ES2308977T3 - Analogos de camptotecina y metodos para su preparacion. - Google Patents
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Abstract
Un compuesto que tiene la fórmula: (Ver fórmula) en forma racémica, forma enantioméricamente enriquecida o forma enantioméricamente pura; en la que R 1 es hidrógeno, -C(O)R f , donde R f es como se define a continuación, un grupo alquilo como se define a continuación, un grupo alquenilo como se define a continuación, un grupo alquinilo como se define a continuación, un grupo alcoxi como se define a continuación, un grupo ariloxi de fórmula -OR e , donde R e es fenilo o naftilo, un grupo aciloxi como se define a continuación, un grupo alcoxicarboniloxi de fórmula -OC(O)OR d , donde R d se define a continuación, un grupo carbamoiloxi de fórmula -OC(O)NR a R b , un átomo de halógeno, un grupo hidroxi, un grupo nitro, un grupo un grupo ciano, un grupo azido, un grupo formilo, un grupo hidrazino, un grupo amino de fórmula -NR a R b , -SR c ; o R 1 y R 2 forman juntos una cadena de tres o cuatro miembros elegidos entre el grupo de CH, CH2, O, S, NH o NR 15 , donde R 15 es un grupo alquilo C1-C6; en la que R 2 es -C(O)R f , donde R f es como se define a continuación, un grupo alquilo como se define a continuación, un grupo alquenilo como se define a continuación, un grupo alquinilo como se define a continuación, un grupo alcoxi como se define a continuación, un grupo ariloxi de fórmula -OR e , donde R e es fenilo o naftilo, un grupo aciloxi como se define a continuación, un grupo alcoxicarboniloxi de fórmula -OC(O)OR d , donde R d es como se define a continuación, un grupo carbamoiloxi de fórmula -OC(O)NR a R b , un grupo hidroxi, un grupo nitro, un grupo ciano, un grupo azido, un grupo formilo, un grupo hidrazino, un grupo amino de fórmula -NR a R b , -SR c ; o R 1 y R 2 forman juntos una cadena de tres o cuatro miembros elegidos entre el grupo de CH, CH2, O, S, NH o NR 15 , donde R 15 es un grupo alquilo C1-C6; donde R a y R b son independientemente H, un grupo acilo de fórmula -C(O)R f como se define a continuación, un grupo alquilo como se define a continuación o un grupo arilo en el que el arilo es fenilo o naftilo; donde R c es hidrógeno, -C(O)R f , donde R f es como se define a continuación, un grupo alquilo o un grupo arilo en el que el arilo es fenilo o naftilo; y donde R f es un grupo alquilo, un grupo haloalquilo, un grupo perfluoroalquilo, un grupo alcoxi como se ha definido anteriormente, un grupo amino como se ha definido anteriormente o un grupo hidroxi; R 3 es H, un átomo de halógeno, un grupo nitro, un grupo amino como se ha definido anteriormente, un grupo hidroxi o un grupo ciano; o R 2 y R 3 forman juntos una cadena de tres o cuatro miembros elegidos entre el grupo de CH, CH2, O, S, NH o NR 15 ; R 4 es H, F, un grupo amino de fórmula -NR a R b , un grupo alquilo C1 - 3, un grupo alquenilo C2 - 3, un grupo alquinilo C2 - 3, un grupo trialquilsililo o un grupo alcoxi C1 - 3; R 5 es un grupo alquilo C1 - 10, un grupo alquenilo como se define continuación, un grupo alquinilo como se define continuación o un grupo bencilo; R 6 es -Si(R 8 R 9 R 10 ) o -(R 7 )Si(R 8 R 9 R 10 ), donde R 7 es un grupo alquileno, un grupo alquenileno o un grupo alquinileno; y R 8 , R 9 y R 10 son independientemente un grupo alquilo C1 - 10, un grupo alquenilo C2 - 10, un grupo alquinilo C2 - 10, un grupo arilo como se ha definido anteriormente o un grupo -(CH2)nNR 11 , donde n es un número entero en el intervalo de 1 a 10 y R 11 es un grupo hidroxi, un grupo alcoxi como se define a continuación, un grupo amino de fórmula -NR a R b , un grupo alquilamino, un grupo dialquilamino, un átomo de halógeno, un grupo ciano, -SR c , donde R c se ha definido anteriormente, o un grupo nitro; R 13 es...
Description
Análogos de camptotecina y métodos para su
preparación.
La presente invención se refiere a nuevos
compuestos y métodos para su preparación y, particularmente, a
derivados o análogos de la camptotecina con anillo E expandido y a
métodos de preparación de dichos análogos de la camptotecina.
Las camptotecinas son inhibidores de la ADN
topoisomerasa I que se usan ahora como fármacos anticancerosos. El
topotecano (tpt) y la CPT-11 son los primeros dos
miembros de la familia de las camptotecinas que obtuvieron la
categoría de aprobación total de la Food and Drugs
Administration (el topotecano en 1966 como terapia de segunda
línea contra el cáncer epitelial de ovario en estado avanzado, el
topotecano de nuevo en 1998 para el tratamiento del cáncer pulmonar
de células pequeñas, la CPT-11 en 1998 como terapia
de primera línea contra el cáncer de colon). Otros varios análogos
de la familia de la camptotecina, tales como el
GI-147211C, DX8951f, la
9-aminocamptotecina (9-AC) y la
9-nitrocamptotecina, están en varias etapas de la
evaluación pre-clínica y clínica. Cada una de las
camptotecinas en uso clínico experimenta una hidrólisis
relativamente rápida en la corriente sanguínea lo que produce una
pérdida pronunciada de actividad anticancerosa. En las camptotecinas
clínicamente importantes el farmacóforo clave
\alpha-hidroxilactona es el que se hidroliza a pH
fisiológico para conducir a una forma hidroxicarboxilato
biológicamente inactiva y potencialmente tóxica. Fassberg, J. y
Stella, V. J., "A Kinetic and Mechanistic Study of the Hydrolysis
of Camptothecin and Some Analogues", J. Pharm. Sci. 81:
676-684 (1992); Hertzberg, R. P., Caranfa, M. J. y
Hecht, S. M. "On the Mechanism of Topoisomerase I Inhibition by
Camptothecin: Evidence for Binding to an Enzyme-DNA
Complex", Biochemistry 28: 4629-4638
(1989); Hsiang, Y-H. y Liu, L. F., "Identification
of Mammalian DNA Topoisomerase I as an Intracellular Target of the
Anticancer Drug Camptothecin", Cancer Res. 48:
1722-1726 (1988); y Jaxel, C., Kohn, K. W., Wani,
M. C., Wall, M. E. y Pommier, Y.,
"Structure-Activity Study of Camptothecin
Derivatives on Mammalian Topoisomerase I: Evidence for a Specific
Receptor Site and a Relation to Antitumor Activity", Cancer
Res. 49: 5077-5082 (1989). Las referencias
mencionadas en la presente memoria, incluyendo las mencionadas
anteriormente, pueden facilitar la comprensión de la presente
invención.
A continuación se muestran las estructuras de la
camptotecina y algunos de sus análogos importantes:
Recientes trabajos de investigación han mostrado
que agentes tales como la 9-aminocamptotecina y la
camptotecina (cpt) presentan estabilidades muy pequeñas en la
sangre humana debido a interacciones de enlace de elevada afinidad
entre sus formas carboxilato y la albúmina del suero humano
(abreviada generalmente como HSA por sus iniciales en inglés:
human serum albumin). Burke, T. G., Mi, Z.,
Jiang, Y. y Munshi, C. B. "The Important Role of Albumin in
Determining the Relative Human Blood Stabilities of the Camptothecin
Anticancer Drugs", Journal of Pharmaceutical Sciences,
84: 518-519 (1995); Burke, T. G. y Mi, Z. "The
Structural Basis of Camptothecin Interactions with Human Serum
Albumin: Impact on Drug Stability", Journal of Medicinal
Chemistry, 37: 40-46 (1994); Mi, Z. y Burke, T.
G. "Differential Interactions of Camptothecin Lactone and
Carboxilate Forms with Human Blood Components",
Biochemistry, 33: 10325-10336 (1994); y Mi,
Z., Malak, H. y Burke, T. G. "Reduced Albumin Binding Promotes
the Stability and Activity of Topotecan in Human Blood",
Biochemistry, 34:13722-13728 (1995).
Experimentos de persistencia de la fluorescencia en el dominio de la
frecuencia revelaron que la albúmina de suero humano (HSA) se
enlaza preferentemente al carboxilato de la camptotecina con una
afinidad más de 100 veces mayor en comparación con la lactona de la
camptotecina. Mi, Z. y Burke, T. G. "Marked Interspecies
Variations Concerning the Interactions of Camptothecin with Serum
Albumins: A Frequency-Domain Fluorescence
Spectroscopic Study", Biochemistry, 33:
12540-12545 (1994). Este enlace diferencial del
carboxilato sobre la lactona hace que la camptotecina y la
9-AC se abran más rápida y completamente en
presencia de HSA que en ausencia de la proteína. En el plasma
humano, pH 7,4 y 37ºC, tanto la camptotecina como la
9-AC se abren rápidamente y de forma esencialmente
completa hasta niveles de lactona casi despreciables de 0,2% en el
equilibrio. Mientras que la presencia de la HSA favorece la apertura
del anillo lactona de la camptotecina y la 9-AC,
los glóbulos rojos de la sangre y las capas dobles de lípidos se
enlazan en general preferentemente a las formas lactona neutras de
la camptotecina frente a sus formas respectivas lactona y
carboxilato cargadas negativamente. Burke, T. G., Staubus, A. E.,
Mishra, A. K. y Malak, H., "Liposomal Stabilization of
Camptothecin's Lactone Ring", J. Am. Chem. Soc. 114:
8318-8319 (1992); y Burke, T. G., Mishra, A. K.,
Wani, M. y Wall, M. "Lipid Bilayer Partitioning and Stability of
Camptothecin Drugs", Biochemistry, 32:
5352-5364 (1993). Las interacciones del fármaco con
los eritrocitos favorecen de este modo los niveles de lactona activa
en la sangre.
Recientemente, Lavergne et al. han
demostrado que la expansión del anillo E de la camptotecina para
producir una "homocamptotecina" aumenta de estabilidad en
disolución de la camptotecina manteniendo a la vez la actividad
anticancerosa. Lavergne, O., Lesuerur-Ginot, L.,
Rodas, F. P., Kasprzyk, P. G., Pomier, J., Demarquay, D., Prevost,
G., Ulibarri, G., Rolland, A., Schiano-Liberatore,
A.-M., Harnett, J., Pons, D., Camara, J., Bigg, D.
"Homocamptothecins: Synthesis and Antitumor Activity of Novel
E-Ring Modified Camptothecin Analogs", J.
Med. Chem. 41, 5410-5419 (1998); y Lavergne, O.,
Lesueur-Ginot, L. Rodas, F. P. y Bigg, D., "An
E-Ring Modified Camptothecin With Potent
Antiproliferative and Topoisomerase I inhibitory Activities",
Bioorg. Med. Chem. Lett., 7: 2235-2238
(1997). La modificación del anillo E en los estudios de Lavergne
et al. implicaron la inserción de un espaciador de metileno
entre el grupo funcional OH en la posición 20 y el grupo carboxilo
de la \alpha-hidroxilactona de seis miembros
natural de la camptotecina. Se encontró que la incorporación del
nuevo anillo \beta-hidroxilactona de 7 miembros en
la camptotecina mejoraba la estabilidad en disolución y en plasma
del agente.
A continuación se muestra la estructura de la
homocamptotecina de Lavergne et al. y el sistema de
numeración usado para describir dichos compuestos:
Aunque se han hecho avances esenciales en el
desarrollo de la familia de fármacos de camptotecina, sigue siendo
todavía muy conveniente desarrollar compuestos mejorados en esta
familia de fármacos y desarrollar vías de síntesis mejoradas para
producir dichos fármacos.
El trabajo de Josien et al. en
Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, Vol. 7, Nº 24,
páginas 3189-3194 (1997) describe camptotecinas
sustituidas con sililo en la posición 7 para su utilización como
agentes antitumorales.
La presente invención proporciona de forma
general un compuesto que tiene la siguiente fórmula (1):
\vskip1.000000\baselineskip
en forma racémica, forma
enantioméricamente enriquecida o forma enantioméricamente
pura;
en la que R^{1} es hidrógeno,
-C(O)R^{f}, donde R^{f} es un grupo alquilo, un
grupo alcoxi, un grupo amino o un grupo hidroxi, un grupo alquilo,
un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo alcoxi, un grupo
ariloxi, un grupo aciloxi, -OC(O)R^{d}, donde
R^{d} es un grupo alquilo, -OC(O)NR^{a}R^{b},
donde R^{a} y R^{b} son independientemente el mismo o
diferente, H, -C(O)R^{f}, un grupo alquilo o un
grupo arilo, un átomo de halógeno, un grupo hidroxi, un grupo
nitro, un grupo ciano, un grupo azido, un grupo formilo, un grupo
hidrazino, un grupo amino, -SR^{c}, donde R^{c} es hidrógeno,
-C(O)R^{f}, un grupo alquilo o un grupo arilo; o
R^{1} y R^{2} forman juntos una cadena de tres o cuatro miembros
elegidos entre el grupo de CH, CH_{2}, O, S, NH o NR^{15},
donde R^{15} es un grupo alquilo
C_{1}-C_{6};
R^{2} es -C(O)R^{f} donde
R^{f} es un grupo alquilo, un grupo alcoxi, un grupo amino o un
grupo hidroxi, un grupo alquilo, un grupo alquenilo, un grupo
alquinilo, un grupo alcoxi, un grupo ariloxi, un grupo aciloxi,
-OC(O)OR^{d}, donde R^{d} es un grupo alquilo,
-OC(O)NR^{a}R^{b}, donde R^{a} y R^{b} son
independientemente el mismo o diferente, H,
-C(O)R^{f}, un grupo alquilo o un grupo arilo, un
grupo hidroxi, un grupo nitro, un grupo ciano, un grupo azido, un
grupo formilo, un grupo hidrazino, un grupo amino, -SR^{c}, donde
R^{c} es hidrógeno, -C(O)R^{f}, un grupo alquilo o
un grupo arilo; o R^{1} y R^{2} forman juntos una cadena de
tres o cuatro miembros elegidos entre el grupo de CH, CH_{2}, O,
S, NH o NR^{15}, donde R^{15} es un grupo alquilo
C_{1}-C_{6};
R^{3} es H, un átomo de halógeno, un grupo
nitro, un grupo amino, un grupo hidroxi o un grupo ciano; o R^{2}
y R^{3} forman juntos una cadena de tres o cuatro miembros
elegidos entre el grupo de CH, CH_{2}, O, S, NH o NR^{15}, donde
R^{15} es un grupo alquilo C_{1}-C_{6};
R^{4} es H, F, un grupo amino, un grupo
alquilo C_{1-3}, un grupo alquenilo
C_{2-3}, un grupo alquinilo
C_{2-3}, un grupo trialquilsililo o un grupo
alcoxi C_{1-3};
R^{5} es un grupo alquilo
C_{1-10}, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo o
un grupo bencilo;
R^{6} es -Si(R^{8}R^{9}R^{10}) o
-(R^{7})Si(R^{8}R^{9}R^{10}), donde R^{7} es
un grupo alquileno, un grupo alquenileno o un grupo alquinileno;
y
R^{8}, R^{9} y R^{10} son
independientemente un grupo alquilo C_{1-10}, un
grupo alquenilo C_{2-10}, un grupo alquinilo
C_{2-10}, un grupo arilo o un grupo
-(CH_{2})_{N}R^{11}, donde N es un número entero en el
intervalo de 1 a 10 y R^{11} es un grupo hidroxi, un grupo alcoxi,
un grupo amino, un grupo alquilamino, un grupo dialquilamino, un
átomo de halógeno, un grupo ciano, -SR^{c} o un grupo nitro;
R^{13} es H, F o -CH_{3}; y
R^{16} es -C(O)R^{f} o H;
o uno de los compuestos
7-trimetilsililhomocamptotecina o
7-ter-butildimetilsililhomocamptotecina;
y sus sales farmacéuticamente aceptables.
R^{1} y R^{2} juntos pueden formar, por
ejemplo, un grupo de fórmula -O(CH_{2})_{n}O- en
la que n es un número entero 1 ó 2. Similarmente, R^{2} y R^{3}
juntos pueden formar, por ejemplo, un grupo de fórmula
-O(CH_{2})_{n}O- en la que n es un número entero 1
ó 2.
R^{5} es preferiblemente un grupo etilo, un
grupo alilo, un grupo bencilo o un grupo propargilo. Más
preferiblemente, R^{5} es un grupo etilo. Preferiblemente, R^{4}
es H.
En un modo de realización, R^{8} y R^{9} son
grupos metilo, R^{10} es un grupo ter-butilo o un
grupo metilo, R^{1} es H y R^{3} es H. En este modo de
realización, R^{2} puede ser, por ejemplo, NH_{2} u OH.
R^{13} es preferiblemente H. R^{16} es
preferiblemente H o un grupo alquilo. Más preferiblemente, R^{16}
es H o -C(O)R^{f}, donde R^{f} es un grupo
alquilo. Más preferiblemente, R^{16} es H.
La presente invención también proporciona un
método de síntesis de un compuesto que tiene la fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
como se ha definido en la reivindicación 11,
mediante una anulación 4+1 en cascada de
radicales, en la que el precursor:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
o el
precursor:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
se hace reaccionar con un
arilisonitrilo que tiene la
fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que X es un precursor de
radicales. Preferiblemente, X es Cl, Br o I. Más preferiblemente, X
es Br o
I.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención también proporciona un
compuesto que tiene la fórmula:
en forma racémica, forma
enantioméricamente enriquecida o forma enantioméricamente pura, en
la que R^{12} es preferiblemente H o -C(O)R^{f},
-C(O)OR^{d} o
-C(O)NR^{a}R^{b}.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención proporciona además
compuestos que tienen las fórmulas:
y
en forma racémica, forma
enantioméricamente enriquecida o forma enantioméricamente
pura.
\vskip1.000000\baselineskip
Adicionalmente todavía, la presente invención
proporciona un compuesto que tiene la fórmula:
en forma racémica, forma
enantioméricamente enriquecida o forma enantioméricamente
pura.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención también proporciona un
compuesto que tiene la fórmula:
La presente invención también proporciona un
compuesto que tiene la fórmula:
en la que R^{15} es un grupo
alquilo
C_{1}-C_{6}.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención proporciona además un
compuesto que tiene la fórmula:
en forma racémica, forma
enantioméricamente enriquecida o forma enantioméricamente pura, en
la que R^{14} es SiMe_{3}, I o
Br.
\vskip1.000000\baselineskip
Adicionalmente además, la presente invención
proporciona un método de síntesis de un compuesto que tiene la
fórmula siguiente:
en la que Y es cloro, bromo o
yodo;
que comprende las etapas de:
(a) tratar un enol éter de estructura:
en condiciones de escisión oxidante
adecuadas para formar un compuesto que tiene la
estructura:
(b) tratar el compuesto formado en la etapa (a)
con un reactivo organometálico que tiene la estructura:
MC(R^{13})(R^{13})CO_{2}R^{15}
en la que M es Li, Na, K, MgY o
ZnY, en condiciones adecuadas para formar un compuesto que tiene la
estructura:
(c) tratar el compuesto formado en la etapa (b)
en condiciones adecuadas con ácido para formar un compuesto que
tiene la estructura:
(d) tratar el compuesto formado en la etapa (c)
en condiciones adecuadas de desililación halogenante para formar un
compuesto de la estructura:
(e) tratar el compuesto de la etapa (d) con
ácido o con yodotrimetilsilano en condiciones adecuadas para la
desmetilación, para proporcionar un compuesto de la estructura
siguiente:
(f) tratar el compuesto de la etapa (e) con una
base de litio o una base de sodio en presencia de una sal inorgánica
de litio para desprotonar el átomo de nitrógeno;
(g) hacer reaccionar la especie desprotonada
resultante de la etapa (f) con un compuesto de la estructura
siguiente:
en la que Z es I, Br, Cl, un grupo
mesilato o un grupo tosilato, y en condiciones adecuadas para
producir la formación del compuesto de la estructura
siguiente:
Como se ha indicado anteriormente, todos los
compuestos de la presente invención que incluyen el grupo
\beta-hidroxilactona pueden existir en forma
racémica, en forma enantioméricamente enriquecida o en forma
enantioméricamente pura. Las fórmulas de dichos compuestos, como se
han expuesto en la presente memoria, cubren y/o incluyen cada una de
dichas formas.
El término "precursor(es) de
radicales", como se usa en la presente memoria y como es bien
conocido por los expertos en la técnica, se refiere generalmente a
aquellos grupos funcionales que se escinden para generar radicales
en condiciones estándar de reacciones de radicales en cadena o no.
Los precursores de radicales habituales son los átomos de halógeno
(excepto el flúor), los ácidos carboxílicos y sus derivados (tal
como los tiohidroxamatos), los grupos selenofenilo y las sales de
diazonio. Véase, por ejemplo, Giese, B. "Radicals in Organic
Synthesis: Formation of Carbon-Carbon Bonds";
Pergamon, Oxford (1986).
Los términos "alquilo", "arilo" y
otros grupos se refieren generalmente tanto a grupos sustituidos
como no sustituidos, a menos que se especifique lo contrario. A
menos que se especifique de otra forma, los grupos alquilo son
grupos hidrocarbonados y son preferiblemente grupos alquilo
C_{1}-C_{15} (es decir, que tienen de 1 a 15
átomos de carbono), y más preferiblemente grupos alquilo
C_{1}-C_{10}, y pueden ser ramificados o no
ramificados, acíclicos o cíclicos. La definición anterior de un
grupo alquilo y otras definiciones se aplican también cuando el
grupo es un sustituyente de otro grupo (por ejemplo, un grupo
alquilo como sustituyente de un grupo alquilamino o un grupo
dialquilamino). El término "arilo" se refiere a fenilo o
naftilo. Como se usa en la presente memoria, el término
"halógeno" o "halo" se refiere a flúor, cloro, bromo o
yodo.
El término "alcoxi" se refiere a -OR^{d},
donde R^{d} es un grupo alquilo. El término "ariloxi" se
refiere a -OR^{e}, donde R^{e} es un grupo arilo. El término
acilo se refiere a -C(O)R^{f}. El término
"alquenilo" se refiere a un grupo hidrocarbonado de cadena
lineal o ramificada con al menos un doble enlace, preferiblemente
con 2-15 átomos de carbono y más preferiblemente
2-10 átomos de carbono (por ejemplo, -CH=CHR^{g}
o -CH_{2}CH=CHR^{g}). El término "alquinilo" se refiere a
un grupo hidrocarbonado de cadena lineal o ramificada con al menos
un triple enlace, preferiblemente con 2-15 átomos de
carbono y más preferiblemente 2-10 átomos de
carbono (por ejemplo, -C\equivCR^{h} o
-CH_{2}-C\equivCR^{h}). Los términos
"alquileno", "alquenileno" y "alquinileno" se
refieren a las formas bivalentes de los grupos alquilo, alquenilo y
alquinilo, respectivamente.
Los grupos mencionados anteriormente pueden
estar sustituidos con una gran variedad de sustituyentes para
sintetizar análogos de la homocamptotecina conservando su actividad.
Por ejemplo, los grupos alquilo pueden estar preferiblemente
sustituidos con uno o varios grupos, incluyendo un grupo bencilo, un
grupo fenilo, un grupo alcoxi, un grupo hidroxi, un grupo amino
(incluyendo, por ejemplo, grupos amino libre, grupos alquilamino,
dialquilamino y grupos arilamino), un grupo alquenilo, un grupo
alquinilo y un grupo aciloxi. En el caso de los grupos amino,
(-NR^{a}R^{b}), R^{a} y R^{b} son preferible e
independientemente hidrógeno, un grupo acilo, un grupo alquilo o un
grupo arilo. Los grupos acilo pueden estar sustituidos
preferiblemente con (es decir, R^{f} es) un grupo alquilo, un
grupo haloalquilo (por ejemplo, un grupo perfluoroalquilo), un
grupo alcoxi, un grupo amino y un grupo hidroxi. Los grupos
alquinilo y alquenilo pueden estar sustituidos preferiblemente con
(es decir, R^{g} y R^{h} son preferiblemente) uno o varios
grupos que incluyen un grupo alquilo, un grupo alcoxialquilo, un
grupo aminoalquilo y un grupo bencilo.
El término "aciloxi" como se usa en la
presente memoria se refiere al grupo
-OC(O)R^{d}.
El término "alcoxicarboniloxi" como se usa
en la presente memoria se refiere al grupo
-OC(O)OR^{d}.
El término "carbamoiloxi" como se usa en la
presente memoria se refiere al grupo
-OC(O)NR^{a}R^{b}.
Los grupos amino e hidroxi pueden incluir grupos
protectores como se conoce en la técnica. Los grupos protectores
preferidos para los grupos amino incluyen el
ter-butoxicarbonilo, formilo, acetilo, bencilo,
p-metoxibenciloxicarbonilo y tritilo. Otros grupos
protectores adecuados, como es conocido por los expertos en la
técnica, se describen en Greene, T. Wuts, P. G. M., "Protective
Groups in Organic Synthesis", Wiley (1991).
En general, R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{6},
R^{7} y R^{8} son preferiblemente no demasiado voluminosos para
mantener la actividad del análogo de la camptotecina resultante.
Preferiblemente por lo tanto R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{6},
R^{7} y R^{8} tienen independientemente un peso molecular de
menos de aproximadamente 250. Más preferiblemente, R^{1},
R^{2}, R^{3}, R^{6}, R^{7} y R^{8} tienen
independientemente un peso molecular de menos de aproximadamente
200.
Algunos de los análogos de la camptotecina de la
presente invención se pueden preparar para uso farmacéutico como
sales con ácidos inorgánicos, tales como hidrocloruro, hidrobromuro,
sulfato, fosfato y nitrato. Los análogos de la camptotecina también
se pueden preparar como sales con ácidos orgánicos, tales como
acetato, tartrato, fumarato, succinato, citrato, metanosulfonato,
p-toluensulfonato y estearato. Se pueden usar otros
ácidos como intermedios en la preparación de los compuestos de la
presente invención y sus sales farmacéuticamente aceptables.
Para la purificación, el anillo E (el anillo
lactona) se puede abrir con un metal alcalino, tal como hidróxido
de sodio o hidróxido de calcio, para formar análogos de anillo E
abierto de los compuestos de fórmula (1) como se he mencionado para
los compuestos de fórmula (2). Los intermedios obtenidos de esta
forma son más solubles en agua y pueden ser purificados para
producir, después de tratamiento con un ácido, una forma purificada
de los análogos de la camptotecina de la presente invención.
El anillo E también puede modificarse para
producir análogos de los compuestos de fórmula (1) con diferentes
perfiles de solubilidad en agua o en otros disolventes. Los métodos
para obtener este objetivo incluyen abrir el anillo E con un
hidróxido o un grupo amino soluble en agua o funcionalizar el grupo
hidroxi en la posición 20 del anillo E con un grupo soluble en
agua, tal como un grupo polietilenglicol o un grupo acilo. Dichos
grupos pueden ser introducidos bien en el derivado de la
homocamptotecina o bien en una etapa anterior de la síntesis. Los
análogos preparados de esta forma actúan como
pro-fármacos. En otras palabras, estos análogos
regeneran los compuestos de fórmula (1) (con la estructura de anillo
E cerrado) cuando se administran a un organismo vivo. Véase
Greenwald, R. B. et al., J. Med. Chem. 39: 1938
(1996). Los alquil ésteres resultantes de la acilación en el C20,
por ejemplo, producirán pro-fármacos más lipófilos
que no pueden hidrolizarse hasta que el grupo alquilo sea escindido
enzimáticamente.
Los compuestos de fórmula (1) pueden usarse en
un método de tratamiento de un paciente que comprende administrar
una cantidad farmacéuticamente eficaz de un compuesto de fórmula (1)
o una de sus sales farmacéuticamente aceptables. El compuesto puede
administrarse, por ejemplo, a un paciente que padece cáncer y/o
leucemia. Los compuestos de la presente invención también pueden
actuar como agentes antivíricos (por ejemplo
anti-VIH) y agentes antiparasitarios. Los
compuestos de fórmula (1) pueden ser administrados por cualquier vía
convencional de administración, incluyendo por vía intravenosa,
intramuscular, oral, subcutánea, intratumoral, intradérmica y
parenteral. La cantidad farmacéuticamente eficaz o dosis está
preferiblemente entre 0,01 y 60 mg de uno de los compuestos de
fórmula (1) por kg de peso corporal. Más preferiblemente, la
cantidad farmacéuticamente eficaz o dosis está preferiblemente
entre 0,1 mg y 40 mg de uno de los compuestos de fórmula (1) por kg
de peso corporal. En general, una cantidad farmacéuticamente eficaz
o dosis contiene una cantidad de uno de los compuestos de fórmula
(1) eficaz para que presente un comportamiento antileucemia,
antitumoral (anticanceroso), antivírico y/o antiparasitario. Las
composiciones farmacéuticas que contienen como ingrediente activo
uno de los compuestos de fórmula (1), o una de sus sales
farmacéuticamente aceptables, asociado con un vehículo o diluyente
farmacéuticamente aceptable también están dentro del alcance de la
presente invención.
La presente invención también proporciona una
composición farmacéutica que comprende cualquiera de los compuestos
de fórmula (1) y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La
composición puede contener, por ejemplo, entre 0,1 mg y 3 g, y
preferiblemente entre aproximadamente 0,1 mg y 500 mg de los
compuestos de fórmula (1) y puede estar constituido en cualquier
forma adecuada para el modo de administración.
Las modificaciones estructurales de la presente
invención se encontraron para evitar el enlace de alta afinidad
entre la forma carboxilato de un análogo de la camptotecina y la
HSA, favoreciendo al mismo tiempo las interacciones de la lactona
con los eritrocitos. Una consideración adicional en el diseño de
camptotecinas estables en el plasma y la sangre se refiere a la
estructura del anillo E. Las camptotecinas modificadas en los
anillos A, B, E o en B, E de la presente invención: 1) presentan
una estabilidad aumentada en presencia de la HSA mediante la
eliminación o minimización del enlace altamente preferente de la HSA
con la forma carboxilato sobre la forma lactona; 2) presentan
niveles elevados de lipofilia que favorecen asociaciones reversibles
de las formas lactona de los fármacos con los glóbulos rojos
sanguíneos, retardando y restringiendo de esta forma la extensión
de la hidrólisis del fármaco; y 3) presentan una estabilidad
mejorada en disolución acuosa.
Se ha descubierto además que los nuevos
derivados de la homocamptotecina sustituidos con sililo y estables
en sangre (denominados en la presente memoria silatecanos u
homosilatecanos (hST) con \beta-hidroxilactona)
de la presente invención se pueden preparar mediante una
modificación significativa de un enfoque de síntesis total expuesto
en la solicitud de patente estadounidense Nº 09/212.178, titulada
CAMPTOTHECIN ANALOGS AND METHODS OF PREPARATION THEREOF y
presentada el 15 de diciembre de 1998 y en la solicitud de patente
estadounidense Nº 09/007.872, titulada NOVEL INTERMEDIATES IN THE
SYNTHESIS OF CAMPTOTHECIN AND RELATED COMPOUNDS AND SYNTHESIS
THEREOF y presentada el 15 de enero de 1998. Se sintetizaron nuevos
intermedios para realizar la anulación en cascada de radicales de la
presente invención.
\newpage
Se estudiaron extensamente varios compuestos
modelo de la presente invención, descritos en la fórmula
siguiente:
Las homocamptotecinas de la presente invención
contienen modificaciones en los anillos A,B o B que disminuyen el
enlace preferencial con el carboxilato sobre la lactona de la
albúmina humana. Estas modificaciones en los anillos A, B también
aumentan de forma importante la lipofilia y favorecen asociaciones
de la lactona con las capas dobles de lípidos presentes en la
sangre. Los nuevos compuestos también contienen un anillo E de
\beta-hidroxilactona expandido que mejora la
estabilidad global de los agentes sin pérdida de potencia. En
ensayos de citotoxicidad usando células de cáncer de mama
MDA-MB-435, los silatecanos con
\beta-hidroxilactona de anillo E expandido de la
presente invención presentaron valores de IC_{50} en el intervalo
de 2 a 115 nM. Los compuestos de la presente invención (varios de
los cuales se describen en la fórmula anterior), como resultado de
sus nuevas sustituciones estructurales, tienen estabilidades en
plasma humano y en sangre humana superiores que los agentes
descritos por Lavergne et al.
La síntesis de las camptotecinas con anillos
A,B,E modificados y con anillos B,E modificados de la presente
invención ha llevado a la identificación de las camptotecinas más
estables en sangre que presentan todavía una potencia intrínseca
para ser identificadas. Un beneficio adicional de estos nuevos
agentes es que no presentan ninguna variación significativa
interespecies en las estabilidades en sangre, tales como las de la
9-AC y la camptotecina descritas en el documento
Mi, Z. y Burke, T. G. "Marked Interspecies Variations Concerning
the Interactions of Camptothecin with Serum Albumins: A
Frequency-Domain Fluorescence Spectroscopic
Study", Biochemistry, 33: 12540-12545
(1994). Esta característica muy interesante debería facilitar de
forma importante el proceso de desarrollo de fármacos y la
traducción de las observaciones experimentales y patrones de
dosificación desarrollados en los modelos animales a los ensayos
clínicos.
La figura 1 muestra la síntesis de los
precursores para las reacciones en cascada de radicales.
Las figuras 2a y 2b muestran la síntesis de
nuevos derivados de homocamptotecina/homosilatecano con anillo AB
modificado.
La figura 3 muestra los espectros de emisión de
fluorescencia típicos para un homosilatecano
(7-trimetilsilil-10-aminohomocamptotecina
(DB-38) 1 \muM) en presencia y en ausencia de
membranas de capas dobles de lípidos.
La figura 4 muestra una comparación del enlace
de equilibrio de cuatro nuevos homosilatecanos con SUVs (del inglés:
small unillamelar vesicles: vesículas
unilamelares pequeñas) compuestas por dimiristoilfosfatidilcolina
(DMPC) neutra en PBS, así como con los datos obtenidos para la
camptotecina (CPT) y el topotecano (TPT).
La figura 5 presenta la considerable dependencia
de los espectros de emisión de fluorescencia de la
7-t-butildimetilsilil-10-hidroxihomocamptotecina
(DB-91) 1 \muM en presencia de agua.
La figura 6 muestra los espectros de emisión de
fluorescencia de la
7-t-butildimetilsilil-10-hidroxicamptotecina
(DB-91) 1 \muM en disoluciones de suero salino
tamponado con fosfato (PBS) a pH 7,4 y en PBS a pH 7,4 que contenía
glóbulos rojos sanguíneos sin albúmina a una concentración de (10
\pm 1) x 10^{6} células/\muL.
La figura 7 muestra los espectros de emisión de
fluorescencia del compuesto de la técnica anterior
7-etil-10-hidroxicamptotecina
(SN-38) en disoluciones de suero salino tamponado
con fosfato (PBS) a pH 7,4 y en PBS a pH 7,4 que contenía glóbulos
rojos sanguíneos sin albúmina a una concentración de (10 \pm 1) x
10^{6} células/\muL.
La figura 8 muestra la dependencia con el pH de
la estabilidad de la
7-dimetilsilil-homocamptotecina
(DB-38) 1 \muM en disoluciones de suero salino
tamponado con fosfato (PBS) a valores de pH de 5,0, 7,4, 8,0 y 9,0
determinada usando métodos de HPLC.
\newpage
La figura 9 muestra la dependencia con el pH de
la estabilidad de la
7-t-butil-dimetilsililhomocamptotecina
(DB-81) 1 \muM en disoluciones de suero salino
tamponado con fosfato (PBS) a valores de pH de 5,0, 7,4, 8,0 y 9,0
determinada usando métodos de HPLC.
La figura 10 muestra la dependencia con el pH de
la estabilidad de la
7-t-butildimetilsilil-10-aminohomocamptotecina
(DB90) 1 \muM en disoluciones de suero salino tamponado con
fosfato (PBS) a valores de pH de 5,0, 7,4, 8,0 y 9,0 determinada
usando métodos de HPLC.
La figura 11 muestra la dependencia con el pH de
la estabilidad de la
7-t-butildimetilsilil-10-hidroxihomocamptotecina
(DB91) 1 \muM en disoluciones de suero salino tamponado con
fosfato (PBS) a valores de pH de 5,0, 7,4, 8,0 y 9,0 determinada
usando métodos de HPLC.
La figura 12 muestra las estabilidades mejoradas
de cuatro nuevos homosilatecanos de la presente invención en
disolución de PBS, determinadas usando métodos de HPLC.
La figura 13 muestra las estabilidades mejoradas
de cuatro nuevos homosilatecanos de la presente invención en
PBS/HSA, determinadas por métodos de HPLC.
La figura 14 muestra las estabilidades en plasma
humano de cuatro nuevos homosilatecanos de la presente invención,
determinadas usando métodos de HPLC.
La figura 15 muestra las estabilidades de cuatro
nuevos homosilatecanos de la presente invención en suspensiones de
PBS que contenían concentraciones fisiológicamente importantes [(5
\pm 1) x 10^{6} células/\muL] de glóbulos rojos sanguíneos sin
albúmina.
La figura 16 muestra las estabilidades mejoradas
en sangre humana de cuatro nuevos homosilatecanos de la presente
invención, determinadas usando métodos de HPLC.
La figura 17 muestra las estabilidades mejoradas
en sangre humana de cuatro nuevos homosilatecanos de esta invención
con respecto a agentes clínicamente importantes de la técnica
anterior que incluyen la 9-aminocamptotecina (9AC),
la camptotecina (CPT), el topotecano (TPT) y el
SN-38.
Los compuestos de la fórmula 1 de la presente
invención se pueden preparar según los esquemas de síntesis
esquematizados en las figuras 1 y 2. La figura 1 muestra la síntesis
de una yodopiridona 9 clave que se puede usar para elaborar los
compuestos de la fórmula 1. La síntesis de 9 comienza a partir del
enol éter 3, un intermedio en la síntesis de la camptotecina y sus
análogos. Véase la solicitud de patente estadounidense Nº
09/007.872. La dihidroxilación seguida por escisión oxidante
proporciona el cetoformato 5 que se extiende a continuación
mediante una reacción de Reformatsky para dar 6. De forma
conveniente, el grupo formilo se escinde en esta reacción, una
escisión favorecida por un ácido del t-butil éster
produce directamente la \beta-hidroxilactona 7.
Este compuesto se convierte a continuación en la yodopiridona 9
mediante una secuencia de 1) desililación yodante y 2)
desmetilación.
La figura 2a muestra la conversión de la
yodopiridona 9 en varios derivados modelo de homocamptotecina
modificados en AB. La N-propargilación de 9 en
condiciones optimizadas proporciona los precursores radicálicos
10a,b. Las anulaciones de radicales en cascada de estos precursores
con los isonitrilos indicados dan los productos 1a, c, e, g, h. Los
productos 1a, c, e se desprotegen a continuación por medios
convencionales para proporcionar los candidatos a fármacos diana
1b, d, f con los rendimientos totales indicados. Los compuestos 1g y
1h no necesitan desprotección. La síntesis de nuevos compuestos
adicionales de la presente invención se describe en la sección de
Ejemplos de la presente solicitud.
Lavergne y colaboradores describen dos vías para
elaborar derivados del homosilatecano, pero ambas tienen
limitaciones importantes. La primera implica la conversión de un
derivado de camptotecina estándar en un derivado de la
homocamptotecina mediante una serie de etapas que implican el
desmontaje de la lactona normal y el nuevo ensamblaje de la lactona
homologada. Esta vía está limitada porque requiere que exista una
camptotecina para empezar. Además, muchos de los derivados de la
camptotecina existentes llevan sustituyentes de los que no se
esperaría que sobrevivan en las severas condiciones de la formación
de la lactona. Este procedimiento necesita las etapas de reducción,
oxidación, ácido fuerte y base fuerte. La segunda vía implica una
síntesis total usando una ciclación catalizada con paladio para
formar el anillo C. Esta vía está limitada por la disponibilidad de
precursores del anillo A y por la capacidad de sus sustituyentes
para sobrevivir durante las varias etapas subsiguientes de la
síntesis. Además, la síntesis no parece ofrecer la posibilidad de
introducir muchos sustituyentes en el anillo B, incluyendo los
sustituyentes descritos en la presente memoria.
Por el contrario, los esquemas de síntesis en
cascada de radicales de la presente invención son mucho más
tolerantes y flexibles y se pueden usar para obtener derivados de la
homocamptotecina con muchos perfiles de sustitución en A, B o A/B,
como se muestra, por ejemplo, en la figura 2b. Generalmente, se
pueden usar varios reactivos en la cascada de radicales incluyendo
hexametil-diestaño, hexametildisilano o
tetrakis(trimetilsilil)silano. La fuente de energía
para esta reacción puede ser una lámpara solar o una lámpara de
ultravioleta. La temperatura se ajusta preferiblemente entre
aproximadamente 25 y 150ºC. Más preferiblemente, la temperatura se
ajusta a aproximadamente 70ºC. Generalmente no hay limitaciones
sobre la elección del disolvente usado, aparte de que sea inerte
frente a la cascada de radicales. Los disolventes preferidos
incluyen benceno, tolueno, benzotrifluoruro, acetonitrilo, THF y
ter-butanol. Además, hay una gran libertad en la
elección de los sustituyentes del alquino (R^{6}) y el isonitrilo
(R^{1}-R^{4}) en los esquemas de síntesis de la
presente invención debido a la suavidad de las condiciones de
reacción. Además, en los casos raros en los que los derivados del
propargilo no se preparen fácilmente, se pueden sustituir por
derivados de alilo en su lugar y se forman los mismos productos
finales, aunque con un menor rendimiento.
El sustituyente en C20 (R^{5}) también se
puede variar ampliamente ya que se obtiene a partir de alcoholes
alílicos fácilmente disponibles. También se pueden usar ésteres
sustituidos en la reacción de Reformatsky para proporcionar
compuestos con sustituyentes en C20a (R^{13}). Aunque los
compuestos de esta invención pueden usarse en forma racémica para
quimioterapia, es más preferible usar muestras que sean
exclusivamente o predominantemente el enantiómero biológicamente
activo en C20. Debido a un cambio de prioridades en las Reglas de
Cahn-Ingold-Prelogs para la
asignación de la configuración absoluta, el enantiómero S en C20 de
una camptotecina estándar generalmente tiene la misma configuración
relativa que el enantiómero R en C20 de la homocamptotecina
correspondiente. Las muestras racémicas o enantioméricamente
enriquecidas de los derivados de la homocamptotecina se pueden
separar en sus componentes individuales por métodos convencionales
de cromatografía líquida, usando columnas quirales disponibles
comercialmente. Véase Lavergne, O. et al.
"Homocamptothecins: Synthesis and Antitumor Activity of Novel
E-Ring Modified Camptothecin Analogs", J. Med.
Chem. 41, 5410-5419 (1998).
\vskip1.000000\baselineskip
Recientemente, las emisiones fluorescentes
intrínsecas de las formas lactona y carboxilato de la camptotecina
y sus análogos relacionados han sido estudiadas con el fin de
aclarar sus interacciones considerablemente diferentes con los
componentes de la sangre humana. Burke, T. G. y Mi, Z. "Ethyl
substitution at the 7 position extended the
half-life of 10-hydroxycamptothecin
in the presence of human serum albumin", J. Med. Chem.
36: 2580-2582 (1993); Burke, T. G., Mishra, A. K.,
Wani, M. y Wall, M. "Lipid Bilayer Partitioning and Stability of
Camptothecin Drugs", Biochemistry, 32:
5352-5364 (1993); Burke, T. G. y Mi, Z.
"Preferential Binding of the Carboxilate Form of Camptothecin by
Human Serum Albumin", (1993a) Anal. Biochem. 212,
285-287; Burke, T. G. y Mi, Z. "The Structural
Basis of Camptothecin Interactions with Human Serum Albumin: Impact
on Drug Stability" (1994), J. Med. Chem. 37:
40-46; Burke, T. G., Munshi, C. B., Mi, Z. y Jiang,
Y. "The Important Role of Albumin in Determining the Relative
Human Blood Stabilities of the Camptothecin Anticancer Drugs",
(1995) J. Pharma. Sci. 84: 518-519; Mi, Z. y
Burke, T. G. "Differential Interactions of Camptothecin Lactone
and Carboxilate Forms with Human Blood Components", (1994a),
Biochemistry 33: 10325-10336; Mi, Z. y
Burke, T. G. "Marked Interspecies Variations Concerning the
Interactions of Camptothecin with Serum Albumins: A
Frequency-Domain Fluorescence Spectroscopic
Study", (1994b) Biochemistry 33:
12540-12545: y Mi, Z., Malak, H. y Burke, T. G.
"Reduced Albumin Binding Promotes the Stability and Activity of
Topotecan in Human Blood", (1995) Biochemistry
34:13722-13728.
En suero salino tamponado con fosfato (PBS) a pH
7,4, la espectroscopia de la persistencia de la fluorescencia en el
dominio de la frecuencia revela que la albúmina de suero humano
(HSA) se enlaza preferentemente con la forma carboxilato de la
camptotecina con una afinidad 200 veces mayor que la de la forma
lactona. Estas interacciones hacen que la camptotecina se abra más
rápida y completamente en presencia de la HSA que en ausencia de la
proteína. En el plasma humano, pH 7,4 y 37ºC, la lactona de la
camptotecina se abre rápida y totalmente a la forma carboxilato con
un valor del t_{1/2} de 11 minutos y un porcentaje casi
despreciable de lactona con un valor de equilibrio de 0,2%. En la
sangre total frente al plasma, la camptotecina presentó una
estabilidad aumentada (valor de t_{1/2} de 22 minutos y un
porcentaje de lactona con un valor de equilibrio de 5,3%). Se
encontró que la estabilidad aumentada de la lactona de la
camptotecina en la sangre humana es un resultado de las
asociaciones del fármaco con las capas dobles de lípidos de los
glóbulos rojos sanguíneos. La camptotecina se enlaza con las
membranas de eritrocito, el fármaco se localiza en la región de la
cadena acilo y, consecuentemente, permanece protegida de la
hidrólisis.
También se han comparado las estabilidades en la
sangre humana de los distintos análogos de la camptotecina de
interés clínico. Como se observó en el caso de la camptotecina, se
observó que la 9-aminocamptotecina
(9-AC) se hidroliza casi completamente (>99%) en
disolución de PBS que contiene HSA. Aunque no se intentó cuantificar
espectroscópicamente las afinidades de enlace relativas de las
formas lactona y carboxilato del análogo 9-amino
(debido a los rendimientos cuánticos de fluorescencia
significativamente reducido de las especies lactona y carboxilato
de la 9-AC con respecto a la camptotecina), los
datos de HPLC fueron consistentes con el enlace preferencial de la
HSA con la forma carboxilato de este agente frente a su forma
lactona. En el plasma se observó que >99,5% del análogo
9-amino de la camptotecina se convirtió en
carboxilato, un descubrimiento que de nuevo es muy semejante a los
datos de estabilidad obtenidos usando la camptotecina. En sangre
total, <0,5% y 5,3% son las fracciones de
9-aminocamptotecina y camptotecina, respectivamente,
que permanecieron en la forma lactona en equilibrio. El nivel
aproximadamente 10 veces mayor de lactona que queda en equilibrio
para la camptotecina con respecto a la
9-aminocamptotecina puede ser en parte explicado por
la lipofilia aumentada y la mayor capacidad de la camptotecina para
la transición desde el medio acuoso y dentro de las membranas de
eritrocito presentes en la sangre total.
En contraste con los bajos niveles de lactona
que permanecen en equilibrio en la sangre humana total para la
camptotecina y la 9-aminocamptotecina (< 0,5% y
5,3%, respectivamente), el topotecano (11,9%), la
CPT-11 (21,0%) y el SN-38 (19,5%)
presentan todos estabilidades en sangre aumentadas. Mientras que los
niveles de lactona en el equilibrio para el topotecano son 20 veces
mayores que los de la 9-aminocamptotecina, los
niveles de lactona correspondientes para la CPT-11
y el SN-38 son aproximadamente 40 veces mayores que
en el caso de la 9-aminocamptotecina. Los aumentos
significativos en las estabilidades relativas del topotecano, la
CPT-11 y el SN-38 se pueden
correlacionar con sus interacciones favorables con la HSA. Se cree
que los sustituyentes estructurales en las posiciones 7 y 9
dificultan y evitan el enlace preferencial de las formas carboxilato
del fármaco con la HSA. Recientemente se ha usado la técnica de
anisotropía de fluorescencia resuelta temporalmente para demostrar
que, en condiciones experimentales en las que el carboxilato de la
camptotecina se asocia con la HSA y pasa a la disolución
estrechamente asociado con la proteína, las formas carboxilato del
topotecano y la CPT-11 no se asocian con la HSA. En
el caso del SN-38, se han obtenido evidencias
espectroscópicas directas que indican que la HSA se enlaza
preferentemente con la forma lactona de este agente, desplazando de
este modo el equilibrio lactona-carboxilato hacia la
lactona.
Estas observaciones indican que la HSA tiene un
papel importante en la determinación de las estabilidades relativas
en la sangre humana de las camptotecinas. En los casos de la
camptotecina y la 9-aminocamptotecina, la proteína
actúa como un sumidero para la forma carboxilato del fármaco,
enlazándose con la especie de anillo abierto y desplazando de este
modo el equilibrio lactona-carboxilato hacia la
derecha. Sin embargo, en los casos del topotecano, la
CPT-11 y el SN-38, no se ha
observado dicho enlace preferencial de la forma carboxilato del
fármaco con la HSA. En oposición a la situación de la camptotecina y
su análogo 9-amino, la HSA se enlaza
preferentemente a la forma lactona del SN-38 que
favorece de este modo mayores niveles circulatorios de esta especie
biológicamente activa.
La rápida y extensa pérdida de fármaco activo
que se produce con las camptotecinas clínicamente importantes indica
que sería muy ventajoso identificar camptotecinas con estabilidades
aumentadas en sangre humana.
En los estudios presentes, se modificó la
camptotecina en los anillos A y B con el efecto de: 1) reducir el
enlace a la proteína; 2) aumentar la lipofilia; y 3) producir tanto
una reducción concomitante del enlace del carboxilato a la albúmina
humana como también aumentar la lipofilia. También se incluyó un
anillo E expandido en el diseño de los compuestos presentes. Estos
estudios han llevado al diseño de nuevas camptotecinas con anillos
A, B, E modificados que son los análogos de la camptotecina más
estables en sangre e intrínsecamente potentes que han sido
identificados hasta ahora, con parámetros de estabilidad en sangre
que superan al compuesto homocamptotecina de la técnica anterior,
así como de los análogos de la camptotecina con anillos A,B
modificados que contienen un grupo funcional
\alpha-hidroxilactona convencional. Los nuevos
análogos de la camptotecina de la presente invención presentan
propiedades únicas, tales como estabilidades en sangre humana
superiores en combinación con actividades anticancerosas
elevadas.
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 3 muestra los espectros de emisión de
fluorescencia del DB-38 1 \muM en suero salino
tamponado con fosfato (PBS) y capas dobles de lípidos. Los datos
indican que después de la introducción de las capas dobles de
lípidos en la muestra hay un aumento en la emisión de fluorescencia
del compuesto, indicativo de una interacción entre el fármaco y la
membrana. Al cambiar el disolvente a etanol, la fluorescencia
también cambia. En cada caso, con las membranas hay un considerable
aumento en la intensidad de la fluorescencia a medida que el
fármaco se distribuye en el medio microscópico de capas dobles de
lípidos. En cada caso, hay también un importante desplazamiento
hacia el azul, o un desplazamiento en el espectro de emisión hacia
longitudes de onda menores después de la interacción del fármaco
con la membrana (véase la tabla 1). Los datos espectrales
presentados en la figura 3 indican que los homosilatecanos son
fluorescentes y que los parámetros espectrales de los fármacos
cambian después de la adición de membranas de doble capa de lípidos
a las muestras. La tabla 1 mostrada a continuación compara las
longitudes de onda de máxima excitación y emisión de los nuevos
análogos del homosilatecano. También se examinaron las
interacciones de membrana de las formas de anillo abierto del
DB-90 y DB-91 y los resultados
indican un desplazamiento espectral similar para las especies de
anillo abierto.
La naturaleza fluorescente intrínseca de las
formas lactona y carboxilato de los homosilatecanos permite emplear
el método sensible de valoración de la anisotropía de fluorescencia
en estado estacionario para determinar la fuerza de las
interacciones del enlace de los distintos análogos con las capas
dobles de lípidos.
Una medida de la anisotropía de fluorescencia en
estado estacionario (a) está relacionada con la velocidad rotacional
de la molécula fluorescente mediante la ecuación de Perrin:
a_{o}/a = 1 +
(\tau/\phi)
donde a_{o} es la anisotropía de
fluorescencia limitante en ausencia de rotaciones despolarizantes,
\tau es la vida media del estado excitado y \phi es el tiempo
de correlación rotacional del fluoróforo. La ecuación anterior
indica que cambios en los valores bien de \tau o bien de \phi de
un compuesto fluorescente pueden modular su anisotropía en estado
estacionario.
Se examinaron los valores de la vida media del
estado excitado de la camptotecina en PBS, glicerol y metanol a
37ºC. Se determinó que los valores de la vida media eran 4,7 ns, 3,8
ns y 3,5 ns, respectivamente. De forma similar, se midió el valor
de la vida media de la camptotecina cuando se asocia con capas
dobles de lípidos DMPC a 37ºC y se encontró que el valor medio para
el fármaco enlazado a la membrana era de 3,7 ns.
Por lo tanto, las medidas de la vida media
descritas anteriormente indican que la vida media de la camptotecina
es relativamente insensible frente a las alteraciones en el medio
microscópico (por ejemplo, un cambio en el disolvente o en la
reubicación del fluoróforo de un medio acuoso a una membrana
fosfolipídica). Para un fluoróforo que tiene un valor de \tau que
permanece relativamente constante durante una transición que impacta
fuertemente sobre su movimiento rotacional (tal como un cambio en
la viscosidad del disolvente o el enlace del fluoróforo a conjuntos
macromoleculares grandes tales como partículas liposómicas), la
ecuación de Perrin indica que existirá una relación directa entre a
y los valores de \phi (es decir, cuando el valor de \phi del
compuesto fluorescente aumenta entonces ocurre lo mismo con su valor
de la anisotropía en estado estacionario).
Se ha demostrado que los valores de la
anisotropía de la fluorescencia en estado estacionario de los
análogos de la camptotecina y de los nuevos homosilatecanos son muy
sensibles a la viscosidad del disolvente y a las asociaciones con
vesículas lipídicas unilamelares pequeñas. Por ejemplo, el
topotecano tiene un valor de a de 0,008 en PBS, pero su valor
aumenta 9 veces y 40 veces en los disolventes viscosos octanol y
glicerol, respectivamente. Se observa un aumento en 21 veces en el
valor de a de la camptotecina después del enlace del fármaco a las
vesículas compuestas bien por DMPC o bien por DMPG. Debido a la
sensibilidad del valor de a frente a las asociaciones de los
fármacos de camptotecina con la membrana, se empleó el método de
valoración de la anisotropía de fluorescencia para estudiar el
enlace de equilibrio de los análogos de la camptotecina con las
capas dobles de lípidos. El experimento incluye la determinación de
los valores de a para una serie de muestras en las que la
concentración del fármaco en cada uno se mantuvo constante
(típicamente 1 ó 2 \muM), mientras que la concentración de lípido
entre los miembros de una serie se varió de 0 a 0,29M.
Como consecuencia de las brillantes emisiones de
fluorescencia de los homosilatecanos nuevamente sintetizados (puede
encontrarse un resumen de sus parámetros espectrales en la tabla 1),
las isotermas de adsorción de las capas dobles de lípidos resumidas
en la figura 4 estaban relativamente libres de cualquier señal de
ruido de fondo. Se usó el método de valoración de la anisotropía de
la fluorescencia para obtener las isotermas de adsorción. Los
experimentos se realizaron con concentraciones de fármaco de 1
\muM en disolución tampón de PBS (37ºC). Los valores de la
anisotropía del DB-38, DB-90 y
DB-91 se valoraron mucho más rápidamente que los de
la camptotecina o el topotecano, lo que indica que los nuevos
homosilatecanos tienen interacciones mucho más fuertes con estas
membranas que la camptotecina y el topotecano. Debido al potencial
del anillo lactona de los homosilatecanos y camptotecinas para
hidrolizarse en PBS, los valores de la anisotropía para cada
concentración de lípido se determinaron inmediatamente
(aproximadamente 1 minuto) después de la adición de la forma
lactona de cada agente a la suspensión de liposomas, para minimizar
cualquier posibilidad de conversión a la forma carboxilato. Usando
concentraciones de fármaco de 1 \muM y filtros de paso largo para
aislar la luz emitida de la señal del ruido de fondo (es decir, luz
de excitación dispersa señal de fluorescencia residual resultante
de la posible presencia de impurezas), los niveles de señal de los
fármacos disueltos en disolución tampón de PBS fueron típicamente
de 99,97% en ausencia de membrana y mayores de 98% en presencia de
membrana. Las isotermas de adsorción se usaron para determinar las
constantes de asociación totales para los fármacos de
homosilatecano, silatecano y camptotecina. Las constantes de
asociación totales se definen como:
K = [A_{B}] /
[A_{F}]
[L]
donde [A_{B}] representa la
concentración del fármaco enlazado, [A_{F}] representa la
concentración del fármaco libre y [L] representa la concentración
de lípido total en la suspensión de vesículas. Esta ecuación es
válida cuando la concentración de lípido libre es aproximadamente
igual a la concentración total de lípido (es decir, la
concentración de lípido libre está en un exceso significativo sobre
la concentración de fármaco enlazado). Con tal de que se satisfaga
esta condición, la K se puede determinar a partir de la inversa de
la pendiente de una gráfica doblemente recíproca. En dicha gráfica
doblemente recíproca, se representa 1/(fracción del fármaco
enlazado total) frente a 1/(concentración de lípido), con un valor
de la ordenada en el origen de 1 (para un sistema que presente
homogeneidad de sitio de enlace). Dichas gráficas doblemente
recíprocas para las asociaciones de los nuevos análogos de los
homosilatecanos (tanto en forma lactona como en forma carboxilato)
con preparaciones de vesículas unilamelares pequeñas (SUV) de DMPC y
DMPG fueron lineales con buenos coeficientes de correlación. La
linealidad de dichas gráficas, así como las gráficas
correspondientes a asociaciones de los fármacos con otros tipos de
preparaciones de membrana, indican que el enlace del fluoróforo
para estas concentraciones de lípido se describe adecuadamente con
la ecuación
anterior.
Los estudios resumidos en la tabla 2 examinan
las bases estructurales de las asociaciones del homosilatecano con
las capas dobles de lípidos. Se incluyeron dos tipos de membranas en
estos estudios que se realizaron en condiciones de pH y temperatura
próximas a las fisiológicas; estas membranas incluyeron
L-\alpha-dimiristoilfosfatidil-colina
(DMPC) en fase fluida y neutra; y
L-\alpha-dimiristoilfosfatidil-glicerol
(DMPG) en fase fluida y cargado negativamente. La DMPC y el DMPG
tienen la misma longitud de cadena pero las cargas de sus grupos
principales difieren.
\vskip1.000000\baselineskip
En los estudios de la tabla 2, se obtuvieron las
isotermas de enlace usando el método de valoración de la
anisotropía de fluorescencia descrito anteriormente y los valores de
K se determinaron a partir de las pendientes de las gráficas
doblemente recíprocas. Los valores de K tienen un 10% de
incertidumbre. Una de las características más sorprendentes de los
datos presentados en la tabla 2 es la fuerte modulación que se puede
obtener mediante la creación de camptotecinas modificadas en los
anillos A, B, E (por ejemplo, los homosilatecanos denominados
DB-38, DB-90 y
DB-91) o las camptotecinas modificadas en los
anillos B, E (por ejemplo, el homosilatecano denominado
DB-81). Se han obtenido homosilatecanos que
contienen bien una única sustitución el posición 7 o bien una
sustitución doble en las posiciones 7 y 10 y se ha encontrado que
presentan una lipofilia muy elevada. En la tabla 2 se incluyen
compuestos de camptotecina (topotecano y camptotecina). Para el
DB-81, la lipofilia por las membranas de DMPC
aumenta aproximadamente 1.400 veces con respecto al valor
correspondiente para el topotecano. Se incluyeron los datos para
estos agentes para mostrar la naturaleza altamente lipófila de las
nuevas homocamptotecinas con respecto a compuestos tales como el
topotecano y la camptotecina. A partir de la tabla 2 es evidente
que los compuestos de la presente invención son mucho más lipófilos
tanto que la camptotecina como que el topotecano.
Otros descubrimientos interesantes e inesperados
son evidentes después de examinar los datos contenidos en la tabla
2. La comparación de los valores de la K_{DMPC} para los dos
homosilatecanos con sus correspondientes análogos de silatecano (en
los que los sistemas de anillo E son restos
\beta-hidroxilactona frente a restos
\alpha-hidroxilactona, respectivamente) indican
que las homocamptotecinas presentan una lipofilia mayor. Por
ejemplo, los valores de la K_{DMPC} para los silatecanos homólogos
del DM-38 (CHJ-792, K_{DMPC} =
820 M^{-1}) y del DB-91 (DB-67,
K_{DMPC} = 2.500 M^{-1}) son aproximadamente de 2 a 3 veces
menores que los de los homosilatecanos correspondientes. Por lo
tanto, para el DB-38 y el DB-91, el
anillo E expandido es una consideración favorable para el enlace
con la membrana que, a su vez, favorece la estabilidad del fármaco
en la sangre humana.
Se observó otra tendencia sorprendente de los
homosilatecanos cuando se estudiaron las formas carboxilato de los
fármacos. Previamente se había observado una disminución de 3 veces
en la afinidad por la DMPC después de la apertura del anillo
lactona de la camptotecina. Burke, T. G., Mishra, A. K., Wani, M. y
Wall, M. "Lipid Bilayer Partitioning and Stability of
Camptothecin Drugs", Biochemistry, 32:
5352-5364 (1993). Para las homocamptotecinas
DB-90 y DB-91 se ha observado una
disminución de 10 veces en el enlace a la DMPC después de la
apertura del anillo. Por lo tanto, los homosilatecanos no solo
presentan una lipofilia considerablemente aumentada, sino que los
niveles de enlace diferencial entre las formas lactona y carboxilato
son significativamente mayores (10 veces frente a 3 veces) con
respecto a las camptotecinas que contienen sistemas de anillo
\alpha-hidroxilactona. Las dos consideraciones
descritas anteriormente (elevada lipofilia y mayor enlace
diferencial de la forma lactona sobre la forma carboxilato) son
factores que contribuyen a las estabilidades en sangre optimizadas
que presentan los homosilatecanos sobre la camptotecina y la
homocamptotecina.
La figura 5 presenta los espectros de emisión de
fluorescencia de la
7-t-butildimetilsilil-10-hidroxi-homocamptotecina
(DB-91) 1 \muM en disoluciones de suero salino
tamponado con fosfato (PBS) a pH 7,4, etanol y sus mezclas. Todos
los espectros se registraron usando luz de excitación de 394 nm a
37ºC. El máximo de emisión para el DB-91 en PBS es
554 nm, pero este valor se desplaza significativamente hacia una
\lambda_{max} de aproximadamente 410 nm en etanol anhidro.
Debido a que el DB-91 contiene un grupo funcional
hidroxi en la posición 10, existe la posibilidad de que la
fluorescencia se produzca a partir de dos especies distintas. En un
disolvente aprótico o en un medio microscópico no acuoso, predomina
una especie protonada (con respecto al grupo funcional hidroxi en
la posición 10), mientras que en disolventes próticos, tales como el
agua, predomina un complejo de estado excitado desprotonado. El
pico a 554 nm se corresponde con el complejo de estado excitado
desprotonado, mientras que la \lambda_{max} de aproximadamente
410 nm se corresponde con el complejo de estado excitado protonado.
La formación del complejo de estado excitado desprotonado se
facilita de forma importante por la presencia de agua; incluso para
cantidades de agua pequeñas, tales como 1%, se observado un pico a
aproximadamente 550 nm que se corresponde con la formación
facilitada por el agua del complejo de estado excitado desprotonado.
La sensibilidad espectral del DB-91 y otros
miembros de la familia de las camptotecinas que contienen un grupo
funcional hidroxi en la posición 10, proporciona un enfoque útil
para estudiar la distribución del fármaco desde un medio acuoso a un
medio hidrófobo, tal como en la superficie de los glóbulos rojos de
la sangre.
La figura 6 muestra los espectros de emisión de
fluorescencia de la
7-t-butildimetilsilil-10-hidroxi-homocamptotecina
(DB-91) 1 \muM en disoluciones de suero salino
tamponado con fosfato (PBS) a pH 7,4 y en PBS a pH 7,4 que contenía
glóbulos rojos sanguíneos sin albúmina a una concentración de (10
\pm 1) x 10^{6} células/\muL y proporciona una evidencia
directa de las extensas interacciones de un homosilatecano con los
glóbulos rojos de la sangre. Los espectros se recogieron en cubetas
de cara frontal (para optimizar la fluorescencia frente a los
niveles de dispersión) a 37ºC usando una concentración de
DB-91 de 10 \muM y una luz de excitación de 370
nm.
El máximo de emisión para el
DB-91 en PBS es 554 nm. En presencia de glóbulos
rojos sanguíneos, se observa un pico con un valor de
\lambda_{max} significativamente inferior, lo que indica que el
agente es capaz de distribuirse en las membranas de los glóbulos
rojos sanguíneos. Las membranas de los glóbulos rojos sanguíneos
proporcionan un medio microscópico hidrófobo en el que los complejos
de estado excitado protonados se pueden formar y emitir
fluorescencia. La comparación de los espectros de emisión del
DB-91 en presencia de eritrocitos humanos con el de
la
7-etil-10-hidroxicamptotecina
(SN-38) clínicamente importante, como se muestra en
la figura 7, indica que hay una formación más extensa de complejo
de estado excitado protonado en el caso del DB-91.
De forma similar a los estudios de la figura 6, los espectros de la
figura 7 se registraron en cubetas de cara frontal a 37ºC usando
una concentración de SN-38 de 10 \muM y una luz de
excitación de 370 nm. Estos descubrimientos corroboran los estudios
de membrana modelo que indican que el enlace a la membrana de la
SN-38 es significativamente menor que las extensas
interacciones encontradas para la DB-91 (la
SN-38 presenta un valor de K_{DMPC} de 300
M^{-1}, mientras que la DB-91 presenta un valor de
K_{DMPC} de 8.000 M^{-1}). De estos estudios espectroscópicos
se concluye que el nuevo homosilatecano DB-91 es un
agente de interacción con los eritrocitos más lipófilo que el
SN-38 aprobado por la FDA.
Las figuras 8 a 11 muestran la dependencia con
el pH de la estabilidad de disoluciones 1 \muM del
DB-38, DB-81, DB-90
y DB-91 en disoluciones de suero salino tamponado
con fosfato (PBS) para valores de pH de 5,0, 7,4, 8,0 y 9,0. Los
parámetros de estabilidad de cada fármaco se determinaron usando
métodos de HPLC. Todos los experimentos se realizaron a 37ºC. Se
observó hidrólisis a los valores de pH de 7,4, 8,0 y 9,0,
observándose una hidrólisis más extensa a mayores valores de pH.
Aunque se observó hidrólisis a valores de pH de
7,4, 8,0 y 9,0, los datos indican que el anillo lactona de los
homosilatecanos es menos lábil (es decir, se produce la hidrólisis
significativamente más despacio), con respecto tanto a los
silatecanos como a las camptotecinas que contienen el resto de
anillo \alpha-hidroxilactona convencional.
La figura 12 compara las estabilidades
aumentadas de cuatro nuevos homosilatecanos de la presente invención
con las correspondientes estructuras de silatecano que contienen el
grupo funcional \alpha-hidroxilactona. Todos los
experimentos de la figura 12 se realizaron en PBS a 37ºC. Las
divisiones A a D contienen cada una los perfiles de estabilidad de
un nuevo homosilatecano (círculos vacíos) y su correspondiente
silatecano (círculos sólidos) que contiene el resto de anillo
\alpha-hidroxilactona convencional encontrado en
la camptotecina y otros análogos de la camptotecina clínicamente
importantes, tales como el topotecano, el SN-38, la
CPT-11 y la 9-aminocamptotecina.
En todos los casos, los agentes que contienen el
anillo E expandido o las estructuras de homosilatecano presentan
una estabilidad considerablemente aumentada. Los parámetros de
estabilidad para los homosilatecanos se resumen en la tabla 3. Los
datos indican que el anillo lactona de los homosilatecanos es menos
lábil (es decir, se produce la hidrólisis significativamente más
despacio), con respecto al resto de anillo
\alpha-hidroxilactona contenido tanto en los
silatecanos como en las camptotecinas. Para los silatecanos y las
camptotecinas, tales como el topotecano y la camptotecina,
aproximadamente 12% de la lactona permanece en el equilibrio después
de 3 horas, mientras que más del 80% de la lactona permanece para
cada uno de los homosilatecanos en idénticas condiciones de
incubación.
La figura 13 muestra las estabilidades mejoradas
de cuatro nuevos homosilatecanos de la presente invención después
de incubación en PBS que contenía 30 mg/mL de albúmina de suero
humano a 37ºC. Las divisiones A a D contienen cada una los perfiles
de estabilidad de un nuevo homosilatecano y su correspondiente
silatecano que contiene el resto de anillo
\alpha-hidroxilactona convencional encontrado en
la camptotecina y otros análogos de la camptotecina clínicamente
importantes, tales como el topotecano, el SN-38, la
CPT-11 y la 9-aminocamptotecina. En
todos los casos, los agentes que contienen estructuras de anillo E
expandido presentaron estabilidades considerablemente aumentadas en
presencia de la HSA. Los parámetros de estabilidad para los
homosilatecanos se resumen en la tabla 3. Como se muestra en la
figura 14, los homosilatecanos de la presente invención también
presentan estabilidades superiores en plasma humano que las
camptotecinas, tales como el topotecano, el SN-38 y
la CPT-11. De los homosilatecanos, el
DB-81 presenta la mayor estabilidad en plasma
humano, seguido por el DB-90 y el
DB-91, presentando el DB-38 (el
menos lipófilo de los homosilatecanos estudiados) la menos
estabilidad en plasma humano. Todos los experimentos de la figura
14 se realizaron en plasma humano a 37ºC. Las muestras de plasma se
airearon continuamente mediante una corriente de gases sanguíneos
que produjeron el mantenimiento del pH a valores de 7,5\pm0,1. En
todos los casos, los agentes que contienen el anillo E expandido o
las estructuras de homosilatecano presentaron una estabilidad
considerablemente aumentada con respecto a los fármacos de
camptotecina precursores que contienen el resto de anillo
\alpha-hidroxilactona convencional. Los parámetros
de estabilidad para los homosilatecanos se resumen en la tabla
3.
Estos estudios demuestran que tanto los
homosilatecanos lipófilos como los más solubles en agua presentan
estabilidades aumentadas con respecto a la homocamptotecina que no
contiene sustituciones en los anillos A y B. Véase Lavergne et
al. "Homocamptothecins: Synthesis and Antitumor Activity of
Novel E-Ring Modified Camptothecin Analogs",
J. Med. Chem. 41, 5410-5419 (1998). Por lo
tanto, la presente invención indica que la sustitución de los
anillos A y B de la homocamptotecina es un factor favorable con
respecto a las estabilidades en sangre. La explicación probable es
que el carboxilato de la homocamptotecina no sustituida, como el
carboxilato de la camptotecina, se enlaza con la
HSA preferentemente en forma carboxilato y desplaza efectivamente el equilibrio lactona-carboxilato hacia la derecha.
HSA preferentemente en forma carboxilato y desplaza efectivamente el equilibrio lactona-carboxilato hacia la derecha.
Estos resultados indican que se puede obtener
una estabilidad en plasma humano aumentada de forma importante
combinando el farmacóforo \beta-hidroxilactona con
los siguientes cambios estructurales concomitantes: 1) modificación
del anillo B, tal como con un grupo funcional sililo o sililalquilo
en la posición 7 (por ejemplo, DB-81); modificación
del anillo A, tal como las modificaciones estructurales contenidas
en el topotecano (cambios que aumentan la solubilidad en agua como
la inclusión de grupos funcionales dimetilaminometilo en posición 9
e hidroxi en posición 10 desfavorecen el enlace del carboxilato a la
HSA); y 3) sustitución combinada en ambos anillos A y B, que
incluye, por ejemplo un sustituyente sililo o sililalquilo en la
posición 7 (por ejemplo, DB-90 y
DB-91). Véase también Mi, Z., Malak, H. y Burke, T.
G. "Reduced Albumin Binding Promotes the Stability and Activity
of Topotecan in Human Blood", Biochemistry,
34:13722-13728 (1995). Los compuestos del ultimo
ejemplo presentan una lipofilia elevada e interacciones específicas
pequeñas entre la forma carboxilato del fármaco y la HSA,
contribuyendo ambos factores a una estabilidad en plasma
aumentada.
La figura 15 muestra las estabilidades de cuatro
nuevos homosilatecanos de la presente invención en suspensiones de
PBS que contenían concentraciones fisiológicamente importantes
[(5\pm1) x 10^{6} células/\muL] de glóbulos rojos sanguíneos
sin albúmina. Las características de estabilidad se determinaron a
37ºC usando métodos de HPLC. En todos los casos, los agentes que
contienen el anillo E expandido o estructuras de homosilatecano
presentan estabilidades considerablemente aumentadas en presencia de
glóbulos rojos sanguíneos con respecto a los valores publicados en
la bibliografía para los análogos de la camptotecina que contienen
el resto de anillo \alpha-hidroxilactona
convencional (tales como los agentes clínicamente importantes
SN-38, 9-aminocamptotecina,
9-nitrocamptotecina, GI-147211C,
topotecano, etc.). Los parámetros de estabilidad para los
homosilatecanos se resumen en la tabla 3.
La figura 16 y la figura 17 muestran las
estabilidades mejoradas en sangre humana de cuatro nuevos
homosilatecanos de la presente invención. Todos los experimentos se
realizaron a pH 7,4 y 37ºC. En la figura 16, las divisiones A a D
contienen cada una los perfiles de estabilidad de un nuevo
homosilatecano (círculos vacíos) y su correspondiente silatecano
(círculos sólidos) que contiene el resto de anillo
\alpha-hidroxilactona convencional encontrado en
la camptotecina y otros análogos de la camptotecina clínicamente
importantes, tales como el topotecano, el SN-38, la
CPT-11 y la 9-aminocamptotecina y
también agentes experimentales. En todos los casos, los agentes que
contienen el anillo E expandido o estructuras de homosilatecano
presentan estabilidades en sangre humana considerablemente
aumentadas con respecto a los análogos de la camptotecina, tales
como el topotecano y el SN-38. La figura 17 muestra
las estabilidades mejoradas en sangre humana de los nuevos
homosilatecanos de la presente invención en comparación con agentes
clínicamente importantes actuales, incluyendo la
9-aminocamptotecina (9AC), la camptotecina (CPT),
el topotecano (TPT) y el SN-38 (SN38). Los
parámetros de estabilidad de las figuras 16 y 17 se resumen en la
tabla 3.
Los valores de estabilidad en sangre humana
observados para el DB-81, DB-90 y
DB-91 son los mayores medidos hasta ahora para un
análogo de la camptotecina intrínsecamente potente. Los valores de
lactona mayores que 80% después de 3 horas de incubación se
comparan muy favorablemente con respecto a los correspondientes
niveles de porcentaje de lactona en sangre humana total para la
9-aminocamptotecina (aproximadamente 0,3%), la
camptotecina (aproximadamente 6%), el topotecano (aproximadamente
15%), la CPT-11 (aproximadamente 21,0%) y el
SN-38 (aproximadamente 30%).
\vskip1.000000\baselineskip
La camptotecina y la
9-aminocamptotecina, reconocidos agentes
anticancerosos por su nuevo mecanismo de acción y sobresaliente
actividad in vivo en múridos, solo han demostrado hasta el
momento una utilidad terapéutica moderada frente a cánceres
humanos. Los fármacos contienen el resto de anillo lactona que, a pH
7,4, se hidroliza para producir formas carboxilato biológicamente
inactivas. La comparación de las estabilidades del fármaco para la
9-aminocamptotecina revela que la apertura del
anillo se produjo en una extensión mucho mayor en sangre humana que
en sangre de ratón (véase la tabla 4). La camptotecina ha mostrado
previamente un comportamiento similar. Burke, T. G., Munshi, C. B.,
Mi, Z. y Jiang, Y. "The Important Role of Albumin in Determining
the Relative Human Blood Stabilities of the Camptothecin Anticancer
Drugs", J. Pharma. Sci. 84: 518-519
(1995); y Mi, Z. y Burke, T. G. "Marked Interspecies Variations
Concerning the Interactions of Camptothecin with Serum Albumins: A
Frequency-Domain Fluorescence Spectroscopic
Study", Biochemistry, 33: 12540-12545
(1994). Se ha utilizado la técnica de análisis espectroscópico en
multifrecuencia con modulación de fase de las emisiones intrínsecas
de fluorescencia de la lactona y el carboxilato de la camptotecina
para proporcionar una explicación física de la extensa apertura del
anillo observada para la camptotecina y la
9-aminocamptotecina en presencia de albúmina de
suero humano (HSA). LA HSA presenta una preferencia de enlace 200
veces mayor para el carboxilato (K = 1,2x10^{6} M^{-1}) con
respecto a la lactona (K = 5,5x10^{3} M^{-1}). Se encontró que
las albúminas de suero de otras especies no se enlazan al
carboxilato de la camptotecina tan fuertemente como la HSA. Debido
a que la capacidad única de la albúmina humana para enlazarse al
carboxilato de la camptotecina y al carboxilato de la
9-aminocamptotecina produce una extensa conversión
del fármaco a su forma biológicamente inactiva, evidencia que el
éxito de estos agentes en la erradicación del cáncer en modelos
animales puede ser inherentemente más difícil de duplicar en
humanos.
Los datos para los nuevos homosilatecanos de la
presente invención muestran esencialmente solo pequeñas variaciones
entre los niveles de lactona en la sangre de ratón frente a la
sangre humana. Los cambios observados en la sangre de ratón frente
a la humana son muy pequeños en comparación con la diferencia de 100
veces en los niveles de lactona observados para la
9-aminocamptotecina. En los experimentos con sangre
de ratón para la DB-81 y DB-91, los
niveles de lactona realmente observados en la sangre humana eran
moderadamente subestimados en valores de 6% y 20%, respectivamente.
Sin embargo, para la 9-aminocamptotecina en sangre
de ratón se sobreestiman en 100 veces los niveles de lactona
observados realmente en la sangre humana. Estos resultados indican
que hay razones fisiológicas fundamentales para pensar que el éxito
de estos nuevos homosilatecanos en modelos animales puede ser
trasladado más fácilmente a humanos en comparación con agentes tales
como la camptotecina y la 9-aminocamptotecina.
\vskip1.000000\baselineskip
- *
- Los experimentos se realizaron a pH 7,4 y 37ºC y los niveles de lactona se determinaron usando métodos de HPLC. Se extrajeron las muestras sanguíneas y se mantuvieron a 5ºC antes de la iniciación del experimento.
\vskip1.000000\baselineskip
En la tabla 5 se recogen las citotoxicidades de
varias camptotecinas frente a células de cáncer de mama humano
tumorigénicas metastáticas
MDA-MB-435. Los valores de la
citotoxicidad son para tiempos de exposición de 72 horas. En
conjunto, se encontró que el DB-38 es el más potente
de los cuatro nuevos homosilatecanos que se han estudiado, con un
valor de IC_{50} de 20 nM, mientras que los valores de la
IC_{50} para los otros homosilatecanos variaban de 20 nM a 115
nM. Estos resultados indican claramente que a lo largo del
desarrollo del nuevo homosilatecano, la estabilidad de los agentes
en la sangre humana y animal puede aumentarse y equipararse
notablemente sin comprometer las elevadas potencia y citotoxicidad
intrínsecas de esta clase importante de fármacos anticancerosos.
Productos químicos. La camptotecina y el
topotecano estaban en su configuración 20 (S) y eran de alta pureza
(>98) como se determinó mediante análisis por HPLC con detección
de fluorescencia. La preparación de los homosilatecanos se describe
en otra parte de esta solicitud. Todos los otros agentes eran de
grado de reactivo y se usaron sin purificación adicional. El agua
de alta pureza fue proporcionada mediante un sistema de
purificación Milli-Q UV PLUS (Badford, MA) y se usó
en todos los experimentos.
Preparación de la disolución madre de
fármaco. Las disoluciones madre de los fármacos se prepararon en
dimetilsulfóxido (grado espectroscópico de la A. C. S.), Aldrich,
Milwaukee, WI) con una concentración de 2x10^{-3} M y se
almacenaron en la oscuridad a 4ºC. La
L-\alpha-dimiristoilfosfatidilcolina
(DMPC) y el
L-\alpha-dimiristoilfosfatidilglicerol
(DMPC) se obtuvieron de Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL, y se
usaron sin purificación adicional. Todos los demás productos
químicos fueron de grado de reactivo y se usaron sin purificación
adicional.
Preparación de las vesículas. El día del
experimento se prepararon suspensiones de las vesículas unilamelares
pequeñas (SUV) mediante una metodología descrita anteriormente en
Burke y Tritton, Biochemistry 24: 5972-5980
(1985); y en Burke, T. G., Mishra, A. K., Wani, M. y Wall, M.
"Lipid Bilayer Partitioning and Stability of Camptothecin
Drugs", Biochemistry, 32: 5352-5364
(1993). En resumen, las suspensiones madres de lípido que contenían
una cantidad conocida de lípido (200 mg/mL de lípido o menos) en
suero salino tamponado con fosfato (PBS, pH 7,4) se prepararon por
agitación durante 5-10 minutos por encima de la
T_{M} del lípido. A continuación las dispersiones de lípido se
sonicaron usando un baño de ultrasonidos (Laboratory Supplies Co.,
Hicksville, NY) durante 3-4 horas hasta que se
hicieron ópticamente claras. Se observó una disminución del pH de
7,4 a 6,8 para las preparaciones de SUV de DMPG; por lo tanto, el pH
de estas suspensiones de SUV se ajustó a 7,4 usando pequeñas
cantidades de NaOH 2,5M en PBS, seguido por sonicación adicional.
Cada tipo de suspensión de vesículas se templó durante 30 minutos a
37ºC y a continuación se usaron en los experimentos.
Instrumentación de fluorescencia. Las
medidas de fluorescencia en estado estacionario se obtuvieron con
un espectrofluorómetro SLM Modelo 9850 con un compartimento de
cubeta termostatizado. Este instrumento estaba unido mediante una
interfaz con un ordenador IBM PS/2 Modelo 55 SX. Los espectros de
excitación y de emisión se registraron con una resolución en
excitación de 8 nm y una resolución en emisión de 4 nm. En todos los
casos, se corrigieron la fluorescencia residual y la dispersión de
fondo de los espectros procedentes de lípidos no marcados o de los
disolventes mediante la sustracción de un blanco al espectro. Las
medidas de la intensidad de fluorescencia en estado estacionario se
realizaron en ausencia de polarizadores. Las medidas de la
anisotropía en estado estacionario (a) se determinaron con el
instrumento en "formato T" para la medida simultánea de dos
intensidades polarizadas. El alineamiento de los polarizadores se
comprobó de forma rutinaria usando una suspensión diluida de
microesferas de poliestireno de 0,25 \mum (Polysciences Inc.,
Warrington, PA) en agua y se obtuvieron valores de anisotropía de
>0,99. Alternativamente, se comprobó la orientación del
polarizador usando una disolución diluida de glicógeno en agua. Se
calculó la anisotropía a partir de a = (I_{VV} - GI_{VH})/
(I_{VV} + GI_{VH}), donde G = I_{VH}/I_{HH} y los subíndices
se refieren a las orientaciones vertical y horizontal de los
polarizadores de la excitación y la emisión, respectivamente.
Las medidas de anisotropía para los
homosilatecanos y camptotecinas se realizaron usando luz de
excitación de 370 a 400 nm y filtros de paso largo sobre cada canal
de emisión para aislar la señal de fluorescencia del fármaco de la
dispersión de fondo y/o la fluorescencia residual. Todos los filtros
de emisión se obtuvieron de Oriel Corp. (Stamford, CT). La
combinación de luz de excitación y filtros de emisión permitió la
adecuada separación de la fluorescencia y la señal de fondo. La
contribución de la fluorescencia residual, junto con la luz
dispersada, fue típicamente menor que 1% de la intensidad total.
Como los anillos lactona de la camptotecina y sus análogos
relacionados experimentan una hidrólisis en medio acuoso con vidas
medias de aproximadamente 20 minutos, todas las medidas se
completaron en el tiempo más corto posible (aproximadamente 0,5 a 1
minuto) después de mezclar la disolución madre con disoluciones
previamente equilibradas térmicamente, de forma que todos los
experimentos estuvieran libres de productos de hidrólisis. En los
experimentos espectroscópicos de fluorescencia diseñados para
proporcionar información sobre las interacciones de los
homosilatecanos y las camptotecinas con los glóbulos rojos
sanguíneos, se usaron concentraciones de fármaco de 10 \muM. Los
experimentos con glóbulos rojos sanguíneos se realizaron en cubetas
con la cara frontal de cuarzo para optimizar la señal de
fluorescencia y minimizar la luz dispersa.
Determinación de las constantes de enlace de
equilibrio. Se empleó el método de valoración de la anisotropía
de fluorescencia, como se describe en Burke, T. G., Mishra, A. K.,
Wani, M. y Wall, M. "Lipid Bilayer Partitioning and Stability of
Camptothecin Drugs", Biochemistry 32:
5352-5364 (1993), para determinar las
concentraciones de especies de fármaco libres y enlazadas en
suspensiones de liposomas que contenían una concentración total de
fármaco de 1x10^{6}M y variando las concentraciones de lípidos.
Todos los experimentos se realizaron en tubos de vidrio. Las
constantes de asociación totales se definen como K = [A_{B}]/
[A_{F}] [L], donde [A_{B}] representa la concentración de
fármaco enlazado, [A_{F}] representa la concentración de fármaco
libre y [L] representa la concentración total de lípido de la
muestra. Las gráficas doblemente recíprocas de las isotermas de
enlace {1/(fracción de fármaco enlazado} vs. 1/[lípido]} fueron
lineales y los valores de K se determinaron a partir de las
pendientes usando el método de análisis lineal por mínimos
cuadrados. Se escribió un programa informático basado en la
relación K = [A_{B}]/ [A_{F}] [L] para predecir los niveles de
fármaco enlazado para valores específicos de K y de fármaco
total.
Cinética de la apertura del anillo lactona de
los homosilatecanos, silatecanos y camptotecinas. Se determinó
la cinética de la hidrólisis de las camptotecinas en presencia de
distintos componentes de la sangre mediante análisis cuantitativos
por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en fase inversa
C18, modificados de las metodologías descritas previamente en la
bibliografía citada anteriormente. La preparación de las muestras
de sangre total y sangre fraccionada se realizó como se ha descrito
anteriormente. Se usó HSA cristalizada de alta pureza (>97%) de
Sigma Chemical (St. Louis, MO). Se prepararon disoluciones madre de
HSA en disolución tampón de PBS con un pH final de 7,40\pm0,05.
Las concentraciones de HSA se determinaron por absorbancia de UV a
278 nm usando un coeficiente de extinción de 39.800
M^{-1}cm^{-1} (Porter, 1992). Todos los agentes fueron de grado
de reactivo y se usaron sin purificación adicional. En todos los
experimentos se usó agua de alta pureza proporcionada por un
sistema de purificación Milli-Q UV PLUS. Los
disolventes para HPLC fueron de Fisher Scientific. El plasma y los
glóbulos rojos sanguíneos humanos se obtuvieron a partir de un
donante varón en tubos heparinizados, se almacenaron a
5-10ºC y se usaron tan pronto como fue posible
(generalmente en 1 semana). La sangre de ratones se recogió en tubos
heparinizados y se almacenó a 5-10ºC hasta su
utilización.
Los análisis por HPLC se realizaron con un
sistema de HPLC Waters Alliance 2690 equipado con un automuestreador
controlado térmicamente y un detector de fluorescencia de barrido
Waters 474. Un segundo sistema de HPLC era un sistema de HPLC
Waters compuesto por bombas de HPLC 501, automuestreador controlado
térmicamente 717 Plus y un detector de fluorescencia de barrido
470. Los procedimientos de análisis por HPLC usados para los
homosilatecanos se resumen a continuación. El disolvente A
consistía en acetonitrilo y el disolvente B fue acetato de
trietilamonio al 2%, pH 5,5, con un caudal de 1 mL/minuto. Para el
DB-38 se usó elución isocrática: 33% de disolvente
A, 67% de disolvente B; \lambda_{ex} = 345 nm y
\lambda_{em} = 518 nm. Para el DB-81 se usó
elución isocrática: 56% de disolvente A, 44% de disolvente B;
\lambda_{ex} = 375 nm y \lambda_{em} = 444 nm. Para el
DB-90 se usó elución isocrática: 41% de disolvente
A, 59% de disolvente B; \lambda_{ex} = 412 nm y \lambda_{em}
= 526 nm. Para el DB-91 se usó una elución
isocrática de 42% de disolvente A, 58% de disolvente B, y
\lambda_{ex} = 392 nm y \lambda_{em} = 562 nm.
Para determinar las estabilidades de los
homosilatecanos en PBS, se añadió una alícuota de cada uno de los
homosilatecanos en DMSO a suero salino tamponado con fosfato (PBS),
pH 7,4 en un frasco del automuestreador de HPLC mantenido a 37ºC en
un baño de agua para obtener una concentración final de fármaco de 1
\muM. El frasco que contenía el fármaco se transfirió rápidamente
al automuestreador mantenido a 37ºC y se analizaron las alícuotas a
varios tiempos. Todas las determinaciones se hicieron por
triplicado. Los datos se recogieron y se analizaron usando un
programa informático de Waters Millenium. La fracción de lactona se
calculó usando el área de pico de los picos de la lactona y del
carboxilato y usando la relación lactona/carboxilato.
Para determinar la estabilidad del fármaco en la
sangre total, se incubó la sangre total a 37ºC durante 30 minutos a
pH determinado. El pH de la sangre se ajustó a 7,4\pm0,5 usando
bien KOH 0,1M o bien HCl 0,1M. Se incubaron las muestras de sangre
a 37ºC durante 30 minutos y se volvió a medir el pH para asegurar
que estaba en el intervalo anterior y se inició el ensayo
individual. Se tomaron alícuotas de sangre (2 mL cada una) y se
colocaron en tres tubos de ensayo de vidrio desechables y los tubos
se incubaron a 37ºC. A continuación se añadió a la sangre una
alícuota de fármaco en DMSO para obtener una concentración final de
fármaco de 1 \muM. Se prosiguió la incubación a 37ºC y se tomaron
alícuotas de 150 \muL a diferentes tiempos y se añadieron a 600
\muL de metanol frío (-20ºC) en un tubo de Eppendorf. A
continuación el tubo se agitó durante 10 segundos y se centrifugó
en una microcentrífugadora de sobremesa a 8.000 rpm durante 45
segundos. Se eliminó el sobrenadante y se colocó en un frasco de
automuestreador y el frasco se introdujo rápidamente en el
automuestreador mantenido a 4ºC. La muestra se analizó
inmediatamente en el sistema de HPLC. El análisis de los datos fue
como se ha descrito para las muestras de fármaco y PBS solos.
Para estudiar la estabilidad de los
homosilatecanos en PBS que contenía albúmina de suero humano (HSA),
se disolvió en HSA en PBS, pH 7,4, a la concentración de 30 mg/mL y
se incubó a 37ºC. Se midió el pH y se ajustó a 7,4\pm0,5 usando
KOH 0,1M o HCl 0,1M. La incubación prosiguió hasta que el pH se
estabilizó en el intervalo deseado. Se tomó una alícuota de PBS/HSA
y se colocó en un frasco del automuestreador y se mantuvo a 37ºC
durante 10 minutos. Se añadió a la muestra una alícuota del fármaco
en DMSO resultando una concentración final del fármaco de 1 \muM.
Se introdujo rápidamente el frasco en el automuestreador del HPLC
mantenido a 37ºC y se inyectaron y analizaron por HPLC alícuotas a
diferentes tiempos. El análisis de los datos fue como se ha descrito
anteriormente para las muestras de fármaco y PBS solos.
Para caracterizar las estabilidades de los
nuevos silatecanos de interés en plasma humano se incubó plasma
helado a 37ºC para descongelarlo. Se burbujeó gas sanguíneo a través
del plasma para ajustar el pH a aproximadamente 7,5. Se incubaron
alícuotas de plasma (5 mL) a 37ºC en tubos de ensayo de cristal
desechables y se añadió disolución madre de fármaco en DMSO hasta
obtener una concentración final de fármaco de 1 \muM. A
continuación se dejó que las muestras se incubaran adicionalmente a
37ºC. Se tomaron alícuotas (150 \muL) a diferentes tiempos y se
añadieron a 600 \muL de metanol frío (-20ºC) en un tubo de
Eppendorf. Los tubos se agitaron durante 10 segundos y se
centrifugaron en una microcentrifugadora de sobremesa a 8.000 rpm
durante 45 segundos. Se eliminó el sobrenadante y se colocó en un
frasco de automuestreador y el frasco se introdujo rápidamente en
el automuestreador mantenido a 4ºC. La muestra se analizó por HPLC
tan pronto como fue posible. El análisis de los datos fue como el
descrito para las muestras de fármaco y PBS solos como se ha
indicado anteriormente. Se burbujeó continuamente gas sanguíneo a
través de las muestras de plasma para mantener el pH a 7,5 \pm
1,0.
Para estudiar las estabilidades de los nuevos
homosilatecanos en presencia de concentraciones fisiológicamente
importantes de glóbulos rojos sanguíneos (abreviados generalmente
como RBC por sus iniciales en inglés: red blood cells), se
realizaron los siguientes experimentos. Los glóbulos rojos
sanguíneos envasados se obtuvieron de Central Kentucky Red Cross y
se contaron usando un contador de células Counter. El número de
células se ajustó a 5x10^{12} células/L usando PBS, pH 7,4, y se
incubaron a 37ºC durante 30 minutos. Se midió el pH de las muestras
y se ajustó a 7,4\pm0,5 usando bien KOH 0,1M o bien HCl 0,1M. Los
RBCs se incubaron a 37ºC durante 30 minutos y se volvió a medir el
pH para asegurar que estaba en el mismo intervalo que anteriormente
antes de empezar los análisis. Se tomaron alícuotas de RBCs (2 mL
cada una) y se colocaron en tres tubos de ensayo de vidrio
desechables y los tubos se incubaron a 37ºC. Se añadieron a las
suspensiones de RCBs en PBS alícuotas del fármaco en DMSO para
obtener una concentración final de fármaco de 1 \muM. Se prosiguió
la incubación a 37ºC y se tomaron alícuotas de 150 \muL a
diferentes tiempos y se añadieron a 600 \muL de metanol frío
(-20ºC) presente en un tubo de Eppendorf. Los tubos se agitaron
durante 10 segundos y se centrifugaron en una microcentrífugadora
de sobremesa a 8.000 rpm durante 45 segundos. Se eliminó el
sobrenadante y se colocó en un frasco de automuestreador y el
frasco se introdujo rápidamente en el automuestreador mantenido a
4ºC. La muestra se analizó por HPLC tan pronto como fue posible. El
análisis de los datos fue como el descrito para las muestras de
fármaco y PBS solos como se ha indicado anteriormente.
Cambios espectrales en la fluorescencia
debidos a las interacciones de los homosilatecanos con las membranas
de doble capa de lípidos. Se recogieron los datos de emisión de
fluorescencia para los homosilatecanos en disoluciones de suero
salino tamponado con fosfato (PBS) a pH 7,4 y etanol. También se
adquirieron datos para los nuevos agentes en presencia de
suspensiones de vesículas unilamelares pequeñas (SUVs) compuestas
bien por dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) neutra en PBS o bien
por dimiristoilfosfatidilglicerol cargado negativamente (DMPG) en
PBS. Se usaron concentraciones de lípido de 5mM. Para el
DB-38 todos los espectros se registraron usando luz
de excitación de 410 nm a 37ºC. El máximo de emisión para el
DB-38 en PBS es 531 nm y este valor se desplaza a
valores inferiores en presencia de las membranas (\lambda_{max}
de 515 nm en presencia de vesículas de DMPC y \lambda_{max} de
517 nm en presencia de vesículas de DMPG). Los desplazamientos
espectrales del DB-38 que se producen en presencia
de las membranas indican que el agente es capaz de enlazarse tanto
a membranas neutras como a membranas cargadas negativamente. Los
registros espectrales se iniciaron y completaron poco tiempo
después de la adición de la forma lactona del agente a la disolución
o suspensión, asegurando de esta forma que la señal detectada
proviene predominantemente de la forma lactona del agente (y no de
la forma de anillo abierto).
También se examinaron los espectros de emisión
de fluorescencia de la
7-t-butil-dimetilsililhomocamptotecina
(DB-81) 1 \muM. Se usaron concentraciones se
lípido de 10mM. Todos los espectros se registraron usando luz de
excitación de 380 nm a 37ºC. El máximo de emisión para el
DB-81 en disolución tampón de PBS es 452 nm y este
valor se desplaza a valores inferiores en presencia de las membranas
(\lambda_{max} de 443 nm en presencia de vesículas de DMPC y
\lambda_{max} de 442 nm en presencia de vesículas de DMPG). Los
desplazamientos espectrales del DB-81 que se
producen en presencia de las membranas indican que el agente es
capaz de enlazarse tanto a membranas neutras como a membranas
cargadas negativamente.
También se examinó el espectro de emisión de
fluorescencia de la
7-t-butil-dimetilsilil-10-aminohomocamptotecina
(DB-90) 1 \muM. Todos los espectros se
registraron usando luz de excitación de 430 nm a 37ºC. El máximo de
emisión para el DB-90 en PBS es 535 nm y este valor
se desplaza a valores inferiores en presencia de las membranas
(\lambda_{max} de 513 nm en presencia de vesículas de DMPC y
\lambda_{max} de 512 nm en presencia de vesículas de DMPG).
También se estudió el espectro de emisión de
fluorescencia de la
7-t-butildimetilsilil-10-hidroxi-homocamptotecina
(DB-91) 1 \muM. Se usaron concentraciones de
lípido de 10mM. Todos los espectros se registraron usando luz de
excitación de 394 nm a 37ºC. El máximo de emisión para el
DB-91 en PBS es 554 nm y este valor se desplaza a
valores inferiores en presencia de las membranas (\lambda_{max}
de 441 nm en presencia de vesículas de DMPC y \lambda_{max} de
434 nm en presencia de vesículas de DMPG).
También se estudió el espectro de emisión de
fluorescencia de 1 \muM de la forma carboxilato de la
7-t-butil-dimetilsilil-10-aminohomocamptotecina
(carboxilato de DB-90). Se usaron concentraciones
de lípido de 0,15 mM. La concentración de lípido usada en estos
experimentos fue mayor que en los experimentos realizados usando la
forma lactona correspondiente del DB-90; se usaron
concentraciones mayores de lípido debido a las pequeñas asociaciones
con la membrana de la forma de anillo abierto del fármaco con
respecto a la forma lactona de anillo cerrado del fármaco. Todos los
espectros se registraron usando luz de excitación de 430 nm a 37ºC.
El máximo de emisión para el carboxilato de DB-90
en PBS es 529 nm y este valor se desplaza a valores inferiores en
presencia de las membranas (\lambda_{max} de 512 nm en
presencia de vesículas de DMPC y \lambda_{max} de 512 nm en
presencia de vesículas de DMPG).
También se obtuvo el espectro de emisión de
fluorescencia de 1 \muM de la forma de anillo abierto o
carboxilato de la
7-t-butildimetilsilil-10-hidroxihomocamptotecina
(carboxilato de DB-91). Se usaron concentraciones de
lípido de 0,15 M (la mayor concentración de lípido necesaria en
estos experimentos para favorecer el enlace fue necesaria debido a
las pequeñas asociaciones con la membrana de la forma de anillo
abierto del agente con respecto a la forma lactona de anillo
cerrado del agente). El máximo de emisión para el carboxilato de
DB-91 en PBS es 549 nm y este valor se desplaza a
valores inferiores (\lambda_{max} de 450 nm en presencia de
vesículas de DMPC y \lambda_{max} de 446 nm en presencia de
vesículas de DMPG).
Se estudiaron los espectros de emisión de
fluorescencia normalizados de 1 \muM de la forma lactona frente a
la forma carboxilato de la
7-t-butildimetilsilil-10-aminohomocamptotecina
(DB-90 y carboxilato de DB-90
respectivamente) en PBS a 37ºC. Los datos espectrales de la emisión
de fluorescencia indican que después de la apertura del anillo, hay
un ligero desplazamiento del espectro hacia la región de las
longitudes de onda más cortas (o desplazamiento del espectro más
hacia la región azul de la luz). Los dos espectros se registraron
usando luz de excitación de 402 nm.
Se registraron los espectros de emisión de
fluorescencia normalizados de 1 \muM de la forma lactona frente a
la forma carboxilato de la
7-t-butildimetilsilil-10-hidroxilhomocamptotecina
(DB-91 y carboxilato de DB-91
respectivamente) en PBS a 37ºC. Los datos espectrales de la emisión
de fluorescencia indican que, después de la apertura del anillo,
hay un ligero desplazamiento del espectro hacia la región de las
longitudes de onda más cortas (o desplazamiento del espectro más
hacia la región azul de la luz). Los dos espectros se registraron a
394 nm.
Observación directa de los cambios
espectrales de la fluorescencia después de la distribución del
homosilatecano en los glóbulos rojos sanguíneos. Los registros
espectrales se iniciaron y se completaron poco tiempo después de la
adición de la forma lactona del agente a la disolución, asegurando
de esta forma que la señal detectada proviene predominantemente de
la forma lactona del agente (y no de la forma de anillo abierto). El
máximo de emisión para el DB-91 en PBS es 554 nm
pero este valor se desplaza significativamente a \lambda_{max}
de aproximadamente 410 en etanol anhidro. Debido a que el
DB-91 contiene un grupo funcional hidroxi en la
posición 10, existe la posibilidad de que la fluorescencia pueda
producirse en dos especies distintas. En un disolvente aprótico o
un medio microscópico no acuoso, predomina una especie protonada
(con respecto al grupo funcional hidroxi en la posición 10),
mientras que en disolventes próticos, tales como el agua, predomina
un complejo de estado excitado desprotonado. El pico a 554 nm se
corresponde con el complejo de estado excitado desprotonado,
mientras que la \lambda_{max} de aproximadamente 410 nm se
corresponde con el complejo de estado excitado protonado. La
formación del complejo de estado excitado desprotonado se facilita
de forma importante por la presencia de agua; incluso para
cantidades de agua pequeñas, tales como 1%, aparece un pico a
aproximadamente 550 nm que se corresponde con la formación
facilitada por el agua del complejo de estado excitado
desprotonado. En las figuras 6 y 7 se estudia la extensión de la
formación del complejo de estado excitado protonado y se usa este
parámetro como una medida relativa de la lipofilia de dos
camptotecinas modificadas en la posición 7 (DB-91 y
SN-38) cada una de ellas conteniendo el grupo
funcional hidroxi en la posición 10. Los registros espectrales se
iniciaron y completaron poco tiempo después de la adición de la
forma lactona del agente a la disolución, asegurando de esta forma
que la señal detectada proviene predominantemente de la forma
lactona del agente (y no de la forma de anillo abierto). El máximo
de emisión para el DB-91 en PBS en 554 nm. En
presencia de glóbulos rojos sanguíneos, se observa un pico con un
valor de \lambda_{max} significativamente menor, lo que indica
que el agente es capaz de distribuirse en las membranas de los
glóbulos rojos sanguíneos. Las membranas de los glóbulos rojos
sanguíneos proporcionan un medio microscópico hidrófobo en el que
los complejos de estado excitado protonados se pueden formar y
emitir fluorescencia. La comparación del espectro del
DB-91 en presencia de eritrocitos humanos con el del
fármaco importante clínicamente
7-etil-10-hidroxicamptotecina
(figura 7) indica que hay una formación del complejo de estado
excitado protonado más extensa en el caso del
DB-91. Estos descubrimientos corroboran los estudios
de membrana modelo que indican que el enlace a la membrana del
SN-38 es significativamente menor que las extensas
interacciones observadas para el DB-91 (el
SN-38 presenta un valor de K_{DMPC} de 300
M^{-1}, mientras que el DB-91 presenta un valor de
K_{DMPC} de 8.000 M^{-1}). El nuevo homosilatecano
DB-91 es un agente de interacción con los
eritrocitos más lipófilo en comparación con el compuesto conocido
7-etil-10-hidroxicamptotecina
(SN-38). El máximo de emisión para el
SN-38 en PBS es aproximadamente 550 nm. El agente
SN-38, como el DB-91, también
contiene un grupo funcional hidroxi en posición 10 y, como
consecuencia, el SN-38 también presenta
características espectrales de fluorescencia que son sensibles a la
presencia de agua. En presencia de glóbulos rojos sanguíneos, se
observa para el SN-38 un pico con un valor de
\lambda_{max} significativamente menor (aproximadamente 440 nm),
lo que indica que el agente es capaz de distribuirse en las
membranas de los glóbulos rojos sanguíneos. Sin embargo, el pico
que aparece con un valor de \lambda_{max} menor para el
SN-38 es pequeño con respecto a la situación
observada para el DB-91 (véase la figura 6). Estos
resultados indican que hay una formación de complejo de estado
excitado protonado más extensa en el caso del DB-91,
lo que corrobora que el nuevo homosilatecano DB-91
es un agente de interacción
con los eritrocitos más lipófilo en comparación con el compuesto conocido 7-etil-10-hidroxicamptotecina (SN-38).
con los eritrocitos más lipófilo en comparación con el compuesto conocido 7-etil-10-hidroxicamptotecina (SN-38).
Actividades anticancerosas de los
homosilatecanos determinadas por experimentos de cultivos celulares
in vitro . Se realizaron medidas de citotoxicidad usando
células tumorigénicas de cáncer de mama humano
MDA-MB-435. Las células se
expusieron a un intervalo de concentraciones de fármaco durante
periodos de exposición de 72 horas y a continuación se evaluó la
viabilidad usando un ensayo de sulfa-rodamina B
(SRB). La SRB mide los niveles totales de proteína en las células
vivas. Las proteínas de las células muertas se descompusieron y se
eliminaron en la etapa de lavado antes de la fijación con TCA. Sin
embargo, es posible que las células en una etapa temprana de la
muerte todavía tengan su integridad de membrana y por lo tanto
mantengan dentro los contenidos de proteína. Como resultado,
algunas veces la densidad óptica a 490 nm puede estar sobrestimada
y la citotoxicidad subestimada. Para validar el análisis con SRB se
han ensayado varios agentes quimioterapéuticos a lo largo de
múltiples paneles de líneas celulares tumorales y se han encontrado
correlaciones cercanas con el análisis estándar con tetrazolio
(MIT) y con análisis clonogénicos. El análisis con SRB es ahora un
ensayo bien considerado y recientemente fue aprobado por el NCI
como un análisis estándar para selección de fármacos
anticancerosos. Usando el análisis con SRB, se determinaron los
valores de la citotoxicidad para las células expuestas a los cuatro
nuevos homosilatecanos durante 72 horas. Se determinó la
citotoxicidad de los homosilatecanos y la camptotecina frente a
células tumorigénicas metastáticas de cáncer de mama humano
MDA-MB-45 en presencia y en
ausencia de albúmina de suero humano y se recogen en la tabla 5.
Cada
valor de IC_{50} representa la media de tres ensayos separados con cada nivel de dosificación estudiado por triplicado.
valor de IC_{50} representa la media de tres ensayos separados con cada nivel de dosificación estudiado por triplicado.
\vskip1.000000\baselineskip
En un matraz de fondo redondo se añadió N-óxido
de metilmorfolina (0,89 g, 7,6 mmoles) seguido por H_{2}O (10 mL)
y t-BuOH (10 mL). Se añadió una disolución al 2,5
por ciento en peso de OsO_{4} en t-BuOH (0,5 mL)
seguido por el enol éter (3) (0,5 g, 1,9 mmoles). Después de 12
horas, a 22ºC, se añadió Na_{2}SO_{3} (1,0 g) a la mezcla,
Después de 30 minutos la mezcla se diluyó con H_{2}O (100 mL) y se
extrajo con CH_{2}Cl_{2} (2 x 100 mL). La fase orgánica se secó
(MgSO_{4}) y el residuo bruto se cromatografió (mezcla de
hexanos:EtOAc 3:1) para dar el lactol (4), 0,55 g (98%), como un
sólido blanco. IR (CHCl_{3}, cm^{-1}) 3602, 3569, 3398, 3022,
2950, 1579, 1456, 1351; RMN de ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3})
\delta 0,22 (s, 9H), 0,83 (t, J = 7 Hz, 3H),
1,71-1,79 (m, J = 7 Hz, 2H), 2,91 (s, 1H), 3,90 (s,
3H), 4,19 (d, J = 5 Hz, 1H), 4,53 (d, J = 16 Hz, 1H), 4,70 (d, J =
16 Hz, 1H), 5,06 (d, J = 5 Hz, 1H), 7,25 (s, 1H); RMN de ^{13}C
(75 MHz, CDCl_{3}) \delta -1,7, 7,8, 31,5, 53,1, 58,8, 70,9,
93,8, 115,1, 119,7, 145,8, 158,0, 162,8; HRMS (EI) m/z
calculado para el C_{14}H_{23}NO_{4}Si (M^{+}) 473,0519,
encontrado 473,0507; LRMS (EI) m/z 473 (M^{+}), 458, 386,
360, 346, 139, 73, 57.
\vskip1.000000\baselineskip
En un matraz de fondo redondo se añadió el
lactol (4) (0,100 g, 0,34 mmoles) seguido por AcOH (9 mL) y
tetraacetato de plomo (0,18 g, 0,406 mmoles). Después de 3 horas a
50ºC, la mezcla se vertió en NaHCO_{3} saturado enfriado en hielo
y se extrajo con éter (3 x 75 mL). La fase orgánica se secó
(MgSO_{4}) y se cromatografió (mezcla de hexanos:EtOAc 95:5) para
dar el cetoformato éster (5), 91 mg (91%), como un aceite claro. IR
(puro, cm^{-1}) 2963, 2902, 1733, 1556, 1455, 1345; RMN de
^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta 0,30 (s, 9H), 1,21 (t, J = 7
Hz, 3H), 2,75-2,95 (m, J = 7 Hz, 2H), 4,02 (s, 3H),
5,28 (s, 2H), 7,07 (s, 1H), 8,05 (s, 1H); RMN de ^{13}C (75 MHz,
CDCl_{3}) \delta -1,8, 7,9, 35,9, 54,0, 57,6, 112,9, 118,7,
148,5, 160,8, 162,2, 167,6, 205,6; HRMS (EI) m/z calculado
para el C_{14}H_{21}NO_{4}Si (M^{+}) 295,1240, encontrado
295,1239; LRMS (EI) m/z 295 (M^{+}), 280, 267, 250, 234,
222, 206, 176, 162, 103, 89, 79, 73, 57.
\vskip1.000000\baselineskip
En un matraz secado con llama se añadió el
cetoformato éster (5) (0,5 g, 1,69 mmoles) seguido por dioxano (20
mL). Se añadió
\alpha-bromo-ter-butilacetato
(0,9 mL, 6,08 mmoles) seguido por Zn activado (0,59 g, 9,1 mmoles).
El Zn se activó por el método de Cava como se ha descrito en el
documento J. Organic. Chem. 47, pág. 5030 (1982). Después se
añadió I_{2} (0,16 g, 0,63 mmoles) y la mezcla se sonicó durante
3,2 horas. Después de la sonicación, la mezcla se diluyó con
H_{2}O (100 mL) y éter (100 mL). La emulsión resultante se filtró
a través de una almohadilla de celita, se separaron las fases y la
fase acuosa se extrajo con éter (2 x 100 mL). Los extractos en éter
combinados se secaron (MgSO_{4}) y se cromatografió (mezcla de
hexanos:EtOAc 85:15) para dar el betahidroxi éster (6), 0,50 g
(78%) como un aceite claro. IR (puro, cm^{-1}) 3469, 2980, 1705,
1575, 1545, 1447, 1342, 1248, 1153; RMN de ^{1}H (300 MHz,
C_{6}D_{6}) \delta 0,38 (s, 9H), 0,79 (t, J = 7 Hz, 3H),1,15
(s, 9H), 1,75-1,92 (m, J = 7 Hz, 2H), 2,52 (d, J =
16 Hz, 1H), 2,79 (d, J = 16 Hz, 1H), 3,03 (t, J = 7 Hz, 2H), 3,74
(s, 3H), 5,18 (d, J = 7 Hz, 2H), 5,19 (s, 1H), 7,18 (s, 1H); RMN de
^{13}C (75 MHz, C_{6}D_{6}) \delta -1,9, 8,1, 27,6, 35,5,
45,6, 53,0, 57,0, 77,3, 81,5, 120,9, 121,8, 152,3, 162,6, 163,3,
172,3; HRMS (EI) m/z calculado para el
C_{19}H_{31}NO_{4}Si (M-H2O) 365,2022,
encontrado 365,2028; LRMS (EI) m/z 383 (M^{+}), 365, 336,
309, 280, 262, 250, 208, 89, 73, 57.
\vskip1.000000\baselineskip
En un matraz de 100 mL se añadieron el
betahidroxi éster (6) (0,75 g, 1,9 mmoles) seguido por ácido
trifluoroacético (150 mL). Después de 24 horas, la mezcla se vertió
en NaHCO_{3} saturado (pH 8) y se extrajo con éter (3 x 100 mL).
La fase orgánica se secó (MgSO_{4}) y se cromatografió (mezcla de
hexanos:EtOAc 2:1) para dar la betahidroxi lactona (7), 0,48 g
(79%), como un sólido blanco. IR (CHCl_{3}, cm_{-1}) 3020, 2978,
2978, 2873, 1742, 1561, 1384, 1348, 1110, 909, 842; RMN de ^{1}H
(300 MHz, CDCl_{3}) \delta 0,22 (s, 9H), 0,83 (t, J = 7 Hz,
3H),1,81-1,88 (m, J = 7 Hz, 2H), 1,37 (br s, 1H),
3,00 (d, J = 14 Hz, 1H), 3,32 (d, J = 14 Hz, 1H), 3,91 (s, 3H),
5,18 (d, J = 15 Hz, 1H), 5,42 (d, J = 15 Hz, 1H), 7,26 (s, 1H); RMN
de ^{13}C (75 MHz, CDCl_{3}) \delta -1,9, 8,4, 33,9, 42,9,
53,8, 62,2, 73,8, 114,7, 121,2, 151,6, 159,8, 165,9, 172,3; HRMS
(EI) m/z calculado para el C_{15}H_{23}NO_{4}Si
(M^{+}) 309,1396, encontrado 309,1399; LRMS (EI) m/z 309
(M^{+}), 294, 266, 252, 238, 89.
\vskip1.000000\baselineskip
En un matraz secado con llama a 0ºC se añadió la
betahidroxi lactona (7) (0,94 g, 3,0 mmoles) seguido por
CH_{2}Cl_{2} seco (25 mL). Se añadió ICl (3,2 g, 19,7 mmoles) a
un matraz secado con llama a -78ºC. El matraz se sacó del baño, se
calentó ligeramente, se secó el exceso de humedad del exterior y se
pesó rápidamente en atmósfera de nitrógeno. Después de la pesada,
se volvió a poner en el baño a -78ºC y se diluyó con CCl_{4}
enfriado en hielo (16 mL) para dar una disolución 1,2M de ICl. La
disolución de ICl resultante se transfirió en un baño de hielo y se
dejó equilibrar a 0ºC. Se transfirió una porción de la disolución de
ICl (10,1 mL) a la mezcla gota a gota en la oscuridad. Después de
16 horas en oscuridad, la mezcla se vertió en una disolución 1:1
(100 mL) de Na_{2}SO_{3} al 5% y saturada. Se añadió salmuera y
se extrajo con EtOAc (3 x 100 mL). La fase orgánica se secó
(MgSO_{4}) y se cromatografió (mezcla de hexanos:EtOAc 3:1) para
dar la betahidroxi lactona (7), 0,43 g (46%), y la yodolactona (8),
0,41 g (37%). IR (CHCl_{3}, cm^{-1}) 2974, 2951, 1747, 1573,
1554, 1359, 1278, 1212, 1054, 870; RMN de ^{1}H (300 MHz,
CDCl_{3}) \delta 0,84 (t, J = 7 Hz, 3H),
1,78-1,85 (m, J = 7 Hz, 2H) 2,98 (br d, J = 14 Hz,
2H), 3,30 (d, J = 14 Hz, 1H), 3,90 (s, 3H), 5,10 (d, J = 15 Hz,
1H), 5,35 (d, J = 15 Hz, 1H), 7,51 (s, 1H); RMN de ^{13}C (75 MHz,
CDCl_{3}) \delta 8,4, 37,4, 42,7, 55,0, 61,8, 73,4, 114,0,
114,9, 127,3, 155,3, 159,8, 171,9; HRMS (EI) m/z calculado
para el C_{12}H_{14}INO_{4} (M^{+}) 362,9967, encontrado
362,9955 LRMS (EI) m/z 363 (M^{+}), 334, 326, 317, 302,
292, 262, 234, 162, 137, 120, 57.
\vskip1.000000\baselineskip
En un matraz secado con llama se añadió la
yodolactona (8) (0,33 g, 0,90 mmoles) seguido por acetonitrilo seco
(12 mL). Se añadió yoduro de sodio (0,22 g, 1,44 mmoles) seguido por
clorotrimetilsilano (0,18 mL, 1,44 mmoles). La mezcla resultante se
agitó a 22ºC durante 15 minutos, momento en el que se añadió
H_{2}O (7,6 \muL, 0,42 mmoles) y se calentó la mezcla a 60ºC.
Después de 5 horas a 60ºC, la mezcla se vertió en una disolución
1:1 de NaSO_{3} al 5%/salmuera (75 mL) y a continuación se extrajo
rápidamente con EtOAc (6 x 75 mL). La fase orgánica se secó
(MgSO_{4}) y se cromatografió (CH_{2}Cl_{2}:MeOH 95:5) para
dar la yodopiridona (9) como un sólido blanco, 0,19 g (61%). RMN de
^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}/CD_{3}OD) \delta 0,62 (t, J = 7
Hz, 3H), 1,45-1,54 (m, J = 7 Hz, 2H), 2,80 (d, J =
14 Hz, 1H), 2,97 (d, J = 14 Hz, 1H), 4,93 (d, J = 15 Hz, 1H), 5,06
(d, J = 15 Hz, 1H), 6,66 (s, 1H); RMN de ^{13}C (75 MHz,
CDCl_{3}) \delta 7,5, 35,6, 41,9, 61,6, 72,5, 94,4, 118,3,
121,1, 156,5, 162,6, 172,7; HRMS (EI) m/z calculado para el
C_{11}H_{12}INO_{4} (M^{+}) 348,9811, encontrado 348,9815
LRMS (EI) m/z 349 (M^{+}), 331, 320, 303, 289, 278, 264,
250, 162, 150, 122, 94, 57.
\vskip1.000000\baselineskip
En un matraz secado con llama se añadió la
yodopiridona (9) (0,16 g, 0,46 mmoles) seguido por DME seco (3,8
mL) y DMF (0,95 mL). Esta disolución se llevó a 0ºC y se añadió NaH
en dispersión al 60% en aceite (19,3 mg, 0,482 mmoles) en
porciones. Después de 15 minutos se añadieron 2 eq. de LiBr (81 mg,
0,92 mmoles), secado a vacío con llama, y la mezcla se llevó a
22ºC. Después de 25 minutos a 22ºC, se añadió bromuro de
trimetilsililpropargilo (0,130 mL, 0,92 mmoles) y se calentó la
mezcla a 65ºC. Después de 16 horas, se vertió la mezcla en salmuera
(50 mL) y se extrajo con EtOAc (8 x 30 mL). La fase en EtOAc se secó
(MgSO_{4}) y se cromatografió (CH_{2}Cl_{2}:EtOAc 80:20) para
dar la piridona N-alquilada (10a) buscada, 134 mg
(63%), como una espuma blanca. RMN de ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3})
\delta 0,005 (s, 9H), 0,80 (t, J = 7 Hz, 3H),
1,60-1,74 (m, J = 7 Hz, 2H), 2,94 (d, J = 14 Hz,
1H), 3,11 (d, J = 14 Hz, 1H), 3,60 (br s, 1H), 4,82 (d, J = 17 Hz,
1H), 5,01 (d, J = 17 Hz 1H) 5,09 (d, J = 15 Hz, 1H), 5,26 (d, J =
15 Hz, 1H), 7,01 (s, 1H); RMN de ^{13}C (75 MHz,
CDCl_{3}/CD_{3}OD) \delta -0,44, 7,9, 35,7, 42,2, 45,2, 62,3,
72,6, 90,7, 98,1, 99,2, 119,9, 122,3, 155,1, 160,6, 172,6; HRMS
(EI) m/z calculado para el C_{17}H_{22}INO_{4}Si
(M^{+}) 459,0363, encontrado 459,0366 LRMS (EI) m/z 459
(M^{+}), 444, 388, 306, 111, 96, 83, 73, 57.
\vskip1.000000\baselineskip
Siguiendo el procedimiento resumido
anteriormente la yodopiridona (7) (0,16 g, 0,46 mmoles) se
N-alquiló con bromuro de propargilo TBDMS (0,21 g,
0,92 mmoles). Por cromatografía ultra-rápida
(CH_{2}Cl_{2}:EtOAc 9:1) se obtuvo la yodopiridona (8b), 134 mg
(58%), como una espuma blanca. RMN de ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3})
\delta 0,097 (s, 6H), 0,92 (br s, 12H), 1,82-1,89
(br m, 2H), 3,01 (d, J = 14 Hz, 1H), 3,33 (d, J = 14 Hz, 1H), 3,48
(br s, 1H), 5,07 (s, 2H), 5,12 (d, J = 15 Hz, 1H), 5,47 (d, J = 15
Hz, 1H), 7,10 (s, 1H); RMN de ^{13}C (75 MHz, CDCl_{3})
\delta -4,7, 8,3, 16,6, 26,3, 36,0, 42,6, 45,3, 62,8, 73,5, 89,4,
98,6, 99,5, 119,5, 122,9, 154,1, 160,4, 172,0; HRMS (EI) m/z
calculado para el C_{20}H_{28}INO_{4}Si (M^{+}) 501,0832,
encontrado 501,0843 LRMS (EI) m/z 501 (M^{+}), 444, 402,
335, 318, 169, 121, 96, 57.
\vskip1.000000\baselineskip
En un tubo a presión secado en horno se añadió
en atmósfera de Ar la yodopiridona (10a) (15 mg, 0,033 mmoles)
seguido por benceno (0,25 mL) y t-BuOH (0,5 mL).
Después se añadieron fenilisonitrilo (13,6 mg, 0,13 mmoles) y
hexametil-diestaño (16,0 mg, 0,049 mmoles) y el tubo
se llenó con Ar, se selló y se colocó enfrente de una lámpara solar
GE de 275 W. Después de 12 horas de irradiación, se cromatografió
(CH_{2}Cl_{2}:acetona 5:1) para dar la homocamptotecina (1h),
5,2 mg (36%), como un sólido de color canela. RMN de ^{1}H (300
MHz, CDCl_{3}/CD_{3}OD) \delta 0,64 (s, 9H), 0,96 (t, J = 7
Hz, 3H), 1,96-2,05 (m, J = 7 Hz, 2H), 3,19 (d, J =
14 Hz, 2H), 3,46 (d, J = 14 Hz, 1H), 5,34 (s, 2H), 5,44 (d, J = 15
Hz, 1H), 5,63 (d, J = 15 Hz, 1H), 7,65-7,71 (m,
2H), 7,78-7,84 (m, 1H), 8,18 (d, J = 8 Hz, 1H), 8,27
(d, J = 8 Hz, 1H); HRMS (EI) m/z calculado para el
C_{24}H_{26}N_{2}O_{4}Si (M^{+}) 434,1662, encontrado
434,1679 LRMS (EI) m/z 434 (M^{+}), 419, 388, 374, 363,
347, 335, 320, 303, 289, 275, 261, 247, 231, 219, 174, 149, 73.
\vskip1.000000\baselineskip
Siguiendo el procedimiento descrito
anteriormente, se hizo reaccionar la yodopiridona (10a) (30 mg,
0,065 mmoles) con
para-Boc-aminofenilisonitrilo (57
mg, 0,26 mmoles) y hexametil-diestaño (32,2 mg, 0,1
mmoles) en benceno (0,5 mL) y t-BuOH (1 mL). Por
cromatografía (CH_{2}Cl_{2}:acetona 7:1) se obtuvo el compuesto
(1c), 18,8 mg (53%), como un sólido marrón. IR (CHCl_{3},
cm^{-1}) 3022, 3007, 1736, 1655, 1594, 1528, 1155, 1062; RMN de
^{1}H (500 MHz, CDCl_{3}) \delta 0,70 (s, 9H), 0,96 (t, J = 7
Hz, 3H), 1,61 (s, 9H), 1,85-2,10 (m, J = 7 Hz, 2H),
3,31 (d, J = 13 Hz, 1H), 3,41 (d, J = 13 Hz, 1H), 5,11 (d, J = 19
Hz, 1H), 5,34-5,41 (m, 2H), 5,61 (d, J = 15 Hz,
1H), 6,96 (s, 1H), 7,19-7,40 (m, 1H) 7,62 (s, 1H),
8,37 (s, 1H); RMN de ^{13}C (125 MHz, CDCl_{3}) \delta 1,43,
8,3, 28,4, 35,8, 42,6, 52,4, 62,3, 73,9, 81,2, 100,3, 115,1, 122,2,
123,0, 130,7, 132,6, 134,8, 137,1, 143,4, 143,6, 145,1, 148,2,
152,6, 156,5, 159,8, 171,8; HRMS (EI) m/z calculado para el
C_{29}H_{35}N_{3}O_{6}Si (M^{+}) 549,2295, encontrado
549,2274 LRMS (EI) m/z 549 (M^{+}), 493, 475, 449, 433,
415, 404, 389, 378, 350, 304, 260, 195, 182, 73.
\vskip1.000000\baselineskip
Siguiendo el procedimiento descrito
anteriormente, se hizo reaccionar la yodopiridona (10a) (30 mg,
0,065 mmoles) con para-acetoxifenilisonitrilo (42
mg, 0,26 mmoles) y hexametil-diestaño (32,2 mg, 0,1
mmoles) en benceno (0,5 mL) y t-BuOH (1 mL). Por
cromatografía (CH_{2}Cl_{2}:acetona 5:1) se obtuvo el producto,
6,6 mg (21%), como un sólido de color canela. IR (CHCl_{3},
cm^{-1}) 3025, 2992, 2953, 1753, 1657, 1600, 1504, 1193; RMN de
^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta 0,67 (s, 9H), 0,98 (t, J = 7
Hz, 3H), 1,99-2,07 (m, 2H), 2,42 (s, 3H), 3,26 (d,
J = 14 Hz, 1H), 3,45 (d, J = 14 Hz, 1H), 3,66 (br s, 1H), 5,18 (d, J
= 19 Hz, 1H), 5,35 (d, J = 15 Hz, 1H), 5,39 (d, J = 19 Hz, 1H),
5,66 (d, J = 15 Hz, 1H), 7,38 (dd, J_{1} = 9 Hz, J_{2} = 2 Hz,
1H), 7,40 (s, 1H), 7,88 (d, J = 9 Hz, 1H), 7,92 (d, J = 2 Hz, 1H);
RMN de ^{13}C (125 MHz, CDCl_{3}) \delta 1,6, 8,3, 21,5,
35,9, 42,6, 52,2, 62,2, 74,0, 100,5, 118,9, 122,9, 124,7, 131,3,
132,2, 135,0, 144,1, 144,8, 145,0, 148,9, 150,0, 156,0, 159,7,
169,1, 171,5; HRMS (EI) m/z calculado para el
C_{26}H_{28}N_{2}O_{6}Si (M^{+}) 492,1717, encontrado
492,1707 LRMS (EI) m/z 492 (M^{+}), 477, 459, 450, 432,
421, 403, 393, 379, 365, 351, 336, 147.
\vskip1.000000\baselineskip
Siguiendo el procedimiento descrito
anteriormente, se hizo reaccionar la yodopiridona (10b) (25 mg, 0,05
mmoles) con fenilisonitrilo (15,5 mg, 0,15 mmoles) y
hexametil-diestaño (25 mg, 0,075 mmoles) en benceno
(0,75 mL). Por cromatografía (CH_{2}Cl_{2}:acetona 7:1) se
obtuvo el compuesto (1g), 6,4 mg (27%), como un sólido de color
canela. IR (CHCl_{3}, cm^{-1}) 3027, 2958, 2932, 2859, 1745,
1655, 1600, 1269, 1065; RMN de ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3})
\delta 0,69 (s, 3H), 0,70 (s, 3H), 0,92 (t, J = 7 Hz, 3H), 1,00
(s, 9H), 1,92-2,02 (m, J = 7 Hz, 2H), 3,23 (d, J =
13 Hz, 1H), 3,39 (d, J = 13 Hz, 1H), 3,90 (br s, 1H), 5,11 (d, J =
19 Hz, 1H), 5,31 (d, J = 15 Hz, 1H), 5,40 (d, J = 19 Hz, 1H), 5,60
(d, J = 15 Hz, 1H), 7,35 (s, 1H), 7,39-7,49 (m,
2H), 7,70 (d, J = 8 Hz, 1H), 8,07 (d, J = 8 Hz, 1H); RMN de ^{13}C
(75 MHz, CDCl_{3}) \delta -0,5, -0,3, 8,3, 19,4, 27,3, 35,9,
42,7, 52,9, 62,3, 74,0, 100,3, 122,8, 126,9, 129,4, 130,3, 132,7,
136,0, 143,3, 145,3, 147,6, 150,1, 156,1, 159,9, 171,5; HRMS (EI)
m/z calculado para el C_{27}H_{32}N_{2}O_{4}Si
(M^{+}) 476,2131, encontrado 476, 2118 LRMS (EI) m/z 476
(M^{+}), 458, 430, 419, 405, 389, 377, 361, 345, 319, 304, 275,
149, 117, 91, 73, 56.
\vskip1.000000\baselineskip
Siguiendo el procedimiento descrito
anteriormente, se hizo reaccionar la yodopiridona (10b) (45 mg,
0,089 mmoles) con
para-Boc-aminofenilisonitrilo (58
mg, 0,27 mmoles) y hexametil-diestaño (45 mg, 0,13
mmoles) en benceno (1,3 mL). Por cromatografía
(CH_{2}Cl_{2}:acetona 10:1) se obtuvo el compuesto (1a), 7,8 mg
(15%), como un sólido de color canela. IR (CHCl_{3}, cm^{-1})
3435, 3022, 2931, 2859, 1738, 1654, 1563, 1528, 1156; RMN de
^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta 0,76 (s, 3H), 0,77 (s, 3H),
0,96 (t, J = 7 Hz, 3H), 1,10 (s, 9H), 1,62 (s, 9H),
1,91-2,07 (m, J = 7 Hz, 2H), 3,34 (d, J = 14 Hz, 1H)
3,41 (d, J = 14 Hz, 1H), 4,42 (br s, 1H), 5,09 (d, J = 19 Hz, 1H),
5,38 (d, J = 15 Hz, 1H), 5,47 (d, J = 19 Hz, 1H), 5,62 (d, J = 15
Hz, 1H), 6,99 (br s, 1H), 7,21-7,25 (m, 2H), 7,45,
(d, J = 9 Hz, 1H), 8,37 (d, J = 2 Hz, 1H); RMN de ^{13}C (125
MHz, CDCl_{3}) \delta -0,9, -0,5, 8,3, 19,6, 27,4, 28,4, 35,5,
42,7, 53,0, 62,2, 73,8, 81,1, 100,0, 116,2, 122,2, 123,0, 130,3,
133,5, 136,3, 136,9, 144,4, 145,2, 148,2, 152,6, 156,4, 160,0,
171,5; HRMS (EI) m/z calculado para el
C_{32}H_{41}N_{3}O_{6}Si (M^{+}) 591,2765, encontrado
591,2751 LRMS (EI) m/z 534 (M-57), 516, 488,
477, 459, 435, 417, 393, 375, 111, 97, 83, 69, 57.
\vskip1.000000\baselineskip
Siguiendo el procedimiento descrito
anteriormente, se hizo reaccionar la yodopiridona (10b) (45 mg,
0,089 mmoles) con para-acetoxifenilisonitrilo (43
mg, 0,27 mmoles) y hexametil-diestaño (45 mg, 0,13
mmoles) en benceno (1,3 mL). Por cromatografía
(CH_{2}Cl_{2}:acetona 10:1) se obtuvo el compuesto (1e), 9,6 mg
(20%), como un sólido de color canela. RMN de ^{1}H (300 MHz,
CDCl_{3}) \delta 0,73 (s, 3H), 0,74 (s, 3H), 0,97 (t, J = 7 Hz,
3H), 1,07 (s, 9H), 1,94-2,08 (m, J = 7 Hz, 2H), 2,42
(s, 3H), 3,29 (d, J = 14 Hz 1H), 3,44 (d, J = 14 Hz, 1H), 4,05 (br
s, 1H), 5,16 (d, J = 19 Hz, 1H), 5,37 (d, J = 15 Hz, 1H), 5,48 (d, J
= 19 Hz, 1H), 5,65 (d, J = 15 Hz, 1H), 7,31 (dd, J_{1} = 9 Hz,
J_{2} = 2 Hz, 1H) 7,36 (s, 1H), 7,70 (d, J = 9 Hz, 1H), 7,97 (d,
J = 2 Hz, 1H); RMN de ^{13}C (125 MHz, CDCl_{3}) \delta -0,7,
-0,5, 8,3, 19,3, 21,5, 27,2, 35,8, 42,7, 52,9, 62,2, 73,9, 100,4,
120,1, 122,8, 124,7, 131,1, 133,0, 136,5, 143,0, 145,0, 145,4,
148,9, 149,9, 156,2, 159,9, 169,0, 171,5; HRMS (EI) m/z
calculado para el C_{29}H_{34}N_{2}O_{6} (M^{+})
534,2186, encontrado 534,2188 LRMS (EI) m/z 534 (M^{+}),
516, 488, 477, 459, 435, 417, 393, 375, 335, 320, 291, 275, 234,
164, 137, 125, 111, 97, 83, 69, 57.
\vskip1.000000\baselineskip
El compuesto (1e) (11,9 mg, 0,022 mmoles) se
disolvió en H_{2}O (0,3 mL) y MeOH (0,3 mL). A continuación, se
añadió K_{2}CO_{3} (7,5 mg, 0,054 mmoles) y la mezcla se agitó a
22ºC. Después de 4 horas, se evaporó el disolvente y el residuo se
disolvió en CH_{2}Cl_{2} (2 mL) y TFA (2 mL). Después de
agitación a 22ºC durante 16 horas, se añadió cuidadosamente
NaHCO_{3} saturado hasta que se alcanzó un pH de 5. En este
momento se extrajo la disolución con EtOAc (3 x 10 mL) y la fase
orgánica se secó (Na_{2}SO_{4}) y se concentró. El residuo se
cromatografió dos veces (1: CH_{2}Cl_{2}:MeOH:AcOH 94:5:1) (2:
CH_{2}Cl_{2}:acetona 5:1) para dar el compuesto (1f), 8,6 mg
(79%), como un sólido amarillo. RMN de ^{1}H (300 MHz,
CDCl_{3}/CD_{3}OD) \delta 0,65 (s, 6H),
0,90-0,99 (m, 12H), 1,89-2,05 (m,
2H), 3,14 (d, J = 14 Hz, 1H), 3,34 (d, J = 14 Hz, 1H), 5,23 (s,
2H), 5,35 (d, J = 15 Hz, 1H), 5,57 (d, J = 15 Hz, 1H), 7,42 (dd,
J_{1} = 9 Hz, J_{2} = 2 Hz, 1H), 7,58 (d, J = 2 Hz, 1H), 7,70
(s, 1H), 8,16 (d, J = 9 Hz, 1H); RMN de ^{13}C (125 MHz,
CDCl_{3}/CD_{3}OD) \delta -1,1, 8,1, 19,2, 26,9, 36,1, 42,1,
52,8, 62,1, 73,5, 101,8, 111,5, 122,7, 123,6, 127,5, 129,0, 135,0,
136,6, 139,8, 143,1, 145,5, 156,7, 156,9, 159,6, 172,8; HRMS (EI)
m/z calculado para el C_{27}H_{32}N_{2}O_{5}Si
(M^{+}) 492,2080, encontrado 492,2087 (LRMS (EI) m/z 492
(M^{+}), 474, 446, 435, 421, 393, 375, 346, 335, 315, 291, 273,
259, 231, 183, 155.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió ácido trifluoroacético (0,1 mL) a una
disolución que contenía CH_{2}Cl_{2} (0,5 mL) y el compuesto
(1a) (8,1 mg, 0,014 mmoles) y el contenido se agitó a 22ºC. Después
de 5 horas, la mezcla se vertió en NaHCO_{3} saturado (2 mL) y se
extrajo con EtOAc (6 x 2 mL). El EtOAc se secó (Na_{2}SO_{4}),
se concentró y se cromatografió (CH_{2}Cl_{2}:MeOH 96:4) para
dar el compuesto (1b), 6 mg (89%), como un sólido amarillo. RMN de
^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}/CD_{3}OD) \delta 0,28 (s, 6H),
0,78-0,88 (m, 12H), 1,78-1,90 (m
2H), 3,04 (d, J = 14 Hz, 1H), 3,24 (d, J = 14 Hz, 1H),
5,02-5,11 (m, 2H), 5,24 (d, J = 15 Hz, 1H), 5,46 (d,
J = 15 Hz, 1H), 7,20 (s, 1H), 7,26 (dd, J_{1} = 9 Hz, J_{2} = 2
Hz, 1H); RMN de ^{13}C (125 MHz, CDCl_{3}/CD_{3}OD) \delta
-1,0, 8,0, 19,1, 26,9, 36,1, 42,1, 52,7, 62,1, 73,4, 100,7, 122,0,
123,2, 130,5, 134,3, 136,8, 141,8, 144,2, 147,1, 156,7, 159,7,
172,8; HRMS (EI) m/z calculado para el
C_{27}H_{33}N_{3}O_{4}Si (M^{+}) 491,2240, encontrado
491,2242 LRMS (EI) m/z 491 (M^{+}), 434, 392, 376, 319, 279, 262,
223, 178, 167, 149, 136, 121, 107, 91, 77, 57.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió ácido trifluoroacético (0,1 mL) a una
disolución que contenía CH_{2}Cl_{2} (0,5 mL) y el compuesto
(1c) (6,6 mg, 0,012 mmoles) y el contenido se agitó a 22ºC. Después
de 5 horas, la mezcla se vertió en NaHCO_{3} saturado (2 mL) y se
extrajo con EtOAc (6 x 2 mL). El EtOAc se secó (Na_{2}SO_{4}),
se concentró y se cromatografió (CH_{2}Cl_{2}:MeOH 95:5) para
dar el compuesto (1d), 2,5 mg (45%), como un sólido
rojo-anaranjado. RMN de ^{1}H (300 MHz,
CDCl_{3}/CD_{3}OD) \delta 0,60 (s, 9H), 0,94 (t, J = 7 Hz,
3H), 1,92-2,05 (m, 2H), 3,16 (d, J = 14 Hz, 1H),
3,46 (d, J = 14 Hz, 1H), 5,24 (s, 2H), 5,40 (d, J = 15 Hz, 1H), 5,61
(d, J = 15 Hz, 1H), 7,25-7,32 (m, 2H), 7,52 (s,
1H), 7,89 (d, J = 9 Hz, 1H); RMN de ^{13}C (125 MHz,
CDCl_{3}/CD_{3}OD) \delta -0,12, 7,1, 35,7, 41,5, 51,6, 61,3,
72,8, 99,3, 107,0, 120,4, 121,7, 129,9, 133,6, 134,4, 139,5, 141,0,
144,7, 145,2, 146,4, 156,2, 159,3, 172,6; HRMS (EI) m/z
calculado para el C_{24}H_{27}N_{3}O_{4}Si (M^{+})
449,1771, encontrado 449,1791 (LRMS (EI) m/z 449 (M^{+}),
434, 402, 389, 374, 350, 335, 304, 178, 73. (+/-).
\vskip1.000000\baselineskip
Siguiendo el procedimiento resumido
anteriormente, la yodopiridona (9) (0,106 g, 0,92 mmoles) se
N-alquiló con bromuro de
2-trimetilsililetilpropargilo (0,43 g, 1,84 mmoles).
Por cromatografía ultra-rápida
(CH_{2}Cl_{2}:EtOAc 10:1) se obtuvo la yodopiridona (10c), 68
mg (46%), como una espuma de color amarillo claro. RMN de ^{1}H
(300 MHz, CDCl_{3}) \delta -0,069 (s, 9H), 0,72 (t, J = 8 Hz,
2H), 0,87 (t, J = 7 Hz, 3H), 1,70-1,88 (m, 2H),
2,10-2,20 (m, 2H), 2,96 (d, J = 14 Hz, 1H), 3,15 (br
s, 1H), 3,27 (d, J = 14 Hz, 1H), 4,90-5,00 (m, 2H),
5,07 (d, J = 15 Hz, 1H), 5,41 (d, J = 15 Hz, 1H); RMN de ^{13}C
(75 MHz, CDCl_{3}) \delta -1,6, 8,2, 13,5, 15,7, 35,9, 42,5,
45,3, 62,7, 72,5, 73,4, 88,0, 99,7, 119,2, 122,8, 153,9, 160,4,
171,8; HRMS (EI) m/z calculado para el
C_{19}H_{26}INO_{4}Si (M^{+}) 487,0676, encontrado 487,0676
LRMS (EI) m/z 487 (M^{+}), 472, 400, 374, 346, 96, 73.
\vskip1.000000\baselineskip
Este compuesto no es un compuesto según la
reivindicación 1.
En un tubo a presión secado en horno se añadió
en atmósfera de Ar la yodopiridona (10c) (16 mg, 0,033 mmoles)
seguido por benceno (0,5 mL). Después se añadieron fenilisonitrilo
(10,2 mg, 0,1 mmoles) y hexametil-diestaño (16,7
mg, 0,051 mmoles) y el tubo se llenó con Ar, se selló y se colocó
enfrente de una lámpara solar GE de 275 W. Después de 12 horas de
irradiación, la mezcla se concentró y se cromatografió
(CH_{2}Cl_{2}:acetona 4:1) para dar la homocamptotecina (1i)
deseada, 3,6 mg (24%) como un sólido de color canela. RMN de ^{1}H
(300 MHz, CDCl_{3}) \delta 0,184 (s, 9H),
0,85-1,05 (m, 5H), 1,98-2,10 (m,
2H), 3,00-3,12 (m, 2H), 3,18 (d, J = 14 Hz, 2H),
3,48 (d, J = 13 Hz, 1H), 5,14 (d, J = 19 Hz, 1H), 5,24 (d, J = 19
Hz, 1H), 5,34 (d, J = 15 Hz, 1H), 5,71 (d, J = 15 Hz, 1H), 7,53 (s,
1H), 7,57-7,63 (m, 1H), 7,70-7,77
(m, 1H), 7,94 (d, J = 8 Hz, 1H), 8,10 (d, J = 8 Hz, 1H); HRMS (EI)
m/z calculado para el C_{26}H_{30}N_{2}O_{4}Si
(M^{+}) 462,1975, encontrado 462,1976 LRMS (EI) m/z 462
(M^{+}), 447, 415, 402, 391, 377, 363, 348, 317, 289, 243, 231,
73, 59.
\vskip1.000000\baselineskip
Siguiendo el procedimiento descrito
anteriormente, se hizo reaccionar la yodopiridona (10c) (16 mg,
0,033 mmoles) con
para-Boc-aminofenilisonitrilo (21,6
mg, 0,1 mmoles) y hexametil-diestaño (16,7 mg, 0,051
mmoles) en benceno (0,5 mL). Por cromatografía
(CH_{2}Cl_{2}:acetona 7:1) se obtuvo el compuesto (1j), 10,7 mg
(56%), como un sólido marrón. RMN de ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3})
\delta 0,20 (s, 9H), 0,83-0,93 (m, 2H), 0,99 (t,
J = 7 Hz, 3H), 1,60 (s, 9H), 1,93-2,10 (m, 2H),
2,90-3,05 (m, 2H), 3,24 (d, J = 14 Hz, 1H), 3,44
(d, J = 14 Hz, 1H), 3,74 (br s, 1H), 5,03 (d, J = 19 Hz, 1H), 5,20
(d, J = 19 Hz, 1H), 5,33 (d, J = 15 Hz, 1H), 5,67 (d, J = 15 Hz,
1H), 6,85 (s, 1H), 7,35-7,44 (m, 2H), 7,85 (d, J =
9Hz, 1H), 8,11 (br s, 1H); HRMS (EI) m/z calculado para el
C_{31}H_{39}N_{3}O_{6}Si (M^{+}) 577,2608, encontrado
577,2611 LRMS (EI) m/z 577 (M^{+}), 521, 477, 462, 434, 417, 378,
304, 260, 178, 108, 73.
\newpage
Siguiendo el procedimiento descrito
anteriormente, se hizo reaccionar la yodopiridona (10c) (16 mg,
0,033 mmoles) con para-acetoxifenilisonitrilo (16
mg, 0,1 mmoles) y hexametil-diestaño (16,7 mg, 0,051
mmoles) en benceno (0,5 mL). Por cromatografía
(CH_{2}Cl_{2}:acetona 5:1) se obtuvo el compuesto (1k), 7,1 mg
(41%), como un sólido de color canela. RMN de H (300 MHz,
CDCl_{3}) \delta 0,19 (s, 9H), 0,82-0,89 (m,
2H), 0,99 (t, J = 7 Hz, 3H), 1,95-2,06 (m, 2H),
2,42 (s, 3H), 2,94-2,98 (m, 2H), 3,23 (d, J = 14 Hz,
1H), 3,46 (d, J = 14 Hz, 1H), 3,59 (br s, 1H), 5,08 (d, J = 19 Hz,
1H), 5,24 (d, J = 19 Hz, 1H), 5,35 (d, J = 15 Hz, 1H), 5,68 (d, J =
15 Hz, 1H), 7,41-7,49 (m, 2H), 7,60 (d, J = 2 Hz,
1H), 7,96 (d, J = 9 Hz, 1H); HRMS (EI) m/z calculado para el
C_{28}H_{32}N_{2}O_{6}Si (M^{+}) 520,2030, encontrado
520,2017 LRMS (EI) m/z 520 (M^{+}), 491, 478, 463, 449,
431, 421, 406, 393, 379, 333, 305, 261, 178, 109, 73.
\vskip1.000000\baselineskip
Siguiendo el procedimiento resumido
anteriormente, se hizo reaccionar el compuesto (1k) (7,1 mg, 0,014
mmoles) con K_{2}CO_{3} (4 mg, 0,028 mmoles) en una disolución
de MeOH/H_{2}O. El residuo se cromatografió
(CH_{2}Cl_{2}:acetona 7:1 para obtener el compuesto (1l), 2,6
mg (39%), como un sólido amarillo. RMN de ^{1}H (300 MHz,
CDCl_{3}/CD_{3}OD) \delta 0,042 (s, 9H),
0,68-0,92 (m, 5H), 1,80-1,95 (m,
2H), 2,83-2,95 (m, 2H), 3,07 (d, J = 14 Hz, 1H),
3,28 (d, J = 14 Hz, 1H), 5,05 (s, 2H), 5,29 (d, J = 15 Hz, 1H), 5,51
(d, J = 15 Hz, 1H), 7,22 (d, J = 2 Hz, 1H),
7,26-7,34 (m, 1H), 7,40 (s, 1H), 7,89 (d, J = 9 Hz,
1H); HRMS (EI) m/z calculado para el
C_{26}H_{30}N_{2}O_{5}Si (M^{+}) 478,1924, encontrado
478,1915 LRMS (EI) m/z 478 (M^{+}), 463, 431, 418, 393, 379, 364,
305, 261, 153, 117, 105, 91, 73, 59.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió ácido trifluoroacético (0,1 mL) a una
disolución que contenía CH_{2}Cl_{2} (0,5 mL) y el compuesto
(1i) (10,7 mg, 0,018 mmoles) y el contenido se agitó a 22ºC. Después
de 5 horas, la mezcla se vertió en NaHCO_{3} saturado (2 mL) y se
extrajo con EtOAc (6 x 2 mL). El EtOAc se secó (Na_{2}SO_{4}),
se concentró y se cromatografió (CH_{2}Cl_{2}:MeOH 96:4) para
dar el compuesto (1m), 6,7 mg (78%), como un sólido amarillo. RMN
de ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}/CD_{3}OD) \delta 0,059 (s, 9H),
0,70-0,92 (m, 5H), 1,82-1,98 (m,
2H), 2,80-2,92 (m, 2H), 3,08 (d, J = 14 Hz, 1H),
3,29 (d, J = 14 Hz, 1H) 5,00 (s, 2H), 5,29 (d, J = 15 Hz, 1H), 5,52
(d, J = 15 Hz, 1H), 6,95 (d, J = 2 Hz, 1H), 7,18 (dd, J_{1} = 9
Hz, J_{2} = 2 Hz, 1H), 7,38 (s, 1H), 7,83 (d, J = 9 Hz, 1H).
Claims (58)
1. Un compuesto que tiene la fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en forma racémica, forma
enantioméricamente enriquecida o forma enantioméricamente
pura;
en la que R^{1} es hidrógeno,
-C(O)R^{f}, donde R^{f} es como se define a
continuación, un grupo alquilo como se define a continuación, un
grupo alquenilo como se define a continuación, un grupo alquinilo
como se define a continuación, un grupo alcoxi como se define a
continuación, un grupo ariloxi de fórmula -OR^{e}, donde R^{e}
es fenilo o naftilo, un grupo aciloxi como se define a continuación,
un grupo alcoxicarboniloxi de fórmula -OC(O)OR^{d},
donde R^{d} se define a continuación, un grupo carbamoiloxi de
fórmula -OC(O)NR^{a}R^{b}, un átomo de halógeno,
un grupo hidroxi, un grupo nitro, un grupo un grupo ciano, un grupo
azido, un grupo formilo, un grupo hidrazino, un grupo amino de
fórmula -NR^{a}R^{b}, -SR^{c}; o R^{1} y R^{2} forman
juntos una cadena de tres o cuatro miembros elegidos entre el grupo
de CH, CH_{2}, O, S, NH o NR^{15}, donde R^{15} es un grupo
alquilo C_{1}-C_{6};
en la que R^{2} es -C(O)R^{f},
donde R^{f} es como se define a continuación, un grupo alquilo
como se define a continuación, un grupo alquenilo como se define a
continuación, un grupo alquinilo como se define a continuación, un
grupo alcoxi como se define a continuación, un grupo ariloxi de
fórmula -OR^{e}, donde R^{e} es fenilo o naftilo, un grupo
aciloxi como se define a continuación, un grupo alcoxicarboniloxi de
fórmula -OC(O)OR^{d}, donde R^{d} es como se
define a continuación, un grupo carbamoiloxi de fórmula
-OC(O)NR^{a}R^{b}, un grupo hidroxi, un grupo
nitro, un grupo ciano, un grupo azido, un grupo formilo, un grupo
hidrazino, un grupo amino de fórmula -NR^{a}R^{b}, -SR^{c}; o
R^{1} y R^{2} forman juntos una cadena de tres o cuatro miembros
elegidos entre el grupo de CH, CH_{2}, O, S, NH o NR^{15}, donde
R^{15} es un grupo alquilo C_{1}-C_{6};
donde R^{a} y R^{b} son independientemente
H, un grupo acilo de fórmula -C(O)R^{f} como se
define a continuación, un grupo alquilo como se define a
continuación o un grupo arilo en el que el arilo es fenilo o
naftilo;
donde R^{c} es hidrógeno,
-C(O)R^{f}, donde R^{f} es como se define a
continuación, un grupo alquilo o un grupo arilo en el que el arilo
es fenilo o naftilo; y
donde R^{f} es un grupo alquilo, un grupo
haloalquilo, un grupo perfluoroalquilo, un grupo alcoxi como se ha
definido anteriormente, un grupo amino como se ha definido
anteriormente o un grupo hidroxi;
R^{3} es H, un átomo de halógeno, un grupo
nitro, un grupo amino como se ha definido anteriormente, un grupo
hidroxi o un grupo ciano; o R^{2} y R^{3} forman juntos una
cadena de tres o cuatro miembros elegidos entre el grupo de CH,
CH_{2}, O, S, NH o NR^{15};
R^{4} es H, F, un grupo amino de fórmula
-NR^{a}R^{b}, un grupo alquilo C_{1-3}, un
grupo alquenilo C_{2-3}, un grupo alquinilo
C_{2-3}, un grupo trialquilsililo o un grupo
alcoxi C_{1-3};
R^{5} es un grupo alquilo
C_{1-10}, un grupo alquenilo como se define
continuación, un grupo alquinilo como se define continuación o un
grupo bencilo;
R^{6} es -Si(R^{8}R^{9}R^{10}) o
-(R^{7})Si(R^{8}R^{9}R^{10}), donde R^{7} es
un grupo alquileno, un grupo alquenileno o un grupo alquinileno; y
R^{8}, R^{9} y R^{10} son independientemente un grupo alquilo
C_{1-10}, un grupo alquenilo
C_{2-10}, un grupo alquinilo
C_{2-10}, un grupo arilo como se ha definido
anteriormente o un grupo -(CH_{2})_{n}NR^{11}, donde n
es un número entero en el intervalo de 1 a 10 y R^{11} es un grupo
hidroxi, un grupo alcoxi como se define a continuación, un grupo
amino de fórmula -NR^{a}R^{b}, un grupo alquilamino, un grupo
dialquilamino, un átomo de halógeno, un grupo ciano, -SR^{c},
donde R^{c} se ha definido anteriormente, o un grupo nitro;
R^{13} es H, F o -CH_{3}; y
R^{16} es -C(O)R^{f} o H;
\newpage
o uno de los compuestos:
-
7-trimetilsililhomocamptotecina;
-
7-ter-butildimetilsililhomocamptotecina;
y sus sales farmacéuticamente aceptables;
donde:
- -
- alquilo es un grupo hidrocarbonado ramificado o no ramificado, cíclico o acíclico que tiene de 1 a 15 átomos de carbono (a menos que se indique de otra forma); opcionalmente sustituido con un grupo elegido entre: un grupo bencilo, un grupo fenilo, un grupo alcoxi como se define a continuación, un grupo hidroxilo, un grupo amino como se define a continuación, un grupo alquilamino, un grupo dialquilamino, un grupo arilamino donde el arilo es fenilo o naftilo, un grupo alquenilo como se define a continuación, un grupo alquinilo como se define a continuación o un grupo aciloxi como se define a continuación;
- -
- alquenilo es un grupo hidrocarbonado de cadena lineal o ramificada con al menos un doble enlace, que tiene de 2 a 15 átomos de carbono (a menos que se indique de otra forma), opcionalmente sustituido con un grupo alquilo, un grupo aminoalquilo, un grupo bencilo o un grupo alcoxialquilo;
- -
- alquinilo es un grupo hidrocarbonado de cadena lineal o ramificada con al menos un tripe enlace, que tiene de 2 a 15 átomos de carbono (a menos que se indique de otra forma), opcionalmente sustituido con un grupo alquilo, un grupo aminoalquilo, un grupo bencilo o un grupo alcoxialquilo;
- -
- alcoxi es un grupo de fórmula -OR^{d}, donde R^{d} en un grupo alquilo C_{1-15} (a menos que se indique de otra forma); y
- -
- aciloxi es un grupo de fórmula -OC(O)R^{d}, donde R^{d} es como se ha definido anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El compuesto según la reivindicación 1, en el
que R^{16} es H.
3. El compuesto según la reivindicación 2, en el
que R^{2} y R^{3} juntos forman un grupo de fórmula
-O(CH_{2})_{n}O- en la que n representa el número
entero 1 ó 2.
4. El compuesto según la reivindicación 2, en el
que R^{5} es un grupo etilo, un grupo alilo, un grupo bencilo o un
grupo propargilo.
5. El compuesto según la reivindicación 2, en el
que R^{13} es H.
6. El compuesto según la reivindicación 5, en el
que R^{5} es un grupo etilo.
7. El compuesto según la reivindicación 6, en el
que R^{4} es H.
8. El compuesto según la reivindicación 7, en el
que R^{8} y R^{9} son grupos metilo, R^{10} es un grupo
ter-butilo o un grupo metilo, R^{1} es H y R^{3}
es H.
9. El compuesto según la reivindicación 8, en el
que R^{2} es NH_{2} u OH.
10. El compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes en el que R^{6} es
-Si(R^{8}R^{9}R^{10}).
11. Un método de síntesis de un compuesto que
tiene la fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R^{1} y R^{2} son
independientemente el mismo o diferentes y son hidrógeno,
-C(O)R^{f}, donde R^{f} es como se ha definido en
la reivindicación 1, un grupo alquilo como se ha definido en la
reivindicación 1, un grupo alquenilo como se ha definido en la
reivindicación 1, un grupo alquinilo como se ha definido en la
reivindicación 1, un grupo alcoxi como se ha definido en la
reivindicación 1, un grupo ariloxi de fórmula -OR^{e}, donde
OR^{e} es fenilo o naftilo, un grupo aciloxi como se define a
continuación, un grupo alcoxicarboniloxi de fórmula
-OC(O)OR^{d} donde R^{d} se define a continuación,
un grupo carbamoiloxi de fórmula
-OC(O)NR^{a}R^{b}, un átomo de halógeno, un grupo
hidroxi, un grupo nitro, un grupo ciano, un grupo azido, un grupo
formilo, un grupo hidrazino, un grupo amino de fórmula
-NR^{a}R^{b}, -SR^{c}; o R^{1} y R^{2} juntos forman una
cadena de tres o cuatro miembros elegidos entre el grupo de CH,
CH_{2}, O, S, NH o NR^{15}, donde R^{15} es un grupo alquilo
C_{1}-C_{6};
y en la que R^{3}, R^{4}, R^{5}, R^{6} y
R^{13} son como se han definido en la reivindicación 1,
mediante una anulación 4+1 en cascada de
radicales, en la que el precursor:
\vskip1.000000\baselineskip
o el
precursor:
\vskip1.000000\baselineskip
se hacen reaccionar con un
arilisonitrilo que tiene la
fórmula:
en la que X es un precursor de
radicales elegido entre el grupo que consiste en Cl, Br, I, ácidos
carboxílicos y sus derivados, selenofenilo y sales de
diazonio.
12. El método según la reivindicación 11, en el
que R^{2} y R^{3} juntos forman un grupo de fórmula
-O(CH_{2})_{n}O- en la que n representa el número
entero 1 ó 2.
13. El método según la reivindicación 11, en el
que R^{5} es un grupo etilo, un grupo alilo, un grupo bencilo o un
grupo propargilo.
14. El método según la reivindicación 11, en el
que X es Br o I.
15. El método según la reivindicación 14, en el
que R^{13} es H.
16. El método según la reivindicación 15, en el
que R^{5} es un grupo etilo.
17. El método según la reivindicación 16, en el
que R^{4} es H.
18. El método según la reivindicación 17, en el
que R^{8} y R^{9} son grupos metilo, R^{10} es un grupo
ter-butilo o un grupo metilo, R^{1} es H y R^{3}
es H.
19. El método según la reivindicación 18, en el
que R^{2} es H, NH_{2} u OH.
20. Un compuesto que tiene la fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en forma racémica, forma
enantioméricamente enriquecida o forma enantioméricamente
pura;
en la que R^{1}, R^{2},R^{3}, R^{4},
R^{5}, R^{6} y R^{13} son como se han definido en la
reivindicación 1,
y en la que R^{12} es H o
-C(O)R^{f}, -C(O)OR^{d} o
-C(O)NR^{a}R^{b}; donde R^{a}, R^{b}, R^{d}
y R^{f} son como se han definido en la reivindicación 1.
21. El compuesto según la reivindicación 20, en
el que R^{2} y R^{3} juntos forman un grupo de fórmula
-O(CH_{2})_{n}O- en la que n representa el número
entero 1 ó 2.
22. El compuesto según la reivindicación 20, en
el que R^{5} es un grupo etilo, un grupo alilo, un grupo bencilo o
un grupo propargilo.
23. El compuesto según la reivindicación 20, en
el que R^{13} es H.
24. El compuesto según la reivindicación 23, en
el que R^{5} es un grupo etilo.
25. El compuesto según la reivindicación 24, en
el que R^{4} es H.
26. El compuesto según la reivindicación 25, en
el que R^{8} y R^{9} son grupos metilo, R^{10} es un grupo
ter-butilo o un grupo metilo, R^{1} es H y R^{3}
es H.
27. El compuesto según la reivindicación 26, en
el que R^{2} es NH_{2} u OH.
28. Un compuesto que tiene la fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en forma racémica, forma
enantioméricamente enriquecida o forma enantioméricamente
pura;
en la que R^{5}, R^{6} y R^{13} son como
se han definido en la reivindicación 1;
en la que X es un precursor de radicales como se
ha definido en la reivindicación 11.
29. El compuesto según la reivindicación 28, en
el que R^{5} es un grupo etilo, un grupo alilo, un grupo bencilo o
un grupo propargilo.
30. El compuesto según la reivindicación 28, en
el que X es Br o I.
31. El compuesto según la reivindicación 30, en
el que R^{13} es H.
32. El compuesto según la reivindicación 31, en
el que R^{5} es un grupo etilo.
\newpage
33. Un compuesto que tiene la fórmula:
en forma racémica, forma
enantioméricamente enriquecida o forma enantioméricamente
pura;
en la que R^{5} y R^{13} son como se han
definido en la reivindicación 1;
en la que X es un precursor de radicales como se
ha definido en la reivindicación 11.
34. El compuesto según la reivindicación 33, en
el que R^{5} es un grupo etilo, un grupo alilo, un grupo bencilo o
un grupo propargilo.
35. El compuesto según la reivindicación 34, en
el que X es Br o I.
36. El compuesto según la reivindicación 34, en
el que R^{13} es H.
37. El compuesto según la reivindicación 36, en
el que R^{5} es un grupo etilo.
38. Un compuesto que tiene la fórmula:
en la que R^{5} es como se ha
definido en la reivindicación 1 y R^{12} es como se ha definido en
la reivindicación
20.
39. El compuesto según la reivindicación 38, en
el que R^{5} es un grupo etilo, un grupo alilo, un grupo bencilo o
un grupo propargilo.
40. El compuesto según la reivindicación 39, en
el que R^{5} es un grupo etilo.
41. Un compuesto que tiene la fórmula:
en la que R^{5} y R^{13} son
como se han definido en la reivindicación 1; y R^{15} es un grupo
alquilo
C_{1-6}.
en la que X es un precursor de radicales como se
ha definido en la reivindicación 11.
42. El compuesto según la reivindicación 41, en
el que R^{5} es un grupo etilo, un grupo alilo, un grupo bencilo o
un grupo propargilo.
43. El compuesto según la reivindicación 42, en
el que R^{13} es H.
44. El compuesto según la reivindicación 43, en
el que R^{5} es un grupo etilo.
45. Un compuesto que tiene la fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en forma racémica, forma
enantioméricamente enriquecida o forma enantioméricamente
pura;
en la que R^{5} y R^{13} son como se han
definido en la reivindicación 1 y R^{14} es SiMe_{3}, I o
Br.
46. Un método de síntesis de un compuesto que
tiene la fórmula siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R^{5}, R^{6} y
R^{13} son como se han definido en la reivindicación 1;
y
en la que Y es Cl, Br o I; que comprende las
etapas de:
(a) tratar un enol éter de estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en condiciones de escisión oxidante
adecuadas para formar un compuesto que tiene la
estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(b) tratar el compuesto formado en la etapa (a)
con un reactivo organometálico que tiene la estructura:
MC(R^{13})(R^{13})CO_{2}R^{15}
\newpage
en la que M es Li, Na, K, MgY o
ZnY, y R^{15} es un grupo alquilo C_{1}-C_{6}
en condiciones adecuadas para formar un compuesto que tiene la
estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(c) tratar el compuesto formado en la etapa (b)
en condiciones adecuadas con ácido para formar un compuesto que
tiene la estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(d) tratar el compuesto formado en la etapa (c)
en condiciones adecuadas de desililación halogenante para formar un
compuesto que tiene la estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(e) tratar el compuesto de la etapa (d) con
ácido o con yodotrimetilsilano en condiciones adecuadas para la
desmetilación, para proporcionar un compuesto de la estructura
siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(f) tratar el compuesto de la etapa (e) con una
base de litio o una base de sodio en presencia de una sal inorgánica
de litio para desprotonar el átomo de nitrógeno;
\newpage
(g) hacer reaccionar la especie desprotonada
resultante de la etapa (f) con un compuesto de la estructura
siguiente:
en la que Z es I, Br, Cl, un grupo
mesilato o un grupo tosilato, y en condiciones adecuadas para
producir la formación del compuesto de la estructura
siguiente:
47. El método según la reivindicación 46, en el
que R^{5} es un grupo etilo, un grupo alilo, un grupo bencilo o un
grupo propargilo.
48. El método según la reivindicación 47, en el
que R^{13} es H.
49. El método según la reivindicación 48, en el
que R^{5} es un grupo etilo.
50. Un compuesto según la reivindicación 1 para
usarlo para tratar a un paciente que padece cáncer o leucemia.
51. El compuesto para usarlo según la
reivindicación 50, donde cáncer es cáncer de cerebro o cáncer de
mama.
52. Uso de un compuesto según la reivindicación
1 para la elaboración de un medicamento para el tratamiento del
cáncer o la leucemia.
53. Uso según la reivindicación 52, donde el
cáncer es cáncer de cerebro o cáncer de mama.
54. Un compuesto que tiene la fórmula:
en forma racémica, forma
enantioméricamente enriquecida o forma enantioméricamente
pura;
en la que R^{5}, R^{6} y R^{13} son como
se han definido en la reivindicación 1; y
en la que X es un precursor de radicales como se
ha definido en la reivindicación 11.
55. El compuesto según la reivindicación 54, en
el que R^{5} es un grupo etilo, un grupo alilo, un grupo bencilo o
un grupo propargilo.
56. El compuesto según la reivindicación 55, en
el que X es Br o I.
57. El compuesto según la reivindicación 56, en
el que R^{13} es H.
58. El compuesto según la reivindicación 57, en
el que R^{5} es un grupo etilo.
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