ES2307769T3 - Procedimientos y compuestos para la diagnosis de enfermedades inflamatorias e identificacion de agentes farmacologicos de utilidad en el tratamiento de enfermedades inflamatorias. - Google Patents
Procedimientos y compuestos para la diagnosis de enfermedades inflamatorias e identificacion de agentes farmacologicos de utilidad en el tratamiento de enfermedades inflamatorias. Download PDFInfo
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Abstract
Un procedimiento para diagnosticar un estado de enfermedad inflamatoria, en el que se utiliza una muestra de tejido obtenida de un paciente, comprendiendo, dicho procedimiento, las etapas de: (a) medir un parámetro indicativo del nivel de Pim-2, ó Pim-2-mRNA, en la muestra de tejido del paciente; (b) determinar cualquier diferencia en la medición del citado parámetro, en la muestra de tejido, al compararse con la medición del citado parámetro en (una) muestra(s) de tejido comparable(s), obtenida(s) de uno o más pacientes que no tienen el citado estado inflamatorio.
Description
Procedimientos y compuestos para la diagnosis de
enfermedades inflamatorias e identificación de agentes
farmacológicos de utilidad en el tratamiento de enfermedades
inflamatorias.
El sector de la presente invención, se refiere
al área de biología molecular. De una forma particular, la presente
invención, se refiere a secuencias nucleótidas que codifican el
Pim-2 humano
(h-Pim-2) y el correspondiente
h-Pim-2-polipéptido
traducido, a vectores recombinantes que comprenden la secuencia de
ácidos nucleicos de h-Pim-2, y a
procedimientos para la producción de recombinantes de
h-Pim-2-polipétidos,
así como el uso de los mismos, en el diagnóstico de estados de
enfermedades inflamatorias y en los ensayos de rastreo para la
identificación de composiciones que pueden ser de utilidad en el
tratamiento de estados de enfermedades inflamatorias, de una forma
particular, enfermedades inflamatorias del intestino, tales como
colitis ulcerativa y la enfermedad de Crohn.
El Pim-2, es una
serina/treonina-quinasa, altamente conservada,
involucrada en la proliferación de células, meiosis, y la
prevención de apoptosis (Baytel et al., Biochim. Biophys.
Acta Gene Struct. Expr. 1442 : 274 (1998). El Pim-2
de los ratones, también conocida como Tic-1, según
se ha reportado, es aproximadamente un 53% idéntica en secuencia,
en el nivel de aminoácidos, al proto-oncogen
Pim-1, y ha expresado a unos reducidos niveles en
una variedad de tejidos, con la expresión más alta en el cerebro y
el timo (van der Lugt et al., EMBO J. 14 (11): 2536 (1995).
De la misma forma que el Pim-1, el locus de la
Pim-2, es también un sitio común de integración de
provirus (Haupt et al., Cell 65: 753 (1991): Bruer et
al., Embo. J. 8: 742 (1989). De hecho, el
Pim-2, se identificó en primer lugar, por mediación
de experimentos provirales de identificación, realizados en
ratones, y análisis de DNA, obtenidos a partir de tumores
sobrecrecidos, obtenidos después del transplante de linfomas
inducidos mediante la inoculación de ratones BABL/c ó C57BL10,
recién nacidos, en los cuales, el gen Pim-21, fue
objeto de una amplia deleción, mediante objetivación genética como
diana, con MuLV de Moloney. (Breuer et al., Embo J. 8 (39):
743 (1989). Tales estudios, sugieren el hecho de que, el
Pim-2, es un sitio de integración proviral, el cual
porta provirus somáticamente adquiridos, en la mayoría de tumores
transplantados (id.).
Se cree que, el proto-oncogen de
Pim-1, es uno de los colaboradores más potentes de
proto-oncogenes myc, en la inducción de
linfomagénesis, en ratones (van der Lugo et al, EMBO J.
14(11): 2536 (1995). Allen et al. (Oncogene 15, 1133
(1997), sugieren, basándose en experimentos de identificación
proviral, el hecho de que, el Pim-2, es similar, en
su comportamiento oncogénico, al Pim-1. Éstos toman
debida nota en cuanto al hecho de que, mientras que la expresión
basal de Pim-1 y Pim-2, difieren,
con respecto a la expresión basal en tejidos, ambos genes se
encuentran altamente expresados en respuesta a las mismas citocinas.
Se vio que, un transgen de Pim-2, en células
linfoides, predisponía a los linfomas de células T, como aquéllas
promocionadas mediante transgenes de Pim-1.
Tal y como se ha reportado anteriormente,
arriba, el Pim-2, como el gen relacionado del
Pim-2, codifica
serina/treonina-quinasas citoplásmica. La
fosforilación de substratos de proteínas mediante
serina/treonina-quinasas, se encuentra a menudo
involucrada en la transducción de señales procedentes de receptores
de superficies celulares, a afectores intracelulares. Se cree que,
el Pim-2 , como el Pim-1, es una
diana para un transductor de señal mediatizado por
gp-130 y señalizante de activador transcripcional 3
("STAT3"). Tal y como se conoce por parte de aquellas personas
expertas en el arte especializado de la técnica, la activación del
STAT3 mediante el receptor de citocinas gp130, es necesaria, tanto
para la transición del ciclo celular G1 al ciclo celular S, como
para la antiapoptosis (Shirogane et al., Immunity 11 : 709
(1999).
Baytel et al. (Biochim. Biophys. Acta
Gene Struct. Expr. 1442: 274 (1998), reportan sobre la clonación del
gen h-Pim-2. En comparación con el
Pim-2 de los ratones, el
h-Pim-2, según se reporta por parte
de Baytel et al., codifica un proteína que comparte el 90%
de identidad y un 93% de similitud en el primer nivel de
estructura. Al nivel del RNA, se han identificado dos transcriptores
de Pim-2, en humanos, un transcripto de 2,2 kb, el
cual se expresa altamente en tejidos hemaptopoyéticos en líneas
celulares lecémicas y de limpofomas, y un transcripto de 5,0 kb, el
cual se detecta en el bazo, el timo, el intestino delgado, y la
apoptosis del colon (Baytel el al., Biochim. Biophys. Acta Gene
Struct. Exp. 142: 274 (1998). Se cree que, el gen Pim 2, en humanos,
se X-ligado Ivan der Lug et al., EMBO N. 14
(11): 2536 (1995).
Los presentes inventores (Li et al., J.
Biol. Chem, 276: 18579 (2001), han dado a conocer recientemente el
hecho de que, el Pim-2, se induce, mediante
lipopolisacáridos (LPS), en una variedad de líneas celulares. Los
estudios realizados por parte de los inventores, sugieren el hecho
de que, la regulación " up" (regulación hacia arriba) del
Pim-2, en células 70Z3, mediante LPS, se controla
mediante la trayectoria del IKK/NF-\kappaB.
La actividad aberrante de serina/treonina en
proteínas, se ha visto implicada, o se sospecha que se encuentra
implicada en un gran número de patologías, incluyendo el shock
séptico, la pérdida ósea, la psoriasis, la artritis reumatoidea,
muchos cánceres, y otras enfermedades proliferativas (Véase, a dicho
efecto, la patente estadounidense U.S. nº 5.165.716, concedida a
Creasy et al. (Fecha de publicación, 20 de diciembre del
2000). Un gran número de investigadores, han invertido un tiempo
considerable para identificar las proteínas
serina/treonina-quinasas, las cuales pueden jugar
un rol interpretativo en la prevención, la mejora y la corrección de
disfunciones o enfermedades. Así, por ejemplo, la patente
estadounidense U.S. n1 5.972.606, concedida a Creasy et al.
(fecha de publicación, 26 de octubre de 1999), da a conocer una
proteína humana de serina/treonina-quinasa,
designada como HOACF72, de la familia hYAKI de polipéptidos,
anticuerpos contra los cuales se dice que son de utilidad en el
tratamiento de la pérdida ósea, enfermedades inflamatorias tales
como la artritis, la osteoartritis, el síndrome de la enfermedad
respiratoria en el adulto (ARDS), la enfermedad inflamatoria del
intestino (IBS), la psoriasis, la dermatitis, el asma, la alergias,
las infecciones, el shock séptico, los cánceres, la bulimia, y un
huésped de otras condiciones. Las patentes estadounidenses U.S
n^{os} 5.965.420 y 6.165.766, también concedidas a Creasy et
al. (fechas de publicación, 12 de octubre de 1999 y 26 de
diciembre del 2000, respectivamente), hacen valer los polipétidos y
polinucleótidos YAK3 humanos, anticuerpos contra los cuales se dice
que son de utilidad para tratar la pérdida ósea, la enfermedades
inflamatorias, las infecciones, los trastornos de
inmunodeficiencia, el shock séptico, el dolor, los cánceres, y un
huésped de otras condiciones. Tal y como se afirma por parte de
Creasy et al., existe una necesidad en cuanto al hecho de una
identificación y una caracterización adicionales de miembros
adicionales para la familia de proteínas
serina/treonina-quinasas, para identificar otros
miembros de la familia que pueden jugar un rol interpretativo en la
prevención, la mejora y la corrección de disfunciones o
enfermedades. Existe también una necesidad en cuanto al hecho de
identificar relaciones potenciales entre estas quinasas y estados de
enfermedad en sí mismos.
El arte de la técnica anterior, ha enfatizado el
rol interpretativo del Pim-2 en el comportamiento
oncogénico, y ha clasificado el gen un proto-gen.
Ha sido particularmente sorprendente, el hecho de que, los presentes
inventores, han encontrado que, el Pim-2, se
encuentra significativamente incrementado, en una gran variedad de
estados inflamatorios, viéndose unos incrementos particularmente
grandes en Pim-2-mRNA, con respecto
a los niveles de tejidos intestinales en pacientes diagnosticados
con colitis ulcerativa y enfermedad de Crohn y estados de
enfermedades inflamatorias, asociados con: un páncreas inflamado,
unas amígdalas inflamadas, un intestino inflamado, (incluyendo los
intestinos delgado y grueso y el recto), revestimiento del estómago
inflamado, tiroides inflamadas, cérvix inflamado, pulmón inflamado,
riñones inflamados, hígado inflamado y piel inflamada.
La presente invención, se refiere a secuencias
nucleótidas que codifican los Pim-2
(h-Pim-2) y polipéptidos de
h-Pim-2. Una forma de presentación
de la presente invención, se refiere a procedimientos para la
utilización de tales polinucleótidos y polipéptidos par el
tratamiento de enfermedades inflamatorias humanas, tales como la
colitis ulcerativa y la enfermedad de Crohn. Otra forma de
presentación de la presente invención, se refiere a procedimientos
para rastrear compuestos para la actividad
anti-inflamatoria potencial, mediante la
consideración del efecto de tales compuestos en la
Pim-2-actividad. Y todavía otra
forma de presentación de la presente invención, se refiere a
ensayos de diagnóstico para detectar enfermedades inflamatorias,
asociadas con la actividad Pim-2 alterada.
En una forma de presentación de la presente
invención, se da a conocer un procedimiento para diagnosticar
estados de enfermedad, tales como un estado inflamatorio del
intestino, utilizando una muestra de tejido obtenida de un
paciente, comprendiendo, dicho procedimiento, las etapas de : (a)
medir el nivel de Pim-2 ó
Pim-2-mRNA, en la muestra de tejido
del paciente, y (b) determinar cualquier diferencia del nivel de
Pim-2 ó Pim-2-mRNA,
en la muestra de tejido del paciente, como comparación al nivel de
Pim-2 ó Pim-2-mRNA,
en muestra(s) de tejido comparable(s), obtenidas de
uno o más pacientes que no tienen el estado de enfermedad
inflamatoria. Tal procedimiento, pueden comprender adicionalmente
la etapa de (c) diagnosticar al paciente, como teniendo el estado de
enfermedad inflamatoria, cuando la medición de tales parámetros,
con respecto al tejido del paciente, es significativamente superior
que en muestra(s) de tejido comparable(s), obtenidas
de uno o más pacientes que no tienen la estado de enfermedad
inflamatoria. Mediante "significativamente superior", se quiere
dar a entender una diferencia de más de un porcentaje de
aproximadamente un 50%, de una forma más preferible, una diferencia
mayor de un porcentaje de aproximadamente un 100%, y de una forma
todavía más preferible, una diferencia mayor de un porcentaje de
aproximadamente un 200%. El nivel de Pim-2 ó
Pim-2-mRNA, puede medirse
directamente, o indirectamente, como por ejemplo, midiendo la
actividad quinasa del Pim-2. Tal tipo de
procedimiento, puede comprender una hibridación in situ, de
por lo menos una sonda de ácidos nucleicos, que comprende una
secuencia polinucléotida de por lo menos aproximadamente 15
nucleótidos contiguos de la SEC ID NO: 1, incluyendo, de una forma
preferible, una sonda de ácidos nucleicos, los nucleótidos 294 a
311 de la SEQ ID NO: 1. Tal tipo de procedimiento, puede
utilizarse, de una forma particularmente ventajosa, para la
diagnosis de la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerativa, pero
puede también utilizarse para detectar estados de enfermedades
inflamatorias, asociadas con el páncreas inflamado, unas amígdalas
inflamadas, un intestino inflamado, (incluyendo los intestinos
delgado y grueso y el recto), revestimiento del estómago inflamado,
tiroides inflamadas, cérvix inflamado, pulmón inflamado, riñones
inflamados, hígado inflamado y piel inflamada.
En otra forma de presentación de la presente
invención, se proporciona un procedimiento para diagnosticar un
estado de enfermedad inflamatoria, tal como una enfermedad
inflamatoria del intestino, en un paciente, que comprende las
etapas de (a) establecer una correlación estadísticamente
significante, entre la expresión del Pim-2, y el
tejido inflamado del estado de enfermedad inflamatoria, y la
presencia y/o gravedad del estado de enfermedad inflamatoria; (b)
medir el nivel de Pim-2, en el correspondiente
tejido obtenido del citado paciente; y (c) determinar si el nivel
de Pim-2 medido, corresponde al nivel correlacionado
con el estado de enfermedad inflamatoria. Tal tipo de
procedimiento, puede también utilizarse, de una forma
particularmente ventajosa, para la diagnosis de la enfermedad de
Crohn y la colitis ulcerativa, pero puede también utilizarse para
detectar estados de enfermedades inflamatorias, asociadas con el
páncreas inflamado, unas amígdalas inflamadas, un intestino
inflamado, (incluyendo los intestinos delgado y grueso y el recto),
revestimiento del estómago inflamado, tiroides inflamadas, cérvix
inflamado, pulmón inflamado, riñones inflamados, hígado inflamado y
piel inflamada.
Se proporciona, también, un procedimiento para
controlar la eficacia de regímenes con fármacos antiinflamatorios,
en un estado de enfermedad inflamatoria, tal como una enfermedad
inflamatoria del intestino, comprendiendo, dicho procedimiento, las
etapas de (a) establecer una correlación estadísticamente
significante, entre los niveles de Pim-2, y la
respuesta clínica de la terapia antiinflamatoria en el estado de la
enfermedad inflamatoria; (b) medir el nivel de
Pim-2, en el paciente; y (c) determinar la
correspondencia entre el nivel de Pim-2 medido en
el paciente y los niveles de Pim-2 correlacionados a
la respuesta clínica a la terapia anti-inflamatoria.
Este procedimiento, puede emplearse, de una forma ventajosa, para
controlar la eficacia de regímenes con fármacos antiinflamatorios,
con respecto al tratamiento de la enfermedad de Crohn y la colitis
ulcerativa. Este procedimiento, puede también emplearse para medir
la para controlar la eficacia de regímenes con fármacos
antiinflamatorios, en estados de enfermedades asociados con el
páncreas inflamado, unas amígdalas inflamadas, un intestino
inflamado, (incluyendo los intestinos delgado y grueso y el recto),
revestimiento del estómago inflamado, tiroides inflamadas, cérvix
inflamado, pulmón inflamado, riñones inflamados, hígado inflamado y
piel inflamada.
Mediante la presente invención, se abarcan,
también, otros procedimientos para detectar estados de enfermedades
inflamatorias, teles como la enfermedad inflamatoria del intestino.
Así, por ejemplo, la presente invención, comprende adicionalmente
un procedimiento para detectar estados de enfermedades
inflamatorias, que comprende la etapas de: a) recolectar una
muestra sospechosa, y (b) someter la muestra sospechosa, a un test
de ensayo de diagnóstico, empleando la secuencia nucleótida de la
SEQ ID NO: 1, ó fragmentos de ésta, comprendiendo, el test de
ensayo de diagnóstico, una reacción en cadena de la polimerasa o una
hibridación de ácidos nucleicos ó (a) recolectar una muestra
sospechosa, y (b) someter la muestra a un test de ensayo de
diagnóstico, que comprende antisuero policlonal y/o anticuerpo
monoclonal, que dan lugar a inmunógenos que comprenden la secuencia
polinucleótida de la SEQ ID NO: 2, o un fragmento inmunogénico de
ésta, comprendiendo, el citado test de ensayo de diagnóstico, el
análisis de transferencia de Western o el inmunoensayo ligado a
enzimas (ELISA). Éste proporciona, asimismo, un procedimiento para
detectar estados de enfermedades antiinflamatorias, que comprende
las etapas de: (a) recolectar una muestra sospechosa, y someter la
muestra a un test de ensayo de diagnóstico, que comprende antisuero
policlonal y/o anticuerpo monoclonal, que dan lugar a inmunógenos
que comprenden la secuencia polinucleótida de la SEQ ID NO: 2, ó un
fragmento inmunogénico de ésta, (b) detectar el citado antisuero
policlonal y/o anticuerpo monoclonal.
Mediante la presente invención, se abarca,
también un equipo de diagnóstico, a modo de kit, el cual comprende,
por ejemplo: (a) un anticuerpo específico para la SEQ ID NO:2, ó una
porción de enlace a un antígeno de un anticuerpo específico para
SEQ ID NO:2; y (b) reactivos para detectar el citado
anti-cuerpo o porción específica para la SEQ ID
NO:2.
La presente invención, proporciona, también,
ensayos de rastreo, para determinar si un compuesto sería efectivo
en el tratamiento de un estado de enfermedad inflamatoria. Uno de
estos ensayos de rastreo, comprende las etapas de: (a) incubar el
compuesto con células la SEQ ID NO:2, o una variante de ésta, en la
exposición a LPS; (b) determinar la extensión de la inhibición
causada por el citado compuesto, en la expresión de la SEQ ID NO:2,
o variante de ésta, mediante la medición de un parámetro indicativo
del nivel de SEQ ID NO:2 (o variante de ésta), o
m-RNA traducido a la SEQ ID NO:2 (o variante de
ésta). Otro de tales tipos de ensayo de rastreo, comprende: (a)
incubar in vitro el compuesto, con una proteína que comprende
la SEQ ID NO:2, o variante de ésta, que tenga actividad quinasa, y
un substrato, con respecto a la citada actividad quinasa; (b)
determinar si el compuesto inhibe la actividad quinasa de la
proteína, con respecto al substrato. La proteína de este ensayo,
puede ser recombinante o de origen natural. Mediante la presente
invención, se abarcan, también, los compuestos identificados por
tales tipos de ensayos de rastreo.
Otro ensayo de rastreo, para identificar
compuestos que mejoren los estados de enfermedad inflamatoria,
comprende las etapas de: (a) cultivar separadamente una primera
línea de células inmortalizada, que contiene por lo menos un gen de
la SEQ ID NO:1, y una segunda línea de células inmortalizada, en
donde, el gen de la SEQ ID NO:, se inactiva; (b) someter ambas
líneas de células, a un compuesto sospechoso de tener actividad
antiinflamatoria; y (c) determinar si, el citado compuesto, inhibe
selectivamente el crecimiento de la citada primera línea
inmortalizada de células. Otra vez, los compuestos identificados por
tal tipo de ensayo, se encuentran dentro del ámbito de la presente
invención.
Y en todavía otra forma de presentación de la
presente invención, se proporciona un ensayo de rastreo (y
compuestos identificados mediante éste), para identificar
compuestos que pueden tener un uso en la mejora de estados de
enfermedades inflamatorias, tal como una enfermedad inflamatoria del
intestino, debido a la modulación o alteración de actividad
Pim-2, que comprende las etapas de: (a) establecer
un sistema de control que comprende Pim-2 y un
substrato de Pim-2; (b) establecer un sistema de
test de ensayo, que comprende Pim-2, el citado
substrato de Pim-2, y el compuesto candidato; (c)
medir la actividad de Pim-2, en los sistemas de
control y de test de ensayo; y (d) determinar que, el compuesto
candidato, modula o altera la actividad Pim-2, si
la actividad del Pim-2, en el sistema de test de
ensayo, es inferior o mayor que la actividad medida para el sistema
de control. El ensayo de rastreo, puede también comprender el
contactar un compuesto con una célula cultivada que expresa el gen
Pim-2, y detectar un cambio en la expresión del gen
Pim-2, ó actividad quinasa de
Pim-2, en la célula cultivada. Este procedimiento,
puede comprender adicionalmente la etapa de determinar que un
compuesto rastreado, es de utilidad en el tratamiento de estados de
enfermedades inflamatorias, cuando la expresión del gen
Pim-2, o actividad quinasa del
Pim-2, en la célula cultivada, disminuye de una
forma significativa mediante el compuesto rastreado. Mediante la
expresión "disminuye de una forma significativa" , se pretende
dar a entender el hecho de que, la expresión del gen
Pim-2, o actividad quinasa de Pim-2,
se reduce en un porcentaje de más de aproximadamente un 50%, de una
forma preferible, en un porcentaje de más de aproximadamente un
100% y, de una forma más preferible, en un porcentaje de más de
aproximadamente un 200%. Estos procedimientos, pueden también
emplearse para identificar compuestos que pueden tener un uso en la
mejora de los estados de enfermedades inflamatorias, asociados con
el páncreas inflamado, unas amígdalas inflamadas, un intestino
inflamado, (incluyendo los intestinos delgado y grueso y el recto),
revestimiento del estómago inflamado, tiroides inflamadas, cérvix
inflamado, pulmón inflamado, riñones inflamados, hígado inflamado y
piel inflamada.
De una forma alternativa, los compuestos, pueden
rastrearse para una actividad en el tratamiento de estados de
enfermedades inflamatorias y estados de enfermedades inflamatorias,
asociados con un páncreas inflamado, unas amígdalas inflamadas, un
intestino inflamado, (incluyendo los intestinos delgado y grueso y
el recto), revestimiento del estómago inflamado, tiroides
inflamadas, cérvix inflamado, pulmón inflamado, riñones inflamados,
hígado inflamado y piel inflamada.
En los procedimientos de rastreo de la presente
invención, un cambio en el nivel de expresión de citocinas
pro-inflamatorias, tales como la
IL-6, comparado con el de control, es una indicación
de actividad Pim-2. Pueden determinarse las
diferencias en los niveles de expresión, utilizando procedimientos
conocidos en el arte especializado de la técnica, incluyendo, pero
no de una forma limitativa en cuanto a ésta, a la tecnología de la
interferencia de RNA (RNAi) (Elbashir, S. M. et al., 2001,
Nature, 411, 494-498).
Los compuestos candidatos identificados y/o
aislados mediante cualquiera de estos procedimientos, se abarcan
también, mediante la presente invención.
Se encuentran también incluidos, los
procedimientos para tratar animales afectados de estados de
enfermedades inflamatorias, y prevenir el desarrollo de estados de
enfermedades inflamatorias, los cuales incluyen, pero no de una
forma limitativa en cuanto a ésta, a una enfermedad inflamatoria del
intestino.
En un procedimiento, el tratamiento, se lleva a
cabo mediante la administración de una cantidad terapéuticamente o
profilácticamente efectiva, de un compuesto antisentido, que
objetiviza, como diana, una secuencia de ácido nucleico, que
codifica al Pim-2. en todavía otra forma de
presentación, se proporciona un procedimiento para tratar un estado
de enfermedad inflamatoria, tal como una enfermedad inflamatoria del
intestino, la cual comprende el administrar, a un paciente con
necesidad de éste, un oligonucleótido que hibrida específicamente a
un transcripto que codifica la Pim-2 humana, y que
suprime la expresión del Pim-2 humano, como su
ingrediente efectivo, y un portador o vehículo farmacológicamente
aceptable. En todavía otro procedimiento, se administra, a un
paciente, una cantidad de un agente que inhibe la producción de
Pim-2, en donde, el agente, es una construcción
antisentido que objetiviza, como diana, las secuencias que
codifican el Pim-2, bajo las condiciones en las que
se efectúa el tratamiento. En otro procedimiento, el agente es una
construcción de RNA de corta interferencia (si), que objetiviza,
como diana, las secuencias que codifican al
Pim-2.
Los procedimientos anteriormente descritos,
arriba, de diagnosticar, controlar la eficacia de fármacos
antiinflamatorios, detectar, rastrear e identificar, funcionan
particularmente bien, con respecto a enfermedades inflamatorias del
intestino, de una forma particular, la enfermedad de Crohn y la
colitis ulcerativa.
La figura 1, muestra los cambios múltiples de la
expresión de Pim-2-mRNA, en personas
que sufren de diferentes estados de enfermedades inflamatorias, al
compararse con la expresión de
Pim-2-mRNA en personas que no sufren
de dichos estados de enfermedades inflamatorias. El número de
muestras de donantes sometidas a tests de ensayo, se indica mediante
(n). Los niveles de expresión de mRNA, se obtuvieron mediante series
de distribución de genes en obleas, del tipo "Affymetrix Gene Chip
arrays", tal y como se describen (Lockhard, D. J. et al.,
Nat. Biotechnol. 14: 1675-1680 (1996)). Los valores
p de confianza, se calcularon en base al test de ensayo de dos
muestras modificado de Welch, de dos lados.
La figura 2, muestra la expresión de
Pim-2-mRNA, en tejido de intestino
inflamado, según se compara con la expresión de
Pim-2-mRNA, en tejido de intestino
no inflamado de los mismos pacientes diagnosticados con colitis
ulcerativa. "A", indica tejido inflamado y "B", indica
tejido "no inflamado". Los cuatro diferentes pacientes, se
numeran como 1, 2, 3 y 4.
La figura 3, muestra los resultados de tres
experimentos, en donde, la expresión Pim-2, se midió
en líneas de células THP-1, estimuladas y no
estimuladas con liposacárido. Los valores de los múltiples cambios,
se derivaron a partir de la comparación de la expresión de
Pim-2-mRNA en células
THP-1, estimuladas con LPS, durante un transcurso de
tiempo de 6 horas, con respecto a la expresión de
Pim-2-mRNA, en THP-1
no estimulada.
La figura 4, muestra que la
Pim-2-mRNA, se induce mediante la
estimulación de anti-CD3 ó de
IL-12/IL-18, en células CD4+ Th1. Se
estimularon células esplénicas DO11.10, con OVA,
IL-12 y anti-IL-4,
durante un transcurso de tiempo de 4 días. Las células CD4+, se
recolectaron y estimularon con anti-CD3 ó
IL-12/IL-18, durante un transcurso
de tiempo de 16 horas; se extrajo el RNA total y se sintetizó la
primera hebra de cDNA. El mRNA de Pim-2 e
IFN-\gamma, se detectaron mediante análisis de
TaqMan. Los niveles de expresión de mRNA de cada gen, se presentan
como valores en porcentajes del número medio de copias de mRNA, en
la muestra estimulada de
IL-12/IL-18.
La figura 5, muestra el hecho de que, el
Pim-2 recombinante purificado, es activo en la
fosforilación de Histona. Se expresó Pim-2 marcado
con His, y se purificó a partir de E. coli. Se sometieron a
tests de ensayo las cantidades indicadas de Pim-2,
en un tampón que contenía 25 mM HEPES pH 7,5, 10 mmM MgCl_{2}, 0,5
mM DTT, 10 \muM ATP fría, 1,5
\muCi[\gamma^{33}P]-_ATP, 10 \mug
Histona III (el tipo es de timo de ternero) a la temperatura
ambiente (- \medbullet - \mug enzima versus
His-Pim-2; (\cdot\cdot\cdot
\medbullet \cdot\cdot\cdot \mug enzima versus
Pim-2, 30 min; \cdot\cdot\cdot \ding{116}
\cdot\cdot\cdot \mug enzima vs.
His-Pim-2, 60 minutos). Se procedió
a medir la incorporación de ^{33}P en Histona.
La figura 6, muestra el hecho de que se requiere
Pim-2, para la expresión de IL-6
NTF\alpha-inducida en células Hela. Los dúplex de
Pim-2 siRNA (Pim2_1 control invertida, PIM2_1 a 200
nM). por se transfectaron en células HeLa, durante un tiempo de 2
días. A continuación, las células, se trataron con varias
concentraciones (entre 0,16 y 20 ng/ml) de TNF\alpha, durante un
transcurso de tiempo de 2 horas, antes de que su RNA celular total,
se preparara para análisis de PCR a tiempo real, con
Taq-Man. Las RT y PCR, se llevaron a cabo utilizando
cuantificación de Taq-Man (mostrando un número de
copias de mRNA detectado en 20 ng de RNA total). El número de copias
de transcriptos de genes, se determinó en concordancia con los
patrones standard de DNA y se normalizó con Gapdh humana. Todas las
reacciones de PCR con Taq-Man de cada muestra
individual, se realizaron por triplicado y, a continuación, se
procedió a determinar el número de copias y error standard.
Las definiciones que se facilitan a
continuación, se proporcionan para facilitar la compresión de
ciertos términos utilizados aquí.
Mediante "anticuerpos", se pretende dar a
entender que se incluyen anticuerpos policlonales y monoclonales,
anticuerpos quiméricos, de cadena individual y humanizados, así como
fragmentos de Fab., incluyendo el producto de una Fab o de otra
biblioteca de expresión de inmunoglobulina.
Mediante "células", se pretende dar a
entender que se incluyen células de cualquier forma, incluyendo,
pero no de u una forma limitativa en cuanto a éstas, a células
retenidas en tejidos, agrupaciones de células y células aisladas
individuales.
Mediante "línea celular" (o línea de
células), se pretende dar a entender un clon de una célula primaria,
la cuales es capaz de un crecimiento estable, in vitro, para
muchas generaciones.
Mediante "clon", se pretende dar a entender
una población de células derivadas de una célula individual o
ancestro común mediante mitosis.
Mediante "secuencia codificadora", se
pretende dar a entender una secuencia de DNA de doble hebra, la cual
se transcribe y se traduce en un polipéptido in vivo, cuando
se emplaza bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas.
Los límites de la secuencia codificadora, se determinan mediante un
codón de inicio, en el (amino)término 5' y un codón de paro,
en el (carboxi)término 3'. Una señal de poliadenilizacion y
secuencia de terminación de transcripción, se encontrarán
usualmente localizadas (corriente abajo de) 3', en la secuencia de
codificación.
Mediante material "exógeno", se pretender
dar a entender material que se ha introducido en una célula,
organismo, etc., que se ha originado fuera de la misma.
Mediante región "heteróloga" de una
construcción de DNA, se pretende dar a entender un segmento
identificable de DNA, dentro de una molécula de DNA más grande, que
no se encuentra en asociación con la molécula más grande, en la
naturaleza.
Mediante "aislamiento" de un material (o
aislar un material), se pretende dar a entender cambiar el entorno
medioambiental del material, o retirar un material de su entorno
medioambiental original, o ambos. Así, por ejemplo, cuando un
polinucleótido o un polipéptido se separa de sus materiales
coexistentes de su estado natural, éste se "aísla".
Mediante secuencias nucleótidas
"operativamente unidas", se pretende dar a entender una
yuxtaposición tal que, la funcionalidad de las secuencias, se
conserva. Así, por ejemplo, una secuencia codificadora
"operativamente unida" a un promotor, se posiciona de tal
forma que, el promotor, es capaz de efectuar la expresión de las
secuencias codificadoras.
Mediante "polinucleótido", se pretende dar
a entender cualquier polirribonucleótido o
polidesoxirribonucleótido, el cual puede ser RNA ó DNA no
modificado, ó DNA ó DNA modificado. Tal y como se utiliza aquí, el
término "polinucleótido", incluye, sin ninguna limitación,
moléculas híbridas de DNA y RNA de hebra individual y de doble
hebra, que comprenden DNA y RNA que puede ser de hebra individual, o
de una forma más típica, de doble hebra, o un mezcla de regiones de
hebra individual o de doble hebra. El término "polinucleótido",
puede adicionalmente referirse a regiones de triple hebra, que
comprenden RNA ó DNA, ó ambos, DNA y RNA. "Polinucleótido",
abarca a las formas químicamente, enzimáticamente ó metabólicamente
modificadas de polinucleótidos típicamente encontrados en la
naturaleza, así como también a las formas químicas de DNA y RNA,
características de virus y células. El término, se pretende que
abarque a ambas, tanto secuencias largas de nucleótidos así como a
las secuencias cortas de oligonucleótidos, a las cuales se les hace
referencia, a menudo, como oligonucleótidos y oligómeros.
Mediante el término "polipéptido", se
pretende dar a entender cualquier péptido o proteína, que comprende
dos o más aminoácidos, unidos entre ellos, mediante enlaces de
péptidos, o enlaces de péptidos modificados, es decir, isósteros de
péptidos. Los polipéptidos, pueden comprender aminoácidos distintos
de los 20 aminoácidos codificados en genes, e incluyen aminoácidos
modificados naturalmente o sintéticamente.
Mediante "polipéptido
Pim-2", se quiere dar a entender que se incluye
las SEQ ID NO:2, y polipéptidos que comprenden una secuencia de
aminoácidos de la SEQ ID NO:2, que tiene por lo menos un 80% de
identidad, de una forma todavía más preferible, un 90% de identidad
y, de una forma todavía más preferible, un 95% de identidad, con la
SEQ ID NO:2, en la totalidad de su longitud. El polipéptido
Pim-2, puede ser en forma de una proteína
"natural", o puede ser parte de una proteína más larga, tal
como una proteína de fusión, y puede incluir secuencias secretorias
o líder, pro-secuencias que ayudan en la
purificación, o secuencia adicional para la estabilidad durante la
producción de recombinantes.
Mediante célula "recombinante" o "de
ingeniería genética", se pretende dar a entender una célula, en
el interior de la cual, se ha introducido un gen recombinante, por
mediación de la mano humana. Los genes introducidos
recombinantemente, pueden ser en forma de un gen de cDNA (es decir,
carente de intrones), una copia de un gen genómico, (es decir,
incluyendo intrones con los exones), genes producidos por medios
sintéticos, y/o pueden incluir genes posicionados adyacentes a un
promotor, u operativamente asociados con el gen particular
introducido.
Mediante "replicón", se pretende dar a
entender un elemento genético (por ejemplo, plásmido, cromosoma,
virus), que funciona como una unidad autónoma de replicación de DNA
in vivo, es decir, capaz de replicación bajo su propio
control.
Mediante "célula transformada", se pretende
dar a entender una célula, en la cual, se ha introducido DNA exógeno
o heterólogo. El DNA transformante, puede estar integrado, o puede
no estar integrado (unido de forma covalente), en el DNA
cromosómico que forma el genoma de la célula. El DNA transformante,
puede mantenerse en un elemento episomal, tal como un plásmido.
Mediante "variante", se pretende dar a
entender una secuencia, tal como un polinucleótido o polipéptido,
que difiere de otra secuencia, pero que retiene propiedades
esenciales. Así, por ejemplo, una variante de un polinucleótido,
puede diferir en secuencia nucleótida, mediante una o más
sustituciones, y deleciones, con respecto al polinucleótido de
referencia.
Mediante "vector", se pretende dar a
entender un replicón, tal como un plásmido, fago o cósmido, al cual
se le puede unir otro segmento de DNA, de tal forma que se produzca
el replicón del segmento unido.
Los presentes inventores, han descubierto, de
una forma sorprendente, el hecho de que, la transcripción y
traducción del Pim-2, se mejora de una forma
significativa, en estados de enfermedades inflamatorias. De una
forma particular, tal y como se muestra en la figura 1, los
presentes inventores, han descubierto el hecho de que, la expresión
del Pim-2 humano y su molde de mRNA, se incrementan
de una forma dramática, en tejidos selecciones de humanos
diagnosticados con colitis ulcerativa y enfermedad de Crohn, dos
enfermedades inflamatorias del intestino, enfermedades de las
tiroides inflamadas, enfermedades del estómago inflamado,
enfermedades del páncreas inflamado, cérvix inflamado, tejido
pulmonar inflamado, riñones inflamados, hígado inflamado, y piel
inflamada, al compararse con tejidos de humanos sin tales estados de
enfermedades inflamatorias o en remisión de tales estados de
enfermedades inflamatorias (controles). Se han observado también
incrementos en la expresión de
h-Pim-2 y sus moldes de mRNA, en
amigdalitis, tiroiditis y enfermedad del recto inflamado. Tal y
como puede verse en la fig. 2, la expresión de mRNA en
h-Pim-2, era significativamente
superior (2-3 veces), en tejidos inflamados del
colon, de personas que sufren de colitis ulcerativa de enfermedades
del intestino inflamado, si se comparan con tejido de colon no
inflamado.
Las enfermedades inflamatorias, pueden
diagnosticarse mediante procedimientos que comprenden el determinar,
a partir de una muestra derivada de un sujeto, la extensión de
transcripción y traducción de Pim-2, al compararse
con la transcripción y traducción del gen, en una población normal
(es decir, que no sufren de la enfermedad inflamatoria). La
caracterización de la expresión, en el nivel de RNA, puede
realizarse utilizando cualesquiera de los procedimientos bien
conocidos en el arte especializado de la técnica, para la
cuantificación de polinucleótidos, tales como, por ejemplo, PCR,
RT-PCR, protección de RNasa, transferencia de
Norhern y otros procedimientos de hibridación. Los niveles de
polipéptido Pim-2, pueden ensayarse de una forma
semejante, utilizando técnicas bien conocidas en el arte
especializado de la técnica, incluyendo, tales técnicas, pero no de
una forma limitativa en cuanto a éstas, los ensayos de enlace
competitivo, el análisis de transferencia de Western, y los ensayos
ELISA. La tecnología de microseries de distribución (microarray
technology), se conoce bien, y tiene una aplicabilidad general en la
expresión genética de gauge (de calibración).
El descubrimiento inesperado en cuanto al hecho
de que, la expresión de Pim-2, se mejora de una
forma significativa, en ambos niveles, el nivel transcripcional y
el nivel traductor, en estados de enfermedades inflamatorias,
ofrece nuevos procedimientos de rastreo para aislar compuestos que
disminuyen (o incrementan) la gravedad del estado de enfermedad
inflamatoria.
Los agonistas y antiagonistas de
Pim-2, o de la transcripción y/o traducción del gen
Pim-2, puede encontrar un uso en el tratamiento de
estados inflamatorios.
Los antagonistas, pueden emplearse para
propósitos terapéuticos y profilácticos, para hacer decrecer la
inflamación, procediendo a hacer decrecer la actividad
Pim-2, en el tejido u órgano afectado. Los
antagonistas de actividad Pim-2, pueden encontrar
un uso particular, en el mejoramiento de enfermedades inflamatorias
del intestino, enfermedades inflamatorias de las tiroides,
enfermedades inflamatorias del estómago, y enfermedades
inflamatorias del páncreas, en donde, la expresión incrementada del
gen, se ve que es alta, en individuos afectados. Los antagonistas,
pueden también encontrar un uso, en el mejoramiento de las
condiciones inflamatorias vistas en otros tejidos, incluyendo, pero
no de una forma limitativa en cuanto a éstos, al pulmón, la piel,
los riñones, y las tiroides. Puesto que, el Pim-2,
se expresa ampliamente en tejidos del cuerpo, los antagonistas de
actividad de la línea básica de Pim-2, pueden
encontrar un uso en una variedad de estados inflamatorios, distintos
de estas enfermedades inflamatorias, incluyendo (pero no de una
forma limitativa en cuanto a éstas) al síndrome de la enfermedad
respiratoria en el adulto (ARDS), alergias, asma, dermatitis,
osteorartritis, psoriasis, artritis reumatoidea.
Los procedimientos de rastreo, pueden acarrear
la utilización de células apropiadas que expresen
Pim-2 ó que respondan al polipéptido
Pim-2 de la presente invención. Tales tipos de
células, incluyen a las células de mamíferos, levadura, Drosophila
ó E. coli. Una línea celular particularmente de utilidad, es
la THP-1, una línea celular humana de leucemia
monolítica aguda, comercialmente obtenible en el mercado, de
procedencia de la American Type Culture Collection, Rockville, MD
(USA), la cual exhibe una morfología celular semejante a la
linfoblástica, tiene receptores Fc y C3b, y carece de
inmunoglobulinas de superficie y citoplásmicas (estas células,
marcan como positivas para la
alfa-naftil-butirato-estearasa,
producen lisozimas, y son fagocíticas). Las células que expresan
Pim-2, ó que responden a Pim-2,
pueden ponerse en contacto con un compuesto de test de ensayo, para
determinar el efecto del compuesto de test de ensayo en la actividad
Pim-2. Los compuestos de test de ensayo que
demuestran acción para reducir la actividad Pim-2,
con respecto a tales tipos de células, pueden considerarse como
buenos candidatos como agentes terapéuticos en el tratamiento de
estados de enfermedades inflamatorias.
Las células que expresan Pim-2,
puede ser células transformadas, de tal forma que expresen la SEQ ID
NO:2, o una variante de ésta. El polipéptido Pim-2
de la SEQ ID NO:2, puede prepararse en ambos sistemas, el sistema
procariótico y el sistema eucariótico. Pueden realizarse
construcciones, en donde, la secuencia de codificación para el
polipéptido, venga precedida por un péptido de señal operativo, el
cual tiene como resultado la secreción de la proteína. Las
particularidades para la construcción de los sistemas de expresión,
y de purificación de polipéptidos, y segmentación de péptidos de
fusión, son bien conocidas, por parte de aquéllas personas
comúnmente expertas en el arte especializado de la técnica. La
tecnología para la introducción de DNA en células, incluye cuatro
procedimientos generales: (1) procedimientos físicos, tales como la
micro-inyección, la electroporación, y el cañón
génico (véase, por ejemplo, Johnston et al., Gen gun
transfection of animal cells and genetic imnunization,
-Transfección mediante cañón génico, de células animales, e
inmunización genética-, 43(A) Methods Cell. Biol.
353-35 (1994)); (2) vectores víricos (véase, por
ejemplo, Eglitis et al., Retroviral vectors for introduction
of genes into mammalian cells, -Vectores retrovíricos para la
introducción de genes en células de mamíferos-, 6 (7) Biotechniques
608-614 (1988); (3) Procedimientos químicos (véase,
por ejemplo, Zatloukal et al., Transferrinfection: A highly
efficient way to Express gene constructs in eukariotic cells,
-Transferrinfección: Una vía altamente eficiente para expresar
construcciones génicas en células eucarióticas-, 660 Ann. N.Y.
Acad. Sci. 136-153 (1992)), y (4) mecanismos
mediatizados por receptores (véase por ejemplo, Wagner et
al., Coupling of adenovirus to
transfetrin-polisine/DNA complexes greatly enhances
receptor mediated gene delivery and expression of transfected
genes, -EL acoplamiento de adenovirus a complejos de
transferrina-polisina/DNA, mejora ampliamente el
suministro génico mediatizado por receptores y la expresión de los
genes transfectados-, 89 (13) Porc. Natl. Acad. Sci. USA
6099-6102 (1992)).
Tal y como se comprenderá por parte de una
persona comúnmente experta en el arte especializado de la técnica,
una modificación menor de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID
NO:2, puede dar como resultado un polipéptido que tenga una
actividad substancialmente equivalente al compararse con la SEQ ID
NO:2. Mediante "modificación" de la secuencia primaria de
aminoácidos, se pretende dar a entender el hecho de que, ésta,
incluye "deleciones" (es decir, polipéptidos en los cuales uno
o más residuos de aminoácidos, se encuentran ausentes),
"adiciones" (es decir, un polipéptido que tiene uno o más
aminoácidos adicionales, si se compara con al polipéptido
especificado), "sustituciones" (es decir, un polipéptido, el
cual resulta del reemplazo de uno o más residuos de aminoácidos), y
"fragmentos" (es decir, un polipéptido consistente en una
secuencia primaria de aminoácidos, la cual es idéntica a una
porción de la secuencia primaria del polipéptido especificado).
Mediante "modificación", se quiere también dar a entender, que
se incluyen polipéptidos que se encuentran alterados o modificados,
como resultado de eventos post-traducción, los
cuales cambian, por ejemplo, la glicosilación, la amidación, el
modelo patrón de lipidación, o la estructura primaria, secundaria o
terciaria del polipéptido.
\newpage
Se conoce, en el arte especializado de la
técnica, el hecho de que, ciertos aminoácidos, pueden sustituirse
por otros aminoácidos que tengan un índice o puntuación hidropática
similar, y que todavía tengan como resultado un polipéptido que
tenga una actividad biológica similar. En la realización de tales
tipos de cambios, la sustitución de aminoácidos cuyos índices
hidropáticos se encuentren comprendidos dentro de unos márgenes de
\pm2, son los que se prefieren, prefiriéndose más, aquéllos que
cuyos índices se encuentren comprendidos dentro de unos márgenes de
\pm1, y prefiriéndose todavía más, aquéllos que cuyos índices se
encuentren comprendidos dentro de unos márgenes de \pm0,5. De una
forma similar, los aminoácidos seleccionados, pueden sustituirse
por otros aminoácidos que tengan una hidrofilicidad o capacidad
hidrofílica similar a la que se expone en la patente estadounidense
US nº 4.554.101 (la cual se incorpora aquí, en este documento, en su
totalidad, a título de referencia). En la realización de tales
tipos de cambios, al igual que con los índices hidropáticos, la
sustitución de aminoácidos cuyos índices de hidrofilicidad se
encuentren comprendidos dentro de unos márgenes de \pm2, son los
que se prefieren, prefiriéndose más, aquéllos que cuyos índices se
encuentren comprendidos dentro de unos márgenes de \pm1, y
prefiriéndose todavía más, aquéllos que cuyos índices se encuentren
comprendidos dentro de unos márgenes de \pm0,5 (véase, por
ejemplo, Kyte et al., 157 J. Mol. Bio.
105-132 (1982), que incorpora aquí, en este
documento, en su totalidad, a título de referencia).
Los cambios conservadores de aminoácidos, pueden
realizarse procediendo a cambiar los codones de secuencias de DNA,
utilizando, por ejemplo, la redundancia conocida en el código:
En este aspecto, la presente invención, se
refiere, también, a vectores que comprenden Pim-2, ó
una variante de éste, y células huésped, las cuales se diseñan
mediante ingeniería genética, con vectores de la invención, y a la
producción de polipéptidos de Pim-2, mediante
técnicas de recombinantes. Los sistemas de traducción libres de
células, pueden también emplearse, para producir tales tipos de
proteínas, utilizando RNAs derivados de las construcciones de DNA de
la presente invención
El polinucleótido Pim-2 de la
SEQ ID NO:1, puede obtenerse utilizando clonación y rastreo
standard, por ejemplo, a partir de una biblioteca de cDNA derivada
de mRNA o a partir bibliotecas de DNA genómico, o puede sintetizarse
utilizando procedimientos bien conocidos y técnicas comercialmente
disponibles en el mercado. Cuando el polinucleótido se utiliza para
la producción de recombinantes, es decir, para producir células
recombinantes, éste puede consistir en el polipéptido maduro, o un
fragmento de éste, o puede incluir otras secuencias de codificación,
tales como una secuencia líder o secretoria, una pre-, ó pro-, ó
pre-pro-secuencia, u otras porciones
de péptidos de
fusión.
fusión.
Las células huésped que deben transformarse,
pueden diseñarse mediante ingeniería genética, para incorporar
sistemas de expresión del polipéptido Pim-2. La
introducción de la secuencia polinucleótida de la expresión de
Pim-2 en la célula huésped, puede efectuarse
mediante cualquiera de los procedimientos bien conocidos por parte
de aquellas personas expertas en el arte especializado de la
técnica, tal y como de describe, por ejemplo, en Sambrook et
al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., -Clonación
molecular: Un manual de laboratorio, 2ª Edición-, Cold Spring
Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), tal como la
transfección de fosfato cálcico, transacción mediatizada con
DEAE-dextrano, transvección, microinyección,
transfección catiónica mediatizada por lípidos, electroporación,
transducción, carga mediante roce, introducción balística o
infección. Generalmente, puede utilizarse cualquier sistema o
vector apropiado para mantener, propagar o expresar el
polinucleótido, para producir el polipéptido.
Los presentes inventores, han demostrado
adicionalmente el hecho de que, el gen Pim-2, es una
diana de "bona fide" de NF-\kappaB, en
virtud de su respuesta al I\kappaB\alphaSR (super represor), y
que, su expresión, puede inducirse mediante liposacáridos
("LPS") (J. Biol. Chem. 276: 13579 (2001). Estudios realizados
por parte de los presentes inventores, sugieren el hecho de que la
regulación up (regulación hacia arriba) del Pim-2
en células, mediante LPS, se controla mediante la trayectoria del
HCK/NF-\kappaB. La trayectoria de la transducción
de la señal del NF-\kappaB, involucra una serie de
etapas intracelulares que fomentan la fosforilización y la
subsiguiente disociación de la proteína inhibitoria de I\kappaB,
procedente del complejo inactivo de NF-\kappaB.
Se cree que, el NF-\kappaB liberado, se transloca
al núcleo, en donde, éste, se une al elemento mejorador k, en el
DNA, y que puede activar la transcripción del gen
Pim-2. Puesto que, la trayectoria de transducción
de señal de NF-\kappaB, se induce también mediante
THF, IL-1 y forbol-éster, estos compuestos, pueden
también utilizarse para inducir actividad Pim-2.
La expresión con LPS, de varias líneas
celulares, incluyendo a los monocitos humanos
(THP-1) y pre-células B de ratones,
según se ha visto por parte de los presentes inventores, se
incrementa en aproximadamente 10 veces. Así, de este modo, una
célula estimulada mediante LPS (u otro inductor de la trayectoria de
transducción de señal de NF-\kappaB), puede
utilizarse, de una forma ventajosa, para mejorar la deleción de
compuestos que pueden poseer actividad
anti-inflamatoria, asociadas con actividad de línea
de base de Pim-2. La figura 3, ilustra tres
diferentes experimentos, llevados a cabo para determinar el cambio
multiplicador de la transcripción de
Pim-2-RNA, en líneas celulares de
THP-1, siendo, el cambio multiplicador, el
correspondiente a un valor comprendido dentro de unos márgenes que
van de 8,4 a 18,6.
La enfermedad de Crohn, se mediatiza,
"inter alia", mediante células Th1 activadas. Los
cultivos de células T procedentes de pacientes con la enfermedad de
Crohn, producen unos niveles significativamente más altos de
INF-\gamma y TNF-\alpha, que los
cultivos de células T procedentes de controles sanos (Agholt, J. y
K. Kaltoft, Citokine 15(4): 212-222 (2001)).
La figura 4, ilustra un experimento llevado a cabo para determinar
la inducción de Pim-2 e IFN\alpha, mediante la
estimulación con anti-CD3 ó
IL-12/IL-18 de las células CD4^{+}
Th1. Tal y como puede verse en la figura 4, la expresión de
Pim-2-mRNA, en células CD4^{+} Th1
estimuladas, se había incrementado de una forma significativa,
comparándola con la de las células de control no estimuladas.
Las líneas celulares, pueden activarse de una
forma alternativa, o pueden también activarse, para expresar
Pim-2, mediante la exposición de las células a
pro-virus de leucemia múrida de Moloney.
Los procedimientos de rastreo, pueden también
acarrear un test de ensayo para determinar el enlace de un compuesto
candidato con Pim-2, en sí mismo. El enlace, puede
detectarse mediante cualesquiera de los procedimientos que son bien
conocidos en el arte especializado de la técnica, como por mediación
con un marcador directamente o indirectamente asociado con un
compuesto candidato o mediante la medición de la competencia con un
competidor marcado, tal como un agonista de la actividad
Pim-2 identificado mediante la presente invención,
el cual se encuentre que se enlaza al Pim-2, en sí
mismo. Los procedimientos standard para conducir tales tipos de
ensayos de rastreo, se entienden bien, en el arte especializado de
la técnica. Los indicadores de actividad Pim-2,
pueden incluir, pero no de una forma limitativa en cuanto a éstos, a
las diferencias en la actividad quinasa, comparada con el control o
cambios en los niveles de expresión de substancias
pro-inflamatorias, por ejemplo,
TNF-\alpha, IL-6, 3
INF-\gamma.
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia nucleótida del
Pim-2, se reporta a los números de acceso del banco
de genes (GenBank Accesion Nos.) NM_006875/U77735, basados en los
datos de secuencia reportados por parte de Baytel et al.,
Biochim. Acta 1442 : 274 (1998) (SEQ ID NO:3). Los presentes
inventores, han descubierto el hecho de que, la secuencia de
codificación del polinuclétotido reportada, del
Pim-2, por parte de Baytel et al., difiere de
la obtenida por éstos, en la secuenciación de clones
"image"-EST, que comprenden el gen Pim-2. La
secuencia polinucleótida Pim-2 de Baytel et
al., indica una timidina ("t") adicional, en la posición
1063 ó 1064, en la región de codificación, de forma opuesta a las
SEQ ID NO: 1, obtenida por parte de los presentes inventores, y una
secuencia de codificación, en las posiciones
185-1120, de forma opuesta a la secuencia de
codificación 185 a 1117, obtenida por parte de los presentes
inventores.
Tal y como se conoce bien en el arte
especializado de la técnica, una inserción (o deleción) individual,
en una secuencia nucleótida, comparada con la secuencia real,
provocará un cambio del marco de lectura en la traducción de la
secuencia nucleótida, de tal forma que, la secuencia de aminoácidos
pronosticada codificada por una secuencia nucleótida determinada,
será diferente de la secuencia de aminoácidos realmente codificada
por la molécula de DNA secuenciada, que empieza en el punto de tal
inserción (o deleción). Los presentes inventores, han determinado
el hecho de que, éste es el caso, con respecto a la secuencia de
aminoácidos reportada por parte de Baytel et al. La
secuencia (SEQ ID NO: 4) de Baytel et al., indica el hecho de
que, el Pim-2, tiene 41 aminoácidos, que no se
encuentran en la SEQ ID NO: 2, y que, éste, comprende veintitrés
aminoácidos adicionales, si se compara con dicha SEQ ID NO: 2,
debido a un codón de paro tardío. Los presentes inventores, han
determinado el hecho de que, la SEQ ID NO: 1, codifica el
Pim-2 de tipo salvaje. La secuencia polinucleótida
de Baytel et al. para el Pim-2, puede
diferir del tipo salvaje, debido al material de fuente para su
secuenciación, comprendiendo un polimorfismo en forma de una
mutación adicional, o puede haber resultado a partir de un error de
secuenciación.
Se encuentra un soporte para el polipéptido SEQ
ID NO:2, en datos de secuencias genómicas suministrados por parte
de Ishida el al., en el NCBI: AB042425, con respecto a la
organización genómica del gen transportador humano de
UDP-galactosa, a partir de los cuales, éstos
pronostican un polipéptido "homólogo" del
proto-oncogén Pim-2 (SEQ ID NO: 5),
que corresponde al polipéptido Pim-2 descubierto por
la presente invención. Hasta la fecha, ha habido una carencia de
consistencia en la predicción o pronosticación de genes humanos, a
partir de secuencias genómicas (Hogenesch, et al., Cell 106:
413-415 (2001). Debido a errores potenciales de
exones pronosticados a partir de secuencias genómicas, Ishida et
al., no pudieron señalar la mutación del error de secuencia en
el registro del h-Pim-2 (acceso:
U77735), y en lugar de ello, éstos denominaron a la secuencia
péptida pronosticada como homólogo de Pim-2. Un
soporte para el polinucléotido de la secuencia SEQ ID NO:1, así
como para el polipéptido de la secuencia SEQ ID NO:2, se encuentra
en los NCBI:XM_010208 (SEQ ID NO:6) y NCBI:XP_010208 (SEQ ID NO:7),
presentados y aducidos, ambos, por el Nacional Center for
Biotechnology, que se basan en datos de secuencia, derivados
mediante análisis computacional automatizado "coting" de
secuencia genómica NCBI, NT_011611, utilizando metodología de
predicción genética de ensamblaje, indican secuencias
polinucleótidas y polipeptídicas correspondientes a las encontradas
por parte de los presentes inventores.
La figura 5, ilustra el hecho de que, el
polipéptido Pim-2, según se caracteriza por parte de
los presentes inventores, es capaz de fosforolizar histones, en una
forma dependiente de la concentración.
La invención, contempla la mejora y/o
tratamiento de tales tipos de enfermedades, mediante la
administración de una cantidad inhibitoria de Pim-2
de un inhibidor de actividad Pim-2. Tal y como se
comprenderá por parte de una persona comúnmente experta en el arte
especializado de la técnica, los inhibidores de utilidad de
actividad Pim-2 en el nivel celular, incluyen, pero
no de una forma limitativa en cuenta a éstos, a compuestos que
inhiben la actividad quinasa de Pim-2 y/o reducen
la expresión de Pim-2, tanto en el nivel de
transcripción como en el nivel de traducción, y/o incrementan la
degradación de Pim 2, y/o inhiben la interacción de
Pim-2, con uno o más de sus moduladores/substratos,
corriente arriba o corriente abajo, e incluyen anticuerpos, o
fragmentos de análogos de éstos. En una forma de presentación de la
presente invención, el inhibidor de actividad Pim-2,
se identifica por mediación del test de ensayo de rastreo descrito
anteriormente, arriba.
Los estados de enfermedades inflamatorias,
pueden tratarse mediante la inhibición de la expresión del gen
Pim-2, utilizando técnica de bloqueo de expresión,
siendo dichas técnicas conocidas, por parte de aquéllas personas
comúnmente expertas en el arte especializado de la técnica. Así, por
ejemplo, tales técnicas, pueden involucrar el uso se secuencias
antisentido, bien ya sea internamente generadas, o bien ya sea
separadamente administradas (véase, por ejemplo, O'Connor, J.
Neurochem. 56: 560 (1991), o la formación de triples hélices con el
gen (véase, por ejemplo, Dervan et al., Science 251: 1360
(1991). De una forma alternativa, tales tipos de técnicas, pueden
utilizar tecnología de interferencia de RNA (RNAi)(a la cual se le
hace también referencia como tecnología de interferencia corta de
RNA (siRNA). La figura 6, ilustra estudios de destrucción genética,
de las células Pim-2, en células HeLa, utilizando la
tecnología de siRNA (Elbashir, S.M. et al., 2001, Nature,
411, 494-498). SiRNA-oligo
(Pim-2; sentido:
5'-GU
GAUUCCCCGGAAUCGUGT-3' (SEQ ID NO:8), antisentido: 5'-CACGAUUCCGGGGAAUCACTT-3' (SE1 ID NO:9), se designó que destruía específicamente la expresión de DNA del Pim-2. El siRNA oligo, inverso (Pim-2-1 inv; sentido: 5'-GUGCUAAGGCCCCUUAGUGTT-3' (SEQ ID NO:10), antisentido: 5'-CACUAAGGGGCCUUAG
CACTT-3' (SEQ ID NO:11)), se utilizó como control. El rol interpretativo del Pim-2, en la mediación de la inflamación, puede por lo menos explicarse por su función en el control de la expresión de interleucina-6 (IL-6). La IL-6, en una citosina pro-inflamatoria mayor. La producción incrementada de IL-6, se ha reportado, tanto en la enfermedad de Crohn, como en la enfermedad de la colitis ulcerativa (Braegger CP et al., 1994, Ann Allergy, 72, 135-141). Los ratones con IL-6, muestran una respuesta inflamatoria defectuosa (Fattori et al., J. Exp Med 1994, 180 : 1243-1250). Tal y como se muestra en la figura 6, cuando se suprimió la expresión de Pim-2, mediante su SiRNA-oligo (Pim-2-1), la expresión de IL-6, se redujo, cuando las células se estimularon con varias dosis de TNF-\alpha. Tal tipo de regresión, es gen-específica, puesto, el mismo siRNA, no tenía un efecto significante en la producción de IL-8, como respuesta al TNF-\alpha (figura 6).
GAUUCCCCGGAAUCGUGT-3' (SEQ ID NO:8), antisentido: 5'-CACGAUUCCGGGGAAUCACTT-3' (SE1 ID NO:9), se designó que destruía específicamente la expresión de DNA del Pim-2. El siRNA oligo, inverso (Pim-2-1 inv; sentido: 5'-GUGCUAAGGCCCCUUAGUGTT-3' (SEQ ID NO:10), antisentido: 5'-CACUAAGGGGCCUUAG
CACTT-3' (SEQ ID NO:11)), se utilizó como control. El rol interpretativo del Pim-2, en la mediación de la inflamación, puede por lo menos explicarse por su función en el control de la expresión de interleucina-6 (IL-6). La IL-6, en una citosina pro-inflamatoria mayor. La producción incrementada de IL-6, se ha reportado, tanto en la enfermedad de Crohn, como en la enfermedad de la colitis ulcerativa (Braegger CP et al., 1994, Ann Allergy, 72, 135-141). Los ratones con IL-6, muestran una respuesta inflamatoria defectuosa (Fattori et al., J. Exp Med 1994, 180 : 1243-1250). Tal y como se muestra en la figura 6, cuando se suprimió la expresión de Pim-2, mediante su SiRNA-oligo (Pim-2-1), la expresión de IL-6, se redujo, cuando las células se estimularon con varias dosis de TNF-\alpha. Tal tipo de regresión, es gen-específica, puesto, el mismo siRNA, no tenía un efecto significante en la producción de IL-8, como respuesta al TNF-\alpha (figura 6).
Los estados de enfermedades inflamatorias,
pueden también tratarse por mediación de anticuerpos, o vacunas
formuladas para inducir una respuesta inmunológica en el animal
afectado, de tal forma que se interfiera con la actividad
Pim-2 en la célula. Así, por ejemplo, pueden
generarse anticuerpos contra el polipéptido Pim-2
de la presente invención, mediante la administración de
Pim-2, o un fragmento de éste, portador de epítopes,
a un animal capaz de de generar tales tipos de anticuerpos,
utilizando protocolos de rutina. Para la preparación anticuerpos no
clónicos, puede utilizarse cualquier técnica que proporcione
anticuerpos producidos mediante cultivos continuos de líneas de
células (véase, por ejemplo, Kohler y Milstein, Nature 256: 495
(1975). Técnicas para la producción de anticuerpos de cadena
individual, se dan a conocer, por ejemplo, en la patente
estadounidense U.S. nº 4.946.778, y se utilizan para producir
anticuerpos de cadena individual, para los polipéptidos de la
presente invención. Para expresar anticuerpos humanizados, pueden
utilizarse adicionalmente animales no humanos. Las vacunas, pueden
comprender el inocular un mamífero con un polipéptido
Pim-2, o un fragmento de éste, en una concentración
apropiada, para proteger al animal contra el estado de enfermedad
inflamatoria que se contempla prevenir. Puesto que, los
polipéptidos, pueden degradarse en el entorno medioambiental
gástrico, se prefiere administrar las vacunas proteináceas
parenteralmente.
Los polipéptidos o moléculas pequeñas, pueden
formularse en combinación con un vehículo o portador apropiado. Los
vehículos o portadores, incluyen, pero no de una forma limitativa en
cuanto a éstos, a sueros salinos, sueros salinos tamponizados,
agua, dextrosa, glicerol, etanol, y combinaciones de éstos. La
formulación de la composición, dependerá, por supuesto, de la vía o
ruta de administración y de las características del activo. Las
técnicas de formulación, son bien conocidas en el arte especializado
de la técnica. Puede emplearse cualquier modo de administración,
siempre que, el activo, realice un efecto en el tejido inflamado,
incluyendo, tal tipo de administración, sin limitación, la
administración parenteral (incluyendo la administración subcutánea,
intramuscular e intraperitoneal), la administración enteral
(incluyendo la administración oral y rectal), la administración
dérmica y transdérmica, y la administración ocular y aural. La
invención, se refiere, también, a packs farmacéuticos y equipos a
modo kits farmacéuticos, que comprenden uno o más recipientes
contenedores cargados con un activo.
<110> Boehringer Ingelheim
Pharmaceuticals, Inc.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimientos y compuestos para la
diagnosis de enfermedades inflamatorias e identificación de agentes
farmacológicos utilizados en el tratamiento de enfermedades
inflamatorias
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 9/206-217
\vskip0.400000\baselineskip
<140> A determinar
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2002-05-23
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/292.968
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2001-05-23
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn, version 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1535
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (185)..(1117)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 311
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2088
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (186)..(1187)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<300>
\vskip0.400000\baselineskip
<301> Baytel, D. et al.
\vskip0.400000\baselineskip
<302> El proto-oncogén
humano Pim-2 y su expresión testicular
\vskip0.400000\baselineskip
<303> Biochim. Biophys. Acta
\vskip0.400000\baselineskip
<304> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<305> 1442
\vskip0.400000\baselineskip
<306> 274-285
\vskip0.400000\baselineskip
<307> 1998
\vskip0.400000\baselineskip
<308> NM_006875
\vskip0.400000\baselineskip
<309>
2000-11-02
\vskip0.400000\baselineskip
<313> (1)..(2088)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 334
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 311
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(311)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<300>
\vskip0.400000\baselineskip
<308> AB042425
\vskip0.400000\baselineskip
<309>
2000-05-11
\vskip0.400000\baselineskip
<313> (1)..(311)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 2055
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<300>
\vskip0.400000\baselineskip
<308> XM_010208
\vskip0.400000\baselineskip
<309>
2001-04-17
\vskip0.400000\baselineskip
<313> (1)..(2055)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 311
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<300>
\vskip0.400000\baselineskip
<308> XP_010208
\vskip0.400000\baselineskip
<309>
2001-07-12
\vskip0.400000\baselineskip
<313> (1)..(311)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> RNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<313> (1)..(21)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgugauucccc ggaaucguct t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> RNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<313> (1)..(21)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacgauuccg gggaaucact t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
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<212> RNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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<313> (1)..(21)
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgugcuaaggc cccuuagugt t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
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<212> RNA
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<213> Homo sapiens
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<313> (1)..(21)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacuaagggg ccuuagcact t
\hfill21
Claims (35)
1. Un procedimiento para diagnosticar un estado
de enfermedad inflamatoria, en el que se utiliza una muestra de
tejido obtenida de un paciente, comprendiendo, dicho procedimiento,
las etapas de:
(a) medir un parámetro indicativo del nivel de
Pim-2, ó Pim-2-mRNA,
en la muestra de tejido del paciente;
(b) determinar cualquier diferencia en la
medición del citado parámetro, en la muestra de tejido, al
compararse con la medición del citado parámetro en (una)
muestra(s) de tejido comparable(s), obtenida(s)
de uno o más pacientes que no tienen el citado estado
inflamatorio.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, que
comprende adicionalmente la etapa de:
(c) diagnosticar al paciente, como teniendo el
citado estado de enfermedad inflamatorio, cuando la citada medición
del citado parámetro, con respecto al tejido del paciente, es
significativamente superior que la citada muestra de tejido obtenida
del (de los) citado(s) un o más paciente(s) que no
tienen el citado estado de enfermedad inflamatoria.
3. El procedimiento de la reivindicación 2, en
donde, la citada medición del citado parámetro, con respecto al
tejido del paciente, se juzga como siendo significativamente
superior que la citada medición del citado parámetro, en
la(s) citada(s) muestra(s) de tejido
comparable(s), cuando las mediciones, difieren en más de un
porcentaje de aproximadamente un 50%.
4. El procedimiento de la reivindicación 2, en
donde, la citada medición del citado parámetro, con respecto al
tejido del paciente, se juzga como siendo significativamente
superior que la citada medición del citado parámetro, en
la(s) citada(s) muestra(s) de tejido
comparable(s), cuando las mediciones, difieren en más de un
porcentaje de aproximadamente un 100%.
5. El procedimiento de la reivindicación 2, en
donde, la citada medición del citado parámetro, con respecto al
tejido del paciente, se juzga como siendo significativamente
superior que la citada medición del citado parámetro, en
la(s) citada(s) muestra(s) de tejido
comparable(s), cuando las mediciones, difieren en más de un
porcentaje de aproximadamente un 200%.
6. El procedimiento de la reivindicación 1, en
donde, el parámetro medido, es actividad quinasa de
Pim-2.
7. El procedimiento de la reivindicación 1, en
donde, el procedimiento, comprende la hibridación in situ de
por lo menos una sonda de ácidos nucleicos que comprende una
secuencia de nucleótidos de por lo menos aproximadamente 15
nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:1.
8. El procedimiento de la reivindicación 7, en
donde, las secuencia polinucleótida de la citada sonda de ácidos
nucleicos que se deriva, incluye los nucleótidos 294 a 311 de la SEQ
ID NO:1.
9. El procedimiento de la reivindicación 1, en
donde, el estado de enfermedad inflamatoria, consiste en un páncreas
inflamado, unas amígdalas inflamadas, un segmento del intestino
inflamado, un revestimiento del estómago inflamado, o unas tiroides
inflamadas.
10. Un procedimiento para detectar estados de
enfermedades inflamatorias, que comprende la etapas de: a)
recolectar una muestra sospechosa, y (b) someter la muestra
sospechosa, a un test de ensayo de diagnóstico, empleando la
secuencia nucleótida de la SEQ ID NO: 1, ó fragmentos de ésta,
comprendiendo, el citado test de ensayo de diagnóstico, una reacción
en cadena de la polimerasa o una hibridación de ácidos
nucleicos.
11. Un procedimiento para detectar estados de
enfermedades inflamatorias, que comprende las etapas de: recolectar
una muestra sospechosa, y someter la muestra a un test de ensayo de
diagnóstico, que comprende antisuero policlonal y/o anticuerpo
monoclonal, que dan lugar a inmunógenos que comprenden la secuencia
polinucleótida de la SEQ ID NO: 2, o un fragmento inmunogénico de
ésta, comprendiendo, el citado test de ensayo de diagnóstico, el
análisis de transferencia de Western o el inmunoensayo ligado a
enzimas (ELISA).
12. Un procedimiento para detectar estados de
enfermedades inflamatorias, que comprende las etapas de: (a)
recolectar una muestra sospechosa, y someter la muestra a un test de
ensayo de diagnóstico, que comprende antisuero policlonal y/o
anticuerpo monoclonal, que dan lugar a inmunógenos que comprenden la
secuencia polinucleótida de la SEQ ID NO: 2, ó un fragmento
inmunogénico de ésta, (b) detectar el citado antisuero policlonal
y/o anticuerpo monoclonal.
13. Un ensayo de rastreo, para determinar si un
compuesto sería efectivo en el tratamiento de un estado de
enfermedad inflamatoria, que comprende:
(1) incubar el compuesto, in vitro, con
células la SEQ ID NO:2, o una variante de ésta, en la exposición a
LPS;
(2) determinar la extensión de la inhibición
causada por el citado compuesto, en la expresión de la SEQ ID NO:2,
o variante de ésta, mediante la medición de un parámetro indicativo
del nivel de SEQ ID NO:2 (o variante de ésta), o
m-RNA traducido a la SEQ ID NO:2 (o variante de
ésta).
14. Un ensayo de rastreo, para determinar si un
compuesto sería efectivo en el tratamiento de un estado de
enfermedad inflamatoria, que comprende:
(1) incubar in vitro el compuesto, con
una proteína que comprende la SEQ ID NO:2, o variante de ésta, que
tenga actividad quinasa, y un substrato, con respecto a la citada
actividad quinasa;
(2) determinar si el compuesto inhibe la citada
actividad quinasa de la proteína, con respecto al citado
substrato.
15. El procedimiento de la reivindicación 14, en
donde, la citada proteína, es de origen recombinante o de origen
natural.
16. Un ensayo de rastreo, para determinar
compuestos candidatos para el mejoramiento de los estados de
enfermedades inflamatorias, que comprende las etapas de:
(a) cultivar separadamente una primera línea de
células inmortalizada, que contiene por lo menos un gen de la SEQ ID
NO:1, o una variante de ésta, y una segunda línea de células
inmortalizada, en donde, el gen de la SEQ ID NO:1, o variante de
ésta, se inactiva;
(b) someter ambas líneas de células, a un
compuesto sospechoso de tener actividad en el mejoramiento del
estado de enfermedad inflamatoria; y
(c) determinar si, el citado compuesto, inhibe
selectivamente el crecimiento de la citada primera línea
inmortalizada de células.
17. Un ensayo de rastreo, para identificar
compuestos que pueden tener un uso en la mejora de estados de
enfermedades inflamatorias, debido a la modulación o alteración de
actividad Pim-2, que comprende las etapas de:
(a) establecer un sistema de control que
comprende Pim-2 y un substrato de
Pim-2;
(b) establecer un sistema de test de ensayo, que
comprende Pim-2, el citado substrato de
Pim-2, y el compuesto candidato;
(c) medir la actividad de Pim-2,
en los sistemas de control y de test de ensayo; y
(d) determinar que, el compuesto candidato,
modula o altera la actividad Pim-2, si la actividad
del Pim-2, en el sistema de test de ensayo, es
inferior o mayor que la actividad medida para el sistema de
control.
18. Un procedimiento para el rastreo de
compuestos para su uso en el tratamiento de estados de enfermedades
inflamatorias, que comprende las etapas de: (a) contactar un
compuesto con una célula cultivada que expresa el gen
Pim-2, y (b) detectar un cambio en la expresión del
gen Pim-2, ó actividad quinasa de
Pim-2, en la célula cultivada.
19. El procedimiento de la reivindicación 18,
que comprende adicionalmente la etapa de:
(c) determinar que un compuesto rastreado, es de
utilidad en el tratamiento de estados de enfermedades inflamatorias,
cuando la expresión del gen Pim-2, o actividad
quinasa del Pim-2, en la célula cultivada, disminuye
de una forma significativa mediante el citado compuesto
rastreado.
20. El procedimiento de la reivindicación 19, en
donde, se determina una disminución significativa en la etapa (c),
cuando, la expresión del gen Pim-2, ó la actividad
quinasa del Pim-2, en las células cultivadas, se
reduce en un porcentaje de más de aproximadamente un 50%, mediante
el compuesto rastreado.
21. El procedimiento de la reivindicación 19, en
donde, se determina una disminución significativa en la etapa (c),
cuando, la expresión del gen Pim-2, ó la actividad
quinasa del Pim-2, en las células cultivadas, se
reduce en un porcentaje de más de aproximadamente un 100%, mediante
el compuesto rastreado.
22. El procedimiento de la reivindicación 19, en
donde, se determina una disminución significativa en la etapa (c),
cuando, la expresión del gen Pim-2, ó la actividad
quinasa del Pim-2, en las células cultivadas, se
reduce en un porcentaje de más de aproximadamente un 200%, mediante
el compuesto rastreado.
23. Un procedimiento para rastrear compuestos
para la actividad en el tratamiento de estados de enfermedades
inflamatorias, que comprende la etapa de medir la afinidad de los
compuestos para Pim-2 in vitro.
24. Uso de un compuesto antisentido objetivizado
a una secuencia de ácidos nucleicos que codifica al
Pim-2, para preparar un medicamento para el
tratamiento de un animal que tenga una enfermedad inflamatoria.
25. Uso de un oligonucleótido el cual hibrida
específicamente a un transcripto que codifica al Pim 2, y suprime la
expresión del Pim-2 humano, para preparar un
medicamento para tratar un estado de enfermedad inflamatoria.
26. Uso de un constructor antisentido que
objetiviza, como diana, secuencias que codifican al
Pim-2, para preparar un medicamento para el
tratamiento de un estado de enfermedad inflamatoria, en un
paciente.
27. El procedimiento de las reivindicaciones 1 a
8, en el cual, el estado de enfermedad inflamatoria, es una
enfermedad inflamatoria del intestino.
28. El procedimiento de la reivindicación 27, en
donde, la enfermedad inflamatoria del intestino a ser diagnosticada,
es la enfermedad de Crohn o la colitis ulcerativa.
29. El procedimiento de las reivindicaciones 10
a 12, en el cual, el estado de enfermedad inflamatoria, es una
enfermedad inflamatoria del intestino.
30. El ensayo de rastreo de las reivindicaciones
13 a 15, en el cual, el estado de enfermedad inflamatoria, es una
enfermedad inflamatoria del intestino.
31. El ensayo de rastreo de las reivindicaciones
16 a 17, en el cual, el estado de enfermedad inflamatoria, es una
enfermedad inflamatoria del intestino.
32. El procedimiento de las reivindicaciones 18
a 22, en el cual, los estados de enfermedades inflamatorias, son
enfermedades inflamatorias del intestino.
33. Un procedimiento para rastrear compuestos,
para la actividad en el tratamiento de estados de enfermedades
inflamatorias, que comprende medir la afinidad de los compuestos
para Pim-2 in vitro.
34. Uso de un anticuerpo reactivo con el
polipéptido de la SEQ ID NO:2, para preparar un medicamento para
tratar un individuo que tiene una enfermedad inflamatoria del
intestino.
35. El procedimiento de las reivindicaciones 24
a 26, en el cual, la enfermedad inflamatoria, es una enfermedad
inflamatoria del intestino.
Applications Claiming Priority (6)
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|---|---|---|---|
| US29296801P | 2001-05-23 | 2001-05-23 | |
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| US33547401P | 2001-11-15 | 2001-11-15 | |
| US335474P | 2001-11-15 | ||
| US33384801P | 2001-11-28 | 2001-11-28 | |
| US333848P | 2001-11-28 |
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| Publication Number | Publication Date |
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