5 mM. Se añadieron 20 \mul de muestra de ADP a 1
ml de los reactivos para ensayo y se midió la absorción óptica a
340 nm después de una incubación a 37ºC durante 5 minutos, usando la
disolución de blanco como testigo. Como se muestra en la Figura 2,
el ADP pudo ser ensayado cuantitativamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Para preparar la muestra de ADP, se preparó una
disolución acuosa de ADP en concentraciones de 2,5 mM, 5,0 mM, 7,5
mM, 10,0 mM y 12,5 mM. Se añadieron 20 \mul de muestra de ADP a 1
ml de los reactivos para ensayo y se midió la absorción óptica a
340 nm después de una incubación a 37ºC durante 5 minutos, usando la
disolución de blanco como testigo. Como se muestra en la Figura 3,
el ADP pudo ser ensayado cuantitativamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Para preparar la muestra de ADP, se preparó una
disolución acuosa de ADP en concentraciones de 2,8 mM, 5,6 mM, 8,4
mM, 11,2 mM y 14 mM. Se añadieron 20 \mul de muestra de ADP a 1 ml
de los reactivos para ensayo y se midió la absorción óptica a 340
nm después de una incubación a 20ºC durante 5 minutos, usando la
disolución de blanco como testigo. Como se muestra en la Figura 4,
el ADP pudo ser ensayado cuantitativamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Para preparar la muestra de ADP, se preparó una
disolución acuosa de ADP en concentraciones de 2,7 mM, 5,4 mM, 8,1
mM, 10,8 mM y 13,5 mM. Se añadieron 20 \mul de muestra de ADP a 1
ml de los reactivos para ensayo y se midió la absorción óptica a
340 nm después de una incubación a 40ºC durante 5 minutos, usando la
disolución de blanco como testigo. Como se muestra en la Figura 5,
el ADP pudo ser ensayado cuantitativamente.
Para preparar la muestra de urea, se preparó una
disolución acuosa de urea en concentraciones de 2,6 mM, 5,2 mM, 7,8
mM, 10,4 mM y 13 mM. Se añadieron 20 \mul de muestra de urea a 1
ml de los reactivos para ensayo y se midió la absorción óptica a
340 nm después de una incubación a 37ºC durante 5 minutos, usando la
disolución de blanco como testigo. Como se muestra en la Figura 6,
la urea pudo ser ensayada cuantitativamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Para preparar la muestra de creatinina, se
preparó una disolución acuosa de creatinina en concentraciones de
2,6 mM, 5,2 mM, 7,8 mM, 10,4 mM y 13 mM. Se añadieron 20 \mul de
muestra de creatinina a 1 ml de los reactivos para ensayo y se
midió la absorción óptica a 340 nm después de una incubación a 37ºC
durante 5 minutos, usando la disolución de blanco como testigo.
Como se muestra en la Figura 7, la creatinina pudo ser ensayada
cuantitativamente.
Para preparar la muestra de creatinina, se
preparó una disolución acuosa de creatinina en concentraciones de
2,7 mM, 5,3 mM, 7,9 mM, 10,5 mM y 13 mM. Se añadieron 20 \mul de
muestra de creatinina a 1 ml de los reactivos para ensayo y se
midió la absorción óptica a 340 nm después de una incubación a 37ºC
durante 5 minutos, usando la disolución de blanco como testigo.
Como se muestra en la Figura 8, la creatinina pudo ser ensayada
cuantitativamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Para preparar la muestra de creatina, se preparó
una disolución acuosa de creatina en concentraciones de 2,6 mM, 5,2
mM, 7,8 mM, 10,4 mM y 13 mM. Se añadieron 20 \mul de muestra de
creatina a 1 ml de los reactivos para ensayo y se midió la
absorción óptica a 340 nm después de una incubación a 37ºC durante 5
minutos, usando la disolución de blanco como testigo. Como se
muestra en la Figura 9, la creatina pudo ser ensayada
cuantitativamente.
Para preparar la muestra de glicerol, se preparó
una disolución acuosa de glicerol en concentraciones de 2,6 mM, 5,2
mM, 7,8 mM, 10,4 mM y 13 mM. Se añadieron 20 \mul de muestra de
glicerol a 1 ml de los reactivos para ensayo y se midió la
absorción óptica a 340 nm después de una incubación a 37ºC durante 5
minutos, usando la disolución de blanco como testigo. Como se
muestra en la Figura 10, el glicerol pudo ser ensayado
cuantitativamente. Se pudo ensayar el glicerol liberado de un
triglicérido por la acción de una lipasa o el liberado de
fosfatidilglicerol por la acción de la fosfolipasa D.
\vskip1.000000\baselineskip
Para preparar la muestra de hidrocloruro de
colina, se preparó una disolución acuosa de hidrocloruro de colina
en concentraciones de 2,6 mM, 5,2 mM, 7,8 mM, 10,4 mM y 13 mM. Se
añadieron 20 \mul de muestra de hidrocloruro de colina a 1 ml de
los reactivos para ensayo y se midió la absorción óptica a 340 nm
después de una incubación a 37ºC durante 5 minutos, usando la
disolución de blanco como testigo. Como se muestra en la Figura 11,
la colina pudo ser ensayada cuantitativamente. Se pudo ensayar la
colina liberada de un fosfolípido por la acción de la fosfolipasa
D.
Para preparar la muestra de
L-glutamato, se preparó una disolución acuosa de
L-glutamato en concentraciones de 2,6 mM, 5,2 mM,
7,8 mM, 10,4 mM y 13 mM. Se añadieron 20 \mul de muestra de
L-glutamato a 1 ml de los reactivos para ensayo y
se midió la absorción óptica a 340 nm después de una incubación a
37ºC durante 5 minutos, usando la disolución de blanco como
testigo. Como se muestra en la Figura 12, el
L-glutamato pudo ser ensayado cuantitativamente. Se
pudo ensayar el L-glutamato liberado por la acción
de la aspartato transferasa (GOT) o la alanina transferasa
(GPT).
Para preparar la muestra de urea, se preparó una
disolución acuosa de urea en concentraciones de 2,3 mM, 4,6 mM, 6,9
mM, 9,2 mM y 11,5 mM. Se añadieron 20 \mul de muestra de urea a 1
ml de los reactivos para ensayo y se midió la absorción óptica a
340 nm después de una incubación a 37ºC durante 5 minutos, usando la
disolución de blanco como testigo. Como se muestra en la Figura 13,
la urea pudo ser ensayada cuantitativamente.
Para preparar la muestra de creatinina, se
preparó una disolución acuosa de creatinina en concentraciones de
2,5 mM, 5,0 mM, 7,5 mM, 10,0 mM y 12,5 mM. Se añadieron 20 \mul de
muestra de creatinina a 1 ml de los reactivos para ensayo y se
midió la absorción óptica a 340 nm después de una incubación a 37ºC
durante 5 minutos, usando la disolución de blanco como testigo.
Como se muestra en la Figura 14, la creatinina pudo ser ensayada
cuantitativamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Para preparar la muestra de creatina, se preparó
una disolución acuosa de creatina en concentraciones de 2,8 mM, 5,6
mM, 8,4 mM, 11,2 mM y 14 mM. Se añadieron 20 \mul de muestra de
creatina a 1 ml de los reactivos para ensayo y se midió la
absorción óptica a 340 nm después de una incubación a 20ºC durante 5
minutos, usando la disolución de blanco como testigo. Como se
muestra en la Figura 15, la creatina pudo ser ensayada
cuantitativamente.
Para preparar la muestra de glicerol, se preparó
una disolución acuosa de glicerol en concentraciones de 2,7 mM, 5,4
mM, 8,1 mM, 10,8 mM y 13,5 mM. Se añadieron 20 \mul de muestra de
glicerol a 1 ml de los reactivos para ensayo y se midió la
absorción óptica a 340 nm después de una incubación a 40ºC durante 5
minutos, usando la disolución de blanco como testigo. Como se
muestra en la Figura 16, el glicerol pudo ser ensayado
cuantitativamente. Se pudo ensayar el glicerol liberado de un
triglicérido por la acción de una lipasa o el liberado de
fosfatidilglicerol por la acción de la fosfolipasa D.
Ejemplo de referencia
2
Para preparar la muestra de ADP, se preparó una
disolución acuosa de ADP en concentraciones de 0,5 mM, 10 mM y 15
mM. Se añadieron 20 \mul de muestra de ADP a 1 ml de los reactivos
para ensayo una vez que estos hubieran sido precalentados a 50ºC
durante 5 minutos, y se midió la absorción óptica a 340 nm después
de una incubación a 50ºC durante 5 minutos, usando la disolución de
blanco de reactivos como testigo. Como se muestra en la Figura 17,
el ADP no pudo ser ensayado cuantitativamente.
En el método del presente invento, puesto que la
muestra biológica es ensayada basándose en la cantidad generada de
NAD(P) reducido, el límite del ensayo es elevado. Puesto que
se ensaya el NAD(P) reducido, cuyo coeficiente de absorción
molecular está claramente definido, la fiabilidad de los datos del
ensayo es elevada. Además, el método de ensayo del presente invento
presenta ventajas sin la influencia de la sustancia reductora activa
de la muestra. En consecuencia, de acuerdo con el presente invento,
se puede ensayar sencilla y precisamente el ADP de la muestra
biológica o la enzima que genera ADP y el sustrato de la misma en la
muestra biológica.
Claims (20)
-
\global\parskip0.900000\baselineskip
1. Un método para determinar el ADP contenido en una muestra líquida por medio de una reacción enzimática, que comprende hacer reaccionar la muestra a una temperatura de 15 a 45ºC al menos en presencia de glucosa, hexoquinasa dependiente de ADP, NAD(P) oxidado, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, y una o más sales liberadoras de iones seleccionadas del grupo que consiste en sales liberadoras de iones magnesio, cobalto y manganeso, y determinar el ADP contenido en la muestra basándose en la cantidad de NAD(P) reducido producido. - 2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en que el ADP es ADP existente o generado en la muestra.
- 3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en que la hexoquinasa dependiente de ADP es hexoquinasa supertermófila dependiente de ADP.
- 4. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en que la temperatura para la reacción es 20-40ºC.
- 5. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en que la concentración de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y de hexoquinasa dependiente de ADP es 0,1-100 U/ml; la concentración de glucosa es 0,5-100 mM; la concentración de NAD(P) oxidado es 5-50 mM; y la concentración de sal liberadora de iones es 0,1-50 mM.
- 6. Un método para determinar una enzima para generar ADP o un sustrato de la misma en una muestra líquida por medio de una reacción enzimática, que comprende hacer reaccionar la muestra que contiene la enzima para generar ADP o el sustrato de la misma en la muestra líquida a una temperatura de 15 a 45ºC al menos en presencia de un reactivo de reacción que está implicado en la reacción basada en la enzima para generar ADP y el sustrato de la misma, ATP, glucosa, hexoquinasa dependiente de ADP, NAD(P) oxidado, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y una o más sales liberadoras de iones magnesio, iones cobalto o iones manganeso, y determinar la enzima para generar ADP o el sustrato de la misma contenidos en la muestra junto con el AMP que resulta de la reacción basándose en la cantidad del NAD(P) reducido producido.
- 7. Un método de acuerdo con la reivindicación 6, en que la enzima para generar ADP es urea amidohidrolasa y el sustrato de la misma es urea.
- 8. Un método de acuerdo con la reivindicación 6, en que la enzima para generar ADP es creatina quinasa y el sustrato de la misma es creatina.
- 9. Un método de acuerdo con la reivindicación 8, en que la creatina es la creatina liberada de creatinina por acción de la creatininasa.
- 10. Un método de acuerdo con la reivindicación 6, en que la enzima para generar ADP es N-metilhidantoinasa y el sustrato de la misma es N-metilhidantoína.
- 11. Un método de acuerdo con la revindicación 10, en que la N-metilhidantoína es la N-metilhidantoína liberada de creatinina por acción de la creatinina desiminasa.
- 12. Un método de acuerdo con la reivindicación 6, en que la enzima para generar ADP es glicerol quinasa y el sustrato de la misma es glicerol.
- 13. Un método de acuerdo con la reivindicación 12, en que el glicerol es el glicerol liberado de triglicéridos, diglicéridos o monoglicéridos por acción de una lipasa o el glicerol liberado de fosfatidilglicerol por acción de la fosfolipasa D.
- 14. Un método de acuerdo con la reivindicación 6, en que la enzima para generar ADP es colina quinasa y el sustrato de la misma es colina.
- 15. Un método de acuerdo con la reivindicación 14, en que la colina es la colina liberada de fosfatidilcolina por acción de la fosfolipasa D o la colina liberada de un éster de colina por acción de la colina esterasa.
- 16. Un método de acuerdo con la reivindicación 6, en que la enzima para generar ADP es glutamina sintetasa o glutamato quinasa y el sustrato de la misma es L-glutamato.
- 17. Un método de acuerdo con la revindicación 16, en que el L-glutamato es el L-glutamato liberado de L-aspartato y \alpha-cetoglutarato por acción de la aspartato aminotransferasa.
- 18. Un método de acuerdo con la revindicación 16, en que el L-glutamato es el L-glutamato liberado de L-alanina y \alpha-cetoglutarato por acción de la alanina aminotransferasa.
- 19. Un método de acuerdo con la reivindicación 6, en que la hexoquinasa dependiente de ADP es una hexoquinasa supertermófila dependiente de ADP.
- 20. Un método de acuerdo con la reivindicación 5, en que la temperatura para la reacción es 20-40ºC.
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