ES2307301T3 - ANTICUERPO LO-CD2a Y USOS DEL MISMO PARA INHIBIR LA ACTIVACION Y PROLIFERACION DE CELULAS T. - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo humanizado que comprende las CDR de LO-CD2a como se define en las Figuras 31 y 42, conteniendo dicho anticuerpo humanizado en la región flanqueante de la región variable de cadena pesada del anticuerpo humanizado, los aminoácidos 47, 67, 70, 72, 76, 85, y 87, y uno, dos, tres, o cuatro de los aminoácidos 12, 13, 28, y 48 de la región variable de cadena pesada de LO-CD2a de rata como se muestra en la Figura 42.

Description

Anticuerpo LO-CD2a y usos del mismo para inhibir la activación y proliferación de células T.

Esta invención se refiere a un anticuerpo (o fragmento o derivado del mismo) y preferiblemente, a un anticuerpo (o fragmento o derivado del mismo) que se une a linfocitos humanos. Más particularmente, esta invención se refiere a prevenir y/o inhibir respuestas inmunes en desarrollo en un paciente a través de la administración de dicho anticuerpo (o fragmento o derivado del mismo) a un paciente. Preferiblemente, esta invención se refiere a prevenir o inhibir la activación y proliferación de células T a través de la administración de dicho anticuerpo o fragmento o derivado del mismo a un paciente.

La técnica anterior ha descrito la posibilidad de usar anticuerpos contra el antígeno CD2 para inhibir el rechazo de injertos. En general, la técnica anterior describe el uso de anticuerpos que se unen a antígenos CD2 como posiblemente útiles para inhibir el rechazo de injertos, véase, Ortho Pharmaceutical Corp., Patentes de Estados Unidos Nº 4.364.973; 4.614.720; 4.515.893; 4.743.681; y 4.798.806.

Schad V. et al. ("An anti-CD2 monoclonal antibody that elicits alloantigen-specific hyporesponsiveness" Transplantation Proceedings, Orlando, FL, US, Vol. 28, Nº 4, Agosto 1996 (1996-08), páginas 2051 a 2053) describe un anticuerpo monoclonal anti-CD2 no activador BTI-322 que induce insensibilidad de células T específica de antígeno que puede ser útil para la inducción de tolerancia a transplantes cuando se da en el momento de exposición inicial al injerto orgánico sólido foráneo.

Mourad et al. ("BTI-322 For acute rejection after renal transplantation", Transplantation Proceedings, Vol. 29, Nº 5, 1997, páginas 2353) sugiere usar el anticuerpo monoclonal IgG2b-anti-CD2 de rata BTI-322/LO-CD2a que se une a todas las células T humanas y asesinas naturales (NK) para el tratamiento del primer episodio de rechazo de aloinjerto renal agudo y rechazo incontrolado.

El documento EP 0 687 300 B1 se refiere a un anticuerpo LO-CD2a, un método para usar dichos anticuerpos o moléculas que se unen a una parte del mismo epítopo (o una parte del mismo) para prevenir e inhibir una respuesta inmune en pacientes humanos, preferiblemente cuando la respuesta inmune está mediada por la activación y proliferación de células T o células asesinas naturales.

L. Riechmann et al., ("Reshaping human antibodies for therapy", Nature, Vol. 332, 24 de marzo de 1988, páginas 323 a 327) describe un anticuerpo IgG1 humano que se ha reformado para seroterapia en seres humanos introduciendo las seis regiones hipervariables de los dominios variables de cadena pesada y ligera de un anticuerpo de rata dirigido contra linfocitos humanos.

No se sabe que dichos anticuerpos sean útiles para inhibir el rechazo de injertos en pacientes humanos o en primates no humanos. Como se ejemplifica en las siguientes referencias, J. V. Giorgi, et al., Immunosuppressive Effect and Immunogenicity of OKT11A Monoclonal Antibody in Monkey Allograft Recipients, Transplantation Proceedings Vol. XV Nº 1, Marzo 1983, y P. J. Thurlow, et al., A Monoclonal Anti-Pan-T-Cell Antibody, Transplantation, Vol. 36, Nº 3, Pág. 293-298.

Descripción detallada de las figuras Figura 1

Tinción de dos colores de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) con LO-CD2a biotinilado y Leu-SbPE.

Para esta tinción, se siguieron los siguientes parámetros:

1

Figura 2

Se tiñeron PBMC humanas con LO-CD2a-FITC y después a) se tiñeron con T11-PE (anticuerpo Coulter contra CD2) conjugado con ficoeritrina (PE) o b) Leu-5B-PE (anticuerpo Becton Dickinson contra CD2) conjugado con ficoeritrina (PE). En ningún caso hubo tinción por el anticuerpo secundario alterado por pretratamiento con LO-CD2a.

Figuras 3a y 3b

Efectos de LO-CD2a sobre marcadores de membrana. Se cultivaron PBMC a 2x10^{6} células/ml en ausencia (líneas continuas) o en presencia (líneas discontinuas) de LO-CD2a (200 ng/ml). En los momentos indicados en las figuras, las células se recogieron y se trataron para análisis citofluorométrico. a) y b); las PBMC se marcaron con mAb anti-CD3 (Leu-4a-FITC), anti-CD4 (T4-RD), anticuerpos monoclonales (mAb) anti-antígenos clase II (LO-DRa-FITC) o anti-CDB (T8-RD). Los controles negativos para mAb comerciales de ratón fueron alícuotas de las mismas células teñidas con IgG de ratón marcadas con FITC o rodamina. Los controles negativos para mAb de rata fueron células incubadas con suero normal de rata seguido de un anticuerpo de ratón anti-mAb de rata marcado con FITC (MARK-FITC). Los resultados se expresan como porcentaje de células positivas.

Figura 4

Efectos de LO-CD2a sobre marcadores de membrana y cultivo de linfocitos de sangre humana con y sin adición de LO-CD2a. Los cultivos de linfocitos a 1x10^{6} células/ml se marcaron con (a) mAb anti-CD2 (Leu-5b-FITC), anti-CD4 (T4-RD1), o mAb anti-CD8 (T8-RD) en los momentos indicados. Los controles negativos para mAb comerciales de ratón fueron alícuotas de las mismas células teñidas con IgG de ratón marcadas con FITC o rodamina. Los controles negativos para mAb de rata fueron células incubadas con suero normal de rata seguido de un anticuerpo de ratón anti-mAb de rata marcado con FITC (MARK-FITC). Los resultados se expresan como porcentaje de células positivas.

Figuras 5a y 5b

Efectos de LO-CD2a y Leu-5b sobre la expresión de CD2. Se incubaron PBMC humanas con a) LO-CD2a (200 ng/ml) o b) Leu-5b (dializado frente a PBS, diluido 1:2) en los momentos indicados y a) se tiñeron para la expresión de CD2 (Leu-5b-FITC y T11-RD1) y para la unión de LO-CD2a (Mark-3-FITC) o b) CD2 (LO-CD2a-FITC, T11-RD1) y para la unión de anticuerpo de cabra Leu-5b anti-ratón (GAM-FITC).

Figura 6

Efectos de LO-CD2a sobre MLR (reacción leucocitaria mixta). a) inhibición de MLR en cultivos mixtos de linfocitos incubados durante 6 días, en presencia de concentraciones crecientes de LO-CD2a añadidas a tiempo 0. Los cultivos se recogieron en el día 6; b) inhibición de MLR en cultivos mixtos de linfocitos incubados con diferentes concentraciones de LO-CD2a añadidas a tiempo 0. Los cultivos se recogieron a intervalos de 24 h; c) incorporación de ^{3}H-timidina (^{3}H-T) (cpm) por cultivos mixtos de linfocitos en ausencia (línea continua) o en presencia (línea discontinua) de LO-CD2a (200 ng/ml); d) inhibición de MLR por LO-CD2a (200 ng/ml) añadido en diferentes momentos después del inicio de la incubación. Los cultivos se recogieron en el día 6. Todos los cultivos se hicieron por triplicado (1x10^{6} células de cada donante/ml) en un volumen final de 200 \mul/pocillo. Se añadió ^{3}H-timidina 8 h antes de recoger los cultivos. Los resultados en c) se muestran como cpm x 10^{-3} incorporadas por pocillo recogidas en el momento indicado. Los resultados en a), b) y d) se expresan como porcentaje de inhibición de MLR de cultivos triplicados (media \pm S.D.), en comparación con cultivos de control (sin LO-CD2a).

Figura 7

Efectos de LO-CD2a sobre blastocitos durante MLC (cultivo leucocitario mixto). Se cultivaron células mononucleares de sangre periférica en cultivos mixtos de linfocitos con o sin la adición de 200 ng/ml de LO-CD2a. En los momentos indicados las células se retiraron y se analizaron por citometría de flujo después de teñir con anticuerpo contra CD2 (Leu5b-FITC). Los blastocitos se abrieron por dispersión directa y lateral y la expresión de los marcadores indicados se cuantificó sobre los blastocitos.

Figuras 8a y 8b

Efectos de LO-CD2a sobre células en reposo durante MLC. Se cultivaron linfocitos humanos con y sin la adición de LO-CD2a (200 ng/ml). En los momentos indicados las células se retiraron y se tiñeron para CD3 (Leu 4a-FITC), CD4 (T4-RD1), CD8 (T8-RD1) o CD25 (LO-TACT-1-FITC). Los linfocitos en reposo se identificaron por abertura diferencial para el tamaño y la granularidad y los resultados se expresan como el porcentaje de linfocitos en reposo total que se tiñen con el anticuerpo indicado. (Figura 8a). El porcentaje de células en reposo teñidas positivamente por Leu-5b en cultivos con y sin LO-CD2a se muestra en la Figura 8b.

Figura 9

Efectos de LO-CD2a sobe linfocitos estimulados por mitógenos. Se cultivaron PBMC durante 96 h en ausencia o en presencia de OKT3 (100 ng/ml), Con-A (10 \mug/ml) y PHA (1 \mug/ ml). En cultivos paralelos, se añadió LO-CD2a (200 ng/ml) 1 h después de los mitógenos (barras grises) o 1 h antes de los mitógenos (barras blancas). Las barras a cuadros representan cultivos realizados en presencia de LO-CD2a solo. Los cultivos (por triplicado) se marcaron por pulsos con ^{3}H-timidina durante las últimas 8 h de incubación.

Figura 10

Efectos de LO-CD2a sobre la activación dirigida por mitógenos de PBMC. Se cultivaron las PBMC de dos donantes durante 96 h en presencia de OKT3 (100 ng/ml), CON-A (10 \mug/ml) y PHA (1 \mug/ml). En cultivos paralelos, se añadió LO-CD2a (200 ng/ml) en el Día 0 (0 h) después del inicio del cultivo, Día 1 (24 h), o Día 2 (48 h). El gráfico representa el porcentaje de inhibición por LO-CD2a de la proliferación inducida por mitógenos en cada donante.

Figuras 11a y 11b

Inhibición de la actividad NK por incubación de las células efectoras y diana (células K562 marcadas con ^{51}CR) en presencia de LO-CD2a. Se han ensayado tres concentraciones de LO-CD2a: 5 \mug/ml, 1 \mug/ml, 0,5 \mug/ml. Las células efectoras eran linfocitos de sangre periférica de actividad NK expresada como el porcentaje de lisis de células diana marcadas. Se ensayaron dos sujetos normales a 3 proporciones efector/diana E/T: 200/1, 200/1, 50/1.

Figura 12

Linfocitos totales por \mul de sangre periférica de un mono cynomolgus que recibió 20 mg/día de LO-CD2a durante 10 días (días 0-9).

Figura 13

Las PBMC del mono cynomolgus que recibió LO-CD2a a 20 mg/día durante 10 días (día 0 a 9) se tiñeron con anticuerpos monoclonales contra CD2 (Leu-5b), CD4 (Leu3a), CD8 (Leu2a), células asesinas naturales (CD8 y CDIIb), y células B (anti-IgM) en los días indicados y se analizaron por citometría de flujo. Los resultados se presentan como el porcentaje de la cantidad total de células en tinción por microlitro de sangre.

Figura 14

Actividad NK de un mono cynomolgus que recibió 20 mg/día de LO-CD2a durante 10 días (día 0-9). La actividad NK se ensayó en los días 11 y 22 y se presentó como % de lisis a E/T de 25/1, 50/1 y 100/1.

Figura 15

Concentración en suero de LO-CD-2a de un mono cynomolgus que recibió el anticuerpo a 20 mg/día durante 10 días (día 0-9). El anticuerpo monoclonal se midió por ELISA como se describe en el texto y se expresó en \mug/ml.

Figura 16

Desarrollo de anticuerpo IgG contra LO-CD2a en un mono cynomolgus que recibió 20 mg/día de LO-CD2a durante 10 días (días 0-9). El anticuerpo contra el anticuerpo monoclonal se midió en diluciones seriadas de suero extraído en los días indicados por el ELISA tipo sándwich descrito en el texto y se expresa como la densidad óptica a 492 nm.

Figuras 17a y 17b

Efecto de LO-CD2a sobre linfocitos de babuino.

a) En los días indicados se obtuvo sangre del babuino y las células se tiñeron con los anticuerpos anti-CD2 T11-RD1 y Leu-5b-FITC, LO-CD2a y MARK3-FITC, un anticuerpo de ratón anti-kappa 1b de rata acoplado a FITC para detectar LO-CD2a unido.

b) Las muestras séricas tomadas en los días indicados se evaluaron para los niveles de LO-CD2a por ELISA.

Figuras 18a y 18b

Efecto de LO-CD2a sobre linfocitos de babuino. En los días indicados se tomó sangre y las células se tiñeron para detectar LO-CD2a unido con MARK3-FITC y MARR2b-8-biotina (un anticuerpo monoclonal de ratón anti-IgG2b de rata acoplado a biotina) detectado con estreptavidina acoplada a PE.

a) Sin pretratamiento de células;

b) Incubación con 2,5 \mug/ml de LO-CD2a antes de la tinción para detectar cualquier sitio no ocupado por anticuerpos en circulación.

Figura 19

Efecto de LO-CD2a sobre linfocitos de babuino. En los días indicados se tomaron muestras de sangre y se tiñeron con T4-RD1 (CD4); T8-RD1 (CD8) o MARK3-FITC (LO-CD2a unido).

Figura 20

Leucocitos, linfocitos y creatinina en el paciente Nº 1 tratado con ATG después LO-CD2a para rechazo de aloinjerto.

Figura 21

Niveles séricos de LO-CD2a durante y después del tratamiento en el paciente Nº 1.

Figura 22

Creatinina en el paciente Nº 2 antes de, durante y después del tratamiento con LO-CD2a.

Figura 23

Recuentos de leucocitos y linfocitos en el paciente Nº 2 antes de, durante y después del tratamiento con LO-CD2a.

Figura 24

Niveles séricos de LO-CD2a en el paciente Nº 2, extraídos justo antes de y 2,5 horas después de cada inyección.

Figura 25

Recuento de leucocitos, recuento de linfocitos y nivel de creatinina sérica en el paciente Nº 3 que recibió LO-CD2a para rechazo de aloinjerto renal.

Figura 26

Tinción de color doble con LO-CD2a y (2) Leu5b, (3) Leu 4(CD3), (4) Leu3a (CD4), (5) Leu2b (CD8) y (6) Leu11 (anti-CD16) un marcador para células NK. La unión de LO-CD2a se detectó con anticuerpo de cabra anti-Ig de rata-FITC. El conjunto superior (1-6) de histogramas de dos colores muestra la doble tinción. El conjunto inferior (7-12) muestra tinción sencilla con cada anticuerpo.

Figura 27

Tinción de dos colores de PBL humanos con un control de isotipo de rata para LO-CD2a (Pharmingen, IgG2b de rata purificada, kappa) o LO-CD2a y anticuerpos conjugados con ficoeritrina contra CD4 (c, d), CD8 (e, f), CD16 (g, h), CD19 (i, j) y CD2 (k, I). LO-CD2a y el control de isotipo se detectaron con F(ab')2 purificado por afinidad anti-inmunoglobulina de rata conjugado con FITC (Biotecnología Southern). Los anticuerpos contra los antígenos CD eran todos anticuerpos conjugados con ficoeritrina obtenidos de Becton-Dickinson [CD4 (Leu3a), CD8 (Leu2a), CD16 (Leu-11b), CD19 (Leu 12) y CD2 (Leu5b)]. La tinción en cada caso con el control de isotipo se muestra en el primer histograma y el LO-CD2a en el segundo histograma. El histograma a muestra el patrón con el control de isotipo y b con LO-CD2a.

Figura 28

Análisis citofluorográfico de la tinción de células COS transfectadas con CD2 de tipo silvestre. Los paneles de la izquierda muestran los histogramas de tinción de una célula COS transfectada con el vector de control, que no contienen CD2; el conjunto de paneles de la derecha la tinción de una célula COS transfectada de forma transitoria con un vector que contiene la molécula CD2 completa. En cada conjunto el histograma de la parte superior muestra la tinción con W632 murino (anticuerpo contra la Clase I, que se sabe que se expresa por células COS) y 76-2-11 (un control de isotipo para el W632 murino); el panel central muestra la tinción con Leu5b (anti-CD2 de Becton Dickinson) y 76-2-11, un control de isotipo coincidente para tinción con Leu5b, el panel inferior la tinción con LO-CD2a y un control de isotipo coincidente de rata para LO-CD2a.

Figura 29

Secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la cadena V_{L} de LO-CD2a quimérico.

Figura 30

Secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la cadena V_{H} de LO-CD2a quimérico.

Figura 31

Secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de LO-CD2a de rata, HUM5400 humano, y LO-CD2a humanizado.

Figura 32

Secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de LO-CD2a humanizado.

Figura 33

Secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de LO-CD2a de rata, Amu5-3 humano, y LO-CD2a humanizado.

Figura 34

Secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de cadena pesada de LO-CD2a humanizado.

Figura 35

Unión de LO-CD2a de rata, LO-CD2a humanizado a células Jurkat.

Figura 36

Inducción de hiposensibilidad in vitro por LO-CD2a de rata, LO-CD2a humanizado, e inmunoglobulinas de rata y humanas de control.

Figuras 37A, 37B, y 37C

Inhibición de MLR primaria por LO-CD2a y respuesta de células T cultivadas con LO-CD2a en una MLR primaria contra un antígeno en una MLR secundaria o un tercer estimulador en una MLR.

Figuras 38A y 38B

Respuesta de células T cultivadas con LO-CD2a en una MLR primaria contra un antígeno en una MLR secundaria o contra toxoide tetánico en cultivos secundarios.

Figura 39

Efecto del fragmento F(ab')_{2} de LO-CD2a sobre una MLR.

Figura 40

Comparación de las propiedades inhibidoras de anticuerpo LO-CD2a intacto con el fragmento F(ab')_{2} de LO-CD2a sobre la proliferación de PBMC por OKT3 soluble.

Figura 41

Efecto de APC sobre las propiedades inhibidoras de LO-CD2a sobre la proliferación inducida por OKT3 unido a placa.

Figura 42

Secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de LO-CD2a de rata, el anticuerpo MEDI-507 humanizado, y Amu5-3 humano.

Figura 43

Mapas plasmídicos de hcmv-VIIys-kr-neo y hcmv-VhLys-gammal-neo.

Figura 44

Mapas plasmídicos de pEE6hCMV-B y pEE12.

Figura 45

Comparación de LO-CD2a de rata con el anticuerpo MEDI-507 humanizado en un ensayo de unión basado en células Jurkat.

Figura 46

Comparación de la capacidad de LO-CD2a de rata, anticuerpo MEDI-507 humanizado, e IgG humana de inhibir una reacción linfocitaria mixta. La respuesta MLR de un par respondedor/estimulador se muestra como un ejemplo de inhibición relativa de la respuesta por LO-CD2a de rata o MEDI-507. IgG2b de rata o IgG humana son los controles de isotipo.

Figura 47

Comparación de LO-CD2a de rata y el anticuerpo MEDI-507 humanizado en un ensayo de hiposensibilidad. En resumen, se realizaron MLR de 7 días masivas en placas de 6 pocillos en presencia de LO-CD2a de rata, MEDI-507, o IgG de rata o humana de control. Los cultivos se sedimentaron en Ficoll para retirar las células muertas y se dejaron reposar en los medios durante 3 a 4 días. Las células después se evaluaron para su capacidad de proliferar contra una segunda estimulación con el aloestimulador original. Se muestra el porcentaje de control de esa proliferación relativo a un cultivo reestimulado de una MLR primaria que no recibió anticuerpo exógeno. Este cultivo de tratamiento en "medios" se toma como una respuesta del 100%.

Figura 48

Comparación del efecto de LO-CD2a de rata y anticuerpo MEDI-507 humanizado sobre los recuentos de células CD2.

Descripción detallada

De acuerdo con la presente invención se proporciona un anticuerpo como se define en la reivindicación 1.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona una molécula (preferiblemente un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo) que se une al mismo epítopo (o una parte del mismo) en linfocitos humanos que el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular depositada como Depósito ATCC Nº HB11423. El anticuerpo que se produce por la línea celular depositada a veces se menciona a partir de ahora como LO-CD2a. La expresión "molécula" o "anticuerpo que se une al mismo epítopo que LO-CD2a" incluye LO-CD2a. El término "LO-CD2a" incluye el anticuerpo producido por la línea celular depositada ATCC HB 11423 y aquellos idénticos al mismo que pueden producirse, por ejemplo, por tecnología recombinante.

Las moléculas o anticuerpos de la presente invención inhiben la activación y proliferación de células T humanas y se ha descubierto que dicha inhibición puede realizarse cuando se añade la molécula o anticuerpo antes o después de un agente que estimule la activación de células T.

Las moléculas o anticuerpos de la presente invención tienen las características de unión a un epítopo de un antígeno CD2 (células T humanas CD2 positivas) pero tiene que entenderse, sin embargo, que la capacidad de dichas moléculas o anticuerpos de inhibir la activación o proliferación de células T puede realizarse o no a través de la unión a células CD2 positivas, aunque se cree actualmente que el mecanismo de acción implica la unión de la molécula o anticuerpo a células CD2 positivas.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona el uso de un anticuerpo para la preparación de un medicamento para prevenir y/o inhibir la respuesta inmune en desarrollo en pacientes humanos a través de la administración al paciente de un anticuerpo, como se define en la reivindicación 1.

Una línea celular que produce LO-CD2a, se depositó el 28 de julio de 1993, en la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, y se le dio el número ATCC de acceso ATCC HB 11423. Dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal de rata.

Aunque sin el deseo de limitar la invención a ningún razonamiento teórico, se cree que el mecanismo que posibilita que el anticuerpo monoclonal de esta invención prevenga o reduzca la gravedad de una respuesta inmune, e inhiba la activación y proliferación de células T, es el hecho de que el anticuerpo LO-CD2a disminuye la densidad de CD2 expresado en las superficies de las células T y por tanto disminuye la cantidad de linfocitos T CD2+; y/o afecta a la transducción de señales. Se cree que estos mecanismos de acción son responsables no solamente de la prevención de la respuesta inmune, sino también de la reducción en la gravedad de las respuestas inmunes en desarrollo. Además, el anticuerpo LO-CD2a inhibe la actividad de las células asesinas naturales (NK) in vitro como se ejemplifica en este documento. Esto está relacionado con la presente invención ya que se cree que un mecanismo citotóxico no restringido por MHC tal como la actividad de las células NK se ha implicado en enfermedad de injerto contra hospedador.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención se proporciona el uso de una molécula para inhibir la activación inicial o adicional y la proliferación de células T en un paciente humano administrado al paciente una cantidad eficaz de un anticuerpo que se une al mismo epítopo (o cualquier parte del mismo) en linfocitos humanos que el anticuerpo LO-CD2a. La molécula es un anticuerpo humanizado como se define en la reivindicación 1. Dicha molécula contendría, por ejemplo, la misma región determinante de complementariedad (CDR) que el anticuerpo LO-CD2a.

El término "inhibir" como se usa en todo este documento pretende indicar prevención, o inhibición, o reducción en la gravedad, o inducción de tolerancia a, o reversión del rechazo de injerto. El término "injerto" como se usa en este documento para propósitos de esta solicitud significa todos y cada uno de los transplantes, incluyendo, aunque sin limitación, transplante de aloinjerto y xenoinjerto. Dicho transplante puede incluir, a modo de ejemplo, aunque sin limitación, transplante de células, médula ósea, tejido, órganos sólidos, hueso.

La expresión "respuesta(s) inmune(s)" como se usa en este documento pretende indicar respuestas inmunes que dependen de la activación y proliferación de células T que incluye tanto efectos celulares como anticuerpos dependientes de células T que pueden provocarse en respuesta a, a modo de ejemplo y sin limitación: (i) injertos, (ii) enfermedad de injerto contra hospedador, y (iii) autoantígenos producidos en enfermedades autoinmunes, que a modo de ejemplo incluyen, aunque sin limitación, artritis reumatoide, lupus sistémico, esclerosis múltiple, diabetes mellitus.

La molécula empleada en la presente invención es una que se une al mismo epítopo (o una parte de ese epítopo) que el anticuerpo monoclonal LO-CD2a. La expresión "se une al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal LO-CD2a" pretende describir no solamente el anticuerpo monoclonal LO-CD2a sino que también describe otros anticuerpos, fragmentos o derivados de los mismos o moléculas que se unen a ese mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal LO-CD2a.

Dichos otros anticuerpos incluyen a modo de ejemplo y sin limitación anticuerpos de rata, murinos, porcinos, bovinos, humanos, quiméricos, humanizados, o fragmentos o derivados de los mismos.

El término "derivado" como se usa en este documento significa un anticuerpo quimérico o humanizado, anticuerpo de cadena sencilla, anticuerpo biespecífico u otro de dichos anticuerpos que se una al mismo epítopo (o una parte del mismo) reconocido por el anticuerpo monoclonal LO-CD2a.

El término "fragmento" como se usa en este documento significa una parte de un anticuerpo, a modo de ejemplo, dichas partes de anticuerpos incluirán, aunque sin limitación, CDR, Fab, u otras partes, que se unan al mismo epítopo o cualquier parte del mismo reconocido por LO-CD2a.

El término "anticuerpo" como se usa en este documento incluye anticuerpos policlonales, monoclonales así como fragmentos de anticuerpos, derivados así como anticuerpos preparados por técnicas recombinantes, tales como anticuerpos quiméricos o humanizados, anticuerpos de cadena sencilla o biespecíficos que se unen al mismo epítopo o una parte del mismo reconocido por el anticuerpo monoclonal LO-CD2a. El término "moléculas" incluye a modo de ejemplo y sin limitación, péptidos, oligonucleótidos o otros compuestos derivados de cualquier fuente que imite al anticuerpo o se una al mismo epítopo o una parte del mismo que el fragmento de anticuerpo o derivado del mismo.

Otra realización de la presente invención proporciona un método para tratar a un paciente que tiene que recibir o ha recibido un transplante de injerto con una cantidad eficaz de un anticuerpo como se define en la reivindicación 1.

Un anticuerpo monoclonal de esta invención como se ha descrito anteriormente en este documento puede producirse por técnicas conocidas en la técnica tal como se describe por Kohler y Milstein (Nature 256; Pág. 495-497, 1975) así como las técnicas descritas en este documento. La preparación de un anticuerpo monoclonal LO-CD2a se describe con más detalle en el Ejemplo 1 de esta solicitud. Como se ha indicado anteriormente en este documento los anticuerpos LO-CD2a también pueden producirse por técnicas recombinantes usando procedimientos conocidos en la técnica. El anticuerpo de acuerdo con la presente invención comprende restos aminoacídicos de las regiones flanqueantes de las regiones variables de cadena ligera y pesada de las regiones flanqueantes de LO-CD2a de rata como se define en la reivindicación 1. Dichos restos de las regiones flanqueantes de rata se retienen en el anticuerpo humanizado porque dichos restos pueden mantener la especificidad de unión de LO-CD2a. Por tanto, en la producción de un anticuerpo humanizado, de acuerdo con un aspecto preferido de la invención, las CDR de un anticuerpo humano se remplazan con las CDR de LO-CD2a con el factor añadido de que ciertos aminoácidos de la parte variable de cadena ligera de LO-CD2a en particular de FR1, FR2 y FR3 y ciertos aminoácidos de la parte variable de cadena pesada de LO-CD2a en particular de FR-2 y FR-3 se retienen al construir el anticuerpo humanizado; es decir, los aminoácidos correspondientes de la región flanqueante humana se remplazan con los aminoácidos indicados de la región flanqueante de LO-CD2a de rata. Como se indica con respecto a la Figura 31, los aminoácidos 9, 12, 41, 42, 50, 51 y 82 de la región flanqueante de la región variable de cadena ligera de LO-CD2a de rata se retienen y como se indica en la Figura 33, los aminoácidos 47, 67, 70, 72, 76, 85 y 87 en la región flanqueante de la región variable de cadena pesada de LO-CD2a de rata se retienen en un anticuerpo humanizado. Se da una realización específica de la construcción de dicho anticuerpo humanizado en el Ejemplo 7 a continuación en este documento.

En otra realización, en el anticuerpo humanizado, en la parte variable de cadena pesada, ciertos aminoácidos de las regiones FR1, FR2, y FR3 se retienen al construir el anticuerpo humanizado. En particular, como se indica en la Figura 42, los aminoácidos 47, 67, 70, 72, 76, 85, y 87, y uno, dos, tres, o cuatro de los aminoácidos 12, 13, 28, y 48 de la región flanqueante de la parte variable de cadena pesada de LO-CD2a de rata se retienen en el anticuerpo humanizado. En una realización preferida, los aminoácidos 12, 13, 28, 47, 48, 67, 70, 72, 76, 85, y 87 de la región flanqueante de la parte variable de cadena pesada de LO-CD2a de rata se retienen en el anticuerpo humanizado. En otra realización preferida, además de la retención de los aminoácidos mencionados anteriormente en la región flanqueante de la parte variable de cadena pesada de LO-CD2a de rata en el anticuerpo humanizado, el anticuerpo humanizado contiene adicionalmente en la región flanqueante de la región variable de cadena ligera del anticuerpo humanizado, uno o más de los aminoácidos 9, 12, 41, 42, 50, 51, y 82 de la región variable de cadena ligera de LO-CD2a de rata como se muestra en la Figura 31. Preferiblemente, cada uno de los aminoácidos 9, 12, 41, 42, 50, 51, y 82 de la región flanqueante de la parte variable de cadena ligera de LO-CD2a de rata se retienen en el anticuerpo humanizado.

En una realización más preferida, el anticuerpo humanizado contiene en la región flanqueante de la región variable de cadena pesada del anticuerpo humanizado, los aminoácidos 12, 13, 28, 47, 48, 67, 70, 72, 76, 85, y 87 de la región variable de cadena pesada de LO-CD2a de rata como se muestra en la Figura 42. El anticuerpo humanizado también contiene en la región flanqueante de la región variable de cadena ligera del anticuerpo humanizado, los aminoácidos 9, 12, 41, 42, 50, 51, y 82 de la región variable de cadena ligera de LO-CD2a de rata como se muestra en la Figura 31. Dicho anticuerpo a veces se menciona a partir de ahora en este documento como MEDI-507, cuya construcción se detalla en el Ejemplo 11 a continuación en este documento.

El anticuerpo o molécula de esta invención preferiblemente: (i) se une a todos los linfocitos T y también a células nulas pero no a linfocitos B como se muestra por la tinción de dos colores de los linfocitos analizados por citometría de flujo (Figuras 26 y 27); (ii) se une a todas las células T (como se determina por tinción con el anticuerpo Leu4 anti-CD3), todas las células CD4 y CD8 positivas como se define por los anticuerpos Leu3a y Leu2b respectivamente y algunos linfocitos que son CD3 negativos (células nulas); (iv) se une a células nulas como se corrobora por la tinción de células CD16 positivas que se detectan con Leu11, un marcador para células NK (Figura 26); la tinción de células B, como se define por unión anti-CD19, no se observó con LO-CD2a. (Figura 27). El anticuerpo LO-CD2a preferiblemente también tiene la característica de que el anticuerpo se une a células nulas humanas, y por tinción doble tienen mayor intensidad de tinción a células humanas que son tanto CD2+ como CD4+ que a células humanas que son tanto CD2+ como CD16+, y tiene mayor intensidad de tinción de células humanas que son tanto CD2+ como CD8+ que a células humanas que son tanto CD2+ como CD16+.

Que Lo-CD2a se une a CD2 se confirmó por expresión transitoria de CD2 en células COS.

Se transfectaron transitoriamente células COS con el plásmido \piH3MCD2 que contiene el gen que codifica la molécula CD2 completa, como se describe en Peterson A. y Seed B., Nature Volumen 329, 29/10/87, pág. 842-846.

La transfección se consiguió por el método de DEAE-dextrano. Las células se recogieron y se tiñeron con el anticuerpo monoclonal Leu5b anti-CD2 (Becton-Dickinson) y LO-CD2a, con W632 murino, un anticuerpo contra MHC clase I como control positivo para la tinción y con los controles de isotipo coincidente correspondientes. Las especificidad de la reactividad se confirmó evaluando la unión del mismo panel de anticuerpos monoclonales sobre células COS transfectadas con un plásmido irrelevante.

El patrón de tinción de estos anticuerpos monoclonales sobre CD2 nativo expresado transitoriamente (Figura 28) indica que la transfección con CD2 conducía a la unión de ambos anticuerpos, lo que apoya la capacidad de LO-CD2a de unirse a CD2.

La preparación de un anticuerpo monoclonal LO-CD2a adecuado para los propósitos de la presente invención debe ser evidente para los especialistas en la técnica a partir de los contenidos de este documento.

Un anticuerpo como se define en la reivindicación 1 puede administrarse in vivo de acuerdo con la presente invención para inhibir la activación y proliferación de células T, y disminuir la densidad de la expresión de CD2 sobre la superficie celular y por tanto reducir la cantidad de linfocitos T CD2+.

Por tanto, por ejemplo, en un procedimiento in vivo, dichos anticuerpos LO-CD2a se administran para prevenir y/o inhibir la respuesta inmune y por tanto para inhibir la activación y proliferación de células T.

Un anticuerpo como se define en la reivindicación 1 puede administrarse ex vivo de acuerdo con la presente invención para disminuir la densidad de la expresión CD2+ sobre la superficie celular y por tanto para reducir la cantidad de células CD2+ de las células donantes. A modo de ejemplo y sin limitación, en un procedimiento ex vivo, dichos anticuerpos se infundirían en médula ósea donante antes del transplante para prevenir la aparición de enfermedad de injerto contra hospedador después del transplante.

En dicha técnica in vivo o ex vivo, el anticuerpo se administrará en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como ejemplos representativos de dichos vehículos, pueden mencionarse solución salina normal, tampones, etc. Dichos vehículos farmacéuticos son bien conocidos en la técnica y la selección de un vehículo adecuado se considera que está dentro del alcance de los especialistas en la técnica a partir de las enseñanzas contenidas en este documento.

El anticuerpo como se define en al reivindicación 1 puede administrarse in vivo por vía intravenosa o por administración intramuscular.

Como se ha indicado anteriormente en este documento, el anticuerpo de la presente invención se administra in vivo en una cantidad eficaz para inhibir el rechazo de injertos. La expresión "una cantidad eficaz" para propósitos de esta solicitud significará que la cantidad de anticuerpo monoclonal capaz de producir el efecto deseado, es decir; la inhibición del rechazo de injertos o la inhibición de la activación de células T. En general, dicho anticuerpo se administra en una cantidad de al menos 1 mg. Debe entenderse que podrían usarse cantidades inferiores. Además, después del tratamiento inicial, pueden reducirse las cantidades descritas anteriormente en este documento para tratamientos posteriores, si los hay. Por tanto, el alcance de la invención no se limita por dichas cantidades.

De acuerdo con la presente realización, dichos anticuerpos se administran para mantener la inhibición de la activación de células T y el rechazo de injertos. Por tanto, a modo de ejemplo y sin limitación, el anticuerpo puede administrarse por infusión intravenosa durante un periodo de una a dos horas en una cantidad de aproximadamente 1 mg/dosis a aproximadamente 50 mg/dosis en una suspensión de vehículo fisiológicamente aceptable una o dos veces al día durante un periodo de aproximadamente ocho días o más, según sea necesario. Dicho tratamiento para el rechazo de injertos se inicia preferiblemente en, o inmediatamente antes de, o poco después del transplante o cuando sucede el rechazo de injerto. El tratamiento podría darse una o dos veces al día durante tan sólo uno o dos días cuando se inicia en el momento del transplante para inducir un estado hiposensible selectivo al transplante. Dicho tratamiento para enfermedades autoinmunes con respecto a la administración del anticuerpo o fragmento o derivado del mismo o molécula de acuerdo con la presente invención se comienza cuando el médico que atiende ha determinado que es deseable inhibir una respuesta inmune patológica.

Por tanto, de acuerdo con un aspecto de la presente invención, administrando un anticuerpo de acuerdo con la invención en el momento del transplante y en la mayoría de los casos durante un corto periodo después del mismo puede inducirse una hiposensibilidad al tejido u órgano transplantado, por lo tanto para prevenir o inhibir episodios adicionales de rechazo.

Las técnicas de la presente invención para inhibir la activación de células T pueden emplearse solas o en combinación con otras técnicas, fármacos o compuestos para inhibir la activación de células T o inhibir el rechazo de injertos o enfermedad de injerto contra hospedador.

La invención se describirá adicionalmente con respecto a los siguientes ejemplos, que son ilustrativos y que no pretenden limitar el alcance de la invención.

Las células, cultivos, mAb y mitógenos usados en los ejemplos pueden prepararse y usarse por procesos y procedimientos conocidos y practicados por los especialistas en la técnica. A continuación hay un ejemplo de un proceso o procedimiento que puede usarse para la preparación y uso de las células, cultivos, mAb y mitógenos usados en los siguientes ejemplos.

Células y cultivos

Las PBMC se obtuvieron por sedimentación en Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Suecia) de sangre heparinizada obtenida del Centro de Donantes de Sangre local. Las PBMC aisladas se resuspendieron en medio enriquecido: medio RPMI 1640 (Gibco, Bélgica), suplementado con 100 U/ml de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina, L-Glutamina 20 mM, y suero AB humano combinado al 20% o suero de ternera fetal inactivado por calor al 15%. Las PBMC se cultivaron a 1x10^{5} células/pocillo en microplacas de 96 pocillos en forma de U (Falcon) en un volumen final de 200 \mul de medio de cultivo/pocillo. Se realizaron MLC bidireccionales con 1x10^{5} células de cada donante/pocillo en el mismo volumen de medio de cultivo como se ha indicado anteriormente. Todos los cultivos se hicieron por triplicado. Ocho horas antes de los momentos indicados en los resultados, los cultivos se marcaron por pulsos con 2,0 \muCi/pocillo de ^{3}H-T (Amersham, Bélgica; 247,9 GBq/mmol; 6,7 Ci/mmol) y se cuantificó el radioisótopo incorporado en los cultivos por centelleo líquido en un contador Beta (Beckman L5 6000 SE). El porcentaje de inhibición se calculo del siguiente modo: % de Inhibición = [1 - (cpm medias de cultivo ensayado/cpm medias de cultivo de control)] x 100. Todos los resultados se expresan como la media de tres cultivos independientes. La desviación típica siempre fue menos del 15% de la media, excepto para aquellos casos donde estos valores se indican en los gráficos.

Se realizaron análisis citofluorométricos usando un citofluorógrafo FACScan (Becton Dickinson) con un hardware Hewlett-Packard equipado con el programa Consort 30. Fue posible el análisis independiente de tinción de linfocitos y blastocitos usando abertura diferencial que se define por el tamaño y granularidad. Se analizaron 25.000 acontecimientos para cada muestra. En estos experimentos, la concentración final de LO-CD2a fue de 200 ng/ml, excepto cuando se indica.

Mab y Mitógenos

LO-DRA y LO-Tact-1 (ambos marcados con FITC), son mAb de rata producidos en este laboratorio (op. cit. H. Bazin (Ed) 1990 pág. 287). LO-Tact-1 está dirigido contra la cadena p55 del receptor de IL-2 (op. cit. H. Bazin Immunol. 1984 y Janszen, M., Buck, D. y Maino, V.C. en Leucocyte Typing IV White Cell Differentiation Antigens, W. Knapp (ED), Oxford University Press, 1989, pág. 403). Se obtuvieron mAb de ratón anti-CD2 humano y anti-CD3 (Leu-5b y Leu-4a marcado con FITC) de Becton Dickinson (Bélgica). Se obtuvieron mAb de ratón anti-CD4 humano o anti-CD8 humano (marcados con ficoeritrina), e IgG de ratón marcado con FITC o ficoeritrina (controles negativos) de Coulter. Se usó OKT3 (Ortho-Cilag, Bélgica) a una concentración final de 100 ng/ml. Se usaron Fitohemaglutinina A (PHA; Wellcome Labs, RU) y Concanavalina A (Con A; Calbiochem Co., EEUU) a una concentración final de 1 y 10 \mug/ml, respectivamente.

Biotinilación de LO-CD2a. La concentración de LO-CD2a purificado se ajustó a 1 mg/ml en tampón bicarbonato sódico 0,1 M, pH 8,4. Se disolvió NHS-biotina (Boehringer Mannheim 1008 960) en DMSO a una concentración de 1,5 mg/ml. Para cada MAB, se añadió 0,1 ml de solución de NHS-biotina. La mezcla se rotó durante 2 h. a temperatura ambiente. La reacción se completó añadiendo 0,1 ml de tris-HCl 2 M, pH 8,0, por cada ml de anticuerpo (10 minutos a temperatura ambiente), seguido de 1 ml de BSA al 1% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) por cada ml de anticuerpo. Para retirar la biotina libre, la solución se dializó durante una noche a 4ºC en 1000 volúmenes de PBS. Tanto la reacción de biotinilación como el mAb conjugado se protegieron de la luz cubriéndolos con una lámina de aluminio.

Lisis de glóbulos rojos (RBC). Se retiraron las RBC de sangre completa por lisis con cloruro de amonio. Se preparó una solución madre 10X que constaba de 90 g de NH_{4}Cl, 10 g de KHCO_{3}, 370 mg de EDTA, y H_{2}O hasta un volumen de 100 ml. Se añadieron cuarenta ml de cloruro de amonio 1X a cada 10 ml de sangre y se incubaron durante 10 min. a temperatura ambiente. La mezcla después se centrifugó a 1200 rpm durante 10 min. y el sedimento se resuspendió en 10 ml de PBS con azida al 0,1%.

Tinción de sangre periférica. La tinción se realizó en placas de grupos de 96 pocillos de fondo redondo (Costar Nº 3790) a 4ºC. Para la tinción con un único color, se diluyeron apropiadamente diez \mul de mAb en PBS que contenía 0,2 mg de inmunoglobulina humana y se añadieron a cada pocillo. La sangre desprovista de glóbulos rojos se distribuyó en placas a un volumen de 90 \mul por pocillo. Las células y los mAb se mezclaron golpeteo suave y se incubaron 30 min. Se añadieron cincuenta \mul de PBS frío a cada pocillo y las placas se centrifugaron a 1900 rpm durante 2 min. Se desechó el sobrenadante por inversión y moviendo rápidamente de forma suave la placa. Las células se dispersaron golpeando la placa en el contador. El procedimiento de lavado se repitió dos veces añadiendo 200 \mul de PBS frío. Se añadieron diez \mul de una dilución 1/20 de F(ab')_{2} de cabra anti-Ig de rata-FITC a las células dispersadas en cada pocillo y se incubaron durante 30 min. en la oscuridad. Las células se lavaron por la adición de 180 \mul de PBS frío a cada pocillo seguido de centrifugación a 1900 rpm durante 2 min. El sobrenadante se desechó, las células se dispersaron, y se añadieron 200 \mul de paraformaldehído al 0,5% frío a cada pocillo. Las células se transfirieron a tubos (Falcon Nº 2054) y se diluyeron a aproximadamente 0,5 ml con paraformaldehído al 0,5%. Las muestras se evaluaron en una máquina Becton-Dickinson FACScan usando el software LYSIS II.

La tinción de color doble se realizó por un protocolo similar. Después de que las células se incubaran con el mAb primario y el reactivo anti-rata conjugado con FITC, se añadió una dilución 1/5 de suero normal de ratón para bloquear cualquier sitio restante en el reactivo anti-rata. Después de una incubación de 15 min. (sin lavado), se añadieron 20 \mul de un mAb marcado con PE específico para un determinante CD conocido y se incubaron durante 30 min. Las células se lavaron y se fijaron como se ha descrito para la tinción sencilla.

Ejemplo 1

LO-CD2a es un anticuerpo monoclonal de rata (IgG2b-Kappa) anti-CD2 producido y caracterizado en este laboratorio como se indica en otra parte (Véanse las siguientes referencias: Xia, H., Ravoet, A.M. Latinne, D., Ninanne, J., De Bruyere, M., Sokal, G. y Bazin, H., en H. Bazin (Ed), Rat Hybridomas and Rat Monoclonal Antibodies, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida 1990, pág. 309 y Ravoet, A.M. Latinne, D., Seghers, J., Manouvriez, P., Ninanne, J., DeBruyere, M., Bazin, H. y Sokal, G. en H. Bazin (Ed) Rat Hybridomas and Rat Monoclonal Antibodies, CRC Press Inc., Boca Raton, Florida, 1990, pág. 287). Se purificó LO-CD2a de fluido ascítico por cromatografía de inmunoafinidad aprovechando la ventaja de la diferencia alotípica existente entre las inmunoglobulinas de la rata que recibe el hibridoma productos y el mAb secretado por el último (Bazin, H., Cormont F. y DeClercq, L. J. Immunol. Method., 1984, 71:9). Reconoce la población total teñida por el mAb de ratón Leu-5b (marcado con FITC) de la Figura 1 y aproximadamente el 90% de la población marcada por el mAb T11 de ratón (marcado con rodamina) ((datos no mostrados). El epítopo reconocido por LO-CD2a en la molécula CD2, es diferente de los epítopos reconocidos por los mAb de ratón anti-CD2 Leu-5b y T11 (Figura 2).

Ejemplo 2 LO-CD2a muestra efectos moduladores pero no mitogénicos sobre PBMC

Para determinar los efectos del mAb de rata LO-CD2a sobre linfocitos en reposo, se incubaron PBMC en presencia de concentraciones crecientes de este mAb. Como puede observarse en el Apéndice 1, las PBMC incubadas durante 6 días en presencia de LO-CD2a no muestran variaciones significativas en la velocidad de incorporación de ^{3}H-T en comparación con cultivos de control. La viabilidad celular al final de este periodo fue variable pero promediaba aproximadamente el 80% como se evalúa por exclusión de azul tripán. Cuando se incubaron PBMC en reposo en presencia de LO-CD2a, no hubo variación significativa en la expresión fenotípica de varios marcadores de membrana, como se evaluó por citometría de flujo. Los marcadores celulares de células T maduras en reposo (tales como CD3, CD4 y CD8) muestran el mismo patrón de variación durante 6 días de cultivo en presencia o en ausencia de LO-CD2a, y las moléculas de activación tales como CD25 (IL-2R/p55) no se expresan en estas condiciones experimentales o no se modifican por LO-CD2a como es el caso de determinantes antigénicos DR. (Figura 3).

Cuando se incubaron PBMC durante 6 días en presencia de LO-CD2a, se observó una disminución significativa en el porcentaje de linfocitos abiertos Leu-5b+ (Figura 4). El porcentaje de linfocitos CD4- y CD8- no está afectado durante un periodo de 6 días de cultivo por la presencia de LO-CD2a, lo que indica que la disminución observada de linfocitos que albergan CD2 no puede atribuirse a una eliminación de estas células sino a una desaparición de la molécula CD2 o a un cambio conformacional en esta glicoproteína producido por la unión de LO-CD2a.

Para verificar si la disminución observada en los linfocitos Leu-5b era debida a un cambio conformacional de CD2 o a una desaparición (internalización o liberación) de esta molécula después de la unión de LO-CD2a, se cultivaron PBMC en presencia de 500 ng/ml de LO-CD2a y se analizaron durante 6 días en citometría de flujo usando Leu-5b (marcado con FITC), T11-RD1 (marcado con rodamina) y MARK-3 (marcado con FITC). Como se muestra en la Figura 5a, los mAb Leu-5b o T11 no son capaces de unirse a las PBMC después de 2 a 4 días de cultivo en presencia de LO-CD2a. En estas condiciones, el mAb de ratón anti-cadena kappa de rata MARK-3 marcó el 50% de las células en el día 6 de cultivo lo que indica que solamente el 35% de las células que albergan CD2 originales no muestran LO-CD2a en sus superficies, sin embargo la tinción de Leu-5b-FITC y T11-RD1 ha disminuido marcadamente en el día 2. Esto sugiere que sucede una alteración conformacional de CD2 que vuelve al epítopo de Leu5b y T11 no disponible para la unión en respuesta a LO-CD2a.

El análisis de la fluorescencia media de células CD2+ indicó que la densidad de expresión de este marcador disminuía con el tiempo en presencia de LO-CD2a. Se observó el mismo fenómeno si se usaba Leu-5b marcado con FITC o LO-CD2a (revelado por MARK-1 marcado con FITC) para detectar los linfocitos CD2+. Se cultivaron alícuotas de las mismas PBMC en paralelo en presencia de Leu-5b (mAb disponible en el mercado, dializado frente a PBS, dilución final 1:2 en medio de cultivo). Como se muestra en la Figura 5b, en esas condiciones experimentales todas las células que albergan CD2 se recubren por el mAb Leu-5b (revelado por anticuerpo de cabra anti-ratón-FITC). La tinción por T11-RD1 se redujo marcadamente, mientras que se observó una disminución más pequeña, más lenta en el porcentaje de células que presentan el epítopo reconocido por el mAb LO-CD2a-FITC. Tomados en conjunto, estos resultados indican que las moléculas CD2 tienen su conformación parcialmente cambiada en respuesta a LO-CD2a, y que sucede una modulación lenta de CD2/LO-CD2a.

LO-CD2a inhibe MLR

Cuando se realizaron MLC (durante un periodo de 6 días) en presencia de concentraciones crecientes de mAb de rata, se observó una inhibición significativa de la MLR (medida por la incorporación de ^{3}H-timidina (^{3}H-T)), a concentraciones de mAb tan bajas como 125 ng/ml. En la Figura 6a, se muestra un ejemplo típico de una curva de respuesta a dosis de la inhibición de MLR por LO-CD2a. Como puede observarse en esta Figura 6a, LO-CD2a induce una inhibición del 80% de MLR (6 días de cultivo) a 250 ng/ml y este porcentaje de inhibición permanece casi constante o mayor al 80% sobre un amplio intervalo de concentraciones (0,25 a 5,0 \mug/ml de mAb). La Figura 6b muestra el transcurso en el tiempo de los efectos inhibidores de diferentes concentraciones de LO-CD2a sobre MLR desde el día 0 al día 6 de cultivo. Un ejemplo típico de incorporación de ^{3}H-T sobre MLC (en presencia o en ausencia de LO-CD2a) se muestra en la Figura 6c, donde se añadió LO-CD2a a una concentración final de 200 ng/ml.

En la Figura 6d se muestran los efectos de LO-CD2a sobre MLR, cuando se añade este mAb (a 200 ng/ ml) en momentos variables después del inicio del MLC. Se obtiene más del 90% de inhibición de MLR (medida por incorporación de ^{3}H-T) cuando se añade este mAb en el día 0, y este efecto inhibidor aún está presente (el 45% de la inhibición en este ejemplo) cuando se añade LO-CD2a 4 días después del inicio del MLC. Se obtuvieron resultados similares (no mostrados) con concentraciones mayores (de 0,20 a 5,0 \mug/ml) de LO-CD2a.

LO-CD2a bloquea la vía de expresión de IL-2R

Cuando se realizaron análisis de citofluorografía sobre el subconjunto de linfoblastos de un MLC (Figura 7a y b), se hicieron las siguientes observaciones: a) la cantidad de blastocitos (aproximadamente 300-500 blastocitos de 25.000 acontecimientos analizados) ya presentes al inicio del MLC se elevó abruptamente desde el día 4 hasta el día 6 en cultivos de control (más de 1200 blastocitos de 25.000 acontecimientos analizados); b) en MLC realizado en presencia de LO-CD2a, no hubo variación significativa en la cantidad de blastocitos durante el periodo completo de cultivo y en el día 6 la cantidad de blastocitos es siempre inferior o casi igual que la cantidad inicial de blastos en el día 0 (Figura 7a); c) el porcentaje de blastos CD25 se elevó abruptamente entre las células incubadas sin LO-CD2a (Figura 7b); d) este porcentaje permanece por debajo del 20% en la pequeña cantidad de blastos del MLC incubado en presencia de mAb (Figura 7b), y la fluorescencia media (como una medida de la expresión de CD25) disminuyó en un 75% en comparación con blastos presentes en cultivos de control (resultados no mostrados); e) en ausencia de mAb el porcentaje de blastos CD3- permanece constante durante los primeros 4 días de cultivo (Figura 7b) y en el día 6 el porcentaje de células CD3- aumentó al 90%, mientras que en presencia de LO-CD2a el porcentaje de CD3- se eleva lentamente hasta alcanzar solamente aproximadamente el 45% en el día 6. Estos resultados indican que la presencia de LO-CD2a inhibe la entrada de estas células en la vía de activación caracterizada por la expresión del receptor de IL-2 (CD25). La cantidad de blastos CD2+ permanece constante o disminuye en presencia de LO-CD2a, y la densidad de expresión de este marcador de membrana disminuye fuertemente en estas condiciones (datos no mostrados).

Cuando se realizaron análisis fenotípicos durante 6 días sobre el subconjunto de linfocitos en reposo (no blastos) de MLC, se obtuvieron resultados similares a los descritos en la Figura 3: en presencia de LO-CD2a, no pudo detectarse variación significativa en el porcentaje de linfocitos CD3+, CD4+ o CD8+, en comparación con cultivos de control; no pudo detectarse expresión de CD25 (marcador de activación) sea en presencia o en ausencia de LO-CD2a durante 6 días de cultivo (Figura 8a). Estos resultados sugieren que LO-CD2a tiene un efecto muy débil, si lo tiene, sobre el subconjunto en reposo de linfocitos T en MLC; es decir, en células T no comprometidas en el proceso de activación. Al mismo tiempo, como se muestra en la Figura 8b, LO-CD2a induce una disminución significativa en el porcentaje de linfocitos CD2+ durante MLC. Estos resultados sugieren que tanto en cultivos no estimulados (Figura 5) como en el MLC, el efecto de LO-CD2a es reducir la expresión de CD2 y/o inducir un cambio conformacional en su estructura.

LO-CD2a puede bloquear las vías de activación de células T dependiente del complejo TcR/CD3 o de receptores de mitógenos.

Cuando se añadió LO-CD2a a PBMC activadas por mitógenos, se observó una inhibición significativa de la incorporación de ^{3}H-T. En uno de los tres experimentos de PBMC incubadas con mitógenos (OKT3, ConA y PHA) en presencia o en ausencia de LO-CD2a añadido a tiempo 0 ó 1 hora después del comienzo de los cultivos. En el primer caso, los mitógenos se añadieron 1 hora después. Cuando se añadió LO-CD2a 1 hora después del inicio del cultivo, los mitógenos se añadieron a tiempo 0. Esto se hizo para saber si la preincubación de PBMC con mitógenos o LO-CD2a podía desencadenar acontecimientos que pudieran verse afectados por la adición del segundo reactivo. Los cultivos se recogieron a 96 h, después de un marcaje por pulsos (6 h) con ^{3}H-T. Se observó más del 50% de inhibición de la incorporación de ^{3}H-T en presencia de LO-CD2a, se añadiera antes o después de los mitógenos (Figura 9). Se observó el mismo efecto cuando las células se recogieron 4 días después de la aparición de MLC y se expusieron a mitógenos (resultados no mostrados). Se observó una disminución drástica en la incorporación de ^{3}H-T dos días después de la aparición de MLC, en aquellos cultivos que recibieron tanto el mitógeno como LO-CD2a, en comparación con los mismos cultivos que recibieron solamente mitógenos (resultados no mostrados). La preincubación de MLC con LO-CD2a antes de la adición de mitógenos, disminuyó la captación de ^{3}H-T a valores comparables con MLC sin OKT3.

LO-CD2a también fue capaz de inhibir la proliferación inducida por mitógenos si se añadía un día después del inicio de la proliferación inducida por mitógenos. Los resultados de los experimentos realizados con dos donantes se muestran en la Figura 10. Se incubaron PBMC junto con mitógenos (OKT3, ConA y PHA). En estos experimentos, se añadió LO-CD2a a tiempo 0 (Día 0), 24 h (Día 1) o 48 h (Día 2) después del comienzo de los cultivos. La inhibición de la proliferación en respuesta a OKT3 y ConA por LO-CD2a fue significativa si se añadía 24 horas después de la adición de mitógenos a tiempo 0.

Ejemplo 3 Inhibición de la Actividad de Células Asesinas Naturales (NK)

Se aislaron PBMC de sangre heparinizada por sedimentación en Ficoll Hypaque. Después de lavar, se incubaron las células efectoras, suspendidas en medio enriquecido, durante una noche a una concentración de 1X10^{6}/ml en una placa Falcon para eliminar los monocitos (por adherencia).

Las células diana (línea celular K562) se marcaron por incubación durante una noche con ^{51}cromo ^{51}Cr (0,9 ml de una suspensión celular a 3x10^{6}/ml + 0,02 ml de una solución de 5 mCi/ml de ^{51}Cr, Amersham).

Después de una incubación de 16 horas, se lavaron las células efectoras y diana cuatro veces, se contaron y se incubaron en una microplaca de fondo en V de 96 pocillos a diferentes proporciones E/T: 200/1 (100 \mul de una suspensión de 4x10^{6}/ml de células efectoras con 100 \mul de 2x10^{4} ml de células diana) 100/1, 50/1 y 25/1.

Después de una incubación de cuatro horas, se midió la liberación de ^{51}Cr contando 100 \mul de sobrenadante de cada pocillo en un contador gamma.

Se usó la liberación máxima (células diana + HCLIN) y espontánea (células diana + medio enriquecido) para calcular la lisis específica:

3

La inclusión de LO-CD2a a 5, 1 y 0,5 \mug/ml en el ensayo NK con dos donantes normales (Figuras 11a y 11b) condujo a una inhibición de la citotoxicidad de aproximadamente el 50% con todas las concentraciones ensayadas de anticuerpo y sobre todas las proporciones E/T ensayadas. Esto es en comparación con la inhibición esencialmente completa de la proliferación en la MLR a dosis de o por encima de 0,25 \mug/ml.

Ejemplo 4 Estudios in vivo en primates no humanos Material y métodos Anticuerpos monoclonales

MARK3-FITC es un mAb de ratón dirigido contra el alotipo Ig kappa 1b de rata conjugado con FITC. MARG2b-biotina es un mAb de ratón anti-inmunoglobulina IgG2b de rata conjugado con biotina. Estos dos mAb se produjeron y se marcaron en este laboratorio. Para los ensayos inmunofluorescentes se usaron a una concentración final de 2,5 \mug/ml. Leu-5b-FITC (Hecton-Dickirison) y T11 Rodamina (COULTER) son dos mAb de ratón anti-CD2 humano. T4 y T8 marcado con rodamina (COULTER) son mAb de ratón anti-CD4 y CD8 humanos, respectivamente.

Análisis de Fenotipo

Se añadieron mAb anti-células T humanas (anti-CD2, -CD4, -CD8, véase anteriormente) a muestras de 100 \mul de sangre completa y se incubaron a 4ºC durante 45 min. Se lisaron los glóbulos rojos con cloruro de amonio tamponado con Tris-tampón de lisis (NH_{4}Cl 144 mM/Tris 17 mM, pH 7,2) y los linfocitos se lavaron con PBS/FCS 2%/NaN_{3} al 0,2%. Para la detección de mAb no marcados, se añadió un segundo mAb (conjugado con FITC o biotina) a una concentración final de 2,5 \mug/ml. Después de 45 min. de incubación a 4ºC, las células se lavaron con PBS/FCS/NaN_{3}. Para los mAb biotinilados, se hizo una incubación adicional (15 min.) con conjugado de etreptavidina-ficoeritrina. Se resuspendieron los linfocitos humanos o de mono marcados en una solución de formalina al 2% y se analizaron en un citofluorómetro FACSan (Becton-Dickinson) equipado con el programa lysis II para linfocitos de abertura como una función del tamaño frente a la granularidad. Como control para la tinción no específica, se incubaron alícuotas de células con Ig de ratón conjugadas con FITC o Ficoeritrina (Coulter).

Nivel de Ab en circulación

Se cuantificó LO-CD2a en suero por ELISA usando un mAb de ratón anti-IgG2b de rata (MARG2b-8, producido en este laboratorio) como primera capa (recubrimiento) y un mAb de ratón anti-cadena kappa de rata (MARK-3) acoplado a peroxidasa de rábano rusticano para la detección. En resumen, se incubaron placas de microtitulación (Falcon) durante una noche con 100 \mul/pocillo de MARG2b-8 (5 \mug/ml) y se saturaron los sitios no ocupados en el plástico con PBS que contenía leche en polvo al 5% (bovina). Después de 1 h de incubación a temperatura ambiente, las placas se lavaron con PBS con Tween-20 al 0,1%, y se incubaron 1 h con 100 \mul/pocillo de suero de mono o humano diluido. Después de retirar por lavado el material no unido, las placas se incubaron 1 h con 100 \mul/pocillo de MARK3-peroxidasa (2 \mug/ml en PBS). Después de lavar de nuevo, las placas se incubaron con OPD (diclorhidrato de o-fenilendiamina, 0,4 mg/ml, Sigma Chemicals), en tampón citrato-fosfato que contenía H_{2}O_{2} al 0,03%. El producto de reacción coloreado se detectó a 492 nm. Se hizo una curva patrón en paralelo con una concentración conocida de LO-CD2a purificado diluido en serie en una combinación de suero de mono o humano de control.

La detección de anticuerpos de mono o humanos anti-LO-CD2a se realizó por ELISA usando placas de microtitulación de 96 pocillos recubiertas con LO-CD2a (5 \mug/ml). Los anticuerpos humanos o de mono anti-LO-CD2a unidos en las placas, se revelaron por mAb de rata anti-IgM humana (LO-HM-7) o IgG (LO-HG-22) marcados con peroxidasa de rábano rusticano.

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A. Monos cynomolgus

Un mono cynomolgus recibió 10 mg/día de LO-CD2a durante tres días consecutivos. El anticuerpo monoclonal se toleró bien.

Se observó la eliminación de linfocitos después de la primera inyección pero se obtuvo una eliminación adicional muy pequeña después de la 2ª y 3ª inyecciones.

El segundo mono recibió 20 mg/d durante 10 días. El mAb también se toleró bien. No se observaron efectos secundarios después de la dosificación porque los animales estaban activos, alerta, comían bien sin evidencias de náuseas o alteración gastrointestinal.

Los recuentos de linfocitos y poblaciones celulares en el segundo mono se resumen en las Figuras 12 y 13. La actividad NK se redujo ligeramente después de las 10 inyecciones (Figura 14). Los niveles en circulación de mAb fueron muy elevados (Figura 15) y la inmunización sucedió al final del tratamiento (Figura 16).

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B. Babuino

El experimento descrito ahora se emprendió para determinar la tolerancia de un babuino a LO-CD2a, para analizar los efectos de este mAb sobre algunos de los marcadores de membrana de linfocitos de babuino y para determinar la vida media de LO-CD2a en suero.

La tinción de células de babuino con LO-CD2a produce <20% de células positivas a una intensidad de fluorescencia media significativamente inferior que la de las células humanas teñidas. Este patrón de tinción puede reflejar una débil reacción cruzada o unión mediante la interacción de Fc con células de babuino.

El estudio se hizo sobre un babuino (papio mormon) macho que pesaba 8,8 kg. Antes de cada inyección de LO-CD2a se anestesió al mono; la primera vez con Ketaler® (2 ml) y Prazin® (0,5 ml), la segunda vez con Ketaler solamente y las posteriores veces con ketaler y Prazina (0,3 ml). Se inyectó LO-CD2a por vía intravenosa (i.v. en 10 min.), diluido en 100 ml de solución salina fisiológica. Para el análisis fenotípico de linfocitos y la medición de anticuerpos en circulación (LO-CD2a inyectado, anticuerpos anti-LO-CD2a recién formados, y anticuerpos de babuino anti-LO-CD2a con reacción cruzada preexistentes), se tomaron muestras de sangre (10 ml) en dos tubos. El tubo para el tipado de linfocitos contenía EDTA. Las muestras se tomaron antes del primer tratamiento para determinar los niveles iniciales.

La primera dosis (10 mg) de LO-CD2a se administró en el día 0 del estudio; las siguientes cuatro dosis (10 mg/dosis) se administraron en los días 7, 8, 9, y 10. Se tomaron muestras de sangre uno pocos minutos después de cada dosis de LO-CD2a. En los días 7 y 9 también se tomó una muestra de sangre suplementaria (en un tubo que contenía EDTA) antes de las inyecciones de LO-CD2a. Se tomaron muestras de sangre en los días 1, 2, 11, 12, 13, 16 y 24.

No se observaron reacciones anormales en la actividad o hábitos de alimentación durante las inyecciones de LO-CD2a o en todo el periodo de estudio. El peso del animal permaneció aproximadamente en los 8,8 kg medido en el día 0 (véase la siguiente tabla).

4

Análisis de fenotipo y mAb en circulación

La tinción fluorescente de estos linfocitos de sangre periférica de babuino reveló algunas características interesantes:

a) Bajo el efecto de LO-CD2a el subconjunto CD2-positivo de linfocitos disminuyó significativamente (como se revela por dos diferentes mAb anti-CD2) al final de la quinta dosis de LO-CD2a, que está en el momento de una máxima acumulación de mAb en sangre (véanse las Figuras 17a y 17b). Dado que los subconjuntos CD4+ y CD8+ de linfocitos no disminuyen durante este periodo (Figura 19), y a causa de que las células CD4+ y CD8+ comprenden la mayoría de los linfocitos que albergan CD2, la disminución en células CD2+ indica que es la expresión del marcador de membrana lo que está disminuyendo o lo que está alterado en conformación, en lugar de los linfocitos.

Como puede observarse en (Figura 17a), se observa una ligera disminución de linfocitos positivos CD2+ (Leu-5b^{+} o T11^{+}) después de la primera dosis de LO-CD2a. Dos días después de esta primera dosis, el nivel de células CD2 positivas (Leu 5b+ o T11+) se eleva hasta los valores de partida.

Al final de las cuatro dosis espaciadas por 24 horas de LO-CD2a (días 7-10) el porcentaje de células CD2 positivas (Leu 5b^{+} o T11^{+}) disminuyó abruptamente y comenzó a elevarse lentamente 3 días después del final de la administración de LO-CD2a.

b) Al mismo tiempo, el porcentaje de células positivas LO-CD2a, es decir, el porcentaje de células unidas por los mAb en circulación se elevó al 22% después de la segunda dosis de LO-CD2a (día 7) y después disminuyó como lo hicieron las células CD2+ revelado por los mAb anti-CD2 Leu-5b y T11 (Figura 17). La disminución de células LO-CD2a+ se reveló por el mAb MARK-3FITC (Figura 18).

La disminución de células LO-CD2a+ se determinó por la detección del LO-CD2a presente en células detectadas por MARK3-FITC o por los mAb MARG2b-8 conjugados con biotina (Figura 18a). Se observó el mismo fenómeno si las células se incubaban primero con LO-CD2a a 2,5 \mug/ml para saturar todos los sitios no ocupados por mAb en circulación. Se detectó LO-CD2a por MARK-3-FITC o MARG2b-8-biotina (Figura 18).

c) Como puede observarse en (Figura 19), el subconjunto T4 positivo de linfocitos de babuino mostró una elevación moderada durante los días 9 a 12 después de que el porcentaje de linfocitos T4^{+} volviera a su valor inicial. De forma concomitante con la elevación en las células T4^{+}, el porcentaje de linfocitos T8 positivos se elevó desde el día 9 hasta el día 11. Después de ese día este porcentaje volvió a sus valores iniciales.

d) Los niveles de mAb.LO-CD2a en circulación disminuyeron a valores de fondo 3 días después de la primera inyección (véase la Figura 17b). Cuando se aplica LO-CD2a en cuatro dosis espaciadas por un corto tiempo (días 7 a 10), los niveles de LO-CD2a en suero (aproximadamente 3,7 mg/ml, valor máximo en este periodo) disminuyeron lentamente después de la última dosis (días 10 a 16), lo que indica una vida media relativamente larga del Ab en este modelo animal. No se detectaron anticuerpos de babuino anti-LO-CD2a en las muestras de sangre recogidas en los días 11, 12, 13, 16 y 24.

Conclusión

LO-CD2a parece que se tolera bien por primates no humanos, como se demuestra por la ausencia de reacciones aparentes en mono cynomolgus y babuino. LO-CD2a parece que tiene una vida media relativamente larga en el babuino. Veinticuatro horas después de la primera dosis de LO-CD2a (día 1 en la Figura 21b), el 50% del nivel detectable máximo de mAb aún estaba presente en suero. Tres días después de la última dosis de LO-CD2a (día 13 en la Figura 21b), el 50% del nivel detectable máximo de mAb aún estaba presente en suero.

Aunque el patrón de tinción en primates no humanos no es coherente con lo observado para CD2 en células humanas, la disminución en el porcentaje de linfocitos CD2 positivos seguido de una lenta elevación de este porcentaje de células es similar a lo observado en células mononucleares PBMC humanas cultivadas en presencia de LO-CD2a.

Ejemplo 5 Pacientes tratados con LO-CD2a Pacientes tratados con LO-CD2a en una base compasiva (i) Paciente Nº 1 (Mb.E.)

Éste era un paciente femenino con pielonefritis crónica, que se trató con un aloinjerto renal para fallo renal en fase final. Sucedió una crisis de rechazo y se trató con 10 días de OKT3. El nivel de creatinina bajó de 2 a 1,4 mg/dl. Aproximadamente cuatro (4) meses después se diagnosticó una crisis de rechazo por un nivel de creatinina de 2 mg/dl y una biopsia que indicaba rechazo moderado. El paciente se trató con 1,5 g de Solumedrol® y un transcurso de ATG (globulina antitimocito) los siguientes ocho (8) días momento en el que el nivel de creatinina era de 1,65 mg/dl. Siete días después del tratamiento se realizó una biopsia e indicó rechazo celular y rechazo vascular moderado. Dos días después de la biopsia (día 0) el paciente estaba anúrico con un nivel de creatinina de 2,4 mg/dl. El mismo día el paciente recibió 10 mg de LO-CD2a, 1,5 g del corticosteroide Solumedrol, más 1 g de Polarimina (una anti-histamina) y 1 g Dafalgan (acetaminofeno). El tratamiento con el corticosteroide, dexclorfeniramina y acetaminofeno se menciona por la comunidad de transplantes como "cobertura". No se observaron efectos secundarios. Al cabo de 23 horas, el paciente produjo 700 ml de orina y la creatina estaba a 2,72 mg/dl. Durante los siguientes 9 días recibió 10 mg/día de LO-CD2a. El paciente dejó el hospital sin una biopsia de seguimiento en ese momento, Día 11.

La medición del nivel de creatinina sérica durante el tratamiento con ATG y durante el siguiente tratamiento con LO-CD2a indicó que el nivel de creatinina se elevó a pesar del tratamiento con ATG y disminuyó y se estabilizó con LO-CD2a (Figura 25).

El recuento de leucocitos disminuyó desde un pico alto de 10.000 hasta 2.000 durante el tratamiento con LO-CD2a y continuó hasta bajar hasta la última medición en el día 21 (Figura 20). El recuento de linfocitos fue bajo y variable durante el periodo de observación.

Los niveles séricos de LO-CD2a se elevaron hasta picos de 2,0-3,0 \mug/ml inmediatamente después de cada tratamiento y bajaron a picos bajos de aproximadamente 1,0 \mug/ml entre cada tratamiento (Figura 21). Con el último tratamiento en el día 9, el nivel bajó en un 50% en 24 horas y a 0 en el día 14. Este paciente volvió a la clínica en el día 40.

El nivel de creatinina del paciente era de 2,27 en el día 40, 2,48 en el día 50 y se elevó a 3,11 en el día 66 punto en el cual se obtuvo una biopsia, con el informe inicial coherente con rechazo celular grave y hemorragia intersticial (véase a continuación). El paciente se trató con 150R de irradiación al riñón, 3 x 125 mg de Solumedrol®, continuando al mismo tiempo la terapia de mantenimiento de ciclosporina más 12,5 mg/día de esteroides. El nivel de creatinina continuó elevándose durante el periodo posterior. En el día 70 el nivel de creatinina era de 3,3; día 80, 5,63; día 84, 8,35. En el día 86 el nivel de creatinina era de 10,8 y se realizó una nefrectomía del transplante en el día 88. El cumplimiento de este paciente con la inmunosupresión de mantenimiento durante el periodo entre su alta el día 10 y su biopsia el día 66 está en cuestión y debe tomarse en consideración en el cumplimiento incierto la pérdida del riñón a pesar de haberlo salvado de forma evidentemente exitosa.

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(ii) Paciente Nº 2

El paciente era un hombre de 38 años de edad que era Hepatitis C^{+}. Había recibido un aloinjerto renal para el tratamiento de fallo renal en fase final debido a nefropatía intersticial crónica. Un año y tres meses después, experimentó una nefrectomía del transplante debido a rechazo celular y vascular agudo resistente a un transcurso de OKT3.

Un año y diez meses desde la nefrectomía del transplante, recibió un segundo aloinjerto renal. Tres días después si nivel de creatinina era de 1,4 mg/dl: Tres días después recibió 500 mg de Solumedrol®; la creatinina del paciente después de ese día era de 1,8 mg/dl. En el siguiente día recibió 500 mg de Solumedrol®; la creatinina era de 3, 25 mg/dl. El siguiente día recibió 500 mg de Solumedrol®; su creatinina era de 2,95 mg/dl. Tres días después su nivel de creatina era de 2,3 mg/dl y experimentó una biopsia que demostró rechazo celular de grado 3. Tres días después recibió 10 mg de LO-CD2a, más 200 mg de Solumedrol®, Polaramina y Dalfagan. Los efectos secundarios observados se limitaron a somnolencia; no se observaron hipertermia o hipertensión. Durante los siguientes 9 días recibió diariamente tratamientos de 10 mg de LO-CD2a. El día después del final de dichos tratamientos una biopsia mostró ausencia de signos de rechazo.

El paciente toleró el transcurso de LO-CD2a bien sin evidencias de efectos secundarios clínicos, incluyendo ausencia de fiebre o hipertensión con ninguna dosis. Los ensayos rutinarios hematológicos y de laboratorio químico clínico (incluyendo LFT) obtenidos durante el transcurso del tratamiento demostraron ausencia de alteraciones que se pueden atribuir a la administración del anticuerpo, excepto por una disminución en el recuento de linfocitos de 290/mm^{3} a un pico bajo de 100/mm^{3} y la reducción en el nivel de creatinina asociada con la resolución de la crisis de rechazo (desde 2,7 mg/dl al inicio del tratamiento con LO-CD2a hasta 1,10 al final del transcurso).

La Figura 22 muestra el nivel de creatinina sérica de este paciente, bajando desde 2,5 hasta aproximadamente 1,0 en los días después del tratamiento con LO-CD2a. El paciente era linfopénico antes y durante el tratamiento y el recuento de leucocitos no mostró una alteración drástica con el tratamiento (Figura 23). En este paciente los niveles séricos de LO-CD2a no se elevaron por encima de 2,0 \mug/ml después de cada tratamiento y bajaron a picos bajos de 1,0 a menos de 0,25 \mug/ml (Figura 24). Ocho meses después del primer tratamiento con LO-CD2a el paciente estaba prosperando con función renal normal y sin evidencias de rechazo recurrente.

Paciente 2 Biopsia Nº 1 - Diagnóstico: Indeterminado

La biopsia contenía aproximadamente 20 glomérulos que no tenían nada especial. Había un infiltrado mononuclear escaso con un grado minoritario de edema intersticial. Se encontraron solamente grados minoritarios de invasión tubular y sin lesiones vasculares. Estos hallazgos son insuficientes para el diagnóstico de rechazo celular agudo. Había células mononucleares raras en arterias pequeñas, que eran sospechosas, pero no cumplían los criterios para el diagnóstico de rechazo.

Paciente 2 - Biopsia Nº 2 Aproximadamente 2 semanas después de la primera biopsia - Sin anormalidad diagnóstica reconocida

La biopsia parecía similar a la biopsia previa y contenía aproximadamente 10 glomérulos. El infiltrado era muy escaso y no se identificaron lesiones vasculares.

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(iii) Paciente Nº 3

El paciente tenía 19 años de edad con enfermedad de von Willebrand que recibió un aloinjerto renal para el tratamiento de fallo renal en fase final debido a pielonefritis crónica. El transplante se retiró 17 días después debido a rechazo vascular agudo con hipertensión secundaria después del fallo de un transcurso de 6 días de OKT3.

Cinco meses y medio después recibió un segundo aloinjerto renal. Diez días después su nivel de creatinina era de 6 mg/dl. El siguiente día el nivel de creatinina era de 7 mg/dl y una biopsia indicó rechazo celular y rechazo vascular de grado 3 (endarteritis proliferativa sin necrosis o trombosis). Ese mismo día recibió 10 mg de LO-CD2a, 40 mg de Solumedrol® y Polaramina y Dafalgan. No se observaron efectos secundarios. Durante los siguientes 9 días recibió diariamente tratamientos de 10 mg de LO-CD2a, sin otros fármacos y sin efectos secundarios. Dos días después de completarse el tratamiento, su nivel de creatinina era de 1,75 mg/dl y una biopsia indicó ausencia de signos de rechazo agudo, con necrosis intersticial y una mancha focal de rechazo crónico.

No se observaron efectos secundarios clínicos (alteración en BP o temperatura). Ensayos rutinarios hematológicos y de laboratorio químico clínico (incluyendo LFT) mostraron ausencia de cambios que se pueden atribuir a la administración del anticuerpo excepto la disminución en el nivel de creatinina asociada con la resolución de la crisis de rechazo (de 7,10 mg/dl al inicio del tratamiento con LO-CD2a hasta 1,75 mg/dl al final del transcurso de 10 días). El recuento de linfocitos era de 340/mm^{3} antes del tratamiento y bajó hasta un pico bajo de 220/mm^{3} durante el tratamiento, se elevó hasta 690/mm^{3} 9 días después del cese de tratamiento con el LO-CD2a y se había elevado hasta 1000/mm^{3} 23 días después del final del tratamiento.

El recuento de leucocitos en este paciente no se alteró significativamente por el tratamiento (Figura 25). El nivel de creatinina sérica bajó drásticamente con el tratamiento (Figura 25). Siete meses después del primer tratamiento con LO-CD2a el paciente estaba prosperando con función renal normal y sin evidencias de rechazo recurrente.

Paciente 3 - Biopsia Nº 1 - Diagnóstico: Rechazo celular grave que afecta a las arterias pequeñas y a un grado menor del intersticio y los glomérulos

Una arteria del tamaño de la arcuata mostró una infiltración mononuclear marcada de la íntima con alteración de la elástica. Había infiltrado escaso en el intersticio, que ocasionalmente invadía los túbulos. El intersticio mostraba edema intersticial leve difuso. Había aproximadamente 7 glomérulos presentes. Estos muestran hipercelularidad con células mononucleares e hinchamiento endotelial. Globalmente, este patrón se diagnosticó de rechazo celular agudo grave.

Paciente 3 - Biopsia Nº 2 Aproximadamente 2 semanas después de la primera biopsia - Diagnóstico: Coherente con el rechazo tratado

La biopsia mostró unas pocas arterias pequeñas, que muestran fibrosis intimal a veces con un material mucoide pero un infiltrado celular mínimo. El intersticio mostró una fibrosis difusa fina y un infiltrado mononuclear mínimo. Los túbulos estaban localmente atróficos pero por lo demás sin nada especial. No había evidencias de rechazo celular activo.

No se han presentado episodios de rechazo posteriores durante 28 meses de seguimiento del segundo y tercer pacientes que siguieron cumpliendo su terapia inmunosupresora.

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(iv) Paciente Nº 4

El paciente que estaba padeciendo enfermedad de injerto contra hospedador grave (grave toxicidad cutánea, intestinal, renal y del SNC resistente a elevadas dosis de prednisona) después de un transplante alogénico de médula ósea recibió 12 días de LO-CD2a a 10 mg/día. Sus síntomas mejoraron; la función renal volvió a la normalidad, cesó la diarrea, mejoró la piel y se resolvió la confusión. Cuatro días después de detener el anticuerpo recurrieron los síntomas y el paciente murió a pesar del inicio de un segundo transcurso de anticuerpo.

LO-CD2a por tanto podía usarse para revertir las respuestas inmunes en desarrollo contra tejidos foráneos (alogénicos y xenogénicos, ya que inhibe la xeno MLR así como la alo MLR). El anticuerpo se daría por infusión i.v. una o dos veces al día durante 10 días a 14 días. También puede usarse de forma profiláctica para prevenir la activación de células T como parte del protocolo de inducción inmediatamente después del transplante del órgano.

En un segundo experimento, se inició un ensayo clínico farmacocinético y de búsqueda de dosis, seguro, de Fase I en receptores de aloinjerto renal que experimentan una biopsia inicial que demuestra un episodio de rechazo agudo. La preparación de anticuerpo usada en este ensayo es LO-CD2a, producido en cultivo celular.

El uso compasivo del anticuerpo no mostró efectos secundarios y sugirió eficacia para revertir el rechazo de injerto agudo a una dosis de 10 mg/día durante 10 días. Los estudios preclínicos con chimpancés sugirieron que se observaban efectos similares in vivo con dosis equivalentes a dosis humanas que varían de 0,1 - 100 mg/día sin efectos adversos obvios. Por lo tanto, un objetivo de este ensayo de Fase I era investigar los niveles de dosis decrecientes de LO-CD2a comenzando a 10 mg/día durante diez días (con una extensión opcional durante cinco días adicionales) para obtener indicios de la dosis mínima eficaz. Como no se habían observado efectos secundarios con "cobertura" de esteroides en los pacientes de uso compasivo descritos anteriormente, se decidió administrar el anticuerpo sin cobertura de esteroides y solamente pretratamiento mínimo con analgésicos y antihistamina. Esto se hizo para caracterizar de forma predecible los efectos secundarios inducidos por LO-CD2a.

Se han admitido once pacientes según este protocolo hasta la fecha. Cuatro pacientes se trataron con 10 mg/día, cinco pacientes se trataron a 5 mg/día y dos pacientes se trataron con 2,5 mg/día.

Entre los once pacientes admitidos, nueve pacientes experimentaron una reversión o reversión parcial del rechazo agudo confirmado por la biopsia: los cuatro pacientes tratados con LO-CD2a a 10 mg/día, tres de los pacientes tratados con 5 mg/día, y los dos pacientes tratados con 2,5 mg/día. Uno de los pacientes tratados con 5 mg/día (el Paciente 8, véase a continuación) se retiró del estudio voluntariamente después de la primera dosis y un segundo paciente tratado con 5 mg (Paciente 9) mostró una mala respuesta.

La Tabla 1 resume los resultados obtenidos con pacientes con rechazo renal tratados con LO-CD2a según este protocolo.

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(Tabla pasa página siguiente)

TABLA 1

5

Los acontecimientos adversos observados durante el tratamiento con LO-CD2a sin cobertura de esteroides incluían náuseas, vómitos, fiebre, tiritonas, e hipertensión, posiblemente como resultado de una liberación transitoria de citoquinas. La mayoría (más del 70%) de estos acontecimientos se observaron durante la administración de la primera dosis y fueron de grado y duración limitados. Por ejemplo, no se observaron fiebres de más de 40ºC y la mayoría de los acontecimientos se resolvieron en horas desde la aparición. No se observó hipotensión o diarrea grave. No había una relación clara entre la intensidad y la incidencia de estos acontecimientos y la dosis de anticuerpo. A pesar del malestar obvio de estos síntomas, ningún acontecimiento requirió medidas de resucitación urgente.

En un tercer experimento, diez pacientes con rechazo de aloinjerto renal agudo se trataron en una base compasiva sin cobertura de esteroides con LO-CD2a del siguiente modo:

Dos se trataron con 10 mg/día, cuatro se trataron con 5 mg/día, y cuatro se trataron con 2,5 mg/día. Todos los pacientes de uso compasivo tratados con 10 mg/día y 5 mg/día, y todos menos uno de los tratados con 2,5 mg/día mostraron evidencias de resolución completa o parcial del rechazo por biopsia y otros signos clínicos. El perfil de acontecimientos adversos con estos pacientes de uso compasivo se parecía al observado anteriormente en este documento con síntomas predominantemente de primera dosis de duración y grado limitados.

En un cuarto experimento, seis pacientes con enfermedad de injerto contra hospedador resistente a esteroides, y un receptor de transplante de hígado han recibido LO-CD2a en una base de uso compasivo. No se presentaron acontecimientos adversos para estos pacientes. A continuación hay breves narraciones de estos pacientes.

Los seis pacientes GvHD se trataron por 10 dosis diarias consecutivas de 10 mg de LO-CD2a, administradas por vía intravenosa durante una hora. De forma concomitante, se continuó con ciclosporina y esteroides. Todos salvo uno de los pacientes mostraron una mejora sobre sus síntomas GvHD. La resolución de los síntomas GvHD comenzó en el día 3-6 después de iniciar la terapia de mAb. Se ha observado un progreso de los signos de GvHD hepática con terapia de mAb en dos pacientes. Se observó recaída de los signos de GvHD en 2 de 3 pacientes evaluables.

Un séptimo paciente había recibido un hígado donante, pero desafortunadamente había desarrollado sepsis como resultado de una complicación quirúrgica acompañada de fallo renal debido a toxicidad por ciclosporina y función de la médula ósea gravemente deprimida. A causa de su estado, el cirujano no quiso arriesgar al paciente o un segundo hígado que se había destinado usando agentes inmunosupresores actualmente disponibles (OKT3, Mofetil, FK506 (tacrolimus), ciclosporina y ATG) para la inducción. El paciente recibió el transplante de hígado y tratamiento con LO-CD2a durante siete días a 5 mg/día con la primera dosis infundida durante la cirugía comenzando antes del despinzamiento del órgano transplantado. Las dosis posteriores se dieron con esteroides a baja dosis. Durante el periodo de tratamiento, la función renal del paciente mejoró suficientemente para iniciar un régimen inmunosupresor convencional. El paciente no ha mostrado ningún signo de rechazo en las ocho semanas después del transplante.

Aunque la presente invención, en una realización preferida, se refiere a la inhibición del rechazo de injertos, tiene que entenderse que el alcance de la invención no se limita a ello y generalmente es útil para la inhibición de la activación de células T para todos y cada uno de los propósitos.

Ejemplo 6 Construcción y Expresión de Anticuerpo Quimérico A. Clonación y Secuenciación de V_{H} y V_{L} de LO-CD2a

Se aisló el ARN total de la línea celular LO-CD2a (ATCC HB 11423) de acuerdo con el método de Chirgwin (Biochemistry, 18:5294, 1979). Después se preparó el ARNm usando el kit de ARNm oligotex-dT (Qiagen, Chatsworth, CA). Se transcribieron de forma inversa aproximadamente 200-300 ng de ARNm usando el kit de ARN-PCR de Perkin-Elmer Cetus (Norwalk, CT). La reacción se realizó a 42ºC durante 1 hora. Los cebadores oligonucleotídicos requeridos para la amplificación de los genes de V_{H} y V_{L} se eligieron usando las siguientes referencias: 1) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat et al., 5a ed., 1991, 2) Orlandi et al., Proc. Nat'l Acad. Sci., (USA) 86: 3833-3837 (1989).

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Los números se refieren a restos aminoacídicos, como se muestra en Kabat, et al., 1991.

Se realizaron reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) en un Perkin-Elmer DNA Thermal Cicler 480 usando las siguientes condiciones: 5 minutos a 94ºC, 30 ciclos que consisten en 1 minuto a 94ºC, 2 minutos a 60ºC, y 2 minutos a 72ºC. Esto estuvo seguido de 5 minutos a 72ºC. Los fragmentos de ADN se purificaron en gel de agarosa al 1% usando el kit de extracción de gel Qiaex (Qiagen, Chatsworth, CA). Los fragmentos después se acabaron en extremos romos de acuerdo con el método de Kanungo y Pandey, BioTechniques, 14:912-913 (1993) y se ligaron en el sitio Sma I de Bluescript KSII^{+} (Stratagene La Jolla, CA). Se secuenciaron múltiples clones por el método de terminación de cadena didesoxi usando el kit de polimerasa T7 Sequenase^{TM} (U.S. Biochemical, Cleveland, OH).

Debido al índice de error potencial inherente en PCR, se realizaron al menos tres reacciones distintas. Las secuencias más habitualmente observadas para los genes de V_{L} y V_{H} de LO-CD2a se muestran en las Figuras 29 y 30, donde Figura 29 muestra las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la cadena V_{L} de LO-CD2a incluyendo la secuencia líder nativa. La Figura 30 muestra las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la cadena V_{H} de LO-CD2a incluyendo la secuencia líder nativa.

Como se muestra en la Figura 29, la secuencia líder es de los restos aminoacídicos -20 a -1. La región flanqueante 1 es de los restos aminoacídicos 1 a 23. CDR1 es de los restos aminoacídicos 24 a 39. La región flanqueante 2 es de los restos aminoacídicos 40 a 54. CDR2 es de los restos aminoacídicos 55 a 61. La región flanqueante 3 es de los restos aminoacídicos 62 a 93. CDR3 es de los restos aminoacídicos 94 a 102. La región flanqueante 4 es de los restos aminoacídicos 103 a 112.

Como se muestra en la Figura 30, la secuencia líder es de los restos aminoacídicos -19 a -1. La región flanqueante 1 es de los restos aminoacídicos 1 a 30. CDR1 es de los restos aminoacídicos 31 a 35. La región flanqueante 2 es de los restos aminoacídicos 36 a 49. CDR2 es de los restos aminoacídicos 50 a 66. La región flanqueante 3 es de los restos aminoacídicos 67 a 98. CDR3 es de los restos aminoacídicos 99 a 107. La región flanqueante 4 es de los restos aminoacídicos 108 a 118.

B. Inserción En Vectores para Expresión Transitoria

Se licenciaron dos vectores de The Medical Research Council (MRC) en Londres para la expresión de cadenas ligera y pesada quiméricas de LO-CD2a respectivamente. El vector de la cadena ligera de 9,2 kb (hcmv-vllys-kr-neo) contiene el clon genómico de la región constante kappa humana y el dominio V_{L} humanizado de anti-lisozima como un fragmento Hind III-Bam HI. El vector de la cadena pesada de 8,6 kb (hcmv-VhLys-gammal-neo) contiene el clon genómico de la región constante \gamma1 humana y el dominio V_{H} humanizado de anti-lisozima como un fragmento Hind III-Bam HI. Estos vectores se describen más completamente en Maeda, et al., Hum. Antibod. Hybridomas 2: 124-134, (1991).

Como los fragmentos de ADN que contienen los péptidos señal nativos no estaban disponibles, las regiones V de LO-CD2a se clonaron detrás de las señales ya presentes en los vectores MRC. La región V de cadena ligera con el fragmento señal se construyó a partir de dos fragmentos, cada uno obtenido de una reacción de PCR diferente del siguiente modo:

Reacción 1: El molde de ADN era el vector de cadena ligera MRC. El fragmento amplificado contenía el péptido señal más una parte de la región flanqueante (FR)1. Los dos oligonucleótidos usados fueron:

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El cebador antisentido contenía la secuencia FR1 de LO-CD2a, no la encontrada en el vector MRC para anti-lisozima. La reacción de PCR produjo un fragmento de 0,15 kb Hind III - Tth III.

Reacción 2: El molde de ADN era el clon de V_{L} de LO-CD2a en Bluescript. El fragmento amplificado incluía FR1 de LO-CD2a (desde el sitio Tth III) hasta el final de FR4. La región 3' no traducida encontrada en el vector de cadena ligera MRC se añadió al extremo 3' de LO-CD2a usando el oligonucléotido antisentido. Los 2 oligonucleótidos usados fueron:

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Esta reacción produjo un fragmento de 0,35 kb TthIII-Bam HI. Ambos productos de PCR se purificaron en gel usando Qiaex y se restringieron con las enzimas apropiadas. El fragmento Hind III - Tth III más el fragmento Tth III - Bam HI después se ligaron entre los sitios Hind III y Bam HI de Bluescript en un ligamiento de 3 secciones. Después se secuenció esta construcción, que contenía la región V_{L} completa de LO-CD2a más el péptido señal MRC.

La región V de LO-CD2a de cadena pesada contiene la secuencia señal MRC en su extremo 5' y la región larga 3' no traducida, también obtenida del vector de cadena H MRC. La construcción final se hizo a partir de 3 reacciones de PCR diferentes del siguiente modo:

Reacción 1: El molde de ADN era el vector de cadena H MRC H. Como los genes de V_{L} y V_{H} de anti-lisozima usan la misma señal, el cebador con sentido era el mismo que el usado para la construcción V_{L} de LO-CD2a, es decir, 5' V lyssig. El cebador antisentido era 3' V_{H} lyssig:

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Esta reacción produjo un fragmento de 0,16 kb Hind III - Pst I que contiene la señal MRC más una parte de FR1 de LO-CD2a. El fragmento se purificó en gel, se restringió, y se ligó en Bluescript cortado con Hind III - Pst I para la secuenciación.

Reacción 2: El molde de ADN era la región V_{H} de LO-CD2a en Bluescript. Esta reacción produjo un fragmento de 0,3 kb Pst I - Sty I que contenía la mayor parte de la región V_{H}. Como había un sitio Pst I interno en FR3 de LO-CD2a, el fragmento Pst I - Sty I tuvo que construirse a partir de 2 reacciones de PCR del siguiente modo:

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El ADN molde mostrado anteriormente es el clon 82-8, de V_{H} de LO-CD2a en Bluescript.

Reacción A: Produce un fragmento de 0,2 kb, usando los oligonucleótidos, también mencionados como oligos 1 y 2, como cebadores:

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Reacción B: Produce un fragmento de 0,1 kb, usando los oligos 3 y 4 como cebadores. El oligo 3 es 5'int. Pst I (con sentido):

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Los oligos 2 y 3 anteriores contienen cambios en la secuencia de nucleótidos que retiran el sitio interno Pst I sin cambiar la secuencia de aminoácidos de LO-CD2a. Se combinaron alícuotas (2-5 \mul) de los productos solapantes de las reacciones A y B anteriores y sirvieron como moldes para una tercera reacción de PCR. Los cebadores oligonucleotídicos para esta reacción fueron los números 1 y 4 del diagrama previo. El producto de 0,3 kb se purificó en gel por Qiaex y se restringió con Pst I y Sty I. Como el fragmento permaneció intacto, el sitio interno Pst 1 se había mutado exitosamente.

Reacción 3: El fragmento V_{H} final se produjo usando el vector de cadena pesada MRC como molde. Este fragmento de 0,23 kb Sty I - Bam HI contenía una parte de FR4 de LO-CD2a, y la región 3' no traducida completa del vector MRC. Los cebadores usados fueron: 5'V_{H}lys Sty I (con sentido):

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El fragmento resultante se purificó en gel y se restringió con Sty I y Bam HI. Los fragmentos Pst I-Sty I y Sty I-Bam HI después se ligaron en Bluescript cortado con Pst l-Bam HI para secuenciación.

Todos los oligonucleótidos se sintetizaron en un sintetizador Applied Biosystems. Todas las reacciones de secuenciación se realizaron usando el kit de polimerasa T7 Sequenase^{TM} (U.S. Biochemical, Cleveland, OH). Todas las PCR se realizaron usando el siguiente protocolo: 5 min. a 95ºC, 35 ciclos que consisten en 1 min. a 94ºC, 1 min. a 50ºC, 2 min. a 72ºC, una extensión final de 5 min. a 72ºC.

Los fragmentos V_{L} y V_{H} de LO-CD2a que contenían las secuencias correctas se retiraron de Bluescript y se clonaron entre los sitios Hind III y Bam HI de los vectores de cadena ligera y pesada MRC, respectivamente. Para la cadena H, el fragmento 5' Hind III - Pst I se unió primero al resto de la construcción (Pstl-Bam HI) en Bluescript; después se clonó el fragmento Hind III - Bam HI completo en el vector MRC.

C. Secuenciación de Aminoácidos N-Terminales de V_{H} y V_{L}

El análisis de secuencia de aminoácidos N-terminal se realizó por el Harvard Microchemistry Laboratory en Cambridge, MA sobre muestras de las cadenas pesada y ligera de LO-CD2a para confirmar las secuencias obtenidas usando ARN-PCR. Las muestras se prepararon del siguiente modo: se aplicaron 200 \mug de LO-CD2a a través de un gel de SDS poliacrilamida al 12% procesado en presencia de B-mercaptoetanol. Después de electroforesis, la proteína se transfirió a una membrana de PVDF usando un aparato de transferencia de Western. La membrana se tiñó brevemente con Ponceau S, se destiñó en ácido acético al 1%, y las bandas de cadena ligera y pesada se secaron al vacío y se enviaron para los análisis de aminoácidos y secuenciación N-terminal.

La secuencia de aminoácidos de los primeros 20 restos de V_{H} de LO-CD2a coincidieron completamente con la secuencia clonada; sin embargo, la secuencia de V_{L} indicó que los restos 2, 3 y 7 en FR1 eran diferentes a los codificados por los genes clonados. Estas diferencias residen todas en el cebador de PCR usado para propósitos de clonación, en base a una secuencia de mejor estimación obtenida de la bibliografía citada previamente.

D. Confirmación de la Secuencia de ADN de la Secuencia de Aminoácidos N-Terminal y su Corrección

Para corregir esta secuencia y clonar simultáneamente los péptidos señal nativos tanto de V_{L} como de V_{H} de LO-CD2a, se empleó RACE-PCR (Amplificación Rápida de Extremos de ADNc): se transcribió de forma inversa el ARNm de células LO-CD2a y el ADNc resultante se acabó con una cola G en su extremo 3' usando transferasa terminal en presencia de dGTP. El ADNc después se amplificó usando un oligonucleótido 3' específico y un oligonucleótido 5' complementario a la cola G. Para simplificar la subclonación, se añadió un sitio de restricción adecuado en el extremo 5' de cada oligonucleótido.

Los oligonucleótidos usados para la preparación de ADNc fueron los siguientes:

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Los oligonucleótidos para RACE-PCR fueron los siguientes:

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Las reacciones de RACE-PCR se realizaron usando el siguiente protocolo: 5 min. a 94ºC, 40 ciclos de 30 seg. a 94ºC, 30 seg. a 50ºC, y 50 seg. a 72ºC, seguido de una extensión de 5 min. a 72ºC.

Los productos de PCR obtenidos para V_{L} y V de LO-CD2a se extrajeron en gel usando Qiaex. El fragmento V_{H} se restringió con Xho I y Stu I y se ligó en Bluescript cortado con Xho I - Sma I. El fragmento V_{L} se acabó en extremos romos y se ligó en Bluescript cortado con Sma I. Se secuenciaron varios clones par las regiones V tanto de cadena ligera como de cadena pesada y se identificaron las secuencias señal.

Como las secuencias señal encontradas en los genes de inmunoglobulina generalmente tienen intrones, éstas pueden ser importantes para la expresión. También se identificaron clones genómicos que contenían las secuencias líder de V_{L} y V_{H}. El ADN genómico se preparó del siguiente modo: 4 x 10^{7} células LO-CD2a se sedimentaron por centrifugación, se lavaron en PBS frío, se sedimentaron por centrifugación, y se lavaron con PBS de nuevo. Las células se resuspendieron en 0,4 ml de tampón de digestión (con proteinasa K recién añadida). Esta mezcla se incubó con agitación a 50ºC durante 12-15 horas, se extrajo con un volumen igual de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico, y se centrifugó a 1700 x g. La fase acuosa se transfirió a un tubo limpio y se añadieron 1/2 volúmenes de acetato amónico 7,5 M y 2 volúmenes de etanol al 95%. El ADN se sedimentó agitando 2 minutos, 1700 x g. El sedimento se lavó con etanol al 70% y se secó al aire. El sedimento se resuspendió en 80 ml de TE, pH 8,0.

Usando el ADN genómico obtenido de la línea celular LO-CD2a como molde, se designaron los siguientes oligonucleótidos para amplificar las secuencias líder genómicas tanto de V_{L} como de V_{H} así como partes de las regiones flanqueantes que acaban en sitios de restricción únicos (Sph I para V_{L}, Pst I para V_{H}).

LVL Nº 430

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Las reacciones de PCR se realizaron del siguiente modo: 100 ng de ADN genómico de células LO-CD2a, 200 pmol de cada uno de los oligos LVL y BKA (para el fragmento V_{L}) o 200 pmol para cada uno de LVH y PVHA (para el fragmento V_{H}), 10 \mul de dNTP 1 mm, 10 \mul de tampón Pfu 10 x, 1 \mul (2,5 unidades) de ADN polimerasa Pfu (Stratagene La Jolla, CA), agua desionizada hasta 100 \mul. Se usó Pfu a causa de su mayor precisión que la Taq polimerasa.

Las condiciones de reacción fueron las siguientes: 5 min. 94ºC, 5 min. 50ºC, 35 ciclos de 1 min. 94ºC, 1 min. 50ºC, 1 min. 72ºC, seguido de 5 min. a 72ºC. Los productos de PCR se purificaron en gel, se restringieron y se ligaron en Bluescript para la secuenciación. Una vez que se identificaron los clones que contenían la secuencia correcta, los vectores Bluescript que contenían estos clones se cortaron con Hind III y Sph I (V_{L}) o Hind III y Pst I (V_{H}) y los fragmentos se aislaron en gel. El fragmento de 0,75 kb Hind III-Sph I después se ligó en Bluescript que contenía la construcción de V_{L} de LO-CD2a original de la que se había retirado el fragmento Hind III - Sph I. La nueva construcción contenía la señal de LO-CD2a nativa más el intrón y una secuencia FR1 corregida (de acuerdo con la secuencia N-terminal). El fragmento de 0,16 kb Hind III - Pst I se ligó en Bluescript que contenía la construcción de V_{H} de LO-CD2a original de la que se había retirado el fragmento Hind III - Pst I. La nueva construcción contenía la señal nativa + intrón. Los fragmentos V_{L} y V_{H} recién construidos después se retiraron de Bluescript por digestión con Hind III y Bam HI y se clonaron en los vectores de cadena ligera y pesada MRC, respectivamente, para la expresión en células COS.

E. Expresión transitoria en células COS

Se obtuvieron células COS 7 de la ATCC (Nº de Acceso CRL-1651) y se cultivaron en Medio Esencial Mínimo de Dulbecco (DMEM) con suero bovino fetal al 10% (FBS). Se consiguió una transfección óptima a una confluencia de aproximadamente el 50% de células adherentes. En la preparación para la transfección, se añadió el ADN plasmídico a DMEM que contenía NuSerum y DEAE-Dextrano/difosfato de cloroquina. Se retiró el medio de células COS, se añadió la mezcla de ADN y se incubaron las células durante 3 horas a 37ºC. Este medio después se retiró, y se añadió DMSO al 10% en PBS a las células durante 2 minutos y después se retiró. Se añadió DMEM con FBS al 10% a las células. Después de incubación durante una noche, se remplazó el medio y se incubaron las células durante 2 días a 37ºC. Los sobrenadantes se recogieron para ensayo por ELISA para la secreción de anticuerpos quiméricos.

F. Detección de anticuerpo quimérico secretado por ELISA

La secreción de anticuerpo quimérico se confirmó por ensayo de los sobrenadantes de las células COS transfectadas en un ELISA diseñado para detectar la presencia de anticuerpo humano (o una parte del mismo). Se diluyó anticuerpo de cabra anti-IgG humana (H+L) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) diluida a una concentración de 5 \mug/ml y se unió a los pocillos de placas de microtitulación ELISA por incubación durante una noche a 4ºC. Las placas se lavaron 3 veces usando un lavador de placas ELISA.

Los sitios libres restantes se bloquearon por la adición de 200 \mul de PBS que contenía albúmina de suero bovino al 1% (PBS-BSA) durante 1/2 h. a temperatura ambiente. Se prepararon diluciones de factor dos en PBS-BSA de los sobrenadantes y de un patrón de referencia de control positivo (IgG1k humana purificada). Medios solos y/o PBS-BSA solo constituyeron los controles negativos. Se añadieron diluciones de anticuerpos y controles a los pocillos y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 1/2 horas. Las placas después se lavaron 3 veces con un lavador de placas en PBS que contenía Tween20 al 0,05%. Se añadió La dilución apropiada de un anticuerpo de cabra anti-IgG humana (específico de cadena gamma) conjugado con peroxidasa de rábano rusticano (HRP) o anticuerpo de cabra anti-cadena ligera kappa humana conjugado con HRP a cada pocillo y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas se lavaron con PBS-Tween20 como se ha descrito anteriormente, después de lo cual se añadió el sustrato de revelado (ABTS) que contenía peróxido de hidrógeno. El anticuerpo unido se detectó leyendo la absorbancia a una longitud de onda de 405 nm.

G. Especificidad de unión de anticuerpo quimérico secretado

La especificidad de unión del anticuerpo quimérico se evaluó por análisis de citometría de flujo de la unión del anticuerpo a la línea celular Jurkat mutante que expresa CD2 JRT3-T3-5. El perfil de unión del anticuerpo quimérico (IgG1 humana) se comparó con los del anticuerpo de rata nativo (IgG2b) y los mAb de control de isotipo coincidente (IgG1 humana e IgG2b de rata) que muestran especificidades de unión irrelevantes (no CD-2).

Preparación de la línea celular JRT3 - T3 - 5 (Jurkat). La línea celular Jurkat se obtuvo de la ATCC (Nº de Acceso TIB-153) y se propagó en D-MEM que contenía suero bovino fetal al 10% (FBS), suplemento aminoacídico al 10% (NCTC), y L-glutamina 6 mM (medio completo). Las células se mantuvieron a 37ºC con CO_{2} al 10% y se pasaron tres veces por semana a una proporción de 1:4 (siendo la concentración celular en el pase de aproximadamente 3 x 10^{6}/ml). Las células Jurkat se recogieron, se centrifugaron para retirar el medio usado, y se lavaron en DMEM. Las células después se resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) con azida sódica al 0,1% (NaAz), y se retiró una alícuota para la cuantificación celular. La cantidad de células viables se determinó por exclusión de azul tripán.

Tinción indirecta de células Jurkat. La tinción de la superficie celular se realizó en una placa de microtitulación de fondo en U de 96 pocillos. Se distribuyeron aproximadamente 6 x 10^{5} células en un volumen de 90 \mul en cada pocillo de la placa de microtitulación. Las diluciones de los anticuerpos a ensayar se prepararon en PBS con Na.Az al 0,1% y se distribuyeron en los pocillos apropiados en un volumen de 10 \mul. Las células se incubaron con anticuerpo durante 15 minutos a temperatura ambiente, después de lo cual las células se lavaron 3 veces añadiendo PBS con NaAz al 0,1% a cada pocillo y centrifugando durante 2 minutos a 1900 rpm (Sorvall RT6000D). La resuspensión de las células se consiguió por golpeteo suave de las placas. Se añadieron alícuotas de diez \mul del anticuerpo secundario (anti-Ig humana o anti-Ig de rata) conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) apropiado a los pocillos apropiados y se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos en la oscuridad. Las placas se lavaron 3 veces en PBS con NaAz al 0,1% como se ha descrito anteriormente. Las células teñidas se fijaron por la adición de 200 \mul de paraformaldehído al 0,5% en PBS y se almacenaron a 4ºC (hasta 1 semana).

Análisis de citometría de flujo de células Jurkat teñidas. Las células teñidas se transfirieron a tubos de poliestireno de 12 x 17 mm para la adquisición de datos usando un Becton-Dickinson FACScan. La adquisición y análisis de los datos se realizaron usando el software LYSIS-II. Las células Jurkat que expresaban CD2 se incubaron con el mAb LO-CD2a (IgG2b de rata), la versión quimérica de LO-CD2a (IgG1 humana), y los controles de isotipo coincidente correspondientes. El anticuerpo unido se detectó usando el anticuerpo secundario conjugado con FITC apropiado de acuerdo con el protocolo descrito anteriormente. El análisis muestra patrones de unión similares del LO-CD2a de rata nativo y el LO-CD2a humano-de rata quimérico.

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H. Expresión Estable en Células NSO

Para expresar el anticuerpo quimérico en un transfectante estable, se obtuvo el sistema de amplificación del gen de la glutamina sintetasa de Celltech Limited (Berkshire, RU). Este sistema se describe en Bebbington, et al., Biotechnology, Vol. 10, pág. 169-175 (1992). Los vectores de expresión usados fueron pEE6hCMV-B y pEE12. Dichos vectores se describen en las Solicitudes PCT publicadas Nº W086/05807, W087/04462, W089/01036, y W089/10404. Como ninguno de estos vectores contiene C kappa o C gamma 1, los clones genómicos para estos genes se obtuvieron de los vectores de cadena ligera y pesada MRC, respectivamente. Ambos clones de región constante se secuenciaron para obtener los mapas de restricción. Se prepararon dos construcciones en pEE12: la primera contenía la cadena ligera (V+C) 5' hasta la cadena pesada (V+C); la segunda construcción contenía la cadena pesada 5' hasta la cadena ligera.

La estrategia que implica la cadena ligera fue la siguiente:

1. Se digirieron pEE6hCMV-B y pEE12 cada uno con Xma I y Eco RI.

2. La parte 5' de 1,93 kb de la cadena ligera quimérica se retiró del vector MRC usando HindIII y Eco RI. Este fragmento se usó como molde para la mutagénesis por PCR del siguiente modo:

Oligos de PCR

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Los sitios de restricción están subrayados.

La PCR se realizó para cambiar el sitio de restricción 5' de HindIII a Xma I y para añadir una secuencia consenso Kozak en el extremo 5' de la construcción. Esto es esencial para una traducción eficaz (Kozak, M. J. Cell. Biol. 108: 229, 1989). El oligo de PCR 3' se usa para retirar los sitios internos Bam HI y Eco RI que impedirían las etapas de clonación posteriores. El producto final de la mutagénesis por PCR es un fragmento de 0,85 kb Xma I-Msc I. Las PCR se realizaron siguiendo las instrucciones suministradas con el kit de clonación TA (Invitrogen, San Diego, CA). Se usaron las siguientes condiciones para PCR: 2 min. a 94ºC seguido de 30 ciclos de 1 min. a 94ºC, 2 min. a 55ºC y 2 min. a 72ºC. Esto estuvo seguido de una extensión de 5 min. a 72ºC. Los ligamientos y las transformaciones se realizaron de acuerdo con las instrucciones del kit. Se secuenciaron varios clones por el método de terminación de cadena didesoxi, como se ha descrito previamente. Se retiró un clon correcto del vector de clonación TA por digestión con Xma I y Msc I. Este fragmento se purificó en gel usando Qiaex.

3. El fragmento C kappa de 2,7 kb se retiró del vector MRC por digestión con Msc I y Eco RI. El fragmento se purificó en gel usando Qiaex.

Usando dos ligamientos diferentes de 3 secciones, la cadena ligera quimérica completa, es decir, el fragmento de 0,85 kb Xma I/Msc I + el fragmento de 2,7 kb Msc I/Eco RI se ligó tanto en pEE6hCMV-B como en pEE12, cada uno de los cuales estaba cortado con Xma I/Eco RI.

La estrategia que implica la cadena pesada fue la siguiente:

1. Tanto pEE6hCMV-B como pEE12 se introdujeron por transfección en la cepa de E. coli DM1. Ambos vectores se digirieron con Eco RI y BcII (BcII cortará solamente si los plásmidos se propagan en bacterias metilasa menos).

2. La cadena pesada quimérica se retiró del vector MRC por digestión con HindIII y Eco RI. El fragmento de 2,7 kb resultante se purificó en gel usando Qiaex. Este fragmento se digirió con Nhe I y Bgl II. Esto produce un fragmento de 0,7 kb HindIII/Nhe I y un fragmento de 2 kb Nhe I/Bgl II. Ambos fragmentos se purificaron en gel. El fragmento de 0,7 kb después se usó como molde para mutagénesis por PCR.

Oligos de PCR

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Los sitios de restricción están subrayados.

Esta PCR se realiza para cambiar el sitio de restricción 5' de HindIII a Eco RI y para añadir una secuencia consenso Kozak. El oligo 3' se usa para retirar un sitio interno Bam HI que impediría las etapas de clonación posteriores. Las PCR, ligamientos y transformaciones se realizaron como se ha descrito previamente.

Usando dos ligamientos diferentes de 3 secciones, se ligó la cadena pesada quimérica completa, es decir el fragmento de 0,7 kb Eco RI/Nhe I + el fragmento de 2,0 kb Nhe I/Bgl II tanto en pEE6hCMV-B como en pEE12, cada uno cortado con Eco RI/Bcl I.

(Bcl I y BgI II son sitios de restricción compatibles).

Las construcciones finales en pEE12, que contenían ambas cadenas ligera y pesada quiméricas se prepararon del siguiente modo:

Cadena ligera 5' a cadena pesada: pEE6hCMV-B, que transporta la cadena pesada quimérica, se digirió con Bgl II/Bam HI. El fragmento de 5,1 kb que contenía la cadena pesada más el promotor de hCMV, se purificó en gel y se ligó en el sitio Bam HI de pEE12 que contiene la cadena ligera quimérica. La orientación correcta se comprobó por digestión con Sal I/Bam HI. La presencia de un fragmento de 0,28 kb indica una orientación correcta.

Cadena pesada 5' a cadena ligera: pEE6hCMV-B, que transporta la cadena ligera quimérica, se digirió con Bgl II/Bam HI. El fragmento de 5,9 kb que contiene la cadena ligera más el promotor de hCMV se purificó en gel y se ligó en el sitio Bam HI de pEE12 que contiene la cadena pesada quimérica. La orientación se comprobó por digestión con Sal I/Bam HI, como se ha indicado anteriormente.

Se transfectaron células NSIO (Galfre, et al., Meth. en Enzymol., Vol. 73(B) pág. 3-46 (1981), y depositadas en la European Collection of Animal Cell Cultures como ECACC Nº Catalog. 85110503, por electroporación. Las células transfectadas se seleccionaron por cultivo en medio sin glutamina. La producción de anticuerpos y la actividad de unión sobre células Jurkat que expresan CD2 se confirmaron como se ha descrito anteriormente.

El análisis funcional del anticuerpo quimérico humano-de rata muestra que sus propiedades funcionales son similares a las del anticuerpo LO-CD2a de rata. Ambos inhiben una reacción leucocitaria mixta primaria (MLR) cuando se añaden cantidades de nanogramos de anticuerpo hasta 120 ng/ml al cultivo. Además, la adición del anticuerpo quimérico a una MLR primaria induce un estado de hiposensibilidad en la población respondedora a la estimulación con el aloantígeno original o con un tercer aloantígeno. La hiposensibilidad es específica de aloantígeno porque la estimulación con mitógenos o toxoide tetánico provoca una respuesta proliferativa.

Ejemplo 7 Construcción y expresión de Anticuerpo Humanizado A. Construcción de Cadena Ligera Humanizada

Las regiones flanqueantes de un gen V kappa humano designado como HUM5400 (acceso EMBL X55400), que comparte homología con LO-CD2a, se eligieron para la humanización de la región V de cadena ligera. A continuación hay una comparación entre las regiones flanqueantes de LO-CD2a y HUM5400:

Región flanqueante 1

23

Región flanqueante 2

2300

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Región flanqueante 3

24

Región flanqueante 4

2400

Una comparación de las secuencias de la región variable de cadena ligera del LO-CD2a de rata, la región variable humana homóloga, HUM5400, y el LO-CD2a humanizado se muestra en la Figura 31. La secuencia de aminoácidos completa se da para la región variable de LO-CD2a y los restos están numerados de acuerdo con la secuencia de rata. Los restos idénticos a los de la rata en las posiciones correspondientes en las secuencias humanizada y HUM5400 se indican por líneas discontinuas horizontales, mientras que los restos no idénticos se dan por código de letra. La región variable de cadena ligera de LO-CD2a humanizada está compuesta por las regiones flanqueantes de HUM5400, las CDR de LO-CD2a de rata (subrayadas), y siete restos flanqueantes de LO-CD2a de rata (designados por un * encima de la secuencia de rata) que se seleccionaron porque dichos restos pueden ser relevantes para mantener la especificidad de unión de LO-CD2a.

Como se muestra en la Figura 31, la región flanqueante 1 es de los restos aminoacídicos 1 a 23. CDR1 es de los restos aminoacídicos 24 a 39. La región flanqueante 2 es de los restos aminoacídicos 40 a 54. CDR2 es de los restos aminoacídicos 55 a 61. La región flanqueante 3 es de los restos aminoacídicos 62 a 93. CDR3 es de los restos aminoacídicos 94 a 102. La región flanqueante 4 es de los restos aminoacídicos 103 a 112. La secuencia líder es de los restos aminoacídicos -20 a -1 (Figura 32). Los restos aminoacídicos de rata que están retenidos en las regiones flanqueantes son los restos aminoacídicos 9 y 12 en la región flanqueante 1; los restos aminoacídicos 41, 42, 50, y 51 en la región flanqueante 2; y el resto aminoacídico 82 en la región flanqueante 3.

Se construyó una cadena ligera humanizada que contiene las CDR de LO-CD2a y las regiones flanqueantes de la región variable de HUM5400 excepto para 7 restos no habituales (*) que se retuvieron de las regiones flanqueantes de LO-CD2a. La región 5' se tomó de la construcción de cadena ligera quimérica. Este fragmento de 0,43 kb Hind III/Hph I contiene la señal nativa más el intrón y la secuencia que codifica los 3 primeros restos aminoacídicos de la región flanqueante 1 que son idénticos en las regiones flanqueantes de rata y humana. El resto (es decir, el extremo 3') de la construcción (0,37 kb), que contiene los nucleótidos que codifican todo menos los tres primeros aminoácidos de la región variable, se sintetizó por PCR a partir de 7 oligonucleótidos solapantes, que varían en tamaño de 63-81 nucleótidos. Estos oligonucleótidos largos sirvieron como moldes para oligonucleótidos de PCR externa 5' y 3' más cortos (21-26 nucleótidos de longitud). En todos los casos, se usaron 5 pmol de molde junto con 100 pmol de cada oligonucleótido de PCR externa. Todas las PCR se realizaron usando la polimerasa Pfu para conseguir mayor fidelidad. El procedimiento fue el siguiente: 5 min a 95ºC, seguido de 25 ciclos que incluyeron 2 min a 94ºC, 2 min a 55ºC y 2 min a 72ºC. Esto estuvo seguido de una extensión de 5 min adicional a 72ºC. La síntesis completa se consiguió en 4 etapas. En la primera etapa, el primer oligonucleótido largo se añadió al fragmento de 0,43 kb Hind III-Hph I. Los siguientes 3 conjuntos de oligonucleótidos solapantes se añadieron después secuencialmente usando PCR. Después de que la síntesis de la construcción de 0,8 kb completa se completara, se purificó en gel usando Qiaex, se restringió con Hind III y Bam HI, se purificó en gel de nuevo con Qiaex, y se ligó a Bluescript KS II cortado con Hind III/Bam HI. Se secuenciaron varios clones hasta que se obtuvo una versión correcta. El clon después se retiró de Bluescript por digestión con Hind III y Bam HI. El fragmento resultante se purificó en gel usando Qiaex y se ligó en el vector de cadena ligera MRC que se había cortado con Hind III/Bam HI. Las secuencias de nucleótidos aminoácidos de la región V de cadena ligera de LO-CD2a humanizado se muestra en la Figura 32.

Los oligonucleótidos solapantes usados en la síntesis de la cadena ligera humanizada y una descripción de su uso se dan a continuación:

Oligonucleótido Nº 1:

2

Oligonucleótido Nº 2:

26

Oligonucleótido Nº 3:

27

Oligonucleótido Nº 4:

28

Oligonucleótido Nº 5:

29

Oligonucleótido Nº 6:

30

Oligonucleótido Nº 7:

31

Los oligonucleótidos 1, 3, 5, y 7 son secuencias de complementariedad inversa.

Los oligonucleótidos 2, 4, y 6 son secuencias de cadena con sentido.

El oligonucleótido Nº 1 solapa el fragmento de 0,43 kb Hind III/Hph I derivado de la construcción de cadena ligera quimérica. Este oligonucleótido se añadió al fragmento de 0,43 kb por PCR, usando los siguientes oligos de PCR:

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(5') PCR 1A (con sentido): 5'GATCAAGCTTCATGATGAGTCCT3'

(3') PCR 1A' (complemento inverso): 5'GCAAGAGATGGAAGCTGGTTG3'

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De un modo similar, los oligonucleótidos Nº 2 y Nº 3 se unieron juntos por PCR usando los siguientes oligos de PCR:

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5' PCR 2B (con sentido): 5'CAACCAGCTTCCATCTCTTGC3'

3' PCR 2B' (complemento inverso): 5'AGATTCCAGTTTGGATACCAA3'.

\vskip1.000000\baselineskip

Después de PCR, ambos productos se purificaron en gel usando Qiaex, y después se unieron juntos usando una tercera PCR. La tercera PCR requirió los siguientes oligos:

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(5') PCR 1A

(3') PCR 2B'.

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El fragmento resultante se purificó en gel por Qiaex. Los oligonucleótidos Nº 4 y Nº 5 después se unieron juntos por PCR usando los siguientes oligos:

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(5') PCR 3C (con sentido): 5'TTGGTATCCAAACTGGAATCTGGG3'

(3') PCR 3C (complemento inverso): 5'ATGGGTAAATTGCATGCAGTAATA3'

El fragmento después se purificó en gel y se añadió a la construcción previa usando los oligos de PCR:

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(5') PCR 1A

(3') PCR 3C.

\vskip1.000000\baselineskip

La pieza final se construyo usando los oligonucleótidos Nº 6 y Nº 7 y los oligos de PCR:

\vskip1.000000\baselineskip

(5') PCR 4D (con sentido): 5TACTGCATGCAATITACCCATTAT3'

(3') PCR 4D' (complemento inverso): 5'GATCGGATCCAACTGAGGAAGCAAAG3'

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Después de la purificación en gel, este fragmento se añadió al resto de la construcción de cadena ligera humanizada por PCR usando los oligos:

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(5') PCR 1A

(3') PCR 4D'.

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B. Construcción de la Cadena Pesada Humanizada

Las regiones flanqueantes del clon de anticuerpo humano Amu 5-3 (número de acceso GenBank U00562) se usaron para la generación de la cadena pesada humanizada. A continuación hay una comparación entre las regiones flanqueantes de LO-CD2a y las de Amu 5-3:

\newpage

Región flanqueante 1

32

Región flanqueante 2

3200

Región flanqueante 3

33

Región flanqueante 4

3300

La Figura 33 muestra las secuencias de la región variable de cadena pesada del LO-CD2a de rata, la región variable humana homóloga, Amu5-3, y el LO-CD2a humanizado (Vh humanizado). La secuencia completa de aminoácidos se da para LO-CD2a y los restos están numerados de acuerdo con la secuencia de rata. Los restos idénticos a los de la rata en las posiciones correspondientes en las secuencias humanizadas y Amu5-3 se indican por líneas discontinuas horizontales mientras que los restos no idénticos se dan por código de letra. El Vh LO-CD2a humanizado está compuesto por las regiones flanqueantes de Amu5-3, las CDR de LO-CD2a de rata, y siete restos flanqueantes de LO-CD2a de rata (designados por un * encima del resto de rata) que se seleccionaron porque pueden ser relevantes para mantener la especificidad de unión de LO-CD2a. Las líneas verticales en CDR3 de las secuencias de rata y humanizada representan espacios que se requerían para alinear las tres secuencias porque el Amu5-3 tiene una CDR3 más larga que las regiones de rata y humanizada.

Como se muestra en la Figura 33, la región flanqueante 1 es de los restos aminoacídicos 1 a 30. CDR1 es de los restos aminoacídicos 31 a 35. La región flanqueante2 es desde los restos aminoacídicos 36 a 49. CDR2 es de los restos aminoacídicos 50 a 66. La región flanqueante 3 es de los restos aminoacídicos 67 a 98. CDR3 es de los restos aminoacídicos 99 a 107. La región flanqueante 4 es de los restos aminoacídicos 108 a 118. La secuencia líder es desde los restos aminoacídicos -19 a -1, (Figura 34).

Los restos aminoacídicos de LO-CD2a de rata que se retienen en las regiones flanqueantes son el resto aminoacídico 47 en la región flanqueante 2; y los restos aminoacídicos 67, 70, 72, 76, 85 y 87 en la región flanqueante 3.

Se preparó una construcción de cadena pesada humanizada sencilla. Esta construcción contiene las CDR de LO-CD2a y las regiones flanqueantes de Amu 5-3, con la excepción de los 7 restos (*) retenidos de LO-CD2a. Esta construcción se produjo de un modo similar al de la cadena ligera humanizada. En este caso, había 12 oligonucleótidos molde solapantes, que varían de tamaño de 69-88 nucleótidos. Los 12 oligonucleótidos de PCR externa variaban de tamaño de 21-26. La síntesis se consiguió en 6 etapas, añadiendo un par de oligonucleótidos molde solapantes en cada etapa. La construcción final (0,7 kb) se purificó en gel usando Qiaex, se digirió con Hind III y Bam HI, se purificó en gel de nuevo, y se ligó en Bluescript para la secuenciación, como se ha descrito previamente. Cuando se identificó un clon correcto, se retiró de Bluescript por restricción con Hind III/Bam HI, y después se ligó en el vector de cadena pesada MRC que se había digerido con las mismas enzimas. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de la región V de cadena pesada de LO-CD2a humanizado se muestran en la Figura 34.

Los oligonucleótidos solapantes usados en la síntesis de la cadena pesada humanizada y una descripción de su uso se dan a continuación:

Oligonucleótido Nº 1 (con sentido):

34

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Oligonucleótido Nº 2 (antisentido):

35

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Oligonucleótido Nº 3 (con sentido):

36

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Oligonucleótido Nº 4 (antisentido):

37

\vskip1.000000\baselineskip

Oligonucleótido Nº 5 (con sentido):

38

\newpage

Oligonucleótido Nº 6 (antisentido):

39

Oligonucleótido Nº 7 (con sentido):

40

Oligonucleótido Nº 8 (antisentido):

41

Oligonucleótido Nº 9 (con sentido):

42

Oligonucleótido Nº 10 (antisentido):

43

Oligonucleótido Nº 11 (con sentido):

44

Oligonucleótido Nº 12 (antisentido):

45

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Los oligonucleótidos solapantes Nº 1 y Nº 2 se unieron juntos por PCR usando los siguientes oligos de PCR:

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(5') PCR 4H (con sentido): 5'GATCAAGCTTCATGAAATGCAGGTG3'

(3') PCR 4H' (antisentido): 5'CACCTGTGAGTTGACCCCTGTTG3'.

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El fragmento resultante se purificó en gel.

\newpage

Los oligonucleótidos solapantes Nº 3 y Nº 4 se unieron juntos por PCR usando los siguientes oligos de PCR:

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(5') PCR 1E (con sentido): 5'ACAGGGGTCAACTCACAGGTG3'

(3') PCR 1E' (antisentido): 5'GGCCTGTCGCACCCAGTACAT3'.

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El fragmento se purificó en gel.

Los oligonucleótidos Nº 5 y Nº 6 se unieron juntos por PCR usando los siguientes oligos de PCR:

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(5') PCR 2F (con sentido): 5'ATGTACTGGGTGCGACAGGCC3'

(3') PCR 2F' (antisentido): 5'TGTGCTAGAGGACGTGTCAGC3'.

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Después de purificación en gel, este fragmento se unión al fragmento producido por los oligonucleótidos Nº 3 y Nº 4 por PCR con los siguientes oligos:

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(5') PCR 1E (con sentido)

(3') PCR 2F' (antisentido).

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El fragmento resultante se purificó en gel.

Los oligonucleótidos Nº 7 y Nº 8 se unieron juntos por PCR usando los siguientes oligos de PCR:

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(5') PCR 3G (con sentido): 5'GCTGACACGTCCTCTAGCACA3'

(3') PCR 3G' (antisentido): 5'GGACTCACCTGAGGAGACGGT3'.

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El fragmento resultante se purificó en gel y se añadió a la construcción preparada uniendo los oligonucleótidos Nº 3 a Nº 6. Esto se consiguió usando los oligos de PCR.

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(5') PCR 1E (con sentido)

(3') PCR 3G' (antisentido).

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El fragmento resultante, preparado uniendo los oligonucleótidos Nº 3 a Nº 8, se purificó en gel. El extremo 5' de la construcción (oligonucleótidos Nº 1 + Nº 2) se añadió después usando los oligos de PCR:

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(5') PCR 4H (con sentido)

(3') PCR 3G'.

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Este fragmento se purificó en gel y la siguiente pieza (3') se añadió usando los oligonucleótidos Nº 9 y Nº 10.

Los oligonucleótidos Nº 9 y Nº 10 se unieron por PCR usando los siguientes oligos de PCR:

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(5') PCR 51 (con sentido): 5'ACCGTCTCCTCAGGTGAGTCC3'

(3') PCR 51' (antisentido): 5'CCTAGTCCTTCATGACCTGAA3'.

\newpage

Después de purificación en gel, esta pieza 3' se añadió al resto de la construcción usando los oligos de PCR:

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(5') PCR 4H (con sentido)

(3') PCR 51' (antisentido).

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El fragmento resultante se purificó en gel y se unió al resto de la construcción.

Los oligonucleótidos Nº 11 y Nº 12 se unieron por PCR usando los siguientes oligos de PCR:

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(5') PCR 6J (con sentido): 5TTCAGGTCATGAACGACTAGG3' y

(3') PCR 6J' (antisentido): 5'GATCGGATCCCTATAAATCTCTGGCC3'

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Después de purificación en gel, este fragmento 3' final se añadió al resto de la construcción usando los oligos (5') PCR4H (con sentido) y (3') PCR6J' (antisentido). La construcción final resultante de 0,7 kb se purificó en gel, se secuenció, y se clonó en el vector de cadena pesada MRC, como se ha indicado previamente.

La expresión transitoria en células COS y la detección de anticuerpo secretado se realizaron como se ha descrito previamente para el anticuerpo quimérico. El anticuerpo humanizado se purificó por cromatografía de afinidad (Proteína A). Los estudios de unión sobre células Jurkat demuestran patrones de unión similares entre las formas humanizada y de rata de LO-CD2a (Figura 35). La línea celular Jurkat, que expresa CD2, se tiñó con LO-CD2a de rata, el LO-CD2a humanizado (LO-CD2aHu), o los controles de IgG2b de rata o IgG humana. Las concentraciones de anticuerpo variaron de 0 a 4 \mug/ml. Las formas de rata y humanizada de LO-CD2a se unen a células Jurkat con patrones de unión similares, mientras que los anticuerpos de control de isotipo de rata y humanos no. Los anticuerpos unidos se detectaron con un antisuero conjugado con FITC específico de isotipo. Los resultados mostrados en la Figura 35 se expresan como el porcentaje de células teñidas positivamente por los anticuerpos sobre el intervalo de concentraciones mencionado anteriormente en este documento. Estudios funcionales indican que el anticuerpo humanizado también es capaz de inhibir una MLR primaria. Se añadieron cantidades de nanogramos de LO-CD2a, LO-CD2aHu, control de IgG2b de rata, o control de IgG1 humana a pocillos de cultivo que contenían cantidades equivalentes de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) de un respondedor y estimulador designados (células irradiadas). Los pocillos de control no contenían anticuerpo. Los cultivos se incubaron durante 5 días, después se pulsaron durante una noche con timidina tritiada (^{3}HT). La proliferación se detecta por la captación de ^{3}HT. Los resultados, dados en la siguiente Tabla 2, se expresan como las CPM medias registradas por un lector de placa Beta.

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TABLA 2

46

El anticuerpo humanizado también induce un estado hiposensible a estimulación con aloantígeno en células T (medido por la captación de ^{3}HT como CPM medias) cuando esas células T se cultivan en una MLR primaria en presencia de aloantígeno y LO-CD2a humanizado pero no cuando se sustituye un control de isotipo (con especificidad irrelevante) por el anticuerpo humanizado (Figura 36). Las propiedades funcionales del anticuerpo humanizado son similares a las del LO-CD2a de rata.

Ejemplo 8 LO-CD2a provoca hiposensibilidad específica de aloantígeno

Se examinó la capacidad de las células T de reconocer el aloantígeno en una MLR secundaria después de la adición de LO-CD2a solamente al cultivo primario. Los cultivos de MLR primaria contenían células respondedoras y células estimuladoras irradiadas en presencia de LO-CD2a, anticuerpo de control (LO-DNP11, Biotranplant, Inc., Charlestown, MA), o sin anticuerpo, y se incubaron durante 7 días. Las células después se lavaron y dejaron reposar en medio solo durante 3 días adicionales. Después del periodo de reposo, las células cultivadas se reestimularon con las células estimuladoras originales o células obtenidas de un donante diferente ("terceras" células).

Los resultados de un experimento representativo de estos estudios se ilustran en la Figura 37. En el Panel A, se observó una respuesta primaria cuando se cultivaron células respondedoras en presencia de anticuerpo de control a 200 ng/ml pero cuando las células se cultivaron en presencia de LO-CD2a a 200 ng/ml no se observó respuesta, coherente con datos presentados previamente. La cinética de la respuesta se determinó recogiendo las células en los días 3, 5, y 7. Los datos se presentaron como valores medios de pocillos triplicados procesados en cada punto de datos en que las cpm de pocillos individuales estaban en el 10% de la media.

Como se representa en la Figura 37B, las células respondedoras de cultivos tratados con LO-CD2a o anticuerpo de control se reestimularon con células estimuladoras que albergan aloantígeno a una proporción 1:1 sin ningún anticuerpo presente en la MLR secundaria. La cinética de la respuesta se determinó recogiendo los cultivos en los días 3, 5, y 7. La respuesta de las células cultivadas en MLR primaria con LO-CD2a o anticuerpo de control se incluye como control. Los datos se presentan como valores medios de pocillos triplicados procesados en cada punto de datos en que las cpm de pocillos individuales estaban en el 10% de la media. Los datos son del mismo experimento representado en la Figura 37A.

Como se muestra en la Figura 37C, las células estimuladas en una MLR primaria con un aloantígeno específico en presencia de LO-CD2a o anticuerpo de control después se estimularan con células que albergan aloantígeno de un tercer donante a una proporción 1:1 sin ningún anticuerpo presente en el cultivo secundario. La cinética de la respuesta se determinó recogiendo los cultivos en los días 3, 5, y 7. La respuesta de las células a células estimuladoras autólogas cultivadas en la MLR primaria con anticuerpo de control o LO-CD2a se incluye como control. Los datos se presentan como valores medios de pocillos triplicados procesados en cada punto de datos en que las cpm de pocillos individuales estaban en el 10% de la media. Los datos son del mismo experimento representado en las Figuras 37A y B.

Las células cultivadas en presencia de anticuerpo de control en el cultivo primario son sensibles a reestimulación por las mismas células estimuladoras alogénicas que las del cultivo primario (Panel B) y también eran sensibles a estimulación por terceras células (Panel C). En contraste, las células cultivadas en presencia de LO-CD2a durante la MLR primaria no eran sensibles a reestimulación con las células estimuladoras alogénicas primarias (Panel B) o estimulación por terceras células (Panel C). Las células en los cultivos que contenían LO-CD2a eran viables y sensibles a estímulos diferentes al aloantígeno. Por ejemplo, la estimulación por PHA u OKT3 soluble provocaba respuestas proliferativas equivalentes en células cultivadas con anticuerpo de control LO-CD2a, o con PBMC autólogas recientes (datos no mostrados). El análisis de citometría de flujo de estas células después de reposo no logró detectar LO-CD2a sobre la superficie celular (datos no mostrados). Por tanto, estos datos indican que la exposición a LO-CD2a y aloantígeno puede inducir un estado de hiposensibilidad a aloantígeno posterior, es decir, tolerancia.

Para abordar la especificidad de aloantígeno aparente de la hiposensibilidad inducida por LO-CD2a durante la estimulación con aloantígeno, las células obtenidas de cultivos después de la estimulación con aloantígeno se estimularon para responder al antígeno de proteína soluble, toxoide tetánico. Las respuestas a antígeno soluble requieren la presencia de células presentadoras de antígeno viables (APC), que estén eliminadas en cultivos estimulados con aloantígeno después de 7 días. Por lo tanto, en estos estudios, se proporcionó una fuente reciente de APC a las células cultivadas añadiendo PBMC autólogas irradiadas al cultivo de ensayo secundario. Como se representa en la Figura 38A, las células respondedoras de cultivos tratados con LO-CD2a o anticuerpo de control se reestimularon con células estimuladoras que albergan aloantígeno a una proporción 1:1 sin ningún anticuerpo presente en la MLR secundaria. La cinética de la respuesta se determinó recogiendo los cultivos en los días 3, 5, y 7. La respuesta de las células a células estimuladoras autólogas cultivadas en MLR primaria con LO-CD2a o anticuerpo de control también se incluye como control. Los datos se presentan como valores medios de pocillos triplicados procesados en cada punto de datos en que las cpm de pocillos individuales estaban en el 10% de la media.

Como se representa en la Figura 38B, las células respondedoras de cultivos tratados con LO-CD2a o anticuerpo de control se reestimularon con 7,5 \mug/ml de toxoide tetánico sin ningún anticuerpo presente en cultivos secundarios. La cinética de la respuesta se determinó recogiendo los cultivos en los días 3, 5, y 7. La respuesta de las células cultivadas en cultivos primarios sin anticuerpo y con células estimuladoras autólogas sirvió como control para la respuesta a toxoide tetánico.

Los resultados mostrados en las Figuras 38A y B demuestran que aunque las células cultivadas con LO-CD2a más aloantígeno en una MLR primaria eran hiposensibles a aloantígeno en una MLR secundaria, las células eran sensibles a toxoide tetánico cuando se presentaba por APC recientes.

Ejemplo 9

Para abordar el papel de la parte Fc de LO-CD2a, se realizaron estudios para comparar los efectos funcionales del fragmento F(ab')_{2} con el anticuerpo completo.

Como se muestra en la Figura 39, se cultivaron PBMC durante 6 días con la línea de células B transformada con virus Epstein-Barr (EBV) irradiado a una proporción respondedor a estimulador de 2:1 y dosis crecientes de LO-CD2a o su fragmento F(ab')_{2}. El gráfico representa el efecto del fragmento F(ab')_{2} sobre la respuesta de cuatro donantes diferentes, y cada punto es un valor medio de pocillos triplicados procesados en cada punto de datos. Los resultados se presentan como un porcentaje de la respuesta de control. Para claridad en el gráfico, los datos de la adición del anticuerpo completo LO-CD2a no se presentan. A una dosis de 30 ng/ml de LO-CD2a completo, las respuestas de los donantes eran: donante 1 - 18%; donante 2 - 6,6%; donante 3 - 3,7%; y donante 4 - 12% del control. Las respuestas celulares sin anticuerpo presente de los individuos ensayados tenían valores medios que variaban de 56.690 a 404.843 cpm, y las cpm de pocillos individuales estaban en el 10% de la media.

Para evaluar adicionalmente las propiedades inhibidoras potenciales del fragmento F(ab')_{2}, se añadió una titulación de dosis del fragmento F(ab')_{2} a PBMC no fraccionadas estimuladas con OKT3 soluble (una respuesta dependiente de APC). Como se representa en la Figura 40, las PBMC se estimularon con OKT3 soluble (100 ng/ml) durante 3 días. Se añadió anticuerpo intacto o el fragmento F(ab')_{2} de LO-CD2a en el día 0 a dosis crecientes. Los resultados se expresan como el porcentaje de la respuesta proliferativa de las células a OKT3 en presencia de un anticuerpo monoclonal de control de isotipo coincidente. Cada punto de datos es una media de pocillos triplicados en que las cpm de pocillos individuales estaban en el 10% de la media. Las cpm medias para PBMC estimuladas sin anticuerpo fueron 60.117.

Los resultados de la Figura 40 muestran que la proliferación de células T a OKT3 no se inhibía cuando se usó el fragmento F(ab')_{2}.

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Ejemplo 10 Se requiere APC para las propiedades inhibidoras de LO-CD2a en cultivos in vitro

Para abordar la cuestión del papel de APC en las propiedades inhibidoras de LO-CD2a, la población de células T de las PBMC se eliminó de células CD14, CD56, CD19 y HLA-DR positivas por selección inmunomagnética. El análisis por técnicas de citometría de flujo de las células purificadas demostró que la población de APC estaba eliminada en >95% (datos no mostrados). La proliferación de estas células T purificadas a OKT3 soluble (una respuesta dependiente de APC) se redujo a <1% de la proliferación de PBMC no fraccionadas por esta eliminación (datos no mostrados). Se estimularon células T purificadas o PBMC no fraccionadas por OKT3 unido a placa (un método independiente de APC de estimulación de células T) en presencia o ausencia de LO-CD2a. La capacidad de LO-CD2a de inhibir la activación de células T se eliminaba cuando se retiraron las APC (Figura 41). Como se muestra en la Figura 41, las PBMC o PBMC desprovistas de APC por técnicas inmunomagnéticas se sembraron en placas de 96 pocillos recubiertas con OKT3 (10 \mug/ml) y se cultivaron durante 3 días. Se añadió LO-CD2a al inicio de los cultivos. Los resultados se expresan como un porcentaje de la respuesta proliferativa de las células a OKT3 en presencia de un anticuerpo monoclonal de control de isotipo coincidente. Los datos representados son representativos de tres experimentos, donde cada punto de datos es la media de pocillos triplicados en que las cpm de pocillos individuales estaban en el 10% de la media.

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Ejemplo 11 Construcción y Análisis de LO-CD2a Humanizado de Segunda Generación (MEDI-507) Construcción de Vectores

Se realizó mutagénesis adicional de la cadena pesada de LO-CD2a humanizado de primera generación (Ejemplo 7B) para mejorar las propiedades de unión del anticuerpo. Se retuvieron cuatro restos flanqueantes de rata adicionales además de los siete retenidos en la molécula descrita en el Ejemplo 7. Estos cuatro cambios de aminoácidos se hicieron usando tres experimentos de mutagénesis por PCR diferentes (una de las PCR condujo a que se cambiaran dos aminoácidos).

Todas las PCR se realizaron usando la ADN polimerasa Pfu (Stratagene La Jolla, CA) y el siguiente programa: 5 minutos a 95ºC; 5 minutos a 72ºC; 25 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 55ºC, y 1 minuto a 72ºC; seguido de una extensión de 5 minutos a 72ºC. El ADN molde fue el fragmento de ADN de 701 pb (Por favor, confírmese) HindIII/BamHI aislado de la región V_{H} de LO-CD2a humanizado de primera generación. Los oligonucleótidos usados se enumeran en la siguiente Tabla 3.

TABLA 3 Oligonucleótidos Usados En La Construcción De la Cadena Pesada del LO-CD2a Humanizado de Segunda Generación (MEDI-507)

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La reacción Nº 1 incluía los oligonucleótidos 877 y 1007 y generó un fragmento de ADN de 185 pb que retenía dos restos del anticuerpo LO-CD2a de rata adicionales en la región flanqueante FR1 en los aminoácidos (AA) 12 y 13 (Gln 12 y Arg 13). (Los restos están numerados de acuerdo con Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Cuarta Edición, 1987, U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health).

La reacción Nº 2 incluía los oligonucleótidos 1006 y 875 y generó un fragmento de ADN de 515 pb que también retenía los dos restos de rata en los AA Gln 12 y Arg 13.

La reacción Nº 3 incluía los oligonucleótidos 877 y 1012 y generó un fragmento de ADN de 290 pb que retenía el resto de LO-CD2a de rata en la posición 48.

La reacción Nº 4 incluía los oligonucleótidos 1011 y 875 y generó un fragmento que también retenía el resto de rata en la posición 48.

Todos los productos de reacción se purificaron usando Qiaex (Qiagen, Chatsworth CA). Los productos de reacción después se sometieron a PCR adicional para generar el fragmento V_{H} de 701 pb, del siguiente modo. La reacción Nº 5 incluía los productos de reacción de las reacciones Nº 1 y Nº 2, y los oligonucleótidos 877 y 875; la reacción 6 incluía los productos de reacción de las reacciones Nº 3 y Nº 4, y los oligonucleótidos 877 y 875.

Para obtener la mutación en la posición 28, (Isoleucina) las PCR se establecieron usando el molde de la reacción Nº 5 (es decir, que contenía Gln12 Arg13). La reacción Nº 7 incluía los oligonucleótidos 877 y 1020 y generó un fragmento de ADN de 230 pb que retenía el resto de rata en la posición 28. La reacción Nº 8 incluía los oligonucleótidos 1008 y 875 y generó un fragmento de ADN de 470 pb que también retenía el resto de rata en la posición 28. Después de la purificación de los productos de reacción usando Qiaex (Qiagen, Chatsworth CA). Los productos de reacción después se sometieron a PCR adicional para generar el fragmento V_{H} de 701 pb y se clonaron en pBluescript/Sma (Stratagene La Jolla, CA) para posterior secuenciación de ADN.

Después del análisis de secuencia, se aislaron en gel dos fragmentos usando Qiaex (Qiagen, Chatsworth, CA): (1) 270 pb HindIII/EcoNI (Hu Vh mut 1+2A) que contenía 3 de los 4 nuevos cambios de aminoácidos; y (2) 430 pb EcoNI/BamHI (Hu Vh mut 3D) que contenía el cuarto cambio de aminoácidos. Los fragmentos después se ligaron en el vector de cadena pesada MRC, previamente descrito en el Ejemplo 6B, que ya contenía la región constante de cadena pesada humana, entre los sitios HindIII y BamHI, para producir el clon final, Clon Nº 257-20. El vector de expresión de cadena ligera era igual que el usado en el vector de expresión de primera generación (202-2).

La Figura 42 muestra la secuencia de aminoácidos del fragmento VH de LO-CD2a humanizado de segunda generación (MEDI-507) alineado con las secuencias del anticuerpo de rata y la secuencia variable de cadena pesada humana usada en el proceso de modelado.

Expresión Transitoria en Células COS Usando Vectores MRC

Se licenciaron dos vectores del Medical Research Council (MRC, Londres, RU) para la expresión de las cadenas ligera y pesada humanizadas, respectivamente (Figura 43). El vector de cadena ligera de 9,2 kb (hcmv-vllys-kr-neo) contiene un clon genómico de la región constante kappa humana y el dominio V_{L} humanizado de antilisozima como un fragmento HindIII-BamHI. El vector de cadena pesada de 8,6 kb (hcmv-VhLys-gammaI-neo) contiene un clon genómico de la región constante \gamma1 humana y el dominio V_{H} humanizado de antilisozima como un fragmento HindIII-BamHI (Maeda, et al., 1991, Hum. Antibod. Hybridomas, Vol. 2, pág. 124-134). Los dominios V_{L} y V_{H} de antilisozima se retiraron por digestiones con enzimas de restricción, y las construcciones V_{L} y V_{H} humanizadas se insertaron en su lugar. Los dos plásmidos después se introdujeron por co-transfección en células COS-7.

Las células COS-7 se obtuvieron de la ATCC (Número de acceso CRL-1651) y se cultivaron en FBS al 10%/medio DME a una confluencia del 40-60% en dos frascos rotatorios de plástico ondulados de 1700 cm^{2} de área superficial (Corning, Corning, NY). Se retiró todo el medio y se remplazó con medio de transfección [DMEM con NuSerum al 10% (Collaborative Research, Inc., Waltham, MA), DEAE-Dextrano/Difosfato de cloroquina, 0,25 mg de ADN de cadena pesada y 0,25 mg de ADN de cadena ligera para LO-CD2a humanizado] a 37ºC. Los frascos rotatorios se devolvieron a la incubadora y el aparato de frascos rotatorios durante tres horas, después de que se retirara todo el medio y se remplazara con DMSO al 10% en PBS a 37ºC. Después de 2 a 5 minutos de contacto, la solución de DMSO se retiró y se remplazó por FBS/DMEM. Los frascos rotatorios se devolvieron a la incubadora y el aparato de frascos rotatorios durante un día a 37ºC, después de lo cual se retiró el medio y se desechó (se supuso que la acumulación de proteína era demasiado baja en este punto para recogerla), y se remplazó con medio idéntico reciente. Después de incubación durante dos o tres días a 37ºC, se retiró la mitad del medio de cada frasco rotatorio y se remplazó con medio idéntico reciente. Este proceso se repitió hasta que se obtuvieron aproximadamente tres recogidas (después de ese punto, la producción disminuyó). Los sobrenadantes recogidos se ensayaron para la presencia de IgG humanizada por ELISA.

El anticuerpo resultante se purificó de los sobrenadantes de células COS transfectadas por cromatografía de afinidad (Proteína A). La actividad in vitro de este anticuerpo humanizado se comparó con la de LO-CD2a de rata usando 3 sistemas experimentales: unión a células Jurkat, inhibición de la reacción linfocitaria mixta (MLR) primaria, e inducción de hiposensibilidad a aloantígeno en una MLR secundaria. Las propiedades funcionales del anticuerpo humanizado producido en el sistema de expresión transitoria fueron similares a las de LO-CD2a de rata, y se confirmaron después en expresión estable del anticuerpo en células NSO.

Expresión Estable En Células NSO Usando Vector Celltech

La bioproducción de productos génicos recombinantes de mamífero para uso clínico generalmente necesita el uso de células eucariotas superiores para conseguir el procesamiento apropiado de las proteínas y actividad biológica completa. Las células de roedor inmortalizadas son actualmente el sistema de elección para este propósito debido a su capacidad de crecer hasta elevada densidad en medio barato, su elevad productividad, y su fidelidad de procesamiento post-traduccional. Los dos sistemas preferidos son: 1) selección por glutamina sintetasa (GS) en células NSO de mieloma murino (Bebbington, et al., 1992, Bio/Technology, Vol. 10, pág. 169-175), y 2) amplificación por dihidrofolato reductasa (dhfr) en células de ovario de hámster chino (CHO-DHFR menos) (Kaufman y Sharp, 1982, Journal of Molecular Biology, Vol. 159, pág. 601-621).

El sistema de glutamina sintetasa en células NSO se utilizó para la expresión estable y producción ocasional del LO-CD2a humanizado de segunda generación (MEDI-507). Las células NSO son auxótrofas de glutamina con una necesidad absoluta de glutamina añadida, o la introducción de un gen GS exógeno, para la supervivencia (Bebbington, et al., 1992). El sistema de expresión aprovecha la ventaja de esta propiedad de seleccionar células que llevan el gen GS y genes de inmunoglobulina en medio deficiente en glutamina (Cockett, et al., 1990, Biotechnology (NY), Vol. 8, pág. 662-667). Un método por el que las células pueden aumentar el nivel de glutamina sintetasa es aumentar el número de copias del gen por amplificación de ADN, con la amplificación concomitante del número de copias de genes adyacentes. Implícito en la dosificación génica aumentada existe un aumento en la producción del producto génico, en este caso tanto glutamina sintetasa como inmunoglobulina.

Los vectores de expresión Celltech (Figura 44) usados fueron pEE6hCMV-B y pEE12 (descritos en las Solicitudes PCT publicadas Nº W086/05807, W087/04462, W089/01036, y W089/10404). Como ninguno de estos vectores contenía C kappa o C gamma 1, los clones genómicos para estos genes se obtuvieron de los vectores de cadena ligera y pesada MRC, respectivamente. Ambos clones de la región constante se secuenciaron para obtener mapas de restricción.

A causa de las diferencias entre los vectores MRC y los vectores Celltech (los vectores MRC para las cadenas ligera y pesada son diferentes; en el vector Celltech, la cadena pesada sigue la cadena ligera, separadas por una región promotora de hCMV), es necesario hacer los siguientes cambios en las construcciones de cadena ligera y pesada.

Para clonar la construcción de cadena ligera de BTI-322 humanizado expresado de forma transitoria en el vector Celltech, se hicieron los siguientes cambios. El clon de cadena ligera, Clon Nº 202-2, se digirió con HindIII/EcoNI, y el fragmento de 1,93 kb se purificó en gel. Este fragmento sirvió como molde para mutagénesis por PCR para cambiar el sitio de restricción 5' a XmaI y añadir una secuencia consenso de inicio de la traducción (Kozak, 1986, Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes, Cell, Vol. 44, 283-292). Esta reacción de PCR también se usó para retirar los sitios internos BamHI y EcoRI para permitir las etapas de clonación posteriores. El producto de PCR de 0,85 kb resultante se secuenció y después se digirió con XmaI/MscI. El clon Nº 202-2 después se digirió con MscI/ EcoRI, y el fragmento de 2,7 kb se aisló en gel. Se realizó un ligamiento de 3 secciones de los fragmentos de 0,85 kb y 2,7 kb para insertarlos en pEE12 entre los sitios XmaI y EcoRI en el polienlazador. El clon resultante se llamó clon Nº 237-4.

La inserción de la construcción de cadena pesada en el vector Celltech requería los siguientes cambios: el clon Nº 257-20 se digirió con HindIII/EcoRI y la cadena pesada completa de 2,7 kb se aisló en gel. Este fragmento después se digirió adicionalmente con NheI/BglII para producir un fragmento de 0,7 kb HindIII/NheI y un fragmento de 2,0 kb NheI/BglII (El sitio BglII está muy cercano al extremo 3' original del clon, es decir, 20 pb desde el sitio EcoRI). El fragmento de 0,7 kb HindIII/NheI después se usó como molde para mutagénesis por PCR para cambiar el sitio de restricción 5' de HindIII a EcoRI y añadir una secuencia consenso de inicio de la traducción (Kozak, 1986, Cell, Vol. 44, pág. 283-292). El extremo 3' también se cambió retirando un sitio interno BamHI. El fragmento resultante se secuenció. Cuando se encontró un clon correcto, se realizó un ligamiento de 3 secciones del siguiente modo: los fragmentos de 0,7 kb EcoRI/NheI y de 2,0 kb NheI/BglII se ligaron en pEE6hCMV-B entre los sitios EcoRI y BclI en el polienlazador (BclI y BglII son sitios compatibles). Después de que se identificaran transformaciones bacterianas satisfactorias por PCR, uno de estos clones, designado clon Nº 6, se usó para construir el vector de expresión final.

Para hacer esto, el fragmento de 6 kb BglII/BamHI derivado del clon Nº 6, que contenía la cadena pesada humanizada más su promotor de hCMV se insertó en el sitio BamHI del pEE12/vector de cadena ligera humanizada 237-4. Después de la introducción por transformación en E. coli, se realizaron PCR usando ADN molde obtenido de colonias bacterianas que se habían hervido durante 5 minutos (PCR de colonia) para identificar clones que contienen tanto la cadena ligera como la pesada en la orientación correcta. Los dos cebadores de PCR oligonucleotídicos si diseñaron para amplificar una región que abarcaba el extremo 3' de la cadena ligera hasta el extremo 5' de la cadena pesada. El clon Nº 12 se identificó como correcto. Para asegurar adicionalmente que este clon contenía los insertos de cadena ligera y pesada en la orientación apropiada, se aisló el ADN plasmídico de este clon y el ADN se digirió con BamHI/SalI. La liberación de un pequeño fragmento de 0,25 kb del clon Nº 12 indicó que el fragmento de 6 kb BglII/BamHI que contenía la cadena pesada y el promotor de hCMV estaba en la orientación 5' a 3' correcta (si la orientación estaba invertida, un digestión con BamHI/SalI habría producido un fragmento de 6,3 kb).

Expresión Estable En Líneas Celulares NSO

El ADN del clon Nº 12, linealizado con SAII, se usó para la transfección de células NSO de acuerdo con el Sistema de Amplificación del Gen Glutamina Sintetasa Celltech - Manual of Operating Procedures (Versión 2: For Use with Myeloma Cells, Revisión 5: 6-14, 11-5-92). Las células se sometieron a electroporación a 3 \muF, 1500 voltios, 2 pulsos (40 \mug por 10^{7} células NSO transfectadas). Después de electroporación, las células se sembraron en 4-6 placas cada una de 16.000, 4.000, y 1.000 células/pocillo en 50 \mul/pocillo de FBS al 10%/DME. El siguiente día, se añadieron 150 \mul/pocillo de IMDM sin glutamina con FBS dializado al 10% a las placas. Las colonias se marcaron ya que se identificó que crecían en las placas de 96 pocillos en medio sin glutamina (lo que sugiere que se había incorporado el gen para la glutamina sintetasa que se unió al gen para el gen del anticuerpo MEDI-507). A partir de las transfecciones realizadas con el ADN mencionado anteriormente, se exploró un total de 204 colonias por ELISA y se seleccionaron por el título mayor. Se eligió aproximadamente una tercera parte de las colonias para la expansión a placas de 48 pocillos, se incubaron durante cinco días, y después se expandieron a matraces T-25. Cuando hubo sucedido un crecimiento celular significativo en cualquier matraz T-25 particular (habitualmente otros 3-6 días), el matraz se dividió adicionalmente en dos o tres matraces T-25 cada uno a 5x10^{4} células viables/ml. Uno de estos matraces se usó para comprobar la producción de anticuerpos permitiendo que el matraz se cultivara sin alteraciones durante 2-3 semanas. Los otros matraces se usaron para medir las velocidades de crecimiento celular y para propagar las diversas líneas celulares hasta que se pudo determinar que las líneas celulares eran dignas de ensayo adicional o clonación en base a la producción de anticuerpos, crecimiento celular, y adaptabilidad a crecimiento en medio libre de suero. Durante aproximadamente seis semanas las células usadas para propagar la línea celular simplemente se pasaron de un matraz a otro, no siempre realizando recuentos celulares antes de cada pase. Al final de este periodo, se inició la subclonación sobre varias de las líneas celulares más prometedoras, que se determina por los criterios mencionados anteriormente. MEDI-507hu2.2.204 era de una placa sembrada a 16K células/pocillo de placa. La subclonación se realizó sobre el clon MEDI-507hu2.2.204.x en dos placas cada una a 0,5 y 5 células/pocillo, y se dejaron incubando durante aproximadamente tres semanas.

El subclón marcado clon Nº 204.11 se generó en una placa de 5 células/pocillo (densidad de células viable de partida inicialmente calculada). La placa particular se había cultivado en 33 de 96 pocillos. Se marcaron veintinueve clones (de todas las placas) y se exploraron por ELISA. Cinco de los 29 clones se seleccionaron para la expansión a placas de 48 pocillos, después a un matraz T-25 después de 5-7 días de incubación. Los cinco clones se incubaron adicionalmente durante 5-7 días y después se expandieron a matraces T-75. Después de 5-7 días algunas de las células de estos matraces se usaron para preparar viales congelados de cada clon, el resto de las células se usó para ensayo adicional de la velocidad de producción de anticuerpos, velocidad de crecimiento, y adaptabilidad a medio libre de suero. Después de que se completara el proceso de exploración, los viales congelados previamente de los mejores clones de las mejores líneas celulares se descongelaron y se expandieron para congelar varios viales (habitualmente 3 ó 4) de cada uno, y se evaluaron adicionalmente en cultivo.

Comparaciones De Las Propiedades Funcionales y Biológicas In Vitro de MEDI-507 Humanizado y LO-CD2a de Rata

Se realizaron estudios que comparan la actividad funcional y biológica del MEDI-507 humanizado con las de LO-CD2a de rata en términos de afinidad de unión relativa, inhibición de la reacción linfocitaria mixta (MLR), capacidad de inducir hiposensibilidad a un aloantígeno en una MLR secundaria, y eliminación de células CD2 en ratones transgénicos Hu-CD2. Los resultados indican que los dos anticuerpos se comportan de forma similar.

Unión Relativa a Células Jurkat

Se realizó un ensayo de unión basado en células Jurkat para comparar la unión competitiva de un lote de investigación de MEDI-507 humanizado (Lote PA 112895) con el de LO-CD2a de rata (Lote SO82/83). Se incubaron trescientos \mul de células Jurkat a una densidad celular de 1,3 X 10^{6} células/ml a 4ºC con 20 \mul de una solución 4 mM de LO-CD2a de rata marcado con ^{125}I y 80 \mul de LO-CD2a de rata o MEDI-507 humanizado frío (no marcado). La concentración eficaz del LO-CD2a de rata marcado era 0,2 nM. El LO-CD2a de rata no marcado y MEDI-507 humanizado se varió de 2 nM a 0 nM. Un tubo que contenía la concentración eficaz 20 nM de LO-CD2a frío sirvió como control para la unión no específica.

Después de 30 minutos de incubación a 4ºC, se marcaron 240 \mul de esta mezcla de reacción en la parte superior de una mezcla oleosa de silicio de 50 \mul (2:1 (v/v) de AR-200: Thomas Silicon Oil) en un tubo de polipropileno estrecho y se centrifugó a 14.000 x g durante 5 minutos en un microcentrífuga. La separación del anticuerpo marcado del anticuerpo unido se consiguió por sedimentación de las células a través del lecho de aceite. La capa oleosa se cortó y se contó. Se contaron directamente cien \mul de la mezcla de reacción antes de la separación para determinar la aportación total de cpm. El análisis de los resultados de ensayo muestra patrones de unión similares entre LO-CD2a de rata y MEDI-507 humanizado (Figura 45).

Inhibición de MLR

Se examinó la capacidad de LO-CD2a de rata (Lote S082/83) y dos lotes de investigación diferentes del MEDI-507 humanizado (Lotes QAS y ASQ) de inhibir una reacción linfocitaria mixta. Se incubaron PBMC estimuladoras humanas irradiadas con PBMC respondedoras humanas de un donante diferente en presencia de LO-CD2a de rata, MEDI-507 humanizado, y controles de isotipo adecuados a concentraciones que varían de 10 a 60 ng/ml. Después de incubación durante 5 días a 37ºC, los cultivos se pulsaron con ^{3}H-timidina, y se determinó la incorporación de timidina. Los resultados (Figura 46) muestran que tanto el LO-CD2a de rata como el MEDI-507 humanizado inhiben la MLR de forma similar, de un modo dependiente de dosis.

Inducción de Hiposensibilidad

Una propiedad biológica importante de LO-CD2a de rata es su capacidad de inducir hiposensibilidad específica de aloantígeno in vitro. La capacidad de MEDI-507 humanizado (lotes QAS y ASQ) de inducir hiposensibilidad se comparó con la de LO-CD2a de rata (Lote S082/83).

Se realizaron MLR primarias en presencia de 10, 60, y 200 ng/ml de MEDI-507 humanizado, LO-CD2a de rata, o controles de isotipo apropiados, y un cultivo de control que no contenía anticuerpo. Después de incubación durante 7-8 días, las células se aislaron de los cultivos, se sedimentaron en Ficoll, se lavaron, se resuspendieron en medio de cultivo y se dejaron "reposar" durante 3-4 días a 37ºC. Las células de estos cultivos se usaron como células respondedoras en un cultivo de MLR secundaria que contenía células estimuladoras irradiadas del donante original. Después se incubaron los cultivos durante 48 horas adicionales, se pulsaron con ^{3}H-timidina, y se determinó la incorporación de timidina. El análisis de los resultados (Figura 47) demuestra que MEDI-507 humanizado también induce un estado de hiposensibilidad a la estimulación con aloantígeno.

Eliminación de Células CD2

Se comparó el efecto de MEDI-507 humanizado y LO-CD2a de rata sobre receptores CD2 humanos injertados en ratones (ratones transgénicos Hu-CD2). Veinticinco ratones transgénicos Hu-CD2 se asignaron a uno de cinco grupos para recibir MEDI-507 humanizado (0,12 mg/kg o 0,006 mg/kg), LO-CD2a de rata (0,12 mg/kg o 0,006 mg/kg), o un control de tampón (5 ratones/grupo). Se extrajo sangre de los ratones en los Días 0 (antes de recibir la dosis), 1, 3, 7, 14, 21, 28, 36, y 44; la sangre se analizó para linfocitos CD2.

Se recogió sangre completa en tubos que contenían heparina. Se distribuyeron cuatro alícuotas de 20 \mul en placas de cultivo tisular de 96 pocillos, de fondo redondo, se tiñeron con los anticuerpos apropiados, y se trataron con FACS Lyse para lisar los glóbulos rojos y para fijar las células teñidas. Después de lavar para retirar los anticuerpos no unidos y los desechos celulares, se analizó la población linfocitaria restante por citometría de flujo.

La Figura 48 muestra que la baja dosis del MEDI-507 humanizado y LO-CD2a de rata (0,006 mg/kg, que es una dosis de 0,15 \mug en estos ratones) no tuvo efecto detectable sobre el recuento de células CD2; estos ratones no se ensayaron después del momento puntual día 14. La dosis elevada de MEDI-SO7 humanizado y LO-CD2a de rata (0,12 mg/kg, que es una dosis de 3,0 \mug en estos ratones) tuvo un gran efecto de eliminación sobre los recuentos de células CD2. La eliminación de células que albergan CD2 en los ratones transgénicos tratados con elevadas dosis de los anticuerpos humanizado y de rata también fue comparable.

Claims (8)

1. Un anticuerpo humanizado que comprende las CDR de LO-CD2a como se define en las Figuras 31 y 42, conteniendo dicho anticuerpo humanizado en la región flanqueante de la región variable de cadena pesada del anticuerpo humanizado, los aminoácidos 47, 67, 70, 72, 76, 85, y 87, y uno, dos, tres, o cuatro de los aminoácidos 12, 13, 28, y 48 de la región variable de cadena pesada de LO-CD2a de rata como se muestra en la Figura 42.

2. El anticuerpo humanizado de la reivindicación 1 donde dicho anticuerpo humanizado contiene en la región flanqueante de la región variable de cadena pesada del anticuerpo humanizado, los aminoácidos 12, 13, 28, 47, 48, 67, 70, 72, 76, 85, y 87 de la región variable de cadena pesada de LO-CD2a de rata como se muestra en la Figura 42.

3. El anticuerpo humanizado de la reivindicación 1 donde dicho anticuerpo humanizado contiene adicionalmente en la región flanqueante de la región variable de cadena ligera del anticuerpo humanizado, uno o más de los aminoácidos 9, 12, 41, 42, 50, 51, y 82 de la región variable de cadena ligera de LO-CD2a de rata como se muestra en la Figura 31.

4. El anticuerpo humanizado de la reivindicación 3 donde dicho anticuerpo humanizado contiene en la región flanqueante de la región variable de cadena ligera del anticuerpo humanizado, los aminoácidos 9, 12, 41, 42, 50, 51, y 82 de la región variable de cadena ligera de LO-CD2a de rata como se muestra en la Figura 31.

5. El anticuerpo humanizado de la reivindicación 1 donde la región variable de cadena pesada del anticuerpo humanizado tiene la secuencia de aminoácidos de la Figura 42.

6. El anticuerpo humanizado de la reivindicación 3 donde la región variable de cadena ligera del anticuerpo humanizado tiene la secuencia de aminoácidos de la Figura 31.

7. Uso del anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la preparación de un medicamento para inhibir una respuesta inmune en un paciente.

8. Uso del anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la preparación de un medicamento para inhibir el rechazo de un injerto en un paciente.