ES2308227T3 - Antagonistas de integrina alfavbeta3 y alfavbeta6 como agentes antifibroticos. - Google Patents

Abstract

Uso de un antagonista de integrina alfavBeta6 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de fibrosis hepática biliar secundaria, en el que dicho antagonista es: ácido 3-{3-benciloxi-2-[5-(piridin-2-ilamino)-pentanoilamino]-propanoilamino}-3-(3,5-diclorofenil)-propiónico.

Description

Antagonistas de integrina \alphav\beta3 y \alphav\beta6 como agentes antifibróticos.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a la inhibición de integrinas \alphav, especialmente integrinas \alphav\beta6, mediante el antagonista no específico EMD 409849, ácido 3-{3-benciloxi-2-[5-(piridin-2-ilamino)-pentanoilamino]-propanoilamino}-3-(3,5-diclorofenil)-propiónico, que regula a la baja la fibrogénesis inhibiendo la migración y la producción celular de moléculas profibrogénicas (por ejemplo, colágenos, TIMP-1) y citoquinas (por ejemplo, CTGF, TGF\beta1,2) por células estrelladas hepáticas activadas, miofibroblastos y fibroblastos activados y epitelios y endotelios activados. Este antagonista solo o en combinación con otros agentes puede prevenir, mitigar o incluso invertir eficazmente el desarrollo de fibrosis avanzada, tal como fibrosis del hígado.

Antecedentes de la invención y técnica anterior

Las células estrelladas hepáticas y los miofibroblastos (HSC/MF) activados representan un papel principal en el desarrollo de enfermedades hepáticas crónicas. Depositan un exceso de componentes de la matriz extracelular que conduce a fibrosis y finalmente cirrosis. La cirrosis se define como la distorsión arquitectónica del hígado con anormalidades vasculares y funcionales graves. Las consecuencias son hipertensión portal, con desarrollo de ascitis y hemorragia variceal esofágica, encefalopatía y propensión a infecciones a menudo letales. Ciertos receptores de tipo célula-célula y especialmente célula-matriz, principalmente integrinas, son notablemente regulados al alza en endotelios y HSC/MF activados, transmitiendo señales migratorias, promotoras del crecimiento y otras profibrogénicas.

Así, la activación de la integrina \alphav\beta3 media en la activación y la migración de HSC/MF en respuesta a citoquinas profibrogénicas, tales como PDGF-AB/BB, y regula al alza su expresión de citoquinas profibrogénicas, tales como CTGF, un factor que estimula la síntesis de colágeno de un modo auto- y para-crino.

De forma similar, se encuentra una regulación al alza drástica de integrina \alphav6\beta6 en células epiteliales activadas, particularmente en epitelios de conductos biliares proliferativos de hígados fibróticos, que promueve además la fibrogénesis activando la liberación de la membrana basal y otras proteínas profibrogénicas y factores de crecimiento que activan HSC/MF.

El tratamiento de enfermedades hepáticas fibróticas y cirrosis con antagonistas de integrinas \alphav\beta3 y \alphav\beta6 específicos puede bloquear la migración y la activación de células endoteliales, HSC/MF y epiteliales, y así mitigar o incluso invertir la fibrogénesis. Puesto que, análogamente al a hígado, las células similares a miofibroblastos y epiteliales activadas son fundamentales en la patogénesis de otras enfermedades fibróticas progresivas, los antagonistas de integrinas \alphav\beta3 y \alphav6\beta6 específicos también pueden usarse para tratar trastornos fibróticos de otros órganos, por ejemplo el páncreas, el intestino, los pulmones, el corazón, los riñones, las arterias o la piel.

Las integrinas son una familia de receptores celulares de transmembrana que median en interacciones entre células y entre células y la matriz extracelular. La pérdida de contactos mediados por integrinas conduce habitualmente a apoptosis. Los receptores de integrinas están compuestos por una subunidad \alpha y una \beta que pueden estar presentes en al menos 24 combinaciones diferentes, teniendo cada una sus propias especificidades de unión y propiedades de señalización. La subfamilia de cadena \beta3 consiste en dos integrinas, \alphaIIb\beta3 y \alphav\beta3. \alphaIIv\beta3 se expresa en plaquetas y megacariocitos y participa en la formación de trombos. \alphav\beta3 es una integrina no plaquetaria expresada por células endoteliales, miofibroblásticas y algunas inflamatorias (1-3). La cadena de integrina \beta6 se encuentra principalmente en células epiteliales y ciertos fibroblastos/miofibroblastos activados y forma un heterodímero solamente con la subunidad av (4).

Varios informes han mostrado que la expresión elevada de \alphav\beta3 parece estar estrechamente asociada con la transformación oncogénica y la progresión de tumores, es decir, propiedades invasivas y metastáticas de células tumorales humanas. Se cree que la expresión inducida de integrina \alphav\beta3 sobre la superficie de células endoteliales es esencial para la migración, la proliferación y la tubulogénesis de células endoteliales (5). En los últimos años se ha hecho evidente que la adhesión mediada por integrinas a proteínas de la matriz extracelular (ECM) se requiere para el crecimiento y la supervivencia de la mayoría de los tipos de células (2). La ruptura de la adhesión detiene a las células en la fase G1 y provoca apoptosis. Se encontró que la integrina \alphav\beta3 representa un papel fundamental durante la angiogénesis inhibiendo la apoptosis de células endoteliales (6). La sobreexpresión de \alphav\beta3 en células de ovario de hámster chino potencia la actividad de Rho y realza la formación de fibras (7), factores que están relacionados con la adhesión, la migración y la activación.

La regulación al alza del sistema PDFG (BB)-receptor de PDGFB representa un papel importante durante la fibrogénesis, es decir la formación y deposición de novo de matriz extracelular (ECM) en órganos tales como el hígado (8). El receptor de PDGF\beta activado puede coinmunoprecipitarse junto con integrina \alphav\beta3 (9), y se ha observado que \alphav\beta3 interactúa con el motivo RGD del péptido asociado con la latencia (LAP\beta1) de factor de crecimiento transformante beta (TGF\beta) (10), lo que puede tener implicaciones en el cáncer y un número de enfermedades inflamatorias y fibróticas en las que la expresión de ambas proteínas representa un papel importante.

\alphav\beta3 es esencial para la migración de células del músculo liso y endoteliales y la formación de vasos sanguíneos en tejido de granulación. Hasta ahora, el papel potencial de \alphav\beta3 en fibrosis hepática y fibrosis de otros órganos ha seguido estando fundamentalmente inexplorado (11-19).

La integrina \alphav\beta6 se encuentra predominantemente en células epiteliales y fibroblásticas activadas. Es drásticamente regulada al alza durante la lesión tisular (20-22). Los ratones que carecen de esta subunidad de integrina muestran una sorprendente resistencia a la inducción de fibrosis pulmonar (20). La activación y la proliferación de células epiteliales de los conductos biliares es un hallazgo regular en la lesión hepática crónica y la fibrosis, y los epitelios de conductos biliares proliferativos son una fuente principal de factores profibrogénicos, tales como TGF\beta1, TGF\beta2 y CTGF, y ciertas proteínas ECM en la fibrosis hepática, en particular la fibrosis biliar (23, 24).

Se considera que HSC/MF y miofibroblastos son los principales tipos de células responsables de la deposición de ECM en exceso durante la fibrogénesis hepática activa. Se ha observado que sintetizan y liberan varios tipos de colágenos, especialmente los colágenos formadores de fibrillas tipo I y III de tejidos cicatrizales, laminina-2, fibronectina y TIMP-1, el principal inhibidor de colagenasas y otros (12-19, 25-27). La migración de estas células es crucial para su acumulación en zonas de lesión hepática. Después de la activación, HSC/MF cultivados migran en respuesta a varios estímulos, incluyendo factores de crecimiento, tales como PDGF-AB, PDGF-BB, sustancias vasoactivas, tales como endotelina-1, y quimioquinas, tales como proteína quimiotáctica de monocitos (MCP-1) (28-30).

HSC/MF expresan un número de integrinas cuyos ligandos son principalmente moléculas de la ECM que transducen señales extracelulares desde la ECM hasta las células, de acuerdo con citoquinas/factores de crecimiento (señalización cruzada) (1-3). Varias actividades de HSC/MF pueden ser reguladas por integrinas, incluyendo la proliferación, la contracción, la migración celular y la síntesis de ECM (1-3). Por otra parte, las integrinas también pueden activar TGF\beta latente, ampliando así la actividad fibrogénica de esta citoquina clave (10, 22). Por lo tanto, modular farmacológicamente la interacción entre HSC/MF y la ECM circundante interfiriendo con la señalización de integrinas es una estrategia potencial para limitar la fibrosis hepática y la fibrosis de otros órganos.

Aunque la migración de HSC/MF in vivo es difícil de medir, las sustancias que inhiben la migración de HSC/MF in vitro son candidatos primordiales para reducir su acumulación en hígado lesionado. Además, la inhibición de la activación, la migración y la proliferación de células endoteliales y epiteliales y endoteliales de los conductos biliares puede suprimir adicionalmente la fibrogénesis en un hígado crónicamente lesionado.

Lo siguiente ilustra el impacto clínico de enfermedades fibrosantes crónicas, según se ejemplifica por la fibrosis hepática. El escenario es similar para todas las enfermedades fibrosantes, tales como las que afectan a los pulmones, los riñones, el intestino, el páncreas, la piel o las arterias. Se estima que solo en Alemania, con una población de 100 millones, alrededor de 500.000 sufren cirrosis hepática, el estadio final de enfermedades hepáticas crónicas, y que el grado de mortandad anual debido a la cirrosis está entre 50.000 y 100.000 personas (12, 31). La cirrosis puede definirse como la distorsión de la arquitectura hepática por una acumulación excesiva de matriz extracelular (ECM) que da como resultado nódulos celulares hepáticos anormales, esclerosis perisinusoidal y derivación de la sangre más allá de los hepatocitos metabólicamente activos. Los pacientes con cirrosis pueden entrar fácilmente en un estado de enfermedad hepática descompensada con todas las consecuencias de la función sintética hepática deteriorada (trastornos de coagulación, síntesis de albúmina y nutrientes defectuosa), dando como resultado hemorragia general, edema, hipertensión portal que conduce a ascitis y hemorragia variceal esofágica, una propensión a infecciones graves y el desarrollo de encefalopatía hepática. La propia cirrosis predispone a una preponderancia altamente incrementada de carcinoma celular hepático primario.

Aunque en Occidente aproximadamente la mitad de los casos de cirrosis se debe al abuso de alcohol, la otra mitad tiene causa múltiple, tal como (en orden de magnitud decreciente) hepatitis C y B viral crónica, trastornos autoinmunes (cirrosis biliar primaria, hepatitis autoinmune clásica, colangitis esclerosante primaria), enfermedades metabólicas (hemocromatosis, enfermedad de Wilson, deficiencia de antitripsina \alpha1, tirosenemia, glucogenosis), fibrosis quística, fibrosis inducida por fármacos (por ejemplo, metotrexato), anormalidades innatas (fibrosis hepática congénita, atresia biliar, síndrome de Alagille), complicaciones posoperatorias (cirrosis biliar secundaria) o enfermedades vasculares (síndrome de Budd Chiari). Estos números y causas de cirrosis hepática pueden extrapolarse fácilmente a otros países occidentales. Los números pueden ser incluso superiores en países no occidentales, con una proporción superior de hepatitis B y C viral.

El tratamiento causal de estas enfermedades hepáticas es limitado (12, 31). Así, incluso las mejores terapias farmacológicas disponibles pueden eliminar el virus B en solo 40% y el virus C en solo 30-40-50% de pacientes con hepatitis viral crónica. Estas terapias siempre incluyen interferón durante 6-12 meses y así son costosas y están cargadas de efectos secundarios significativos. Un problema sanitario creciente es la epidemia de hepatitis C (32) que se hace crónica en 80-90% de las personas infectadas, y que tiene una preponderancia entre 0,5 y 1% en Europea occidental, entre 1 y 1,5% en los EE.UU. de A. y aproximadamente 2% en Europa oriental y Asia, y de hasta 20% en algunos países como Egipto. Algunas enfermedades hepáticas tales como los trastornos autoinmunes pueden tratarse sintomáticamente o quizás retardarse ligeramente en su avance hacia la cirrosis mediante agentes tales como corticosteroides (en la hepatitis autoinmune clásica) y ácido ursodesoxicólico (en la cirrosis biliar primaria). Otras pueden evitarse cuando se descubren en una fase primaria. Ejemplos son la venisección en la hemocromatosis y agentes quelantes tales como D-penicilamina en la enfermedad de Wilson. Debido a la escasez de donantes y los altos costes, el trasplante de hígado solo es posible en unos pocos casos seleccionados de enfermedad hepática en estadio final.

Los estímulos adversos mencionados tales como hepatotoxinas, incluyendo el alcohol, virus hepatotrópicos, reacciones inmunes al hígado, enfermedades metabólicas y estasis biliar, pueden activar la fibrogénesis hepática, es decir, la síntesis y deposición excesivas de matriz extracelular (ECM). En enfermedades hepáticas agudas, tales como hepatitis viral autolimitada, la fibrogénesis está equilibrada por la fibrolisis, es decir, la retirada de ECM en exceso. Sin embargo, ataques repetidos de suficiente intensidad o influencias nocivas adicionales, por ejemplo hepatitis C crónica combinada con consumo de alcohol, que se producen en muchas enfermedades hepáticas crónicas, cambian el metabolismo de la ECM hacia la fibrogénesis, dando como resultado fibrosis o cirrosis (12-19, 32). En la fibrogénesis, el daño al hepatocito o al epitelio de los conductos biliares conduce a activación de células mononucleares, liberación de factores fibrogénicos y activación de las células mesenquimales hepáticas. Se cree que la célula de Kupffer, es decir, el macrófago específico del hígado, activada, pero también el epitelio proliferativo de los conductos biliares, son las principales fuentes de citoquinas y factores de crecimiento potencialmente fibrogénicos que finalmente se dirigen a HSC/MF activados, aquellos tipos de células que son responsables de la deposición de ECM en exceso en el hígado (12-19, 32). Según se menciona anteriormente, ambas células tienen sus correlaciones en todos los otros órganos mesenquimales-epiteliales y vasculares (14, 33-44). Durante la activación por factores de crecimiento fibrogénicos y una ruptura de su ambiente matricial tridimensional normal, HSC/MF habitualmente quiescentes sufren una transformación en un fenotipo celular que se caracteriza por un alto potencial proliferativo y la capacidad de producir un exceso de moléculas de la ECM. Esta transformación, que habitualmente se caracteriza por la adquisición de la actina del músculo liso \alpha marcadora de miofibroblastos, representa una parte fundamental en un programa protector que está destinado al cierre rápido de una herida potencialmente letal. Habitualmente autolimitado si el agente atacante está presente solo durante un corto período de tiempo, este programa puede conducir a fibrosis y cirrosis cuando está continuamente activado. Ha de subrayarse de nuevo que las células y los factores que conducen a fibrosis hepática y cirrosis son casi idénticos a los que subyacen en los procesos que conducen a fibrosis y cicatrización de otros
órganos.

Así, en muchas enfermedades crónicas del hígado (12-1, 32) y otros órganos, tales como el corazón, los riñones, los pulmones, las arterias, la piel, el intestino y el páncreas (14, 33-44), que conducen a fibrosis, el daño continuado no puede prevenirse y como mucho solo puede mitigarse. Por otra parte, los pacientes habitualmente presentan un estadio ya avanzado de deterioro estructural y funcional. Esto necesita del desarrollo de tratamientos que bien puedan detener el avance de la fibrosis orgánica o bien incluso invertir la cicatrización avanzada. Estos tratamientos deben estar disponibles oralmente, ser económicamente razonables y estar libres de efectos secundarios no deseados.

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Sumario de la invención

La materia de la solicitud está limitada por la reivindicación adjunta.

Un objetivo de la presente invención es proporcionar un medicamento para tratar estados patológicos en los que fibroblastos, células miofibroblásticas y miofibroblastos activados y células endoteliales y epiteliales activadas producen y/o inducen a un exceso de matriz extracelular, dando como resultado cicatrización no deseada. Esto se refiere a la fibrosis hepática, por encima de todo, a la fibrosis hepática biliar secundaria.

Se ha encontrado que las enfermedades y los estados patológicos mencionados anteriormente pueden tratarse satisfactoriamente con inhibidores de integrina, preferiblemente antagonistas de \alphav\beta6. Preferiblemente, el inhibidor de integrina EMD 409849 es un fármaco muy potente en dicho contexto, que es conocido en la especialidad previa o puede prepararse fácilmente de acuerdo con técnicas estándar.

EMD 409849 es ácido 3-{3-benciloxi-2-[5-(piridin-2-ilamino)-pentanoilamino]-propanoilamino}-3-(3,5-diclorofenil)-propiónico.

Este antagonista solo o en combinación con otros agentes puede prevenir, mitigar o incluso invertir eficazmente el desarrollo de fibrosis avanzada, tal como fibrosis del hígado.

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Descripción corta de las figuras

Fig. 1. Expresión de a) procolágeno \alpha1(I), b) TGF\beta1 b) y c) CTGF en la fibrosis hepática biliar secundaria. Medida mediante PCR en tiempo real en RNA total procedente de hígados de rata: ratas operadas simuladamente (Simulación) y ratas con fibrosis debida a la oclusión de los conductos biliares durante 6 semanas (BDL). Cada barra representa muestras de RNAs hepáticos procedentes de tres animales individuales, los datos se muestran como medias \pm MES (unidades arbitrarias).

Fig. 2. Expresión de a) integrina beta 3 y b) integrina beta 6 en fibrosis hepática. Medida mediante PCR en tiempo real en RNA total procedente de hígados de rata: ratas operadas simuladamente (Simulación) y ratas con fibrosis debida a la oclusión de los conductos biliares durante 6 semanas (BDL). Cada barra representa muestras de RNAs hepáticos procedentes de tres animales individuales, los datos se muestran como medias \pm MES (unidades arbitrarias).

Descripción detallada de realizaciones preferidas Métodos Aislamiento y cultivo de HSC

Brevemente, el hígado se perfundió in situ a través de la vena portal usando una cánula de 16-18 G con HBSS libre de calcio (Gybco, Reino Unido) durante 5 min seguido por 0,1% de pronasa E (Sigma) y subsiguientemente 0,025% de colagenasa tipo IV (Sigma) en medio de Eagle modificado de Dulbecco durante 10-15 min cada una. El hígado digerido se extirpó, se picó suavemente y se incubó adicionalmente con 0,04% de pronasa, 0,025% de colagenasa, 0,002% de DNAsa (Sigma) en medio de Eagle modificado de Dulbecco complementado con HEPES 25 mM, a 37ºC durante 10-30 min con agitación suave. Después de la filtración a través de gasa de nailon de 100 \mum, las células parenquimales se retiraron mediante centrifugación a baja velocidad. La fracción de HSC se recogió de la interfase del gradiente cada enriquecimiento mediante una centrifugación en dos etapas a través de la totalidad y un gradiente al 13% de Nycodenz (Sigma) a 1500 g durante 15 min sin frenar, y se cultivó en placa a una densidad de 0,5 x 10^{6}/cm^{2} en DMEM complementado con FCS al 10%, penicilina y estreptomicina. El medio se cambiaba cada 24 h y adicionalmente cada 48 horas. La viabilidad de las células aisladas se determinó mediante exclusión con azul de tripano y era habitualmente mayor de 95-98%. La pureza de los aislados de HSC se confirmó por su apariencia morfológica típica: gotículas de lípido en el citoplasma que muestran autofluorescencia verdosa a una excitación de 390 nm y una conformación similar a una estrella. La contaminación con células de Kupffer fue determinada por la capacidad para engullir cuentas de látex de 3 \mum y estaba por debajo de 3-5% después del aislamiento, y era casi indetectable después de la 1ª pasada. Para los experimentos, las células se usaron entre la pasada 1ª y 3ª, si no se indica otra cosa.

Además de las líneas celulares HSC, se usaron CFSC-2G (moderadamente activadas, amable obsequio del Dr. M. Rojkind, Washington DC, EE.UU. de A).

Experimentación con animales: Ratas Wistar adultas macho que pesaban 206 \pm 19 g sufrían el siguiente procedimiento microquirúrgico bajo un microscopio en funcionamiento (OPMI 6-S, Zeiss, Alemania) (45-47): 1. incisión abdominal en la línea media después de anestesia con 100 mg/kg de hidrocloruro de ketamina (Ketanest®, Parke-Davis, Alemania) y 10 mg/kg de hidrocloruro de 5,6-dihidro-2-(2,6-xilidino)-4H-1,3-tiazina (Rompun®, Bayer, Alemania); 2. disección del conducto biliar común, inserción de un catéter de teflón (Abbocath®-T 26 G, Venisystems, EE.UU. de A.) y colocación de una ligadura completa distal y una incompleta proximal con seda 5-0 (Perma-hand®, Ethicon, Alemania); 3. inyección retrógrada de amidotrizoato sódico (Ethibloc®, Ethicon Germany) en una dosis de 0,02 ml/100 g de peso corporal; 4. retirada del catéter, cierre de la ligadura proximal, escisión del conducto biliar entre las ligaduras y cierre de la herida. Después de la oclusión del conducto biliar (BDO), los animales recibían comida normal (Altromin®, Lage, Alemania) y se les dejó libre acceso a agua.

La mortalidad inicial (desde menos de 1 h hasta 3 días) en ratas con BDO se debía a fuga biliar y ascendía a 9%. Puesto que en este modelo es evidente una fibrosis significativa solo después de 2 semanas de la BDO, los animales que morían antes no tenían que considerarse para el análisis estadístico. Después de 6 semanas, las ratas fueron sacrificadas bajo anestesia con Ketanest/Rompun mediante punción del ventrículo derecho y exsanguinación. El hígado y el bazo se pesaron, y trozos de 1-2 g de los lóbulos hepáticos izquierdo y derecho se fijaron en formalina al 4% o se congelaron en nitrógeno líquido para determinaciones de histología, mRNA e hidroxiprolina (HYP).

Ensayo de rayado: La migración celular se estimó midiendo la reducción del área rayada. Se sembraron células en una placa de 24 pocillos a una densidad de 60.000 células/pocillo. Después de alcanzar la confluencia las células se privaron de alimento en medio libre de suero durante 24 h antes de hacer una raya a través de la monocapa celular usando una punta de pipeta estéril. Después de la herida, las células se pretrataron mediante el inhibidor de integrina \alphav\beta3 a concentraciones crecientes (10^{-10} M-10^{-6} M) durante 30 min y a continuación se trataran mediante PDGF-BB a una concentración de 10 ng/ml en ausencia de suero. La reducción del área rayada se midió en tres puntos diferentes por pocillo usando una lente especial con micrómetro reticulado después de 15-20 h.

Incorporación de BrdU: Para valorar la proliferación celular, se determinó la síntesis de DNA de novo como incorporación de BrdU. Las células se sembraron a una densidad de 20.000 células/pocillo en placas de 96 pocillos en medio de crecimiento que contenía 10% de suero de ternero fetal (PCS). Después de 24 h el medio se cambió hasta 0% de FCS durante las siguientes 24 h, seguido por incubación con medio que contenía DPGF-BB a una concentración de 10 ng/ml, inhibidor de integrina \alphav\beta3 (10^{-9}-10^{-6}) o no contenía inhibidor durante 20 h. Durante las últimas horas de incubación las células se marcaron por impulsos con BrdU y su incorporación se midió usando un estuche de ELISA (Roche) y un lector de microplacas.

PCR en tiempo real: El RNA total se aisló de los lisados celulares usando el estuche comercial RNApure (PeqLab, Erlangen, Alemania) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Se obtuvo cDNA de plantilla mediante transcripción inversa de 0,5 mg de RNA total.

Los niveles relativos de transcrito se cuantificaron mediante RT-PCR en tiempo real usando el sistema LightCycler (Roche), usando 1,5 \mul de dilución de cDNA de plantilla en un volumen de reacción total de 15 \mul que incluía DNA-polimerasa de Taq, mezcla de dNTP, tampón de reacción y MgCl_{2} 3,0 mM proporcionado por el "LightCycler FastStart DNA Master Hybridization Probes Kit" (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para cada transcrito medido, se usó como patrón una serie de dilución de 1:2 a 1:32. Los datos se analizaron con el software LightCycler usando la opción "máximo de la segunda derivada proporcional". Los genes de mantenimiento ("housekeeping") microglobulina beta-2 o GAPDH se amplificaron en una reacción paralela para la normalización de los resultados.

Sondas de TaqMan y grupos de cebadores se diseñaron usando el software Primer Express (Perkin Elmer) basado en secuencias publicadas. Cebadores de sentido y antisentido (cada uno a 0,5 \muM) y sonda 5'-fosforilada 0,125 \mum, marcada en su extremo 5' con el colorante informador (FAM) y en el extremo 3' con la molécula extinguidora (TAMRA), se sintetizaron en MWG Biotech AG (Ebersberg, Alemania). Grupos de cebadores que se usaban para medir la expresión de genes diana específicos se resumen en la tabla:

1

Para la cuantificación de niveles de transcrito en estado estacionario de integrina \beta3 y \beta6, se usó PCR en tiempo real con verde SYBR como el fluoróforo (Molecular Probes, Eugene, OR). Para distinguir el producto de PCR específico de productos no específicos y dímeros de cebadores, se realizaron análisis con curvas de fusión. Debido a que un producto de DNA diferente se funde a diferentes temperaturas, era posible distinguir productos genuinos de dímeros de cebadores o productos no específicos.

Todos los experimentos se realizaron en cultivo celular con la línea de células similares a miofibroblastos CFSC-2G (línea celular HSC derivada de hígado cirrótico de rata) y HSC/MF de rata primarios. Para investigar el efecto del inhibidor de integrina \alphav\beta3 sobre la migración celular, se sembraron células sobre placas de 24 pocillos y, después de alcanzar la confluencia, se privaron de alimento en ausencia de FCS durante 24 h. Se realizaron marcas y las células se trataron con PDFCR-BB a 10 ng/ml en presencia o ausencia del inhibidor de \alphav\beta3 a 10^{-6}-10^{-9} M. La velocidad de migración se midió después de 17-20 h como una reducción de la anchura de la raya inicial.

Para investigar los patrones de expresión de integrinas durante la fibrosis hepática, se usó el modelo de rata de obstrucción biliar completa durante 6 semanas, que da como resultado cirrosis con una acumulación de 4 ó 10-12 veces de colágeno hepático relativo (por g de hígado) y absoluto (por hígado total), respectivamente. Después de 6 semanas de oclusión del conducto biliar se observaba una regulación al alza drástica de la expresión de mRNA de procolágeno \alpha1(I), TGF\beta1, TGF\beta2 y CTGF (25, 10, 200 y 190 veces, respectivamente) en comparación con animales operados simuladamente (Fig. 1).

Al mismo tiempo, mRNA de \alphav\beta3 era regulado al alza moderadamente (Fig. 2a), mientras que se observaba una sobrexpresión drástica (180 veces) de la subunidad de integrina \beta6 en hígados cirróticos (Fig. 2b). Esta fuerte regulación al alza de integrina \beta6 nunca se ha mostrado en enfermedades fibróticas ni en fibrosis hepática en particular. Las células responsables de esta regulación al alza son principalmente células epiteliales proliferativas de los conductos biliares (pero también HSC/miofibroblastos activados), aquellas células que secretan grandes cantidades de citoquinas profibrogénicas, tales como TGP\beta y CTGF y que por lo tanto son dianas principales para la terapia de la fibrosis hepática, aparte de HSC/MF activados. Por otra parte, los recientes experimentos piloto de los presentes solicitantes en el modelo de fibrosis de rata implacablemente progresiva de la oclusión del conducto biliar (5-6 animales por grupo) sugiere que la inhibición de integrina \beta6 específica por EMD 409849 puede aliviar la fibrosis hepática biliar secundaria reduciendo el colágeno hepático total en 50-70% después de 5-6 semanas de oclusión del conducto biliar. Tomados juntos, estos datos muestran que la inhibición de integrinas \alphav\beta6 por péptidos de bajo peso molecular específicos y en particular sus análogos no peptídicos es una herramienta poderosa para aliviar, bloquear o incluso invertir la fibrosis del hígado y de otros órganos cuyo tratamiento sigue siendo en gran parte difícil de encontrar (11-19, 33-44).

Los compuestos para el uso de acuerdo con la presente invención y/o sus sales fisiológicamente aceptables y/o sus derivados fisiológicamente aceptables pueden usarse por lo tanto para la producción de composiciones o preparaciones farmacéuticas poniéndolos en la forma de dosificación adecuada junto con al menos un excipiente o agente auxiliar y, si se desea, con uno o más compuestos activos adicionales. Las composiciones o preparaciones así obtenidas pueden emplearse como medicamentos en medicina humana o veterinaria. Excipientes adecuados son sustancias orgánicas o inorgánicas que son adecuadas para la administración enteral (por ejemplo, oral o rectal) o parenteral y no reaccionan con los compuestos para el uso de acuerdo con la presente invención, por ejemplo agua, aceites vegetales, alcoholes bencílicos, polietilenglicoles, triacetato de glicerol y otros glicéridos de ácido graso, gelatina, lecitina de soja, carbohidratos tales como lactosa o almidón, estearato magnésico, talco o celulosa.

Para la administración oral, se usan en particular tabletas, tabletas revestidas, cápsulas, jarabes, zumos o gotas. Son de especial interés tabletas revestidas y cápsulas que tienen revestimientos entéricos o envueltas para cápsulas. Para la administración rectal, se usan supositorios y, para la administración parenteral, soluciones, preferiblemente soluciones oleosas o acuosas, y también se usan suspensiones, emulsiones o implantes.

Los compuestos para el uso de acuerdo con la invención también pueden liofilizarse y los liofilizados obtenidos usarse, por ejemplo, para la producción de preparaciones para inyección.

Las composiciones o las preparaciones indicadas pueden esterilizarse y/o contener agentes auxiliares tales como conservantes, estabilizantes y/o agentes humectantes, emulsionantes, sales para afectar a la presión osmótica, sustancias tamponadoras, colorantes y/o saborizantes. Si se desea, también pueden contener uno o más compuestos activos adicionales, por ejemplo una o más vitaminas, diuréticos, compuestos antiinflamatorios, antidiabéticos, analgésicos, antiflojísticos o compuestos distintos a los compuestos para el uso de acuerdo con la invención, tales como compuestos que no son la materia de la presente invención, que pueden usarse en el diagnóstico, la profilaxis y/o el tratamiento de trastornos, cuadros clínicos y/o síntomas como los descritos en la presente memoria, por ejemplo para mejorar o potenciar adicionalmente el efecto terapéutico y/o la tolerancia de los compuestos.

Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención pueden obtenerse o producirse de acuerdo con métodos conocidos en la especialidad o análogamente a estos métodos. Habitualmente, las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención se producen con métodos no químicos, por ejemplo mezclando los ingredientes activos con, por ejemplo, excipientes, agentes auxiliares, adyuvantes y portadores fisiológicamente aceptables, y convirtiendo la mezcla en la forma de dosificación deseada, por ejemplo en tabletas mediante métodos de moldeo o en soluciones disolviendo los ingredientes activos en un disolvente. En general, los ingredientes activos se convierten en una composición farmacéutica junto con uno o más excipientes, por ejemplo un excipiente sólido, líquido y/o semilíquido, o uno o más agentes auxiliares y, si se desea, en combinación con uno o más ingredientes activos adicionales.

Estas preparaciones pueden usarse como medicamentos en medicina humana o veterinaria.

Excipientes adecuados son sustancias orgánicas o inorgánicas que son adecuadas para la administración enteral (por ejemplo oral), parenteral o tópica y no reaccionan con los nuevos compuestos, por ejemplo agua, aceites vegetales, alcoholes bencílicos, alquilenglicoles, polietilenglicoles, triacetato de glicerol, gelatina, carbohidratos, tales como lactosa o almidón, estearato magnésico, talco o vaselina. En particular, son adecuados para la administración oral las tabletas, las píldoras, las tabletas revestidas, las cápsulas, los polvos, los gránulos, los jarabes, los zumos o las gotas, son adecuados para la administración rectal los supositorios, son adecuadas para la administración parenteral las soluciones, preferiblemente soluciones oleosas o acuosas, también las suspensiones, emulsiones o los implantes, y son adecuados para la administración tópica las pomadas, las cremas o los polvos. Los nuevos compuestos también pueden liofilizarse y los liofilizados resultantes usarse, por ejemplo, para la preparación de preparaciones para inyección. Las preparaciones indicadas pueden esterilizarse y/o comprender agentes complementarios, tales como lubricantes, conservantes, esterilizantes y/o agentes humectantes, emulsionantes, sales para modificar la presión osmótica, sustancias tamponadoras, colorantes, sabores y/o una pluralidad de ingredientes activos adicionales, por ejemplo una o más vitaminas.

Para la administración como un aerosol de inhalación, es posible usar aerosoles en los que el ingrediente activo está bien disuelto o bien suspendido en un gas propelente o una mezcla de gases propelentes (por ejemplo, CO_{2} o clorofluorocarbono). El ingrediente activo se usa ventajosamente en la presente memoria en forma micronizada, en cuyo caso pueden estar presentes uno o más disolventes fisiológicamente aceptables adicionales, por ejemplo etanol. Las soluciones para inhalación pueden administrarse con la ayuda de inhaladores convencionales.

De acuerdo con esto, los antagonistas se administran preferiblemente en dosis entre aproximadamente 0,01 mg y 200 mg, más preferiblemente entre aproximadamente 0,01 mg y 100 mg, aún más preferiblemente entre aproximadamente 0,1 mg y 50 mg y en particular entre 0,01 y 30 mg, por unidad de dosificación.

La dosis diaria es preferiblemente mayor que o igual a aproximadamente 0,001 mg/kg, más preferiblemente mayor que o igual a aproximadamente 0,001 mg/kg, aún más preferiblemente mayor que o igual a aproximadamente 0,005 mg/kg, mayor que o igual a aproximadamente 0,01 mg/kg o mayor que o igual a aproximadamente 0,1 mg/kg. La dosis diaria es preferiblemente menor que o igual a aproximadamente 30 mg/kg, más preferiblemente menor que o igual a aproximadamente 20 mg/kg, aún más preferiblemente menor que o igual a aproximadamente 15 mg/kg, menor que o igual a aproximadamente 5 mg/kg o menor que o igual a aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal.

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Claims (1)

1. Uso de un antagonista de integrina \alphav\beta6 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de fibrosis hepática biliar secundaria, en el que dicho antagonista es: ácido 3-{3-benciloxi-2-[5-(piridin-2-ilamino)-pentanoilamino]-propanoilamino}-3-(3,5-diclorofenil)-propiónico.