ES2306723T3 - Conjugados peptidos y peptidomimeticos con propiedades inhibidoras de integrina. - Google Patents

Conjugados peptidos y peptidomimeticos con propiedades inhibidoras de integrina. Download PDF

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Abstract

Compuesto de fórmula 1 B-Q-X1 en la que B es una molécula bioactiva que se une a integrina Q falta o es una molécula espaciadora orgánica seleccionada del grupo [CO-(CH2)x-NH-]m, (xii) [CO-CH2-(O-CH2CH2)y-NH-]m, (xiii) [CO-(CH2)2-CO-] (xiv) [NH-(CH2)z-NH-] (xv) [CO-CH2-(OCH2CH2)y-O-CH2-CO-] (xvi) [NH-CH2CH2-(OCH2CH2)y-NH-] (xvii) así como su combinación en las que m es en cada caso, independientemente entre sí, 1 a 20 x es 1 a 12 y es 1 a 50 z es 1 a 12, X1 significa una molécula de anclaje seleccionada del grupo -Lys-(CO-CH2-(CH2)n-PO3H2)2 (i) -Lys-[Lys-(CO-CH2-(CH2)n-PO3H2)2]2 (ii) o -Lys-(Lys[-Lys-(CO-CH2-(CH2)n-PO3H2)2]2 (iii) y n es en cada caso, independientemente entre sí, 0, 1, 2 ó 3, y en las que un grupo amino libre del grupo B está unido peptídicamente entre sí a un grupo carboxilo libre de la molécula espaciadora Q o de la molécula de anclaje X1, o un grupo amino libre del resto Q a un grupo carboxilo libre del resto X1, así como sus sales.

Description

Conjugados peptídicos y peptidomiméticos con propiedades inhibidoras de integrina.
La invención se refiere a compuestos de fórmula I
B-Q-X_{1}
I
en la que
B
significa una molécula bioactiva que se une a integrina
Q
falta o es una molécula espaciadora orgánica seleccionada del grupo
[CO-(CH_{2})_{x}-NH-]_{m},
(xii)
[CO-CH_{2}-(O-CH_{2}CH_{2})_{y}-NH-]_{m},
(xiii)
[CO-(CH_{2})_{z}-CO-]
(xiv)
[NH-(CH_{2})_{z}-NH-]
(xv)
[CO-CH_{2}-(OCH_{2}CH_{2})_{y}-O-CH_{2}-CO-]
(xvi)
[NH-CH_{2}CH_{2}-(OCH_{2}CH_{2})_{y}-NH-]
(xvii)
\vskip1.000000\baselineskip
\quad
así como su combinación
\quad
en las que
\quad
m es en cada caso, independientemente entre sí, 1 a 20
\quad
x es 1 a 12
\quad
y es 1 a 50
\quad
z es 1 a 12.
X_{1}
significa una molécula de anclaje seleccionada del grupo
-Lys-(CO-CH_{2}-(CH_{2})_{n}-PO_{3}H_{2})_{2}
(i)
-Lys-[Lys-(CO-CH_{2}-(CH_{2})_{n}-PO_{3}H_{2})_{2}]_{2}
(ii)
\quad
o
-Lys-(Lys[-Lys-(CO-CH_{2}-(CH_{2})_{n}-PO_{3}H_{2})_{2}]_{2}
(iii)
\quad
y n es en cada caso, independientemente entre sí, 0, 1, 2 ó 3, y
en las que un grupo amino libre del grupo B está unido peptídicamente entre sí a un grupo carboxilo libre de la molécula espaciadora Q o de la molécula de anclaje X_{1}, o un grupo amino libre del resto Q a un grupo carboxilo libre del resto X_{1},
así como sus sales.
Se conocen compuestos similares de los documentos DE 19932796, DE 19755800 y DE 19831710.
La invención tenía como objetivo encontrar nuevos compuestos con valiosas propiedades, en especial aquellas que pueden usarse para la preparación de medicamentos.
Se encontró que los compuestos de fórmula I y sus sales poseen a una buena tolerancia propiedades farmacológicas muy valiosas. Actúan sobre todo como inhibidores de integrina, inhibiendo en especial las interacciones de los receptores de integrina \alpha_{v}\beta_{3} o \alpha_{v}\beta_{5} con ligandos, como p. ej. el enlace del fibrinógeno al receptor de integrina \beta_{3}. Los compuestos presentan una especial actividad en el caso de las integrinas \alpha_{v}\beta_{3}, \alpha_{v}\beta_{5}, \alpha_{IIb}\beta_{3} así como \alpha_{v}\beta_{1}, \alpha_{v}\beta_{6} y \alpha_{v}\beta_{8}.
Este efecto puede demostrarse p. ej. mediante el método descrito por J. W. Smith y col. en J. Biol. Chem. 265, 12267-12271 (1990).
La dependencia entre la aparición de angiogénesis y la interacción entre integrinas vasculares y proteínas de la matriz extracelular lo describen P. C. Brooks, R. A. Clark y D. A. Cheresh en Science 264, 569-71 (1994).
La posibilidad de inhibición de esta interacción y con ello de introducir apoptosis (muerte celular programada) de células vasculares angiógenas por medio de un péptido cíclico lo han descrito P. C. Brooks, A. M. Montgomery, M. Rosenfeld, R. A. Reisfeld, T.-Hu, G. Klier y D. A. Cheresh en Cell 79, 1157-64 (1994).
El documento DE 19755801 describe péptidos que contienen dominios responsables de la adhesión de las células, así como grupos de anclaje. Los grupos de anclaje poseen, entre otros, grupos tiol con los que se unen al material del implante.
B.C.F. Chu y col.: "Presentations of Ligands on Hydroxylapatite", publicado en Bioconjugate Chemistry 8, 1997, páginas 103-105, describe trímeros de ácido 2-amino-5-fosfonovalérico conjugados con biotina, que se unen a hidroxilapatito.
Los compuestos de la fórmula I que bloquean la interacción de receptores de integrina y ligandos, como p. ej. del fibrinógeno al receptor de fibrinógeno (glicoproteína IIb/IIIa), impiden como antagonistas GPIIb/IIIa la propagación de las células tumorales por metástasis. Esto se demostró mediante las observaciones siguientes:
\quad
La propagación de las células tumorales desde un tumor local al sistema vascular se realiza mediante la formación de microagregados (microtrombos) al interaccionar las células tumorales con las plaquetas. Las células tumorales están blindadas mediante la protección en el microagregado y no son reconocidas por las células del sistema inmunitario. Los microagregados pueden fijarse a las paredes de los vasos, con lo cual se facilita la penetración adicional de las células tumorales en el tejido. Puesto que la formación de microtrombos está meada por el enlace de fibrinógeno a los receptores de fibrinógeno sobre plaquetas activadas, los antagonistas GPIIaIIIIb pueden considerarse inhibidores eficaces de las metástasis.
El resto fosfonato sirve para unir iónicamente o por adsorción los péptidos a superficies biocompatibles de p. ej. implantes que presentan óxidos, como p. ej. superficies metálicas (p. ej. titanio o aleaciones de titanio tales como TiAl_{6}V_{4}) o superficies que contienen cationes como p. ej. sobre fosfatos de calcio amorfos o sinterizados (p. ej. hidroxilapatito, huesos, dientes) o cementos de fosfato de calcio (p. ej. Biocement D).
Por consiguiente, son objeto de la invención en especial los compuestos de la fórmula I para el enlace iónico o por adsorción a superficies biocompatibles mediante el grupo funcional del resto X_{1}.
Los péptidos según la invención permiten ahora la biofuncionalización de biomateriales, en particular implantes para órganos humanos o animales mediante su recubrimiento, estimulándose principalmente la adhesión de aquellas especies celulares que deben llevar a cabo la integración del biomaterial en el correspondiente tejido. Con el uso de los recubrimientos de este tipo debe conseguirse una integración más rápida y fuerte de los distintos implantes de biomaterial con una mejora de la estabilidad a largo plazo una vez incorporados al cuerpo.
Los péptidos según la invención se unen selectivamente a integrinas. Tras la inmovilización en superficies biocompatibles, p. ej. implantes, estimulan la adhesión de células que llevan integrinas.
Después del recubrimiento de las superficies con los compuestos, para la unión se pueden estimular selectivamente aquellas especies celulares que tras la implantación en el tejido natural deban llevar a cabo la integración del implante. Así, p. ej. en el caso de osteoblastos, osteoclastos y células endoteliales se trata de especies celulares que
llevan \alpha_{v}.
Por consiguiente, son objeto de la invención los compuestos de la fórmula I como inhibidores de integrina para el enriquecimiento selectivo de células en implantes.
Una vez anclados a una superficie biocompatible, los compuestos de la fórmula I pueden usarse en medicina y veterinaria como principios activos de medicamentos, pudiéndose usar en especial como inhibidores de integrina para el tratamiento de enfermedades, defectos e inflamaciones causados por implantes tales como la integración incompleta y retrasada de biomateriales e implantes, de trombosis causada por implantes, de defectos óseos y dentales, así como de enfermedades osteolíticas tales como osteoporosis, trombosis, infarto de miocardio, arteriosclerosis, en la curación de las heridas para apoyar los procesos de curación, así como para acelerar y reforzar el proceso de integración del implante o de la superficie biocompatible en el tejido.
Los compuestos de la fórmula I pueden usarse como sustancias de acción antimicrobiana en operaciones en las que se usen biomateriales, implantes, catéteres o marcapasos.
Tienen entonces un efecto antiséptico. La eficacia de la actividad antimicrobiana puede demostrarse mediante el procedimiento descrito por P. Valentin-Weigund y col. en Infection and Immunity, 2851-2855 (1988).
Por consiguiente, son objeto de la invención los compuestos de la fórmula I como inhibidores de integrina para el tratamiento de enfermedades, defectos e inflamaciones causados por implantes y de enfermedades osteolíticas tales como osteoporosis, trombosis, infarto de miocardio y arteriosclerosis, así como para acelerar y reforzar el proceso de integración del implante o de la superficie biocompatible en el tejido.
Además, son objeto de la invención el uso de compuestos de la fórmula I para la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades, defectos, inflamaciones causados por implantes y de enfermedades osteolíticas tales como osteoporosis, trombosis, infarto de miocardio y arteriosclerosis, así como para acelerar y reforzar el proceso de integración del implante o de la superficie biocompatible en el tejido.
Los péptidos portadores de anclajes de fosfonato correspondientes se pueden unir iónicamente a soportes con superficies que contienen óxidos tales como p. ej. implantes, cromatografías de afinidad o placas de microtitulación o también a superficies que contienen cationes como p. ej. sobre fosfatos de calcio amorfos o sinterizados (p. ej. hidroxilapatito, huesos, dientes) o cementos de fosfato de calcio (p. ej. Biocement D).
Es también objeto de la invención el uso de compuestos de la fórmula I para el recubrimiento mediante enlace iónico o por adsorción de implantes para órganos humanos y animales.
Las abreviaturas de restos de aminoácidos indicadas con anterioridad y a continuación representan los restos de los siguientes aminoácidos:
Abu
ácido 4-aminobutírico
Aha
ácido 6-aminohexanoico, ácido 6-aminocaproico
Ala
alanina
Asn
asparagina
Asp
ácido asparagínico
Arg
arginina
Cys
cisteína
Dab
ácido 2,4-diaminobutírico
Dap
ácido 2,3-diaminopropiónico
Gln
glutamina
Glp
ácido piroglutámico
Glu
ácido glutámico
Gly
glicina
His
histidina
homo-Phe
homo-fenilalanina
Ile
isoleucina
Leu
leucina
Lys
lisina
Met
metionina
Nle
norleucina
Orn
ornitina
Phe
fenilalanina
Phg
fenilglicina
4-Hal-Phe
4-halofenilalanina
Pro
prolina
Ser
serina
Thr
treonina
Trp
triptófano
Tyr
tirosina
Val
valina.
\vskip1.000000\baselineskip
Además, significan a continuación:
Ac
acetilo
BOC
terc.-butoxicarbonilo
CBZ o Z
benciloxicarbonilo
DCCI
diciclohexilcarbodiimida
DMF
dimetilformamida
EDCI
N-etil-N,N'-(dimetilaminopropil)-carbodiimida
Et
etilo
FCA
ácido fluoresceinocarboxílico
FITC
isotiocianato de fluoresceína
Fmoc
9-fluorenilmetoxicarbonilo
FTH
fluoresceintiourea
HOBt
1-hidroxibenzotriazol
Me
metilo
MBHA
4-metil-benzhidrilamina
Mtr
4-metoxi-2,3,6-trimetilfenil-sulfonilo
HATU
hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio
HONSu
N-hidroxisuccinimida
OtBu
éster terc.-butílico
Oct
octanoílo
OMe
éster metílico
OEt
éster etílico
POA
fenoxiacetilo
Pbf
pentametilbenzofuranilo
Pmc
2,2,5,7,8-pentametilcromano-6-sulfonilo
Sal
saliciloílo
Su
succinilo
TIPS
triisopropilsilano
TFA
ácido trifluoroacético
En lugar de los compuestos según la invención también pueden usarse los llamados derivados de profármacos, es decir, compuestos de la fórmula 1 modificados con grupos alquilo o acilo, azúcares u oligopéptidos que en el organismo se disocian rápidamente para dar los compuestos eficaces según la invención.
TMSBr
bromuro de trimetilsililo
Trt
tritilo (trifenilmetilo)
Siempre que los aminoácidos anteriormente citados puedan aparecer en varias formas enantioméricas, con anterioridad y a continuación, p. ej. como componente de los compuestos de la fórmula 1, se incluyen todas estas formas y también sus mezclas (p. ej. las formas DL). Además los aminoácidos, p. ej. como componente de compuestos de la fórmula 1, pueden estar provistos de los correspondientes grupos protectores en sí conocidos.
Como ciclopéptidos pueden usarse también sobre todo modificaciones de la cadena lateral de la arginina, tal como se realizó p. ej. en los antagonistas \alpha_{v}\beta_{3} no peptídicos (p. ej. por R. Keenan y col., Abstr. Pap. 211th ACS National Meeting (Nueva Orleans, EE.UU.) 1996, MEDI 236), como p. ej. derivados de bencimidazol en lugar del grupo guanidina.
Es objeto de la invención, además, un implante adecuado para órganos humanos y animales constituido por una matriz de soporte y una capa de una molécula bioactiva que media en la adhesión celular que rodea esta matriz, estando formada la capa circundante por un compuesto de la fórmula I, y existiendo entre la matriz de soporte y este compuesto un enlace iónico o por adsorción. La matriz de soporte y/o su superficie están constituidos preferentemente por un metal u óxido metálico. La matriz de soporte y/o su superficie están constituidos preferentemente por un material de sustitución ósea o dental, como p. ej. de mezclas de fosfato de calcio.
Es objeto de la invención, además, un procedimiento para la preparación de compuestos de la fórmula I según la reivindicación 1, así como sus sales, caracterizado porque una molécula B bioactiva que puede estar provista de grupos protectores y una molécula espaciadora-de anclaje (Q-X_{1}) o molécula de anclaje (X_{1}) provista de grupos protectores se unen entre sí peptídicamente y a continuación se disocian los grupos protectores, y/o porque un compuesto básico o ácido de la fórmula 1 se convierte en una de sus sales mediante tratamiento con un ácido o base.
Anteriormente y a continuación, los restos B, Q y X_{1} tienen el significado indicado en la fórmula I siempre que no se indique expresamente lo contrario.
B significa preferentemente un resto ciclo-(Arg-Gly-Asp-Z_{1}),
1
Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys,
Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys,
Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys,
Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg,
Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn o
Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg,
significando Z_{1} en cada caso, independientemente entre sí, un resto de aminoácido o un resto di- o tripeptídico, seleccionándose los aminoácidos independientemente entre sí del grupo constituido por Ala, Asn, Asp, Arg, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Homo-Phe, Ile, Leu, Lys, Orn, Met, Phe, Phg, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val.
Q falta o significa una molécula espaciadora orgánica. Esta es preferentemente un resto [CO-(CH_{2})_{x}-NH-]_{m}, [CO-CH_{2}(-O-CH_{2}CH_{2})_{y}-NH-]_{m}, [CO-(CH_{2})_{z}-CO-], [NH-(CH_{2})_{z}-NH-], [CO-CH_{2}(OCH_{2}CH_{2})_{y}-O-CH_{2}-CO-] o [NHCH_{2}
CH_{2}-(OCH_{2}CH_{2})_{y}-NH-] así como sus combinaciones, siendo válidos para los índices m, x, y y z los intervalos de valores reivindicados en la reivindicación 3. Han resultado ser especialmente ventajosos los compuestos anteriormente
citados que pueden tomar para m valores entre 1 y 8, para x valores entre 1 y 5 y para y y z valores entre 1 y 6.
X_{1} significa una molécula de anclaje, preferentemente del grupo -Lys-(CO-CH_{2}-(CH_{2})_{n}-PO_{3}H_{2})_{2}, -Lys-[Lys-(CO-CH_{2}-(CH_{2})_{n}-PO_{3}H_{2})_{2}]_{2} o -Lys-(Lys[-Lys-(CO-CH_{2}-(CH_{2})_{n}-PO_{3}H_{2})_{2}]_{2})_{2}, pudiendo ser n en cada caso e independientemente entre sí 0, 1, 2 ó 3.
Los aminoácidos y restos de aminoácidos citados en los significados de Z_{1} también pueden derivarse, prefiriéndose los derivados de N-metilo, N-etilo, N-propilo, N-bencilo o C_{\alpha}-metilo. Se prefieren además derivados de Asp y Glu, en especial los ésteres metílicos, etílicos, propílicos, butílicos, terc.-butílicos, neopentílicos o bencílicos de los grupos carboxi de cadena lateral, además también derivados de Arg que en el grupo -NH-C(=NH)-NH_{2} pueden estar sustituidos con un resto benzoílo, metoxicarbonilo o etoxicarbonilo.
X significa preferentemente H_{2}N-C(=NH)-NH-, Het-NH-, H_{2}N-C(=NH)-, A-C(=NH)-NH o un resto Het.
Y significa preferentemente un resto -(CH_{2})_{n} o
2
-(CH_{2})_{s}-CH(R^{4})-(CH_{2})_{t} o -(CH_{2})_{p}-Het^{1}-(CH_{2})_{q}.
Z significa preferentemente N-R^{2} o CH-R^{2}, pudiendo ser R^{2} preferentemente un átomo de H o un resto alquilo con 1 a 4 átomos de C.
R^{3} significa preferentemente un átomo de H, Ar, Het o un resto A, pudiendo tener A, Ar y Het uno de los significados indicados anterior o posteriormente.
R^{4} significa preferentemente un átomo de H, A, Ar, OH, OA, OAr, arilalquilo, Hal, CN, NO_{2}, CF_{3} o un resto OCF_{3}. Arilalquilo significa preferentemente bencilo, feniletilo, fenilpropilo o naftilmetilo, de manera especialmente preferente bencilo.
A significa preferentemente un resto COOH, NH_{2} o alquilo con 1 a 6 átomos de C, sin sustituir o sustituido con COOH o NH_{2}. A significa preferentemente metilo, además etilo, propilo, n-butilo, isobutilo, sec.-butilo o terc.-butilo, además también n-pentilo, 1-, 2- o 3-metilbutilo, 1,1-, 1,2- o 2,2-dimetilpropilo, 1-etilpropilo, hexilo, 1-, 2-, 3- o 4-metilpentilo, 1,1-, 1,2-, 1,3-, 2,2-, 2,3- o 3,3-dimetilbutilo, 1- o 2-etilbutilo, 1-etil-1-metilpropilo, 1-etil-2-metilpropilo, 1,1,2- o 1,2,2-trimetilpropilo. Especialmente preferido para A es metilo.
Ar significa preferentemente fenilo sin sustituir o sustituido una, dos o tres veces con A, OH, OA, CF_{3}, OCF_{3}, CN, NO_{2} o Hal, que puede sustituirse con fenilo sustituido una, dos o tres veces con A, OH, OA, NH_{2}, OCF_{3}, CN, NO_{2} o Hal, de tal manera que se forme un bifenilo sustituido o sin sustituir.
Por lo tanto, Ar significa preferentemente fenilo, o-, m- o p-metilfenilo, o-, m- o p-etilfenilo, o-, m o p-propilfenilo, o, -m o p-isopropilfenilo, o-, m- o p-terc.-butilfenilo, o-, m- o p-hidroxifenil-, o-, m- o p-metoxifenilo, o-, m- o p-etoxifenil-, o-, m-, p-trifluorometilfenilo, o-, m-, p-trifluorometoxifenilo, o-, m- o p-fluorofenilo, o-, m- o p-clorofenilo, o-, m- o p-bromofenilo, o-, m-, p-nitrofenilo, o-, m- o p-aminometilfenilo.
Het significa un resto heterocíclico mono o bicíclico, saturado, parcialmente o totalmente insaturado con 5 a 10 elementos de anillo, pudiendo existir de 1 a 3 átomos de N y/o 1 S u O y pudiendo estar sustituido el resto heterocíclico una o dos veces con CN, Hal, OH, NH_{2}, COOH, OA, CF_{3}, A, NO_{2}, Ar o OCF_{3}.
Het es preferentemente un piridilo sustituido en o, m o p, un pirimidilo sustituido en la posición 2, 4, 5 ó 6 o un piridazilo sustituido en la posición 3, 4, 5 ó 6, que preferentemente está sin sustituir o sustituido con un grupo metilo, etilo, propilo o un grupo metilamino, etilamino o propilamino (referido a los tres compuestos heteroaromáticos citados), así como un bencimidazolilo sustituido en 2 que no está sustituido o está sustituido con un grupo 3-metilo, 3-etilo o 3-bencilo, así como un dihidroimidazolilo sustituido en 2, tetrahidropirimidilo o tetrahidropiridilo. Ejemplos que están contenidos preferentemente en Het son:
3
4
5
Het^{1} significa un heterociclo aromático de 5 ó 6 elementos con 1 a 4 átomos de N, O y/o S que puede estar sin sustituir o sustituido una o dos veces con F, Cl, Br, A, OA o OCF_{3}.
Het^{1} es preferentemente un piridilo disustituido en 2,4, 3,5 ó 2,5 o un pirimidilo disustituido en 2,4, 2,5, 2,6, 4,6, un 1,3-oxazolilo o 1,3-tiazolilo disustituidos en 2,4, 2,5.
OA significa preferentemente metoxi, etoxi, propoxi o butoxi, además también pentiloxi o hexiloxi.
Het significa preferentemente F, Cl o Br, aunque también 1.
Los índices n, m, o, p, q, s y t tienen el significado indicado en la reivindicación 2, siempre que no se indique expresamente lo contrario.
Los compuestos de la fórmula I pueden poseer uno o varios centros quirales y, por consiguiente, pueden presentarse en distintas formas estereoisómeras. La fórmula I comprende todas estas formas.
Por consiguiente, son objeto de la invención en particular aquellos compuestos de la fórmula I en la que como mínimo uno de los restos mencionados tiene uno de los significados preferidos antes indicados.
Especialmente preferidos son los siguientes compuestos de la fórmula I:
a)
Ciclo-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(N^{\varepsilon}H-[CO-(CH_{2})_{5}-NH]_{2}-Lys-[Lys-(CO-CH_{2}-(CH_{2})_{n}-PO_{3}H_{2})_{2}]_{2}));
b)
Ciclo-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(N^{\varepsilon}H-[CO-(CH_{2})_{5}-NH]_{3}-Lys-[Lys-(CO-CH_{2}-(CH_{2})_{n}-PO_{3}H_{2})_{2}]_{2}));
c)
Ciclo-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(N^{\varepsilon}H-[CO-CH_{2}(-O-CH_{2}CH_{2})_{6}-, NH]_{2}-Lys-[Lys-(CO-CH_{2}-(CH_{2})_{n}-PO_{3} H_{2})_{2}]_{2}));
en la que n es igual a 1.
Los compuestos de la fórmula I y también las sustancias de partida para su preparación se preparan, por lo demás, según métodos en sí conocidos tal como se describen en la bibliografía (p. ej. en las obras estándar tales como Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, Georg-Thieme-Verlag, Stuttgart), y en concreto en las condiciones de reacción que son conocidas y apropiadas para las citadas reacciones. Puede usarse también una variante en sí conocida aunque no se cite aquí de manera más detallada.
En caso deseado, las sustancias de partida pueden formarse también in situ de tal manera que no se aíslan a partir de la mezcla de reacción, sino que inmediatamente se siguen haciendo reaccionar para dar los compuestos de la fórmula I.
El acoplamiento de fragmentos o el acoplamiento de ligando al conector se realiza por regla general en un disolvente inerte, disolviéndose un fragmento de ácido carboxílico (conector de fosfonato p. ej. HO-[CO-(CH_{2})_{5}-NH]_{2}-Lys-[Lys-(CO-CH_{2}-CH_{2}-PO_{3}(C_{2}H_{5})_{2})_{2}]_{2}) con HATU, HOAt y 2,4,6-colidina en DMF y haciéndose reaccionar con un fragmento de amina (ciclopéptido p. ej. c[R(Pbf)G(OtBu)fK]).
Como disolventes inertes son apropiados p. ej. hidrocarburos tales como hexano, éter de petróleo, benceno, tolueno o xileno; hidrocarburos clorados tales como tricloroetileno, 1,2-dicloroetano, tetracloruro de carbono, cloroformo o diclorometano; alcoholes tales como metanol, etanol, isopropanol, n-propanol, n-butanol o terc.-butanol; éteres como éter dietílico, éter diisopropílico, tetrahidrofurano (THF) o dioxano; éteres glicólicos tales como éter monometílico o monoetílico de etilenglicol (metilglicol o etilglicol), éter dimetílico de etilenglicol (Diglyme); cetonas tales como acetona o butanona; amidas tales como acetamida, N-metilpirrolidona, dimetilacetamida o dimetilformamida (DMF); nitrilos tales como acetonitrilo; sulfóxidos tales como dimetilsulfóxido (DMSO); disulfuro de carbono; ácidos carboxílicos tales como ácido fórmico o ácido acético; compuestos nitrogenados tales como nitrometano o nitrobenceno; ésteres tales como acetato de etilo, agua o mezclas de los disolventes mencionados.
Los compuestos cíclicos pueden prepararse ciclando los compuestos lineales tal como se describe p. ej. en el documento DE 43 10 643, en Houben-Weyl, l.c., tomo 15/II, páginas 1 a 806 (1974) o lo describen S. Zimmer, E. Hoffmann, G. Jung y H. Kessler, Liebigs Ann. Chem. 1993, 497-501.
Los péptidos lineales pueden sintetizarse p. ej. según R. B. Merrifield, Angew. Chemie 1985, 97, 801-812.
Por lo demás, los compuestos lineales de cadena abierta, como p. ej. los compuestos de la fórmula I, se pueden preparar según métodos habituales de la síntesis de aminoácidos y de péptidos, p. ej. también por síntesis en fase sólida según Merrifield (véase también p. ej. B. F. Gysin y R. B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 94, 3102 ss. (1972)).
Los compuestos de la fórmula I pueden obtenerse además liberándolos de sus derivados funcionales mediante solvólisis, en especial hidrólisis, o mediante hidrogenolisis.
Sustancias de partida preferidas para la solvólisis o la hidrogenolisis son aquellas que en lugar de uno o varios grupos amino y/o hidroxi libres contienen los correspondientes grupos amino y/o hidroxi protegidos, preferentemente aquellos que en lugar de un átomo de H que está unido a un átomo de N llevan un grupo protector de amino, p. ej. aquellos que corresponden a la fórmula 1 pero que en lugar de un grupo NH_{2} contienen un grupo NHR' (en donde R' significa un grupo protector de amino, p. ej. BOC o CBZ).
Además, se prefieren sustancias de partida que en lugar del átomo de H de un grupo hidroxi llevan un grupo protector de hidroxi, p. ej. aquellos que corresponden a la fórmula 1 pero que en lugar de un grupo hidroxifenilo contienen un grupo R''O-fenilo (en donde R'' significa un grupo protector de hidroxi).
En la molécula de la sustancia de partida pueden estar también presentes varios grupos amino y/o hidroxi protegidos, iguales o distintos. En el caso de que los grupos protectores presentes sean distintos entre sí, en muchos casos pueden disociarse selectivamente.
La expresión "grupo protector de amino" es conocida en general y se refiere a grupos que son adecuados para proteger (bloquear) un grupo amino de las reacciones químicas, pero que pueden eliminarse con facilidad después de haberse realizado en otros sitios de la molécula la reacción química deseada. Grupos típicos de este tipo son en especial grupos acilo, arilo, aralcoximetilo o aralquilo sustituidos o sin sustituir. Ya que después de la reacción deseada (o sucesión de reacciones) se eliminan los grupos protectores de amino, su tipo y su tamaño no son por lo demás críticos; no obstante, se prefieren aquellos con 1-20, en especial 1-8 átomos de C. La expresión "grupo acilo" debe entenderse en el contexto de la presente invención en su sentido más amplio. Comprende grupos acilo derivados de ácidos carboxílicos o ácidos sulfónicos alifáticos, aralifáticos, aromáticos o heterocíclicos, así como en especial grupos alcoxicarbonilo, ariloxicarbonilo y sobre todo aralcoxicarbonilo. Ejemplos de grupos acilo de este tipo son alcanoílo tal como acetilo, propionilo, butirilo; aralcanoílo tal como fenilacetilo; aroílo tal como benzoílo o toluilo; ariloxialcanoílo tal como POA; alcoxicarbonilo tal como metoxicarbonilo, etoxicarbonilo, 2,2,2-tricloroetoxicarbonilo, BOC, 2-yodoetoxicarbonilo; aralquiloxicarbonilo tal como CBZ ("carbobenzoxi"), 4-metoxibenciloxicarbonilo, FMOC; arilsulfonilo tal como Mtr, Pbf o Pmc. Grupos protectores de amino preferidos son BOC y Mtr, además CBZ, Fmoc, bencilo y acetilo.
La expresión "grupo protector de hidroxi" también es conocida en general y se refiere a grupos que son adecuados para proteger un grupo hidroxi de las reacciones químicas, pero que pueden eliminarse con facilidad después de haberse realizado en otros sitios de la molécula la reacción química deseada. Grupos típicos de este tipo son los grupos arilo, aralquilo o acilo sustituidos o sin sustituir que se han mencionado anteriormente, además también grupos alquilo. La naturaleza y el tamaño de los grupos protectores de hidroxi no son críticos ya que vuelven a eliminarse después de la reacción química o sucesión de reacciones químicas deseadas; se prefieren grupos con 1-20, en especial 1-10 átomos de C. Ejemplos de grupos protectores de hidroxi son, entre otros, bencilo, p-nitrobenzoílo, p-toluenosulfonilo, terc.-butilo y acetilo, prefiriéndose en especial bencilo y terc.-butilo. Los grupos COOH de los ácidos asparagínico y glutámico se protegen preferentemente en forma de sus ésteres terc.-butílicos (p. ej. Asp(OtBu)).
La liberación de los compuestos de la fórmula I de sus derivados funcionales se consigue - según el grupo protector usado - p. ej. con ácidos fuertes, de manera conveniente con TFA o ácido perclórico, aunque también con otros ácidos inorgánicos fuertes tales como ácido clorhídrico o ácido sulfúrico, ácidos carboxílicos orgánicos fuertes tales como ácido tricloroacético o ácidos sulfónicos tales como ácido bencenosulfónico o ácido p-toluenosulfónico. La presencia de un disolvente inerte adicional es posible, aunque no siempre es necesaria. Como disolventes inertes resultan apropiados preferentemente, por ejemplo, ácidos carboxílicos orgánicos tales como ácido acético, éteres como tetrahidrofurano o dioxano, amidas como DMF, hidrocarburos halogenados como diclorometano, además también alcoholes tales como metanol, etanol o isopropanol, así como agua. Entran además en consideración mezclas de los disolventes anteriormente mencionados. El TFA se usa preferentemente en exceso sin la adición de otro disolvente, el ácido perclórico en forma de una mezcla de ácido acético y ácido perclórico al 70% en la proporción 9:1. Las temperaturas de reacción para la disociación se encuentran convenientemente entre aproximadamente 0 y aproximadamente 50º, se trabaja preferentemente a entre 15 y 30º (temperatura ambiente).
Los grupos BOC, OtBu, Pbf, Pmc y Mtr pueden disociarse p. ej. preferentemente con TFA en diclorometano o con HCl aproximadamente 3 a 5 n en dioxano a 15-30º, el grupo FMOC con una disolución de aproximadamente el 5 al 50% de dimetilamina, dietilamina o piperidina en DMF a 15-30º.
El grupo tritilo se utiliza para la protección de los aminoácidos histidina, asparagina, glutamina y cisteína. La disociación se realiza, según el producto final deseado, con TFA/tiofenol al 10%, disociándose el grupo tritilo de todos los aminoácidos mencionados, al utilizar TFA/anisol, TFA/tioanisol o TFA/TIPS/H_{2}O el grupo tritilo se disocia sólo de His, Asn y Gln, mientras que permanece en la cadena lateral de Cys.
El grupo Pbf (pentametilbenzofuranilo) se utiliza para la protección de Arg. La disociación se realiza p. ej. con TFA en diclorometano.
Los grupos protectores que pueden eliminarse hidrogenolíticamente (p. ej. CBZ o bencilo) pueden disociarse p. ej. tratándolos con hidrógeno en presencia de un catalizador (p. ej. de un catalizador de metal precioso tal como paladio, convenientemente sobre un soporte tal como carbono). Como disolventes son apropiados los mencionados anteriormente, en especial p. ej. alcoholes tales como metanol o etanol o amidas tales como DMF. La hidrogenolisis se lleva a cabo por regla general a temperaturas entre aproximadamente 0 y 100ºC y presiones entre aproximadamente 100 y 20.000 kPa, preferentemente a 10-30ºC y 100-1.000 kPa.
Una hidrogenolisis del grupo CBZ se consigue bien p. ej. en Pd del 5 al 10%/C en metanol o con formiato de amonio (en lugar de hidrógeno) en Pd/C en metanol/DMF a 10-30ºC.
Una base de la fórmula I puede transformarse con un ácido en la correspondiente sal de adición de ácido, por ejemplo haciendo reaccionar cantidades equivalentes de la base y del ácido en un disolvente inerte tal como etanol y a continuación evaporándolo. Para esta reacción entran en consideración en especial ácidos que proporcionan sales fisiológicamente inocuas. Pueden usarse así ácidos inorgánicos, p. ej. ácido sulfúrico, ácido nítrico, halogenuros de hidrógeno tales como cloruro de hidrógeno o ácido bromhídrico, ácidos fosfóricos tales como ácido ortofosfórico, ácido sulfámico, además ácidos orgánicos, en especial ácidos carboxílicos, ácidos sulfónicos o ácidos sulfúricos alifáticos, alicíclicos, aralifáticos, aromáticos o heterocíclicos de una o más bases, p. ej. ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico, ácido piválico, ácido dietilacético, ácido malónico, ácido succínico, ácido pimélico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido láctico, ácido tartárico, ácido málico, ácido cítrico, ácido glucónico, ácido ascórbico, ácido nicotínico, ácido isonicotínico, ácidos metanosulfónico o etanosulfónico, ácido etanodisulfónico, ácido 2-hidroxietanosulfónico, ácido bencenosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, ácidos naftalenmono- y disulfónico, ácido laurilsulfúrico. Sales con ácidos fisiológicamente no inocuos, p. ej. picratos, pueden usarse para aislar y/o purificar compuestos de la
fórmula I.
Por otro lado, un ácido de la fórmula I se puede transformar en una de sus sales metálicas o de amonio fisiológicamente inocuas haciéndolo reaccionar con una base. Como sales entran en consideración a este respecto en especial las sales de sodio, de potasio, de magnesio, de calcio y de amonio, además de sales de amonio sustituidas, p. ej. las sales de dimetil-, dietil- o diisopropilamonio, sales de monoetanol-, dietanol- o diisopropanolamonio, sales de ciclohexil-, diciclohexilamonio, sales de dibenciletilendiamonio, además de p. ej. sales con arginina o lisina.
Con anterioridad y a continuación todas las temperaturas de indican en ºC. En los ejemplos siguientes "preparación habitual" significa: si es necesario se añade agua, si es necesario se ajusta, según la constitución del producto final, a valores del pH entre 2 y 10, se extrae con acetato de etilo o diclorometano, se separa, se seca la fase orgánica sobre sulfato sódico, se evapora y se purifica mediante cromatografía en gel de sílice y/o mediante cristalización. Valores Rf en gel de sílice; fase móvil: acetato de etilo/metanol 9:1.
TR = Tiempo de retención (minutos) para HPLC en los siguientes sistemas:
[A]
Columna:
YMC ODS A RP 5C_{18}, 250 x 4,6 mm
Eluyente A:
0,1% de TFA en agua
Eluyente B:
0,1% de TFA en acetonitrilo
Flujo:
1 ml/min
Gradiente:
0 - 50% de B/30 min
\vskip1.000000\baselineskip
[B]
como [A];
Gradiente:
5 - 50% de B/30 min
\newpage
[C]
como [A];
Gradiente:
10 - 50% de B/30 min
\quad
Espectrometría de masas (EM):
\quad
EI (ionización por impacto electrónico) M^{+}
\quad
FAB (bombardeo con átomos rápidos) (M+H)^{+}
\quad
ESI (ionización por electropulverización) (M+H)^{+}
Resina DMPP representa resina 4-(2',4'-dietoxifenil-hidroximetil)fenoxi, que permite p. ej. la síntesis de péptidos con cadenas laterales protegidas, resina TCP significa resina de cloruro de tritilo-poliestireno.
Los ejemplos siguientes describen por un lado el acoplamiento de fragmentos y la disociación de ésteres fosfónicos, y por otro lado la síntesis de derivados de ciclopéptido seleccionados con conector de fosfonato. El procedimiento para el recubrimiento de distintos cuerpos de moldeo de metal o materiales de sustitución ósea se describe con más detalles basándose en los ejemplos 7 a 9.
Ejemplo 1 Acoplamiento de fragmentos en disolución
0,2 mmol de fragmentos de ácido carboxílico (conector de fosfonato, p. ej. HO-[CO-(CH_{2})_{5}-NH]_{2}-Lys-[Lys-(CO-CH_{2}-CH_{2}-PO_{3}(C_{2}H_{5})_{2})_{2}]_{2}), 0,98 eq de HATU, 1:1 eq de HOAt y 10 eq de 2,4,6-colidina se disuelven en 2 ml de DMF. Al cabo de 1,5 h se añade 1 eq de fragmentos de amina (ciclopéptido, p. ej. c[R(Pbf)G(OtBu)fK]). Se deja agitar durante 24 h a temperatura ambiente y se purifica el producto por medio de HPLC preparativa.
Ejemplo 2 Disociación de ésteres fosfónicos en conectores de fosfonato
El péptido con grupos de ésteres fosfónicos se disuelve en una mezcla de CHCl_{3} abs. y TMSBr 10 : 1 o eventualmente se suspende en el baño ultrasónico. Después de 3 días en agitación y eventualmente con suspensión ocasional del sedimento en baño ultrasónico se separa el disolvente por destilación. El residuo se liofiliza del H_{2}O.
La disociación de los grupos ácidos protectores de cadenas laterales se realiza según las técnicas de trabajo convencionales.
Ejemplo 3 Síntesis de los conectores de fosfonato
Los conectores de fosfonato se sintetizaron en una síntesis de péptidos en fase sólida según la estrategia Fmoc (véase G. B. Fields, R. L. Nobie, Int. J. Pept. Protein Res. 1990, 35, 161-214).
Como último elemento se acopló ácido 3-dietilfosfonopropiónico.
Síntesis de ácido 3-dietilfosfonopropiónico Éster bencílico del ácido 3-bromopropiónico
58,3 mmol de cloruro de ácido 3-bromopropiónico (10,0 g) y 1 eq de alcohol bencílico (6,3 g) se disuelven en 100 ml de DCM seco con agitación en un matraz redondo de 250 ml con tubo de cloruro de calcio. Después de 2 días se añaden a la preparación 200 ml de CHCl_{3} y se extrae 2 veces la fase orgánica con disolución saturada de NaHCO_{3}. Después de secar sobre MgSO_{4} se separa el disolvente por destilación y se obtiene el producto como un líquido incoloro.
Rendimiento: 13,8 g (56,8 mmol, 97%); R_{f} = 0,75 (H:EE 1:1).
RMN (CDCl_{3}):
^{1}H (250 MHz): \delta = 7,35 (s, 5H; H ar), 5,16 (s, 2H; CH_{2}-OCO), 3,58 (t, ^{3}J(H,H) = 7 Hz, 2H; CH_{2}Br), 2,95 (t, ^{3}J(H,H) = 7 Hz, 2H; CH_{2}CO). CG-EM:m^{+} = 242,0.
Éster bencílico del ácido 3-dietilfosfonopropiónico
56,8 mmol de éster bencílico del ácido 3-bromopropiónico (13,8 g) y 1,7 eq de fosfito de trietilo (16,0 g) se calientan hasta 140ºC con agitación en un aparato de destilación hermetizado con un globo de gas como compensador de presión. El bromoetano formado en el curso de la reacción se elimina de manera continua por destilación y se recoge en un matraz de destilación enfriado a 0ºC. Después de 4 h, el residuo oleoso restante se destila mediante fraccionamiento a alto vacío a través de una columna de Vigreux, el producto es un aceite incoloro. Rendimiento 12,1 g (40,3 mmol, 71%), ligeramente impurificado, R_{f} = 0,33 (A:H 2:3).
Para tener una mayor pureza hay que purificar el producto eventualmente mediante cromatografía ultrarrápida (eluyente A:H 2:3).
RMN (CDCl_{3}):
^{1}H (250 MHz): \delta = 7,31 (s, 5H; H ar), 5,10 (s, 2H, CH_{2}-OCO), 4,05 (m, 4H; CH_{2}OP), 2,61 (m, 2H; CH_{2}CO), 2,04 (m, 2H; CH_{2}P), 1,26 (t, ^{3}J(H,H) = 7 Hz, 6H; CH_{3}).
^{31}P (101,256 MHz): \delta = 28,5 (s).
CG-EM: m^{+} = 300,0.
Ácido 3-dietilfosfonopropiónico
Se disuelven 40,3 mmol de éster bencílico del ácido 3-dietilfosfonopropiónico (12,1 g) en 100 ml de etanol y se mezclan con 2 g de catalizador (Pd al 5%/C). Después de agitar durante 4 h en atmósfera de H_{2} se elimina por filtración el carbón activo y por destilación el disolvente. El producto precipita en forma de un aceite incoloro que a temperatura ambiente solidifica lentamente para dar un sólido incoloro. El producto está ligeramente contaminado con éster etílico del ácido 3-dietilfosfonopropiónico, que eventualmente puede transferirse a la fase orgánica agitando varias veces con agua y hexano y se separa. Rendimiento: 8,2 g (39,0 mmol, 97%).
RMN (CDCl_{3}):
^{1}H (250 MHz): \delta = 10,60 (sa, 1H; COOH), 4,07 (m, 4H; CH_{2}O), 2,59 (m, 2H; CH_{2}CO), 2,06 (m, 2H; CH_{2}P), 1,29 (t, ^{3}J(H,H) = 7 Hz, 6H; CH_{3}).
^{13}C (62,896 MHz): \delta = 174,5 (d, J(C,P) = 18,5 Hz; COOH), 62,1 (d, J(C,P) = 6,6 Hz; CH_{2}-O), 27,1 (d, J(C,P) = 3,8 Hz; CH_{2}-COOH), 20,7 (d, J(C,P) = 144,9 Hz; CH_{2}-P), 16,2 (d, J(C,P) = 6,1 Hz; CH_{3}).
^{31}P (101,256 MHz): \delta = 29,5 (s).
\vskip1.000000\baselineskip
Datos analíticos de los ciclopéptidos con conectores de fosfonato Ejemplo 4 2 ácidos aminohexanoicos en el espaciador
Ciclo-(Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys(N^{8}H-[CO-(CH_{2})_{5}-NH]_{2}-Lys-[Lys-(CO-CH_{2}-CH_{2}-PO_{3}H_{2})_{2}]_{2}))
EM (ESI): m/z (%): 1756,9 (100) [m - H^{+}], 1778,8 (48) [m + Na^{+} - 2H^{+}], 1794,9 (18) [m + K^{+} - 2H^{+}],
RMN ([D_{6}]DMSO):
^{31}P (101,256 MHz): \delta = 29,63 (s, 1P), 29,59 (s, 1P), 29,57 (s, 1P), 29,38 (s, 1P).
Ejemplo 5 3 ácidos aminohexanoicos en el espaciador
Ciclo-(Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys(N^{8}H-[CO-(CH_{2})_{5}-NH]_{3}-Lys-[Lys-(CO-CH_{2}-CH_{2}-PO_{3}H_{2})_{2}]_{2}))
EM (ESI): m/z (%): 934,9 (100) [m - 2H^{+}], 1870,0 (27) [m - H^{+}],
RMN ([D_{6}]DMSO):
^{31}P (101,256 MHz): \delta = 29,57 (s, 1P), 29,51 (s, 2P), 29,33 (s, 1 P).
Ejemplo 6 2 ácidos heptaetilenglicolaminocarboxílicos en el espaciador
Ciclo-(Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys(N^{\varepsilon}H-[CO-CH_{2} (-O-CH_{2}CH_{2})_{6}-NH]_{2}-Lys-[Lys-(CO-CH_{2}-CH_{2}-PO_{3}H_{2})_{2}]_{2}))
EM (ESI): m/z (%): 1086,4 (100) [m - 2H^{+}], 1097,7 (73) [m + Na^{+}- 3H^{+}]. RMN ([D_{6}]DMSO): ^{31}P (101,256 MHz): \delta = 29,66 (s, 1P), 29,61 (s, 1 P), 29,59 (s, 1P), 29,45 (s, 1P).
Además, todos los péptidos anteriormente citados se caracterizaron mediante espectroscopía de RMN ^{1}H (250 MHz), se obtuvieron los espectros esperados.
Ejemplo 7
Cuerpos de moldeo de Ti o de TiAt_{6}V_{4} con un diámetro de 10 mm y una altura de 1-2 mm se limpian previamente en agua destilada a 60ºC en el baño ultrasónico, a continuación se lavan 30 minutos con acetona y después dos veces con agua destilada y se dejan secar ocho horas en la estufa de secado.
Los cuerpos de moldeo se transfieren a 48 pocillos (Costar, "non-tissue culture treated" Nº de art. 3574). Para la fijación de las moléculas B bioactivas que proporcionan la adhesión celular (pudiendo ser B un ciclopéptido, un peptidomimético o un péptido lineal según la reivindicación 2) a los cuerpos de moldeo preparados se preparan disoluciones madre que contienen las moléculas B ("disoluciones B") en una concentración final de 1 mM en un tampón acuoso Tris-HCl (10 mM, pH 8,7), Tris-HClO_{4} (10 mM, pH 8,7) o PBS, pH 7,4. Al final, mediante dilución con PBS, pH 7,4, se preparan series de concentración con las concentraciones finales de las "disoluciones B" de 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 \muM, 10 \muM y 100 \muM respectivamente.
Cada uno de los cuerpos de moldeo se recubre con 250 \mul de la correspondiente disolución B y a continuación se incuba durante 18-24 horas a temperatura ambiente. Para eliminar las moléculas B no ligadas se lavan las muestras tres veces con PBS, pH 7,4, y se almacenan durante la noche en PBS, pH 7,4, a 4ºC.
Añadiendo 250 \mul/cuerpo de moldeo de una disolución al 5% de BSA (albúmina sérica bovina "Bovine Serum Albumine"), pH 7,4, incubando a continuación durante 2 horas a temperatura ambiente y lavando una vez con PBS, pH 7,4, se bloquean los sitios de unión celular no específicos.
Como controles negativos actúan cuerpos de moldeo de Ti o TiAl_{6}V_{4} que en lugar de haber sido tratados con disoluciones B lo han sido con las correspondientes disoluciones tampón (Tris-HCl 10 mM, pH 8,7; Tris-HClO_{4} 10 mM, pH 8,7; PBS, pH 7,4).
El grado de los recubrimientos obtenidos sobre los cuerpos de moldeo se evalúa analíticamente y la eficacia biológica se determina in vitro por medio de una prueba de adhesión celular.
Ejemplo 8
Se fabrican cuerpos de moldeo de marfil como modelo para un material natural de sustitución ósea con un diámetro de 100 mm y una altura de 100 \mum mediante fresado de cilindros de 10 mm de diámetro y posterior serrado en un grosor de 100 \mum en una sierra de baja velocidad "low speed saw" Buehler ISOMET. A continuación se limpian las muestras 10 minutos en agua dest. a 60ºC en el baño ultrasónico y después se lavan dos veces con agua dest. y se secan 8 horas en la estufa de secado.
Para el recubrimiento de los cuerpos de moldeo con disoluciones B se procede tal como se ha descrito en el ejemplo 7.
El grado de recubrimiento obtenido sobre los cuerpos de moldeo se evalúa analíticamente y la eficacia biológica se determina in vitro por medio de una prueba de adhesión celular.
Ejemplo 9
Se fabrican cuerpos de moldeo del material de sustitución ósea que puede obtenerse comercialmente Endobon® (empresa Biomet Merck, Alemania) con un diámetro de 10 mm y una altura de 100 \mum mediante fresado de cilindros de 10 mm de diámetro y posterior serrado en un grosor de 100 \mum en una sierra de baja velocidad "low speed saw" Buehler ISOMET. A continuación se limpian las muestras 10 minutos en agua destilada a 60ºC en el baño ultrasónico y después se lavan dos veces con agua destilada y se secan 8 horas en la estufa de secado.
Para el recubrimiento de los cuerpos de moldeo con las "disoluciones B" se procede tal como se ha descrito en el ejemplo 7.
El grado del recubrimiento obtenido sobre los cuerpos de moldeo se evalúa analíticamente y la eficacia biológica se determina in vitro por medio de una prueba de adhesión celular.
Ejemplo de prueba de adhesión celular
Se analizó la adhesión de cultivos in vitro de osteoblastos MC3T3 H1 de ratón a superficies de material recubiertas de péptido-RGD. Para ello se sembraron 50.000 células/cm^{2} y después de una hora de incubación en medio libre de suero a 37ºC/95% de humedad del aire se determinó la proporción de células adheridas.
Índice de adherencia celular [%] = células adheridas/células sembradas x 100
Péptido: índice de adherencia celular [%]
Ciclo-(Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys(N^{8}H-[CO-(CH_{2})_{5}-NH]_{2}-Lys-[Lys-(CO-CH_{2}-CH_{2}-PO_{3}H_{2})_{2}]_{2})): 75
Ciclo-(Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys(Ne^{\varepsilon}H-[CO-(CH_{2})_{5}-NH]_{3}-Lys-[Lys-(CO-CH_{2}-CH_{2}-PO_{3}H_{2})_{2}]_{2})): 62
<110> Biomet Deutschland GmbH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Conjugados de péptidos y peptidomiméticos con propiedades inhibidoras de integrina
\vskip1.000000\baselineskip
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<130> BMM261EP
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<140> EP 01960612
\vskip0.400000\baselineskip
<141> 2001-08-02
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<160> 9
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<170> PatentIn version 3.1
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<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
6 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm
7 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
8 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
9 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm
10 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm
11 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
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<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ciclopentapéptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)..(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la posición 4 es D-Phe
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)..(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> xaa en la posición 5 es Lys(NH-[CO-(CH_{2})_{5}-NH]_{2}-Lys-[Lys(CO-CH_{2}CH_{2}PO_{3}H_{2})_{2})_{2}))
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm
12 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ciclopentapéptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)..(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> xaa en la posición 4 es D-Phe
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)..(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> xaa en la posición 5 es Lys(NH-[CO-(CH_{2})_{5}-NH]_{3}-Lys-[Lys-(CO-CH_{2}CH_{2}PO_{3}H_{2})_{2})_{2}))
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm
13 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ciclopentapéptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)..(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> xaa en la posición 4 es D-Phe
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)..(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la posición 5 es Lys(NH-[CO-CH_{2}(-O-CH_{2}CH_{2})_{6}-NH]_{2}-Lys-[Lys-(CO-CH_{2}CH_{2}PO_{3}H_{2})_{2})_{2}))
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm
14

Claims (12)

1. Compuesto de fórmula 1
\quad
B-Q-X_{1}
en la que
B
es una molécula bioactiva que se une a integrina
Q
falta o es una molécula espaciadora orgánica seleccionada del grupo
[CO-(CH_{2})_{x}-NH-]_{m},
(xii)
[CO-CH_{2}-(O-CH_{2}CH_{2})_{y}-NH-]_{m},
(xiii)
[CO-(CH_{2})_{2}-CO-]
(xiv)
[NH-(CH_{2})_{z}-NH-]
(xv)
[CO-CH_{2}-(OCH_{2}CH_{2})_{y}-O-CH_{2}-CO-]
(xvi)
[NH-CH_{2}CH_{2}-(OCH_{2}CH_{2})_{y}-NH-]
(xvii)
así como su combinación
en las que
\quad
m es en cada caso, independientemente entre sí, 1 a 20
\quad
x es 1 a 12
\quad
y es 1 a 50
\quad
z es 1 a 12,
X_{1} significa una molécula de anclaje seleccionada del grupo
-Lys-(CO-CH_{2}-(CH_{2})_{n}-PO_{3}H_{2})_{2}
(i)
-Lys-[Lys-(CO-CH_{2}-(CH_{2})_{n}-PO_{3}H_{2})_{2}]_{2}
(ii)
o
-Lys-(Lys[-Lys-(CO-CH_{2}-(CH_{2})_{n}-PO_{3}H_{2})_{2}]_{2}
(iii)
y n es en cada caso, independientemente entre sí, 0, 1, 2 ó 3, y en las que un grupo amino libre del grupo B está unido peptídicamente entre sí a un grupo carboxilo libre de la molécula espaciadora Q o de la molécula de anclaje X_{1}, o un grupo amino libre del resto Q a un grupo carboxilo libre del resto X_{1}, así como sus sales.
2. Compuesto según la reivindicación, en el que el grupo B se selecciona del grupo
ciclo-(Arg-Gly-Asp-Z_{1})
(iv)
\vskip1.000000\baselineskip
15 
\newpage
y
Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys
(vi)
Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys
(vii)
Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys
(viii)
Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg
(ix)
Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn
(x)
Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg
(xi)
en el que
\quad
Z_{1} es en cada caso, independientemente entre sí, un resto de aminoácido o un resto de di- o tripéptido, seleccionándose independientemente entre sí los aminoácidos del grupo constituido por Ala, Asn, Asp, Arg, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Homo-Phe, Ile, Leu, Lys, Met, Orn, Phe, Phg, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val,
en el que para (v)
\quad
X es H_{2}N-C(=NH)-NH, Het-NH-, H_{2}N-C(=NH)-, A-C(=NH)-NH o Het-
\quad
Y es -(CH_{2})_{n}- o
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
16 
\vskip1.000000\baselineskip
\quad
-(CH_{2})_{s}-CH(R^{4})-(CH_{2})_{r} o -(CH_{2})_{p}-Het^{1}-(CH_{2})_{q}-
\quad
Z es N-R^{2} o CH-R^{2}
\quad
R^{2} es H o alquilo con 1 a 4 átomos de C
\quad
R^{3} es H, Ar, Het o A
\quad
R^{4} es H, A, AR, OH, OA, OAR, arilalquilo, Hal, CN, NO_{2}, CF_{3} o OCF_{3},
\quad
A es COOH, NH_{2} o alquilo con 1-6 átomos de C, sin sustituir o sustituido con COOH o NH_{2}
\quad
Ar es fenilo sin sustituir o sustituido una, dos o tres veces con A, OH, OA, CF_{3}, OCF_{3}, CN, NO_{2} o Hal que puede estar sustituido con un fenilo sustituido una, dos o tres veces con A, OH, OA, NH_{2}, OCF_{3}, CN, NO_{2} o Hal de tal manera que se forma un bifenilo sin sustituir o sustituido,
\quad
Hal es F, Cl, Br o I,
\quad
Het es un resto heterocíclico mono o bicíclico saturado, parcialmente o totalmente insaturado con 5 a 10 elementos de anillo, pudiendo existir de 1 a 3 átomos de N y/o 1 átomo de S u O y pudiendo estar sustituido el resto heterocíclico una o dos veces con CN, Hal, OH, NH_{2}, COOH, OA, CF_{3}, A, NO_{2}, Ar o OCF_{3},
\quad
Het^{1} es un heterociclo aromático de 5 ó 6 miembros con 1 a 4 átomos de N y/o S que puede estar sin sustituir o sustituido una o dos veces con F, Cl, Br, A, OA o OCF_{3},
\quad
n es 4, 5 ó 6,
\quad
m, o, p, q son 0, 1 ó 2
\quad
s, t son 0, 1, 3, 4 ó 5.
\newpage
3. Compuesto según la reivindicación 1 ó 2, en el que Q se selecciona del grupo
[CO-(CH_{2})_{x}-NH-]_{m},
(xviii)
[CO-CH_{2}(-O-CH_{2}CH_{2})_{y}-NH-]_{m},
(xix)
[CO-(CH_{2})_{z}-CO-]
(xx)
[NH-(CH_{2})_{z}-NH-]
(xxi)
[CO-CH_{2}-(OCH_{2}CH_{2})_{y}-O-CH_{2}-CO-]
(xxii)
[NH-CH_{2}CH_{2}-(OCH_{2}CH_{2})_{y}-NH-]
(xxiii)
así como su combinación
en las que
\quad
m es en cada caso, independientemente entre sí, 1 a 8
\quad
x es 1 - 5
\quad
y es 1 - 6 y
\quad
z es 1 - 6.
4. Compuestos de la fórmula 1 según la reivindicación 1
a)
Ciclo-(Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys(N^{\varepsilon}H-[CO-(CH_{2})_{5}-NH]_{2}-Lys-[Lys-(CO-CH_{2}-(CH_{2})_{n}-PO_{3}H_{2})_{2}]_{2}));
b)
Ciclo-(Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys(N^{\varepsilon}H-[CO-(CH_{2})_{5}-NH]_{3}-Lys-[Lys-(CO-CH_{2}-(CH_{2})_{n}-PO_{3}H_{2})_{2}]_{2}));
c)
Ciclo-(Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys(N^{\varepsilon}H-[CO-CH_{2}(-O-CH_{2}CH_{2})_{6}-NH]_{2}-Lys-[Lys-(CO-CH_{2}-(CH_{2})_{n}-PO_{3} H_{2})_{2}]_{2}));
en los que n es igual a 1.
5. Compuesto según una de las reivindicaciones 1 a 4 para uso como medicamento para el tratamiento de metástasis mediante inhibición de la angiogénesis y de la propagación de células tumorales, para el tratamiento antimicrobiano y antiséptico de inflamaciones y defectos causados por la incorporación de implantes y de enfermedades osteolíticas tales como osteoporosis, trombosis, infarto de miocardio y arteriosclerosis, así como para acelerar y reforzar el proceso de integración de implantes o superficies biocompatibles en el tejido mediante enriquecimiento selectivo de células en implantes.
6. Implante adecuado para órganos humanos y animales constituido por una matriz de soporte y una capa de una molécula bioactiva que media en la adhesión celular que rodea esta matriz, caracterizado porque la capa circundante está formada por un compuesto según las reivindicaciones 1 a 5, existiendo entre la matriz de soporte y este compuesto un enlace iónico o por adsorción.
7. Implante según la reivindicación 6, caracterizado porque la matriz de soporte y/o su superficie es un metal o un óxido metálico.
8. Implante según la reivindicación 6, caracterizado porque la matriz de soporte y/o su superficie es un material de sustitución ósea o dental.
9. Implante según la reivindicación 8, caracterizado porque el material de sustitución ósea o dental está constituido por mezclas de fosfato de calcio.
10. Procedimiento para la preparación de un compuesto según la reivindicación 1, así como sus sales, caracterizado porque una molécula B bioactiva que puede estar provista de grupos protectores y una molécula espaciadora-de anclaje (Q-X_{1}) o molécula de anclaje (X_{1}) provista de grupos protectores se unen peptídicamente entre sí y a continuación se disocian los grupos protectores, y/o porque un compuesto básico o ácido de la fórmula 1 se convierte en una de sus sales mediante tratamiento con un ácido o base.
11. Uso de un compuesto según una de las reivindicaciones 1 a 4 para preparar un medicamento para el tratamiento de metástasis mediante inhibición de la angiogénesis y de la propagación de células tumorales, para el tratamiento antimicrobiano y antiséptico de inflamaciones y defectos causados por la incorporación de implantes y de enfermedades osteolíticas tales como osteoporosis, trombosis, infarto de miocardio y arteriosclerosis, así como para acelerar y reforzar el proceso de integración de implantes o superficies biocompatibles en el tejido mediante enriquecimiento selectivo de células en implantes.
12. Uso de un compuesto según una de las reivindicaciones 1 a 15 para recubrir mediante enlace iónico o por adsorción implantes para órganos humanos y animales.
ES01960612T 2000-08-17 2001-08-02 Conjugados peptidos y peptidomimeticos con propiedades inhibidoras de integrina. Expired - Lifetime ES2306723T3 (es)

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