ES2279877T3

ES2279877T3 - Polinucleotido utilizable para modular la proliferacion de celulas cancerigenas.

Info

Publication number: ES2279877T3
Application number: ES02748337T
Authority: ES
Inventors: Eric Ferrandis; Jose-Antonio Camara Y Ferrer; Jean Martinez; Christophe Thurieau
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Societe de Conseils de Recherches et dApplications Scientifiques SCRAS SAS
Current assignee: Ipsen Pharma SAS; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 2001-03-01
Filing date: 2002-03-01
Publication date: 2007-09-01
Anticipated expiration: 2022-03-01
Also published as: FR2821624B1; EP1368474A1; CA2437535A1; IL157091A0; CZ20032670A3; BR0207253A; PL204844B1; AU2002335492B2; RU2307666C2; KR100869190B1; HK1065334A1; FR2821624A1; EP1368474B1; DE60217651D1; WO2002070700A1; DE60217651T2; JP2004527240A; KR20030090655A; PL365226A1; HUP0303312A3

Abstract

Polinucleótido aislado que comprende la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 5.

Description

Polinucleótido utilizable para modular la proliferación de células cancerígenas.

La presente invención se refiere a una nueva proteína que modula la proliferación de células cancerosas. Gracias a las proteínas codificadas por los polinucleótidos de secuencias SEC ID Nº 4, SEC ID Nº 5 y SEC ID Nº 9 descritas posteriormente, es igualmente posible determinar el grado de malignidad de las células en proliferación anormal.

El cáncer es un problema de salud importante en el mundo. Aunque se han realizado progresos importantes estos últimos años en la detección y el tratamiento del cáncer, no existe actualmente ninguna vacuna ni ningún otro método de tratamiento universal para la prevención o el tratamiento del cáncer. La gestión de la enfermedad reside en la combinación de un diagnóstico lo más precoz posible y de un tratamiento agresivo que incluye una variedad de elementos como cirugía, radioterapia, quimioterapia o además hormonoterapia. La evolución del tratamiento para un cáncer dado se selecciona a menudo basándose en parámetros de pronóstico que comprenden un análisis de marcadores específicos de tumores. Sin embargo, la utilización de marcadores establecidos conduce a menudo a un resultado difícilmente interpretable y a una mortalidad aumentada continua que se observa en numerosos pacientes cancerosos.

Los cánceres de mama y de próstata son los tumores malignos más frecuentes. En Estados Unidos, se diagnostican 400.000 nuevos casos cada año y aproximadamente 100.000 hombres y mujeres mueren cada año por su enfermedad (Harris y col., New Eng. J. Med. (1992), 327, 319, 390 y 473).

Está admitido que estas enfermedades aparecen como un proceso multifactorial que implica mutaciones en un número limitado de genes, quizás 10 o menos. Estas mutaciones implican un cambio del crecimiento y de la modulación de la proliferación celular de los tejidos, permitiéndolos crecer independientemente de los controles celulares normales, formar metástasis y escapar a la vigilancia inmune. Las clases de genes implicados en los cánceres de mama y de próstata pueden ser altamente específicos de estas clases de tumores. En particular, las mutaciones en los genes implicados en las respuestas hormonales (receptores y ligandos de la clase de estrógenos, progesterona o incluso testosterona) son particularmente importantes, pues probablemente estimulan a las células a proliferar volviéndolas refractarias al efecto antitumoral de estas hormonas.

Además, están frecuentemente implicados cambios en los genes que codifican factores de crecimiento, moléculas de transducción de señal, así como factores de transcripción, y tienen alteraciones que están a su vez implicadas en el desarrollo y la progresión tumorales (King, Nature Genetics (1992), 2, 125).

Una pregunta sin resolver actualmente es la naturaleza de los cambios de expresión génica que aparecen en las células tumorales humanas de manera irreversible conduciendo a la diferenciación celular. Sin embargo, esta información es muy importante para la definición, en el plano molecular, de esquemas de regulación de la expresión génica implicados en el crecimiento y la diferenciación celulares de células humanas de cánceres de próstata y de mama. Existe así una necesidad urgente de identificación de secuencias génicas implicadas en la cita irreversible con la diferenciación terminal.

Muy recientemente, cuando la solicitante estaba ya en posesión de la invención descrita a continuación, se ha divulgado la secuencia SEC ID Nº 4 en la base de datos Genbank con el número de acceso AK000755 y el número de identificación 7021039, sin indicación sin embargo de la actividad de las proteínas que podían estar codificadas por esta secuencia.

La presente invención tiene como objeto un polinucleótido aislado que comprende la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 5. Tiene también como objeto un polinucleótido antisentido que comprende la secuencia complementaria de la de dicho polinucleótido aislado que comprende la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 5.

La invención se refiere también a un polinucleótido aislado que comprende al menos un fragmento de la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 5, siendo dicho polinucleótido tal que codifica un polipéptido que tiene al menos una actividad inmunológica y/o biológica característica de una proteína asociada a la modulación de la proliferación celular. Particularmente, la invención se refiere a este respecto al polinucleótido aislado de secuencia nucleotídica SEC ID Nº 9 o al polinucleótido aislado de secuencia nucleotídica complementaria de la secuencia nucleotídica SEC ID Nº 9.

La invención tiene además como objeto un polipéptido aislado que comprende al menos un fragmento de la proteína codificada por la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 5 o por una secuencia complementaria de la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 5, teniendo dicho polipéptido aislado al menos una actividad inmunológica y/o biológica característica de una proteína asociada a la modulación de la proliferación celular. Preferiblemente, dicho polipéptido aislado posee un fragmento que tiene una actividad inmunológica característica de una proteína asociada a la modulación de la proliferación celular.

Particularmente, la invención se refiere a la proteína de secuencia SEC ID Nº 8 (descrita posteriormente) codificada por el fragmento del polinucleótido de secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 5 contenido entre las bases en las posiciones 420 (codón iniciador ATG que codifica una metionina) y 861 (codón de paro UAA), concretamente por la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 9 (descrita posteriormente).

La invención se refiere también a un vector de expresión que comprende un polinucleótido aislado que comprende al menos un fragmento de la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 5 o de la secuencia complementaria de la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 5, teniendo el polipéptido codificado por dicho polinucleótido aislado al menos una actividad inmunológica y/o biológica característica de una proteína asociada a la modulación de la proliferación celular. Se refiere asimismo a una célula huésped transformada o transfectada con dicho vector de expresión.

La invención tiene igualmente como objeto un anticuerpo monoclonal, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se fija específicamente a un polipéptido aislado tal como el descrito anteriormente, y particularmente un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se fija específicamente a la proteína de secuencia SEC ID Nº 8.

La invención se refiere además, a modo de medicamento, a un polipéptido aislado que comprende al menos un fragmento de la proteína codificada por la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 5 o por una secuencia complementaria de la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 5, teniendo dicho polipéptido aislado al menos una actividad inmunológica y/o biológica característica de una proteína asociada a la modulación de la proliferación celular. Particularmente, dicho fragmento puede ser el fragmento codificado por el polinucleótido de secuencia nucleotídica SEC ID Nº 9 o por la secuencia complementaria de la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 9, o dicho de otro modo, la proteína de secuencia SEC ID Nº 8. Se refiere asimismo, a modo de medicamento, a un polipéptido aislado que comprende al menos un fragmento de la proteína codificada por la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 4 o por una secuencia complementaria de la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 4, teniendo dicho polipéptido aislado al menos una actividad inmunológica y/o biológica característica de una proteína asociada a la modulación de la proliferación celular.

La invención se refiere además, a modo de medicamento, a un anticuerpo monoclonal, o a un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se fija específicamente a un polipéptido aislado que comprende al menos un fragmento de la proteína codificada por la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 4 o SEC ID Nº 5 o por una secuencia complementaria de la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 4 o SEC ID Nº 5, teniendo dicho polipéptido aislado al menos una actividad inmunológica y/o biológica característica de una proteína asociada a la modulación de la proliferación celular.

Particularmente, la invención se refiere, a modo de medicamento, a un anticuerpo monoclonal, o a un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se fija específicamente a un polipéptido aislado codificado por el polinucleótido de secuencia nucleotídica SEC ID Nº 9 o por la secuencia complementaria de la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 9 (dicho de otro modo, la proteína de secuencia SEC ID Nº 8).

La invención se refiere por otro lado a una composición farmacéutica que comprende un polipéptido aislado que comprende:

-: o bien un fragmento de la proteína codificada por la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 5 o por una secuencia complementaria de la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 5,

-: o bien un fragmento de la proteína codificada por la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 4 o por una secuencia complementaria de la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 4.

teniendo dicho polipéptido aislado al menos una actividad inmunológica y/o biológica característica de una proteína asociada a la modulación de la proliferación celular;

comprendiendo dicha composición por otro lado uno o varios excipientes farmacéuticamente aceptables.

Particularmente, la invención tendrá como objeto una composición farmacéutica que comprende la proteína codificada por la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 9 o por la secuencia complementaria de la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 9 (dicho de otro modo, la proteína de secuencia SEC ID Nº 8) con uno o varios excipientes farmacéuticamente aceptables.

Como alternativa, una composición farmacéutica según la invención comprenderá un anticuerpo monoclonal, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se fija específicamente a un polipéptido aislado que comprende al menos un fragmento de la proteína codificada por la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 4 o SEC ID Nº 5 o por una secuencia complementaria de la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 4 o SEC ID Nº 5, teniendo dicho polipéptido aislado al menos una actividad inmunológica y/o biológica característica de una proteína asociada a la modulación de la proliferación celular, comprendiendo dicha composición por otro lado uno o varios excipientes farmacéuticamente aceptables.

Particularmente, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se fija específicamente a la proteína codificada por la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 9 o por la secuencia complementaria de la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 9 (dicho de otro modo, la proteína de secuencia SEC ID Nº 8) con uno o varios excipientes farmacéuticamente aceptables.

Según una variante preferida, dichas composiciones farmacéuticas comprenderán igualmente un activador de la respuesta inmune (el cual puede ser un coadyuvante).

Un objeto suplementario de la invención es la utilización, para preparar un medicamento destinado a tratar una enfermedad proliferativa, de un polipéptido aislado que comprende:

-: o bien un fragmento de la proteína codificada por la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 4 o por una secuencia complementaria de la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 4,

teniendo dicho polipéptido aislado al menos una actividad inmunológica y/o biológica característica de una proteína asociada a la modulación de la proliferación celular.

Particularmente, la invención se refiere a la utilización, para preparar un medicamento destinado a tratar una enfermedad proliferativa, de un polipéptido aislado codificado por la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 9 o por la secuencia complementaria de la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 9 (dicho de otro modo, de la proteína de secuencia SEC ID Nº 8) con uno o varios excipientes farmacéuticamente aceptables.

Es otro objeto de la invención la utilización de un polinucleótido aislado que comprende:

-: la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 5, o

-: la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 4, o también

-: la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 9,

para preparar un medicamento destinado a tratar una enfermedad proliferativa.

Preferiblemente, el polinucleótido aislado utilizado consistirá en un polinucleótido de secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 4, SEC ID Nº 5 o SEC ID Nº 9.

Dicho polinucleótido aislado utilizado está preferiblemente presente en un vector vírico, estando seleccionado dicho vector vírico, por ejemplo, a partir del grupo consistente en un adenovirus, un adenovirus asociado, un retrovirus y un poxvirus.

Como alternativa, siempre según la presente invención, podrá utilizarse para preparar un medicamento destinado a tratar una enfermedad proliferativa un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se fija específicamente a un polipéptido aislado que comprende al menos un fragmento de la proteína codificada por la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 4 o SEC ID Nº 5 o por una secuencia complementaria de la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 4 o SEC ID Nº 5, teniendo dicho polipéptido aislado al menos una actividad inmunológica y/o biológica característica de una proteína asociada a la modulación de la proliferación celu-
lar.

Particularmente, podrá utilizarse para preparar un medicamento destinado a tratar una enfermedad proliferativa un anticuerpo monoclonal, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se fija específicamente a un polipéptido aislado codificado por la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 9 o por la secuencia complementaria de la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 9 (dicho de otro modo, un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se fija específicamente a la proteína de secuencia SEC ID Nº 8).

Según variantes preferidas de las utilizaciones anteriormente mencionadas, la enfermedad proliferativa para tratar por el polipéptido o el polinucleótido descritos anteriormente será un cáncer. Según variantes aún más preferidas, el cáncer se elegirá entre los grupos consistentes en cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de pulmón y cáncer colorrectal.

La invención ofrece además un método para determinar si un tumor en un paciente es maligno, comprendiendo dicho método la determinación en una muestra tumoral obtenida a partir de un paciente de la concentración de un polipéptido aislado que comprende al menos:

Particularmente, dicho método de determinación podrá tener como objeto la determinación en una muestra tumoral obtenida a partir de un paciente de la concentración de polipéptido aislado codificado por la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 9 o por la secuencia complementaria de la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 9 (dicho de otro modo, de la concentración de proteína de secuencia SEC ID Nº 8).

Según una variante preferida del método anteriormente mencionado, dicho método comprende la puesta en contacto de la muestra tumoral con un anticuerpo monoclonal que reconoce específicamente el polipéptido aislado mencionado anteriormente (y particularmente el polipéptido aislado codificado por la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 9 o por la secuencia complementaria de la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 9 (dicho de otro modo, de la concentración de proteína de secuencia SEC ID Nº 8)).

La invención se refiere también a un método para determinar si un tumor en un paciente es maligno, comprendiendo dicho método la determinación, en una muestra biológica obtenida a partir de un paciente, de la concentración de:

-: polinucleótido de secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 5 o SEC ID Nº 4, o

-: polinucleótido cuya secuencia nucleotídica es un fragmento de la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 5 o SEC ID Nº 4, codificando dicho fragmento un polipéptido aislado que tiene al menos una actividad inmunológica y/o biológica característica de una proteína asociada a la modulación de la proliferación celular.

Particularmente, dicho método comprende la determinación, en una muestra biológica obtenida a partir de un paciente, de la concentración de polipéptido aislado codificado por la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 9 o por la secuencia complementaria de la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 9 (dicho de otro modo, de la concentración de proteína de secuencia SEC ID Nº 8).

Según una variante preferida de este último método, dicho método comprende:

(a): la preparación de moléculas de ADNc a partir de moléculas de ARNc de la muestra tumoral, más

(b): la amplificación específica de moléculas de ADNc que son capaces de codificar al menos una porción del polipéptido.

La invención ofrece también un método para seguir la progresión o la regresión de la enfermedad en un paciente aquejado por un cáncer, comprendiendo dicho método:

(a): la determinación, repetida a intervalos elegidos a lo largo del tiempo en una muestra biológica obtenida a partir de un paciente, de la concentración de polipéptido aislado que comprende al menos:

teniendo dicho polipéptido aislado al menos una actividad inmunológica y/o biológica característica de una proteína asociada a la modulación de la proliferación celular, y

(b): la comparación, a lo largo del tiempo, de las concentraciones determinadas en (a).

Particularmente, dicho método para seguir la progresión o la regresión de la enfermedad en un paciente aquejado por un cáncer comprenderá, en una etapa (a), la determinación repetida a intervalos escogidos a lo largo del tiempo, en una muestra biológica obtenida a partir de un paciente, de la concentración de polipéptido aislado codificado por la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 9 o por la secuencia complementaria de la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 9 (dicho de otro modo, de la concentración de proteína de secuencia SEC ID Nº 8).

La etapa (a) del método anterior comprenderá preferiblemente la puesta en contacto de una porción de la muestra biológica con un anticuerpo monoclonal que reconoce específicamente dicho polipéptido (particularmente la proteína de secuencia SEC ID Nº 8). Según una variante preferida del método anterior, la muestra biológica obtenida a partir del paciente será por otra parte una porción de tumor.

Siempre según la invención, otro método para seguir la progresión o la regresión de la enfermedad de un paciente aquejado por un cáncer comprenderá las etapas siguientes:

(a): la determinación, repetida a intervalos escogidos a lo largo del tiempo en una muestra biológica obtenida a partir de un paciente, de la concentración de ARN que codifica un polipéptido aislado que comprende al menos:

Particularmente, dicho método para seguir la progresión o la regresión de la enfermedad en un paciente aquejado por un cáncer comprenderá, en su etapa (a), la determinación repetida a intervalos elegidos a lo largo del tiempo, en una muestra biológica obtenida a partir de un paciente, de la concentración de ARN que codifica un polipéptido aislado codificado por la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 9 o por la secuencia complementaria de la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 9 (dicho de otro modo, de la concentración de ARN que codifica la proteína de secuencia SEC ID Nº 8).

Según una variante preferida del método de seguimiento descrito anteriormente, la etapa (a) comprende preferiblemente:

(i): la preparación de moléculas de ADNc a partir de moléculas de ARN en la muestra biológica, y

(ii): la amplificación específica de moléculas de ADNc que son capaces de codificar al menos una porción de dicho polipéptido aislado.

Todos los métodos de determinación y/o de seguimiento descritos anteriormente son herramientas que permitirán al médico, después del análisis de los resultados, formular su diagnóstico en cuanto a la gravedad y/o la progresión o la regresión de tumores del paciente referido.

La invención tiene además como objeto un kit para el diagnóstico de enfermedades proliferativas que comprende:

(a): un anticuerpo monoclonal que se fija específicamente a un polipéptido aislado que comprende al menos un fragmento de la proteína codificada por la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 5 o SEC ID Nº 4, o por una secuencia complementaria de la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 5 o SEC ID Nº 4,

(b): un segundo anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo que se fija o bien a un anticuerpo monoclonal tal como el definido en (1), o bien al polipéptido aislado tal como se define en (1),

estando conjugado dicho segundo anticuerpo monoclonal con un grupo indicador.

Particularmente, dicho kit para el diagnóstico de enfermedades proliferativas podrá elegirse de tal modo que el fragmento de la proteína codificada por la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 5 sea el polipéptido aislado codificado por la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 9 o por la secuencia complementaria de la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 9 (dicho de otro modo, la proteína de secuencia SEC ID Nº 8).

Preferiblemente, el grupo indicador del kit de diagnóstico anterior se selecciona del grupo compuesto por radioisótopos, grupos fluorescentes, grupos luminiscentes, enzimas, biotina y partículas coloreadas.

La invención ofrece además un método de preparación de un polipéptido aislado que comprende al menos un fragmento de la proteína codificada por la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 5 o por una secuencia complementaria de la secuencia poliuncleotídica SEC ID Nº 5, teniendo dicho polipéptido aislado al menos una actividad inmunológica y/o biológica característica de una proteína asociada a la modulación de la proliferación celular, comprendiendo dicho método de preparación las etapas sucesivas siguientes:

(a): el cultivo, en condiciones convenientes para obtener la expresión de dicho polipéptido, de una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido aislado que comprende al menos un fragmento de la proteína codificada por la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 5 o por una secuencia complementaria de la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 5, teniendo dicho polipéptido aislado al menos una actividad inmunológica y/o biológica característica de una proteína asociada a la modulación de la proliferación celular, y

(b): el aislamiento del polipéptido a partir de cultivos de células huésped.

Particularmente, dicho método tendrá como objeto la preparación del polipéptido aislado codificado por la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 9 o por la secuencia complementaria de la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 9 (dicho de otro modo, la preparación de la proteína de secuencia SEC ID Nº 8).

La presente invención ofrece también un método para la identificación de compuestos susceptibles de modular el crecimiento y/o la diferenciación celulares, el cual comprende la etapas sucesivas siguientes:

(a): la puesta en contacto de cada compuesto candidato, en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir al agente candidato fijarse al polipéptido, con un polipéptido aislado que comprende al menos:

teniendo dicho polipéptido aislado al menos una actividad inmunológica y/o biológica característica de una proteína asociada a la modulación del crecimiento y/o de la diferenciación celulares, y

(b): la detección de la fijación de cada compuesto candidato a dicho polipéptido, y la identificación entre los compuestos candidatos de los compuestos susceptibles de modular el crecimiento y/o la diferenciación celulares.

Particularmente, dicho método para la identificación de compuestos susceptibles de modular el crecimiento y/o la diferenciación celulares comprenderá, en su etapa (a), la puesta en contacto de cada compuesto candidato, en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir al agente candidato fijarse al polipéptido, con el polipéptido aislado codificado por la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 9 o por la secuencia complementaria de la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 9 (dicho de otro modo, con la proteína de secuencia SEC ID Nº 8).

Un método alternativo para la identificación de compuestos susceptibles de modular el crecimiento y/o la diferenciación celulares comprende las etapas sucesivas siguientes:

(a): la puesta en contacto de cada compuesto candidato, en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir interaccionar al agente candidato y a la célula, con una célula capaz de expresar un polipéptido aislado que comprende al menos:

teniendo dicho polipéptido aislado al menos una actividad inmunológica y/o biológica característica de una proteína asociada a la modulación del crecimiento y/o la diferenciación celulares, y

(b): la determinación del efecto de cada compuesto candidato sobre la concentración celular de polipéptido y la identificación entre los compuestos candidatos de los compuestos susceptibles de modular el crecimiento y/o la diferenciación celulares.

Particularmente, dicho método alternativo comprenderá, en su etapa (a), la puesta en contacto de cada compuesto candidato, en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir interaccionar al agente candidato y a la célula, con una célula capaz de expresar polipéptido aislado codificado por la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 9 o por la secuencia complementaria de la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 9 (dicho de otro modo, una célula capaz de expresar la proteína de secuencia SEC ID Nº 8).

Según modos de realización preferidos de los métodos de identificación de compuestos susceptibles de modular el crecimiento y/o la diferenciación descritos anteriormente, los compuestos candidatos procederán de bibliotecas de moléculas pequeñas resultantes de programas de química combinatoria.

La invención se refiere además a un polinucleótido que comprende un promotor endógeno o un elemento de regulación de la proteína asociada a la diferenciación, en la que la proteína comprende una secuencia codificada por una secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 5 o por una secuencia complementaria de la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 5.

La invención se refiere igualmente a un polinucleótido que comprende un gen indicador bajo el control del promotor endógeno o de elementos de regulación de la proteína asociada a la modulación de la proliferación celular, en la que la proteína comprende una secuencia codificada por la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 5 o por una secuencia complementaria de la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 5. La invención se refiere de igual manera a una célula transformada o transfectada con este último polinucleótido.

La invención se refiere por otro lado a un método para identificar compuestos susceptibles de modular la expresión de la proteína asociada a la modulación de la proliferación celular, el cual comprende las etapas sucesivas siguientes:

(a): la puesta en contacto de cada compuesto candidato, en condiciones tales y durante un tiempo suficiente para permitir interaccionar a cada compuesto candidato con el promotor o el elemento de regulación del mismo, con una célula transformada o transfectada con un polinucleótido que comprende un gen indicador bajo el control del promotor endógeno o de elementos de regulación de la proteína asociada a la modulación de la proliferación celular, en el que la proteína comprende una secuencia codificada por la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 5 o por una secuencia complementaria de la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 5,

(b): la determinación de los efectos de cada compuesto candidato sobre la concentración de proteína indicadora producida por la célula, y la identificación de los compuestos susceptibles de modular la expresión de la proteína asociada a la modulación de la proliferación celular.

Según un modo de realización preferido del método de identificación de compuestos susceptibles de modular la expresión de la proteína asociada a la modulación de la proliferación celular descrita anteriormente, los compuestos candidatos provendrán de bibliotecas de moléculas pequeñas resultantes de programas de química combinatoria.

Las propiedades farmacológicas obtenidas por los polinucleótidos y polipéptidos según la invención hacen a estos últimos aptos para una utilización farmacéutica. Efectivamente, los polipéptidos aislados que comprenden al menos:

que tienen al menos una actividad inmunológica y/o biológica característica de una proteína asociada a la modulación de la proliferación celular, así como los polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos, pueden administrarse según la invención a pacientes cancerosos con el fin de ralentizar la progresión de sus tumores o de provocar la regresión de dichos tumores.

En los métodos anteriores, la proteína asociada a la modulación de la proliferación celular o a la diferenciación podrá ser particularmente el polipéptido aislado codificado por la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 9 o por la secuencia complementaria de la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 9 (dicho de otro modo, la proteína de secuencia SEC ID Nº 8).

Los diferentes elementos tratados anteriormente resultarán evidentes para el experto en la técnica una vez hecha la lectura de la descripción más detallada de diferentes aspectos de la invención.

Descripción detallada de diferentes aspectos de la invención

Como se menciona anteriormente, la presente invención está dirigida en general hacia productos y métodos destinados a modular el crecimiento celular y a tratar el cáncer. La presente invención está basada, en parte, en la identificación de "secuencias asociadas a la modulación de la proliferación celular" que son secuencias polipeptídicas y polinucleotídicas asociadas a la modulación de la proliferación celular. Un ARNm asociado a la diferenciación es un ARNm que está presente a un nivel más elevado en células diferenciadas que en las células correspondientes no diferenciadas (concretamente, el nivel de ARNm es al menos 2 veces más elevado). Una molécula de ADNc asociada a la diferenciación es una secuencia correspondiente a un ARNm asociado a la diferenciación (y/o una secuencia complementaria).

Dichas moléculas de ADNc pueden prepararse a partir de preparaciones de ARN o de ARNm utilizando técnicas estándar como la transcripción inversa. De manera similar, una proteína o un polipéptido asociado a la diferenciación comprende la secuencia codificada por un ARNm asociado a la diferenciación celular.

Las composiciones farmacéuticas descritas en la presente pueden incluir uno o varios polipéptidos, secuencias de ácidos nucleicos y/o anticuerpos. Los polipéptidos de la presente invención comprenden al menos una porción de la proteína asociada a la modulación de la proliferación celular o una variante de la misma. Las secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención comprenden una secuencia de ADN o ARN que codifica al menos una porción de dicho polipéptido o que es complementaria de dicha secuencia codificante.

Los anticuerpos son proteínas del sistema inmune, o fragmentos de fijación a antígeno del mismo, que son capaces de fijarse a una porción de los polipéptidos descritos anteriormente.

Como alternativa, una composición puede comprender uno o varios agentes que modulan la expresión del gen asociado a la modulación de la proliferación celular.

Polinucleótidos, polipéptidos y proteínas según la invención:

La presente invención tiene como objeto particularmente los polinucleótidos de secuencia SEC ID Nº 4, SEC ID Nº 5 o SEC ID Nº 9, así como el polipéptido o la proteína de secuencia SEC ID Nº 8.

La invención comprende igualmente polinucleótidos que poseen secuencias polinucleotídicas homólogas al menos a un 75%, preferiblemente al menos a un 85%, y aún más preferiblemente al menos a un 90%, hasta a un 95%, con las secuencias de polinucleótidos descritas anteriormente, particularmente con las secuencias SEC ID Nº 4, SEC ID Nº 5 y SEC ID Nº 9. Esto se aplica igualmente según el caso a otros polinucleótidos, polipéptidos y proteínas que forman parte de la invención, particularmente a la proteína de secuencia SEC ID Nº 8.

La presente invención tiene como objeto polinucleótidos o polipéptidos aislados. Un polinucleótido o un polipéptido se denomina "aislado" si se saca fuera de su entorno original. Particularmente, un polinucleótido o un polipéptido está aislado si se separa del material biológico con el que coexiste en el sistema natural.

Según la invención, las secuencias polinucleotídicas que codifican los polipéptidos o proteínas de la invención, y los fragmentos o proteínas de fusión de estos polipéptidos y proteínas, pueden utilizarse para generar moléculas de ADN recombinante que dirigen la expresión de estos polipéptidos o proteínas, o de una porción activa de los mismos, en células huésped apropiadas. Como alternativa, las secuencias polinucleotídicas que hibridan con porciones de secuencias de polinucleótidos según la invención pueden utilizarse igualmente en los ensayos de hibridación de ácidos nucleicos, transferencia Southern, transferencia Northern, etc.

A causa de la degeneración del código genético, pueden utilizarse otras secuencias de ADN que codifican sustancialmente la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos o proteínas de la invención para la clonación y la expresión de dichos polipéptidos o proteínas. Dichas secuencias de ADN incluyen aquellas capaces de hibridar con las secuencias polinucleotídicas de los polinucleótidos de la invención en ciertas condiciones de rigor que pueden ajustarse de varias maneras. Por ejemplo, en la reacción de polimerización en cadena (PCR), pueden ajustarse la temperatura a la que se hibridan los cebadores con la matriz o las concentraciones de MgCl_{2} en el tampón de reacción. En la utilización de fragmentos de ADN radiomarcados, o de oligonucleótidos para sondear membranas, el rigor puede ajustarse cambiando las fuerzas iónicas de las soluciones de lavado o controlando con precaución la temperatura de lavado.

La invención comprende particularmente los polinucleótidos que presentan una homología de al menos un 75% con el polinucleótido de secuencia SEC ID Nº 4, SEC ID Nº 5 o SEC ID Nº 9. El grado de homología expresado en porcentaje se calcula como sigue:

100-100 x (N'/N)

representando N' el número de nucleótidos modificados con respecto a la secuencia SEC ID Nº 4, SEC ID Nº 5 o SEC ID Nº 9, y N el número de nucleótidos de SEC ID Nº 4, SEC ID Nº 5 o SEC ID Nº 9.

Preferiblemente, dicha secuencia nucleotídica homóloga hibrida específicamente con la secuencia complementaria de la secuencia SEC ID Nº 4, SEC ID Nº 5 o SEC ID Nº 9 en condiciones rigurosas. Los parámetros que definen las condiciones de rigor dependen de la temperatura a la que un 50% de las cadenas apareadas se separan (Tm).

Para las secuencias que comprenden más de 30 bases, según Sambrook y col. ("Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989), Tm se define por la relación:

Tm = 81,5 + 0,41 \ x \ (% \ G+C) + 16,6 \ x \ log[cationes] - 0,63 \ x \ (% \ formamida) - (600/ \ número \ de \ bases)

Para la presente invención, las condiciones de rigor se denominarán "fuertes" cuando se utilice una temperatura de hibridación 10ºC inferior a la Tm y tampones de hibridación que contengan una disolución 6 x SSC (cloruro de sodio 0,9 M y citrato de sodio 0,09 M). En dichas condiciones, los polinucleótidos de secuencias específicas no hibridarán con el polinucleótido de la secuencia complementaria de la secuencia SEC ID Nº 4, SEC ID Nº 5 ni SEC ID Nº 9.

Las secuencias de ADN alteradas que pueden utilizarse según la presente invención incluyen las deleciones, adiciones o sustituciones de diferentes residuos de nucleótidos que dan como resultado una secuencia que codifica el mismo producto génico o de función equivalente. El producto génico puede contener igualmente deleciones, adiciones o sustituciones de residuos de aminoácidos en las secuencias de las proteínas de la invención, que dan como resultado los cambios denominados silenciosos, produciendo así polipéptidos y proteínas de función equivalente.

Dichas sustituciones de aminoácidos pueden realizarse basándose en la polaridad, la carga, la solubilidad, la hidrofobicidad, la hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los restos implicados.

Por ejemplo, los aminoácidos cargados negativamente incluyen ácido aspártico y ácido glutámico, los aminoácidos cargados positivamente incluyen lisina y arginina, los aminoácidos con grupos polares que tienen valores de hidrofobicidad similares incluyen leucina, isoleucina, valina; glicina, alanina; asparagina, glutamina; serina, treonina; fenilalanina, tirosina.

Las secuencias de ADN de la presente invención pueden modificarse para alterar las secuencias de polinucleótidos según la invención por numerosas razones, incluyendo de manera no limitativa alteraciones que codifican el procesamiento y la expresión del producto génico. Por ejemplo, pueden introducirse mutaciones utilizando técnicas bien conocidas por el experto en la técnica, por ejemplo, mutagénesis dirigida, inserción de nuevos sitios de restricción, alteración de las glicosilaciones, fosforilación, etc.

Particularmente, en ciertos sistemas de expresión como la levadura, la célula huésped puede sobreglicosilar el producto génico. En dicho sistema, es preferible alterar las secuencias polinucleotídicas para eliminar los sitios de glicosilación. En el conjunto de la divulgación de la presente invención figuran igualmente secuencias polinucleotídicas modificadas unidas a secuencias heterólogas para codificar una proteína de fusión. La proteína de fusión puede modificarse para contener un sitio de escisión localizado entre la secuencia de la proteína según la invención (por ejemplo, la secuencia SEC ID Nº 8), y la secuencia de la proteína heteróloga, de tal modo que la secuencia de la proteína según la invención pueda escindirse de la parte heteróloga.

Polinucleótidos asociados a la modulación de la proliferación celular:

Cualquier polinucleótido que codifica un polipéptido asociado a la modulación de la proliferación celular o una porción o una variante del mismo como se describe en la presente está cubierto por la presente invención. Dichos polinucleótidos puede ser monocatenarios (codificantes o antisentido) o bicatenarios, y pueden ser de ADN (genómico, ADNc o sintético) o de moléculas de ARN.

Los polinucleótidos asociados a la diferenciación pueden prepararse utilizando cualquier técnica disponible para el experto en la técnica. Por ejemplo, dicho polinucleótido puede amplificarse mediante una reacción de polimerización en cadena (PCR) a partir de ADNc preparado a partir de células o de tejidos humanos. Para este enfoque, pueden diseñarse y encargarse o sintetizarse cebadores específicos; estos cebadores están basados en la secuencia de dicho polinucleótido. Puede utilizarse a continuación una porción amplificada para aislar el gen completo a partir de un banco humano de ADN genómico o a partir de un banco de ADNc de cualquier célula o cualquier tejido, ya sea normal, tumoral o diferenciado, gracias a técnicas bien conocidas por el experto en la técnica y brevemente recordadas a continuación. Como alternativa, puede construirse un gen completo a partir de varios fragmentos de PCR. Las moléculas de ADNC que codifican una proteína asociada la diferenciación, o una porción de la misma, pueden prepararse igualmente examinando un banco de ADNc obtenido, por ejemplo, a partir de ARNm de células o de tejidos. Dichas bibliotecas pueden estar comercialmente disponibles o pueden prepararse utilizando técnicas clásicas (véase Sambrook y col., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

Como alternativa, pueden emplearse otras técnicas de examen bien conocidas por el experto en la técnica.

Puede secuenciarse una molécula de ADNc asociada a la diferenciación utilizando las técnicas clásicas que utilizan enzimas como el fragmento de Klenow de ADN polimerasa I, sequenasa IX (US Biochemical Corp., Cleveland, OH, Estados Unidos), polimerasa Taq (Perkin Elmer, Foster City, CA, Estados Unidos), polimerasa T7 termoestable (Amersham, Chicago, IL, Estados Unidos) o una combinación de polimerasas recombinantes y de exonucleasas con actividad de relectura como el sistema de amplificación elongasa (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, Estados Unidos). Puede utilizarse un sistema de secuenciación automática con la ayuda de instrumentos disponibles en suministradores comerciales como Perkin Elmer y Pharmacia.

Puede utilizarse la secuencia parcial de un ADNc para identificar una secuencia polinucleotídica que codifica la proteína completa asociada a la modulación de la proliferación celular utilizando técnicas clásicas bien conocidas por el experto en la técnica. Entre estas técnicas, se examina una biblioteca de ADNc utilizando una o varias sondas polinucleotídicas utilizando las propiedades de recombinación de RecA (ClonCapture cDNA Selection Kit, Clontech Laboratories, Estados Unidos).

Para las técnicas de hibridación, puede radiomarcarse una secuencia parcial (por ejemplo, mediante translación de corte o mediante marcaje de los extremos utilizando ^{32}P o ^{33}P) utilizando técnicas clásicas. Se examina a continuación una biblioteca de bacterias o de bacteriófagos mediante hibridación sobre filtros que contienen las colonias bacterianas desnaturalizadas (o las improntas que contienen las placas de fagos) con la sonda marcada (véase Sambrook y col., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratores, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Las colonias positivas o placas se seleccionan a continuación y se amplifican, y se aísla el ADN para análisis futuros.

La secuencia completa puede determinarse a continuación utilizando técnicas estándar. Las secuencias superpuestas se ensamblan a continuación en una secuencia única continua. Puede generarse una molécula de ADNc completa mediante ligamiento de los fragmentos de interés utilizando técnicas clásicas.

Como alternativa, existen numerosas técnicas basadas en la amplificación para la obtención de una secuencia codificante completa a partir de una secuencia parcial de ADNc. Entre ellas, la amplificación se realiza generalmente mediante PCR. Puede utilizarse para las etapas de amplificación el conjunto de kits disponibles comercialmente. Los cebadores pueden diseñarse utilizando, por ejemplo, software bien conocido en la técnica. Los cebadores nucleotídicos son preferiblemente moléculas de 20 a 30 nucléotidos que tienen un contenido de guanina y citosina de al menos un 50% y que hibridan con la secuencia diana a temperaturas comprendidas entre 50 y 72ºC. La región amplificada puede secuenciarse como se describe anteriormente y ensamblarse las secuencias superpuestas en una secuencia
continua.

Entre los enfoques alternativos, pueden encontrarse secuencias adyacentes a la secuencia parcial mediante amplificación con un cebador de la secuencia de enlace y un cebador específico de una región conocida. Las secuencias amplificadas se someten a continuación a un segundo ciclo de amplificación.

Las técnicas adicionales incluyen PCR de captura (Lagerstrom y col., "PCR Methods Applic." (1991), 1, 111-119) y PCR progresiva (Parker y col., Nucl. Acids. Res. (1991), 19, 3055-3060). Pueden emplearse igualmente otros métodos que utilizan la amplificación para la obtención de una secuencia completa de ADNc.

Es posible obtener una secuencia de ADNc completa analizando las secuencias depositadas en las bases públicas "marcadores de secuencia expresada" (EST en inglés) disponibles a partir de Genbank. Pueden realizarse investigaciones de recuperación de los EST utilizando programas informáticos bien conocidos por el experto en la técnica (por ejemplo, NCBI BLAST) y pueden utilizarse dichos EST para generar una secuencia completa continua.

Las variantes de secuencias polinucleotídicas descritas anteriormente (particularmente las secuencias SEC ID Nº 4, SEC ID Nº 5 y SEC ID Nº 9) están igualmente incluidas en el alcance de la presente invención. Las variantes polinucleotídicas pueden contener una o varias sustituciones, deleciones o inserciones (véase también anteriormente la parte titulada "Polinucleótidos, polipéptidos y proteínas según la invención").

Puede utilizarse igualmente una porción de la secuencia complementaria de la secuencia codificante (concretamente, un polinucleótido antisentido) como sonda o como modulador de la expresión génica. Los constructos de ADNc que pueden transcribirse a ARN antisentido pueden introducirse en células o en tejidos para facilitar la producción de ARN antisentido. Puede utilizarse un polinucleótido antisentido, como se describe en la presente, para inhibir la expresión de un gen asociado a la modulación de la proliferación celular. La tecnología antisentido puede utilizarse para controlar la expresión génica al formar una triple hélice, lo que compromete la capacidad de la doble hélice de abrirse suficientemente para la fijación de polimerasas, factores de transcripción o moléculas de regulación (véase Gee y col., en Huber y Carr, "Molecular and Immunologic Approaches" (1994), Futura Publishing Co., Mt. Kisco, NY). Como alternativa, puede utilizarse una molécula antisentido para hibridar con una región de control del gen (por ejemplo, un promotor o un sitio de iniciación de la transcripción) y bloquear la transcripción del gen, o bloquear la traducción inhibiendo la fijación de ribosomas al transcrito.

Los polinucleótidos pueden modificarse a continuación para aumentar su estabilidad in vivo. Las modificaciones posibles incluyen (pero sin limitación): la adición de secuencias a los extremos 5' y/o 3'; la utilización de fosforotioato o de 2'-O-metilo en lugar de enlaces fosfodiesterasa en la cadena principal; y/o la introducción de bases como inosina, queosina y wybutosina al igual que acetiladenina, metiltioadenina y otras formas modificadas de adenina, citidina, guanina, timina y uridina.

Por otro lado, se han descrito ya anteriormente otras variaciones de polinucleótidos de la presente invención en la parte titulada: "Polinucleótidos, polipéptidos y proteínas según la invención".

Las secuencias de nucleótidos como se describen en la presente invención pueden unirse a otras secuencias nucleotídicas utilizando técnicas establecidas de ADN recombinante. Por ejemplo, puede clonarse un polinucleótido en un gran panel de vectores de expresión, incluyendo plásmidos, fagémidos, derivados del fago lambda y cósmidos. Los vectores de particular interés incluyen vectores de expresión, vectores de replicación y vectores de secuenciación. En general, un vector contiene un origen de replicación funcional en al menos un organismo, sitios de restricción de endonucleasa convenientes y uno o varios marcadores de selección. La presencia de otros elementos dependerá de la utilización específica deseada por el experto en la técnica, que seleccionará las características del vector de expresión en función de sus necesidades y de las técnicas disponibles.

Los polinucleótidos pueden formularse para entrar en la célula y expresar el polipéptido correspondiente. Dichas formulaciones son particularmente útiles en terapia como se describe a continuación.

Los expertos en la técnica apreciarán que existen varios medios para expresar un polinucleótido en una célula diana, y que puede emplearse cualquier técnica adecuada. Por ejemplo, puede incorporarse un polinucleótido a un vector vírico como un adenovirus o un retrovirus (pero también en otros). Las técnicas para incorporar el ADN en dichos vectores son bien conocidas por el experto en la técnica. Un vector retrovírico puede transferir o incorporar un gen de un marcador de selección y/o una entidad directora como un gen que codifica el ligando de un receptor específico de una célula diana, con el fin a volver al vector específico de diana.

Otras formulaciones para los polinucleótidos incluyen los sistemas de dispersión coloidales como los complejos macromoleculares, nanocápsulas, microesferas, bolas y sistemas basados en la utilización de lípidos, incluyendo las emulsiones aceite/agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. El sistema coloidal preferido para una utilización de suministro de producto in vitro e in vivo es el liposoma (concretamente, una vesícula membranosa artificial).

Polipéptidos asociados a la modulación de la proliferación celular:

En el conjunto de la divulgación, los polipéptidos de la presente invención comprenden al menos una porción de la proteína asociada a la modulación de la proliferación celular o de una variante de la misma, siendo dicha porción inmunológica y/o biológicamente activa. Dichos polipéptidos pueden tener cualquier longitud, incluyendo la proteína completa, un oligopéptido (concretamente, consistente en una serie relativamente limitada de aminoácidos, como 8-10 residuos, unidos por enlaces peptídicos) o un péptido de tamaño intermedio. Un polipéptido puede comprender igualmente secuencias adicionales.

Un polipéptido es inmunológicamente activo, en el contexto de la presente invención, si es reconocido por un receptor de superficie de células B y/o T. La actividad inmunológica puede ensayarse utilizando técnicas clásicas como las resumidas por Paul, "Fundamental Immunology", 3ª ed., 243-247 (Raven Press, 1993). Dichas técnicas incluyen el examen de polipéptidos derivados del polipéptido nativo para determinar su capacidad de reaccionar con un antisuero específico de antígeno y/o estirpes de células T o clones que pueden prepararse según métodos tradicionales. Una porción inmunológicamente activa de la proteína asociada a la modulación de la proliferación celular reacciona con dichos antisueros y/o células T y no es significativamente más débil que la reactividad del polipéptido completo (por ejemplo, en un ensayo ELISA y/o en un ensayo de reactividad de células T). Dichos exámenes pueden realizarse generalmente utilizando métodos bien conocidos por el experto en la técnica como los descritos en Harlow y Lane, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988.

Los epítopos de células B y T pueden predecirse igualmente utilizando técnicas informáticas.

Como alternativa, pueden identificarse porciones inmunogénicas utilizando un análisis informático como el programa Tsites® (véase Rothbard y Taylor, EMBO J. (1988), 7, 93-100; Deavin y col., Mol. Immunol. (1996), 33, 145-155), que investiga los restos peptídicos que tienen el potencial de desencadenar una respuesta. Los restos peptídicos apropiados para la fijación a complejos mayores de histocompatibilidad de clase I o II (MHC) de múrido o humano pueden identificarse según el método BIMAS (Parker y col., J. Immunol. (1994), 152: 163, 1994). Para confirmar la inmunogenicidad, puede ensayarse un péptido utilizando un ratón transgénico HLA A2 y/o un ensayo in vitro de estimulación utilizando células dendríticas, fibroblastos o células de sangre periférica.

De manera similar, un polipéptido es "biológicamente activo" si posee una o varias funciones estructurales, reguladoras y/o bioquímicas a partir de la proteína nativa asociadas a la modulación de la proliferación celular. La presencia de una actividad biológica puede determinarse según métodos bien conocidos por el experto en la técnica.

Por ejemplo, los estudios de comparación de secuencias pueden indicar una actividad biológica particular de la proteína. Los ensayos que tienden a evaluar dicha actividad pueden utilizarse entonces basándose en ensayos ya conocidos en la técnica.

Ciertas porciones de otras variantes de dichas proteínas deberán mostrar igualmente esta propiedad según un ensayo in vitro o in vivo.

Como ya se ha mencionado, los polipéptidos según la presente invención pueden comprender una o varias porciones de una variante de la proteína endógena en la que la porción es inmunológica y/o biológicamente activa (concretamente, la porción presenta una o varias características antigénicas, inmunogénicas y/o biológicas de la proteína completa). Preferiblemente, dicha porción es al menos tan activa como la proteína total en ensayos que permiten la detección de dichas propiedades. Un polipéptido "variante" es un polipéptido que difiere de la proteína nativa por sustituciones, inserciones, deleciones y/o modificaciones de aminoácidos. Ciertas variantes contienen sustituciones conservativas. "Una sustitución conservativa" es una sustitución en la que un aminoácido se sustituye por otro aminoácido que tiene las mismas propiedades, como las determinadas por el experto en la técnica que no espera ningún cambio en la estructura secundaria, así como en la naturaleza hidropática del polipéptido. Las sustituciones de aminoácidos pueden realizarse generalmente basándose en la similitud de polaridad, de carga, de solubilidad, de hidrofobicidad, de hidrofilicidad y/o de la naturaleza anfipática de los residuos. Por ejemplo, los aminoácidos cargados negativamente incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos cargados positivamente incluyen lisina y arginina; y los aminoácidos no cargados polares que tienen valores de hidrofobicidad similares incluyen leucina, isoleucina y valina; glicina y alanina; asparagina y glutamina; serina, treonina, fenilalanina y tirosina. Otros grupos de aminoácidos que pueden representar cambios conservativos son particularmente los siguientes: (1) Ala, Pro, Gly, Glu, Asp, Gln, Asn, Ser, Thr; (2) Cys, Ser, Tyr, Thr; (3) Val, Ile, Leu, Met, Ala, Phe; (4) Lys, Arg, His; y (5) Phe, Tyr, Trp, His. Una variante puede contener igualmente, o como alternativa, cambios no conserva-
tivos.

Las variantes que forman parte de esta invención incluyen igualmente polipéptidos en los que la estructura primaria de la proteína nativa se modifica mediante la formación de conjugados covalentes o no con otros polipéptidos o estructuras químicas como grupos lipídicos o grupos glicosilo o acetilfosfato.

La presente invención incluye igualmente polipéptidos con o sin restos de glicosilación. Los polipéptidos expresados en sistemas de expresión de levadura o de células de mamíferos pueden ser, en términos de peso molecular y de esquema de glicosilación, similares o ligeramente diferentes a la molécula nativa según el sistema de expresión utilizado.

La expresión de ADN en bacterias como E. coli conduce a moléculas no glicosiladas. Los sitios de N-glicosilación de proteínas eucarióticas se caracterizan por el triplete de aminoácidos Asn-A1-Z en el que A1 es cualquier aminoácido excepto Pro y Z es una serina o una treonina.

Se incluyen igualmente en la presente invención los alelos de la proteína asociada a la modulación de la proliferación celular. Los alelos son formas alternativas de la proteína nativa resultantes de una o varias mutaciones (pueden ser aminoácidos suprimidos, añadidos o sustituidos) que conducen a un ARN alterado. Las proteínas alélicas pueden diferir en la secuencia, pero la estructura global, así como la función, son sustancialmente similares. La proteína asociada la modulación de la proliferación celular, las variantes y las porciones de la misma pueden prepararse en general a partir de ácidos nucleicos que codifican el polipéptido deseado utilizando técnicas clásicas. Para preparar la proteína endógena, puede utilizarse un ADNc aislado.

Se han descrito ya por otra parte otras variaciones de los polipéptidos y proteínas de la presente invención anteriormente en la parte titulada: "Polipéptidos y polinucleótidos según la invención".

Para preparar una variante polipeptídica, pueden utilizarse técnicas estándar de mutagénesis, como la mutagénesis dirigida, utilizando un oligonucleótido dirigido.

En general, pueden emplearse cualquier vector de expresión conocido por los expertos en la técnica para expresar polipéptidos recombinantes de esta invención. La expresión puede obtenerse en cualquier célula huésped apropiada que se haya transformado o transfectado con un vector de expresión que contiene una secuencia de ADN que codifica el polipéptido recombinante. Las células huésped convenientes incluyen células procarióticas, eucarióticas superiores o de levadura. Preferiblemente, las células huésped empleadas son E. coli, células de levadura o células de mamíferos como COS, CHO, MCF7 (células tumorales humanas aisladas a partir de un carcinoma de mama) o DU 145 (células tumorales humanas aisladas a partir de un cáncer de próstata).

Después de la expresión, el sobrenadante de los sistemas huésped/vector que secretan la proteína recombinante o el polipéptido al medio de cultivo puede concentrarse en un primer momento utilizando técnicas clásicas como la precipitación alcohólica o la filtración con ayuda de filtros comerciales. Después de la etapa de concentración, el producto resultante puede aplicarse sobre una matriz de purificación adecuada como una matriz de afinidad o una resina de intercambio de iones. Puede emplearse una o varias etapas de HPLC para proseguir la purificación del polipéptido.

Ciertas porciones y otras variantes pueden generarse igualmente por medios sintéticos utilizando técnicas bien conocidas por el experto en la técnica. Por ejemplo, las porciones y otras variantes que tienen menos de 500 aminoácidos, preferiblemente menos de 100 aminoácidos, y más preferiblemente menos de 50 aminoácidos, pueden sintetizarse por vía química. Los polipéptidos pueden sintetizarse utilizando técnicas de síntesis sobre fase sólida disponibles comercialmente, como el método de síntesis sobre resina de Merrifield en el que los aminoácidos se añaden secuencialmente a una cadena de aminoácidos a lo largo de la síntesis (véase Merrifield, J. Am. Chem. Soc. (1963), 85, 2149-2146). Están igualmente disponibles numerosas otras técnicas de síntesis sobre fase sólida (por ejemplo, el método de Roberge y col., Science (1995), 269, 202-204). Los equipamientos para la síntesis automática de polipéptidos están comercialmente disponibles en suministradores como Applied Biosystems, Inc. (Foster City, CA, Estados Unidos); la síntesis de polipéptidos puede realizarse entonces siguiendo las recomendaciones del constructor.

Polinucleótidos o polipéptidos aislados:

En general, los polipéptidos y polinucleótidos descritos en la presente invención están aislados. Un polipéptido o un polinucleótido "aislado" es un polinucleótido o un péptido apartado de su entorno original. Por ejemplo, una proteína natural está aislada si se separa del material biológico con el que coexiste en el sistema natural. Un polinucleótido se considera aislado si, por ejemplo, se clona en un vector que no forma parte del entorno natural.

Secuencias señal:

Están disponibles métodos para predecir si una proteína posee una secuencia señal, al igual que para predecir el punto de escisión para esta secuencia. Por ejemplo, el método de McGeoch (Virus Res. (1985), 3, 271-286) utiliza la información de una secuencia corta cargada N-terminal de una región no cargada de la proteína completa (no escindida). El método de Von Heinje (Nucleic Acid Res. (1986), 14, 4683-4690) utiliza la información de los residuos que rodean al sitio de escisión. La precisión de la predicción de los puntos de escisión de las proteínas secretadas conocidas de mamíferos para cada uno de estos métodos es de 75-80%. Sin embargo, los dos métodos no predicen siempre los mismos sitios de escisión para una proteína dada.

En el presente caso, la secuencia deducida de aminoácidos del polipéptido secretado se ha analizado por un programa informático llamado SignalP (Sequence Analysis Software Package of the Genetic Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705, Estados Unidos). Este programa informático predice la localización celular de una proteína basada en la secuencia de aminoácidos.

Es igualmente reconocido que, en ciertos casos, la escisión de la secuencia señal de una proteína secretada no es uniforme, dando así como resultado la formación de varias especies moleculares. Estos polipéptidos y los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos están cubiertos por la presente invención.

Además, la secuencia señal identificada por el análisis mencionado anteriormente puede no ser predictiva de la secuencia señal natural. Por ejemplo, la secuencia señal natural puede estar cadena arriba o cadena abajo de la secuencia predicha. Sin embargo, es probable que dicha secuencia señal sea capaz de dirigir la proteína secretada hacia el retículo endoplasmático. Estos polipéptidos y los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos están cubiertos por la presente invención.

Los sitios de escisión varían a veces de una especie a otra y no pueden predecirse con seguridad.

Las secuencias de aminoácidos, partiendo de la metionina, se identifican por las secuencias determinadas codificadas por los polinucleótidos, aunque otras fases de lectura pueden traducirse fácilmente utilizando técnicas de biología molecular bien conocidas por el experto en la técnica. Los polipéptidos producidos por estas fases de lectura alternativa abiertas están igualmente considerados por la presente invención.

Anticuerpos y fragmentos de los mismos:

La presente invención proporciona agentes de fijación, como los anticuerpos que se fijan específicamente a la proteína asociada a la modulación de la proliferación celular. Dicho agente se dice que "se fija específicamente" a la proteína de modulación de la proliferación celular si reacciona a un nivel detectable (por ejemplo, por un ensayo ELISA) con una proteína asociada a la modulación de la proliferación celular o una porción o una variante de la misma y no reacciona de manera detectable con otras proteínas. La "fijación" se refiere a una asociación no covalente entre dos moléculas separadas de tal modo que se forme un complejo. La capacidad de fijación puede evaluarse, por ejemplo, mediante la determinación de la constante de fijación para la formación del complejo. La constante de fijación es el valor obtenido cuando el valor de la concentración del complejo se divide entre el producto de los valores de concentración de los componentes. En general, se dice que dos productos "están fijados" cuando la constante de fijación alcanza 103 l/mol. La constante de fijación puede determinarse utilizando métodos bien conocidos por el experto en la técnica.

Cualquier agente capaz de responder a los criterios anteriores puede considerarse un agente fijador.

En la presente invención, un agente de fijación es preferiblemente un anticuerpo o un fragmento del mismo. Los anticuerpos pueden prepararse mediante cualquier técnica disponible para el experto en la técnica (véase Harlow y Lane, "Antibodies. A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). En general, los anticuerpos pueden producirse mediante técnicas de cultivo celular que incluyen la generación de anticuerpos monoclonales o mediante transfecciones de genes de anticuerpos en células huésped de bacterias o de mamíferos con el fin de producir anticuerpos recombinantes.

Entre otras técnicas, se preferirá emplear las descritas a continuación. Se inyecta un inmunógeno que contiene el polipéptido en un grupo de mamíferos (por ejemplo, ratones, ratas, conejos, carneros o cabras). En esta etapa, los polipéptidos de la presente invención pueden servir como inmunógenos sin modificación. Como alternativa, y particularmente para péptidos de pequeño tamaño, puede inducirse una respuesta inmune superior si el polipéptido está unido a una proteína de transporte como la albúmina de suero bovino o la hemocianina de lapa. Se inyecta el inmunógeno en el animal huésped, preferiblemente según un esquema predeterminado, y se saca sangre a los animales periódicamente. Pueden purificarse así anticuerpos policlonales específicos del polipéptido a partir de dichos antisueros, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad utilizando el péptido acoplado a un soporte sólido adecuado.

Proteínas de fusión:

Puede realizarse cualquier gen de fusión por el experto en la técnica para analizar la localización subcelular de una proteína según la invención, particularmente la localización subcelular de la proteína de secuencia SEC ID Nº 8. Están disponibles comercialmente numerosas construcciones plasmídicas como la proteína glutation-S-transferasa (GST) o proteínas fluorescentes como la proteína fluorescente verde (GFP) o también, de manera no exhaustiva, un marcaje de poli-histidina.

Se subcultivan células huésped eucarióticas humanas (por ejemplo, HEK-293) durante 24 h antes del protocolo de transfección, permitiendo un metabolismo normal de las células y una mejor eficacia de transfección. Se han realizado concentraciones crecientes (1, 5 y 10 \mug) de vector que contiene sólo la proteína indicadora (GFP, GST o marcaje de histidina) o de vector que contiene el polinucleótido de secuencia SEC ID Nº 4, el polinucleótido de secuencia SEC ID Nº 5 o el polinucleótido de secuencia SEC ID Nº 9 fusionado con la proteína indicadora utilizando el reactivo Effectene® según las recomendaciones del fabricante (Qiagen).

Se analizan a continuación las células por microscopía confocal, por ejemplo, para detectar la localización de la proteína. Si la proteína es sospechosa de ser secretada, por ejemplo, se recuperan los sobrenadantes, se liofilizan, se depositan sobre gel de acrilamida y se analizan mediante la técnica de transferencia Western con la ayuda de anticuerpos dirigidos contra la proteína indicadora.

Composiciones farmacéuticas:

Según ciertos aspectos de la invención, pueden incorporarse productos tales como polipéptidos, anticuerpos y/o ácidos nucleicos a composiciones farmacéuticas o vacunas. Las composiciones farmacéuticas comprenden uno o varios de estos productos y uno o varios excipientes (vehículos) farmacéuticamente aceptables. Ciertas composiciones farmacéuticas utilizables eventualmente como vacunas podrán comprender uno o varios polipéptidos y un activador de la respuesta inmune como un coadyuvante o un liposoma (al que se incorpora el producto). Las composiciones farmacéuticas y las vacunas pueden contener además un sistema de administración como microesferas biodegradables. Las composiciones farmacéuticas y las vacunas en el conjunto de la divulgación de la presente invención pueden contener igualmente otros productos que pueden ser biológicamente activos o inactivos.

Una composición farmacéutica o una vacuna puede contener ADN que codifica uno o varios polipéptidos como los descritos anteriormente, de tal manera que el polipéptido se genera in situ. Como se menciona anteriormente, el ADN puede estar presente en cualquier forma de administración conocida por el experto en la técnica, incluyendo sistemas de expresión de ácidos nucleicos, bacterianos o víricos. Los sistemas de expresión de ácidos nucleicos apropiados contienen las secuencias de ADN necesarias para la expresión en el paciente.

Los sistemas de administración basados en una bacteria implican la administración de una bacteria (como el bacilo de Calmette-Guérin) que expresa una porción inmunogénica del polipéptido en su superficie. Preferiblemente, el ADN puede introducirse utilizando un sistema de expresión vírico (por ejemplo, un poxvirus, un retrovirus o un adenovirus) que implica la utilización de agentes no patógenos (defectivos).

Aunque puede emplearse cualquier vehículo adecuado conocido por el experto en la técnica en las composiciones farmacéuticas de esta invención, el tipo de vehículo variará según el modo de administración elegido. Las composiciones de la presente invención podrán formularse para cada modo de administración apropiado incluyendo, por ejemplo, las vías tópica, nasal, intravenosa, intracraneal, intraperitoneal, subcutánea e intramuscular.

Para una administración parenteral, como una inyección subcutánea, el vehículo contiene preferiblemente agua, sal, alcohol, grasa, parafina o un tampón. Para una administración oral, puede emplearse cualquier vehículo citado anteriormente o un vehículo sólido como manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, talco, celulosa, glucosa, sacarosa y carbonato de magnesio. Pueden utilizarse también microesferas biodegradables como vehículos para las composiciones farmacéuticas de esta invención. Para ciertas aplicaciones tópicas, se prefieren formulaciones como cremas o lociones.

Dichas composiciones pueden comprender igualmente tampones (por ejemplo, soluciones salinas tamponadas neutras o fosfato), carbohidratos (por ejemplo glucosa, manosa, sacarosa o dextranos), manitol, proteínas, polipéptidos o aminoácidos como glicina, antioxidantes, agentes quelantes como EDTA o glutation, coadyuvantes (por ejemplo, hidróxido de aluminio) y/o agentes protectores. Como alternativa, las composiciones de la presente invención pueden presentarse en forma de un liofilizado. Los productos pueden encapsularse igualmente en liposomas utilizando técnicas clásicas.

Según la invención, cada una de las variedades de coadyuvantes puede utilizase en vacunas para inducir la respuesta inmune. La mayor parte de los coadyuvantes contiene una sustancia que protege al antígeno de un catabolismo rápido, como hidróxido de aluminio o aceite mineral, y un estimulante de respuestas inmunes como el lípido A, proteínas derivadas de Bordetella pertussis o Mycobacterium tuberculosis. Están comercialmente disponibles coadyuvantes adecuados como, por ejemplo: coadyuvante de Freund y coadyuvante completo (Difco Laboratories, Detroit, MI, Estados Unidos; coadyuvante Merck 65 (Merck and Company Inc., Rahway, NJ, Estados Unidos)), microesferas biodegradables; lípido A monofosforilado; y citocinas como GM-CSF o interleucina-2, -7 ó
-12.

Las composiciones descritas anteriormente pueden administrarse igualmente en forma de formulaciones de retardo (concretamente, una formulación como una cápsula o una esponja que desencadena la liberación lenta de producto después de la administración). Dichas formulaciones pueden prepararse generalmente utilizando tecnologías bien conocidas por el experto en la técnica y administrarse, por ejemplo, por vía oral, rectal o en implante subcutáneo o mediante implante en el sitio diana deseado. Las formulaciones de retardo pueden contener un polipéptido, un polinucleótido o un anticuerpo dispersado en una matriz transportadora y/o contenido en un depósito protegido por una membrana de difusión. Los vehículos para la utilización de dichas formulaciones son biocompatibles y deben ser igualmente biodegradables; preferiblemente, la formulación proporciona un nivel relativamente constante de liberación del componente activo. La cantidad de producto activo contenida en la formulación de retardo depende del sitio de implantación.

Terapia anticancerosa:

Según otros aspectos de la presente invención, los productos descritos pueden utilizarse en terapia anticancerosa. Particularmente, los polinucleótidos y polipéptidos asociados a la modulación de la proliferación celular pueden utilizarse para inhibir el crecimiento e inducir una modulación de la proliferación celular en tumores específicos de mama o de próstata.

Dichos polipéptidos o polinucleótidos pueden utilizarse igualmente para la terapia de numerosos carcinomas, incluyendo melanomas, las múltiples formas de glioblastomas, carcinomas de pulmón, así como cánceres colorrectales. Los agentes que activan la expresión de dichos polipéptidos o polinucleótidos pueden emplearse igualmente en el marco de estas terapias.

Según estos aspectos de la invención, los productos (que pueden ser polipéptidos o ácidos nucleicos) se incorporan preferiblemente a composiciones farmacéuticas como se describen anteriormente.

Los pacientes adecuados para la terapia son todos los animales de sangre caliente, y preferiblemente el ser humano. Un paciente elegible para una terapia según la invención puede diagnosticarse o no como aquejado por un cáncer. Dicho de otro modo, las composiciones farmacéuticas descritas anteriormente pueden utilizarse así para inhibir el desarrollo de un cáncer en diferentes estados de la enfermedad (para prevenir la aparición de un cáncer o para tratar un paciente afectado por un cáncer).

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se administrarán de manera apropiada para cada cáncer específico a tratar.

La vía, la duración y la frecuencia de administración se determinarán en función del estado del paciente, del tipo y de la gravedad de la enfermedad, y del método de administración. Las vías y frecuencias de administración pueden variar de un individuo a otro. En general, las composiciones farmacéuticas y las vacunas pueden administrarse mediante inyección (por ejemplo, por vía intracutánea, intramuscular, intravenosa o subcutánea), por vía intranasal (por ejemplo, por inhalación) o por vía oral. Preferiblemente, pueden administrarse entre 1 y 10 dosis durante un periodo de 52 semanas. Pueden ser apropiados protocolos alternativos para cada paciente individualmente.

En general, una dosificación apropiada y un régimen de tratamiento contienen el producto activo en cantidad suficiente para proporcionar un beneficio terapéutico y/o profiláctico. Dicha respuesta puede estar seguida por el establecimiento de una evolución clínica mejorada (por ejemplo, remisiones más frecuentes, una supervivencia completa, parcial o más larga con ausencia de enfermedad) en los pacientes tratados comparados con los pacientes no tratados o tratados con dosis menores.

Según otros aspectos de la presente invención, puede administrarse un polipéptido a dosis que varían de 100 \mug a 5 mg. Las moléculas de ADN que codifican dichos polipéptidos pueden administrarse generalmente en cantidad suficiente para generar niveles comparables de polipéptidos. Las dosificaciones apropiadas pueden determinarse generalmente utilizando modelos experimentales y/o ensayos clínicos. En general, se prefiere la utilización de la dosis mínima suficiente para proporcionar una terapia eficaz. Generalmente, se pueden seguir los pacientes en lo referente a la eficacia de la terapia utilizando ensayos adecuados para las condiciones de tratamiento o de prevención que resultarán familiares para el experto en la técnica.

Métodos de detección y de seguimiento del cáncer:

Los polipéptidos, polinucleótidos y anticuerpos descritos en la presente invención pueden utilizarse en numerosos métodos para la detección de cáncer en un paciente. La presencia de polipéptidos y/o de polinucleótidos asociados a la modulación de la proliferación celular como los descritos en la presente invención en células de un huésped es indicativa de la diferenciación y de la detención del crecimiento celular. Así, las secuencias asociadas a la modulación de la proliferación celular pueden utilizarse como marcadores de distinción entre células normales y células malignas (y permitir al médico que interpretará los resultados diagnosticar, por ejemplo, carcinomas de próstata, de mama, de pulmón y de colon). Las secuencias asociadas a la modulación de la proliferación celular pueden utilizarse igualmente como marcadores de seguimiento del tratamiento.

Los métodos que comprenden la utilización de anticuerpo pueden permitir al experimentador detectar la presencia o la ausencia de un polipéptido descrito en la presente invención en cualquier muestra biológica disponible. Las muestras biológicas disponibles incluyen biopsias de tejidos tumorales y de tejidos sanos, de homogeneizado o de extractos de dichos tejidos obtenidos de un paciente. Existe un gran número de tipos de ensayos conocidos por el experto en la técnica para la utilización de anticuerpos para la detección de marcadores polipeptídicos en una muestra (véase, por ejemplo, Harlow y Lane, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).

Por ejemplo, puede realizarse un ensayo según la técnica de transferencia Western, en la que se somete una preparación de proteína a un gel de electroforesis, se transfiere a una membrana adecuada y se somete a reacción con un anticuerpo. La presencia de un anticuerpo sobre la membrana puede detectarse a continuación utilizando un reactivo de detección adecuado como se describe a continuación.

Según otros aspectos de la invención, pueden realizarse ensayos que comprenden la utilización de un anticuerpo inmovilizado sobre un soporte sólido fijado al polipéptido. El polipéptido fijado puede detectarse utilizando un segundo anticuerpo u otros reactivos que contienen un grupo marcador. Como alternativa, puede utilizarse un ensayo competitivo en el que un polipéptido está marcado con un grupo indicador y permite la fijación al anticuerpo inmovilizado después de la incubación del anticuerpo con la muestra. La facultad según la cual los componentes de la muestra inhiben la fijación del polipéptido marcado al anticuerpo es indicativa de la reactividad de la muestra con el anticuerpo inmovilizado, y por tanto, indicativa de la concentración de polipéptido en la muestra.

El soporte sólido puede ser cualquier material conocido por el experto en la técnica sobre el que el anticuerpo pueda unirse. Por ejemplo, el soporte sólido puede ser un pocillo de ensayo de una placa de microvaloración o un filtro de nitrocelulosa o cualquier otra membrana adecuada. Como alternativa, el soporte puede ser una bola, vidrio, material plástico o látex como poliestireno o poli(cloruro de vinilo). El soporte puede ser igualmente una partícula magnética.

El anticuerpo puede inmovilizarse sobre soporte sólido utilizando una variedad de técnicas conocidas por el experto en la técnica y descritas ampliamente en la bibliografía científica. En el contexto de la presente invención, el término "inmovilización" se refiere tanto a una asociación no covalente, como la adsorción, como a un enlace covalente (que puede ser un enlace directo entre el antígeno y los grupos funcionales sobre el soporte o un enlace mediante la utilización de agente enlazante). Se prefiere la inmovilización por adsorción a un pocillo de una placa de microvaloración o a una membrana. En este caso, la adsorción puede conseguirse presentando el anticuerpo, en un tampón adecuado, ante un soporte sólido durante un tiempo adecuado. El tiempo de contacto varía según la temperatura, pero típicamente está comprendido entre 1 hora y 1 día. En general, la presentación de un pocillo de una placa de plástico (poliestireno o poli(cloruro de vinilo, por ejemplo)) de microvaloración ante una cantidad de anticuerpo de 1 pg a 10 ng y, preferiblemente de 100 a 200 ng, es suficiente para inmovilizar una cantidad adecuada del polipéptido.

Puede crearse igualmente un enlace covalente del anticuerpo a un soporte sólido haciendo reaccionar el soporte con un reactivo bifuncional que reacciona con el soporte y el grupo funcional, como hidroxilo o un grupo amina, en el anticuerpo. Por ejemplo, el anticuerpo puede unirse de manera covalente a soportes recubiertos de polímero apropiado utilizando benzoquinona o mediante condensación de un grupo aldehído sobre el soporte con una amina e hidrógeno activo sobre el asociado según técnicas clásicas.

En ciertos casos, el ensayo para la detección de un polipéptido en una muestra es el ensayo de doble anticuerpo "sándwich". Este ensayo puede realizarse presentando el anticuerpo inmovilizado sobre un soporte sólido, habitualmente el pocillo de una placa de microvaloración, ante la muestra biológica, de tal modo que el polipéptido en la muestra pueda fijarse al anticuerpo inmovilizado. Los productos no fijados se suprimen del complejo polipéptido-anticuerpo y se añade un segundo anticuerpo (que contiene un grupo indicador) capaz de fijarse sobre diferentes sitios del polipéptido. La cantidad de anticuerpo secundario que queda fijada al soporte sólido se determina a continuación utilizando un método apropiado específico del grupo indicador.

Más específicamente, cuando el anticuerpo se inmoviliza sobre el soporte definido anteriormente, los sitios de fijación de la proteína típicamente se bloquean. Puede utilizarse cualquier agente bloqueante conocido por el experto en la técnica, como albúmina de suero bovino o Tween 20™ (Sigma Chemical CO., St. Louis, MO, Estados Unidos). Se incuba a continuación el anticuerpo inmovilizado con la muestra, y el polipéptido puede fijarse al anticuerpo. La muestra puede diluirse en un diluyente adecuado, como solución salina tamponada con fosfato (PBS), antes de la incubación.

En general, el tiempo de contacto apropiado (concretamente, el tiempo de incubación) es el periodo de tiempo suficiente para la detección de la presencia del polipéptido dentro de la muestra obtenida a partir de un individuo. Preferiblemente, el tiempo de contacto así definido es suficiente para conseguir un nivel de fijación de al menos un 95% del conseguido en el equilibrio entre el péptido fijado y el péptido no fijado. El experto en la técnica será consciente de que el tiempo necesario para conseguir el equilibrio debe determinarse midiendo el nivel de fijación que se produce durante un periodo de tiempo. A temperatura ambiente, generalmente es suficiente un tiempo de incubación de 30 minutos. Los productos no fijados pueden retirarse a continuación mediante lavado del soporte sólido con un tampón apropiado como solución salina tamponada con fosfato que contiene 0,1% de Tween 20™. El segundo anticuerpo, que contiene un grupo indicador, puede añadirse a continuación sobre el soporte sólido.

Los grupos indicadores comprenden preferiblemente enzimas (como peroxidasa), sustratos de cofactores, inhibidores de colorantes, grupos luminiscentes, grupos fluorescentes y biotina. La conjugación del anticuerpo con el grupo indicador puede realizarse utilizando métodos estándar conocidos por el experto en la técnica.

El segundo anticuerpo se incuba a continuación con el complejo anticuerpo-polipéptido inmovilizado durante un tiempo suficiente, permitiendo la detección del polipéptido fijado.

Puede determinarse generalmente el tiempo apropiado midiendo el nivel de fijación que se produce durante un periodo de tiempo. El segundo anticuerpo no fijado se retira a continuación y se detecta el segundo anticuerpo fijado utilizando un grupo indicador. El método utilizado para la detección del grupo indicador depende de la naturaleza del grupo indicador. Para grupos radiactivos, son generalmente apropiados métodos de recuento de centelleo o autorradiográficos. Los métodos espectroscópicos pueden utilizarse para detectar colorantes, grupos fluorescentes o luminiscentes. La biotina puede detectarse utilizando avidina, acoplada a un grupo indicador (habitualmente un grupo radiactivo o fluorescente o una enzima). Los grupos indicadores enzimáticos pueden detectarse generalmente mediante la adición de un sustrato (generalmente durante un periodo de tiempo adecuado), seguido de un análisis espectroscópico (u otro) de los productos de reacción.

Para determinar la presencia o ausencia de un cáncer, la señal detectada del grupo indicador fijado al soporte sólido se compara generalmente con la señal correspondiente al valor establecido a partir de un tejido no tumoral. Preferiblemente, el valor límite es la señal media obtenida cuando el anticuerpo inmovilizado se incuba con muestras de pacientes sin cáncer. En general, se considera como indicativa una muestra que genera una señal correspondiente a 3 veces más o 3 veces menos la desviación estándar del valor límite predeterminado.

Para más precisiones, el experto en la técnica se referirá a la publicación siguiente: Sackett y col., "Clinical Epidemiology. A basic Science for Clinical Medicine", pág. 106-107 (Little Brown and Co., 1985).

La presencia o ausencia de un cáncer en un paciente puede determinarse igualmente evaluando las proporciones de ARNm que codifica el polipéptido de la presente invención en la muestra biológica (por ejemplo una biopsia) respecto a un valor límite predeterminado.

Dicha evaluación puede realizarse utilizando un gran número de métodos conocidos por el experto en la técnica como, por ejemplo, hibridación in situ y amplificación mediante reacción de polimerización en cadena (PCR). Las sondas y los cebadores utilizados en dichos métodos pueden generarse generalmente a partir de secuencias enumeradas en los ejemplos, o a partir de secuencias similares identificadas en otros individuos. Las sondas pueden utilizarse en técnicas de hibridación clásicas, y pueden marcarse con un agente de detección para facilitar la detección de la sonda. Dichos reactivos comprenden (pero no están limitados a): radionucleidos, colorantes fluorescentes y enzimas capaces de catalizar la formación de productos detectables.

Los cebadores pueden utilizarse generalmente en métodos de detección que incluyen la reacción de polimerización en cadena (PCR) como la PCR-TI, en la que la PCR se aplica junto con la transcripción inversa. Típicamente, se extrae ARN de una muestra de tejido y se transcribe de manera inversa para la producción de moléculas de ADNc. La amplificación por PCR utilizando cebadores específicos genera moléculas de ADNc asociadas a la modulación de la proliferación celular, que pueden separarse y visualizarse utilizando, por ejemplo, gel de electroforesis. La amplificación se realiza típicamente sobre muestras obtenidas a partir de pares de tejido tumoral y no tumoral de un mismo individuo, o también a partir de pares de tejidos tumoral y no tumoral de individuos diferentes. La reacción de amplificación puede realizarse con diluciones sucesivas de ADNc que cubren 2 órdenes de magnitud. Una modificación de un factor 2 o más de la expresión en las diluciones de la muestra tumoral comparada con las mismas diluciones de la muestra no tumoral se considera típicamente como indicativa.

Por otro lado, pueden realizarse directamente sobre el tumor ciertos ensayos con vistas a establecer un diagnóstico.

Dicho ensayo implica el contacto de células tumorales con un anticuerpo o un fragmento del mismo que se fija a una proteína asociada a la modulación de la proliferación celular. El anticuerpo fijado o un fragmento del mismo puede detectarse directa o indirectamente mediante un grupo indicador. Dichos anticuerpos pueden utilizarse igualmente en aplicaciones histológicas. Como alternativa, puede utilizarse un polinucleótido antisentido en dichas aplicaciones.

Según otros aspectos de la presente invención, la progresión y/o la respuesta a un tratamiento de un cáncer puede seguirse realizando cualquiera de los ensayos descritos anteriormente durante un periodo de tiempo y evaluar el cambio de nivel de la respuesta (concretamente, la cantidad de polipéptido o de ARNm detectado). Por ejemplo, los ensayos pueden realizarse todos los meses durante un periodo de 1 a 2 años. En general, un cáncer progresa en los pacientes en los que el nivel de la respuesta disminuye a lo largo del tiempo. En contraposición, un cáncer no progresa cuando la señal detectada permanece constante o aumenta a lo largo del tiempo.

La presente invención proporciona igualmente kits para la utilización del conjunto de métodos de diagnóstico descritos anteriormente. Dichos kits comprenden dos componentes (o más) necesarios para la realización de dichos ensayos. Dichos componentes pueden ser los productos, los reactivos y/o los recipientes o equipos. Por ejemplo, un recipiente en el interior de un kit puede contener un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo que se une específicamente a un polipéptido asociado a la modulación de la proliferación celular. Dichos anticuerpos o fragmentos pueden proporcionarse unidos a un material soporte como se describe anteriormente. Uno o varios recipientes adicionales pueden contener elementos como reactivos o tampones para utilizar en el ensayo. Dichos kits pueden contener igualmente un reactivo de detección (por ejemplo un anticuerpo) que contiene un grupo indicador conveniente para una detección directa o indirecta del anticuerpo fijado.

Métodos para la identificación de agentes de fijación o de modulación:

La presente invención proporciona además métodos para la identificación de productos que se fijan a y/o que modulan la expresión de proteínas asociadas a la modulación de la proliferación celular. Dichos agentes pueden identificarse generalmente poniendo en contacto un polipéptido proporcionado en la presente invención con un producto/un agente candidato en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la interacción con el polipéptido y/o su efector (por ejemplo, su receptor). Puede realizarse así cada variedad de ensayo de fijación bien conocida por el experto en la técnica para ensayar la capacidad de un producto candidato a la fijación al polipéptido o a su efector (por ejemplo su receptor).

En otros ensayos, los agentes pueden examinarse utilizando células conocidas por tener un aumento de la expresión del gen asociado a la modulación de la proliferación celular. Dichas células pueden ponerse en contacto con agentes candidatos y evaluarse la expresión del gen asociado a la modulación de la proliferación celular con relación a la expresión observada en ausencia de agente candidato.

Como alternativa, en los productos candidatos puede examinarse su capacidad de modular la expresión (por ejemplo la transcripción) de una proteína asociada a la modulación de la proliferación celular. Para evaluar el efecto de un agente candidato sobre la expresión de la proteína asociada a la modulación de la proliferación celular, puede unirse un promotor o un elemento de regulación del mismo a un gen indicador como se describe anteriormente. Dicho constructo puede transfectarse en células huésped convenientes, las cuales se pondrán en contacto con el agente candidato.

Dichas células huésped se utilizarán preferiblemente para el examen de bibliotecas de moléculas pequeñas resultantes de programas de química combinatoria. Según esta variante preferida, las células se incuban con la biblioteca; a continuación se lisan las células y se analiza en el sobrenadante la actividad del gen indicador según protocolos estándar.

Los productos que aumentan la actividad del gen indicador son inductores de la transcripción del gen asociado a la modulación de la proliferación celular, y pueden utilizarse así para inhibir la progresión del cáncer.

A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que el comprendido corrientemente por un especialista normal de la técnica a la que pertenece esta invención. Igualmente, todas las publicaciones, solicitudes de patentes, todas las patentes y todas las demás referencias mencionadas en la presente se incorporan como referencia.

Los ejemplos siguientes se presentan para ilustrar los procedimientos anteriores, y no deben considerarse en modo alguno como una limitación del alcance de la invención.

Ejemplos Ejemplo 1 Aislamiento y caracterización de los fragmentos de ADNc de SEC ID Nº 4 y SEC ID Nº 5

Se ha seleccionado la secuencia de ADN SEC ID Nº 1, presente en la base pública que contiene los EST (Genbank, número de acceso AA176076), y se reproduce a continuación:

1

A partir de esta secuencia, se han sintetizado un par de cebadores 5' Fwdl y 3' Revl de secuencias respectivas SEC ID Nº 2 y SEC ID Nº 3 (reproducidas a continuación) con el fin de obtener una sonda que permita la clonación del ADNc completo que contiene el marco abierto de lectura completo que codifica el gen correspondiente.

Las secuencias SEC ID Nº 2 y SEC ID Nº 3 son las siguientes:

-: SEC ID Nº 2: 5'-CTG ACC TTT CAG TTT TCC ATA GC-3'

-: SEC ID Nº 3: 5'-ATC TAT TTC TGC CAA ACA AGA A-3'

En un primer momento, se realiza una reacción de polimerización en cadena (PCR) sobre una serie de bancos de ADNc disponibles comercialmente utilizando los cebadores de secuencias SEC ID Nº 2 y SEC ID Nº 3. Las condiciones de reacción incluyen 0,5 \muM de Fwdl (SEC ID Nº 2) y de Revl (SEC ID Nº 3), 200 \muM de desoxinucleótidos trifosfato (o dNTP: dATP, dCTP, dGTP y dTTP), Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM y 0,5 U de ADN polimerasa Taq en un volumen final de 50 \mul. Los parámetros de los ciclos térmicos comprenden una desnaturalización a 94ºC durante 30 s, una hibridación de los cebadores a 60ºC durante 1 minuto y una extensión de polimerización a 72ºC durante 30 s (con una extensión final de 5 minutos).

Los productos obtenidos mediante la PCR se separan sobre gel de agarosa al 1% y se visualizan con ayuda de coloración con bromuro de etidio. Los resultados muestran una banda de 245 pares de bases en los bancos de ADNc de cerebro, hipófisis, pulmón, riñón e intestino humano (Quantum) y de 290 pares de bases en un banco de ADNc de mama y de próstata humana. Estos resultados se reproducen en la Figura 1.

Los productos así obtenidos mediante la PCR se purifican mediante electrodilución y se utilizan como sonda para la clonación del ADNc que contiene el marco abierto de lectura completo utilizando las recomendaciones del fabricante para la utilización del kit de clonación de ADNc ClonCapture (Clontech).

Las secuencias de ácidos nucleicos de clones positivos se determinan con ayuda de un secuenciador automático. Se trata de las secuencias SEC ID Nº 4 y SEC ID Nº 5, reproducidas a continuación:

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-: SEC ID Nº 4:

2

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-: SEC ID Nº 5:

3

Ejemplo 2 Clonación en un vector de expresión de SEC ID Nº 4 y SEC ID Nº 5

Las secuencias de ácidos nucleicos SEC ID Nº 4 y SEC ID Nº 5 dan lugar a la síntesis de nuevos cebadores en 5' F1 y en 3' R1 de secuencias respectivas SEC ID Nº 6 y SEC ID Nº 7 (reproducidas a continuación). Estas secuencias contienen respectivamente los sitios de restricción HindIII y EcoRI.

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Las secuencias SEC ID Nº 6 y SEC ID Nº 7 son las siguientes:

-: SEC ID Nº 6: 5'-GCA AGC TTG CGG GGG AGG AGG AGG G-3'

-: SEC ID Nº 7: 5'-CGG AAT TCC CGG GGG GAA TCG CAG-3'

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Se realiza una reacción PCR utilizando las mismas condiciones de reacción que las descritas en el ejemplo 1 con los cebadores de SEC ID Nº 6 y SEC ID Nº 7. Los productos obtenidos mediante dicha reacción PCR pueden insertarse directamente en un vector de expresión de tipo, pero no exclusivamente, pCDNA3.1 (Invitrogen). Después de la etapa de amplificación mediante PCR, se someten los productos a una hidrólisis con HindIII y EcoRI con el fin de liberar los extremos que contienen estas secuencias, purificadas después a partir de gel de agarosa mediante electroelu-
ción.

Las secuencias SEC ID Nº 4 y SEC ID Nº 5 se insertan a continuación en un vector de expresión como, por ejemplo, pCDNA3.1 (Invitrogen). El análisis mediante digestión con enzimas de restricción convenientes de diferentes clones bacterianos que han recibido dicho vector de expresión permite aislar los clones que contienen la nueva construcción "vector de expresión/SEC ID Nº 4" o "vector de expresión/SEC ID Nº 5".

La preparación en gran cantidad de estas construcciones plasmídicas se realiza con ayuda de un kit de purificación de ADN plasmídico (Qiagen).

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Propiedades de los polinucleótidos de secuencias SEC ID Nº 4 y SEC ID Nº 5 Expresión de polinucleótidos de secuencias SEC ID Nº 4 y SEC ID Nº 5 en tejidos tumorales humanos Preparación de ARN a partir de cultivos celulares y de tejidos tumorales

Las células en cultivo o los tejidos tumorales se conservan a -80ºC antes de las etapas de extracción de los ARN totales. La extracción de los ARN totales está basada en una técnica descrita en la bibliografía científica (Chomczynski y Sacchi, Anal. Biochem. (1987), 162, 156) con ayuda del reactivo Trizol (Gibco/BRL). La calidad de los ARN así extraídos se analiza sobre gel de agarosa al 1% en presencia de bromuro de etidio.

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Transcripción inversa a partir de ARN

Los ARN totales se transcriben de forma inversa con cebadores oligo(dT) utilizando la transcriptasa inversa Superscript® como se sugiere en el manual del fabricante (Gibco/BRL).

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Reacción de polimerización en cadena (PCR) sobre los productos obtenidos a partir de la transcripción inversa

Se realiza el análisis de la expresión de las secuencias SEC ID Nº 4 o SEC ID Nº 5 mediante reacción de polimerización en cadena (PCR) sobre los productos de la transcripción inversa utilizando los cebadores en 5' Fwdl y en 3' Revl de secuencias respectivas SEC ID Nº 2 y SEC ID Nº 3. Las condiciones de reacción incluyen 0,5 \muM de Fwdl y Revl, dNTP 200 \muM, Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM y 0,5 U de ADN polimerasa Taq en un volumen final de 50 \mul. Los parámetros de los ciclos térmicos comprenden una desnaturalización a 94ºC durante 30 s, una hibridación de los cebadores a 60ºC durante 1 minuto y una extensión de polimerización a 72ºC durante 30 s (con una extensión final de 5 minutos).

Los productos obtenidos mediante la PCR se separan sobre gel de agarosa al 1% y se visualizan con la ayuda de coloración con bromuro de etidio.

En ciertos casos, se ha realizado un análisis de hibridación sobre membrana de nailon utilizando como sonda la secuencia SEC ID Nº 4 marcada con alfa-P32-dCTP utilizando un kit de marcaje aleatorio (Pharmacia). A continuación, se lava la membrana en condiciones de bajo rigor (2 x SSC, 0,1% de SDS a 60ºC), después en condiciones de alto rigor (0,1 x SSC, 0,1% de SDS a 65ºC). A continuación, se expone la membrana a una película Kodak
XAR.

Análisis de la expresión de polinucleótidos de secuencias SEC ID Nº 4 y SEC ID Nº 5 en muestras de tumores de mama

Se ha realizado el análisis de la expresión de polinucleótidos de secuencias SEC ID Nº 4 y SEC ID Nº 5 sobre 15 muestras tumorales extraídas por cirugía de pacientes aquejados de tumores de mama.

Se han normalizado los ADNc obtenidos según el protocolo descrito anteriormente con la ayuda de un marcador expresado de modo estable G3PDH (gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa) con el fin de controlar las variaciones de cantidad de ARN o de ADNc entre las muestras. Los productos de la reacción PCR se han hibridado a continuación sobre una membrana de nailon según el protocolo descrito anteriormente.

Los resultados obtenidos, representados en la Figura 2, muestran que, mediante este enfoque, puede visualizarse la presencia de polinucleótidos de secuencias SEC ID Nº 4 y SEC ID Nº 5 en muestras tumorales de carcinomas mamarios.

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Inhibición de la proliferación celular mediante los polinucleótidos de secuencias SEC ID Nº 4 y SEC ID Nº 5

Se cultivan células de tumor de próstata DU 145 (código ATCC) en medio DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco) que contiene 100 U/ml de penicilina y sulfato de estreptomicina 100 \mug/ml, complementado con suero de ternero fetal al 10%. Se subcultivan las células durante 24 h antes del protocolo de transfección, permitiendo un metabolismo normal de las células y una mejor eficacia de transfección. Se han realizado concentraciones crecientes (1, 5 y 10 \mug) de vector solo (pCDNA3.1) o de vector que contiene el polinucleótido de secuencia SEC ID Nº 4 (1, 5 y 10 \mug) o el polinucleótido de secuencia SEC ID Nº 5 (1, 5 y 10 \mug) utilizando el reactivo Effectene® según las recomendaciones del fabricante (Qiagen).

Se recuperan las células 48 h después de la transfección mediante un tratamiento con tripsina y después se recuentan. Al mismo tiempo, se centrifugan las células a 5.000 rpm y después se congelan a -80ºC para una extracción de ARN como se describe anteriormente (véase la parte titulada "Preparación de ARN a partir de cultivos celulares y de tejidos tumorales").

Se reproducen los resultados en la Figura 3 (polinucleótido de secuencia SEC ID Nº 4) y la Figura 4 (polinucleótido de secuencia SEC ID Nº 5). Indican que el ADNc que codifica el polinucleótido de secuencia SEC ID Nº 4 o el que codifica el polinucleótido de secuencia SEC ID Nº 5 se expresan de manera proporcional a la cantidad de vector de expresión que contiene el polinucleótido de secuencia SEC ID Nº 4 o el polinucleótido de secuencia SEC ID Nº 5 (parte A). Además, los resultados indican que el crecimiento de células está inhibido de manera significativa en presencia de concentraciones crecientes de vector de expresión que contiene el polinucleótido de secuencia SEC ID Nº 4 o el polinucleótido de secuencia SEC ID Nº 5 con respecto al crecimiento de células transfectadas con 10 \mug de vector solo (parte B). La correlación entre la inhibición del crecimiento de células tumorales y la cantidad de vector transfectado que contiene el polinucleótido de secuencia SEC ID Nº 4 o el polinucleótido de secuencia SEC ID Nº 5 es igual a 1 o a 0,96, respectivamente.

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Polipéptido codificado a partir de un fragmento de secuencia SEC ID Nº 5

En la secuencia SEC ID Nº 5, se observa un marco abierto de lectura con la presencia de un codón iniciador (ATG) que codifica una metionina iniciadora en posición 420 y un codón de paro (UAA) en posición 861. Al polinucleótido así traducido le corresponde una proteína de secuencia SEC ID Nº 8 compuesta por 147 aminoácidos y reproducida a continuación:

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4

\newpage

El polinucleótido al que corresponde la proteína de secuencia SEC ID Nº 8 posee una secuencia nucleotídica SEC ID Nº 9 reproducida a continuación:

5

Leyenda de las figuras

La Figura 1 representa los resultados obtenidos mediante PCR después de separación sobre gel de agarosa al 1% y visualización con la ayuda de coloración con bromuro de etidio.

La Figura 2 representa los resultados obtenidos mediante transferencia Southern sobre 15 muestras de carcinomas mamarios (nombrados de S1 a S15).

La Figura 3 muestra, en su parte A, la expresión del ADNc que codifica el polinucleótido de secuencia SEC ID Nº 4 en células DU 145 (tumor de próstata) y, en su parte B, la inhibición del crecimiento de células en presencia de concentraciones crecientes de vector de expresión que contiene el polinucleótido de secuencia SEC ID Nº 4.

Finalmente, la Figura 4 muestra, en su parte A, la expresión del ADNc que codifica el polinucleótido de secuencia SEC ID Nº 5 en células DU 145 (tumor de próstata) y, en su parte B, la inhibición del crecimiento de células en presencia de concentraciones crecientes de vector de expresión que contiene el polinucleótido de secuencia SEC ID Nº 5.

<110> Societé de Conseils de Recherches et d'Application

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<120> Nuevo polinucleótido utilizable para modular la proliferación de células cancerosas

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<130> RS 314 PCT-Hap 1

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<140>

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<141>

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<150> FR 01/02801

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<151> 03-01-2001

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<160> 9

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<170> PatentIn Ver 2.1

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<210> 1

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<211> 576

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

6

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<210> 2

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<211> 23

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido 5'

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<400> 2

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\hskip-.1em\dddseqskip

ctgacctttc agttttccat agc

\hfill

23

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<210> 3

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido 3'

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<400> 3

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\hskip-.1em\dddseqskip

atctatttct gccaaacaag aa

\hfill

22

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<210> 4

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<211> 1009

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<300>

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<308> Genbank: AK000755

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<400> 4

7

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<210> 5

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<211> 1055

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 5

8

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<210> 6

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<211> 25

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido 5'

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<400> 6

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\hskip-.1em\dddseqskip

gcaagcttgc gggggaggag gaggg

\hfill

25

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<210> 7

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido 3'

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<400> 7

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cggaattccc ggggggaatc gcag

\hfill

24

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<210> 8

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<211> 147

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 8

9

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<210> 9

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<211> 444

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 9

10

Claims

1. Polinucleótido aislado que comprende la secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 5.

2. Polinucleótido antisentido que comprende la secuencia complementaria de la del polinucleótido según la reivindicación 1.

3. Polinucleótido aislado de secuencia nucleotídica SEC ID Nº 9.

4. Polinucleótido aislado de secuencia nucleotídica complementaria de la secuencia nucleotídica SEC ID Nº 9.

5. Polinucleótido aislado de secuencia SEC ID Nº 8.

6. Anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se fija específicamente a un polipéptido aislado según la reivindicación 5.

7. Vector de expresión que comprende un polinucleótido aislado de secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 5.

8. Célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión según la reivindicación 7.

9. Polipéptido aislado según la reivindicación 5 para utilización como medicamento.

10. Composición farmacéutica que comprende un polipéptido aislado de secuencia SEC ID Nº 8 con uno o varios excipientes farmacéuticamente aceptables.

11. Utilización de un polipéptido aislado de secuencia SEC ID Nº 8 para preparar un medicamento destinado a prevenir o tratar un cáncer.