ES2307616T3 - Fructosiltransferasas (inulosacarasa y levansacarasa) de lactobacillus reuteri. - Google Patents
Fructosiltransferasas (inulosacarasa y levansacarasa) de lactobacillus reuteri. Download PDFInfo
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Abstract
Proteína con una actividad fructosiltransferasa, la secuencia de aminoácidos de la proteína presentando al menos un 75% de identidad de los aminoácidos, según ha sido determinado por el algoritmo de BLAST, con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID No. 1.
Description
Fructosiltransferasas (inulosacarasa y
levansacarasa) de Lactobacillus reuteri.
La presente invención pertenece al campo de la
producción enzimática de biomoléculas. La invención se preocupa
particularmente de nuevas fructosiltransferasas derivadas de
lactobacilos y de un proceso para la producción recombinante de las
enzimas y para la producción de inulinas útiles y
fructooligosacáridos provenientes de la sacarosa.
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Las bacterias del ácido láctico (LAB) juegan un
papel importante en la producción fermentativa de alimentos y
piensos. Generalmente, estas bacterias fueron usadas para la
producción de por ejemplo vino, cerveza, pan, queso y yogur, y para
la conservación de alimentos y piensos, p. ej. aceitunas,
encurtidos, salchichas, chucrut y ensilaje. Por estas aplicaciones
tradicionales, las bacterias del ácido láctico son los
microorganismos de grado alimentario que poseen el estatus
Generalmente Reconocido Como Salvo (GRAS). Debido a los diferentes
productos que están formados durante la fermentación con las
bacterias del ácido láctico, estas bacterias contribuyen
positivamente al sabor, olor y conservación del producto final. El
grupo de bacterias del ácido láctico incluye diferentes géneros
tales como Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus,
Streptococcus, etc.
En los últimos años también las propiedades de
promoción sanitaria de las bacterias del ácido láctico recibieron
mucha atención. Ellas producen una variedad abundante de
exopolisacáridos (EPS's). Estos polisacáridos están pensados para
contribuir a la salud humana actuando como sustratos prebióticos,
nutracéuticos, agentes reductores del colesterol o
inmunomoduladores.
Hasta la fecha, los polisacáridos de peso
molecular alto producidos por plantas (de tipo celulosa, almidón y
pectina), algas (de tipo alginato y carragenina) y bacterias (de
tipo alginato, gellan y xantano) que son usados en diferentes
aplicaciones industriales como agentes viscosificantes,
estabilizantes, emulsionantes, gelificantes o con capacidad
higroscópica. Aunque todos estos polisacáridos se usan como
aditivos alimentarios, se originan en organismos que no tienen el
estatus GRAS. Así ellos son menos deseables que los
exopolisacáridos de microorganismos, tales como bacterias del ácido
láctico, que tienen el estatus GRAS.
Los exopolisacáridos producidos por LAB pueden
ser divididos en dos grupos, heteropolisacáridos y
homopolisacáridos; estos son sintetizados por mecanismos totalmente
diferentes. Los primeros consisten en repetir unidades en las
cuales residuos de diferentes tipos de azúcares están presentes y
los segundos consisten en un tipo de monosacárido. La síntesis de
heteropolisacáridos por bacterias del ácido láctico, incluso de
lactobacilos, ha sido estudiada de manera exhaustiva en los últimos
años. Considerablemente menos informaciones están disponibles en la
síntesis de homopolisacáridos de lactobacilos, aunque se realizaron
algunos estudios. Homopolisacáridos con fructosa como el
constituyente del azúcar pueden ser divididos en dos grupos,
inulinas y levanos. Inulinas consisten en residuos de
\beta-fructofuranósido ligado en 2,1, mientras
que levanos consisten en residuos de
\beta-fructofuranósido ligado en 2,6. Ambos
pueden ser lineales o ramificados. El tamaño de los levanos
bacterianos puede variar de 20 kDa hasta algunos MDa. La
información está limitada sobre la síntesis de levanos. Esta
síntesis fue estudiada con más detalles en especies de Zymomonas
mobilis y de Bacillus. Dentro de bacterias del ácido
láctico, las fructosiltransferasas sólo fueron estudiadas en
estreptococos. Hasta ahora ninguna fructosiltransferasa ha sido
reportada en lactobacilos.
En un informe reciente la cepa LB 121 de
Lactobacillus reuteri fue encontrada para producir tanto un
glucano como un fructano cuando ha crecido en sacarosa, pero sólo
un fructano cuando ha crecido en rafinosa (van
Geel-Schutten, G.H. et al., Appl. Microbiol.
Biotechnol. (1998) 50, 697-703). En otro informe el
glucano y el fructano fueron caracterizados por sus pesos
moleculares (de 3.500 y 150 kDa respectivamente) y el glucano fue
reportado por ser altamente ramificado con una estructura única que
consiste en una \alpha-glucosa terminal,
4-sustituida, 6-sustituida, y
4,6-disustituida en una proporción molar 1.1: 2.7:
1.5: 1.0 (van Geel-Schutten, G.H. et al.,
Appl. Environ. Microbiol. (1999) 65, 3008-3014). El
fructano fue identificado como un
(2\rightarrow6)-\beta-D-fructofuranano
lineal (también llamado un levano). Éste fue el primer ejemplo de
síntesis de fructano por una especie de Lactobacillus.
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Dos nuevos genes que codifican enzimas con una
actividad fructosiltransferasa ahora han sido encontrados en
Lactobacillus reuteri, y sus secuencias de aminoácidos han
sido determinadas. Éstas son las dos primeras enzimas identificadas
en una especie de Lactobacillus capaz de producir un
fructano. Una de las enzimas es una inulosacarasa que produce un
alto peso molecular (>10^{7} Da) de fructano conteniendo
unidades de fructosilo ligado en
\beta(2-1) y fructooligosacáridos, mientras
que la otra es una levanosucrasa que produce un fructano que
contiene unidades de fructosilo ligado en
\beta(2-6). La invención se refiere a la
enzima inulosacarasa, al ADN que la codifica, a las células
recombinantes que contienen tal ADN y a su uso en la producción de
carbohidratos, tal y como se define en las reivindicaciones
anexas.
Se descubrió según la invención que una de las
nuevas fructosiltransferasas (FTFA; una inulosacarasa) produce una
inulina de alto peso molecular con unidades de fructosilo ligado en
\beta(2-1) y fructooligosacáridos. La
síntesis de fructooligosacáridos fue también observada en
determinadas cepas de Lactobacillus, en particular en
determinadas cepas de Lactobacillus reuteri. No obstante, la
inulina no fue encontrada en sobrenadantes del cultivo de
Lactobacillus reuteri, sino sólo en extractos de células de
E. coli que expresan la fructosiltransferasa mencionada más
arriba. Esta inulosacarasa consiste en o 798 aminoácidos (2394
nucleótidos) o 789 aminoácidos (2367 nucleótidos) dependiendo del
potencial del codón de iniciación usado. El peso molecular (PM)
deducido de la secuencia de aminoácidos de la segunda forma es 86
kDa y su punto isoeléctrico es 4.51, a pH 7.
La secuencia de aminoácidos de la inulosacarasa
está mostrada en la SEC ID No. 1 (figura 1, residuos de aminoácidos
1-789). Como se ha mencionado anteriormente, la
secuencia de nucleótidos contiene dos codones de iniciación
putativos que llevan a una forma de 2394 (ver SEC ID No. 3) o 2367
(ver SEC ID No. 2) nucleótidos de la inulosacarasa. Ambos codones de
iniciación putativos son precedidos por un centro de unión al
ribosoma putativo, GGGG (localizado 12 pares de bases más arriba de
su codón de iniciación) o AGGA (localizado 14 pares de bases más
arriba de su codón de iniciación), respectivamente (ver figura 1 y
SEC ID No. 4).
La presente invención cubre una proteína que
tiene una actividad inulosacarasa con una identidad de aminoácido
de al menos un 65%, preferiblemente al menos un 75%, y más
preferiblemente al menos un 85%, en comparación con la secuencia de
aminoácidos de la SEC ID No. 1. La invención también cubre una
parte de una proteína con al menos 15 aminoácidos contiguos que son
idénticos a la parte correspondiente de la secuencia de aminoácidos
de la SEC ID No. 1.
Las fructosiltransferasas fueron encontradas en
diferentes bacterias tales como Zymomonas mobilis, Erwinia
amylovora, Acetobacter amylovora, Bacillus polymyxa, Bacillus
amyloliquefaciens, Bacillus stearothermophilus, y Bacillus
subtilis. En las bacterias del ácido láctico este tipo de enzima
solo fue encontrado antes en algunos estreptococos. Muchas
fructosiltransferasas bacterianas tienen una masa molecular de
50-100 kDa (con la excepción de la
fructosiltransferasa encontrada en Streptococcus salivarius
que tiene una masa molecular de 140 kDa). La alineación de
secuencias de aminoácidos ha revelado que la nueva inulosacarasa de
lactobacilos tiene una alta homología con las fructosiltransferasas
que tienen su origen en bacterias Gram positivas, en particular con
enzimas de Streptococcus. La homología máxima (figura 2) fue
encontrada con la enzima SacB de Streptococcus mutans de
Ingbritt A (un 62% de identidad dentro de 539 aminoácidos).
Ciertas funciones putativas basadas en la
alineación y estudios de mutagénesis dirigida pueden ser atribuidas
a diferentes aminoácidos de la nueva inulosacarasa.
Asp-263, Glu-330,
Asp-415, Glu-431,
Asp-511, Glu-514,
Arg-532 y/o Asp-551 de la secuencia
de aminoácidos de la SEC ID No. 1 son identificados como residuos
putativos catalíticos. Cabe destacar que un análisis cuantitativo
de hidrofobicidad según Kite y Doolittle (1982) J. Mol. Biol. 157,
105-132 sugiere que la nueva inulosacarasa contiene
una secuencia señal putativa según la regla de Von Heijne. El sitio
de la peptidasa señal putativa está localizado entre Gly en la
posición 21 y Ala en la posición 22. Además, es sorprendente que la
secuencia del aminoácido C-terminal de la nueva
inulosacarasa contiene un aminoácido señal LPXTG (SEC ID No. 5)
anclado a la pared celular putativa y 20 repeticiones del motivo
PXX (ver figura 1), donde P es una prolina y X es cualquier otro
aminoácido. En 15 de cada 20 repeticiones, no obstante, el motivo es
PXT. Este motivo no ha sido encontrado hasta ahora en proteínas de
origen procariótico y eucariótico.
Una secuencia de nucleótidos codificando
cualquiera de las proteínas anteriormente mencionadas, mutantes,
variantes o partes de ellas son también un sujeto de la invención.
Además, las secuencias de ácidos nucleicos correspondientes a
regiones reguladoras de la expresión (promotores, intensificadores,
terminadores) de al menos 30 ácidos nucleicos contiguos contenidos
en la secuencia de ácidos nucléicos (1)-(67) o (2438)-(2592) de SEC
ID No. 4 (ver también figura 1) pueden ser usadas para la expresión
de genes homólogos o heterólogos. Tales secuencias reguladoras de
la expresión son ligadas de manera operativa a una secuencia de
ácidos nucleicos de codificación del polipéptido tal como los genes
de la fructosiltransferasa según la invención. Un constructo de
ácidos nucleicos comprendiendo la secuencia de nucleótidos ligada
de manera operativa a una secuencia de ácidos nucleicos reguladora
de la expresión está también cubierto por la invención.
Una célula huésped recombinante, tal como una
célula de mamífero (con la excepción del humano), vegetal, animal,
fúngica o bacteriana, conteniendo una o más copias del constructo
de ácidos nucleicos mencionado más arriba es un sujeto adicional de
la invención. El gen de la inulosacarasa (empezando en el
nucleótido 41) ha sido clonado en un vector de expresión de E.
coli bajo el control de un promotor ara en E. coli Top10.
Las células de E. coli Top10 expresando la inulosacarasa
recombinante hidrolizaron la sacarosa y sintetizaron el material de
fructano. SDS-PAGE de extractos de células de E.
coli Top10 inducidas por arabinosa sugirió que la inulosacarasa
recombinante tiene un peso molecular de 80-100 kDa,
estando en la gama de otras fructosiltransferasas conocidas y
conforme con el peso molecular de 86 kDa deducido de la secuencia
de aminoácidos representada en la figura 1.
La invención cubre además una inulosacarasa que,
según la invención, en presencia de sacarosa, produce una inulina
que tiene unidades de D-fructosilo ligadas en
\beta(2-1) y fructooligosacáridos. Dos
tipos diferentes de fructanos, Inulinas y levanos, existen en
naturaleza. Sorprendentemente, la nueva inulosacarasa expresada en
la célula Top10 de E. coli sintetiza un alto peso molecular
(>10^{7} à Da) de inulina y fructooligosacáridos, mientras que
en los sobrenadantes de cultivos de Lactobacillus reuteri,
además de los fructooligosacáridos, se encuentra un levano y no una
inulina. Esta discrepancia puede tener diferentes explicaciones: el
gen de la inulosacarasa puede ser silencioso en Lactobacillus
reuteri, o puede no ser expresado en Lactobacillus
reuteri según las condiciones evaluadas, o la inulosacarasa sólo
puede sintetizar fructooligosacáridos en su huésped natural, o el
polímero de la inulina puede ser degradado poco después de la
síntesis, o puede no ser segregado y permanecer unido a la célula,
o la inulosacarasa puede tener actividades diferentes en células de
Lactobacillus reuteri y de E. coli Top10.
Se encontró además que ciertos lactobacilos, en
particular el Lactobacillus reuteri, poseen otra
fructosiltransferasa, una levansacarasa (FTFB), además de la
inulosacarasa anteriormente descrita. La secuencia del aminoácido
N-terminal de la fructosiltransferasa purificada del
sobrenadante de Lactobacillus reuteri resultó ser
QVESNNYNGVAEVN
TERQANGQI (SEC ID No. 6). Además, tres secuencias internas fueron identificadas, a saber (M)(A) HLDVWDSWP
VQDP(V) (SEC ID No. 7), NAGSIFGT(K) (SEC ID No. 8), V(E)(E)VYSPKVSTLMASDEVE (SEC ID No. 9). La secuencia del aminoácido N-terminal no pudo ser identificada en la secuencia de la inulosacarasa deducida. También las secuencias de aminoácidos de los tres fragmentos peptídicos internos de la fructosiltransferasa purificada no estuvieron presentes en la secuencia de la inulosacarasa putativa. Evidentemente, el gen de la inulosacarasa no codifica la fructosiltransferasa purificada que sintetiza el levano. La secuencia de aminoácidos completa de la levansacarasa está mostrada en la SEC ID No. 11 y la secuencia de nucleótidos está mostrada en la SEC ID No. 10. La levansacarasa comprende un anclaje a la membrana putativa (ver aminoácidos 761 765 en SEC ID No. 11) y un dominio de expansión de la membrana putativa (ver aminoácidos 766-787 en SEC ID No. 11). El fructano producido por la levansacarasa fue identificado en el sobrenadante del cultivo de Lactobacillus reuteri como un (2\rightarrow6)-\beta-D-fructofuranano lineal con un peso molecular de 150 kDa. La enzima purificada también produce este fructano.
TERQANGQI (SEC ID No. 6). Además, tres secuencias internas fueron identificadas, a saber (M)(A) HLDVWDSWP
VQDP(V) (SEC ID No. 7), NAGSIFGT(K) (SEC ID No. 8), V(E)(E)VYSPKVSTLMASDEVE (SEC ID No. 9). La secuencia del aminoácido N-terminal no pudo ser identificada en la secuencia de la inulosacarasa deducida. También las secuencias de aminoácidos de los tres fragmentos peptídicos internos de la fructosiltransferasa purificada no estuvieron presentes en la secuencia de la inulosacarasa putativa. Evidentemente, el gen de la inulosacarasa no codifica la fructosiltransferasa purificada que sintetiza el levano. La secuencia de aminoácidos completa de la levansacarasa está mostrada en la SEC ID No. 11 y la secuencia de nucleótidos está mostrada en la SEC ID No. 10. La levansacarasa comprende un anclaje a la membrana putativa (ver aminoácidos 761 765 en SEC ID No. 11) y un dominio de expansión de la membrana putativa (ver aminoácidos 766-787 en SEC ID No. 11). El fructano producido por la levansacarasa fue identificado en el sobrenadante del cultivo de Lactobacillus reuteri como un (2\rightarrow6)-\beta-D-fructofuranano lineal con un peso molecular de 150 kDa. La enzima purificada también produce este fructano.
La invención también pertenece a un proceso que
produce una inulina de tipo fructano como se ha descrito
anteriormente usando fructosiltransferasas aisladas según la
invención y una fuente de fructosa adecuada tal como sacarosa o
rafinosa. La enzima fructosiltransferasa puede ser aislada por
medios convencionales del cultivo de lactobacilos de la
fructosiltransferasa-positiva, especialmente un
Lactobacillus reuteri, o de un organismo recombinante que
contiene un gen o genes de fructosiltransferasa.
Adicionalmente, la invención concierne un
proceso de producción de fructooligosacáridos conteniendo la
estructura característica de los fructanos anteriormente descritos
usando una fructosiltransferasa aislada según la invención. Hay un
interés creciente en oligosacáridos derivados de homopolisacáridos,
por ejemplo para fines prebióticos. Diferentes fructo- y
gluco-oligosacáridos son conocidos para estimular el
crecimiento de bifido-bacterias en el colon humano.
Se puede producir de otra manera fructooligosacáridos por
hidrólisis de los fructanos anteriormente descritos. Esta
hidrólisis puede ser realizada por métodos de hidrólisis conocidos
tales como la hidrólisis enzimática con enzimas tales como la
levanasa o la inulinasa o por hidrólisis del ácido. La producción
de los fructooligosacáridos según la invención preferiblemente
contiene al menos 2, más preferiblemente al menos 3, hasta
aproximadamente 20 unidades de anhidrofructosa, opcionalmente
además de una o más unidades (glucosa, galactosa, etc.). Estos
fructooligosacáridos son útiles como prebióticos.
Se puede obtener fructanos químicamente
modificados y fructooligosacáridos de los fructanos anteriormente
descritos. Se puede conseguir una modificación química por
oxidación, fosforilación, acilación, hidroxialquilación,
carboximetilación, y alquilación de un amino. La hidrólisis parcial
de fructanos y los fructanos modificados anteriormente descritos
resultan en fructooligosacáridos, que pueden ser usados como
carbohidratos bioactivos o prebióticos.
Las modificaciones anteriormente mencionadas
pueden ser usadas o separadamente o en combinación dependiendo del
producto deseado. Además, el grado de modificación química es
variable y depende del uso previsto.
El uso de una cepa de Lactobacillus capaz
de producir un levano, inulina o fructooligosacáridos o una mezcla
de los mismos, como un probiótico, está también cubierto por la
invención. Preferiblemente, la cepa de Lactobacillus es
también capaz de producir un glucano, especialmente un glucano tal y
como se ha hecho referencia más arriba. La eficacia de algunas
cepas de Lactobacillus reuteri como unos probióticos ha sido
demostrada en varios animales tales como por ejemplo aves de corral
y seres humanos. La administración de algunas cepas de
Lactobacillus reuteri a cerdos resultó en niveles de suero
total y de colesterol LDL significativamente inferiores, mientras
que en niños se usa Lactobacillus reuteri como un agente
terapéutico contra la diarrea aguda. Por ésta y otras razones, las
cepas de Lactobacillus reuteri, que se caracterizan por no
producir los glucanos o fructanos descritos aquí, han sido
suplementadas en los productos probióticos disponibles en el
mercado. El modo de acción del Lactobacillus reuteri como
probiótico no ha sido aclarado todavía. Estudios preliminares
indicaban que la colonización del intestino por el Lactobacillus
reuteri puede tener importancia. Según la invención, se
descubrió que el modo de acción del Lactobacillus reuteri
como probiótico puede residir parcialmente en la capacidad de
producir polisacáridos. Las cepas de Lactobacillus,
preferiblemente las cepas de Lactobacillus reuteri, y más
preferentemente una cepa LB 121 de Lactobacillus reuteri y
otras cepas que contienen uno o más genes de fructosiltransferasa
codificando proteínas capaces de producir inulinas, levanos y/o
fructooligosacáridos pueden así ventajosamente ser usadas como un
probiótico. Ellas pueden también, junto con estos polisacáridos,
ser usadas como un simbiótico.
Los procedimientos generales para la clonación,
manipulaciones de ADN y electroforesis en gel de agarosa fueron
esencialmente tal y como se describe por Sambrook et al.
(1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring
Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York. Las
digestiones de la endonucleasa de restricción y ligaciones con T4
ADN-ligasa fueron realizadas según fue recomendado
por los proveedores. El ADN fue amplificado por técnicas de PCR
(reacción en cadena de la polimerasa) usando ampliTAQ ADN
polimerasa (Perkin Elmer) o Pwo ADN polimerasa. Fragmentos de ADN
fueron aislados de los geles de agarosa usando el equipo de
extracción Qiagen (Qiagen GMBH), siguiendo las instrucciones de los
proveedores. Una cepa 121 (LMG 18388) de Lactobacillus
reuteri creció a 37°C en un medio MRS (DIFCO) o en medio
MRS-s (medio MRS que contiene 100 g/l de sacarosa
en vez de 20 g/l de glucosa). Cuando la producción de
fructooligosacáridos fue investigada el fosfato fue omitido y el
citrato de amonio fue sustituido por nitrato de amonio en el medio
MRS-s. Las cepas de E. coli crecieron
aeróbicamente a 37°C en un medio LB, donde un complemento apropiado
de 50 \mug/ml de ampicilina (para la selección de plásmidos
recombinantes) o con un 0,02% (p/v) de arabinosa (para la inducción
del gen de la inulosacarasa).
Se aisló el ADN total de Lactobacillus
reuteri conforme con Verhasselt et al. (1989) FEMS
Microbiol. Lett. 59, 135-140 según fue modificado
por Nagy et al. (1995) J. Bacteriol. 177,
676-687.
El gen de la inulosacarasa fue identificado por
amplificación del ADN cromosómico de Lactobacillus reuteri
con PCR usando cebadores degenerados (5ftf, 6ftfi, y 12ftfi, ver
tabla 1) basada en secuencias de aminoácidos conservados deducidos
de distintos genes bacterianos de fructosiltranferasa (SacB de
Bacillus amyloliquefaciens, SacB de Bacillus subtilis,
fructosiltransferasa de Streptococcus mutans y
fructosiltransferasa de Streptococcus salivarius, ver figura
4) y en el ADN de Lactobacillus reuteri como modelo. Usando
cebadores 5ftf y 6ftfi, se obtuvo un producto de amplificación con
el tamaño predicho de aproximadamente 234 bp (figura 5A). Este
fragmento de 234 bp fue clonado en E. coli JM109 usando el
vector pCR2.1 y fue secuenciado. Se realizaron transformaciones por
electroporación usando el aparato generador de impulsiones en los
genes BioRad a 2.5 kV, 25 \muF y 200 \Omega, siguiendo las
instrucciones del fabricante. Se realizó una secuenciación según el
método de Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
74, 5463-5467. Los análisis de los datos obtenidos
de la secuencia confirmaron que una parte de un gen de
fructosiltransferasa (ftf) había sido aislada. Se usó el fragmento
de 234 bp amplificado para diseñar los cebadores 7ftf y 8ftfi (ver
tabla 1). La PCR con los cebadores 7ftf y 12ftfi dio un producto
del tamaño predicho de 948 bp (ver figura 5B); su secuencia mostraba
una similitud clara con los genes de fructosiltransferasa
previamente caracterizados. El fragmento amplificado de 948 bp fue
usado para diseñar los cebadores ftfAC1(i) y ftfAC2(i)
(ver tabla 1) para una PCR inversa. Usando técnicas de PCR inversa
se generó un fragmento de 1438 bp de un gen de la inulosacarasa,
incluyendo el extremo 3' del gen de la inulosacarasa (ver figura
5C). El fragmento 5' restante de la inulosacarasa fue aislado con
una combinación de técnicas estándares e inversas de PCR. En
resumen, el ADN de Lactobacillus reuteri fue cortado con la
enzima de restricción XhoI y ligado. Una PCR con los cebadores 7ftf
y 8ftfi, usando el producto de ligación como un modelo, liberó un
producto de PCR de 290 bp que fue clonado en pCR2.1 y secuenciado.
Esto reveló que el cebador 8ftfi se apareó de forma no específica
al igual que produjo específicamente el producto de 290 bp (ver
figura 5D). En ese momento, se obtuvo la secuencia de aminoácidos
N-terminal de una enzima fructosiltransferasa
(FTFB) purificada de la cepa 121 de Lactobacillus reuteri.
Esta secuencia consistió en los 23 aminoácidos siguientes:
QVESNNYNG
VAEVNTERQANGQI (SEC ID No. 6). El cebador degenerado 19ftf (YNGVAEV) fue diseñado basándose en una parte de esta secuencia peptídica N-terminal y el cebador 20ftfi fue diseñado en el producto de la PCR de 290 bp. La PCR con los cebadores 19ftf y 20ftfi dio un producto de la PCR de 754 bp (ver figura 5E), que fue clonado en pCR2.1 y secuenciado. Ambas cadenas de ADN del gen de la fructosiltransferasa entero fueron secuenciadas por duplicado. Se obtuvo de esta manera la secuencia de una región de 2,6 kb del ADN de Lactobacillus reuteri, conteniendo el gen de la inulosacarasa y su entorno.
VAEVNTERQANGQI (SEC ID No. 6). El cebador degenerado 19ftf (YNGVAEV) fue diseñado basándose en una parte de esta secuencia peptídica N-terminal y el cebador 20ftfi fue diseñado en el producto de la PCR de 290 bp. La PCR con los cebadores 19ftf y 20ftfi dio un producto de la PCR de 754 bp (ver figura 5E), que fue clonado en pCR2.1 y secuenciado. Ambas cadenas de ADN del gen de la fructosiltransferasa entero fueron secuenciadas por duplicado. Se obtuvo de esta manera la secuencia de una región de 2,6 kb del ADN de Lactobacillus reuteri, conteniendo el gen de la inulosacarasa y su entorno.
Se construyeron los plásmidos para la expresión
del gen de la inulosacarasa en E. coli Top10 como se
describe más adelante. Un fragmento de 2414 bp, conteniendo el gen
de la inulosacarasa que comenzó en el primer codón de iniciación
putativo en la posición 41, fue generado por PCR, usando los
cebadores ftfA1 y ftfA2i. Ambos cebadores contenían sitios de
reconocimiento de enzimas de restricción adecuados (un sitio
NcoI en el extremo 5' de ftfA1 y un sitio BglII en el
extremo 3' de ftfA2i). La PCR con el ADN de Lactobacillus
reuteri, Pwo ADN polimerasa dirigida y cebadores ftfA1 y ftfA2i
dio el gen completo de la inulosacarasa flanqueado por los sitios
de restricción NcoI y BglII. El producto de la PCR con extremos
romos fue ligado directamente en pCRbluntII-Topo.
Usando los sitios de restricción NcoI y BglII, el gen
putativo ftfA fue clonado en el vector de expresión pBAD, en
dirección descendente del promotor de arabinosa inducible y en el
marco en dirección ascendente del epítopo Myc y una cola His. El
vector pBAD conteniendo el gen (pSVH101) de la inulosacarasa fue
transformado en E. coli Top10 y usado para estudiar la
expresión de la inulosacarasa. Se confirmó la construcción correcta
del plásmido conteniendo el gen completo de la inulosacarasa por
análisis de digestión de la enzima de restricción y por análisis de
secuencias, mostrando una clonación en el marco del gen de la
inulosacarasa usando el sitio de acoplamiento ribosómico
proporcionado por el vector pBAD y el primer codón putativo de
iniciación (en la posición 41) de la inulosacarasa (ver figura
1).
Se aisló el ADN plásmido de E. coli
usando el método de lisis alcalino de Birnboim y Doly (1979)
Nucleic Acids Res. 7, 1513-1523 o con un kit para
plásmidos de Qiagen siguiendo las instrucciones del proveedor. Las
células E. coli Top 10 con pSVH101 crecieron durante toda la
noche en un medio de LB que contenía un 0,02% (p/v) de arabinosa y
fueron cosechadas por centrifugación. El granulado fue lavado con
25 mM de un tampón de acetato sódico con pH 5.4 y la suspensión fue
centrifugada otra vez. Las células granuladas fueron resuspendidas
en 25 mM de un tampón de acetato sódico con pH 5.4. Las células
fueron rotas por sonicación. Los detritos celulares y las células
intactas fueron eliminados por centrifugación durante 30 min a 4°C a
10.000xg y el extracto resultante libre la células fue usado en los
ensayos enzimáticos. Las actividades de fructosiltransferasa fueron
determinadas a 37°C en un tampón de reacción (25 mM de acetato
sódico, pH 5.4, 1 mM de CaCl_{2}, 100 g/l de sacarosa)
controlando la liberación de glucosa de la sacarosa, detectando los
fructooligosacáridos o determinando la cantidad de polímero de
fructano producida usando extractos libres de células de E.
coli o sobrenadante del cultivo de Lactobacillus reuteri
como fuente enzimática. Sacarosa, glucosa y fructosa fueron
determinadas enzimáticamente usando equipos disponibles en el
mercado.
La producción de fructano por Lactobacillus
reuteri fue estudiada con células crecidas en medio
MRS-s. La formación de un producto fue también
estudiada con extractos libres de células de E. coli
conteniendo la nueva inulosacarasa incubada en tampón de reacción
(1 mg de proteína/10 ml de solución tampón, incubado durante toda
la noche a 37°C). Se recogieron los fructanos por precipitación con
etanol. La espectroscopia de ^{1}H-RMN y el
análisis de metilación fueron realizados como se describe por van
Geel-Schutten et al. (1999) Appl. Environ.
Microbiol. 65, 3008-3014. Se determinaron los pesos
moleculares de los fructanos por cromatografía de alto rendimiento
de exclusión por tamaños unida durante el proceso a una dispersión
de luz láser multiángulo y un detector de índice de refracción
diferencial. La síntesis de los fructooligosacáridos fue estudiada
en sobrenadantes de cultivos de Lactobacillus reuteri y en
extractos de células de E. coli que contienen la nueva
inulosacarasa incubada en tampón de reacción (1 mg de proteína/10 ml
de solución tampón, incubada durante toda una noche a 37°C). Se
determinaron la glucosa y la fructosa enzimáticamente según se ha
descrito anteriormente y los fructooligosacáridos producidos fueron
analizados usando una columna Dionex. Se centrifugaron las mezclas
de las incubaciones durante 30 min a 10.000xg y se diluyeron 1:5 en
una solución de un 100% de dimetilsulfóxido antes de la inyección
en una columna Dionex. Se usó el producto resultante de la
digestión de la insulina (DP1-20) como un estándar.
Se consiguió la separación de los compuestos por cromatografía de
intercambio aniónico en una columna CarboPac Pal (Dionex) unida a
una columna de protección CarboPac PA1 (Dionex). Se generó el
gradiente siguiente usando una bomba GP50 Dionex: el % del eluyente
B es un 5% (0 min); un 35% (10 min); un 45% (20 min); un 65% (50
min); un 100% (54-60 min); un 5%
(61-65 min). El eluyente A fue 0,1 M de NaOH y el
eluyente B fue 0,6 M de NaAc en una solución de 0,1 M de NaOH. Se
detectaron los compuestos usando un detector electroquímico Dionex
ED40 con un electrodo de trabajo AU y un electrodo de referencia
Ag/AgCl con una sensibilidad de 300 nC. Se usó el programa de
impulsos: +0,1 Voltio (0-0,4 s); +0,7 Voltio
(0,41-0,60 s); -0,1 Voltio
(0,61-1,00 s). Se integraron los datos usando un
sistema de integración de datos Perkin Elmer Turbochrom. Se hizo
una separación diferente de compuestos bajo la forma de calcio en
una columna de intercambio de cationes (Benson BCX4). Se usó
Ca-EDTA en agua (100 ppm) como fase móvil. La
velocidad de elución fue de 0,4 ml/min a una temperatura de columna
de 85°C. Se hizo la detección de compuestos por un índice de
refracción (Jasco 830-RI) a 40°C. Se consiguió una
cuantificación de compuestos usando el software Turbochrom (Perkin
Elmer).
Se realizó una SDS-PAGE según
Laemmli (1970) Nature 227, 680-685 usando un 7,5%
de geles de poliacrilamida. Después de la electroforesis los geles
fueron coloreados con Azul Brillante de Coomassie o se llevó a cabo
una coloración activa (Periodic Acid Schiff, PAS) tal y como lo
describe Van Geel-Schutten et al. (1999)
Appl. Environ. Microbiol. 65, 3008-3014.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Catalogado de izquierda a derecha: nombre de
cebador (i, cebador inverso), ubicación (en bp) en ftfA y en
la secuencia de 5' a 3' según códigos del grupo IUB (N=ninguna
base; M=A o C; R=A o G; W=A o T; S=C o G; Y=C o T; K=G o T; B=no A;
D=no C; H=no G; y V=no T).
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La adhesión de cepas de Lactobacillus
reuteri a líneas celulares Caco-2 fue
determinada como se describe más abajo. En primer lugar, una
suspensión bacteriana fue preparada como se describe más abajo. Las
cepas de Lactobacillus reuteri LB 121, 35-5
y L. rhamnosus LGG (una cepa probiótica bien conocida con
buenas propiedades de adhesión) fueron cultivadas en Caldo MRS
completado con 5 \mul/ml de
metil-1,2-[^{3}H]-timidina a 37°C
durante 18-20 h antes de los ensayos de adhesión.
Los cultivos fueron cosechados por centrifugación, lavados con una
solución salina tamponada con fostato (PBS) y puestos otra vez en
suspensión en una PBS o una PBS completada con 30 g/l de sacarosa
(ver tabla 3) a una densidad final de aproximadamente 2 x 10^{9}
cfu/ml. Antes del ensayo de adhesión, las células en suspensiones en
PBS con 30 g/l de sacarosa fueron incubadas durante 1 hora a 37°C,
mientras que las células en suspensiones en PBS se mantuvieron en
hielo durante 1 hora. Tras la incubación a 37°C, las suspensiones
en PBS con sacarosa fueron centrifugadas y las células fueron
lavadas con una PBS y resuspendidas en PBS hasta una densidad final
de aproximadamente 2 x 10^{9} cfu/ml.
Se cultivaron las células Caco-2
como se describe más abajo. Se usaron subcultivos de células
Caco-2 (ATCC, código HTB 37, adenocarcinoma de
colon humano), almacenados como reserva de cultivos congelados en
nitrógeno líquido para las pruebas de adhesión. Las células
Caco-2 crecieron en medio de cultivo consistiendo
en un medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), completado con
suero de ternera fetal inactivado por calor (10% v/v), aminoácidos
no esenciales (1% v/v), L-glutamina (2 mM) y
gentamicina (50 \mug/ml). Se sembraron aproximadamente 2.000.000
células en matraces de cultivo de tejido de 75 cm^{2} conteniendo
un medio de cultivo y se cultivaron en una incubadora humidificada
a 37°C en aire conteniendo un 5% de CO_{2}. Los cultivos
confluentes cercanos de células Caco-2 fueron
cosechados por tripsinización y puestos otra vez en suspensión en
medio de cultivo. Se estableció el número de células usando una
cámara de recuento Bürker-Türk.
Para los experimentos siguientes se usó un
sistema de transporte monocapa de Caco-2. Las
células Caco-2 cultivadas en un sistema de
transporte con dos compartimientos son comúnmente usadas para
estudiar la permeabilidad intestinal epitelial. En este sistema la
célula Caco-2 se diferencia en células polarizadas
columnares después de alcanzar la proliferación máxima. El sistema
Caco-2 ha sido mostrado para simular el transporte
transcelular pasivo y activo de electrolitos, azúcares, aminoácidos
y compuestos lipofilicos (Hillgren et al. 1995, Dulfer et
al., 1996, Duizer et al., 1997). También, una
correlación clara entre la absorción in vivo y la
permeabilidad a través de las monocapas de células
Caco-2 ha sido proporcionada (Artursson y Karlsson,
1990). Por los presentes estudios de transportes, las células
Caco-2 fueron sembradas en insertos de filtros
semi-permeables (una placa de 12 pocillos
Transwell, Costar) a aprox. 100.000 células por filtro (área de
crecimiento \pm 1 cm^{2} conteniendo 2,5 ml de medio de
cultivo). Las células insertadas fueron cultivadas durante 17 a 24
días a 37°C en una incubadora humedecida conteniendo un 5% de
CO_{2} en el aire. Durante este periodo de cultivo las células
han sido sometidas a una diferenciación celular en forma de
enterocito.
La gentamicina fue eliminada del medio de
cultivo dos días antes de los ensayos de adhesión.
El ensayo de adhesión fue realizado como se
describe más abajo. La PBS fue usada como medio de exposición. 25
\mul de una suspensión bacteriana (2 x 10^{9} cfu/ml) fueron
añadidos a 0,5 ml de medio. El lado apical de las monocapas de
Caco-2 fue incubado con las suspensiones bacterianas
durante 1 hora a 37°C. Tras la incubación, el fluido restante fue
eliminado y las células fueron lavadas tres veces con 1 ml de PBS.
Posteriormente, las monocapas de Caco-2 fueron
digeridas durante toda la noche con 1 ml de NaOH 0,1M, un 1% de SDS.
El lisado fue mezclado con 10 ml de líquido de centelleo Hionic
Fluor y la radioactividad fue medida por recuento por centelleo
líquido usando un contador de centelleo líquido LKB/Wallac. Como
control, la radioactividad de las suspensiones bacterianas fue
medida. Para cada grupo de prueba, el porcentaje de bacterias
fijadas a las monocapas fue calculado. Se realizaron todas las
pruebas de adhesión por cuadriplicado. La tabla 4 da los resultados
de la prueba de adhesión bacteriana a las líneas celulares de
Caco-2. Se puede concluir de los resultados que los
glucanos y los fructanos contribuyen a la adherencia de
Lactobacillus reuteri a las líneas celulares
Caco-2. Esto podría indicar que las cepas de
Lactobacillus reuteri que producen EPS poseen
características probióticas mejoradas o que el Lactobacillus
reuteri y sus polisacáridos podrían funcionar como un excelente
simbiótico.
Figura 1: SEC ID No. 1; La secuencia de
aminoácidos deducida de la nueva inulosacarasa de Lactobacillus
reuteri (aminoácido 1-789). Además, las
designaciones y orientación (< de 3' a 5' y > de 5' a 3') de
los cebadores y las enzimas de restricción usadas para PCR
(inversa), están mostradas en el lado derecho. Los codones de
iniciación putativos (ATG, en posiciones 41 y 68) y el codón de
detención (TAA, en la posición 2435) están mostrados en negrita. Las
posiciones de los cebadores usados para la PCR están mostrados en
negrita/subrayado. Los sitios de restricción NheI (en las
posiciones 1154 y 2592) usados para la PCR inversa están
subrayados. Los cebadores usados y sus posiciones exactas en la
secuencia de la inulosacarasa están mostrados en la tabla 1.
Empezando por el aminoácido 690, las 20 repeticiones de PXX están
subrayadas. En el aminoácido 755 el motivo LPXTG está subrayado.
Figura 2: Dendrograma de fructosiltransferasas
bacterianas y vegetales. Las distancias horizontales son una medida
para la diferencia al nivel de una secuencia de aminoácidos. Una
diferencia del 10% está indicada por la barra superior. Los valores
bootstrap (en porcentajes) son dados en la raíz de cada árbol. Las
fructosiltransferasas de bacterias Gram positivas se indican en la
mitad inferior de la figura (B. staerothermophilus SurB;
B. amyloliquefaciens SacB; B. subtilis SacB; S.
mutans SacB; L. reuteri FtfA (inulosacarasa); S.
salivarius Ftf). Las fructosiltransferasas vegetales se indican
en la parte media de la figura (Cynara scolymus
Ss-1ft; Allium cepa F-6gft;
Hordeum vulgare Sf-6ft). Las
fructosiltransferasas de bacterias Gram negativas están mostradas en
la parte superior de la figura (Z. mobilis LevU; Z.
mobilis SucE2; Z. mobilis SacB; E. amylovora Lcs;
A. diazotrophicus LsdA).
Figura 3: La secuencia
N-terminal y tres secuencias de aminoácidos internas
de la nueva levansacarasa de Lactobacillus reuteri.
Figura 4: Partes de un alineamiento de las
secuencias de aminoácidos deducidas de algunos genes de la
fructosiltransferasa bacteriana. Las secuencias en negrita indican
las secuencias de consenso usadas para construir los cebadores
degenerados 5ftf, 6ftfi y 12 ftfi. (*) indica una posición con un
residuo de aminoácido completamente conservado. (:) indica una
posición con un grupo "fuerte" completamente conservado: STA,
NEQK, NHQK, NDEQ, QHRK, MILV, MILF, HY, FYW. (.) indica una posición
con un grupo "más debil" completamente conservado: CSA, AN,
SAG, STNK, STPA, SGND, SNDEQK, NDEQHK, NEQHRK, FVLIM, HFY. Según la
matriz de peso del residuo Pam250 unos grupos están descritos por
Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:
403-410.
Figura 5: La estrategia usada para el
aislamiento del gen de la inulosacarasa del ADN cromosómico de
Lactobacillus reuteri 121.
\vskip1.000000\baselineskip
\bullet VAN
GEEL-SCHUTTEN, G.H. et al. Appl.
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<110> TNO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Nuevas fructosiltransferasas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Nuevas fructosiltransferasas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 00201872.9
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-05-25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 01200049.3
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2001-01-09
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 789
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus reuteri
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ACT_SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (263)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Residuo de aminoácido putativo
catalítico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ACT_SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (330)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Residuo de aminoácido putativo
catalítico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ACT_SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (415)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Residuo de aminoácido putativo
catalítico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ACT_SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (431)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Residuo de aminoácido putativo
catalítico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ACT_SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (511)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Residuo de aminoácido putativo
catalítico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ACT_SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (514)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Residuo de aminoácido putativo
catalítico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ACT_SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (532)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Residuo de aminoácido putativo
catalítico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ACT_SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (551)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Residuo de aminoácido putativo
catalítico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SEÑAL
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia señal putativa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DOMINIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (755)..(759)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Aminoácido señal anclado a la pared
celular putativa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> REPETICIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (690) .. (749)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> repetición PXX (20 veces)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2367
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus reuteri
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2394
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus reuteri
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2592
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus reuteri
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> RBS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (29)..(32)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> RBS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (54)..(57)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_señal
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(67)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región reguladora de la expresión
putativa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_señal
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2438)..(2592)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región reguladora de la expresión
putativa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus reuteri
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus reuteri
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus reuteri
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus reuteri
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus reuteri
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4634
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus reuteri
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1220)..(3598)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> RBS
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<222> (1205)..(1210)
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<400> 10
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<210> 11
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<211> 792
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<212> PRT
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<213> Lactobacillus reuteri
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<400> 11
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de Secuencia
Artificial:cebador
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<223> Descripción de Secuencia
Artificial:cebador
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Artificial:cebador
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cebador
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Artificial:cebador
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<223> Descripción de Secuencia
Artificial:cebador
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<213> secuencia artificial
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Artificial:cebador
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Artificial:cebador
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<212> ADN
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Artificial:cebador
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<211> 24
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Artificial:cebador
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<211> 21
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<223> Descripción de Secuencia
Artificial:cebador
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<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm41
Claims (11)
1. Proteína con una actividad
fructosiltransferasa, la secuencia de aminoácidos de la proteína
presentando al menos un 75% de identidad de los aminoácidos, según
ha sido determinado por el algoritmo de BLAST, con la secuencia de
aminoácidos de la SEC ID No. 1.
2. Proteína según la reivindicación 1, que
presenta al menos un 85% de identidad de los aminoácidos con la
secuencia de aminoácidos de la SEC ID No. 1.
3. Proteína según la reivindicación 1 o 2,
teniendo al menos 15 aminoácidos contiguos que son idénticos a 15
aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID
No. 1.
4. Proteína según cualquiera de las
reivindicaciones 1-3, que, en presencia de
sacarosa, produce una inulina con unidades de
D-fructosilo ligadas en
\beta(2-1).
5. Proteína según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes que es una proteína recombinante.
6. Secuencia de nucleótidos que codifica una
proteína según cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
7. Constructo de ácidos nucleicos que comprende
la secuencia de nucleótidos según la reivindicación 6, ligada de
forma operacional a una secuencia de ácidos nucleicos reguladora de
la expresión.
8. Célula huésped recombinante que contiene una
o más copias del constructo de ácidos nucleicos según la
reivindicación 7.
9. Proceso de producción de una
fructosiltransferasa, que comprende el cultivo de una célula
huésped según la reivindicación 8 en un medio de cultivo, y la
recuperación de la proteína del medio de cultivo o del extracto
libre de células.
10. Proceso de producción de un oligosacárido o
polisacárido conteniendo unidades de fructosilo, comprendiendo el
sometimiento de una fuente de fructosa a la actividad de una
proteína según cualquiera de las reivindicaciones
1-5, o una célula huésped según la reivindicación
8.
11. Uso de una cepa de Lactobacillus que
contiene una proteína según cualquiera de las reivindicaciones
1-5 y capaz de producir una inulina, levano o
fructooligosacáridos, como un probiótico o simbiótico.
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