ES2364370T3

ES2364370T3 - Galactosidasa con actividad alfa-galactosiltransferasa.

Info

Publication number: ES2364370T3
Application number: ES07704957T
Authority: ES
Inventors: Georgios Tzortzis; Athanasios K. Goulas; Theodoros Goulas
Original assignee: Clasado Inc
Current assignee: Clasado Inc
Priority date: 2006-01-31
Filing date: 2007-01-23
Publication date: 2011-09-01
Anticipated expiration: 2027-01-23
Also published as: PL1979473T3; US20090110770A1; KR101342472B1; JP4960974B2; GB2447006B; GB2447006A; IL192892A0; ATE507287T1; RU2441913C2; WO2007088324A1; AU2007211356B2; AU2007211356A1; IL192892A; CA2637219A1; EP1979473B1; UA95944C2; KR20080098598A; NO20082780L; EP1979473A1; GB0812896D0

Abstract

Secuencia de ADN que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos como la ofrecida en la SEQ ID n.º 2.

Description

PRODUCTO Y PROCEDIMIENTO

La invención se refiere a una β-galactosidasa con actividad transgalactosilante capaz de convertir la lactosa en una mezcla de oligosacáridos con uniones β y que produce inesperadamente el disacárido α1-6 galactobiosa con una unión α. En particular, se refiere a una β-galactosidasa aislada de una cepa recientemente descubierta de Bifidobacterium bifidum.

La invención se refiere en particular a secuencias de ADN que codifican la enzima β-galactosidasa aislada, a la enzima codificada por tal secuencia de ADN y a una célula hospedadora que comprende la secuencia de ADN o un vector recombinante que incorpora la secuencia de ADN. La invención también se refiere al uso de la enzima codificada por una secuencia de ADN, o de la célula hospedadora que contiene una secuencia de ADN o un vector recombinante, para producir oligosacáridos.

La bifidobacterias colonizan de forma natural el tramo intestinal inferior, un medio que tiene pocos mono- y disacáridos, ya que los azúcares los consumen preferentemente el hospedador y los microbios presentes en el tramo intestinal superior. Para sobrevivir en el tramo intestinal inferior, las bifidobacterias producen varias clases de exo-y endoglucosidasas en formas unidas a la superficie y/o extracelulares, mediante las cuales pueden utilizar diversos glúcidos.

Además de la actividad hidrolasa, algunas enzimas de las bifidobacterias muestran actividad transferásica. Esta actividad transglucosilante de las glucosidasas se utiliza mucho para la síntesis enzimática de diferentes oligosacáridos, que se ha demostrado que actúan como factores que favorecen el crecimiento de las bifidobacterias.

Se sabe que algunos miembros de las bifidobacterias producen enzimas β-galactosidásicas que intervienen en el metabolismo bacteriano de la lactosa. Møller, P. L. et al. en Appl & Envinron. Microbial. (2001), 62 (5), 2276-2283 describen el aislamiento y la caracterización de tres genes de β-galactosidasa de una cepa de Bifidobacterium bifidum. Encontraron que las tres β-galactosidasas eran capaces de catalizar la formación de galactooligosacáridos con uniones β mediante transgalactosilación.

Dumortier et al. en Carbohydrate Research 201, (1990), 115-123 describieron la formación de oligosacáridos con uniones β mediante una reacción de transgalactosilación durante la hidrólisis de la lactosa con Bifidobacterium bifidum DSM 20456. Su análisis de la estructura de la mezcla de oligosacáridos producidos demostró que los enlaces eran β(1→3), β-(1→6) y β-(1→4) entre D-galactosilos. Dumortier sugirió que los compuestos producidos por el Bifidobacterium bifidum intervienen en la adhesión de las bacterias al intestino grueso.

Se ha encontrado que una cepa de Bifidobacterium bifidum es capaz de producir una actividad enzimática galactosidasa que convierte la lactosa en una nueva mezcla de galactooligosacáridos que contiene inesperadamente hasta el 35% de los disacáridos de tipo galactobiosa (Gal (α 1-6) Gal). Se sabe que un disacárido similar, galabiosa (Gal (α 1-4) Gal) (véase Paton, J. C. y Paton A, W (1998) Clin. Microbiol. Revs, 11, 450-479; Carlsson, K. A. (1989) Ann. Reviews Biochem. 58, 309-350), es un antiadherente capaz de impedir la adhesión de toxinas, por ejemplo la toxina Shiga, y patógenos, tales como E. coli, a la pared del intestino.

Esta cepa de B. bifidum se depositó con el número de acceso NCIMB 41171 en la National Collection of Industrial & Marine Bacteria, Aberdeen, Reino Unido, el 31 de marzo de 2003. También se describe en la patente del Reino Unido n.º 2 412 380.

Ahora se ha encontrado que esta cepa de B. bifidum produce varias β-galactosidasas, una de las cuales muestra inesperadamente actividad α-galactosiltransferasa. Esta enzima produce una serie de oligosacáridos diferentes con uniones β, pero también produce la galabiosa, un disacárido con unión α.

De acuerdo con la invención, se da a conocer una secuencia de ADN que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos como la ofrecida en la SEQ ID n.º 2. La secuencia de ADN se ofrece en la SEQ ID n.º 1.

De acuerdo con un segundo aspecto de la invención, se da a conocer una enzima codificada por una secuencia de ADN como la definida anteriormente. Tal enzima puede comprender la secuencia de aminoácidos ofrecida en la SEQ ID n.º 2.

De acuerdo con un tercer aspecto de la invención, se da a conocer un vector recombinante, preferentemente un vector de expresión, que comprende una secuencia de ADN como la definida anteriormente. Tal vector se puede incorporar en una célula hospedadora, tal como una célula bacteriana, de levadura u de hongo. Alternativamente, la secuencia de ADN se puede incorporar en tal célula hospedadora. Se puede seleccionar una célula hospedadora adecuada entre Bifidobacterium, Lactococcus, Lactobacillus, Bacillus, por ejemplo Bacillus subtilis o Bacillus circulans, Escherichia y Aspergillus, por ejemplo Aspergillus niger.

Utilizando la lactosa como sustrato, la enzima codificada por una secuencia de ADN como la definida anteriormente produce una mezcla de disacáridos que comprende Gal (β 1-3) Glc, Gal (β 1-3) Gal, Gal (β 1-6) Gal y Gal (α 1-6) Gal. También se encuentran presentes en la mezcla de oligosacáridos los trisacáridos Gal (β 1-6) Gal (β 1-4) Glc, Gal (β 1-3) Gal (β 1-4) Glc, el tetrasacárido Gal (β 1-6) Gal (β 1-6) Gal (β 1-4) Glc y el pentasacárido Gal (β 1-6) Gal (β 1-6) Gal (β 1-6) Gal (β 1-4) Glc.

La enzima o la célula hospedadora que se han definido anteriormente se pueden utilizar para producir una mezcla de disacáridos, que incluyen Gal (α 1-6) Gal (galabiosa) que puede formar parte de un producto que mejora la salud del intestino. Tal producto se puede seleccionar entre el grupo que consiste en productos lácteos (por ejemplo, leche líquida, leche en polvo seco tal como leche en polvo entera, leche en polvo desnatada, leche en polvo reconstituida, suero en polvo, leches infantiles, fórmulas para bebés, helado, yogur, queso, productos lácteos fermentados), bebidas tales como zumo de frutas, alimentos infantiles, cereales, pan, galletas, golosinas, pasteles, complementos alimenticios, complementos dietéticos, productos comestibles simbióticos, productos comestibles prebióticos, alimentos para animales, alimentos para aves de corral o de hecho cualquier otra comida o bebida.

Alternativamente, los oligosacáridos así producidos se pueden utilizar para preparar un medicamento, por ejemplo en forma de comprimido o cápsula, para impedir la adhesión de los patógenos o de las toxinas producidas por los patógenos a la pared de intestino. El medicamento se puede administrar a un paciente, por ejemplo, después de un ciclo de tratamiento con antibióticos que a menudo altera o incluso destruye la flora normal del intestino sano.

De acuerdo con aún otro aspecto de la invención, se da a conocer un procedimiento para producir una enzima como la definida anteriormente que comprende cultivar una célula hospedadora como la definida anteriormente en un medio de cultivo adecuado en unas condiciones que permiten la expresión de la enzima y recuperar la enzima resultante del cultivo.

La invención también se dirige a un procedimiento para producir una mezcla de oligosacáridos, entre ellos el disacárido Gal (α 1-6) Gal (galabiosa), que comprende poner en contacto la enzima como la definida anteriormente o una célula hospedadora como las definidas anteriormente con un material que contiene lactosa en condiciones que conducen a la formación de la mezcla del oligosacárido.

El material adecuado que contiene la lactosa se puede seleccionar entre lactosa disponible comercialmente, leche entera, leche semidesnatada, leche desnatada, suero de leche, leche reconstituida, impregnado de suero. Tales productos lácteos se pueden obtener de vacas, búfalos, ovejas o cabras. La leche reconstituida se define como leche entera que se ha desnatado para retirar la grasa láctea, que se reemplaza posteriormente con la adición de grasa o aceite vegetal.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra la secuencia nucleotídica (SEQ ID n.º 1) de la β-galactosidasa de Bifidobacterium bifidum de la invención; y

La figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID n.º 2) que corresponde a la secuencia nucleotídica de la figura 1.

La figura 3 es un gráfico que muestra la reacción con el transcurso del tiempo durante la síntesis de galactooligosacáridos con la β-galactosidasa y lactosa al 40% (p/p) en tampón de fosfato a 0,1 M a pH 6,0 como sustrato; y

La figura 4 muestra una cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución de la mezcla de galactooligosacáridos sintetizada por la β-galactosidasa de B. bifidum NCIMB 41171 utilizando lactosa al 40% (p/p) en tampón de fosfato a 0,1 M a pH 6,0 como sustrato (Glc = glucosa, Gal = galactosa, Lac = lactosa, α (1-6) = galactobiosa, GP = grado de polimerización).

Se aisló el ADN genómico de la cepa de Bifidobacterium bifidum (NCIMB 41171) con el método de Lawson et al. (1989) FEMS Microbiol. Letters, 65, (1-2), 41-45. El ADN se digirió con enzimas de restricción y los fragmentos que tenían un tamaño máximo de 15 kpb se ligaron con el vector pSP72 que se había digerido con las mismas enzimas de restricción. Las células de E. coli se transformaron con un vector que contenía inserciones que consistían en ADN cromosómico de

B. bifidum digerido con PstI, EcoRI, BamHI, KpnI, SmaI o HindIII. Los clones con actividad β-galactosidasa se seleccionaron en placas de agar Luria Bertani que contenían p-nitrofenilo. X-β-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-Dgalactósido) e isopropil-β-D-tiogalactósido (IPTG). Las mezclas de ligación con ADN cromosómico digerido con BamHI dieron lugar a siete clones positivos de β-galactosidasa, uno de los cuales se identificó como pB1.

El ADN del fragmento B1 insertado se secuenció mediante el método de Sanger de terminación de la cadena con didesoxinucleótidos (Russel P., 2002 iGenetics, Pearson Education, Inc., San Francisco, 187-189) con el kit de secuenciación en ciclos BigDye Terminator V 3.0 (Applied Biosystems, EE.UU.). La secuencia del ADN de B1 se muestra en la figura 1 (SEQ ID n.º 1).

El marco abierto de lectura (ORF por las siglas en inglés) se localizó con el buscador de ORF del NCBI (National Center of Biochnology Information). La secuencia nucleotídica de la figura 1 se tradujo en los seis marcos de lectura posibles y se identificó un marco abierto de lectura de 1052 aminoácidos que codificaba una posible β-galactosidasa. La traducción se muestra en la figura 2 (SEQ ID n.º 2).

La presente invención se describirá adicionalmente mediante la referencia al siguiente ejemplo.

Ejemplo 1

Material y métodos

Todas las sustancias químicas y preparaciones de medios utilizados durante este estudio se obtuvieron de Sigma (Dorset, GRB), Invitrogen (Paisley, GRB), Oxoid (Basingstoke, GRB), Qiagen (West Sussex, GRB) y Promega (Southampton, GRB).

Cepas bacterianas

La cepa de Bifidobacterium bifidum (NCIMB 41171) se mantuvo sobre perlas criógenas en tubos de Microbank a –70ºC. Para los últimos experimentos, se revivió la cepa en agar de Wilkinson Chalgren (WC) (Oxoid, GRB) y medio TPY (medio con extracto de levadura, fitona y tripticasa) y se hizo crecer en anaerobiosis (composición de CO2 y N2 del 80% y del 20%, respectivamente) a 37ºC durante 48 horas. Se analizó la forma de las colonias y la ausencia de contaminación mediante la tinción de Gram.

Cepas de E. coli

La cepa de Escherichia coli DH5a utilizada en este estudio se incubó habitualmente en condiciones aerobias a 37ºC en agar o medio líquido de Luria Bertani (LB) (Sambrook J. y Russell W. D. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York) y cuando fue necesario se complementó con antibióticos (ampicilina a 100 μg/ml y/o cloranfenicol a 15 μg/ml) y 40 μl de X-β-Gal al 2% y 7 μl de IPTG (isopropil-β-Dtiogalactósido) al 20%, que se aplicaron en la superficie de una placa de agar de 90 mm preparada previamente.

La cepa DH5a de E. coli (Invitrogen, Paisley, GRB) (genotipo: F– φ80lacZΔM Δ(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (rk-, mk-) phoA supE44 thi-1 gyrA96 relA1λ-) es una cepa positiva para la α-galactosidasa y se utilizó en los experimentos de expresión y para otras manipulaciones genéticas.

Extracción del ADN genómico de Bifidobacterium bifidum

Se aisló ADN genómico de la cepa de Bifidobacterium bifidum (NCIMB 41171) utilizando el método que sigue, en el cual se preparó el ADN cromosómico a partir del sedimento de células recogido de 100 ml de medio anaerobio WC. Se resuspendieron las células en 10 ml de tampón TES (Tris-HCl a 10 mM, EDTA a 10 mM, NaCl a 10 mM, pH 8) y se trataron con 200 µl de una mezcla de lisozima y mutanolisina (4:1, lisozima a 10 mg/ml, mutanolisina a 1 mg/ml) durante 30 minutos a 37ºC. A continuación se trataron las células con 200 µl de proteinasa K (a 20 mg/ml) y 200 µl de RNasa (ambas a 10 mg/ml), se mezcló y se incubó durante una hora a 65ºC. Finalmente, se trataron las células con 2 ml de SDS al 10% y se incubaron durante 15 minutos a 65ºC. Se añadieron 12 ml de fenol/cloroformo y se repitió la extracción hasta que la fase acuosa se pudo separar con facilidad de la interfase. Se precipitó el ADN genómico con isopropanol y se resuspendió en Tris-HCl a 10 mM y EDTA a 1 mM (pH 8). El ADN genómico se digirió entonces con enzimas de restricción y se ligó con el pSP72 que estaba digerido con las mismas enzimas y tratado con fosfatasa alcalina. La digestión del ADN genómico de B. bifidum se realizó con EcoRI, PstI, BamHI, SmaI y KpnI. Se utilizaron mezclas de ligación para transformar la cepa DH5a de E. coli y se identificaron los clones positivos para la β-galactosidasa como colonias azules en las placas que contenían X-Gal.

Preparación del ADN del vector

El vector utilizado para la clonación y la expresión durante este estudio fue pSP72 (Promega, GRB) (Krieg, P. A. y Melton, D. A. (1987). «In vitro RNA synthesis with SP6 RNA polymerase». Methods in Enzymology, 155: 397-415).

Se eligió este vector debido a que no es capaz de complementar por carecer del fragmento α de la β-galactosidasa que no está codificado en pSP72. Este vector no lleva el segmento corto de ADN de E. coli que contiene la secuencia reguladora y la información codificante de los primeros 146 aminoácidos de la β-galactosidasa, que en combinación con las cepas de E. coli (a saber, DH5a) que expresan la porción del extremo carboxilo de esta β-galactosidasa, da una βgalactosidasa activa (complementación α).

El vector se digirió con las enzimas de restricción siguientes: PstI, BamHI, HindIII, SmaI, KpnI y EcoRI de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando un exceso de diez veces de la enzima sobre el ADN (unidades enzimáticas: microgramos de ADN iguales a diez unidades de enzima por 1 μg de ADN plasmídico o diez unidades enzimáticas por 0,5 pmol de ADN plasmídico). Después de la inactivación térmica de la enzima (20 min a 65ºC), se analizaron los patrones de restricción mediante un análisis de electroforesis en gel horizontal. La presencia de un solo fragmento en el gel indicó que la digestión del vector era completa y que había un único sitio de restricción en él.

También se analizó que la digestión del vector era suficiente mediante la transformación de las moléculas sin ligar en células competentes DH5a de E. coli. El número de colonias formadas en las placas de agar LB complementadas con ampicilina (100 μg/ml) fue un indicador de las moléculas sin digerir y del ruido de fondo esperado durante los posteriores experimentos.

Los vectores se desfosforilaron posteriormente con fosfatasa alcalina de intestino de ternera (CIAP, por su nombre en

5 inglés) (Promega, Southampton, GRB) según las instrucciones del fabricante. Se comprobó la eficacia del tratamiento mediante autoligación (con la ADN ligasa del bacteriófago T4 según las instrucciones del fabricante) y la posterior transformación en células DH5a. El número de colonias formadas mostró el número de moléculas recircularizadas (vector sin clonar) y una resta de lo anterior con las colonias formadas sin el tratamiento del vector con CIAP mostró el número de vectores sin desfosforilar.

10 Construcción de la genoteca de ADN genómico

El ADN genómico se digirió parcialmente con seis enzimas de restricción que reconocen secuencias de hexanucleótidos que aparecen con frecuencia en del ADN procariota. EcoRI, BamHI, PstI , KpnI, SmaI y HindIII son endonucleasas de restricción de tipo II que reconocen específicamente las secuencias 5'G/AATTC3', 5'G/GATCC3', 5'CTGCA/G3', 5'GGTAC/C3' 5'CCC/GGG3' y 5'A/AGCTT3' respectivamente, y rompen la doble cadena dentro de estas secuencias, lo

15 que genera extremos 5'-protuberantes de cuatro nucleótidos, AATT, GATC y AGCT para EcoRI, BamHI y HindIII, respectivamente, y extremos 3'-protuberantes ACGT y GTAC para PstI y KpnI, respectivamente, y extremos romos para SmaI.

Todas estas enzimas eran activas y capaces de escindir el ADN sólo en presencia de iones divalentes de magnesio. Estos iones eran el único cofactor requerido.

20 Digestión del ADN mediante restricción

Todas las digestiones de restricción de las muestras de ADN genómico se incubaron durante 2 horas a 37ºC y finalmente se inactivaron por calor a 65ºC durante 20 minutos. A continuación, las reacciones se enfriaron a temperatura ambiente y se añadió la cantidad adecuada del tampón de carga, y después se mezcló con suavidad con un capilar de vidrio sellado. Las soluciones se cargaron entonces en los pocillos de un gel de agarosa al 0,8% (se le suministra una

25 potencia de 4 a 5 V/cm durante 14 a 16 horas) y se estimó el tamaño del ADN digerido comparándolo con el de estándar de ADN de 1 kpb (Promega, GRB) (Sambrook J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual [2002]).

Purificación de los fragmentos generados después de la digestión de restricción

La purificación de los fragmentos a partir de las mezclas de reacción en los geles de agarosa se realizó con el kit de extracción en gel QIAEX de Qiagen (West Sussex, GRB). Los protocolos se describen con detalle en el manual del

30 fabricante.

Ligación y transformación del ADN

Después de la purificación de los fragmentos de ADN con el kit de extracción en gel QIAEX, se ligaron con el vector pSP72 tratado con CIAP. Para la ligación, se transfirieron las cantidades adecuadas de ADN a tubos de microcentrífuga de 0,5 ml tal y como se muestra en la tabla 1.

Tubo: ADN

A: Vector (15 fmol ~ 29,7 ng)

B: Vector (15 fmol ~ 29,7 ng de ADN) más inserto (inserto: 15 fmol ~ 69,3 ng)

C: Control de pUC (0,056 fmol ~ 100 pg)

La proporción molar entre el vector de ADN plasmídico y el fragmento de ADN de inserto debe ser ~1:1 en la reacción de ligación. La concentración final de ADN debe ser ~10 ng/µl.

35 Tabla 1: Mezclas de ligación. El tubo A ilustra el número de moléculas de vector autoligado, que se debe sustraer del número total de transformantes después de la transformación. El tubo B muestra la ligación del vector con los fragmentos de ADN y el tubo C muestra el control con el que se calcula la eficiencia de la transformación.

Antes de cada ligación, se calentaron los fragmentos de ADN a 45ºC durante 5 minutos para separar cualquier extremo

40 cohesivo que se hubiera rehibridado durante la preparación del fragmento. Se eligió una proporción molar de ADN vector:inserto de 1:1 para todas las reacciones de ligación y se ensambló la reacción de acuerdo con las instrucciones de Promega.

A los tubos A y B se les añadieron 1,0 µl del tampón de ligación a 10x y 0,5 unidades Weiss de la ADN ligasa del fago T4 (Promega, GRB), y se ajustó el volumen de ligación a 10 µl con agua de calidad para biología molecular. A los tubos C se les añadió 1,0 µl del tampón de ligación a 10 x y se ajustó el volumen de ligación a 10 µl con agua de calidad para biología molecular.

Se añadieron los fragmentos de ADN a los tubos junto con el agua y luego se calentaron a 45ºC durante 5 minutos para separar cualquier extremo cohesivo que se hubiera rehibridado durante la preparación. Se enfrió el ADN a 0ºC antes de 5 que se le añadieran los restantes reactivos de ligación y se incubaron las mezclas de reacción durante una noche a 16ºC (Sambrook y Russell, 2001).

Después de la precipitación con etanol y la purificación de los fragmentos ligados (para retirar la mezcla de ligación que ocasiona la reducción de la eficiencia de transformación), se realizaron las transformaciones de acuerdo con las instrucciones de Hanahan. Se añadieron aproximadamente 50 ng de ADN ligado en 5 µl de disolución a 100 µl de

10 células competentes DH5a de E. coli. Después del choque térmico y la expresión del gen de resistencia a la ampicilina, se sembraron las células en la superficie de placas de LB con ampicilina (100 µg/ml), X-β-Gal (40 μl de X-β-Gal al 2%) e IPTG (7 μl de IPTG al 20%).

Se midió el número de transformantes de cada reacción de ligación. El número de transformantes que se solían obtener en el tubo C iba de 2 x 105 a 1 x 106 ufc/μg, mientras que del tubo A iba de 500 a 600 ufc/μg. El número de

15 transformantes del tubo A era una indicación del tratamiento eficaz del ADN del vector. El número de transformantes del tubo B se encontraba en el intervalo de 2-4 x 104 ufc/µg.

Número de transformantes

Las mezclas de ligación con ADN cromosómico digerido con PstI dieron lugar a 13 clones positivos de β-galactosidasa entre ~2500 transformantes cribados, mientras que con BamHI dieron lugar a 7 clones positivos (~1500 transformantes

20 cribados), EcoRI dio lugar a 3 clones positivos (~1300 transformantes cribados), KpnI dio lugar a 7 clones positivos (~2000 transformantes cribados), SmaI dio lugar a 3 clones positivos (~1600 transformantes cribados) y HindIII dio lugar a 2 clones positivos (~1200 transformantes cribados).

Digestión de los clones positivos

Para identificar los diferentes genes de β-galactosidasa, los plásmidos aislados de los clones positivos se digirieron 25 según la tabla siguiente.

Muestras: Enzimas

1.ª digestión: pB1, pB2, pB3, pB4, pB5, pB6, pB7 BamHI

2.ª digestión: pP1, pP2, pP3, pP4, pP5, pP6, pP7, pP8, pP9, pP10, pP11 PstI

3.ª digestión: pP12, pP13, pP14 PstI

4.ª digestión: pE1, pE2, pE3 EcoRI

5.ª digestión: pP1, pP12, pB1, pP2, pE1, pE2, pE3... PstI y EcoRI

6.ª digestión: pS1, pS2, pS3 SmaI

7.ª digestión: pP1, pP12, pB1, pP2, pS1, pS2, pS3 PstI y SmaI

8.ª digestión: pK1, pK2, pK3, pK4, pK5, pK6, pK7 KpnI

9.ª digestión: pP1, pP12, pB1, pP2, pK1, pK2, pK3, pK4, pK5, pK6, pK7 PstI y KpnI

La primera letra (p) indica el plásmido y el gen del inserto, mientras que la segunda letra (P, B, E, S, K) indica la enzima de restricción que se utilizó para aislar el clon correspondiente a partir del ADN genómico.

El análisis de electroforesis en gel de los fragmentos generados después de la digestión demostró que los plásmidos pB1, pP1, pP2 y pP11 tienen un inserto que codifica una β-galactosidasa diferente. Los clones que contienen pB1 se utilizaron para el análisis posterior.

30 Secuenciación del ADN

La secuenciación del ADN se realizó con el método de terminación de cadenas con didesoxinucleótidos de Sanger utilizando el kit de secuenciación por ciclación BigDye Terminator v.3.0 (Applied Biosystems, EE.UU.) y se analizó con el ABI Prism 3100, un sistema de análisis de ADN basado en la fluorescencia que incorpora una electroforesis capilar.

Los extremos 5' y 3' de los fragmentos de ADN insertados se secuenciaron con cebadores específicos del vector. Los

35 insertos se secuenciaron además utilizando el Genome Priming System (GPS-1) (New England Biolabs, GRB). El GPS1 es un sistema in vitro basado en el transposón Tn7 que utiliza una transposasa TnsABC para insertar el transposón aleatoriamente en el ADN diana. Se utilizó la proporción en masa de ADN donante:diana de 1:4 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El número de plásmidos aislados para la secuenciación después de la inserción del Transprimer en el plásmido diana fue 25. Se calculó este número según las instrucciones del fabricante y suponiendo una cobertura con una profundidad de 5 veces.

Para el plásmido pB1, la introducción de un inserto del transposón de ~1699 pb en la posición 973 pb cadena abajo del sitio de clonación múltiple del vector utilizado eliminó por completo la actividad de la β-galactosidasa, lo que indicaba 5 que el codón de inicio estaba colocado entre el MCS (sitio de clonación múltiple) del vector y el sitio del transposón, mientras que la introducción del inserto en la posición 841 pb cadena abajo del MCS condujo a la formación de una βgalactosidasa activa, lo que indicaba que el codón de inicio se encontraba entre 841 pb y el 973 pb cadena abajo del MCS. La actividad de la enzima se eliminó por completo con la introducción del inserto en la posición 3565 pb cadena abajo del MCS, lo que indicaba que el codón de parada estaba cadena abajo de esta posición. Además, las inserciones

10 en las posiciones 1239 pb, 1549 pb, 1683 pb, 1832 pb, 2108 pb, 2189 pb, 2270 pb, 2340 pb, 2414 pb, 2574 pb, 2648 pb, 2734 pb, 2807 pb y 3410 pb eliminaron por completo la actividad enzimática.

La mezcla de reacción de la secuenciación contenía aproximadamente de 400 a 600 ng de DNA plasmídico, 3,2 pmol de solución con cebador y 4 µl de la solución de BigDye Terminator.

Identificación del marco abierto de lectura

15 El marco abierto de lectura (ORF, por sus siglas en inglés) de B1 se localizó con el buscador de ORF del NCBI. Se utilizó el código genético bacteriano y se determinó que la longitud del marco era de 100 pb. Se tradujo la secuencia nucleotídica en los seis marcos posibles y se identificó un marco abierto de lectura de 1052 aminoácidos que codifica una posible β-galactosidasa (la traducción se muestra en la figura 2).

Ejemplo 2

20 Síntesis con la enzima β-galactosidasa clonada que se aisló de Bifidobacterium bifidum NCIMB 41171 en el hospedador

E. coli (cepa DH5a)

La siguiente síntesis descrita, a menos que se mencione otra cosa, se realizó con las células hospedadoras DH5a de E. coli enteras después del tratamiento de la biomasa de E. coli (recogida por centrifugación a 10 000 g) con tolueno a una concentración de 2000 ppm para aumentar la permeabilidad celular y también para convertir las células en inviables al 25 destruir su membrana citoplásmica. Se preparó la biomasa de E. coli como se describió en el ejemplo 1 en «Cepas de

E. coli».

Síntesis con la enzima clonada

Se realizó la síntesis con β-galactosidasa a una concentración de sustrato que era una concentración inicial de lactosa al 40% (p/p). Se preparó la solución de síntesis en tampón de fosfato a 0,1 M a pH 6,8 (o tampón de citrato a 0,1 M, pH

30 6,2, o tampón de fosfato de potasio, pH 6,8). Se realizó la síntesis a 40ºC en un baño de agua con agitación a 150 rpm. Se eligió el pH óptimo para la enzima específica según las mediciones de actividad (utilizando o-nitrofenil-β-Dgalactopiranósido como sustrato) de una preparación enzimática específica a diferentes valores de pH.

Para la síntesis del galactooligosacárido, se centrifugaron (a 10 000 g) 5 ml de una suspensión de células DH5a de E. coli (con una actividad de 2,2 U/ml) para recoger la biomasa y se descartó el sobrenadante. Se resuspendió esta

35 biomasa con 10 g de la solución de sustrato al 40% (p/p) para realizar la síntesis.

Las concentraciones de los diferentes azúcares presentes en la mezcla durante la síntesis se muestran en la figura 3. Los cromatogramas de HPAEC-PAD (cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución acoplada a la detección amperométrica pulsante) de las mezclas de galactooligosacáridos sintetizados por la β-galactosidasa clonada de B. bifidum NCIMB 41171 se muestran en la figura 4. La concentración de los azúcares de la mezcla de

40 galactooligosacáridos en el punto de tiempo óptimo de la síntesis se muestran en la tabla 1.

Tabla 1. Composición de glúcidos de la síntesis de galactooligosacáridos con una concentración inicial de lactosa al 40% (p/p) en el punto de tiempo donde se observó una concentración máxima de oligosacáridos.

Sustrato inicial para la síntesis: GP GOS ≥ 3 GP GOS = 2 Lac Glc Gal

% (p/p): Concentración (% de azúcares totales)

40: 20,45 27,64 12,73 25,90 13,28

Lac: lactosa, Glc: glucosa, Gal: galactosa, GP: grado de polimerización 5

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> LINDSAY, Clare L

<120> Producto y procedimiento

<130> 13906WO: GH

5: <150> GB 0601901.2

<151> 2006-01-31

<160> 2

<170> PatentIn, versión 3.4

<210> 1

10: <211> 7281

<212> ADN

<213> Bifidobacterium bifidum

<220>

<221> gen

15: <222> (1).. (7281)

<400> 1

imagen1

<210> 2

<211> 1052

<212> PRT 5 <213> Bifidobacterium bifidum

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1) .. (1052)

<400> 2

imagen1

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Secuencia de ADN que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos como la ofrecida en la SEQ ID n.º 2.
2.

Secuencia de ADN de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la secuencia se ofrece en la SEQ ID n.º 1.
3.

Enzima codificada por una secuencia de ADN según la reivindicación 1 o según la reivindicación 2.

5 4. Enzima que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID n.º 2.
5.

β-Galactosidasa que tiene la secuencia que se define en la SEQ ID n.º 2.
6.

Vector recombinante que comprende una secuencia de ADN según la reivindicación 1 o según la reivindicación 2.
7.

Vector de acuerdo con la reivindicación 6, en el que dicho vector es un vector de expresión.
8.

Célula hospedadora que comprende una secuencia de ADN según la reivindicación 1 o según la reivindicación 2.

10 9. Célula hospedadora que comprende el vector según la reivindicación 6 o según la reivindicación 7.
10.

Célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 8 o con la reivindicación 9, en la que dicha célula es una célula bacteriana, una célula de levadura o una célula de hongo.
11.

Célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 10, en la que dicha célula se selecciona del grupo que consiste en Bifidobacterium, Lactococcus, Lactobacillus, Escherichia, Bacillus y Aspergillus.

15 12. Célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 11, en la que la célula se selecciona del grupo que consiste en Bifidobacterium bifidum, Bacillus subtilis, Bacillus circularis y Aspergillus niger.
13. Utilización de una enzima según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, o de una célula según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, para producir una mezcla de oligosacáridos.
14. Utilización de acuerdo con la reivindicación 13, en la que la mezcla comprende los disacáridos Gal (β 1-3) Glc, Gal 20 (β 1-3) Gal, Gal (β 1-6) Gal y Gal (α 1-6) Gal.
15.

Utilización de acuerdo con la reivindicación 13 o con la reivindicación 14, en la que la mezcla comprende trisacáridos Gal (β 1-6) Gal (β 1-4) Glc, Gal (β 1-3) Gal (β 1-4) Glc, tetrasacárido Gal (β 1-6) Gal (β 1-6) Gal (β 1-4) Glc, y pentasacárido Gal (β 1-6) Gal (β 1-6) Gal (β 1-6) Gal (β 1-4) Glc.
16.

Utilización de una enzima según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, o de una célula según una cualquiera

25 de las reinvindicaciones 8 a 12, para producir una mezcla de oligosacáridos que son parte de un producto seleccionado entre el grupo que consiste en productos lácteos, tales como leche líquida, leche en polvo seco, leches infantiles, fórmulas para bebés, helado, yogur, queso, productos lácteos fermentados, bebidas tales como zumo de fruta, comidas infantiles, cereales, pan, galletas, golosinas, pasteles, complementos alimenticios, complementos dietéticos, productos comestibles probióticos, productos comestibles prebióticos, comidas para animales, comidas para aves de corral y

30 medicamentos.
17.

Utilización de acuerdo con la reivindicación 16, en la que la mezcla comprende disacáridos Gal (β 1-3) Glc, Gal (β 13) Gal, Gal (β 1-6) Gal y Gal (α 1-6) Gal, trisacáridos Gal (β 1-6) Gal (β 1-4) Glc, Gal (β 1-3) Gal (β 1-4) Glc, tetrasacárido Gal (β 1-6) Gal (β 1-6) Gal (β 1-4) Glc y pentasacárido Gal (β 1-6) Gal (β 1-6) Gal (β 1-6) Gal (β 1-4) Glc.
18.

Utilización de una célula hospedadora según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, para producir un

35 producto seleccionado entre el grupo que consiste en productos lácteos, tales como leche líquida, leche en polvo seco, leches infantiles, fórmulas para bebés, helado, yogur, queso, productos lácteos fermentados, bebidas tales como zumo de fruta, comidas infantiles, cereales, pan, galletas, golosinas, pasteles, complementos alimenticios, complementos dietéticos, productos comestibles probióticos, productos comestibles prebióticos, comidas para animales, comidas para aves de corral y medicamentos.

40 19. Procedimiento para producir una enzima según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, que comprende el cultivo de una célula hospedadora según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14 en un medio de cultivo adecuado en condiciones que permiten la expresión de dicha enzima y la recuperación de la enzima resultante a partir del cultivo.
20. Procedimiento para producir una mezcla de oligosacáridos que comprende disacáridos Gal (β 1-3) Glc, Gal (β 1-3)

45 Gal, Gal (β 1-6) Gal y Gal (α 1-6) Gal, trisacáridos Gal (β 1-6) Gal (β 1-4) Glc, Gal (β 1-3) Gal (β 1-4) Glc, tetrasacárido Gal (β 1-6) Gal (β 1-6) Gal (β 1-4) Glc y pentasacárido Gal (β 1-6) Gal (β 1-6) Gal (β 1-6) Gal (β 1-4) Glc, comprendiendo dicho procedimiento poner en contacto una enzima según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 o una célula hospedadora según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12 con un material que contiene lactosa.