ES2306781T3 - Inhibidores de la dipeptidil-peptidasa iv para disminucion de la tasa de aumento cronico de peso. - Google Patents

Abstract

Uso de un inhibidor de la actividad enzimática de dipeptidil-peptidasa IV (DP IV) para la preparación de un medicamento para administración oral repetida con objeto de disminuir la tasa de aumento crónico de peso en un mamífero.

Description

Inhibidores de la dipeptidil-peptidasa IV para disminución de la tasa de aumento crónico de peso.

Antecedentes

El páncreas comprende dos tejidos glandulares, uno de los cuales es un conjunto de células que forman la función exocrina del páncreas donde estas células exocrinas sintetizan y liberan enzimas digestivas en el intestino; el segundo tejido comprende la función endocrina del páncreas que sintetizan y liberan hormonas en la circulación. De capital importancia en la función endocrina del páncreas, son las células \beta. Estas células sintetizan y secretan la hormona insulina. La hormona insulina juega un papel vital en el mantenimiento de los niveles normales fisiológicos de glucemia. Existen moléculas que son efectores de las células endocrinas del páncreas. Las incretinas son un ejemplo de tales moléculas. Las incretinas potencian la secreción de insulina inducida por la glucosa del
páncreas.

Se ha demostrado que las incretinas tales como el péptido-1(7-36)-amida semejante a glucagón ("GLP-1"; o el análogo de lagarto Exendina-4) y el polipéptido inhibidor gástrico ("GIP") son insulinotrópicas, es decir que su presencia o estabilización puede mantener un control agudo de la glucemia por sus efectos secretores de insulina (42,18). GIP y GLP-1 son responsables de más del 50% de la secreción de insulina estimulada por los nutrientes. Después de la liberación en la circulación, GIP y GLP-1 son desactivados rápidamente por la enzima circulante dipeptidil-peptidasa IV (DP M, GIP y GLP-1 constituyen el componente endocrino del eje entero-insular (intestino-páncreas) - un concepto que describe los caminos de señalización neurales, endocrinos y de señalización de sustrato entre el intestino delgado y los islotes de Langerhans (9). En conjunto, las incretinas son responsables de más del 50% de la liberación de insulina estimulada por los nutrientes. Adicionalmente, las incretinas comparten cierto número de efectos no mediados por insulina que contribuyen a la homeostasis eficaz de la glucosa. Se ha demostrado que GIP y GLP-1 inhiben ambos la motilidad y la secreción gástricas (10,11), promueven la competencia con glucosa de las células \beta (12), y estimulan la transcripción y biosíntesis del gen de insulina (13,14). Adicionalmente, se ha comunicado que GIP juega un papel en la regulación del metabolismo de las grasas (15), mientras que se ha demostrado que GLP-1 estimula la diferenciación y el crecimiento de las células \beta (16), y restaura la sensibilidad a la glucosa de las células de los islotes (17). Adicionalmente, se ha demostrado que GLP-1 actúa como una hormona de crecimiento de los islotes por estimulación de la proliferación de las células \beta, aumento de la masa celular y promoción de las células pancreáticas no diferenciadas para convertirlas en las células especializadas de los islotes de Langerhans. Dichas células exhiben secreción aumentada de insulina y glucagón (43, 44).

Se ha propuesto previamente aplicar GLP-1 bioactivo exógeno, o sus análogos, para estimular la regeneración de las células de los islotes in vivo, o para obtener células pancreáticas de pacientes de diabetes mellitus y tratar dichas células ex vivo en cultivo de tejidos utilizando GLP-1 bioactivo. Este tratamiento ex vivo se consideró que facilita la regeneración y/o diferenciación de las células de los islotes que podrían sintetizar y secretar luego insulina o glucagón (45, 46).

Sin embargo, un régimen de tratamiento de este tipo requiere la aplicación enteral o parenteral de GLP-1 bioactivo a los pacientes, con inclusión de la posibilidad de cirugía. Es un aspecto que obvia la necesidad de tratamiento quirúrgico, las aplicaciones enterales o parenterales de GLP-1 bioactivo.

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Sumario

La presente invención se refiere a un nuevo método en el cual la reducción de la actividad de la enzima dipeptidil-peptidasa (DP IV o CD26) o de la actividad de la enzima semejante a DP IV en la sangre de los mamíferos inducida por efectores de la enzima conduce como consecuencia causal a una degradación reducida del polipéptido gastrointestinal semejante a glucagón, péptido-amida-1_{7-36} (GLP-1_{7-36}) (o análogos funcionales relacionados estructuralmente de este péptido, tales como GLP-1_{7-37}, o fragmentos truncados pero biológicamente activos de GLP-1_{7-36}) por DP TV (sic) y enzimas semejantes a DP IV. Dicho tratamiento dará como resultado una reducción o retraso en la disminución de la concentración de hormonas peptídicas circulantes de GLP-1 funcionalmente activo (con inclusión de los derivados de GLP-1) o de sus análogos. La frase enzimas semejantes a DP IV tiene por objeto incluir aquellas enzimas que pueden estar relacionadas con DP TV y tienen actividad enzimática de escisión del dipéptido similar a la de DP IV pero que sin embargo pueden distinguirse de DP IV. En particular, las enzimas semejantes a DP IV son enzimas estructuralmente afines a DP N que pueden compartir una cierta homología de secuencia con la secuencia de DP IV, pero que comparten, incluso si no son estructuralmente afines (por evolución convergente) la especificidad de sustrato de DP IV de eliminación de dipéptidos de los términos 14 de los polipéptidos por escisión después de un residuo penúltimo de prolina. Tales enzimas - que incluyen DP IV, DP 11 por una parte y atractina por otra parte - son capaces también de eliminar dipéptidos con una alanina penúltima (o residuos serina o glicina) de los términos N de los polipéptidos pero usualmente con eficacia catalítica reducida en comparación con la escisión post-prolina (Yaron & Naider, 1993). Las mismas muestran la característica común de que acomodan también en la posición Pro de la proteína diana Ala, Ser, Thr y otros aminoácidos con cadenas laterales hidrófobas pequeñas como Gly o Val. La eficacia hidrolítica se clasifica Pro>Ala>>Ser,Thr>>Gly,Val. En tanto que las proteínas DP IV, DP II, FAP\alpha (Seprasa), DP 6, DP 8 y DP 9 son estructuralmente afines y muestran alta homología de secuencia, la atractiva es una enzima semejante a DP IV extraordinariamente funcional (49).

Otras enzimas semejantes a DP IV se describen en los documentos WO 01/19866, WO 02/04610, WO 02/34900 y WO 02/31134. WO 01/19866 describe la dipeptidil-aminopeptidasa 8 humana (DPP8) con semejanzas estructurales y funcionales a DP IV y la proteína de activación de los fibroblastos (FAP). La enzima semejante a dipeptidil-peptidasa IV de WO 02/04610 es bien conocida en la técnica. En la base de datos GENE BANK, esta enzima está registrada como KIAAI492 (inscripción en febrero de 2001, presentada en fecha 4 de abril de 2000, AB040925) y en la base de datos MEROPS. WO 02/34900 describe una dipeptidil-peptidasa 9 (DPP9) con homología significativa a las secuencias de aminoácidos de DP IV y DPPS. WO 02/3.1134 describe tres enzimas semejantes a DP IV, DPRP1, DPRP2 y DPRP3. El análisis de secuencias reveló que DPRP1 es idéntica a DPP8, como se describe en el documento WO 01/19866, que DPRP2 es idéntica a DPP9 y que DPRP3 es idéntica a KIAA1492 como se describe en WO
02/04610.

Como consecuencia de la estabilidad mejorada de los péptidos circulantes GLP-1 endógenos (con inclusión de los derivados de GLP-1) causada por la inhibición de la actividad de DP IV, la actividad de GLP-1 se prolonga dando como resultado hormonas peptídicas circulantes funcionalmente activas de GLP-1 (con inclusión de las derivadas de GLP-1) que facilitan la estimulación semejante a la hormona del crecimiento de las células pancreáticas de tal manera que estas células proliferan hasta células funcionalmente activas de los islotes de Langerhans. Adicionalmente, las células pancreáticas insensibles o células pancreáticas deterioradas pueden transformarse en células funcionalmente activas de los islotes de Langerhans cuando se exponen a GLP-1.

Se esperaba que la transformación de las células pancreáticas insensibles o las células pancreáticas deterioradas a células funcionalmente activas de los islotes de Langerhans dé como resultado una secreción incrementada de insulina y un nivel incrementado de insulina en el plasma sanguíneo. Sorprendentemente, en estudios realizados en individuos voluntarios humanos sanos y ratas Zucker diabéticas obesas, el nivel de insulina disminuía después del tratamiento con el inhibidor de DP IV isoleucil-tiazolidina-hemifumarato (P32/98) (véanse los Ejemplos 1 y 2, respectivamente). Sin embargo, la regeneración resultante de los islotes de Langerhans cambia de hecho la eficacia de la insulina endógena y otras hormonas de los islotes, tales como glucagón, de tal manera que se produce la estimulación del metabolismo de los carbohidratos de un mamífero tratado. Como resultado, el nivel de glucosa en sangre desciende por debajo de la concentración de glucosa característica para la hiperglucemia, como se muestra en los Ejemplos 1 y 2. El mecanismo que desencadena estos efectos no se conoce en detalle. Sin embargo, esta regeneración resultante de las células de los islotes afecta adicionalmente a anomalías del metabolismo que incluyen glucosuria, hiperlipidemias, así como acidosis metabólica severa y diabetes mellitus, por prevención o atenuación de estas secuelas. Se ha descubierto sorprendentemente, además, que la administración oral crónica de efectores de DP IV, tales como inhibidores oralmente activos de la misma, puede dar también como resultado una tasa incrementada de progresión a la saciedad durante la ingestión de nutrientes, reducción de peso, disminución de cromo (sic) o del aumento de peso a largo plazo, y sensibilidad mejorada a la insulina en los músculos. Otro efecto adicional imprevisto implica la disponibilidad incrementada de hormonas que no están reguladas primariamente a corto plazo por ingestión de nutrientes (p.ej. cambios agudos en los niveles de glucosa) y que pueden mejorar la actividad de las células \beta y/o aumentar la diferenciación de las células pancreáticas en células \beta, dando como resultado una producción de insulina mejorada
detectablemente.

En contraste con otros métodos propuestos conocidos en la técnica, tales como el trasplante de células o de tejido pancreático o el tratamiento ex vivo de células pancreáticas utilizando GLP-1 o Exendina-4 seguido por reimplantación de las células tratadas, la presente invención no causa o requiere cirugía complicada y costosa, y proporciona una terapia disponible por vía oral. La presente invención representa un nuevo enfoque para la disminución de la concentración elevada de glucosa en sangre, modificación de la saciedad, y aumento de peso, y la sensibilidad muscular entre otros efectos relacionados. Es comercialmente útil y adecuada para uso en un régimen terapéutico, especialmente concerniente a la disminución de la tasa de aumento crónico de peso en un mamífero.

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Breve descripción de las Figuras

Puede obtenerse una comprensión adicional de la presente invención haciendo referencia a las figuras en las
cuales:

Fig. 1 es una representación gráfica de la dependencia del tiempo de GLP-1 bioactiva circulante en humanos (n = 36) dependiendo de la formulación P32/98 del inhibidor de DP IV aplicada oralmente;

Fig. 2 es un gráfico que representa la dependencia de la AUC de GLP-1 bioactiva circulante en humanos (n = 36) de la formulación P32/98 del inhibidor de DP N aplicada oralmente;

Fig. 3 es una representación gráfica que muestra la mejora de la glucosa en sangre por las mañanas (NOG) después de aplicación monoterapéutica subcrónica de 8,7 mg/kg/d de P32/98 a ratas obesas diabéticas fa/fa;

Fig. 4a es una representación gráfica que muestra el control de glucosa mejorado debido al tratamiento con inhibidor de DP IV después de 16 días de tratamiento en ratas diabéticas obesas;

Fig. 4b es una representación gráfica que muestra la secreción reducida de insulina debida al tratamiento con el inhibidor de DP IV después de 16 días de tratamiento en ratas diabéticas obesas;

Fig. 5a es una representación gráfica que muestra los niveles de glucosa en sangre en función del tiempo en el mantenimiento de la glucemia mejorada después de 21 días de tratamiento subcrónico de ratas diabéticas obesas fa/fa por el inhibidor de DP IV formulado P32/98;

Fig. 5b es una representación gráfica que muestra los niveles de insulina en plasma en función del tiempo en el mantenimiento de la glucemia mejorada después de 21 días de tratamiento subcrónico de ratas diabéticas obesas fa/fa por el inhibidor de DP IV formulado P32/98;

Fig. 6 muestra el peso corporal y la ingestión de agua medidos en ratas VDF tratadas con inhibidor de DP IV (círculos vacíos) o de control (cuadrados llenos; n = 6). El peso corporal (A) y la ingestión de agua (B) se midieron junto con los niveles de glucosa en sangre por la mañana y por la tarde y la ingestión de alimento (no representada) cada dos días. La significación estadística (p < 0,05) se indica por un asterisco;

Fig. 7 muestra un perfil de 24 horas de los niveles de actividad de DP IV en plasma (A), glucosa en sangre (B), e insulina en plasma (C) en ratas VDF después de seis semanas de tratamiento con (círculos abiertos) o sin (cuadrados llenos) el inhibidor de DP N P32/98 (n = 6): se administraron a los animales tratados 10 mg/kg de P32/98 dos veces al día como se indica por las flechas, mientras que el grupo de control recibió solamente el vehículo de inyección de celulosa al 1%. La significación estadística (p < 0,05) se indica por un asterisco;

Fig. 8 muestra tests de tolerancia a la glucosa por vía oral (OGTT) administrada a ratas VDF tanto tratadas con inhibidor de DP IV (círculos vacíos) como ratas de control (cuadrados llenos) después de cuatro (A) y doce (B) semanas de tratamiento (n = 6). Se realizaron medidas de glucosa en sangre e insulina en plasma en ambas series de tests, en tanto que la fracción activa de GLP-1 en plasma se midió también al cabo de 12 semanas. La inserción en B muestra las respuestas integradas de insulina en plasma para el OGTT de doce semanas. La significación estadística (p < 0,05) se indica por un asterisco. (C) Sensibilidad relativa a la insulina, animales de control frente a los tratados, correspondientes a los tests OGTTs de 4 y 12 semanas mostrados en A y B;

Fig. 9 muestra una comparación de la glucosa en sangre en ayunas (A) y máxima (B) y de insulina máxima en plasma (C), medidas durante los OGTTs realizados a intervalos de 4 semanas en ratas VDF de control (cuadrados llenos) o tratadas con inhibidor de DP IV (círculos vacíos) (n = 6). La significación estadística (p < 0,05) se indica por un asterisco;

Fig. 10 muestra la liberación de insulina medida durante la perfusión de páncreas de ratas VDF después de tres meses de tratamiento con (círculos vacíos) o sin (cuadrados llenos) el inhibidor de DP IV P32/98 (n = 3);

Fig. 11 muestra la actividad de glucógeno-sintasa de tejido adiposo (A) y la absorción de 3-O-[^{14}C]-metil-D-glucosa en tiras del músculo sóleo (B) aisladas de ratas VDF después de 12 semanas de tratamiento con P32/98 (barras vacías) o una solución de control de celulosa al 1% (barras llenas) (n = 6). Un asterisco representa una diferencia estadísticamente significativa con relación al valor de control correspondiente (* p < 0,05, ** p < 0,01), mientras que "a" representa una diferencia estadísticamente significativa de los valores basales [insulina] = 0 \muU/ml);

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Fig. 12 muestra los espectros de masas MALDI-TOF del procesamiento proteolítico del péptido vasoactivo intestinal (VIP) por DP IV de riñón de porcino (A), suero humano (B) y suero humano tratado con el inhibidor de DP IV específico isoleucil-tiazolidina-hemifumarato;

Fig. 13 muestra los espectros de masas MALDI-TOF del procesamiento proteolítico del polipéptido 27 activador de la adenilato-ciclasa hipofisaria (PACAP 27) por DP IV de riñón de porcino (A), suero humano (B) y suero humano tratado con el inhibidor específico de DP N P32/98; y

Fig. 14 muestra los espectros de masas MALDI-TOF del procesamiento proteolítico del polipéptido 38 activador de la adenilato-ciclasa hipofisaria (PACAP 38) por DP IV de riñón de porcino (A), suero humano (B) y suero humano tratado con el inhibidor específico de DP IV P32/98.

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Descripción detallada

La invención se refiere al uso de un inhibidor de la actividad enzimática de DP IV para la preparación de un medicamento para administración oral repetida para la disminución de la tasa de aumento crónico de peso.

La secreción de insulina inducida por glucosa es modulada por varias hormonas y neurotransmisores. De interés específico son las dos hormonas intestinales, el péptido-1 semejante a glucagón (GMP-1) y el péptido inhibidor gástrico (GIP), los dos cuales son agentes insulinotrópicos. Los agentes insulinotrópicos pueden estimular, o causar la estimulación de, la síntesis o expresión de la hormona insulina.

GLP-1 es un agente insulinotrópico intestinal potente que aumenta la secreción de insulina y reduce agudamente los niveles de glucosa, con inclusión de los niveles observados en las diabetes tipo I y tipo II. GLP-1 se forma por escisiones alternativas específicas de tejido en las células L del intestino, las células \alpha de la pancreasa endocrina, y las neuronas cerebrales. GIP es sintetizado y liberado por el duodeno y el yeyuno proximal post-prandialmente. Su liberación depende de varios factores que incluyen el contenido de comida y el estatus de salud pre-existente. Fue descubierto inicialmente y nombrado por sus propiedades inhibidoras del ácido gástrico. Sin embargo, a medida que ha avanzado la investigación sobre esta hormona, se han elucidado papeles fisiológicos más relevantes. Específicamente, GIP es un agente insulinotrópico con un efecto estimulador sobre la síntesis y liberación de
insulina.

DP IV es una enzima que es una exopeptidasa que escinde selectivamente los péptidos después de los penúltimos residuos N-terminales prolina y alanina. Sustratos endógenos para esta enzima incluyen las incretinas, tales como polipéptidos insulinotrópicos dependientes de glucosa, como GIP y GLP-1. En presencia de DP TV estas hormonas se reducen enzimáticamente a formas inactivas. La forma inactiva de GIP y GLP no puede inducir la secreción de insulina, por lo que los niveles de glucosa en sangre se elevan, especialmente en el estado hiperglucémico. Los niveles elevados de glucosa en sangre se han asociado también con muchas patologías diferentes, que incluyen diabetes mellitus (tipo 1 y 2) y las secuelas que acompañan a la diabetes mellitus.

Se ha descubierto también que DP IV juega un papel en las respuestas inmunes mediadas por las células T, por ejemplo, en los trasplantes. Se ha demostrado que la inhibición de DP IV prolonga los aloinjertos cardíacos. Adicionalmente, la inhibición de DP IV ha contribuido a la supresión de la artritis reumatoide. Se ha atribuido también un papel a DP IV en la penetración del HIV en las células T (células T adyuvantes).

Se han desarrollado agentes tales como N-(glicil N'-sustituido)-2-cianopirrolidinas, L-treo-isoleucil-tiazolidina (P32/98), L-alo-isoleucil-tiazolidina, L-treo-isoleucil-pirrolidina y L-alo-isoleucil-pirrolidina, que inhiben la actividad enzimática de DP IV y se describen en los documentos WO 99/61431, WO 99/67278, WO 99/67279, DE 19834591, WO 97/40832, DE 19616486 C2, WO 98/19998, WO 00/07617, WO 99/38501, y WO 99/46272. Ejemplos ulteriores de inhibidores de la dipeptidil-peptidasa IV de peso molecular bajo son agentes tales como derivados de tetrahidroisoquinolin-3-carboxamida, 2-cianopirroles y -pirrolidinas sustituidos en N, N-(glicil sustituido en N')-2-cianopirrolidinas, N-(glicil-sustituido)-tiazolidinas, N-(glicil sustituido)-4-cianotiazolinas, inhibidores de amino-acil-borono-prolilo y pirrolidinas fusionadas a ciclopropilo. Inhibidores de la dipeptidil-peptidasa IV se describen en los documentos US 6.011.155; US 6.107.317; US 6.110.949; US 6.124.305; US 6.172.081; WO 99/61431, WO 99/67278, WO 99/67279, DE 198 34 591, WO 97/40832, DE 196 16 486 C2. WO 98/19998, WO 00/07617, WO 99/38501, WO 99/46272, WO 99/38501, WO 01/68603, WO 01/40180, WO 01/81337, WO 01/81304, WO 01/55105, WO 02/02560 y WO 02/14271. El objetivo de estos agentes es inhibir la DP IV, y al hacerlo así, reducir los niveles de glucosa en sangre tratando con ello eficazmente la hiperglucemia y las enfermedades concomitantes asociadas con niveles elevados de glucosa en la sangre. Los autores de la presente invención han descubierto sorprendentemente que tales agentes pueden emplearse ventajosamente para un propósito terapéutico totalmente diferente, conocido previamente por los expertos en la técnica.

En una realización ilustrativa, la presente invención se refiere al uso de compuestos semejantes a dipéptidos y compuestos análogos a compuestos dipeptídicos que están formados por un aminoácido y un grupo tiazolidina o pirrolidina, y sales de los mismos, a los que se hace referencia en lo sucesivo como compuestos semejantes a dipéptidos. Preferiblemente, el aminoácido y el grupo tiazolidina o pirrolidina están unidos con un enlace amídico.

Especialmente adecuados para dicho propósito de acuerdo con la invención son compuestos dipeptídicos en los cuales el aminoácido se selecciona preferiblemente de un aminoácido natural, tal como, por ejemplo, leucina, valina, glutamina, ácido glutámico, prolina, isoleucina, asparagina y ácido aspártico.

Los compuestos semejantes a dipéptidos utilizados de acuerdo con la invención exhiben a una concentración (de compuestos dipeptídicos) de 10 \muM, una reducción en la actividad de la dipeptidil-peptidasa IV en plasma o las actividades de enzimas análogas a DP IV de al menos 10%, especialmente de al menos 40%. Frecuentemente se requiere también una reducción en la actividad de al menos 50% o al menos 70%. Efectores preferidos pueden exhibir también una reducción en la actividad de un máximo de 20% o 30%.

Compuestos preferidos son N-valil-prolil, O-benzoil-hidroxilamina, alanil-pirrolidina, isoleucil-tiazolidina como L-alo-isoleucil-tiazolidina, L-treo-isoleucil-pirrolidina y sales de los mismos, especialmente las sales fumáricas, y L-alo-isoleucil-pirrolidina y sales de la misma. Compuestos especialmente preferidos son glutaminil-pirrolidina y glutaminil-tiazolidina de las fórmulas 1 y 2:

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1

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2

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Compuestos preferidos adicionales se dan en la Tabla 1.

Las sales de los compuestos semejantes a dipéptidos pueden estar presentes en una relación molar de componente dipeptídico (-análogo) a componente salino de 1:1 o 2:1. Una sal de este tipo es, por ejemplo, el ácido (Ile-Tia)_{2}-fumárico.

TABLA 1 Estructuras de otros compuestos dipeptídicos preferidos

3

En otra realización preferida, la presente invención proporciona el uso de compuestos peptídicos semejantes a sustratos de fórmula 3 útiles para modulación competitiva de la catálisis por la dipeptidil-peptidasa IV.

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4

\vskip1.000000\baselineskip

en donde

\quad

A, B, C, D, y E son independientemente restos de aminoácidos cualesquiera que incluyen aminoácidos proteinógenos, aminoácidos no proteinógenos, amino-ácidos L' y aminoácidos D y en donde E y/o D pueden estar ausentes.

Condiciones adicionales concernientes a la fórmula (3):

\quad

A es un aminoácido excepto un D-aminoácido,

\quad

B es un aminoácido seleccionado de Pro, Ala, Ser, Gly, Hyp, ácido azetidina-(2)-carboxílico y ácido pipecólico,

\quad

C es cualquier aminoácido excepto Pro, Hyp, ácido azetidina-(2)-carboxílico, ácido pipecólico y excepto aminoácidos alquilados en N, v.g. N-metil-valina y sarcosina,

\quad

D es cualquier aminoácido o está ausente, y

\quad

E es cualquier aminoácido o está ausente,

o:

\quad

C es cualquier aminoácido excepto Pro, Hyp, ácido azetidina-(2)-carboxílico, ácido pipecólico, excepto aminoácidos alquilados en N', v.g., N-metil-valina y sarcosina, y excepto un D-aminoácido;

\quad

D es cualquier aminoácido seleccionado de Pro, Ala, Ser, Gly, Hyp, ácido azetidina-(2)-carboxílico y ácido pipecólico, y

\quad

E es cualquier aminoácido excepto Pro, Hyp, ácido azetidina-(2)-carboxílico, ácido pipecólico y excepto aminoácidos alquilados en N, v.g. N-metil-valina y sarcosina.

Ejemplos de aminoácidos que pueden utilizarse en la presente invención son aminoácidos L y D, N-metil-aminoácidos; formas alo y treo de Ile y Thr, que pueden, v.g. ser \alpha-, \beta- o \omega-aminoácidos, prefiriéndose los \alpha-aminoácidos.

Ejemplos de aminoácidos a todo lo largo de las reivindicaciones y la descripción son:

\quad

ácido aspártico (Asp), ácido glutámico (Glu), arginina (Arg), lisina (Lys), histidina (His), glicina (Gly), serina (Ser) y cisteína (Cys), treonina (Thr), asparagina (Asn), glutamina (Gln), tirosina (Tyr), alanina (Ala), prolina (Pro), valina (Val), isoleucina (Ile), leucina (Leu), metionina (Met), fenilalanina (Phe), triptófano (Trp), hidroxiprolina (Hyp), beta-alanina (beta-Ala), ácido 2-amino-octanoico (Aoa), ácido azetidina-(2)-carboxílico (Ace), ácido pipecólico (Pip), ácido 3-aminopropiónico, 4-aminobutírico y análogos, ácido alfa-aminoisobutírico (Aib), sarcosina (Sar), ornitina (Orn), citrulina (Cit), homoarginina (Har), t-butilalanina (t-butil-Ala), t-butilglicina (t-butil-Gly), N-metilisoleucina (N-MeIle), fenilglicina (Phg), ciclohexilalanina (Cha), norleucina (Nle), ácido cisteico (Cya) y metionina-sulfóxido (MSO), Acetil-Lys, aminoácidos modificados tales como fosforil-serina (Ser(P)), bencil-serina (Ser(Bzl)) y fosforil-tirosina (Tyr(P)), ácido 2-aminobutírico (Abu), aminoetilcisteína (AECys), carboximetilcisteína (Cmc), deshidroalanina (Dha), ácido deshidro-amino-2-butírico (Dhb), ácido carboxiglutamínico (Gla), homoserina (Hse), hidroxilisina (Hyl), cis-hidroxiprolina (cysHyp), trans-hidroxiprolina (transHyp), isovalina (Iva), ácido piroglutámico (Pyr), norvalina (Nva), ácido 2-aminobenzoico (2-Abz), ácido 3-aminobenzoico (3-Abz), ácido 4-aminobenzoico (4-Abz), ácido 4-(aminometil)benzoico (Amb), ácido 4-(aminometil)ciclohexanocarboxílico (4-Amc), penicilamina (Pen), ácido 2-amino-4-cianobutírico (Cba), y ácidos cicloalcano-carboxílicos.

Ejemplos de \omega-aminoácidos son p.ej.: 5-Ara (ácido aminovalérico), 6-Ahx (ácido aminohexanoico), 8-Aoc (ácido aminooctanoico), 9-Anc (ácido aminovanoico), 10-Adc (ácido aminodecanoico), 11-Aun (ácido aminoundecanoico), 12-Ado (ácido aminododecanoico).

Aminoácidos adicionales son: indanilglicina (Igl), ácido indolina-2-carboxílico (Idc), ácido octahidroindol-2-carboxílico (Oic), ácido diaminopropiónico (Dpr), ácido diaminobutírico (Dbu), naftilalanina (1-Nal), (2-Nal), 4-aminofenilalanina, (Phe(4-NH_{2})), 4-benzoilfenilalanina (Bpa), difenilalanina (Dip), 4-bromofenilalanina (Phe(4-Br)), 2-clorofenilalanina (Phe(2-Cl)), 3-clorofenilalanina (Phe(3-Cl)), 4-clorofenilalanina (Phe(4-Cl)), 3,4-clorofenilalanina (Phe(3,4-Cl_{2})), 3-fluorofenilalanina (Phe(3-F)), 4-fluorofenilalanina (Phe(4-F)), 3,4-fluorofenilalanina (Phe(3,4-F_{2})), pentafluorofenilalanina (Phe(F_{5})), 4-guanidinanofenilalanina (Phe(4-guanidino)), homofenilalanina (hPhe), 3-yodofenilalanina (Phe(3-I)), 4-yodofenilalanina (Phe(4-I)), 4-metilfenilalanina (Phe(4-Me)), 4-nitrofenilalanina (Phe-4-NO_{2})), bifenilalanina (Bip), 4-fosfonometilfenil-alanina (Pmp), ciclohexilglicina (Ghg), 3-piridinil-alanina (3-Pal), 4-piridinilalanina (4-Pal), 3,4-deshidroprolina (A-Pro), 4-cetoprolina (Pro-4-ceto)), tioprolina (Thz), ácido isonipecótico (Inp), ácido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico (Tic), propargilglicina (Pra), 6-hidroxinorleucina (NU(6-OH)), homotirosina (hTyr), 3-yodotirosina (Tyr(3-I)), 3,5-diyodotirosina (Tyr(3,5-I_{2})), d-metiltirosina (Tyr(Me)), 3-NO_{2}-tirosina (Tyr(3-NO_{2})), fosfotirosina (Tys(PO_{3}H_{2})), alquilglicina, ácido 1-aminoindano-1-carboxílico, ácido 2-aminoindano-2-carboxílico (Aic), ácido 4-amino-metilpirrol-2-carboxílico (Py), ácido 4-amino-pirrolidina-2-carboxílico (Abpc), ácido 2-aminotetralina-2-carboxílico (Atc), ácido diaminoacético (Gly(NH_{2})), ácido diaminobutírico (Dab), ácido 1,3-dihidro-2H-isoinol-carboxílico (Disc), homociclohexilalanina (hCha), homofenilalanina (hPhe o Hof), ácido trans-3-fenil-azetidina-2-carboxílico, ácido 4-fenil-pirrolidina-2-carboxílico, ácido 5-fenil-pirrolidina-2-carboxílico, 3-piridilalanina (3-Pya), 4-piridilalanina (4-Pya), estirilamina, ácido tetrahidroisoquinolina-1-carboxílico (Tiq), ácido 1,2,3,4-tetrahidronorharmano-3-carboxílico (Tpi), \beta-(2-tienil)-alanina (Tha).

\newpage

Otras sustituciones de aminoácidos en lugar de los codificados en el código genético pueden incluirse también en los compuestos dentro del alcance de la invención y pueden clasificarse dentro de este esquema general.

Aminoácidos proteinógenos se definen como examino- aminoácidos derivados de proteínas naturales. Los aminoácidos no proteinógenos se definen como todos los restantes aminoácidos, que no son bloques de construcción de las proteínas comunes naturales.

Los péptidos resultantes pueden sintetizarse como el aminoácido C-terminal libre o como la forma amida C-terminal. Los péptidos de ácidos libres o las amidas pueden variarse por modificaciones de la cadena lateral. Dichas modificaciones de la cadena lateral incluyen por ejemplo, pero sin carácter limitante, formación de homoserina, formación de ácido piroglutámico, formación de enlace disulfuro, desamidación de residuos asparagina o glutamina, metilación, t-butilación, t-butiloxicarbonilación, 4-metilbencilación, tioanisilación, tiocresilación, benciloximetilación, 4-nitrofenilación, benciloxicarbonilación, 2-nitrobenzoilación, 2-nitrosulfenilación, 4-toluenosulfonilación, pentafluorofenilación, difenilmetilación, 2-clorobenciloxicarbonilación, 2,4,5-triclorofenilación, 2-bromobenciloxicarbonilación, 9-fluorenilmetiloxicarbonilación, trifenilmetilación, 2,2,5,7,8-pentametilcroman-b-sulfonilación, hidroxilación, oxidación de metionina, formilación, acetilación, anisilación, bencilación, benzoilación, trifluoroacetilación, carboxilación de ácido aspártico o ácido glutámico, fosforilación, sulfatación, cisteinilación, glicolilación con pentosas, desoxihexosas, hexosaminas, hexosas o N-acetilhexosaminas, farnesilación, miristoilación, biotinilación, palmitoilación, estearoilación, geranilgeranilación, glutationilación, 5'-adenosilación, ADP-ribosilación, modificación con ácido N-glicolilneuramínico, ácido N-acetilneuramínico, fosfato de piridoxal, ácido lipoico, 4'-fosfopantetina y/o hidroxisuccinimida.

En los compuestos de la fórmula (3), los restos de aminoácidos A, B, C, D y E están unidos respectivamente al resto adyacente por enlaces amídicos de manera usual de acuerdo con la nomenclatura estándar de tal manera que el término amino (término N) de los aminoácidos (péptido) se representa en el lado izquierdo y el término carboxilo de los aminoácidos (péptido) se representa en el lado derecho (término C).

Hasta la presente invención por los solicitantes, los sustratos peptídicos conocidos de la serina-proteasa dipeptidil-dipeptidasa IV específica de prolina in vitro son los tripéptidos Diprotin A (Ile-Pro-Ile), Diprotin B (Val-Pro-Leu) y Diprotin C (Val-Pro-Ile). Los solicitantes han descubierto inesperadamente que los compuestos descritos en esta memoria anteriormente y más adelante actúan como sustratos de la dipeptidil-peptidasa IV in vivo en un mamífero y, en dosis farmacológicas, mejoran la sensibilidad a la insulina y la señalización de los islotes y alivian anormalidades patológicas del metabolismo de los mamíferos tales como glucosuria, hiperlipidemias, acidosis metabólica, y diabetes mellitus por catálisis competitiva.

Compuestos peptídicos preferidos se enumeran en la Tabla 2.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 2 Ejemplos de sustratos peptídicos

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5

\newpage

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6

t-Butil-Gly se define como:

7

Ser(Bzl) y Ser(P) se definen como bencil-serina y fosforil-serina, respectivamente. Tyr(P) se define como fosforil-tirosina.

Compuestos preferidos adicionales son peptidilcetonas de fórmula 4:

8

y sales farmacéuticamente aceptables de las mismas, en donde:

A

se selecciona de las estructuras siguientes:

9

\quad

X^{1} es H o un grupo acilo u oxicarbonilo con inclusión de todos los aminoácidos y residuos peptídicos,

\global\parskip1.000000\baselineskip

\quad

X^{2} es H, -(CH)_{n}-NH-C_{5}H_{3}N-Y con n = 2-4 o C_{5}H_{3}N-Y (un resto piridilo divalente) e Y se selecciona de H, Br, Cl, I, NO_{2} o CN,

\quad

X^{3} es H o se selecciona de un residuo alquilo, alcoxi, halógeno, nitro, ciano o fenilo o piridilo sustituido con carboxi,

\quad

X^{4} es H o se selecciona de un residuo alquilo, alcoxi, halógeno, nitro, ciano, fenilo o piridilo sustituido con carboxi,

\quad

X^{5} es H o un residuo alquilo, alcoxi o fenilo,

\quad

X^{6} es H o un residuo alquilo,

para n = 1

X

se selecciona de: H, OR^{2}, SR^{2}, NR^{2}R^{3}, N^{+}R^{2}R^{3}R^{4}, en donde:

\quad

R^{2} representa residuos acilo que están sustituidos con residuos alquilo, cicloalquilo, arilo, o heteroarilo, o la totalidad de los residuos de aminoácidos y peptídicos, o residuos alquilo, que están sustituidos con residuos alquilo, cicloalquilo, arilo y heteroarilo,

\quad

R^{3} representa funciones alquilo y acilo, en donde R^{2} y R^{3} pueden estar incluidos en estructuras cíclicas de una estructura carbocíclica o heterocíclica saturada o insaturada,

\quad

R^{4} representa residuos alquilo, en donde R^{2} y R^{4} o R^{3} y R^{4} pueden estar incluidos en estructuras cíclicas de estructuras carbocíclicas o heterocíclicas saturadas o insaturadas,

\quad

para n = 0

X

se selecciona de:

10

en donde

\quad

B representa: O, S, NR^{5}, en donde R^{5} es H, un alquilo o acilo, C, D, E, F, G, H se seleccionan independientemente de residuos alquilo y alquilo sustituido, residuos oxialquilo, tioalquilo, aminoalquilo, carbonilalquilo, acilo, carbamoílo, arilo y heteroarilo, y

\quad

Z se selecciona de H, o un residuo alquilo de cadena ramificada o cadena simple de C_{1}-C_{9} o un residuo alquenilo de cadena ramificada o simple de C_{2}-C_{9}, un residuo cicloalquilo de C_{3}-C_{8}, un residuo cicloalquenilo de C_{5}-C_{7}, un residuo arilo o heteroarilo, o una cadena lateral seleccionada de todas las cadenas laterales de todos los aminoácidos naturales o derivados de los mismos.

Preferiblemente:

-

los grupos acilo son grupos acilo C_{1}-C_{6},

-

los grupos alquilo son grupo alquilo C_{1}-C_{6},

-

los grupos alcoxi son grupos alcoxi C_{1}-C_{6},

-

los radicales arilo son radicales arilo C_{5}-C_{12} que tienen opcionalmente anillos condensados,

-

los radicales cicloalquilo (carbociclos) son radicales cicloalquilo C_{3}-C_{8},

-

los radicales heteroarilo son radicales arilo C_{4}-C_{11} que tienen opcionalmente anillos condensados y, en al menos un anillo, de 1 a 4 heteroátomos, tales como O, N y/o S,

-

los residuos peptídicos son residuos correspondientes constituidos por 2 a 50 aminoácidos,

-

los radicales heterocíclicos son radicales cicloalquilo C_{2}-C_{5} que tienen de 1 a 4 heteroátomos, tales como O, N y/o S.

Adicionalmente, de acuerdo con la presente invención, pueden utilizarse los compuestos de fórmulas 5, 6, 7, 8, 9, 10 y 11, con inclusión de todos los estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos:

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11

12

\vskip1.000000\baselineskip

13

14

\vskip1.000000\baselineskip

en donde:

\quad

R^{1} es H, un residuo alquilo C_{1}-C_{9} ramificado o lineal, un residuo alquenilo C_{2}-C_{9} ramificado o lineal, un residuo cicloalquilo C_{3}-C_{8}, cicloalquenilo C_{5}-C_{7}, arilo o heteroarilo o una cadena lateral de un aminoácido natural o un derivado del mismo,

\quad

R^{3} y R^{4} se seleccionan de H, hidroxi, alquilo, alcoxi, ariloxi, nitro, ciano o halógeno,

\quad

A es H o un isóstero de un ácido carbónico, como un grupo funcional seleccionado de CN, SO_{3}H, CONHOH, PO_{3}R^{5}R^{6}, tetrazol, amida, éster, anhídrido, tiazol e imidazol,

\quad

B se selecciona de:

\vskip1.000000\baselineskip

15

\vskip1.000000\baselineskip

en donde:

\quad

R^{5} es H, -(CH)_{n}-NH-C_{5}H_{3}N-Y con n = 2-4 y C_{5}H_{3}N-Y (un residuo piridilo divalente) con Y = H, Br, Cl, I, NO_{2} o CN,

\quad

R^{6} es H, un residuo acilo, oxicarbonilo o residuo de aminoácido,

\quad

W es H o un residuo fenilo o piridilo, insustituido o sustituido con 1, 2 o más residuos alquilo, alcoxi, halógeno, nitro, ciano o carboxi,

\quad

W^{1} es H, un residuo alquilo, alcoxi o fenilo,

\quad

Z es H o un residuo fenilo o piridilo, insustituido o sustituido con 1, 2 o más residuos alquilo, alcoxi, halógeno, nitro, ciano o carboxi,

\quad

Z^{1} es H o un residuo alquilo,

\quad

D es un residuo alquilo C_{4}-C_{7} cíclico, residuo alquenilo C_{4}-C_{7} que puede estar insustituido o sustituido con 1, 2 o más grupos alquilo o un residuo heteroalquilo cíclico de 4-7 miembros o residuo heteroalquenilo cíclico de 4-7 miembros,

\quad

X^{2} es O, NR^{6}, N^{+}(R^{7})_{2}, o S,

\quad

X^{3} a X^{12} se seleccionan independientemente de CH_{2}, CR^{8}R^{9}, NR^{6}, N^{+}(R^{7})_{2}, O, S, SO y SO_{2} con inclusión de todas las estructuras saturadas e insaturadas,

\quad

R^{6}, R^{7}, R^{8}, R^{9} se seleccionan independientemente de H, un residuo alquilo C_{1}-C_{9} ramificado o lineal, un residuo alquenilo C_{2}-C_{9} ramificado o lineal, un residuo cicloalquilo C_{3}-C_{8}, un residuo cicloalquenilo C_{5}-C_{7}, un residuo arilo o heteroarilo,

con las salvedades siguientes:

Fórmula 6: X^{6} es CH si A no es H,

Fórmula 7: X^{10} es C si A no es H,

Fórmula 8: X^{7} es CH si A no es H,

Fórmula 9: X^{11} es C si A no es H.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones, la expresión "acilo" puede denotar un resto acilo C_{1}-20, preferiblemente un resto acilo C_{1-8} y de modo especialmente preferido un resto acilo C_{1-4}, "cicloalquilo" puede denotar un resto cicloalquilo C_{3-12}, preferiblemente un resto cicloalquilo C_{4}, C_{5} o C_{6}, "carbocíclico" puede denotar un resto carbocíclico C_{3-12}, preferiblemente un resto carbocíclico C_{4}, C_{5} o C_{6}. "Heteroarilo" se define como un resto arilo, en donde 1 a 4, preferiblemente 1, 2, ó 3 átomos del anillo están reemplazados por heteroátomos como N, S u O. "Heterocíclico" se define como un residuo cicloalquilo, en donde 1, 2 ó 3 átomos del anillo están reemplazados por heteroátomos como N, S u O. "Péptidos" se seleccionan de dipéptidos a decapéptidos, siendo preferiblemente dipéptidos, tripéptidos, tetrapéptidos y pentapéptidos. Los aminoácidos para la formación de los "péptidos" pueden seleccionarse de los arriba enumerados.

Debido a la amplia distribución de las proteínas en el cuerpo y la gran diversidad de mecanismos que implican DP IV, actividad de DP N y proteínas afines a DP IV, la terapia sistémica (administración enteral o parenteral) con inhibidores de DP IV puede dar como resultado una serie de efectos secundarios indeseables.

\newpage

El problema a resolver fue además proporcionar compuestos que puedan utilizarse para influir de modo direccionado en los procesos pato-fisiológicos y fisiológicos localmente limitados. El problema de la invención consiste especialmente en la obtención de una inhibición localmente limitada de la actividad de DP IV o análogos de DP IV para el propósito de la intervención direccionada en la regulación de los sustratos activos o localmente activos.

Este problema se resuelve por compuestos de la fórmula general (12)

16

en donde

\quad

A es un aminoácido que tiene al menos un grupo funcional en la cadena lateral,

\quad

B es un compuesto químico unido covalentemente a al menos un grupo funcional de la cadena lateral de A,

\quad

C es un grupo tiazolidina, pirrolidina, cianopirrolidina, hidroxiprolina, deshidroprolina o piperidina unido por enlace amídico a A.

De acuerdo con una realización preferida de la invención, se utilizan composiciones farmacéuticas que comprenden al menos un compuesto de fórmula general (12) y al menos un adyuvante habitual apropiado para el sitio de acción.

Preferiblemente, A es un oc-aminoácido (sic), especialmente un \alpha-aminoácido natural que tiene 1, 2 o más grupos funcionales en la cadena lateral, preferiblemente treonina, tirosina, serina, arginina, lisina, ácido aspártico, ácido glutámico o cisteína.

Preferiblemente, B es un oligopéptido que tiene una longitud de cadena de hasta 20 aminoácidos, un polietilen-glicol que tiene un peso molecular de hasta 20.000 g/mol, una amina, amida, alcohol, ácido o compuesto aromático orgánico opcionalmente sustituido que tiene de 8 a 50 átomos C.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones, la expresión "alquilo" puede denotar un grupo alquilo C_{1-50}, preferiblemente un grupo alquilo C_{6-30}, especialmente un grupo alquilo C_{8-12}; por ejemplo, un grupo alquilo puede ser un grupo metilo, etilo, propilo, isopropilo o butilo. La expresión "alk", por ejemplo en la expresión "alcoxi", y la expresión "alcan", por ejemplo en la expresión "alcanoílo", se definen como para "alquilo"; los compuestos aromáticos son grupos fenilo, bencilo, naftilo, bifenilo o antraceno preferiblemente sustituidos u opcionalmente insustituidos, que tienen preferiblemente al menos 8 átomos C; la expresión "alquenilo" puede denotar un grupo alquenilo C_{2-10}, preferiblemente un grupo alquenilo C_{2-6}, que tiene el o los enlaces dobles en cualquier localización deseada y pueden estar sustituidos o insustituidos; la expresión "alquinilo" puede denotar un grupo alquinilo C_{2-10}, preferiblemente un grupo alquinilo C_{2-6}, que tiene el o los enlaces triples en cualquier localización deseada y puede estar sustituido o insustituido; la expresión "sustituido" o sustituyente puede denotar cualquier sustitución deseada por uno o más, preferiblemente 1 ó 2, grupos alquilo, alquenilo, alquinilo, acilo mono- o multivalente, alcanoílo, alcoxialcanoílo o alcoxialquilo; los sustituyentes arriba mencionados pueden tener a su vez uno o más (pero preferiblemente cero) grupos alquilo, alquenilo, alquinilo, acilo mono- o multivalente, alcanoílo, alcoxialcanoílo o alcoxialquilo como grupos laterales; aminas orgánicas, amidas, alcoholes o ácidos, cada uno de los cuales tiene de 8 a 50 átomos C, preferiblemente de 10 a 20 átomos C, pueden tener las fórmulas (alquil)_{2}N- o alquil-NH-, -CON(alquil)_{2} o -CO-NH(alquilo), -alquil-OH o -alquil-COOH.

A pesar de una función de cadena lateral extendida, los compuestos de fórmula (12) pueden unirse todavía al centro activo de la enzima dipeptidil-peptidasa IV y enzimas análogas pero ya no son transportados activamente por el transportador peptídico PepTi. La transportabilidad resultante reducida o muy restringida de los compuestos de acuerdo con la invención conduce a una inhibición local u orientada de la actividad de las enzimas DP IV y análogas a DP IV.

Por extensión/expansión de las modificaciones de la cadena lateral, por ejemplo más allá de un número de 7 átomos de carbono, es de acuerdo con ello posible obtener una reducción espectacular en la transportabilidad. Con el tamaño espacial creciente de las cadenas laterales, existe una reducción en la transportabilidad de las sustancias. Por expansión espacial y estéricamente de las cadenas laterales, por ejemplo más allá del tamaño de grupos atómicos de un radical fenilo monosustituido, radical hidroxilamina o residuo de aminoácido, es posible de acuerdo con la invención modificar o suprimir la transportabilidad de las sustancias diana.

Compuestos preferidos de fórmula (12) son compuestos, en los cuales los oligopéptidos tienen longitudes de cadena de 3 a 15, especialmente de 4 a 10, aminoácidos, y/o los polietilen-glicoles tienen pesos moleculares de al menos 250 g/mol, preferiblemente de al menos 1500 g/mol y hasta 15000 g/mol, y/o las aminas, amidas, alcoholes, ácidos o compuestos aromáticos orgánicos opcionalmente sustituidos tienen al menos 12 átomos C y preferiblemente hasta 30 átomos C.

Los compuestos de la presente invención pueden convertirse en y utilizarse como sales de adición de ácido, especialmente sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables. La sal farmacéuticamente aceptable tiene generalmente una forma en la cual una cadena lateral básica de aminoácidos está protonizada con un ácido inorgánico u orgánico. Ácidos orgánicos o inorgánicos representativos incluyen los ácidos clorhídrico, bromhídrico, perclórico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, acético, propiónico, glicólico, láctico, succínico, maleico, fumárico, málico, tartárico, cítrico, benzoico, mandélico, metanosulfónico, hidroxietanosulfónico, bencenosulfónico, oxálico, pamoico, 2-naftalenosulfónico, t-toluenosulfónico, ciclohexanosulfámico, salicílico, sacarínico o trifluoroacético. Todas las formas de sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptables de los compuestos de fórmulas (1) a (12) deben considerarse abarcadas por el alcance de la invención.

Teniendo en cuenta la estrecha relación entre los compuestos libres y los compuestos en forma de sus sales, siempre que se hace referencia a un compuesto en este contexto, debe entenderse también la sal correspondiente, con tal que dicha sal sea posible o apropiada en las circunstancias del caso.

La presente invención incluye adicionalmente dentro de su alcance el uso de profármacos de los compuestos. En general, tales profármacos serán derivados funcionales de los compuestos que son fácilmente convertibles in vivo en el compuesto terapéuticamente activo deseado. Así, en estos casos, el uso de la presente invención debe abarcar el tratamiento de los diversos trastornos descritos con versiones profármaco de uno o más de los compuestos reivindicados, que se convierten en el compuesto arriba especificado in vivo después de la administración al individuo. Procedimientos convencionales para la selección y preparación de derivados profármaco adecuados se describen, por ejemplo, en "Design of Prodrugs", compilador H. Bundgaard, Elsevier, 1985 y las solicitudes de patente DE 19828113 y DE 19828114, que se incorporan totalmente en esta memoria por referencia.

Donde los compuestos o profármacos tienen al menos un centro quiral, los mismos pueden existir de acuerdo con ello como enantiómeros. Donde los compuestos o profármacos poseen dos o más centros quirales, los mismos pueden existir adicionalmente como diastereoisómeros. Debe entenderse que el uso de la totalidad de dichos isómeros y mezclas de los mismos están abarcados dentro del alcance de la presente invención. Adicionalmente, algunas de las formas cristalinas de los compuestos o profármacos pueden existir como polimorfos y como tales su uso debe considerarse incluido en la presente invención. Adicionalmente, algunos de los compuestos pueden formar solvatos con agua (es decir hidratos) o disolventes orgánicos comunes, y el uso de tales solvatos debe considerarse también incluido dentro del alcance de esta invención.

Los compuestos, con inclusión de sus sales, pueden obtenerse también en la forma de sus hidratos, o incluir otros disolventes utilizados para su cristalización.

DP IV está presente en una gran diversidad de órganos y tejidos de los mamíferos, v.g. el borde de cepillo intestinal (Gutschmidt S. et al., "In situ"-Measurements of protein contents in the brush border region along rat jejunal villi and their correlations with four enzyme activities. Histochemistry 1981, 72(3), 467-79, epitelios exocrinos, hepatocitos, túbulos renales, endotelios, miofibroblastos (Feller AC, et al., A monoclonal antibody detecting dipeptidylpeptidase IV in human tissue. Virchows Arch. A. Pathol. Anat. Histopathol. 1996; 409(2): 263-73), células nerviosas, membranas laterales de ciertos epitelios superficiales, v.g. el tubo de Falopio, el útero y la glándula vesicular, en el citoplasma luminal de p.ej., el epitelio glandular vesicular, y en células mucosas de la glándula de Brunner (Hartel S. et al., Dipeptidyl peptidase (DPP) TV in rat organs; comparison of inmunohistochemistry and activity histochemistry. Histochemistry 1988; 89(2): 151-61), órganos reproductores, v.g. el epidídimo caudado y la ampolla, las vesículas seminales y sus secreciones (Agrawal & Vanha-Pertulla, Dipeptidyl Peptidases in Bovine reproductive organs and secretions, Int. J. Androl. 1986, 9(6): 435-52). En el suero humano, están presentes dos formas moleculares de dipeptidil-peptidasa (Krepela E. et al., Demostration of two molecular forms of dipeptidyl peptidase IV in normal human serum. Physiol. Bohemoslov. 1983, 32(6): 486-96). La forma de peso molecular alto en suero de DP IV se expresa en la superficie de las células T activadas (Duke-Cohan J.S. et al., Serum high molecular weight dipeptidylpeptidase IV (CD26) his similar to a novel antigen DPPT-L released from activated T cells. J. Immunol, 1996, 156(5): 1714-
21).

Los compuestos y profármacos para uso en la presente invención, y sus formas de sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptables correspondientes son capaces de inhibir DP IV in vivo.

Entre el último grupo de proteasas específicas de prolina, se creía originalmente que DP IV era la única enzima fijada a la membrana específica para prolina como el residuo penúltimo en el término amino de la cadena del polipéptido. Sin embargo, otras moléculas, incluso estructuralmente no homólogas con la DP IV pero que conllevan la actividad enzimática correspondiente, han sido identificadas recientemente. Enzimas semejantes a DP IV, que se han identificado hasta ahora, son p.ej. la proteína \alpha de activación de los fibroblastos, la dipeptidil-peptidasa IV \beta, la proteína afín a la dipeptidilaminopeptidasa, la dipeptidasa ácida acetilada en N y unida a \alpha, la prolina dipeptidasa de las células en reposo, la dipeptidil-peptidasa II, la atractina y la proteína afín a la dipeptidil-peptidasa IV (DPP8), y se describen en el artículo de revisión publicado por Sero & Malik (49). Otras enzimas semejantes a DP IV se describen en los documentos WO 01/19866, WO 02/04610 y WO 02/34900. WO 01/19866 describe una nueva dipeptidil-aminopeptidasa humana (DPP8) con semejanzas estructurales y funcionales a DP TV y la proteína de activación de los fibroblastos (FAP). La enzima afín a la dipeptidil-peptidasa IV del documento WO 02/04610 es bien conocida en la técnica. En la base de datos Gene Bank, esta enzima está registrada como KIAA1492.

Enfermedades que demuestran característicamente hiperglucemia incluyen enfermedades tales como Diabetes mellitus, tipo I y II. La diabetes puede caracterizarse generalmente como una producción insuficiente de hormona por las células \beta pancreáticas. Normalmente, estas células sintetizan y secretan la hormona insulina. En la diabetes tipo I, esta insuficiencia es debida a la destrucción de las células beta por un proceso autoinmune. La diabetes tipo II es debida primariamente a una combinación de deficiencia en células beta y resistencia periférica a la insulina. En el paciente diabético, el número de células beta se reduce de tal modo que no sólo existe una preocupación concerniente a la capacidad de las células beta para sintetizar y liberar la insulina fisiológica, sino que existe también un problema en relación con la masa crítica de estas células pancreáticas productoras de insulina. Se sabe que, en presencia de diabetes, tiene lugar pérdida de células beta. Con la pérdida de estas células productoras de insulina, existe una tensión en la función endocrina para producir, por ejemplo, insulina. Con la pérdida de producción de insulina, pueden llegar a exacerbarse procesos patológicos debidos a la hiperglucemia.

GLP-1 actúa como una hormona del crecimiento de los islotes por estimulación de la proliferación de células \beta, aumento de la masa celular y promoción de células pancreáticas no diferenciadas en células especializadas de los islotes de Langerhans. Tales células pancreáticas expuestas a GLP-1 exhiben una secreción incrementada de insulina y glucagón (43, 44). Los autores de la invención han descubierto que es deseable aumentar la semi-vida de GLP-1's para facilitar con ello la reconstitución de las células beta pancreáticas. Los autores de la invención han descubierto también un método por el cual el catabolismo de GLP-1 puede atenuarse a fin de mejorar la reconstitución de las células pancreáticas.

El método de la presente invención para disminuir la tasa de aumento crónico de peso por un mamífero, con inclusión pero sin carácter limitante de los humanos, comprende la administración oral de un inhibidor de DP IV. Por inhibir la actividad enzimática de DP IV, la semi-vida de la forma activa de GLP-1 se prolongará apreciablemente y se mantendrá en condiciones fisiológicas. La presencia extendida de GLP-1 activo, en particular en el tejido pancreático, facilitará la diferenciación de las células epiteliales pancreáticas en células pancreáticas efectoras, tales como las células beta productoras de insulina. Además, la prolongación de la presencia de GLP-1's fisiológicamente activo en el tejido pancreático facilitará la regeneración de aquellas células beta que están ya presentes pero que necesitan reparación. Sorprendentemente, este efecto es observable solamente después de dosificación repetida (véase el Ejemplo 2). Dado que la retirada de la medicación da como resultado el restablecimiento del estado metabólico anterior, se precisa una dosificación subcrónica o crónica del efector de DP IV para mantener la glucemia mejorada conseguida. Estas células productoras de insulina reparadas pueden contribuir luego eficazmente a la corrección y el mantenimiento de los niveles de glucemia fisiológicos normales.

En la presente invención, se sintetiza GLP-1 endógeno y se libera en las rutas fisiológicas normales. La ingestión de una comida puede estimular la liberación de GLP-1. Alternativamente, pueden administrarse glucosa o su análogo por vía oral en la forma de un vehículo farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, una "píldora de azúcar") con objeto de estimular la liberación de GLP-1 endógeno. Dicha glucosa puede tomarse, antes, simultáneamente o después de la administración de los inhibidores de DP IV.

La presente invención incluye el uso de los compuestos y profármacos de esta invención, y sus formas de sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptables correspondientes, para la preparación de un medicamento para disminuir la tasa de aumento crónico de peso mediada por la modulación de la actividad de DP IV en un individuo. El compuesto debe administrarse a un paciente por la vía de administración oral.

El término "individuo", tal como se utiliza en esta memoria, hace referencia a un animal, preferiblemente un mamífero, muy preferiblemente un humano, que ha sido objeto de tratamiento, observación o experimento.

El término "cantidad terapéuticamente eficaz", tal como se utiliza en esta memoria, significa aquella cantidad de compuesto o agente farmacéutico activo que provoca la respuesta biológica o medicinal en un sistema tisular, animal o humano, que es buscada por un investigador, veterinario, doctor en medicina u otro especialista clínico, que incluye el alivio de los síntomas de la enfermedad o trastorno de que se trata.

Tal como se utiliza en esta memoria, el término "composición" tiene por objeto abarcar un producto que comprende los compuestos reivindicados en las cantidades terapéuticamente eficaces, así como cualquier producto que resulte, directa o indirectamente, de combinaciones de los compuestos reivindicados.

Para preparar las composiciones farmacéuticas utilizadas en esta invención, uno o más compuestos de las fórmulas 1 a 12, o sus profármacos o formas de sal de adición de ácido farmacéuticamente correspondientes, como el ingrediente activo, se mezcla íntimamente con un vehículo farmacéutico de acuerdo con las técnicas de composición farmacéutica convencionales, vehículo que puede tomar una gran diversidad de formas dependiendo de la forma de preparación deseada para administración oral. En la preparación de las composiciones en forma de dosificación oral, puede emplearse cualquiera de los medios farmacéuticos usuales. Así, para preparaciones orales líquidas, tales como por ejemplo, suspensiones, elixires y soluciones, vehículos y aditivos adecuados pueden incluir ventajosamente agua, glicoles, aceites, alcoholes, agentes saborizantes, conservantes, agentes colorantes y análogos; para preparaciones orales sólidas tales como, por ejemplo, polvos, cápsulas, cápsulas de gel y tabletas, vehículos y aditivos adecuados incluyen almidones, azúcares, diluyentes, agentes de granulación, lubricantes, aglomerantes, agentes desintegrantes y análogos. Debido a su facilidad de administración, tabletas y cápsulas representan la forma unitaria de dosificación oral más ventajosa, en cuyo caso se emplean vehículos farmacéuticos sólidos. En caso deseado, las tabletas pueden estar recubiertas de azúcar o proveerse de un recubrimiento entérico por técnicas estándar. Para la vía parenteral, el vehículo comprenderá usualmente agua estéril, aunque pueden incluirse otros ingredientes, por ejemplo, para propósitos tales como favorecer la solubilidad o para fines de conservación.

Preferiblemente, estas composiciones se encuentran en forma de dosis unitaria de tipos tales como tabletas, píldoras, cápsulas, polvos, gránulos, sprays dosificados de aerosol o líquidos, gotas o ampollas, para administración oral. Alternativamente, la composición puede presentarse en una forma adecuada para administración una vez a la semana o una vez al mes. Para preparar composiciones sólidas tales como tabletas, el ingrediente activo principal se mezcla idealmente con un vehículo farmacéutico, v.g. ingredientes convencionales de fabricación de tabletas tales como almidón de maíz, lactosa, sacarosa, sorbitol, talco, ácido esteárico, estearato de magnesio, fosfato dicálcico o gomas, y otros diluyentes farmacéuticos, v.g. agua, a fin de formar una composición de preformulación sólida que contiene una mezcla homogénea de un compuesto de la presente invención, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Cuando se hace referencia a estas composiciones de preformulación como homogéneas, debe entenderse que el ingrediente activo está dispersado idealmente de modo uniforme en toda la composición, de tal manera que la composición puede subdividirse fácilmente en formas de dosificación igualmente eficaces tales como tabletas, píldoras y cápsulas. Esta composición de preformulación sólida puede subdividirse luego en formas de dosificación unitarias del tipo arriba descrito que contienen desde aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1000 mg, con preferencia desde aproximadamente 5 a aproximadamente 500 mg del ingrediente activo de la presente invención.

Las tabletas o píldoras de la nueva composición pueden recubrirse ventajosamente o prepararse de cualquier otro modo en forma de composición a fin de suministrar una forma de dosificación que proporcione la ventaja de la acción prolongada. Por ejemplo, la tableta o píldora puede comprender un componente de dosificación interno y un componente de dosificación externo, encontrándose el último en la forma de una envoltura sobre el primero. Los dos componentes pueden estar separados por una capa entérica que sirve para resistir la desintegración en el estómago y permite que el componente interno pase intacto al duodeno o se retarde su liberación. Pueden utilizarse una diversidad de materiales para dichas capas o recubrimientos entéricos, incluyendo tales materiales cierto número de ácidos polímeros con materiales tales como goma laca, alcohol cetílico y acetato de celulosa.

Estas formas líquidas en las cuales pueden incorporarse ventajosamente las nuevas composiciones de la presente invención para administración por vía oral incluyen soluciones acuosas, jarabes convenientemente saborizados, suspensiones acuosas o aceitosas, y emulsiones saborizadas con aceites comestibles tales como aceite de algodón, aceite de sésamo, aceite de coco o aceite de cacahuete, así como elixires y vehículos farmacéuticos similares. Agentes dispersantes o de suspensión adecuados para suspensiones acuosas incluyen gomas sintéticas y naturales tales como tragacanto, goma arábiga, alginato, dextrano, sodio-

\hbox{carboximetilcelulosa, metilcelulosa,
polivinilpirrolidona  o gelatina.}

En los casos en que los procesos para la preparación de los compuestos para uso en la invención dan lugar a una mezcla de estereoisómeros, estos isómeros pueden separarse por técnicas convencionales tales como cromatografía preparativa. Los compuestos se pueden preparar en forma racémica, o pueden prepararse enantiómeros individuales sea por síntesis enantioespecífica o por resolución. Los compuestos pueden, por ejemplo, resolverse en sus componentes enantiómeros por técnicas estándar, tales como la formación de pares de diastereoisómeros por formación de sal con un ácido ópticamente activo, tal como ácido (-)-di-p-toluoil-d-tartárico y/o ácido (+)-di-p-toluoil-1-tartárico, seguido por cristalización fraccionada y regeneración de la base libre. Los compuestos pueden resolverse también por formación de ésteres o amidas diastereoisómeros(as) seguida por separación cromatográfica y eliminación del adyuvante quiral. Alternativamente, los compuestos pueden resolverse utilizando una columna HPLC quiral.

Durante cualquiera de los procesos para preparación de los compuestos para uso en la presente invención, puede ser necesario y/o deseable proteger los grupos sensibles o reactivos en cualquiera de las moléculas en cuestión. Esto puede conseguirse por medio de grupos protectores convencionales, tales como los descritos en Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, 1991. Los grupos protectores pueden separarse en una etapa conveniente posterior utilizando métodos conocidos en la técnica.

El uso para tratamiento de condiciones moduladas por la dipeptidil-peptidasa IV y enzimas afines a DP IV descritas en la presente invención puede realizarse también utilizando una composición farmacéutica que comprende uno o más de los compuestos como se definen en esta memoria y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede contener desde aproximadamente 0,01 mg a 1000 mg, con preferencia aproximadamente 5 a aproximadamente 500 mg, del compuesto o compuestos, y puede estar estructurado en cualquier forma adecuada para administración oral. Los vehículos incluyen excipientes farmacéuticos necesarios e inertes, con inclusión, pero sin carácter limitante, de aglomerantes, agentes de suspensión, lubricantes, saborizantes, edulcorantes, conservantes, colorantes, y recubrimientos. Las composiciones adecuadas para administración oral incluyen formas sólidas, tales como píldoras, tabletas, capsulitas, cápsulas (incluyendo cada una formulaciones de liberación inmediata, liberación controlada y liberación sostenida), gránulos y polvos, y formas líquidas, tales como soluciones, jarabes, elixires, emulsiones y suspensiones.

Ventajosamente, los compuestos de la presente invención se pueden administrar en una dosis diaria simple, o la dosis diaria total puede administrarse en dosis divididas de 2, 3 ó 4 veces al día.

Más preferiblemente, para administración oral en la forma de una tableta o cápsula, el componente activo del fármaco puede combinarse con un vehículo inerte oral, no tóxico y farmacéuticamente aceptable tal como etanol, glicerol, agua y análogos. Además, en caso necesario o deseado, pueden incorporarse también en la mezcla aglomerantes adecuados; lubricantes, agentes desintegrantes y agentes colorantes. Aglomerantes adecuados incluyen, sin limitación, almidón, gelatina, azúcares naturales tales como glucosa o beta-lactosa, edulcorantes de maíz, gomas naturales y sintéticas tales como goma arábiga, tragacanto u oleato de sodio, estearato de sodio, estearato de magnesio, benzoato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio y análogos. Los desintegrantes incluyen, sin limitación, almidón, metil-celulosa, agar, bentonita, goma de xantano y otros compuestos conocidos en la técnica.

Las formas líquidas son adecuadas en agentes de suspensión o dispersantes saborizados, tales como las gomas sintéticas y naturales, por ejemplo, tragacanto, goma arábiga, metil-celulosa y análogas.

El compuesto de la presente invención puede administrarse también en la forma de sistemas de suministro de liposomas, tales como vesículas unilaminares pequeñas, vesículas unilaminares grandes, y vesículas multilaminares. Los liposomas pueden estar formados por una diversidad de fosfolípidos, tales como colesterol, estearilamina o fosfatidilcolinas utilizando procesos bien descritos en la técnica.

Los compuestos de la presente invención pueden acoplarse también con polímeros solubles como vehículos direccionables de fármacos. Tales polímeros pueden incluir polivinilpirrolidina, copolímero de pirano, polihidroxipropilmetacrilamida-fenol, polihidroxietilaspartamida-fenol, o polietileno-oxidopolisina sustituida con residuo palmitoílo. Adicionalmente, los compuestos de la presente invención pueden acoplarse a una clase de polímeros biodegradables útiles para conseguir la liberación controlada de un fármaco, por ejemplo, poli(ácido acético), poli(épsilon-caprolactona), poli(ácido hidroxibutírico), poliortoésteres, poliacetales, polidihidropiranos, policianoacrilatos y copolímeros de bloques reticulados o anfipáticos de hidrogeles.

Los compuestos para uso en esta invención pueden administrarse en cualquiera de las composiciones que anteceden y de acuerdo con regímenes de dosificación establecidos en la técnica siempre que se requiera tratamiento de los trastornos direccionados.

La dosis diaria de los productos puede modificarse dentro de un intervalo amplio que va desde 0,01 a 1000 mg para un adulto humano al día. Para administración oral, las composiciones se proporcionan preferiblemente en la forma de tabletas que contienen 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0, 50,0, 100, 150, 200, 250, 500 y 1000 miligramos del ingrediente activo para el ajuste sintomático de la dosificación al paciente a tratar. Una cantidad eficaz del fármaco se suministra ordinariamente a un nivel de dosificación comprendido entre aproximadamente 0,1 mg/kg y aproximadamente 300 mg/kg de peso corporal al día. Preferiblemente, el intervalo es de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal al día. Los compuestos se pueden administrar en un régimen de 1 a 4 veces al día.

Las dosificaciones óptimas a administrar pueden ser determinadas fácilmente por los expertos en la técnica, y variarán con el compuesto particular utilizado, el modo de administración, la concentración de la preparación, la biodisponibilidad debida al modo de administración, y el progreso de la condición de la enfermedad. Adicionalmente, factores asociados con el paciente particular que se está tratando, que incluyen la edad, el peso, la dieta del paciente y el tiempo de administración, deberían considerarse generalmente en el ajuste de las dosis.

Los compuestos o composiciones para uso en la presente invención pueden tomarse antes de una comida v.g. 1 hora, 30, 15 ó 5 minutos antes de la comida o la bebida, mientras se toma una comida o después de una comida.

Cuando se toman durante la comida, los compuestos o composiciones de la presente invención pueden mezclarse en la comida o tomarse en una forma de dosificación separada como se ha descrito arriba.

Será fácilmente comprendido por el técnico experto que pueden hacerse numerosas alteraciones a los ejemplos e instrucciones dados en esta memoria, con inclusión de la generación de inhibidores de DP IV diferentes y composiciones terapéuticas alternativas sin apartarse del alcance de la presente invención. Los ejemplos siguientes tal como se describen no deben interpretarse como limitantes del alcance de la presente invención. Una discusión adicional sigue en los ejemplos.

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Ejemplo 1

El inhibidor DP IV P32/98 de DP IV es transportado activamente por el transportador peptídico intestinal PepT1. En el transporte rápido y activo de P32/98 a través de la mucosa intestinal es responsable de su rápido comienzo de acción. El valor t_{max} es un requisito previo para el direccionamiento eficiente de la dipeptidilpeptidasa IV (DP IV). La administración oral de P32/98 da como resultado una inhibición máxima de la diana 15 a 20 min y 30 a 40 minutos después de la ingestión en ratas y humanos, respectivamente. Por consiguiente, el inhibidor de DP IV debería darse 10-20 minutos antes de la ingestión de glucosa o comida.

En el primer estudio en humanos con P32/98, se investigaron parámetros farmacodinámicos tales como la concentración de insulina y la concentración de GLP-1 en plasma y la glucosa en sangre en 36 voluntarios varones sanos. La dosificación oral de P32/98 estaba comprendida en las concentraciones siguientes: 7,5 mg, 15 mg, 30 mg, 60 mg, 120 mg y 240 mg. Los resultados de los parámetros farmacodinámicos anteriores se resumen más adelante en la
Tabla 1.

Los 36 individuos varones sanos se dividieron en 3 grupos individuales, conteniendo cada grupo 12 individuos. En cada grupo individual, 9 individuos recibieron el fármaco activo P32/98 y 3 recibieron placebo. Los individuos que recibieron el fármaco activo se dosificaron dos veces, en periodos diferentes y a concentraciones diferentes. Las concentraciones del P32/98 recibidas dentro de los grupos eran como sigue: el grupo I recibió 7,5 mg y 60 mg; el grupo II recibió 15 mg y 120 mg, y el grupo III recibió 30 mg y 240 mg. A los individuos de todos los grupos que recibieron placebo se les administró placebo en ambos intervalos de dosificación.

Un examen previo al estudio de los individuos se realizó dentro de 3-14 días antes de su participación en el estudio. Una segunda parte del estudio comprendió una fase experimental e implicó 6 tratamientos monodosis a concentraciones crecientes de P32/98 (periodos 1 a 6; Tabla 2) que concluyeron con un examen de seguimiento. Cada individuo participó en el estudio previo y la fase experimental, que estaban separadas por una fase de eliminación por lavado de al menos 5 días. El examen de seguimiento se realizó al menos 7 días después de la última dosis del fármaco de estudio. Los procedimientos de estudio de los 6 periodos fueron idénticos, excepto en lo que respecta a la dosis objeto de investigación.

Métodos

Test de tolerancia oral a la glucosa ("OGTT"): Se requirió que los individuos se encontraran en ayunas durante al menos 12 horas y cumplieran con una dieta rica en carbohidratos tres días antes de cada OGTT. Para cada test de tolerancia a la glucosa, los individuos ingirieron 300 ml de una solución de mono-/disacáridos equivalentes a 75 g de glucosa (Dextro® O.G.-T, Boehringer-Mannheim, FRG). Las muestras de sangre (1,2 ml en tubos de fluoruro de sodio) se tomaron inmediatamente antes de la ingestión de glucosa y al cabo de 30, 60, 90 y 120 min después de ello. Cualquier concentración de glucosa superior a 126 ml/dl (7,0 mmol/l) al cabo de 0 min y 120 min se consideró que se encontraba en estado patológico de tolerancia a la glucosa.

Se realizó un OGTT extendido el día 1 de cada periodo de dosificación. Los individuos ingirieron 300 ml de una solución de mono-/disacáridos equivalente a 75 g de glucosa. Se tomaron muestras de sangre (1,2 ml) en los intervalos siguientes: 1) 5 minutos antes de la ingestión de glucosa; 2) al cabo de 5, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 120, 150 y 180 min después de la ingestión de glucosa; 3) 4, 12, 24 y 48 horas después de la ingestión de glucosa. Adicionalmente, se realizaron otras evaluaciones farmacodinámicas que son bien conocidas en la técnica.

Insulina: Se recogieron 4,7 ml de sangre en tubos de EDTA de 4,9 ml. Las muestras se centrifugaron (1500 g, 10 min) y se guardaron congeladas a -70ºC hasta el análisis en el laboratorio.

Glucosa: Se recogieron 1,2 ml de sangre en tubos de fluoruro de sodio de 1,2 ml. Las muestras de plasma se centrifugaron a 1500 g durante 10 min y se guardaron congeladas a -70ºC hasta el análisis en el laboratorio.

GLP-1: Se recogieron 2,7 ml de sangre en tubos de EDTA y se pusieron en hielo o se refrigeraron, para lo cual se añadió un inhibidor de la dipeptidil-peptidasa IV. El inhibidor fue preparado previamente por los investigadores. La sangre se recogió en tubos y se centrifugó inmediatamente a 1000 g durante 10 min en una centrífuga refrigerada de la sangre (sic) se puso en hielo y se centrifugó dentro de 1 hora, después de lo cual se dividió alícuotamente en muestras iguales. La sangre se guardó en partes alícuotas apropiadas a 70ºC (para evitar ciclos múltiples de congelación/descongelación) hasta el análisis en el laboratorio.

Resultados

Concentraciones activas de GLP-1: Se encontró un efecto dependiente de la dosis de P32/98 comparado con placebo. Las concentraciones individuales globales variaban entre 2 y 68 pmol/l. Los valores medios de los grupos pre-dosis estaban comprendidos entre 3,77 \pm 2,62 pmol/l y 6,67 \pm 9,43 pmol/l y aumentaban hasta 4,22 y 7,66 pmol/l después del uso de un placebo, pero en 11,6 pmol/l (15 mg) y 15,99 pmol/l (240 mg P32/98) después del uso del inhibidor. Si se estima el incremento medio relativo a partir de las concentraciones absolutas, las concentraciones de GLP-1 activo aumentaban aproximadamente en 200-300% después del tratamiento con placebo, pero en aproximadamente 300-400% después del tratamiento con P32/98. El aumento absoluto de las medianas después de 15-240 mg de P32/98 era 2-3 veces mayor comparado con el placebo y la dosis de 7,5 mg (véase la Tabla 3) e indicaba grosso modo una relación dosis-respuesta. Un aumento por encima de los valores previos a la dosis se presentaba hasta aproximadamente 3-4 horas con relación a la dosis de P32/98.

Las concentraciones de insulina exhibían un intervalo individual global de valores entre 3,40 y 155,1 \muIU/ml. Las concentraciones medias (\pm DE) previas a la dosis variaban entre 7,96 \pm 1,92 \muIU/ml (30 mg) y 11,93 \pm 2,91 \muIU/ml (60 mg de P32/98). Después de la ingestión de 75 g de glucosa al cabo de 10 min después de la dosis de P32/98/placebo, las concentraciones medias de insulina aumentaron en 30,12 \muIU/ml (120 mg P32/98) hasta 56-92 \muIU/ml (grupo de 30 mg) dentro de 40-55 min. No había diferencia aparente alguna entre placebo y el grupo de dosificación con P32/98 y, de nuevo, no se apreciaba evidencia alguna de un efecto dependiente de la dosis de P32/98. Resulta interesante que el aumento absoluto en la concentración de insulina era mínimo en los dos grupos de dosificación máxima de P32/98 (véase la Tabla 3). Las concentraciones de insulina eran elevadas durante 3-4 horas en todos los grupos de estudio con inclusión de placebo.

Las concentraciones de glucosa exhibían un intervalo global entre 2,47 y 1,17 mmoles/l en estado de ayuno, durante el OGGT o después de las comidas en todos los individuos objeto del estudio. La concentraciones medias pre-dosis estaban comprendidas entre 4,55 \pm 0,41 (15 mg) y 4,83 \pm 0,30 mmol/l (7,5 ppm P32/98), coincidían estrechamente unas con otras y exhibían poca variación. Las concentraciones medias máximas se alcanzaron dentro de los 40-55 min post-dosis, es decir dentro de 30-45 min después de la dosis de 75 g de glucosa. Las concentraciones medias absolutas eran máximas en los dos grupos de placebo y el grupo de dosificación con 7,5 mg de P32/98. Los valores medios mínimos absolutos se obtuvieron a partir de los grupos de dosificación con 15 mg, 60 mg y 240 mg. Los cambios medios correspondientes oscilaban entre 3,44 y 421 mmol/l y 1,71 a 3,41 mmol/l respectivamente, y coincidían estrechamente con las medianas proporcionadas en la Tabla 4. Aunque no se observó una dependencia perfecta de la dosis, estos resultados indican un menor aumento en las concentraciones de glucosa con las dosis crecientes de 15-240 mg de P32/98 comparadas con el placebo.

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TABLA 3 Cambios máximos en los parámetros farmacodinámicos (0-12 h, medianas)

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TABLA 4 C_{max} y AUC corregidos de las concentraciones de glucosa 0-3 h después de OGTT

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Las concentraciones medias pico de glucosa corregidas por la línea base (C_{max}) excedían de 4,0 mmol/l en los dos grupos de dosificación de placebo y 7,5 mg P32/98 únicamente. Estos valores eran también inferiores a 3,0 mmol/l en los grupos de tratamiento con 15 mg y 240 mg de P32/98. La diferencia comparada al tratamiento con placebo era estadísticamente significativa para los grupos de dosificación de 15 mg, 60 mg, 120 mg y 240 mg de P32/98, pero no para los grupos de dosificación de 7,5 mg y 30 mg. Los valores de AUC medios corregidos por la línea base eran >200 mmol*min/l después de placebo y 7,5 mg de P32/98, pero claramente inferiores a 200 mmol*min/l después de las dosis de 15 mg y 240 mg de P32/98. La reducción en la exposición sistémica de glucosa del OGTT era estadísticamente significativa para los grupos de dosificación de 15 mg, 60 mg, 120 mg y 240 mg de P32/98, pero no para los grupos de dosificación de 7,5 mg y 30 mg (véase Tabla 4). La evaluación de los valores corregidos por la línea base era muy similar a los obtenidos a partir de los datos sin corregir. Así pues, los datos indicaban una exposición a la glucosa claramente inferior después del OGTT en los individuos sanos tratados con P32/98, lo cual era una indicación aproximada, pero no perfecta de dependencia de la dosis.

Conclusiones

Los resultados de este estudio permiten deducir las conclusiones farmacodinámicas siguientes:

El GLP-1 activo aumentaba aproximadamente en un 300-400% después del tratamiento con P32/98 10 min antes del OGTT, pero no se observaba efecto discernible alguno del tratamiento con placebo para el nivel de dosificación de 7,5 mg (véanse las Figuras 1 y 2). Las concentraciones de insulina parecían disminuir a las dosis de 120-240 mg después de estimulación con 75 g de glucosa. Durante el OGTT en individuos sanos, las concentraciones de glucosa exhibían un aumento significativamente menor después del tratamiento con P32/98 (15-240 mg) comparado con placebo, lo que estaba relacionado con la dosis de P32/98.

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Ejemplo 2

En la rata Zucker obesa, P32/98 soporta, dependiendo de los nutrientes, la secreción inicial de insulina. Sin embargo, durante un tratamiento subcrónico, P32/98 reduce la secreción diaria total de insulina. Comparado con una glibenclamida de control, que aumenta la producción de insulina en un 27%, P32/98 causa una economización de insulina por respetar el 45% comparado con el control.

Se realizaron tests para determinar si P32/98 es un candidato principal para influir en la tolerancia a la glucosa in vivo por aumentar las semi-vidas circulantes de las incretinas GIP y GLP-1. Se llevaron a cabo estudios comparativos con glibenclamida (Maninil® Berlin-Chemie, Berlín, Alemania) como sustancia de referencia. La glibenclamida es uno de los fármacos más eficaces para reducir la glucosa en sangre en los pacientes diabéticos tipo 2 y una de las sulfonilureas prescritas más frecuentemente.

Ratas Zucker macho fa/fa, que exhiben anormalidades en el metabolismo de la glucosa y son un modelo animal bien establecido para la diabetes tipo 2, se investigaron de la manera siguiente: se administraron P32/98 y glibenclamida una sola vez al día antes de la ingestión de alimento durante un periodo de 21 días. Los parámetros monitorizados fueron la glucosa en sangre y los niveles de insulina en plasma por las mañanas. En un perfil día/noche, se monitorizaron la glucemia y la insulinemia desde el día 16 al día 17. Se realizó un OGTT finalmente el día 21 para monitorizar la cinética de glucosa en sangre y la insulina en plasma a fin de evaluar los cambios en la tolerancia a la glucosa. La glibenclamida (DAB, 1996; R011150/33372) fue donada por Berlin-Chemie (Berlín, Alemania). Las ratas Zucker macho (fa/fa) de la clase de peso corporal de 300 g fueron adquiridas de Charles River (Sulzfeld, Alemania).

Métodos

Condiciones de Alojamiento: Los animales se mantuvieron en jaulas individuales en condiciones convencionales con temperatura controlada (22 \pm 2ºC) en un ciclo luz/oscuridad de 12/12 horas (encendido de las luces a las 06:00 a.m.). Se permitieron ad libitum pelets estándar (Ssniff®, Soest, Alemania) y agua del grifo acidificada con HCl.

Cateterización de la Arteria Carótida: Después de una semana de adaptación, se implantaron catéteres carotídeos en las ratas bajo anestesia general (inyección de 0,25 ml/kg i.p. de Rompun® [2%], Bayer, Alemania) y 0,5 ml/kg i.p. de Velonarkon® (Arzneimittelwerk Desden, Alemania). Se dejó que los animales se recuperaran durante una semana. El catéter se lavó abundantemente con solución salina de heparina (104 UI/ml) 3 veces por semana.

Dosificación Repetida: 30 ratas Wistar macho no diabéticas y 30 ratas Zucker macho diabéticas se dividieron aleatoriamente en grupos RP (Producto de Referencia: glibenclamida), TP (Producto de Test: P32/98) y CO (control) (N = 10 por grupo). Después de ello, las ratas Wistar no diabéticas se trataron por vía oral una sola vez al día con RP (5 mg/kg de peso corporal) o TP (21,51 mg/kg de peso corporal) y las ratas Zucker diabéticas se trataron por vía oral una sola vez al día con RP (1 mg/kg de peso corporal) o TP (21,61 mg/kg de peso corporal) durante 21 días a las 05:00 p.m. (antes de la ingestión regular de alimento en la fase de oscuridad). Los controles recibieron solución de celulosa al 1% por vía oral (5 ml/kg). Se tomaron cada mañana muestras de sangre a las 07:30 a.m. de la vena del rabo para la medida de glucosa en sangre e insulina en plasma. Las últimas muestras de sangre de esta parte del programa se tomaron a las 07:30 a.m. del día 15º para medir la glucosa en sangre y la insulina en plasma. La terapia oral con fármaco se continuó durante una semana. Los registros del perfil día/noche en la terapia anterior de glucosa en sangre (\Deltat = 3 h) y la insulina en plasma (\Deltat = 3-6 h) se monitorizaron desde el día 16 (comenzando a las 5:40 p.m.) hasta el día 17 (terminando a las 02:00 p.m.).

OGTT: Se realizó un OGTT final el día 21 tomando muestras de sangre de la vena del rabo. Las muestras de sangre de la vena del rabo se tomaron a la hora -12 (la noche anterior al día 21), en el minuto 0 (inmediatamente antes del comienzo del OGTT), y en los minutos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100 y 120. Las muestras de sangre se recogieron en capilares de vidrio de 20 \mul para las medidas de glucosa en sangre y en tubos Eppendorf (100 \mul). Los últimos se centrifugaron inmediatamente y las fracciones de plasma se guardaron a -20ºC para el análisis de insulina.

Glucosa en sangre: Los niveles de glucosa se midieron utilizando el procedimiento de glucosa-oxidasa (instrumento de medida super G Glukose; Dr. Müller Gerätebau, Freital, Alemania).

Insulina en plasma: Las concentraciones de insulina se ensayaron por el método del anticuerpo RIA (LINCO Research, Inc., St. Charles, Mo., EE.UU.).

Resultados

Perfil día-noche de glucemia (véase Figura 4A): La concentración media de glucosa en sangre en el grupo CO el día 16 era 7,78 \pm 0,83 mmol/l antes de la aplicación del fármaco a las 05:00 p.m.. Después de la ingestión oral de placebo y toma de alimento en la fase de oscuridad, la glucemia aumentó hasta niveles máximos de 12,18 \pm 1,34 mmol/l a las 11:00 p.m. Después de ello, la glucemia declinó muy lentamente hasta los valores mínimos de 7,27 \pm 0,61 mmol/l a las 11 a.m., seguido por un aumento hasta 8,90 \pm 0,92 mmol/l a las 02:00 p.m. del día siguiente. En el grupo RP se observó un cuadro de glucemia similar. Sin embargo, a partir de un valor medio comparable de 7,96 \pm 1,13 mmol/l a las 05:00 p.m. con respecto a los animales de control, se registró un aumento más acusado hasta 14,80 \pm 1,46 mmol/l (11:00 p.m.) y después de ello una disminución hasta 7,66 \pm 1,22 mmol/l (11:00 a.m.) y una ligera reducción ulterior hasta 7,34 \pm 0,77 mmol/l a las 02:00 p.m. del día siguiente, respectivamente. En el grupo TP, las ratas Zucker tenían un valor medio normal de glucosa en sangre de 5,25 \pm 0,16 mol/l a las 05:00 p.m. y los valores individuales estaban comprendidos en el intervalo de 4,34 a 6,07 mmol/l. La glucemia mostró un aumento de aproximadamente 3 mmol/l hasta 8,34 \pm 0,47 mmol/l a las 11:00 p.m. Esto iba seguido por una disminución permanente hasta los valores basales que se alcanzaron a las 08:00 a.m. (5,64 \pm 0,23) y que se mantuvieron hasta las 11:00 a.m. (5,33 \pm 0,14 mmol/l) y las 02:00 p.m. del día siguiente (5,51 \pm 0,19 mmol/l), respectivamente.

Perfil de insulinemia día-noche: (véase la Figura 4B): Las ratas Zucker CO y RP eran fuertemente hiperinsulinémicas. La insulina exhibía una variabilidad en valores medios a las 05:00 p.m. en el grupo CO (47,0 \pm 8,7 ng/ml), 08:00 p.m. (45,5 \pm 7,7 ng/ml), 05:00 a.m. (54,2 \pm 5,7 ng/ml) y 02:00 p.m. del día siguiente (61,0 \pm 10,2 ng/ml; NS) que no exhibía relación alguna con las excursiones de glucosa en sangre. En el grupo RP en la fase de oscuridad desde las 06:00 p.m. a las 06:00 a.m. se registraba un aumento significativo de los valores de insulina en plasma con un máximo a las 5:00 a.m.. Este parámetro aumentaba desde valores fuertemente hiperinsulinémicos de 50,0 \pm 8,2 ng/ml (05:00 p.m.) pasando por 57,3 \pm 8,2 ng/ml (08:00 p.m.) hasta 76,3 \pm 8,6 ng/ml (05:00 a.m.; p < 0,01 frente al valor inicial), que iba seguido por una disminución hasta 58,3 \pm 7,3 ng/ml (02:00 p.m. del día siguiente). En este grupo RP, la insulina estaba fuertemente desplazada en fase en relación con las excursiones de glucosa en sangre. En el grupo TP, las ratas Zucker eran también hiperinsulinémicas. La insulina en plasma a las 05:00 p.m. era significativamente menor que en el grupo RP (p < 0,05 frente a RP). Paralelamente a los aumentos de glucosa en sangre (Fig. IV/3A) se registró un aumento de la insulina en plasma a las 08:00 p.m. (41,9 \pm 8,5 ng/ml). El valor máximo de insulina se midió a las 05:00 a.m. (57,1 \pm 8,6 ng/ml; p < 0,01 frente a los valores iniciales). La concentración de insulina en plasma se redujo alcanzando la concentración basal (24,3 \pm 3,7 ng/ml) a aprox. las 2:00 p.m. del día siguiente, lo que era significativamente menor que en los grupos CO o RP (p < D. 0,1 frente a CO o TP).

Curvas de glucosa en sangre OGTT después de 21 días de tratamiento (véase Figura 5A): la última aplicación de fármaco a las 05:00 p.m. y después de una noche en ayunas el día 21 fue seguida por una disminución significativa en la glucemia del grupo CO desde 8,68 \pm 1,26 mmol/l (05:00 p.m.) hasta 5,08 \pm 0,24 mmol/l (p < 0,05), en el grupo RP desde 8,81 \pm 1,21 mmol/l a 4,91 \pm 0,37 mmol/l (p < 0,01) y en el grupo TP desde 5,75 \pm 0,23 mmol/l a 4,88 \pm 0,13 mmol/l (p < 0,01). Por esta razón, las cargas de glucosa oral se realizaron desde un nivel de concentración de glucosa basal comparable en los tres grupos experimentales encontrados por la mañana (07:30 a.m.).

En el grupo CO la glucemia aumentó desde la aplicación de glucosa oral hasta valores máximos de 14,64 \pm 1,42 mmol/l en el transcurso de 40 min. Posteriormente se observó una ligera disminución significativa hasta 5,75 \pm 0,46 mmol/l al final del test (120 min). En el grupo RP, había un aumento pronunciado hasta valores mayores de glucosa en sangre de 16,33 \pm 0,98 y 16,24 \pm 1,09 mmol/l a los 50 min y 80 min, respectivamente. Las concentraciones elevadas de glucosa se mantuvieron hasta el final del estudio a los 120 min (100 min: 15,13 \pm 0,76 mmol/l 120 min: 14,81 \pm 0,66 mmol/l; NS desde los primeros valores pico). En el grupo TP se encontraron propiedades similares de la curva media de glucosa en sangre que en el grupo CO. La glucemia aumentó hasta 14,54 \pm 0,65 mmol/l a los 50 min y disminuyó significativamente hasta un valor de 10,67 \pm 0,62 mmol/l (120 min; NS desde CO).

El área de glucosa bajo la curva (G-AUC_{0-120\ min}) en los grupos CO y TP eran 823 \pm 41 y 895 \pm 50 mmol-min/l, respectivamente (NS). En el grupo RP, este parámetro se determinó como 1096 \pm 76 mmol-min/l y dicho valor era significativamente mayor que en los grupos CO (p < 0,01 o TP (p < 0,05)).

Insulina en plasma de OGTT después de 21 días de tratamiento (véase la Figura 5B): el mantenimiento en ayunas durante una noche en ratas Zucker condujo a concentraciones reducidas de insulina en plasma en los animales CO (14,6 \pm 3,7 ng/ml), el grupo RP hasta 11,8 \pm 1,5 ng/ml, y el grupo TP hasta 9,3 \pm 1,5 ng/ml, respectivamente. Las diferencias entre los grupos experimentales no eran significativas. Después de un estímulo de glucosa, la insulina en plasma se mantenía en la mayoría de los casos inalterada en los grupos CO, RP y TP. Se encontraron valores ligeramente más altos a los 120 min en el grupo CO únicamente, ascendiendo a 21,3 \pm 3,0 ng/ml. Lo que era significativamente mayor que en el grupo TP (p<0,05). El valor I-AUC_{0-120} min era generalmente bajo. En el grupo TP este parámetro era menor que en los grupos CO o RP (NS).

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Sumario

Glucosa en sangre por las mañanas: Los controles tratados con placebo eran hiperglucémicos (aproximadamente 7,5 mmol/l). La concentración media se mantenía inalterada durante el estudio. La terapia RP aumentó la glucosa en sangre en aproximadamente 1,5 mmol/l dentro de dos días. La glucemia se mantenía en el rango superior. La medicación TP reducía la glucosa en sangre a un valor normal dentro de 5 días. La glucosa en sangre se mantuvo en el intervalo normal hasta el final del estudio.

Insulina en plasma: Las ratas Zucker de control eran insulinémicas y exhibían cierto incremento adicional de insulina durante los 14 días de observación. Las ratas Zucker tratadas con RP exhibían un aumento de insulina hasta concentraciones significativamente mayores que en los animales de control. La aplicación de TP reducía ligeramente la concentración de insulina durante 14 días en comparación con los animales de control.

OGTT de Glucosa en sangre después de 21 días de tratamiento: El ayuno nocturno redujo la glucosa en sangre a los valores normales en los grupos experimentales. Los animales tratados con placebo exhibieron aproximadamente un aumento de 9 mmol/l de glucosa en sangre dentro de 40 min después de la carga de glucosa y una ligera disminución después de ello. Las ratas Zucker tratados con RP exhibían aproximadamente 11 mmol/l de aumento de glucosa en sangre después de la carga de glucosa, sin disminución alguna durante el test. La curva de glucosa media en sangre de los animales tratados con TP no era diferente de la de los controles. El tratamiento con RP aumentaba la G-AUC; la medicación con TP no aumentaba G-AUC en comparación con la aplicación de placebo.

OGTT de insulina en plasma después de 21 días de tratamiento: Las ratas Zucker de control tenían la insulina máxima en ayunas de los 3 grupos experimentales de aproximadamente 15 ng/ml. Después de la carga de glucosa, la insulina aumentaba significativamente sólo al final del test (120 min). Las ratas tratadas con RP tenían una insulina en ayunas algo más baja, de aprox. 12,5 ng/ml al comienzo del OGTT y un aumento inicial a los 40 min sin disminución alguna al final del test. Las ratas tratadas con TP tenían la insulina más baja en ayunas de aprox. 9 ng/ml al comienzo del OGTT, un aumento inicial moderado a los 20 min en relación con el aumento de glucosa en sangre y concentraciones menores entre los 40 min y los 100 min. El I-AUC era ligeramente menor en las ratas tratadas con
TP.

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Conclusión

El inhibidor de DP IV P32/98 (TP), administrado una vez al día, normalizaba la glucosa en sangre por la mañana, reducía la hiperinsulinemia, mantenía la glucosa en sangre en el perfil día-noche por debajo del valor crítico (para pacientes diabéticos) de 8,3 mmol/l. El beneficio metabólico se retenía un tiempo determinado después de la cesación de la medicación con P32/98.

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Ejemplo 3

Dos grupos de ratas diabéticas Vancouver (VDF) (una sub-variedad de la rata obesa fa/fa que exhibe anormalidades características de diabetes tipo II que incluyen hiperglucemia moderada, hiperinsulinemia, intolerancia a la glucosa, hiperlipidemias, secreción deteriorada de insulina, y resistencia periférica y hepática a la insulina) (n=6) se trataron por vía oral dos veces al día durante 3 meses con el inhibidor de DP IV P32/98 (20 mg/kg/día). Se examinaron regularmente los parámetros que incluían peso corporal, toma de comida y agua, y tolerancia oral a la glucosa para seguir la pista a la progresión de la enfermedad y estudiar los posibles efectos terapéuticos del inhibidor. Al final del periodo de tratamiento, se evaluaron ex vivo la grasa y la sensibilidad muscular a la insulina, y se realizó perfusión del páncreas para medir la sensibilidad de las células \beta a la glucosa. Tests mensuales de tolerancia a la glucosa oral (OGTT), realizados después de lavado del fármaco, revelaron una mejora progresiva en la tolerancia en los animales tratados. Después de 12 semanas de tratamiento, los valores pico de glucosa en sangre OGTT en los animales tratados eran como promedio 8,5 mM menores que en los controles (12,0\pm0,7 frente a 20,5\pm1,3 mM, respectivamente). Asimismo, determinaciones concomitantes de insulina mostraban una respuesta incrementada de insulina en la fase inicial en el grupo tratado (43% de aumento). Adicionalmente, mientras que los páncreas de control no respondían a una perfusión de glucosa 8,8 mM, los páncreas de los animales tratados exhibían un aumento de 3,2 veces en secreción de insulina, indicando una sensibilidad mejorada a la glucosa de las células \beta. Asimismo, la absorción de glucosa tanto basal como estimulada por insulina se incrementaron en las tiras del músculo sóleo del grupo tratado (20% y 50% respectivamente), proporcionando una evidencia directa de una mejora en la sensibilidad periférica a la insulina. Como se verá en los ejemplos que siguen, se demostró que el tratamiento a largo plazo con el inhibidor de DP IV causa mejoras sostenidas en la tolerancia a la glucosa, insulinemia, sensibilidad de las células \beta a la glucosa y sensibilidad periférica a la insulina, nuevos efectos que soportan el uso de los inhibidores de DP IV en el tratamiento de la
diabetes.

Materiales y Métodos

Materiales. El inhibidor de DP IV P32/98 (di-[2S,3S)-2-amino-3-metil-pentanoico-1,3-tiazolidina fumarato) se sintetizó como ha sido descrito previamente (22).

Animales. Seis pares de ratas VDF Zucker macho obesas (fa/fa) se asignaron aleatoriamente a un grupo o de control o de tratamiento (P32/98) con 440 g de peso corporal (11 \pm 0,5 semanas de edad). Los animales se alojaron en un ciclo de 12 horas luz/oscuridad (encendido de las luces a las 6 am) y se les permitió acceso a comida estándar para ratas, y agua ad libitum.

Protocolo para monitorización y administración diaria del fármaco. El grupo de tratamiento recibió P32/98 (10 mg/kg) por sonda esofágica dos veces al día (0800 h y 1700 h) durante 100 días, mientras que los animales de control recibieron dosis concurrentes de vehículo constituido por una solución de celulosa al 1%. Cada 2 días, se evaluaron el peso corporal, la glucosa en sangre por la mañana y por la tarde, y la toma de alimento y agua. Se extrajeron muestras de sangre del rabo, y se midió la glucosa utilizando un analizador SureStep (Lifescan Canada Ltd., Burnaby). La toma de alimento y agua se midieron por sustracción.

Protocolo para evaluación mensual de tolerancia a la glucosa. Cada 4 semanas a partir del comienzo del experimento se realizó un test de tolerancia a la glucosa oral (OGTT; 1 g/kg) después de un lavado del fármaco rápido y completo de 18 horas (aprox. 12 semi-vidas circulantes para P32/93). No se administró dosis alguna a las 0800 en este caso. Se recogieron muestras de sangre (250 \mul) del rabo utilizando tubos capilares heparinizados, se centrifugaron y se guardaron a -20ºC. En el caso del OGTT de 12 semanas, la sangre se recogió directamente en tubos que contenían el inhibidor de DP IV P32/98 (concentración final 10 \muM) para el análisis de GLP-1 activo (EGLP-35K; Linco Research Inc., EE.UU.). La insulina en plasma se midió por radioinmunoensayo utilizando un anticuerpo anti-insulina de cobayo (GP-01) como se ha descrito previamente (23), y la glucosa en sangre se midió como se ha descrito arriba. La actividad de DP IV en plasma se determinó utilizando un ensayo colorimétrico que medía la liberación de p-nitroanilida (A_{405nm}) por el sustrato de DP IV H=Gly-Pro pNA (Sigma; Parkville, ON9. Es importante observar que el ensayo implica una dilución de 20 veces de la muestra y por consiguiente subestima el grado real de inhibición que tiene lugar en la muestra sin diluir cuando se utilizan inhibidores rápidamente reversibles tales como
P32/98.

La estimación de la sensibilidad a la insulina realizada a partir de los datos OGTT se realizó utilizando el índice compuesto de sensibilidad a la insulina (CISI) propuesto por Matsuda y DeFronzo (24). El cálculo del índice se realizó de acuerdo con la ecuación,

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donde FPG y FPI eran las concentraciones en ayunas de glucosa e insulina en plasma respectivamente y MG y MI eran las concentraciones medias de glucosa e insulina durante el curso del OGTT.

Protocolo para el perfil de insulina y DP IV durante 24 horas. Con objeto de determinar los efectos de la inhibición de DP N a lo largo de un periodo de 24 horas, se midieron los niveles de glucosa en sangre, insulina, y actividad de DP IV como se ha descrito arriba, cada 3 horas durante 24 horas, seis semanas en el estudio. La dosificación del fármaco se continuó en los momentos apropiados durante el perfil.

Sensibilidad del músculo esquelético a la insulina. Se midió la toma de glucosa marcada con ^{14}C en tiras del músculo sóleo como indicador de la sensibilidad del músculo esquelético a la insulina. Resumidamente, después de ayuno durante una noche y 18 horas después de la última dosis de P32/98, los animales se anestesiaron con pentobarbital sódico (Somnotol; aprox. 50 mg/kg). Los músculos sóleos de ambas extremidades posteriores se dejaron al descubierto y se aislaron. Después de liberar el músculo por corte de los tendones proximal y distal, se sacaron tiras de aproximadamente 25-35 mg del músculo (se utilizaron los dos tercios exteriores de cada músculo). Después de pesada, se fijaron las tiras en clips de acero inoxidable en su longitud en reposo, y se dejó que se estabilizaran durante 30 minutos en un tampón de bicarbonato Krebs-Ringer suplementado con piruvato 3 mM, gasificado continuamente con 95% O_{2}: 5% CO_{2} y mantenido a 37ºC en un baño de agua agitado. Se mantuvieron estas condiciones durante toda la duración del experimento a no ser que se indique otra cosa.

A fin de evaluar la toma de glucosa en respuesta a la insulina, las tiras de músculo se sometieron a dos preincubaciones (30 y 60 minutos respectivamente) seguidas por una incubación de test de media hora. Tanto la segunda preincubación como la incubación de test contenían 0 ó 800 \muU/ml de insulina. La incubación de test se realizó en medio suplementado con [^{3}H]-insulina (0,1 \muLCi/ml) como medida del espacio extracelular, y el análogo de glucosa no metabolizable [^{14}C]-3-O-metilglucosa (0,05 \muCi/ml) para medida de la absorción de glucosa. Después de la incubación, se secó cada tira con papel secante, se digirió con proteinasa K (0,25 \mug/ml) y se midió la radiactividad de los materiales digeridos del músculo con un programa de conteo de centelleo de líquido dual-isotópico.

Sensibilidad del tejido adiposo a la insulina. Para estimar la sensibilidad a la insulina en el tejido adiposo, se midieron los niveles de glucógeno-sintasa (GS) y acetil-CoA-carboxilasa (ACC) como se ha descrito previamente (25, 26). De modo resumido, muestras de 3 cm^{3} de tejido adiposo del epéndimo se obtuvieron de animales anestesiados y se sometieron a una digestión de 16 minutos con colagenasa (0,5 ng/ml). Los adipositos recuperados se lavaron tres veces, y se dejaron estabilizar durante una hora en tampón Krebs a 37ºC gasificado repetitivamente con 95% O_{2}: 5% CO_{2}. Se incubaron partes alícuotas de 2 ml de la suspensión de adipocitos que contenían 0, 100, 250, 800 y 1500 \muU/ml de insulina durante 30 minutos y se congelaron bruscamente a continuación en nitrógeno líquido, después de lo cual se guardaron a -70ºC. Antes de la evaluación de ACC y GS, las muestras guardadas se descongelaron, se homogeneizaron en tampón de pH 7,2 que contenía MOPS 20 mM, sacarosa 250 mM, EDTA 2 mM, EGTA 2 mM, benzamidina 2,5 mM, pH 7,2), y se centrifugó (15 min a 15.000 x g).

Para la medida de la actividad de ACC, se añadieron partes alícuotas de 50 \mul del sobrenadante, y se preincubaron en presencia o ausencia de citrato 20 mM, a 450 \mul de [^{14}C]-HCO_{3} que contenía tampón de ensayo de pH 7,4 (HEPES 50 mM, MgSO_{4} 10 mM, EDTA 5 mM, ATP 5,9 mM, glutatión 7,8 mM, BSA 2 ng/ml, KHCO_{3} 15 mM y Acetil-CoA 150 mM). Después de 3 minutos, se `paró la reacción por adición de 200 \mul de HCl 5M. Las muestras se secaron durante 6 horas, se resuspendieron en 400 \mul de agua destilada, se combinaron con 3 ml de cóctel de centelleo y se sometieron a conteo en un contador-\beta Beckman LS 6001C. La actividad de GS se midió utilizando una modificación de un método con papel de filtro (26): 25 \mul de los extractos de células preparados como se ha indicado arriba se añadieron a tampón de ensayo pH 7,0 (MOPS 75 mM, NaF 75 mM, 10 ng/ml de glucógeno, UDP-[^{14}C]-glucosa 2 mM) mantenido a 30ºC en presencia o ausencia de glucosa-6-fosfato 15 mM. Cada reacción se paró añadiendo gota a gota 50 \mul de la mezcla de reacción sobre papel de filtro Whatman 3MM y sumergiendo el papel en etanol al 66%. Después de 3 lavados con etanol, las muestras se secaron al aire y se determinó la actividad de [^{14}C] (incorporación de UDP-[^{14}C]-glucosa en glucógeno).

Protocolo para perfusión del páncreas. Después de escisión de las muestras de tejido adiposo del sóleo y del epéndimo, se aisló el páncreas y se prefundió con un protocolo de perfusión de glucosa baja-a-alta (4,4 mM a 8,8 mM) como se ha descrito previamente (27). Después de exposición a través de una incisión en la línea media en la posición ventral, se aisló el páncreas, se ligaron todos los vasos menores, y se introdujo un perfundido de glucosa a través de la arteria celíaca. El efluente de la perfusión se recogió a intervalos de 1 minuto a través de la vena porta con una tasa de perfusión de 4 ml/min. Las muestras se guardaron a -20ºC hasta el análisis.

Inmunohistoquímica y determinación de la masa de células \beta. Se extirparon los páncreas de los animales anestesiados (50 mg/kg de pentobarbital sódico) y se pusieron directamente en fijador durante 48 horas (44% formaldehído, 47% agua destilada, 9% ácido acético glacial). Después de imbibición en parafina, se cortaron secciones de tejido de 5 \mum, se montaron en portaobjetos, y se secaron rápidamente para tinción. Con objeto de evaluar el área de las células \beta, se tiñeron las secciones con un anticuerpo primario de cobayo anti-insulina seguido por anticuerpo secundario de cabra anti-cobayo conjugado con peroxidasa. Se revelaron los portaobjetos utilizando diaminobencidina y se sometieron a contratinción con hematoxilina. Los análisis se realizaron utilizando Northern Eclipse Software (Empix Imaging, Mississauga, ON, Canadá) como se ha descrito previamente (28).

Análisis Estadístico. Se utilizaron el test de Student y ANOVA, en caso apropiado, para testar la significación estadística de los datos (P < 0,05). El análisis se realizó utilizando el software de análisis de datos Prism 3.0 (CraphPad Software Inc., CA).

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Ejemplo 4

Efectos del tratamiento de P32/98 sobre el peso corporal, la glucosa diaria en sangre y la toma de alimento y agua. Ratas VDF tratadas con P32/98 exhibían una reducción de 12,5% (25 g) de aumento de peso a lo largo del periodo de tratamiento (control: 211 \pm 8 g; tratados: 176 \pm 6 g) (Fig. 6A). Las medidas de toma de comida y agua revelaron una disminución menor en la toma de agua (Fig. 6B) en los animales tratados concomitantemente con una toma de alimento inalterada. La toma de alimento en el curso del experimento promediaba 30,0 g \pm 0,4 g/rata/día y 30,4 g \pm g/rata/día en los grupos tratado y de control respectivamente. La toma de alimento y agua disminuía a lo largo del curso del experimento paralelamente a la disminución de la tasa de aumento de peso a medida que el crecimiento de los animales comenzó a estabilizarse alrededor de los 600-650 gramos (datos no presentados). La monitorización dos veces al día de la glucosa en sangre no reveló diferencia alguna en los valores de glucosa en sangre por la mañana o por la tarde entre los grupos experimentales, aunque ningún grupo presentaba valores notablemente hiperglucémicos (datos no presentados). Los niveles de glucosa en sangre por la mañana a lo largo del curso del experimento promediaban 5,0 \pm 0,1 mM en los animales tratados y 5,3 \pm 0,1 mM en los de control. Los valores de glucosa en sangre por la tarde promediaban 6,7 \pm 0,1 mm y 7,0 \pm 0,2 mM, respectivamente. El hematocrito, medido a intervalos de 4 semanas, no indicaba en absoluto efectos adversos del protocolo de toma de las muestras de sangre empleado, promediando entre 43,4% y 45,3% en ambos grupos.

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Ejemplo 5

Efectos del tratamiento con P32/98 sobre los niveles de glucosa en sangre, insulina y 17P IV (sic) a lo largo de 24 horas

Después de 6 semanas de tratamiento, se obtuvo un perfil de 24 horas de glucosa en sangre, insulina y actividad de DP IV tomando muestras de sangre a intervalos de 3 horas, sin interrumpir la administración del tratamiento ni el ciclo luz/oscuridad. El perfil confirmó que la administración de P32/98 causaba una inhibición significativa de la actividad de DP N a lo largo de la mayor parte del ciclo de 24 horas, con una inhibición de al menos 65% durante el ciclo de alimentación (Fig. 7A). La excursión integrada de glucosa en sangre en los animales tratados era 75% de la de los controles, alcanzando un pico a 7,7 \pm 0,3 mM en comparación con 9,8 \pm 0,6 mM para los animales sin tratar (Fig. 7B). El perfil correspondiente de insulina en plasma exhibía no sólo una disminución en los valores pico de insulina, sino también de los valores "basales", sin alimentación (aprox. 0800 a 1800 horas) en los animales tratados (Fig. 7C).

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Ejemplo 6

Efectos del tratamiento con P32/98 sobre la tolerancia a la glucosa oral

Se utilizaron 3 tests de tolerancia a la glucosa oral, realizados en ausencia de P32/98 circulante y a intervalos de 1 mes, para monitorizar la progresión del estado de enfermedad en los animales de control y documentar cualesquiera mejoras presentadas en el grupo tratado. El test de tolerancia inicial a la glucosa oral, administrada después de 4 semanas de tratamiento, demostró disminuciones significativas (aprox. 2 mM) en los valores de glucosa en sangre basales, a los 45, 60 y 90 minutos en el grupo tratado a pesar de excursiones solapantes de insulina en plasma (Fig. 8A). Los datos del segundo OGTT eran muy similares al primero; con la excepción de que el valor de glucosa en sangre a los 120 min era también significativamente reducido en el grupo tratado (10,8 \pm 0,8 frente a 12,3 \pm0,8 para los animales de control); una vez más, los perfiles de insulina eran superponibles (datos no presentados). EL OGTT final, realizado después de 12 semanas de tratamiento, mostraba una diferencia notable en la tolerancia a la glucosa entre los dos grupos, con valores de glucosa en sangre significativamente reducidos observados en todos los momentos. Los valores pico de glucosa en sangre en el grupo tratado promediaban 12,0 \pm 0,7 mM, 8,5 mM menos que el de los animales de control (Fig. 8B), en tanto que los valores de 2 horas en el grupo tratado habían vuelto a 9,2 \pm 0,5 mM, una reducción de 40% comparada con los controles. Se encontró que los niveles de GLP-1 activo (GLP-1a), medidos durante el OGTT final utilizando un ELISA direccionado al terminal N se mantenían inalterados (Fig. 8B). A pesar de esta falta de niveles alterados de GLP-1a, la respuesta de insulina en la fase precoz medida en el grupo tratado excedía a la de los animales de control en un 43%. No obstante, las respuestas integradas de insulina entre los dos grupos no acusaban diferencia significativa. El análisis de los datos OGTT utilizando el índice compuesto de sensibilidad a la insulina de Matsuda y DeFronzo (24), revelaba un aumento progresivo en la sensibilidad estimada a la insulina de los animales tratados con relación a los controles (Fig. 8C).

La comparación de los tests de tolerancia a la glucosa oral a lo largo del curso del experimento reveló una disminución progresiva de ambos valores en ayunas y pico de glucosa en sangre en los animales tratados con P32/98, mejoras que no se observaban en los animales de control (Fig. 9 A y B). Los valores pico de insulina no diferían significativamente entre los dos grupos experimentales hasta el final, 12 semanas, OGTT, en cuyo momento los niveles pico de insulina en los animales tratados excedían de los de los animales de control en un promedio de 43% (Fig. 9C). La actividad de DP IV en plasma, medida al comienzo de cada OGTT, era significativamente mayor en el grupo tratado en la semana 8 del estudio, y la elevación se mantenía en la semana 12 (Fig. 9D).

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Ejemplo 7

Efectos del tratamiento crónico con el inhibidor de DP IV sobre la sensibilidad pancreática a la glucosa

Se realizó un protocolo de perfusión de glucosa en pasos bajo-a-alto en los páncreas de la miad de cada grupo de animales. El cambio del perfundido de glucosa desde 4,4 a 8,8 mM causó un aumento de 3,2 veces en la tasa de secreción de insulina en los páncreas de los animales tratados (Fig. 10). La tasa de secreción de insulina cambió desde un valor basal de 570 \pm 170 \muU/min a más de 2100 \muU/min dentro de 2 minutos de perfusión alta de glucosa. EL mismo procedimiento de pasos de glucosa no logró provocar ninguna respuesta significativa en los páncreas de control hasta mucho después de 20 minutos de perfusión alta con glucosa (Fig. 10).

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Ejemplo 8

Efectos del tratamiento crónico con el inhibidor de DP IV sobre la sensibilidad de los músculos y la grasa a la insulina

Para definir mejor las mejoras aparentes en la sensibilidad a la insulina observadas en los datos OGTT, se realizaron ensayos de sensibilidad a la insulina de los músculos y la grasa. Se midieron la actividad de glucógeno-sintasa (GS) y acetil-CoA-carboxilasa (ACC) en adipocitos aislados junto con la absorción de glucosa marcada con ^{14}C en tiras del músculo sóleo. Los niveles de ACC en el tejido adiposo de ambos grupos experimentales eran mínimos (aproximándose a los límites de detección), carecían de sensibilidad a la insulina, y no mostraban diferencia alguna entre los dos grupos (datos no presentados). La actividad de GS parecía también insensible a la insulina, aunque la actividad de la enzima para todas las concentraciones de insulina medidas era mayor en los animales tratados que en sus hermanos de camada de control (Fig. 11A). Las tiras del músculo sóleo tomadas de los animales tratados exhibían tasas significativamente mayores de absorción de glucosa tanto en el estado basal como en el estado estimulado por insulina. La absorción de glucosa en el estado no estimulado. La absorción de glucosa en el estado no estimulado era 22% mayor en las ratas tratadas (Fig. 11B). El aumento estimulado por insulina en la absorción de glucosa estaba incrementado en el grupo tratado comparado con los controles (control: 58,5 \pm 3,5; tratados: 87,5 \pm10,4 cpm/mg a 800 \muU/ml
insulina).

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Ejemplo 9

Efectos del tratamiento crónico con el inhibidor de DP IV sobre el área de las células \beta y la morfología de los islotes

El régimen oral de tres meses con el inhibidor de DP IV no producía en ningún caso diferencias significativas en el área de las células \beta, o en la morfología de los islotes. Los islotes procedentes de animales de control y animales tratados comprendían 1,51 \pm 0,04% y 1,50 \pm 0,03% del área pancreática total, respectivamente. Se observaron grandes islotes de forma irregular con hiperplasia significativa de células \beta en ambos grupos, morfología característica de la rata Zucker fa/fa.

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Ejemplo 10

Procesamiento de péptidos bioactivos por DP IV

Se llevó a cabo una espectrometría de masas por desorción-ionización láser asistida por matriz utilizando el Sistema Hewlett-Packard G2025 LD-TOF con una sintonización lineal del analizador de vuelo. El instrumento estaba equipado con un láser de nitrógeno de 337 nm, una fuente potencial de aceleración (5 kV) y un tubo de vuelo de 1,0 m. El detector operaba en el modo de ion positivo, y las señales se registraron y se filtraron utilizando el osciloscopio de almacenamiento digital LeCroy 9350M conectado a un ordenador personal. El espectrómetro se calibró externamente. La reproducibilidad óptima de la señal y la inexistencia de señales de aductos alcalinos se encontraron utilizando una solución matriz de 30 mg de 2',6'-dihidroxiacetofenona (Aldrich) y 44 mg de hidrogenocitrato de diamonio (Fluka) en acetonitrilo/0,1% TFA (1/1). Para obtener los espectros de los péptidos por el tratamiento de DP IV o plasma humano purificado en presencia o ausencia del inhibidor específico de DP IV P32/98, se incubaron sustratos a 37ºC con tampón tricita 40 Mm/HCl de pH 7,6 y una solución de enzima o suero en una relación 2:2:1. Se tomaron muestras de las mezclas de reacción en diversos intervalos de tiempo y se mezclaron con volúmenes iguales de la solución matriz. Por mezcladura de la muestra de ensayo y la matriz, el bajo pH de la solución matriz paró la reacción enzimática. Se transfirió un pequeño volumen (< 1 \mul) de esta mezcla a una punta de sonda y se evaporó inmediatamente en un equipo Hewlett-Packard G2024A Sample Prep Accessory para asegurar una cristalización rápida y homogénea de la muestra. Todos los espectros se generaron por utilización de modo automático promediando 250 dosis simples seleccionadas por la relación de señal a ruido.

Todos los péptidos fueron adquiridos por BACHEM. En las soluciones de incubación, la concentración de los sustratos era 25 \mumol/l. La DP IV utilizada en este estudio se purificó a partir de riñón de porcino. La actividad específica medida utilizando Gly-Pro-4-nitroanilida como sustrato cromógeno era al menos 5 unidades/mg. En el caso del plasma, se utilizó EDTA-plasma humano recién preparado a partir de individuos sanos. La concentración del inhibidor específico de DP N isoleucil-tiazolidina-hemifumarato en las soluciones de incubación era 9,8 \mumol/l. Se realizaron investigaciones de electroforesis en la zona capilar (CZE) utilizando un sistema de Beckman. Los péptidos y las enzimas se incubaron en el sistema de electroforesis capilar a 37ºC utilizando un tampón de fosfato 20 mM de pH 7,4. La disminución del sustrato se determinó por medidas subsiguientes de la misma muestra. La separación se llevó a cabo utilizando un tampón de fosfato 0,1 M de pH 2,5, un capilar de sílice fundida de 50 \muM*30 cm y un voltaje constante de 16 kV. Los péptidos se detectaron a 200 nm. Las concentraciones de sustrato se calcularon a partir de la altura de los picos de péptidos. Para la determinación de las constantes cinéticas se determinó la velocidad de degradación a partir de al menos 4 concentraciones de sustrato y se ajustó de acuerdo con la ecuación de Michaelis-Menten utilizando Graphit 4.0.

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Resultados

La Tabla 5 resume los resultados de los estudios de procesamiento proteolítico de péptidos gastrointestinales analizados por espectrometría de masas MALDI-TOF (Figuras 12-14) y electroforesis capilar.

Las evaluaciones de los espectros de masas permitieron una diferenciación entre las tasas de escisión en condiciones estándar y la determinación de la especificidad de sustrato (Tabla 5). Adicionalmente, se detectaron y confirmaron especificidades de sustrato previamente desatendidas (escisión después de Ser o Gly). La hidrólisis en plasma humano podía bloquearse por el inhibidor de la dipeptidil-peptidasa IV isoleucil-tiazolidina-hemifumarato.

TABLA 5 Análisis cualitativo del procesamiento de péptidos gastrointestinales seleccionados por DP IV

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Discusión

Las investigaciones realizadas en escala aguda (18-20, 29) no aprovechan los beneficios potenciales de los efectos de las incretinas a largo plazo tales como la mejora de la sensibilidad de las células \beta a la glucosa y la estimulación de la mitogénesis, diferenciación, y biosíntesis de insulina por las células \beta. Es una realización importante de la presente invención que la inhibición de DP IV a largo plazo detenía la progresión del síndrome diabético Zucker fa/fa, y causaba una mejora progresiva en la tolerancia a la glucosa, sensibilidad a la insulina y susceptibilidad de respuesta de las células \beta a la glucosa.

La monitorización diaria reveló una disminución de 12,5% en el aumento de peso corporal (4% de reducción en el peso corporal final) en los animales tratados en comparación con los controles sin tratar (Fig. 6A). Aunque no es estadísticamente significativo, la ingestión media de alimento en los animales tratados alcanzaba un promedio de 0,4 g/día/rata (41 g/rata a lo largo del curso del estudio) menos que la del grupo de control. Es posible que la diferencia acumulativa de 41 g/rata no significativa en la ingestión de alimento, el deseo aparentemente reducido de comida o el progreso más rápido hasta la saciedad a lo largo del curso del experimento pudiera explicar en parte el menor aumento de peso en los animales tratados.

Los valores de glucosa en sangre monitorizados sobre una base de dos veces al día, por la mañana y por la tarde, no exhibían respuesta significativa al tratamiento con el inhibidor, un reflejo probable de dos puntos. En primer lugar, las horas de toma de muestra de la sangre (0800 y 1700) correspondían a estados posterior a la absorción y de alimentación reciente respectivamente, con valores de glucosa en sangre en los intervalos de 4,5-5,5 mM y 6,0-8,0 mM. A la vista del supuesto mecanismo de acción del tratamiento dependiente de la glucosa, no serían previsibles grandes disminuciones para estos niveles de glucemia. En segundo lugar, las muestras de sangre tanto de la mañana como de la tarde se recogieron inmediatamente antes de la dosificación del fármaco, en horas de inhibición mínima de DP IV en las que el potencial para cualesquiera efectos terapéuticos agudos del tratamiento se encontraba en un mínimo. Ambos puntos son soportados por el perfil de 24 horas que se muestra en la Figura 7.

A pesar de los valores de glucosa en sangre inalterados post-absorción, el tratamiento con el inhibidor de DP IV reducía eficazmente la glucosa prandial en sangre y las respuestas de glucosa en sangre a un OGTT (Figs. 7 y 8). Durante el perfil de 24 horas, los animales de control exhibían un 105% de aumento de la insulina en plasma en respuesta a un aumento de 5,2 mM de la glucosa en sangre, mientras que los animales tratados exhibían una respuesta mayor de 160% de insulina a una excursión mucho menor de glucosa (3,0 mM). Aunque estas diferencias se debían probablemente, al menos en parte, a un aumento agudo de los niveles circulantes de incretinas inducido por P32/98, el pronunciado pico de insulina en la fase precoz exhibido durante el OGTT no lo era (el OGTT tuvo lugar después de la eliminación completa del fármaco por lavado). Los últimos datos eran sugerentes no sólo de una sensibilidad incrementada a la insulina sino también de una susceptibilidad aumentada de respuesta de las células \beta a la glucosa. Por último, se demostró claramente un aumento en la susceptibilidad de respuesta de las células \beta a la glucosa por perfusión del páncreas. Después de exposición a un perfundido de glucosa elevado (8,8 mM), los páncreas de los animales de control exhibían una ausencia de liberación de insulina de primera fase, mientras que los del grupo tratado exhibían una respuesta inmediata de insulina 3,2 veces mayor (Fig. 10). La ausencia de liberación de insulina en la fase precoz observada en el grupo de control es característica de la rata VDF y es un sello de la diabetes tipo 2 (21). Considerando la falta de área alterada de las células \beta o de morfología alterada de los islotes, estos datos indican que el tratamiento a largo plazo con un inhibidor de DP IV provoca una mejora en la capacidad de la población existente de células \beta para sensibilizarse y responder a los aumentos en la concentración de glucosa.

La glucosa en sangre elevada en ayunas frente a la insulinemia, y el deficiente aclaramiento de una carga oral de glucosa, respectivamente, son consistentes con la resistencia hepática y muscular a la insulina descrita en la rata Zucker fa/fa. Los descubrimientos del presente estudio demuestran que el tratamiento con el inhibidor de DP IV corregía al menos en parte dichas dos desviaciones metabólicas, lo que sugiere mejoras en ambos sitios de resistencia a la insulina. Una relación incrementada de glucosa a insulina evidente durante el estado posterior a la absorción del perfil de 24 horas (Fig. 7), así como valores en ayunas del OGTT de 12 semanas (Figs. 8 y 9) eran consistentes con una disminución en la resistencia a la insulina en los animales tratados. El último aumento de sensibilidad a la insulina se demostró que era significativo tanto a las 4 como a las 12 semanas utilizando el índice compuesto de sensibilidad a la insulina de Matsuda y DeFronzo (24). Este análisis matemático fue validado previamente (con alta correlación) contra la técnica de la pinza euglucémica hiperinsulinémica, en 153 individuos con grados variables de resistencia a la insulina. La sensibilidad relativa a la insulina de los animales tratados mejoraba con cada OGTT sucesivo, alcanzando finalmente un registro relativo de índice 1,56 \pm 0,26 veces el de los animales de control. Los resultados del perfil glucosa/insulina/DP IV de 24 horas y el OGTT fueron corroborados por medidas directas de la absorción de glucosa en tiras del músculo sóleo que demostraban claramente una absorción incrementada de glucosa tanto en el estado no estimulado como en el estado estimulado por insulina (Fig. 11). Aunque algo sujeto a controversia, se ha comunicado que tanto GIP como GLP-1 (y exendina-4) aumentan la sensibilidad muscular a la insulina por la estimulación de la síntesis de glucógeno y la absorción de glucosa (32-35). Adicionalmente, varios estudios en animales utilizando GLP-1 o agonistas de receptores afines a GLP-1 han observado mejoras similares en tolerancia a la glucosa y sensibilidad a la insulina. Young y asociados demostraron que la administración a largo plazo del agonista de GLP-1 Exendina-4 causa disminución de glucosa y efectos de sensibilización a la insulina en varios modelos de animales diabéticos con inclusión de la rata Zucker fa/fa (36). Asimismo, varios estudios de infusión sub-crónica han revelado mejoras en el control de la glucemia, la tolerancia a la glucosa y la sensibilidad a la insulina (37-39). Sin embargo, las contribuciones indirectas de una mejora de la glucemia a largo plazo, o aumento a largo plazo de cierto número de otros sustratos de DP IV (en particular los secretagogos de insulina péptido vasoactivo intestinal, péptido activador de la adenilil-ciclasa hipofisaria (PACAP)(48), péptido liberador de gastrina y neuropéptido Y) a lo largo del curso del tratamiento conducen a las condiciones metabólicas mejoradas que son un aspecto de la presente invención.

Otros aspectos que resultan de la presente invención incluyen la posibilidad de aumentar la capacidad de las células \beta de un mamífero para secretar insulina o para aumentar la diferenciación de las células pancreáticas de un mamífero a células \beta por aumento de la disponibilidad de hormonas de crecimiento de las células de los islotes que son sensibles a la estimulación nerviosa central y/o periférica pero que son sustancialmente insensibles a los cambios agudos en los niveles circulantes de nutrientes en dicho mamífero. PACAP (48) es una hormona de este tipo. El uso comprenderá administrar por vía oral una dosis terapéuticamente eficaz de un inhibidor de DP IV. Sorprendentemente, se ha descubierto también que tales administraciones disminuyen la tasa de aumento crónico de peso y dan también como resultado una disminución o reducción de peso o un peso decreciente. Otro aspecto adicional sorprendente e inesperado de la presente invención implica una mejora de la sensibilidad de los músculos a la insulina por administración oral crónica de una dosis terapéuticamente eficaz de un inhibidor de DP IV. Otra ventaja adicional de la presente invención es la posibilidad de reducir el deseo de comer de un mamífero por la administración oral crónica de una dosis terapéuticamente eficaz de un inhibidor de DP N. Otro resultado ventajoso adicional de la presente invención es el tiempo acortado para alcanzar un estado de saciedad en un mamífero después de la iniciación de la toma de alimento, efecto que es resultado de la administración oral crónica de una dosis terapéuticamente eficaz de un inhibidor de DP IV. Como resultado, es posible disminuir el nivel de obesidad en un mamífero por seguimiento de tales métodos.

Una faceta importante compartida por el OGTT, la absorción muscular de glucosa y los protocolos de perfusión del páncreas fue que la cesación del tratamiento con fármaco ocurría 18 horas antes de estos procedimientos experimentales. Por consiguiente, cualquier divergencia entre grupos reflejaba cambios duraderos a largo plazo en el estado metabólico, más bien que un efecto agudo del fármaco. La eliminación del fármaco por lavado fue confirmada por medidas de la actividad de DP IV.

Con relación al Ejemplo 9, se demostró la hidrólisis enzimática de los péptidos gastrointestinales utilizando DP IV purificada de riñón de porcino así como plasma humano que contenía actividad de DP IV. La dipeptidil-peptidasa IV es capaz de escindir los péptidos de la familia GRF que contienen Ser o Gly en posición penúltima. La especificidad de sustrato podía confirmarse en presencia de inhibidores específicos para DP IV y enzimas afines a DP IV. DP IV es responsable de la inactivación del glucagón in vivo.

Claims (6)

1. Uso de un inhibidor de la actividad enzimática de dipeptidil-peptidasa IV (DP IV) para la preparación de un medicamento para administración oral repetida con objeto de disminuir la tasa de aumento crónico de peso en un mamífero.

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 en donde el inhibidor de DP IV es un compuesto formado a partir de un aminoácido y un grupo tiazolidina o pirrolidona, o una sal del mismo.

3. El uso de acuerdo con la reivindicación 2 en donde el inhibidor de DP IV es glutaminil-pirrolidina o glutaminil-tiazolidina, o una sal del mismo.

4. Un inhibidor de la actividad enzimática de dipeptidil-peptidasa IV (DP IV) para uso en la administración oral repetida con objeto de disminuir la tasa de aumento crónico de peso en un mamífero.

5. Un inhibidor de acuerdo con la reivindicación 4 en donde el inhibidor de DP IV es un compuesto formado a partir de un aminoácido y un grupo tiazolidina o pirrolidona, o una sal del mismo.

6. Un inhibidor de acuerdo con la reivindicación 5 en donde el inhibidor de DP IV es glutaminil-pirrolidina o glutaminil-tiazolidina, o una sal del mismo.