JPH08511421A - 人化抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は，マウスモノクローナル抗体Ｌ243によって認識されるエピトープに対して特異性を有する人化抗体に関する．上記抗体の製造方法，ならびに上記抗体の医薬組成物および医学的使用も記載されている．

Description

【発明の詳細な説明】 人化抗体 発明の分野 本発明は，マウスモノクローナル抗体Ｌ243によって認識されるエピトープに 対して特異性を有する人化抗体，上記抗体の製造方法，上記抗体を含有する医薬 組成物，および上記抗体の医学的使用に関する． 人化抗体分子の語は，非ヒト種からの免疫グロブリンに由来する抗原結合部位 を有する分子であって，その分子の残りの免疫グロブリン由来部分はヒト免疫グ ロブリンから誘導される分子を記述するのに用いられる．抗原結合部位は，ヒト 定常部ドメインに融合された完全可変部であっても，また可変部ドメイン中の適 当なヒトフレームワーク領域にグラフトされた相補性決定領域（ＣＤＲ）のみで あってもよい． 発明の背景 ゲノムの主要組織適合性複合系領域にコードされたタンパク質は免疫学的認識 の多くの局面に関与している．すべての哺乳動物そして多分すべての脊椎動物が 基本的には同等なＭＨＣ系を有し，免疫応答遺伝子はＭＨＣに連結していること が知られている． ヒトでは，主要組織適合性複合系は，染色体６上のＨＬＡ遺伝子集団である． 主要な領域はＤ，Ｂ，Ｃ，およびＡである．Ｄ領域は，免疫系の細胞間の協調な らびに相互作用に関与するクラスIIタンパク質の遺伝子を含有する．多くの疾患 がＨＬＡ遺伝子集団のＤ領域に関連することが見出されてきた．現在までの研究 で，大部分の自己免疫疾患を含めて著しく多様な疾患との関連が明らかにされて いる（たとえば，欧州特許第68790号参照）．欧州特許第68790号には，ヒトにお いて，ＨＬＡ−Ｄ領域のようなＭＨＣのある種の領域の特定の対立遺伝子に関連 する疾患を，ＭＨＣ−クラスII抗原に特異的なモノクローナル抗体によって制御 される免疫応答（単数または複数）を選択的に抑制することによる制御が示唆さ れている． Ｌ243は，インビトロで免疫機能のとくに強力な抑制を示し，すべてのＨＬＡ −ＤＲに対し単形性であることから，自己免疫疾患のような疾病の処置にとくに 有用であろうと考えられるマウスＩｇＧ２Ａ抗−ＨＬＡ ＤＲ抗体である． 最も利用しやすいモノクローナル抗体は齧歯類起源の抗体であるが，それらは 本来，ヒトには抗原性を示し，したがってＨＡＭＡ（ヒト抗−マウス抗体）応答 と呼ばれる望ましくない免疫応答を生じることがある．そのため，ヒトの治療剤 としての齧歯類モノクローナル抗体の使用には，ヒト対象がその抗体に対して免 疫応答を装備しそれを完全に排除するかまたは少なくともその効果を減弱すると いう事実による固有の限界がある． これまで，ヒトにおいて抗原性の低い非ヒトＭａｂを作成する多くの提案がな されてきた．このような技術は総称して「人化」技術と呼ぶことができる．これ らの技術には一般に，抗体分子のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ配列を操作 する組み換えＤＮＡ技術が包含される．簡単な形の人化にはマウス抗体の定常部 のヒト抗体からの定常部による置換がある［Murrisonら(1984)Proc.Natl.Acad.s ci.USA 81 6851-55；Whittleら(1987)Prot.Eng．1 499-505］．キメラ抗体に対 するＨＡＭＡ応答レベルの低下から．抗原結合部位の外側の可変部をさらに人化 することによりこれらの領域に対する応答を排除して有害な応答をさらに減弱で きる可能性が期待される． 抗体のさらに複雑な形の人化にはマウス抗体の結合部位を構成するアミノ酸を ヒト抗体可変部のフレームワーク中に挿入するような可変部ドメインの再設計が 含まれる．人化には多くのクラスにおける全抗原結合活性の再構築が考慮される に至っている［Coら(1990)J.Immunol．148 1149-1154；Coら(1992)Proc.Natl.Ac ad.Sci.USA 88 2869-2873およびCarterら(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89 428 5-4289およびRoutledgeら(1990)Eur.J.Immunol．21 2717-2725ならびに国際特許 明細書ＷＯ91/09967；ＷＯ91/09968およびＷＯ92/11383］． したがって，Ｌ243の人化はヒトにおける免疫原性の低下を招来し，従来ヒト におけるマウス抗体の使用に際して考慮されてきたＨＡＭＡ応答の可能性という 問題が克服されることが予測できる． 本発明者らは今回，マウスモノクローナル抗体Ｌ243によって認識されるエピ トープに対して特異性を有する組み換え抗体分子を調製した． 発明の要約 第一の態様によれば，本発明はＤＲα鎖に依存する抗原決定基に対して特異性 を有する組み換え抗体分子を提供する． 組み換え抗体分子の語は組み換えＤＮＡ技術を用いて製造される抗体を意味し て用いられる．この抗体は好ましくは人化抗体たとえばキメラまたはＣＤＲグラ フト抗体である． 第一の態様の好ましい実施態様においては，本発明はマウスモノクローナル抗 体Ｌ243によって認識されるエピトープに対して特異性を有する組み換え抗体分 子を提供する． 本発明の第一の態様の好ましい実施態様においては，マウスモノクローナル抗 体Ｌ243によって認識されるエピトープに対して特異性を有する人化抗体分子で あって，可変部ドメインの少なくとも１個の相補性決定領域（ＣＤＲ）がマウス モノクローナル抗体Ｌ243（Ｍａｂ Ｌ243）に由来し人化抗体分子の残りの免疫 グロブリン誘導部分はヒト免疫グロブリンまたはその類縁体から誘導される抗原 結合部位を有し，上記人化抗体分子はエフェクターまたはレポーター分子と接合 していてもよい人化抗体分子を提供する． 人化抗体分子はキメラ人化抗体から構成されてもまたＣＤＲグラフト人化抗体 であってもよい．人化抗体分子がＣＤＲグラフト人化抗体からなる場合は，重鎖 および／または軽鎖可変部ドメインは１個または２個のみがＭａｂ Ｌ243由来 のＣＤＲから構成されてもよいが，好ましくは３個すべての重鎖および軽鎖ＣＤ ＲがＭａｂ Ｌ243から誘導される． 上述のようにＬ243は以前にLampson ＆ Levy［J.Immunol.(1980)125,293］に より報告されたモノクローナル抗体である．この抗体の軽鎖および重鎖可変部の アミノ酸配列は以下の図１および２に示す．Ｌ243はAmerican Type Culture Col lection，Rockville，Maryland，USAに受入番号ATCC HB55として寄託されている ． 発明の詳細な説明 本発明の人化抗体はそれにエフェクターまたはレポーター分子が結合していて もよい．たとえば，重金属原子をキレートするための巨大環状分子またはトキシ ンたとえばリシンが共有結合架橋構造によって人化抗体に結合していてもよい． また，組み換えＤＮＡ技術の操作を用いて，完全抗体分子のＦｃフラグメント， Ｃ_H３もしくはＣ_H２ドメインが機能性非免疫グロブリンタンパク質たとえば酵素 またはトキシン分子によって置換されているかまたはペプチド結合によってそれ に結合している人化抗体分子を製造することもできる． 本発明の人化抗体は，完全長重鎖および軽鎖を有する完全抗体分子；そのフラ グメントたとえばＦａｂ，Ｆａｂ'，（Ｆａｂ'）₂，もしくはＦｖフラグメント ；単一鎖抗体フラグメントたとえば単一鎖Ｆｖ，軽鎖もしくは重鎖モノマーもし くはダイマー；２，３，４もしくはそれ以上の抗体もしくはそれらのフラグメン トからなり，それらが連結構造によって互いに結合してなる多価のモノ特異的抗 原結合タンパク質；またはこれらのいずれかもしくはＭａｂ Ｌ243と同一の特 異性を有する他の分子のフラグメントもしくは類縁体から構成されることができ る． 好ましい実施態様においては，抗体は完全長重鎖および軽鎖を有する完全抗体 分子からなる． 人化抗体分子の残りの非Ｌ243免疫グロブリン由来部分は任意の適当なヒト免 疫グロブリンから誘導することができる．たとえば，人化抗体分子がＣＤＲグラ フト人化抗体分子である場合は，抗原結合領域が誘導されるドナー抗体のクラス ／タイプを考慮して適当な可変部フレームワーク配列を使用することができる． 用いられるヒトフレームワークの種類はドナー抗体と同一／類似のクラス／タイ プのものであることが好ましい．フレームワークは，とくにＣＤＲと空間的に近 接するかまたは隣接した位置でドナー抗体配列との相同性が最大／至適になるよ うに選択されるのが有利である．ＣＤＲグラフト抗体の構築に使用できるヒトフ レームワークの例には，ＬＡＹ，ＰＯＭ，ＴＵＲ，ＴＥＩ，ＫＯＬ，ＮＥＷＭ， ＲＥＩおよびＥＵがあり，たとえば重鎖にＫＯＬおよびＮＥＷＭ，軽鎖にＲＥＩ または重鎖および軽鎖の両者にＥＵが用いられる． 適当なヒトフレームワークの選択のための別の操作には，非ヒトフレームワー クの軽鎖のフレームワーク領域を，Kabatら(1991)［Sequences of Proteins of Immunological Interest，5版］によって同定された４つのヒト軽鎖サブグルー プのフレームワーク領域とアラインさせる操作が包含される．非ヒト抗体軽鎖に 最も相同な軽鎖サブグループについてのコンセンサス配列が選択される． 非ヒト抗体とコンセンサスヒトグループ軽鎖配列のフレームワーク残基の間の 差を，公開国際特許出願ＷＯ91/09967号に記載されているようにして，それらが もつ抗原結合への寄与の可能性について分析する．この分析に基づいて，同定さ れた残基の一部またはすべてを変化させることができる．非ヒト重鎖ＣＤＲを容 認する適当なフレームワークの選択についても同じ操作が行われる． Ｌ243ＣＤＲグラフト軽鎖を構築するためにはヒトサブグループ１コンセンサ ス配列がとくに適していることが見出され，またＬ243グラフト重鎖の構築にも ヒトサブグループ１コンセンサス配列がとくに適当であることが見出された． 人化抗体分子の軽鎖または重鎖可変部ドメインは必要に応じて，ヒト軽鎖また は重鎖定常部ドメインに融合させることができる（本明細書において用いられる 「重鎖定常部ドメイン」の語はとくに指示のない限り，ヒンジ部を包含すると理 解すべきである）．人化抗体分子のヒト定常部ドメインは，存在する場合には， その抗体に提案される機能とくに必要なエフェクター機能の欠如を考慮して選択 することができる．たとえば，重鎖可変部に融合させる重鎖定常部ドメインは， ヒトＩｇＡ，ＩｇＧまたはＩｇＭドメインとすることができる．好ましくはヒト ＩｇＧドメインが使用される．軽鎖可変部に融合させることができる軽鎖ヒト定 常部ドメインには，ヒトλまたはヒトκ鎖が包含される． ヒト定常部ドメインの類縁体も代替として有利に使用できる．これらには，相 当するヒトドメインよりも１個または２個以上多い付加アミノ酸を含有する定常 部ドメインまたはヒトドメインに存在するアミノ酸の１個または２個以上を欠失 または変化させた定常部ドメインが包含される．このようなドメインはたとえば オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発によって得られる． 人化抗体分子の残部はヒト免疫グロブリンからのタンパク質配列のみで構成さ れる必要はない．たとえばヒト免疫グロブリン鎖の部分をコードするＤＮＡ配列 がポリペプチドエフェクターまたはレポーター分子のアミノ酸配列をコードする ＤＮＡ配列に融合されている遺伝子を構築することができる． 本発明者らは，Ｌ243抗体のＣ_H２ドメインのＮ−末端領域における１個または ２個以上の残基を修飾することにより，変化前の抗体に比較して補体結合能の 変化した抗体が産生されることを見出した． 変化させることが好ましいアミノ酸残基はアミノ酸位置231〜239，好ましくは アミノ酸位置234〜239にある． とくに好ましい実施態様においては，変化させるアミノ酸残基はLeu 235およ び／またはGly 237である． 抗体が補体を結合する能力に関連して用いられた場合の本明細書で使用される 「変化」の語は通常，出発した無変化抗体に比較して抗体の補体結合能が低下す ることを指示する．変化させる適当なアミノ酸を選択することにより，たとえば 残基Leu 235を変化させることにより，その補体結合能が実質的に低下した抗体 を製造することが可能である．たとえばアミノ酸残基Gly 237を変化させること により，無変化抗体に比較して中程度の補体結合能を有する抗体を製造すること も可能である． 本明細書で用いられる補体結合を「実質的に」低下させるの句は，ヒト補体結 合が野生型抗体に認められるレベルの好ましくは≦30％，さらに好ましくは≦20 ％，とくに好ましくは≦10％であることを意味する． Ｃ_H２ドメインのＮ−末端領域における１個または２個以上のアミノ酸残基の 変化により，好ましくは抗体はＦｃＲＩには有意に結合せず，ＦｃＲIII受容体 に結合するようになる． 本明細書で用いられる残基のナンバーリングは．Kabatら［(1991)Sequences o f Proteins of Immunological Interest，5版，United States Department of H ealth and Human Services］に記載のＥｕインデックスに従う． 位置235におけるロイシンのグルタミン酸またはアラニンによる置換の変化は インビトロで最小毒性を示す強力な免疫抑制Ｌ243抗体の製造にとくに有効であ ることが見出された． 位置237におけるグリシンのアラニンによる置換の変化は中等度の補体結合能 を有する抗体，すなわち補体結合レベルが野生型抗体に認められるレベルのほぼ 15〜80％，好ましくは20〜60％，とくに好ましくは20〜40％の抗体を産生するこ とが見出された． 残基（単数または複数）は，本明細書に記載したのと類似の方法を用いて，た とえばその側鎖に不適当な機能を有する他のアミノ酸残基またはアミノ酸誘導体 によって置換することができた．これはたとえば，その側鎖の荷電および／また は極性を変化させることによって達成できる． ＦｃＲＩ結合に関して用いられる「有意に」の語はＦｃＲＩに対する抗体の結 合が通常，無変化抗体に認められるレベルの≦20％，とくに好ましくは≦10％で あることを意味する． 本発明の抗体をコードするＤＮＡ配列の調製には分子生物学の標準技術が使用 できる．所望のＤＮＡ配列は，オリゴヌクレオチド合成技術を用いて完全にまた は部分的に合成することができる．必要の応じて，部位特異的突然変異誘発およ びポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）技術を使用することもできる． 適当な方法には，たとえば，”PCR Technology Principles and Applicatlons for DNA Amplification”(1989)，H.A.Erlich編，Stockholm Press，N.Y．and Londonに記載されているようなＰＣＲストランド重複操作およびＰＣＲ突然変異 誘発ならびにオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発［Kramerら，Nucl.Acid.Re s．12 9441(1984)］が包含される．適当な技術は公開欧州特許EP307434Bにも開 示されている． 補体結合能が変化した改変Ｌ243は，たとえば235のような残基の欠失，または たとえば分子内の適当な位置へのグリコシル化部位の挿入によって製造できる． このような技術は本技術分野においてよく知られていて．たとえば公開欧州特許 出願EP-307434の教示を参照されたい． 改変Ｌ243はまた，イソタイプの異なる抗体の低位ヒンジ部を交換することに よって製造することもできる．たとえば，Ｇ１／Ｇ２低位ヒンジ部の交換では補 体結合が排除される． Ｇ１／Ｇ２低位ヒンジ部の交換においては，Ｃ_H2ドメインのＮ−末端領域の23 1〜238領域における残基が変化した抗体を生じる．この場合，１個または２個以 上の残基が変化または欠失する． 本発明の第二の態様によれば，本発明の第一の態様の人化抗体を製造する方法 において， ａ）可変部ドメインの少なくとも１個のＣＤＲがＬ243 Ｍａｂに由来し，その 抗体鎖の残りの免疫グロブリン誘導部分はヒト免疫クロブリンから誘導される可 変ドメインからなる抗体重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡ配列を有するオペロ ンを発現ベクター内に製造し， ｂ）可変部ドメインの少なくとも１個のＣＤＲがＭａｂ Ｌ243に由来し，その 抗体鎖の残りの免疫グロブリン誘導部分はヒト免疫グロブリンから誘導される可 変ドメインからなる相補性抗体軽鎖または重鎖をコードするＤＮＡ配列を有する オペロンを発現ベクター内に製造し， ｃ）両オペロンで宿主細胞をトランスフェクトし， ｄ）トランスフェクトされた細胞系を培養して人化抗体分子を産生させる，こ とからなる方法を提供する． 本発明のこの態様の好ましい実施態様においては，少なくとも１個の発現ベク ターは，その抗体のＣ_H２ドメインのＮ−末端領域の１個または２個以上のアミ ノ酸残基が相当する無変化抗体におけるアミノ酸残基から変化している抗体重鎖 をコードするＤＮＡ配列を含有する． Ｃ_H２ドメインのＮ−末端領域における変化は，全非修飾抗体が発現されたの ちに，部位特異的突然変異誘発のような技術を用いて作成されてもよい． 細胞系は，軽鎖由来のポリペプチドをコードするオペロンを含有する第一のベ クターおよび重鎖由来のポリペプチドをコードするオペロンを含有する第二のベ クターの２つのベクターによってトランスフェクトすることができる．これらの ベクターは，コード配列および選択マーカーに関する部分を除いて，各ポリペプ チド鎖が可能な限り同等に発現されることを保証するために，同一であることが 好ましい． 別法として，軽鎖および重鎖由来のポリペプチドの両者および選択マーカーを コードするオペロンを包含する単一のベクターを使用することもできる． Ｃ_H２ドメインのＮ−末端領域における変化，たとえば分子のＣ_H２ドメインの 位置235における変化は，人化の任意の便利な段階で，たとえばＣＤＲグラフト 過程で導入することができる．それは可変部ドメインが重鎖にグラフトされたの ちに導入するのが便利である． さらに他の態様においては，本発明はまた，本発明の抗体の重鎖および軽鎖を コードするＤＮＡ配列，これらのＤＮＡ配列を含有するクローニングおよび発現 ベクター，これらのＤＮＡ配列でトランスフォームされた宿主細胞，ならびにこ れらのＤＮＡ配列をトランスフォームされた宿主細胞内で発現させることからな る重鎖または軽鎖およひ抗体分子の製造方法を包含する． ベクターを構築する一般的方法としてはトランスフェクション法および培養法 がそれ自体よく知られている［たとえばManiatisら(1982)Molecular Cloning，C old Spring Harbor，New YorkおよびPrimrose ＆ Old(1980)Principles of Gene Manipulation，Blackwell，Oxfordならびに以下の実施例参照］． Ｌ243軽鎖および重鎖可変部ドメインのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列 （および相当する推定アミノ酸配列）はそれぞれ以下の図１および２に示す． ヒト免疫グロブリン配列をコードするＤＮＡは任意の適当な方法で得ることが できる．たとえばＬＡＹ，ＰＯＭ，ＫＯＬ，ＲＥＩ，ＥＵ，ＴＵＲ，ＴＥＩおよ びＮＥＷＭのような好ましいヒトアクセプターフレームワークのアミノ酸配列は 本技術分野の研究者には広く利用可能である．同様にヒト軽鎖および重鎖サブグ ループに対するコンセンサス配列も本技術分野の研究者には利用可能である． ＣＤＲグラフト生成物をコードするＤＮＡ配列の調製には分子生物学の標準的 技術が使用できる．所望のＤＮＡ配列はオリゴヌクレオチド合成技術を用いて完 全にまたは部分的に合成することができる．必要に応じて，部位特異的突然変異 誘発およびポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）技術を用いることもできる．た とえばオリゴヌクレオチド特異的合成［Jonesら(1986)Nature 321 522 525］， また予め存在する可変部ドメイン領域のオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発 ［Verhoeyenら(1988)Science 239 1534-1536およびReichmannら(1988)Nature332 323-327］を使用することができる． ギャップを有するオリゴヌクレオチドのＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いる酵素 的充填［Queenら(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86 10029-10033；国際特許出願 ＷＯ90/07861］を使用することもできる． キメラまたはＣＤＲグラフト重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡ配列の発現に は任意の適当な宿主細胞／ベクター系が使用できる．細菌たとえば大腸菌および 他の微生物系は，抗体フラグメントたとえばＦｖ，ＦａｂおよびＦａｂ'フラグ メントならびに単一鎖抗体フラグメントたとえば単一鎖Ｆｖの発現にとくに有利 に使用できる．真核細胞たとえば哺乳動物宿主細胞発現系も本発明の抗体を得る ために，とくに大きなキメラまたはＣＤＲグラフト抗体生成物の製造に使用する ことができる．適当な哺乳動物宿主細胞としては，ＣＯＳ細胞およびＣＨＯ細胞 ［Bebbington ＣＲら(1991)Methods 2 136-145］，ならびに骨髄腫またはハイブ リドーマ細胞系たとえばＮＳＯ細胞［Bebbington CRら(1992)Bio/Technology 10 169-175］がある．ＣＨＯ細胞の使用はとくに好ましい． 本発明の人化抗体は，重鎖および軽鎖可変部ドメインが，Ｍａｂ Ｌ243の全可 変部ドメイン，またＭａｂ Ｌ243のＣＤＲの１つ，一部もしくはすべてがグラフ トされたヒト可変部ドメインのフレームワーク領域のいずれで構成されていても よい．すなわち，人化抗体はキメラ人化抗体またはＣＤＲグラフト人化抗体とす ることができる． 人化抗体分子がＣＤＲクラフト人化抗体である場合には，ＣＤＲに加えて，特 定の可変部フレームワーク残基が非ヒトすなわちＬ243マウス残基に相当するよ うに変化させることができる．本発明のＣＤＲグラフト人化抗体には，好ましく は，本発明者らの国際特許明細書ＷＯ-Ａ-91/09967において定義されたＣＤＲグ ラフト人化抗体が包含される．ＷＯ-Ａ-91/09967における開示は引用により本明 細書に導入される． 好ましくは，重鎖のＣＤＲは，ＣＤＲ１（31〜35），ＣＤＲ２（50〜65）およ びＣＤＲ３（95〜102）のすべてにおいてＬ243残基に相当する．好ましくは，軽 鎖のＣＤＲは，ＣＤＲ１（24〜34），ＣＤＲ２（50〜56）およびＣＤＲ３（89〜 97）のすべてにおいてＬ243残基に相当する．これに加えて，重鎖は残基27，67 ，69，71，72および75の１つまたは２つ以上でマウスＬ243残基をもっていても よい．同様に，軽鎖は残基45，49，70および71の１つまたは２つ以上でマウスＬ 243残基をもっていてもよい． 本発明はさらに，ヒトサブグループコンセンサス配列１およびＬ243ドナー抗 原結合部位から誘導されるアクセプターフレームワークからなる可変部ドメイン を有し，この場合フレームワークは位置27，67，69，71，72および75の１つまた は２つ以上でＬ243ドナー残基からなるＣＤＲグラフト人化抗体重鎖を提供 する． 本発明はさらに，ヒトサブグループコンセンサス配列１およびＬ243ドナー抗 原結合部位から誘導されるアクセプターフレームワークからなる可変部ドメイン を有し，この場合フレームワークは位置45，49，70および71の１つまたは２つ以 上でＬ243ドナー残基からなるＣＤＲグラフト人化抗体軽鎖を提供する． 重鎖はさらにマウスＬ243残基を，残基2，9，11，16，17，20，38，43，46，8 0，81，82，82a，82b，83，84，89，91．108および109の１つまたは２つ以上に もっていてもよい． 軽鎖はさらにマウスＬ243残基を，残基9，13，17，18，37，40，43，45，48， 49，72，74，76，80，84，85，100，103および104の１つまたは２つ以上にもっ ていてもよい． 本発明の人化抗体は，完全抗体，または上に説明したように，そのフラグメン ト，モノマーもしくはダイマー，または多価のモノ特異的抗原結合タンパク質で あってもよい．この後者の群のある種の化合物は，それらが高い結合活性を有す る点でとくに有利である．たとえば，国際特許明細書ＷＯ92/01472参照．この教 示は本明細書に導入する． すなわち本発明のさらに特定の態様によれば，2，3，4個もしくはそれ以上の 抗体もしくはそれらのフラグメントからなり，それらが連結構造によって互いに 結合してなる多価モノ特異的抗原結合タンパク質であり，そのタンパク質は天然 の免疫グロブリンではなく，上記抗体またはそのフラグメントはマウスＭａｂＬ 243によって認識されるエピトープに対する特異性を有し，上記抗原結合タンパ ク質はエフェクターまたはレポーター分子と接合していてもよいタンパク質を提 供する． 本発明のこの態様においては，各抗体またはそのフラグメントは，好ましくは 上に定義した人化抗体またはそのフラグメントであり，多価モノ特異的抗原結合 タンパク質はしたがって人化多価モノ特異的抗原結合タンパク質である．しかし ながら，非人化たとえばマウス多価モノ特異的抗原結合タンパク質も考慮するこ とが可能であり，本発明はこれらにも及ぶことを理解すべきである． 多価抗原結合タンパク質は好ましくは，互いに連結構造によって結合した２， ３もしくは４個の抗体またはそれらのフラグメントからなる． 本発明の抗体によって処置できる免疫疾患には，たとえば，関節疾患たとえば 強直性脊柱炎，若年性関節リウマチ，慢性関節リウマチ；神経性疾患たとえば多 発性硬化症；膵臓疾患たとえば糖尿病，若年発症型糖尿病；胃腸管疾患たとえば 慢性活動型肝炎，セリアック病，潰瘍性大腸炎，クローン病，悪性貧血；皮膚疾 患たとえば乾癬；アレルギー疾患たとえば喘息および移植関連症状たとえば移植 片対宿主病および同種移植片拒絶反応が包含される．他の疾患としては，欧州特 許第68790号に記載された疾患が包含される． 本発明はまた本発明の抗体を含有する治療用および診断用組成物を包含する． このような組成物は通常，本発明の抗体を医薬的に許容される，たとえばインビ ボ用の賦形剤，希釈剤または担体とともに含有する． すなわち，本発明のさらに他の態様においては，本発明の抗体を医薬的に許容 される賦形剤，希釈剤または担体と配合して含有する治療用，医薬用または診断 用組成物が提供される． 本発明はまた，本発明の抗体を医薬的に許容される賦形剤，希釈剤または担体 とともに混合することからなる治療用，医薬用または診断用組成物の製造方法を 提供する． 抗体および組成物は，それらが使用される治療に応じて適当な形態および量で 投与することができる． 治療用，医薬用または診断用組成物は任意の適当な投与形態，好ましくはたと えば注射または輸液，たとえば単回注射または連続輸液による非経口投与に適し た形態とすることができる．製品が注射または輸液用である場合には，それは油 性または水性ビヒクル中懸濁液，溶液または乳化液の形態とすることが可能で， 処方補助剤たとえば懸濁剤，防腐剤，安定化剤および／または分散剤を含有させ ることができる． 別法として，抗体または組成物は，使用前に適当な滅菌液体で再構築する乾燥 剤形とすることもできる． 抗体または組成物が経口投与に適している場合には，処方には活性成分のほか に，添加剤たとえば，デンプンたとえば馬鈴薯，トーモロコシもしくは小麦デン プンまたはセルロースもしくはデンプン誘導体たとえば微結晶セルロース；シリ カ；各種糖たとえばラクトース；炭酸マグネシウムおよび／またはリン酸カルシ ウムを含有させることができる．経口製剤が投与用である場合には，それは患者 の消化系に十分耐えうることが望ましい．この目的では処方中に粘液形成物質お よび樹脂を包含させることが望ましい．抗体または組成物を胃液に不溶性のカプ セル中に処方することによって耐容性を改良することも望ましい．抗体または組 成物を制御放出製剤中に包含させることも好ましい． 抗体または組成物が経直腸投与に適している場合には，結合剤および／または 潤滑剤，たとえば重合グリコール，ゼラチン，ココア脂または他の植物性ワック スまた油脂を含有させることができる． 治療的および診断的使用は通常，本発明の抗体の有効量をヒト対象に投与する ことからなる．投与する正確な用量は，抗体の用途，ならびに患者の年齢，性別 および状態に応じて変動するが，通常は約0.1mg〜1000mgたとえば約１mg〜500mg の範囲である．抗体は単回用量の投与としてもよく，また長時間連続的に投与す ることもできる．投与は必要に応じて反復することができる． 抗体および組成物は，それらが使用される治療に応じて，任意の適当な形態お よび量で投与することができる．抗体の投与量は，処置される状態の本質および 抗体が予防的に用いられるのかまたは現存する状態の処置に使用されるのかに依 存する．用量はまた，患者の年齢および状態に応じて選択される．本発明の抗体 の治療用量はたとえば，好ましくは１回治療用量として0.1〜25mg/kg体重，とく に好ましくは１回治療用量として0.1〜10mg/kg体重である． 抗体は，適当な経路による投与のための慣用の実務に従って製剤化することが 可能で，一般的には，たとえば静脈内，腹腔内または筋肉内投与経路のための液 体剤形（たとえば，医薬的に許容される滅菌緩衝液中抗体溶液）とすることがで きる． 本発明を単に例示の目的で，以下に図面を参照しなから説明する． 図１：Ｌ243 Vl領域のアミノ酸配列を示す． 図２：Ｌ243 Vh領域のアミノ酸配列を示す． 図３：プラスミドｐＭＲ15.1の図解的な地図を示す． 図４：Ｌ243-gL1のVl領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す． 図５：Ｌ243-gL2のVl領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す． 図６：プラスミドｐＭＲ14の図解的な地図を示す． 図７：Ｌ243-gHのVh領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す． 図８：プラスミドｐγ1の図解的な地図を示す． 図９：Ｌ243グラフト対FITC-キメラＬ243についての競合アッセイの結果のグ ラフを示す． 図10：Ｌ243γ4についてのスキャチャード分析のグラフを示す． 図11：ＡＤＣＣにより測定したキメラおよびグラフトL243のFcRIII結合のグラ フを示す． 図12：Ｌ243イソタイプ系列ＭＬＲのグラフを示す． 図13：Ｌ243イソタイプ系列ＴＴレスポンスのグラフを示す． 図14：ヒトＣ-γ1のヒンジ部およびＣ_H2領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配 列を示す． 図15：ＡＤＣＣにより測定したキメラ，グラフトおよびグラフト［L235E］L24 3のFcRIII結合のグラフを示す． 図16：MLRによって測定したＣＤＲグラフトL243の免疫抑制活性のグラフを示 す． 図17：ＣＤＲグラフトL243およびグラフト［L235E］L243ＴＴリコールレスポ ンスのグラフを示す． 図18：ＣＤＲグラフトL243およびＣＤＲグラフト［L235E］L243の補体誘導細 胞傷害有効性のグラフを示す． 図19：以下のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す． ａ）クローン43 ｂ）クローン183 ｃ）クローン192 図20：プラスミドｐγ2の図解的な地図を示す． 発明の特異的実施態様の詳細な説明 例１ 遺伝子クローニングおよび発現 Ｌ243ハイブリドーマ細胞からのＲＮＡの調製 総ＲＮＡは以下に記載する３×10⁷ L243ハイブリドーマ細胞から調製した．細 胞は生理食塩水で洗浄し，RNAzol（10⁶細胞あたり0.2ml）に溶解した．クロロホ ルム（ホモジネート２mlあたり0.2ml）を加え，混合物を15秒間烈しく振盪し， ついで15分間氷上に放置した．得られた水相および有機相をエッペンドルフ遠心 機により15分間遠心分離して分離し，水相から等容量のイソプロパノールの添加 によってＲＮＡを沈殿させた．15分間氷上に置いたのち，遠心分離によってＲＮ Ａをペレット化し，70％エタノールで洗浄し，滅菌したＲＮＡ分解酵素を含まな い水に溶解した．ＲＮＡの収量は350μgであった． Ｌ243軽鎖のアミノ酸配列の決定 成熟L243軽鎖の最初の９個のアミノ酸の配列はＮＨ₂-ＤＩＱＭＴＱＳＰＡＳと 決定された． Ｌ243VhおよびVlのＰＣＲクローニング Ｌ243重鎖および軽鎖の可変部のｃＤＮＡ遺伝子を逆転写酵素を用いて合成し て，総ＲＮＡ中に存在するｍＲＮＡの一本鎖ｃＤＮＡコピーを作成し，ついでこ のｃＤＮＡを特異的オリゴヌクレオチドプライマーによりポリメラーゼチェーン 反応（ＰＣＲ）に付した． ａ）ｃＤＮＡ合成 ｃＤＮＡは，以下の試薬を含有する反応混合物20μl中で合成した．すなわち ，50ｍＭトリス塩酸塩ｐＨ8.3，75ｍＭ塩化カリウム，10ｍＭジチオスレイトー ル．３ｍＭ塩化マグネシウム，各デオキシリボヌクレシド三リン酸0.5ｍＭ，20 単位のRNAsin，２μgのＬ243ＲＮＡおよび20単位のモロニーマウス白血病ウイル ス逆転写酵素である．42℃で60分間インキュベートしたのち，95℃に５分間加熱 して反応を停止させた． ｂ）ＰＣＲ ｃＤＮＡのアリコートを，重鎖および軽鎖に対するプライマーの組合せを使用 してＰＣＲに付した．重鎖および軽鎖の５'プライマーのヌクレオチド配列は， それぞれ，表１および２に示す．すべて，それらの５'末端からの６ヌクレオチ ドに始まる制限部位，それに続いて，得られたｍＲＮＡの至適翻訳を可能にする 配列：ＧＣＣＧＣＣＡＣＣ，イニシエーターコドンおよびさらに20〜30ヌクレオ チドを含有するこれらの配列は，既知のマウス抗体のリーダーペプチド配列に基 づくコンピレーションである［Kabatら(1991)in Sequences of Proteins of Imm unological Interest．第５版−United States Department of Health and Huma n Services］．３'プライマーは表３に示す．軽鎖プライマーは抗体のＶ-Ｃ連結 部にまたがって，Vl ＰＣＲフラグメントのクローニングを容易にする酵素Spll の制限部位を含む．重鎖３'プライマーは抗体のＶ-Ｃ連結部にまたがるように設 計された混合物である．最初の23ヌクレオチドはヒトＣ-γ１，２，３および４ 遺伝子の開始部と同一で，これらのヒトイソタイプに共通するApal制限部位を包 含する．プライマーの３'領域は既知のマウス抗体に見出される配列［Kabat EA ，Wu TT，Perry HM，Gottesman KS & Foeller L；In：Sequences of Proteins o f Immunological Interest，第５版，US Department of Health and Human Serv ices(1991)］に基づく混合配列を含有する． 上述のプライマーの組合せによりVhおよびVlについてのＰＣＲ生成物を適当な 発現ベクター（下記参照）へ直接クローン化してキメラ（マウス−ヒト）重鎖お よび軽鎖を生成させ，これらの遺伝子を哺乳動物細胞内で発現させて所望のイソ タイプのキメラ抗体を産生させることが可能になる． ＰＣＲのためのインキュベーション（20μl）は次のように設定した．各反応 混合物には，10ｍＭトリス塩酸塩ｐＨ8.3，1.5ｍＭ塩化マグネシウム，50ｍＭ塩 化カリウム，0.01％w/vゼラチン，各デオキシリボヌクレシド三リン酸0.25ｍＭ ，１〜６pｍole ５'プライマーミックス（表４），６pｍol ３'プライマー，１ μlのｃＤＮＡおよび0.25単位のTaqポリメラーゼを含有させた．反応混合物は95 ℃で５分間インキュベートしたのち，94℃で１分間，55℃で１分間および72℃で １分間のサイクルに付した．30サイクル後，各反応混合物のアリコートをアガロ ースゲル上電気泳動によって分析した．５'プライマーミックスB1，B2，B3およ びB5を含む反応では完全長Vlフラグメントに一致するサイズのバンドが生成した が，B9を含む反応では期待されたサイズのVh遺伝子のフラグメントが生成した． B1プライマーによって生成されたバンドは以前の結果で，このバンドはハイブリ ドーマ細胞によって産生された軽鎖偽似遺伝子に相当することが示されていたの で，さらに追跡することはしなかった． ｃ）ＰＣＲフラグメントの分子クローニング B2，B3およびB5の反応で生成されたＤＮＡフラグメントを酵素BstB1およびSpl 1で消化し，エタノール沈殿によって濃縮し，1.4％アガロースゲル上電気泳動に 付し，400塩基対の範囲でＤＮＡバンドを回収した．これらをBstB1およびSpl1で 予め制限酵素処理したベクターｐＭＲ15.1（図３）内にライゲートした．ライゲ ーション後，混合物を大腸菌ＬＭ1035にトランスフォームし，得られた細菌コロ ニーからのプラスミドをBstB1およびSpl1での消化により挿入体についてスクリ ーニングした．各ライゲーションから挿入体をもつ代表例については，さらにヌ クレオチド配列決定によって分析した． 同様に，B9の反応で生成し，HindIIIおよびApalで消化したＤＮＡフラグメン トは．HindIIIおよびApalで予め制限酵素処理したベクター14（図６）中にクロ ーン化した．この場合も，挿入体をもつ代表例はヌクレオチド配列決定によって 分析した． ｄ）ヌクレオチド配列分析 反応B9からのVh挿入体を含有する２つの単離体からのプラスミド（pE1701およ びpE1702）はプライマーＲ1053（ｐＭＲ14中のＨＣＭＶの３'領域内をプライム する）およびＲ720（ヒトＣγ4の５'領域内をプライムし，ｐＭＲ14上の ＤＮＡ挿入体によるスクリーニングを可能にする）を用いて配列決定を行った． pE1701内のＬ243Vhの決定されたヌクレオチド配列および推定されたアミノ酸配 列は図２に示す．pE1701中のVh挿入体についてのヌクレオチド配列は，ヌクレオ チド20（pE1701ではＡ）とヌクレオチド426（pE1701ではＡ）を除いてpE1702の 配列と同一であった．これらの２つの相違はそれぞれ，シグナルペプチドとVhの Ｊ領域にあり，調べた２つのクローンは異なるプライマーの使用によりＰＣＲ段 階でオリゴヌクレオチドの混合物から生じた独立の単離体であることが指示され る． 軽鎖クローンの分析にはＲ1053によるプライミングから誘導された配列を調べ た．反応B2（クローン183），B3（クローン43）およびB5（クローン192）から生 じたVl遺伝子のヌクレオチド配列および推定されたアミノ酸配列は図19に示す． 推定されるタンパク質配列の比較を以下に示す． ｉ）クローン182，183，43および45はすべてVl遺伝子をコードし，これはシグ ナルペプチドを除去した場合には，Ｌ243軽鎖についてのアミノ酸配列決定分析 で決定された配列（上記参照）と同一の配列の軽鎖を生成する． ii）クローン182および183は20アミノ酸のシグナルペプチドをコードするVl遺 伝子を含んでいるが，クローン43および45中のVl遺伝子は異なるセットのオリゴ ヌクレオチドによるプライミングから得られ，15アミノ酸のみのリーダー配列を もっている． iii）クローン192はＬ243 Vlをコードしていない．抗体配列のデーターベース の検索（Kabat，1991）から，クローン192はその代わりに，Ｌ243ハイブリドー マの産生に用いられたＮＳ1骨髄種融合パートナーによって合成された軽鎖，Ｍ ＯＰＣ21のVl遺伝子を含んでいることが指示される． iv）クローン182と183はヌクレオチド26（クローン182ではＴ，クローン183で はＣ）を除いて同一である．この差はＰＣＲにおける異なるプライマーの使用に よって説明が可能で，クローン182と183は同じ遺伝子からの独立した単離体であ ることが指示される 完全Vl遺伝子のヌクレオチド配列および推定されたアミノ 酸配列は図１に示す． ヒトγ１および２イソタイプの構築 Ｌ243 Vh遺伝子は，ヒトＣγ１およびＣγ２遺伝子（図８および20）を含むベ クター，それぞれｐγ１およびｐγ２中HindIII-Apalフラグメントにサブクロー ニングした． ヒトイソタイプ変異体 ベクターｐγ１中に含有されるヒトＣγ１内の残基235をロイシンからグルタ ミン酸またはアラニンのいずれかに，また残基237をグリシンからアラニンに変 化させるために，ＰＣＲ突然変異誘発を用いた．ヒトＣγ１の低位ヒンジ部もヒ トＣγ２の相当する領域によって置換した．これらの置換を行うには以下のオリ ゴヌクレオチドを使用した． Ｉ）L235E変化 II）L235A変化 III）L237A変化 IV）低位ヒンジ領域の交換 ＰＣＲ突然変異誘発を用いＲＡられた他のオリゴヌクレオチド Ｒ4732およびＲ4912は，ヒトＣγ１（図14）内のそれぞれヌクレオチド834〜8 58およびヌクレオチド1156〜1137の間をプライムする． ＰＣＲ突然変異誘発の一般的戦略は次の通りであった．各アミノ酸変化につい て，所望の置換を含有するＤＮＡフラグメントを発生させるために２ラウンドの ＰＣＲを用いた．これらのフラグメントはついで，酵素BglIIおよびSty1に よって制限酵素処置を行い，ｐγ１ベクター内の野生型配列（図８）を含有する 相当するフラグメントを置換するために使用した． 第一ラウンドのＰＣＲでは，以下の試薬を含有する反応混合物（20μl）を調 製した．すなわち10ｍＭトリス塩酸塩ｐＨ8.3，1.5ｍＭ塩化マグネシウム，50ｍ Ｍ塩化カリウム，0.01％ゼラチン，0.25ｍＭの各デオキシリボヌクレシド三リン 酸，50μgのＰγ１ＤＮＡ，0.4単位のTaqポリメラーゼ，および６pmolの各プラ イマーを含有させた．プライマーには以下の組合せを用いた． 94℃で１分間，55℃で１分間および72℃で１分間により30サイクル後，反応混 合物をクロロホルムで抽出し，新たに合成されたＤＮＡをエタノールで沈殿させ ，水に溶解させ．1,4％アガロースゲル上電気泳動に付した．ＤＮＡフラグメン トを含むゲルスライスをゲルから切り出し，ＤＮＡをMermaid（登録商標）キッ ト（Stratech Scientific Ltd.，Luton，England）を用いてアガロースから回収 し，20μlの滅菌水中に溶出させた． 第二ラウンドのＰＣＲでは，100μlの反応混合物に10mＭトリス塩酸塩ｐＨ8.3 ，1.5ｍＭ塩化マグネシウム，50ｍＭ塩化カリウム，0.01％のゼラチン，0.25ｍ Ｍの各デオキシリボヌクレシド三リン酸，２単位のTaqポリメラーゼ，第一ラウ ンドの反応からのＤＮＡフラグメントの各ペア1/20，およびＲ4732およびＲ4912 それぞれ30pmolを含有させた．30サイクル後（上記参照），反応混合物をフェノ ール／クロロホルム（1/1）で抽出し，エタノールで沈殿させた．フラグメント をBglIIおよびSty1で消化させ，1.4％アガロースゲル上電気泳動に付し，250塩 基対のＤＮＡハンドを上述の場合と同様にゲルスライスから回収した． これらの，BglII-Sty1フラグメントは，ヒトＣγ１のＣ_H2ドメインのＣ末端部 分および全Ｃ_H3ドメインを含有する830 Sty1-EcoRIフラグメント，ならびにｐγ １（図８参照）からのBglII-EcoRIベクターとの三者ライゲーションによりライ ゲートした．ＬＭ1035にトランスフォームしたのち，得られたコロニーからのプ ラスミドミニプレパレーションをBglII-Sty1フラグメントの存在についてスクリ ーニングし，各体表例をヌクレオチド配列分析用に採取した．これから，所望の 配列を含有するプラスミドが同定され，以後の言及のために次のように命名した ． ｐγ１［L235E］ 残基235にグルタミン酸を含有 ｐγ１［L235A］ 残基235にアラニンを含有 ｐγ１［G237A］ 残基237にアラニンを含有 ｐγ１［g1−g2］ Ｃγ２低位ヒンジ部を含有 上記プラスミドをそれぞれHindIIIとApa1で制限酵素処理し，L243Vhを含有す るHindIII-Apa1フラグメントを挿入して以下のプラスミドを製造した． Ｌ243γ１［L235E］ Ｌ243γ１［L235A］ Ｌ243γ１［G237A］ Ｌ243γ１［g1−g2］ キメラＬ243抗体の製造 生物学的評価のための抗体は，リン酸カルシウム沈殿法を用いてチャイニーズ ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞へコトランスフェクトしたのち，適当な重鎖およ び軽鎖の一過性発現により製造した． トランスフェクションの前日にＣＨＯ−Ｌ761細胞のセミコンフルーエントな フラスコをトリプシン処理し，細胞を数え，Ｔ75フラスコにそれぞれ10⁷個の細 胞をセットした． 翌日，トランスフェクションの３時間前に培養培地を交換した．トランスフェ クションには．50μgの各重鎖および軽鎖発現ベクターを含む0.25Ｍリン酸カル シウム1.25mlを，1.25mlの2×ＨＢＳ（水１liter中16.36gmの食塩，11.9gm ＨＥ ＰＥＳならびに0.4gm Ｎａ₂ＨＰＯ₄をＮａＯＨでｐＨ7.1に調 整）と混合してリン酸カルシウム沈殿を調製し，直ちに細胞を含む培地中に添加 した．ＣＯ₂インキュベーター中37℃に３時間放置したのち，培地と沈殿を除去 し，リン酸緩衝食塩溶液（ＰＢＳ）中15％グリセロール15mlを添加して細胞に１ 分間ショックを与えた．グリセロールを除去し，細胞を１回ＰＢＳにて洗浄し， 10ｍＭの酪酸ナトリウムを含む培地25ml中で48〜96時間インキュベートした．抗 体はプロテインＡ-Sepharoseに結合させ，溶出させることにより精製した．抗体 濃度はヒトＩｇＥＬＩＳＡ（下記参照）を用いて測定した． ＥＬＩＳＡ ＥＬＩＳＡでは，Nunc ELISAプレートをコーティング緩衝液（15ｍＭ炭酸ナト リウム，35ｍＭ炭酸水素ナトリウム，ｐＨ6.9）中５μg/mlのポリクローナルヤ ギ抗−ヒトＦｃフラグメント特異的抗体のＦ(ab)2フラグメント（Jackson Immun o-research．コード109-006-098）によって一夜４℃でコートした．５分間蒸留 水で洗浄して結合しなかった抗体を除去した．定量すべきサンプルならびに精製 標準を接合緩衝液（0.1Ｍトリス塩酸塩ｐＨ7.0，0.1Ｍ食塩，0.2％v／v Tween20 ，0.2％w／v Hammerstenカゼイン）中に約１μg/mlに希釈した．サンプルは２倍 希釈でマイクロタイターウエル中に滴下し，各ウエル中の最終容量を0.1mlとし ，プレートを室温で振盪しながら１時間インキュベートした．最初のインキュベ ーション工程後，プレートを蒸留水で10回洗浄し，ついで前回と同様１時間，0. 1mlのマウスモノクローナル抗−ヒトκ（クローンＧＤ12）ペルオキシダーゼ接 合抗体（The Binding Site，コードＭＰ135）と接合緩衝液中1:700に希釈してイ ンキュベートした．プレートを蒸留水で再び洗浄し，基質溶液（0.1ml）を各ウ エルに添加した．基質溶液は150μlのＮ,Ｎ,Ｎ,Ｎ-テトラメチルベンチジン（Ｄ ＭＳＯ中10mg/ml），150μl過酸化水素（30％溶液）を10mlの0.1Ｍ酢酸ナトリウ ム／クエン酸ナトリウムｐＨ6.0中に含有する．プレートは5〜10分間，630nmに おける吸収が最大標準について約1.0に達するまで展開した．プレートリーダー を用いて630nmにおける吸収を測定し，サンプルの濃度を標準の場合の滴定曲線 と比較することにより決定した． 例２ Ｌ243はヒトＭＨＣクラスIIに対して作成されたマウスモモクローナル抗体で ある．Ｌ243 VlおよびVhのヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ図１およ び２に示す．以下の例はＬ243抗体の人化（ＣＤＲグラフト）を説明する． Ｌ243軽鎖のＣＤＲグラフト Ｌ243軽鎖のフレームワーク領域の，４つのヒト軽鎖サブグループのフレーム ワーク領域［Kabat EA．Wu TT，Perry HM，Gottesman KS & Foeller C．1991，S equences of Proteins of Immunological Interest，第５版］とのアラインメン トにより，Ｌ243はヒト軽鎖サブグループ１における抗体に最も相同であること が明らかにされた．したがって，ＣＤＲグラフト軽鎖の構築には，選択されるフ レームワーク領域はヒトグループ１コンセンサス配列のフレームワーク領域に相 当させた．Ｌ243のフレームワーク領域とコンセンサスヒトグループ１軽鎖のア ミノ酸配列の比較を以下に示す．２つの配列間には21の相違（下線を付す） のあることが明らかである． これらのフレームワークの相違のいずれが抗原の結合に寄与しているかの分析 （公開された国際特許出願ＷＯ91/09967参照）から，検討すべき４つの残基が同 定された．これらは，位置45，49，70および71である．この分析に基づき，２つ のバージョンのＣＤＲグラフト軽鎖を構築した．これらの第一の軽鎖は残基45， 49，70および71がＬ243の軽鎖に由来するＬ243-gL1であり，第二の軽鎖はすべて の残基がヒトコンセンサスのＬ243-gL2である． 軽鎖残基 残基37（Gln→Arg）および残基48（Ile→Val）は将来のすべてのグラフト分子 に包含されることになる． 軽鎖の比較 ＣＤＲグラフト軽鎖Ｌ243-gL1の構築 Ｌ243-gL1の構築は以下に詳細を示す．キメラ軽鎖のフレームワーク領域に変 化を導入するために，以下のオリゴヌクレオチドを，ポリメラーゼチェーン反応 （ＰＣＲ）に使用した． 各20μlの３つの反応混合物には，それぞれ10ｍＭトリス塩酸塩ｐＨ8.3，1.5 ｍＭ塩化マグネシウム，50ｍＭ塩化カリウム，0.01％w／vゼラチン，各デオキシ リボヌクレシド三リン酸0.25ｍＭ，0.1μgのキメラＬ243軽鎖ＤＮＡ，６pmolの Ｒ5043/Ｒ5044またはＲ5045/Ｒ5046またはＲ5047/Ｒ5048および0.25単位のTaqポ リメラーゼを含有するようにセットした．反応混合物は，94℃で１分間，55℃で １分間および72℃で１分間のサイクルに付した．30サイクル後，各反応混合物を アガロースゲル上で電気泳動によって分析し，ＰＣＲフラグメントをゲルから切 り取って，Mermaidキット（Stratech ScientificLtd.，Luton，Englandにより供 給）を用いて回収した． これらのアリコートをついで第二ラウンドのＰＣＲに付した．100μlの反応混 合物には10ｍＭトリス塩酸塩ｐＨ8.3．1.5ｍＭ塩化マグネシウム，50ｍＭ塩化カ リウム，0.01％w／vのゼラチン，第一の反応セットからの３種のＰＣＲフラグメ ントそれぞれ1/10，30pmolのＲ5043およびＲ5048ならびに2.5単位のTaqポリメラ ーゼを含有させた．反応温度は上述の通りとした．ＰＣＲ後，混合物をフェノー ル／クロロホルム，ついでクロロホルムで抽出し，エタノールで沈殿させた．エ タノール沈殿を遠心分離によって回収し，適当な緩衝液に溶解して，酵素BstEII およびSplIで制限酵素処理した．得られた生成物を最後にアガロースゲル上電気 泳動に付し，270塩基対のＤＮＡフラグメントをゲルスライスから回収し，予め 同じ酵素で消化したベクターｐＭＲ15.1（図３）内にライゲートした． ライゲーション混合物を用い大腸菌ＬＭ1035をトランスフォームし，得られた コロニーをＰＣＲ，制限酵素消化およびヌクレオチド配列決定によって分析した ．Ｌ243-gL1のVl領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は図４に示す． ＣＤＲグラフト軽鎖Ｌ243-gL2の構築 Ｌ243-gL2はＰＣＲを用いてＬ243-gL1から構築した．以下のオリゴヌクレオ チドをアミノ酸変化の導入のために使用した． 各20μlの２つの反応混合物はそれぞれ，10ｍＭトリス塩酸塩ｐＨ8.3，1.5ｍ Ｍ塩化マグネシウム，50ｍＭ塩化カリウム，0.01％w／vゼラチン，0.25ｍＭの各 デオキシリボヌクレシド三リン酸，0.1μg Ｌ243-gL1，６pmol Ｒ1053/Ｒ5350ま たはＲ5349/Ｒ684および0.25単位のTaqポリメラーゼを含有するようにセットし た．反応混合物は，94℃で１分間，55℃で１分間および72℃で１分間のサイクル に付した．30サイクル後，各反応混合物をアガロースゲル上電気泳動によって分 析し，ＰＣＲフラグメントをゲルから切り取り，Mermaidキットを用いて回収し た． これらのアリコートをついで第二ラウンドのＰＣＲに付した．100μlの反応混 合物には10ｍＭトリス塩酸塩ｐＨ8.3，1.5ｍＭ塩化マグネシウム，50ｍＭ塩化カ リウム，0.01％w／vゼラチン，第一の反応セットからのＰＣＲフラグメントそれ ぞれ1/5，30pmolのＲ1053およびＲ684ならびに2.5単位のTaqポリメラーゼを含有 させた．反応温度は上述のようにした．ＰＣＲ後，混合物をフェノール／クロロ ホルムついでクロロホルムで抽出し，エタノールで沈殿させた．エタノール沈殿 を遠心分離により回収し，適当な緩衝液に溶解し，酵素BstEIIおよびSplIで制限 酵素処理した．得られた生成物を最後にアガロースゲル上電気泳動に付し，270 塩基対のＤＮＡフラグメントをゲルスライスから回収し，予め同じ酵素で消化し たベクターｐＭＲ15.1（図３）内にライゲートした． ライゲーション混合物を用い大腸菌ＬＭ1035をトランスフォームし，得られた コロニーをＰＣＲ，制限酵素消化およびヌクレオチド配列決定によって分析した ．Ｌ243-gL2のVl領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は図５に示す． Ｌ243重鎖のＣＤＲグラフト Ｌ243重鎖のＣＤＲグラフトは軽さについて記載したのと同じ戦略を用いて達 成された．Ｌ243重鎖はサブグルー１に属するヒト重鎖と最も相同であることが 見出され，したがって，Ｌ243重鎖のアクセプトのためにはヒトグループ１フレ ームワークのコンセンサス配列を選択した． この２つの構造体のフレームワーク領域の比較を以下に示す．これからＬ243 はヒトコンセンサスと28の位置（下線を付す）で相違することがわかる．これら のいずれが抗原結合に寄与しているかの分析から，残基27，67，69，71，72およ び75のみが，ＣＤＲグラフト重鎖，Ｌ243-gHに保持された． 重鎖残基 残基2（Val→Ile）および残基46（Ｇlu→Lys）は将来のすべてのグラフト分子 に包含されることになる．これらの２つの残基に加えて，Ｌ243-gH中に存在する マウス残基67はヒトコンセンサス残基へ戻されることになった．すなわち，Phe →Valの変化である． 重鎖の比較 ＣＤＲグラフト重鎖Ｌ243-gHの構築 Ｌ243-gHは適当なプライマーの存在下に重複オリゴヌクレオチドをＰＣＲに 付して組み立てられた．ＰＣＲには以下のオリゴヌクレオチドが用いられた． アッセンブリー反応混合物50μlは，10ｍＭトリス塩酸塩ｐＨ8.3，1.5ｍＭ塩 化マグネシウム，50ｍＭ塩化カリウム，0.01％w／vゼラチン，0.25のｍＭ各デオ キシリボヌクレシド三リン酸，Ｒ4897〜Ｒ4905各１pmol．Ｒ3004およびＲ3005各 10pmolおよび2.5単位のTaqポリメラーゼを含有した．反応混合物は，94℃で１分 間，55℃で１分間および72℃で１分間のサイクルに付した．30サイクル後，反応 混合物をフェノール／クロロホルムついでクロロホルムで抽出 し，エタノールで沈殿させた．遠心分離後，ＤＮＡを適当な制限緩衝液に溶解し て，HindIIIおよびApaIで消化した．得られたフラグメントをアガロースゲルか ら単離し，予め同じ酵素で消化したベクターｐＭＲ14（図６）内にライゲートし た．ｐＭＲ14はヒトγ４重鎖定常部を含有し，したがってこのベクターから発現 する重鎖はγ４イソタイプということになる．ライゲーション混合物を用いて大 腸菌ＬＭ1035をトランスフォームし，得られた細菌コロニーを制限酵素消化およ びヌクレオチド配列決定分析によってスクリーニングした．この方法で，Ｌ243- gHの正しい配列を含有するプラスミドが確認された（図７）． キメラおよびＣＤＲグラフトＬ243重鎖のγ１バージョンの構築 Ｌ243重鎖のヒトγ１バージョンは，マウスおよびＣＤＲグラフト重鎖両者の 可変部をHindIII-ApaIフラグメントとしてベクターｐγ１（図８）内に移送する ことによって構築された．このベクターはヒトγ１重鎖定常部を含有する． ＣＤＲグラフト遺伝子の活性の評価 ＣＤＲグラフト遺伝子の活性はそれらを哺乳動物細胞内で発現させ，新たに合 成された抗体を生成し定量化することによって評価した．この方法論は以下に説 明し，続いて抗体の生物学的特性表示に用いられる生化学的および細胞ベースの アッセイについて説明する． ａ）ＣＨＯ細胞における遺伝子発現 キメラおよびＣＤＲグラフトＬ243は，重鎖および軽鎖対を，チャイニーズハ ムスター卵巣（ＣＨＯ）にリン酸カルシウム沈殿法を用いてコトランスフェクト したのち，一過性に発現させることにより生物学的評価のために産生させた． トランスフェクションの前日にＣＨＯ−Ｌ761細胞［Cockett MI，Bebbington CR & Yarranton GT，1991，Nucl.Acids Res．19，319-325］のセミコンフルーエ ントなフラスコをトリプシン処理し，細胞を数え，Ｔ75フラスコにそれぞれ10⁷ 個の細胞をセットした．翌日，トランスフェクションの３時間前に培養培地を交 換した．トランスフェクンョンには，50μｇの各重鎖および軽鎖発現ベクターを 含む0.25Ｍリン酸カルシウム1.25mlを，1.25mlの２×ＨＢＳ（水１liter中16.36 gm食塩，11.9gm ＨＥＰＥＳおよび0.4gm Ｎａ₂ＨＰＯ₄をＮａＯＨでｐＨ7.1に調 整）と混合してリン酸カルシウム沈殿を調製し，直ちに細胞を 含む培地中に添加した．ＣＯ₂インキュベーター中37℃に３時間放置したのち培 地と沈殿を除去し，リン酸緩衝食塩溶液（ＰＢＳ）中15％グリセロール15mlを添 加して細胞に１分間ショックを与えた．グリセロールを除去し，細胞を１回ＰＢ Ｓにて洗浄し，10ｍＭの酪酸ナトリウムを含む培地25ml中で48〜96時間インキュ ベートした．抗体はプロテインＡ-Sepharoseに結合させ，溶出させて精製した． 抗体濃度はヒトＩｇＥＬＩＳＡ（下記参照）を用いて測定した． ｂ）ＥＬＩＳＡ ＥＬＩＳＡでは，Nunc ELISAプレートをコーティング緩衝液（15ｍＭ炭酸ナト リウム，35ｍＭ炭酸水素ナトリウム，ｐＨ6.9）中５μg/mlのポリクローナルヤ ギ抗−ヒトＦｃフラグメント特異的抗体のＦ(ab)2フラグメント（Jackson Immun o-research，コード109-006-098）によって一夜４℃でコートした．５分間蒸留 水で洗浄して結合しなかった抗体を除去した．定量すべきサンプルならびに精製 標準を接合緩衝液（0.1Ｍトリス塩酸塩ｐＨ7.0，0.1Ｍ食塩，0.2％v／v Tween 2 0，0.2％w／v Hammerstenカゼイン）中に約１μg/mlに希釈した．サンプルは２ 倍希釈でマイクロタイターウエル中に滴下し，各ウエル中の最終容量を0.1mlと し，プレートを室温で振盪しながら１時間インキュベートした．最初のインキュ ベーション工程後，プレートを蒸留水で10回洗浄し，ついで前回と同様１時間， 0.1mlのマウスモノクローナル抗−ヒトκ（クローンＧＤ12）ペルオキシダーゼ 接合抗体（The Binding Site，コードＭＰ135）と接合緩衝液中1:700に希釈して インキュベートした．プレートを蒸留水で再び洗浄し，基質溶液（0.1ml）を各 ウエルに添加した．基質溶液は150μlのＮ,Ｎ,Ｎ,Ｎ-テトラメチルベンチジン（ ＤＭＳＯ中10mg/ml），150μl過酸化水素（30％溶液）を10ｍlの0.1Ｍ酢酸ナト リウム／クエン酸ナトリウムｐＨ6.0中に含有するプレートは5〜10分間，630nm における吸収が最大標準について約1.0に達するまで展開した．プレートリーダ ーを用いて630nmにおける吸収を測定し，サンプルの濃度を標準の場合の滴定曲 線と比較することにより決定した． ｃ）競合アッセイ このアッセイの原理は，抗原結合部位がマウスからヒトフレームワークに正し くトランスフェクトされたならば，ＣＤＲグラフト抗体は，標識キメラ抗体と等 しくヒトＭＨＣクラスIIへの結合で競合するという点にある．抗原結合能に何ら かの変化があればこの系で明らかにされることになる． キメラＬ243はWoodらの方法［Wood T，Thompson S & Goldstein G（1965），J .Immunol，95，225-229］を用いてフルオレセイン（ＦＩＴＣ）で標識した．す べての希釈，操作およびインキュベーションは0.1％ナトリウムアジドおよび５ ％ウシ胎児血清（Sigma，UK）を含有するリン酸緩衝食塩水（PBS，Gibco，UK） 中で行った．ＲＢポリスチレン管（2052 12×75mm Falcon，UK）中で抗体の希釈 系列100μlを一定量のＦＩＴＣ−標識抗体（予め測定された至適濃度で）とプレ ミックスし，５×10⁴インディケーター細胞（高レベルのＨＬＡ−ＤＲをもつＪ Ｙ Ｂリンパ芽球細胞系）に添加した．細胞および抗体を一緒に４℃で30分間イ ンキュベートし，２回洗浄し，結合はFluorescence Activated Cell Scaner（FA CS Becton Dickinson）を用いて明らかにした．適宜分析後，蛍光強度の中央値 を抗体濃度に対してプロットした． 図９は，Ｌ243重鎖および軽鎖の組合せがＪＹ細胞への結合に関しＦＩＴＣ− 標識キメラＬ243と競合する能力を比較する．すべての組合せが有効なコンピー ターであったが，ＣＤＲグラフト重鎖または軽鎖を含有する組合せにはキメラ抗 体自体と同程度に有効なものはなかった．すなわち，組合せcH/gL1，gH/cLおよ びgH/gL1は，このアッセイにおいて，キメラＬ243のそれぞれ89％，78％および6 4％の効果を示した． ｄ）スキャチャード分析によるアフィニティー定数の測定 Ｌ243抗体をＰＢＳ，５％ウシ胎児血清，0.1％ナトリウムアジド中10μg/mlか ら1.5倍希釈で（各150μl）で滴下したのち，各滴下点につき５×10⁴のＪＹ細胞 を加え氷上で１時間インキュベートした．細胞は前もって計数し，洗浄し，サン プルと同じメジウムに懸濁した．インキュベーション後，細胞を５mlの上記メジ ウムで洗浄し，遠心分離し，上清は捨てた．結合した抗体は100μlの１/100希釈 ＦＩＴＣ接合抗-ヒトＦｃモノクローナル抗体（The Binding Site；コードMF001 ）の添加によって明らかにされた．細胞をついで氷上で１時間インキュベートし ，次に過剰のＦＩＴＣ接合体を前述の場合と同様に洗浄して除去した．細胞を同 じ緩衝液250μlに分散し，細胞あたりの蛍光強度の中央値をFACScan （Becton Dickinson）で測定し，標準ビーズを用い（Flow Cytometry Standard Corporation）検量した．このようにして各抗体濃度で細胞あたりの結合抗体数 を確立してスキャチャードプロットを作成した．計算に際してはＬ243に対する ＦＩＴＣ接合体の結合価は1:1，F/P比は3.36（製造業者により示された値）と推 定した． キメラＬ243（cH/cL），Ｌ243-gH/Ｌ243-gL1およびＬ243-gH/Ｌ243-gL2のアフ ィニティーを比較したスキャチャードプロットを図10に示す キメラＬ243の見 掛けのKdは4.1ｎＭであったのに対し，gL1およびgL2を含むＣＤＲグラフト抗体 では見掛けのKdはそれぞれ6.4ｎＭおよび9.6ｎＭであった．２つのＣＤＲグラフ ト軽鎖をもつ抗体のKd値の差はＬ243-gL1では保持された母体軽鎖からの残基45 ，49，70および71の寄与を反映するものである． ｅ）抗体依存性の細胞誘導細胞傷害作用 キメラおよびＣＤＲグラフトＬ243が抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を 誘導する能力を比較した．実験の原理は，抗体のＦｃがＦｃ受容体をもつ細胞傷 害可能なエフェクター細胞と相互作用できれば，抗体はそれらの同族抗原をもつ 標的細胞の溶解を誘導するというものである． エフェクター細胞は各実験毎に新たに調製した．ヒト静脈血をヘパリン含有無 エンドトキシンチューブに吸引した．末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を密度勾配遠心 分離により製造業者（Pharmacia）の説明書に従い調製した．ＰＢＭＣは２ｍＭ グルタミン（Gibco，UK）および10％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ1640メジウム （Gibco）中１×10⁷細胞/mlに調整した．すべての操作，希釈ならびにインキュ ベーションはこのメジウムで行った． 標的細胞（ＪＹ，上記参照）は１mCi Ｎａ⁵¹Ｃｒにより，室温で１時間，15分 毎に攪拌して標識した．ついで細胞を10回洗浄して遊離の放射標識を除去し，２ ×10⁶細胞/mlに再懸濁した．抗体の希釈系列25μlを二重に滅菌Ｕ底96ウエルマ イクロタイタープレート（Falcon．UK）に調製した．メジウムのみを含む対照ウ エルも設け，アッセイのバックグランドを与える標識の自然放出を確立した．標 的⁵¹Ｃｒ標識ＪＹ細胞はすべてのウエルに10μlを添加した．同数のＪＹ細胞を ２％トリトンＸ-100水溶液を含むウエルにも加え，100％放出値を確立した． 標的細胞および抗体を一緒にインキュベートし，室温で30分後に，すべてのウエ ル（100％を除く）にエフェクター細胞を添加し，さらに４時間37℃でインキュ ベートした．100μlのＥＤＴＡ/食塩水を加えて殺細胞作用を停止させ，マイク ロタイタープレートを2000×ｇで遠心分離して無傷の細胞をペレット化し，上清 100μlを採取してガンマーカウンターで計測した． ％細胞溶解は，すべての値からバックグランドを差し引いて計算して，それを 調整された最大放出の百分率として表した．再測定値間の変動は５％未満であっ た．％細胞溶解をついで抗体濃度に対してプロットした． キメラ（cH/cL）およびＣＤＲグラフト（gH/gL1）Ｌ243ヒトγ１イソタイプの 上記アッセイでの比較を図11に示す 両抗体とも，細胞溶解の効果的なメディエ ーターであり，最大活性は抗体濃度100ng/ml未満で達成された．２つの抗体の間 に有意の差はなかった． ｆ）免疫機能試験 エクソビボＴ細胞機能試験は，ＭＨＣ−IIとＴ細胞受容体の間の相互作用がＴ 細胞の活性化に必須の要求である場合に行われた．キメラおよびＣＤＲグラフト Ｌ243抗体は，ナイーブおよびメモリー両Ｔ細胞の活性化を測定する混合リンパ 球反応，ならびにメモリーＴ細胞応答のみを測定する破傷風トキソイドに対する リコール応答で比較した． １）混合リンパ球反応 この実験の原理は，ある個体からの白血球を異なるＨＬＡ対立遺伝子を発現す る他の個体の白血球と混合した場合，それらは互いに他を異物として認識し，リ ンパ球が活性化されることである．この活性化は一次的に，Ｔ細胞上のＣＤ３／ ＴｃＲ複合体と抗原提示細胞上のＭＨＣクラスII分子との間の相互作用に依存す る．Ｌ243はこの反応を阻害することが知られている． 白血球は各実験毎に新たに調製する．２例の個体からヒト静脈血をヘパリン含 有無エンドトキシンチューブに吸引する 末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は密度勾配 遠心分離機により製造業者（Pharmacia）の説明書に従って調製する．ＰＢＭＣ は２ｍＭグルタミン（Gibco,UK），100μg/mlのペニシリン/ストレプトマイシン および10％ウン胎児血清を含むＲＰＭＩ1640メジウム（Gibco,UK）中２×10⁶ 細胞/mlに調整する．すべての操作，希釈およびインキュベーションはこのメジ ウムで行われる．一方の個体からのＰＢＭＣは3000radで照射する．これらの細 胞は他の個体のＰＢＭＣからの応答を刺激するために用いられる． 抗体の希釈系列100μlを三重に滅菌Ｕ底96ウエルマイクロタイタープレート（ Falcon.UK）中に調整する．メジウムの単独もしくは100ｎＭシクロスポリン（Sa ndimmum,Sandoz）を含む対照ウエルも設け，それぞれ最大応答および最大阻害を 確立する．照射されたスティミュレーターおよびレスポンダーの同数を一緒に混 合し，100μlを各ウエルに添加する．スティミュレーターおよびレスポンダー単 独のウエルも対照として設ける．実験は，37℃，湿度100％および５％ＣＯ₂にお いて５日間インキュベートすることにより行う．応答は，培養の最後の18時間に おける細胞増殖を１μCi/ウエルの³Ｈ-チミジン（Amersham,UK）とインキュベー トし，ガラスフィルターマット上に収穫し，ベーターカウンターを用いてカウン トすることにより評価して測定する． キメラおよびＣＤＲグラフトＬ243のγ１イソタイプの，Ｔ細胞活性化のイン ヒビターとしての有効性を比較するためにＭＬＲを実施した場合，２つの抗体の 間には有意差は認められなかった（図12）．いずれの抗体100ng/mlを用いてもＭ ＬＲの90％を越える阻害が認められた． ２）破傷風トキソイドに対するＴ細胞リコール応答 キメラおよびＣＤＲグラフトＬ243が二次応答を抑制する能力は破傷風トキシ ンに対するリコール応答を用いて評価した．この実験の原理は，破傷風トキソイ ド（ＴＴ）で以前に免疫処置した個体からのＴリンパ球がエクソビボで再暴露さ れた場合にＴＴに応答することにある．この活性化はＴ細胞上のＣＤ３／ＴｃＲ 複合体と抗原を有しそれを提示する細胞上のＭＨＣクラスII分子との間の相互作 用に依存する．Ｌ243はこの反応を阻害することが知られている． ＰＢＭＣは上述のようにして調製する．抗体の希釈系列100μlを三重に滅菌Ｕ 底96ウエルマイクロタイタープレートに調製する．前もって実験によって決定し た至適濃度のＴＴを含む液50μlをすべてのウエルに加える．メジウムのみまた は100ｎＭシクロスポリンを含む対照ウエルも設け，それぞれ最大応答および最 大阻害を確立する．ついで50μlのＰＢＭＣを各ウエルに添加する．実験は， 37℃，湿度100％および５％ＣＯ₂において７日間インキュベートすることにより 行う．応答は，培養の最後の18時間における細胞増殖を１μCi/ウエルの³Ｈ-チ ミジンとインキュベートし，ガラスフィルターマット上に収穫し，ベーターカウ ンターを用いてカウントすることにより評価して測定する． キメラおよびＣＤＲグラフトＬ243のヒトγ１イソタイプの，ＴＴ応答阻害能 を比較する実験の結果は図13に示す．いずれの抗体もＴＴに対するＴ細胞応答の 効果的なインヒビターであり，両者の滴定曲線は識別できなかった． 例３ 位置235に変化があるＣＤＲグラフトＬ243，すなわち［L235E］の抗体依存性 細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）誘導能は，基本的に例２に記載と同様にして測定した ．結果は図15に示す． 同様に，ＣＤＲグラフトＬ243［L235E］抗体は，基本的に例２に記載と同様に して，混合リンパ球反応および破傷風トキソイドに対するリコール応答について 試験した．結果は図16および17に示す． 抗体依存性補体誘導細胞傷害作用 Ｌ243の遺伝子操作変異体のヒト補体結合能を，抗体依存性補体誘導細胞傷害 作用の技術を用いて評価した． この実験の原理は，抗体のＦｃが（通常，古典的）補体カスケードの成分と相 互作用できれば，抗体はそれらの同族抗原をもつ標的細胞の補体溶解を誘導する というものである． これらの実験における補体の起源は，新たに無エンドトキシンガラス瓶に吸引 したヒト静脈血であり，ついで37℃で１時間放置して凝血させる．血餅をガラス から脱着させ，ついで４℃で２時間インキュベートして元に戻させる．血餅を除 去し，1000gで遠心分離して残った赤血球から血清を分離する．いったん調製さ れたならば，血清は，とくに見るべき効力の劣化はなく−20℃で１カ月まで保存 できる． すべての操作，希釈およびインキュベーションは，２ｍＭグルタミン（Gibco, UK）ならびに10％ウシ胎児血清（Sigma,UK）を含有するＲＰＭＩ1640メジウム（ Gibco UK）中で行う．標的細胞（高いＨＬＡ−ＤＲレベルを有するＪＹ，Ｂリ ンパ芽球細胞系）は１mCi Ｎａ⁵¹Ｃｒにより，室温で１時間，15分毎に攪拌して 標識する．ついで細胞を３回洗浄して遊離の放射標識を除去し，２×10⁶/mlに再 懸濁する．抗体の希釈系列25μlを二重にＶ底96ウエルマイクロタイタープレー ト（ICN/Flow,UK）に調製する．メジウムのみを含む対照ウエルも設け，アッセ イのバックグランドを与える標識の自然放出を確立する．標的⁵¹Ｃｒ標識ＪＹ細 胞はすべてのウエルに10mlを添加する．同数のＪＹ細胞を２％トリトンＸ-100水 溶液を含むウエルにも加え，100％放出値を確立する．標的細胞および抗体を一 緒にインキュベートし，室温で１時間後に，すべてのウエル（100％を除く）に 補体のソースとして血清を添加し，さらに１時間室温でインキュベートする．つ いで100ml ４℃のＥＤＴＡ食塩水を加えて殺細胞作用を停止させ，マイクロタイ タープレートを2000gで遠心分離して無傷の細胞をペレット化し，上清100μlを 採取してガンマーカウンターで計測する． ％細胞溶解は，すべての値からバックグランドを差し引いて計算し，ついでそ れを，調整された最大放出の百分率として表す．再測定値間の変動は５％未満で ある．％細胞溶解をついで抗体濃度に対してプロットする． 結果（バックグランドを差し引いていない）は図18に示す．

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 8310−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/531 Ａ 21/08 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ Ｇ０１Ｎ 33/531 9281−4Ｂ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (31)優先権主張番号 ９４０２４９９．９ (32)優先日 1994年２月９日 (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ９４０６２２２．１ (32)優先日 1994年３月29日 (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ボドマー，マーク ウィリアム イギリス国オーエックス１ ５エイエス オックスフォード，サウス ヒンクセイ, マノー ロード ５ (72)発明者 アスウォル，ディルジート シング イギリス国 エスイー17 ロンドン，ニュ ー クロス ゲイト，カセラ ロード 33

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＤＲα鎖依存性抗原決定基に対して特異性を有する組み換え抗体分子 ２．マウスモノクローナル抗体Ｌ243によって認識されるエピトープに対して 特異性を有する「請求項１」に記載の組み換え抗体分子 ３．人化ＣＤＲグラフトもしくはキメラ抗体抗体分子である「請求項１または ２」に記載の組み換え抗体分子 ４．可変部ドメインの少なくとも１個の相補性決定領域（ＣＤＲ）がマウスモ ノクローナル抗体Ｌ243に由来し，人化抗体分子の残りの免疫グロブリン誘導部 分はヒト免疫グロブリンまたはその類縁体から誘導される「請求項３」に記載の 人化抗体分子 ５．ヒトアクセプターのフレームワークとドナーの抗原結合部位からなる可変 部ドメインを有し，フレームワークは位置27，67，69，71，72および75の少なく とも１つまたは２つ以上がドナー残基である「請求項４」に記載のＣＤＲグラフ ト人化抗体重鎖 ６．位置27，67，69，71，72および75がドナー残基である「請求項５」に記載 のＣＤＲグラフト人化抗体重鎖 ７．ヒトグループコンセンサス配列１に由来するヒトアクセプターのフレーム ワークとＬ243ドナー抗原結合部位からなる可変部ドメインを有し，フレームワ ークは位置27，67，69，71，72および75の少なくとも１つまたは２つ以上がドナ ー残基であるＣＤＲグラフト人化抗体重鎖 ８．ヒトアクセプターのフレームワークとドナーの抗原結合部位からなる可変 部ドメインを有し，フレームワークは位置45，49，70および71の少なくとも１つ または２つ以上がドナー残基である「請求項４」に記載のＣＤＲグラフト人化抗 体軽鎖 ９．位置45，49，70および71がドナー残基である「請求項７」に記載のＣＤＲ グラフト人化抗体軽鎖 10．ヒトグループコンセンサス配列１に由来するアクセプターのフレームワー クとＬ243ドナー抗原結合部位からなる可変部ドメインを有し，フレームワーク は位置45，49，70および71の少なくとも１つまたは２つ以上がドナー残基である ＣＤＲグラフト人化抗体軽鎖 11．「請求項５または６」の一つに記載のＣＤＲグラフト重鎖および／または 「請求項８または９」の一つに記載のＣＤＲグラフト軽鎖をコードするＤＮＡ配 列 12．「請求項11」に記載のＤＮＡ配列を含有するクローニングまたは発現ベク ター 13．「請求項12」に記載のクローニングまたは発現ベクターによってトランス フォームされた宿主細胞 14．マウスモノクローナル抗体Ｌ243によって認識されるエピトープに対して 特異性を有するＣＤＲグラフト抗体を製造する方法において，「請求項11または 12」に記載のＤＮＡ配列をトランスフォームされた宿主細胞内で発現させること からなる方法 15．マウスモノクローナル抗体Ｌ243によって認識されるエピトープに対して 特異性を有する組み換えまたは人化抗体を製造する方法において， ａ）可変部ドメインの少なくとも１個のＣＤＲがＬ243 Ｍａｂに由来し，その 抗体鎖の残りの免疫グロブリン誘導部分はヒト免疫グロブリンから誘導される可 変ドメインからなる抗体重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡ配列を有するオペロ ンを発現ベクター内に製造し， ｂ）可変ドメインの少なくとも１個のＣＤＲがＭａｂ Ｌ243に由来し，その抗 体鎖の残りの免疫グロブリン誘導部分はヒト免疫グロブリンから誘導される可変 ドメインからなる相補性抗体軽鎖または重鎖をコードするＤＮＡ配列を有するオ ペロンを発現ベクター内に製造し， ｃ）両オペロンで宿主細胞をトランスフェクトし， ｄ）トランスフェクトされた細胞系を培養して人化抗体分子を産生させる，こ とからなる方法 16．「請求項１または２」に記載の組み換え抗体分子を医薬的に許容される担 体，希釈剤または賦形剤と配合してなる治療用，医薬用または診断用組成物 17．「請求項１または２」に記載の組み換え抗体分子を医薬的に許容される賦 形剤，希釈剤または担体と混合することからなる治療用，医薬用または診断用組 成物の製造方法 18．「請求項１または２」に記載の組み換え抗体分子の有効量をヒトまたは動 物の対象に投与することからなる治療または診断方法