ES2309174T3 - Procedimiento para detectar antigenos de celulas sanguineas y anticuerpos dirigidos frente a estos. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento in vitro para detectar anticuerpos dirigidos frente a antígenos de células sanguíneas o antígenos de células sanguíneas en muestras de seres humanos, caracterizado porque a partir de la muestra se extraen los anticuerpos nativos dirigidos frente a antígenos de células sanguíneas o los antígenos nativos de células sanguíneas usando anticuerpos monoclonales con perlas, que presentan un diámetro de 2-4 mum y una densidad de 1,1-1,8 g/cm 3 , y se conduce la detección de los anticuerpos dirigidos frente a antígenos de células sanguíneas o de los antígenos de células sanguíneas unidos a las perlas mediante aglutinación en una tarjeta de gel, que contiene un anticuerpo específico de especie adecuado para la detección que está dirigido frente a la especie de la que procede el anticuerpo frente al antígeno de células sanguíneas que va detectarse o el anticuerpo usado para detectar el antígeno de células sanguíneas.
Description
Procedimiento para detectar antígenos de células
sanguíneas y anticuerpos dirigidos frente a estos.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para detectar antígenos en células sanguíneas o
detectar anticuerpos dirigidos frente a estos antígenos en sangre
de seres humanos. Este procedimiento se realiza in vitro con
ayuda de la sangre extraída del paciente.
En el diagnóstico actual de determinadas
enfermedades deben detectarse en sangre de los pacientes antígenos
seleccionados de los glóbulos rojos y blancos (eritrocitos o
leucocitos) y de plaquetas o también anticuerpos específicos frente
a estos antígenos.
Los antígenos de células sanguíneas son marcas
superficiales (rasgos) de corpúsculos rojos (eritrocitos),
plaquetas (trombocitos) y corpúsculos blancos (leucocitos). En la
mayoría de los casos se trata a este respecto de glicoproteínas,
glicolípidos o proteínas. Un resumen para esto se encuentra por
ejemplo en Transfusionsmedizin, Mueller-Eckhardt
(Hgb), Springer-Verlag Berlín (1999), pág.
137-200.
La representación clínica de estos antígenos de
células sanguíneas resulta de su inmunogenicidad, es decir su
capacidad, en un individuo que no presenta estos antígenos en
circunstancias normales, de estimular la formación de anticuerpos
específicos por ejemplo tras una transfusión.
La formación de tales anticuerpos dirigidos
frente a antígenos de células sanguíneas puede inducirse además por
ejemplo tras el nacimiento, tal como es el caso con las
isoaglutininas de grupo sanguíneo (anti-A,
anti-B), o mediante la transmisión de células
alogénicas en el contexto de la gestación, un transplante de órganos
o un transplante de médula ósea. Ejemplos de anticuerpos
correspondientes son anti-D, anti-K,
anti-Fy etc. frente a eritrocitos,
anti-HPA-1,
anti-HPA-2 frente a trombocitos,
anti-INA-1,
anti-INA-2 frente a granulocitos o
anticuerpos frente a la clase I y clase II de HLA.
Además pueden formarse anticuerpos frente a
antígenos propios (autoanticuerpos). Estos pueden conducir a la
degradación anticipada o a la destrucción de células autólogas,
tales como por ejemplo en el caso de anemia hemolítica
autoinmunitaria, de la trombocitopenia autoinmunitaria o de la
neutropenia autoinmunitaria (agranulocitosis).
Los aloanticuerpos frente a eritrocitos pueden
provocar en fetos y recién nacidos hemólisis intensa de manera
diferente (enfermedad hemolítica neonatal), sobre todo los
inmunoanticuerpos tales como anti-D y
anti-c.
Las isoaglutininas y los aloanticuerpos
clínicamente relevantes deben tenerse en cuenta antes de cada
transfusión sanguínea con eritrocitos. Por regla general no deben
transfundirse eritrocitos serológicamente incompatibles, por
ejemplo concentrados de eritrocitos Rh positivos, cuando existe en
el receptor (Rh negativo) un aloanticuerpo de la especificad
anti-D. Por tanto deben identificarse anticuerpos
frente a eritrocitos antes de transfusiones y tenerse en cuenta en
una transfusión. Además debe realizarse antes de cada transfusión un
ensayo de compatibilidad serológica (ensayo cruzado) con todas las
muestras de sangre conservadas para la transfusión.
El registro de anticuerpos frente a antígenos
eritrocitarios tiene lugar hasta ahora de manera rutinaria mediante
la incubación de muestras de suero frente a eritrocitos de prueba
nativos seleccionados (búsqueda de anticuerpos y dado el caso
identificación de anticuerpos) o antes de una transfusión frente a
eritrocitos del donante (ensayo cruzado). La incompatibilidad entre
suero y eritrocitos se muestra mediante una aglutinación directa o
indirecta de los eritrocitos sometidos a estudio. Una aglutinación
directa de los eritrocitos se provoca por ejemplo mediante las
isoaglutininas anti-A y anti-B. Una
aglutinación indirecta se induce por ejemplo mediante la incubación
de anti-D con eritrocitos de prueba Rh positivos y a
continuación mediante la administración de suero de antiglobulina
humana (prueba de Coombs indirecta).
Los inconvenientes del uso de eritrocitos de
prueba están representados por la selección, poca frecuencia y
disponibilidad de determinados eritrocitos de prueba y tiempo de
almacenamiento corto de las células. Deben buscarse regularmente
donantes seleccionados con antígenos conocidos para aislar las
células y las células pueden mantenerse sólo durante corto
tiempo.
Todos los métodos de prueba descritos hasta
ahora se refieren prácticamente al uso de tales células (véase
Transfusionsmedizin, Mueller-Eckhardt (Hgb),
Springer-Verlag Berlín (1999), pág.
587-596, y New diagnostic methods in oncology and
hematology, Huhn (Hgb) Springer Verlag, Berlín, 1998, pág.
197-212).
Por tanto los inconvenientes asociados a esto
son:
- \bullet
- Para reconocer anticuerpos específicos deben usarse varios (por regla general más de 11) eritrocitos de prueba (células de prueba) por prueba, dado que los eritrocitos con características (separadas) aisladas no están disponibles (por ejemplo células, que portan sólo la característica "D").
- \bullet
- Por regla general no se dispone de eritrocitos de prueba con características poco frecuentes para reconocer determinados anticuerpos. Debido a ello no siempre puede garantizarse la asistencia de pacientes afectados.
- \bullet
- Por regla general no se dispone de eritrocitos de prueba con características no presentes, que normalmente se producen frecuentemente, para reconocer determinados anticuerpos. También debido a ello no siempre puede garantizarse la asistencia de pacientes afectados.
- \bullet
- La selección de las células de prueba correspondientes es costosa.
- \bullet
- Dado que se trata de material biológico aislado de seres humanos no siempre está descartado un riesgo de infección para el personal clínico, médicos, etc., que se encargan del material.
- \bullet
- Las células sólo pueden almacenarse de manera limitada.
La representación clínica de los anticuerpos
frente a antígenos trombocitarios está reflejada por la
trombocitopenia autoinmunitaria (TPAI), la trombocitopenia
aloinmunitaria neonatal (TPAIN), la púrpura postransfusional (PPT)
y la transfusión de trombocitos incompatibles. En todos los casos
pueden provocar los anticuerpos una alteración de la hemostasia
primaria y una tendencia a la hemorragia en los pacientes
afectados.
La detección de anticuerpos frente a trombocitos
es hasta ahora difícil y sólo puede realizarse en laboratorios
especiales individuales. Una prueba de aglutinación fácil y rápida,
tal como por ejemplo en el caso de eritrocitos, no es posible hasta
ahora por la calidad de las plaquetas. De los métodos descritos
hasta ahora se usan de la manera más frecuente el ensayo de
inmunoabsorción unido a enzimas (ELISA), el ensayo de
inmunofluorescencia de adhesión plaquetaria (PIFT) y para la
especificación de las inmunoglobulinas unidas, la
inmunoprecipitación o ensayo MAIPA (inmovilización por anticuerpo
monoclonales de antígenos plaquetarios) (véase Transfusionsmedizin,
Mueller-Eckhardt (Hgb),
Springer-Verlag Berlín (1999)'' pág.
597-602, New diagnostic methods in oncology and
hematology, Huhn (Hgb) Springer Verlag, Berlín, (1998)'' pág.
213-228, McMillan, Transfusion Medicine Reviews,
tomo IV, nº 2, pág. 136-143 (1990)).
Los inconvenientes de estos métodos son
diversos:
- \bullet
- Todos los métodos de prueba son laboriosos, dado que no existen por regla general trombocitos tipificados y las pruebas sólo pueden realizarse por expertos.
- \bullet
- En pacientes con recuento plaquetario reducido con frecuencia no pueden aislarse ni someterse a estudio o no de manera suficiente trombocitos autólogos, por ejemplo en ELISA o MAIPA.
- \bullet
- La especificidad (ELISA y PIFT) y la sensibilidad (MAIPA) están limitadas, y debido a ello con frecuencia no pueden interpretarse los resultados.
- \bullet
- Además se aplican básicamente todos los inconvenientes, que se describieron anteriormente también para la detección de antígenos eritrocitarios.
La representación clínica de anticuerpos frente
a antígenos dependientes de neutrófilos se caracteriza por la
autoinmunoneutropenia, aloinmunoneutropenia neonatal y TRALI
(insuficiencia respiratoria aguda asociada a transfusión). El
registro de estos anticuerpos es aún más difícil que el registro de
los anticuerpos trombocitarios. Los métodos de prueba conocidos
hasta ahora se adaptan en gran medida a los métodos de detección de
anticuerpos frente a trombocitos (véase Transfusionsmedizin,
Mueller-Eckhardt (Hgb),
Springer-Verlag Berlín (1999)'' pág.
603-609, New diagnostic methods in oncology and
hematology, Huhn (Hgb) Springer Verlag, Berlín, (1998)'' pág.
228-235, Minchinton and Waters, British Journal of
Haematology, 56, pág. 521-528, (1984), McCullough
and William, Transfusion Medicine Reviews, tomo 1, nº 3, pág.
150-160, (1987)).
Además, los anticuerpos frente a linfocitos,
sobre todo linfocitos T, tienen mayor representación en la
inmunología de los transplantes. Estos anticuerpos pueden provocar
un rechazo agudo o atrasado de los transplantes (médula ósea,
corazón, pulmón, riñón y otros órganos). Por tanto, deben
descartarse antes de realizar transplantes de médula ósea y de
riñón la presencia de anticuerpos linfocitarios frente a los órganos
de donante.
Además, los antígenos linfocitarios (antígenos
HLA) en caso de embarazo y transfusiones pueden conducir a la
formación de anticuerpos específicos frente a rasgos de HLA. Por ese
motivo, la presencia casual de tales anticuerpos debe tenerse en
cuenta en caso de transplantes y en caso de transfusiones de
trombocitos y dado el caso leucocitos.
El método de detección clásico de anticuerpos
HLA está limitado hasta ahora a la prueba linfocitotóxica. Sin
embargo, con esta prueba pueden detectarse sólo anticuerpos que
activan al complemento. La técnica ELISA usada últimamente es
extremadamente difícil y se realiza sólo en laboratorios especiales
individuales (véase Transfusionsmedizin,
Mueller-Eckhardt (Hgb),
Springer-Verlag Berlín (1999)'' pág.
611-617, Zachary et al. Transplantation, tomo
60, nº 12, pág. 1600-1606 (1995), Lubenko y Rodi,
Transfusion, tomo 38, pág. 41-44 (1998)).
En resumen, todos los principios de prueba para
registrar anticuerpos frente a células sanguíneas se basan en el
uso de células seleccionadas biológicas y por lo general nativas,
que se obtienen y se ponen a disposición de individuos
seleccionados.
Una prueba relativamente rápida y fácil sólo es
posible para el reconocimiento de anticuerpos habituales frente a
eritrocitos, por ejemplo la detección de un anticuerpo
anti-D.
La búsqueda de alternativas continúa sin éxito
hasta ahora.
Aunque se clonan y se secuencian en parte los
genes de la mayoría de sistemas de grupos sanguíneos (eritrocitos,
trombocitos y leucocitos), la detección de anticuerpos se consigue
mediante el uso de péptidos y antígenos recombinantes, en caso de
que se produzca, sólo en casos particulares (Bowditch et al.,
Blood, tomo 88, nº 12, pág. 4579-4584 (1996),
Peterson et al., Blood, tomo 92, nº 6, pág.
2053-2063 (1998), Yazdanbakhsh, Transfusion
Medicine Reviews, tomo 15, nº 1, pág. 53-66,
(2001)).
También la prueba MAIPA mencionada
anteriormente, con la que se inmovilizan anticuerpos en placas de
microtitulación para realizar una prueba ELISA indirecta, ofrece
todavía problemas de manejo prácticos enormes. De ese modo, esta
prueba dura aproximadamente de 7-8 horas, y con
frecuencia los resultados de la prueba no están claros. Además, las
placas de microtitulación recubiertas no pueden guardarse el tiempo
suficiente de modo que en la práctica deben prepararse de manera
reciente en el laboratorio todas las disoluciones
correspondientes.
Meyer et al., THE LANCET tomo 354, nº
9189, pág. 1525-1526 (1999) describieron un sistema
de prueba, con ayuda del cual pudieron detectar anticuerpos frente
al complejo de factor plaquetario 4 y heparina, añadiéndose perlas
recubiertas con antígenos en una prueba de aglutinación de
partículas a muestras de suero de pacientes. Se detectaron las
muestras aglutinadas mediante una prueba en tarjeta de gel (véase
por ejemplo, Salama y Mueller-Eckhard en:
Transfusionsmedizin, Mueller-Eckhardt (Hgb),
Springer-Verlag Berlín (1999), páginas
587-617). Sin embargo, a pesar de los esfuerzos más
intensos los inventores no pudieron detectar, con ayuda de esta
prueba que se realiza de manera relativamente rápida y fácil, otros
antígenos de células sanguíneas ni tampoco anticuerpos dirigidos
frente a estos.
A pesar de la necesidad extremadamente elevada,
que resulta inevitablemente de lo mencionado anteriormente, de un
sistema de prueba para detectar anticuerpos frente a antígenos de
células sanguíneas seleccionados, que supere los inconvenientes
mencionados, no pudo facilitarse uno de este tipo hasta la presente
invención.
En el documento US 6.203.706 se muestran
procedimientos, con cuya ayuda deben detectarse antígenos de células
sanguíneas o anticuerpos en por ejemplo muestras de sangre. Sin
embargo se ha mostrado que los procedimientos correspondientes, en
los que se unen directamente antígenos a perlas, sólo funcionan
pocas veces.
En vista del estado de la técnica mencionado, la
presente invención se basa por tanto en el objetivo de facilitar un
procedimiento con el que pueden detectarse específicamente
anticuerpos frente a antígenos de células sanguíneas seleccionados
o los propios antígenos de células sanguíneas. Este procedimiento
debe ser rápido y fácil de manejar y seguro y económico de
realizar. Además, el procedimiento debe poder realizarse in
vitro en muestras, que pueden obtenerse a partir de organismos
vivos.
Se soluciona éste así como otros objetivos no
mencionados de manera explícita, que sin embargo pueden derivarse o
deducirse sin más de los contextos discutidos de manera preliminar
en el presente documento, mediante un procedimiento con todas las
características de la reivindicación 1. Las modificaciones
convenientes del procedimiento según la invención se protegen en
las reivindicaciones dependientes referentes a la anterior.
Variante
1
Debido a que en un procedimiento in
vitro
- (i)
- se recubre una microesfera ("perla"), que presenta un diámetro de 2-4 \mum y una densidad de 1,1-1,8 g/cm^{3}, con un anticuerpo no humano, dirigido frente al antígeno de células sanguíneas específico que va a detectarse,
- (ii)
- se mezclan antígenos de células sanguíneas seleccionados, específicos, correspondientes, que dado el caso pueden obtenerse mediante solubilización de células sanguíneas habituales en sí ya conocidas del estado de la técnica o también mediante métodos recombinantes o de química de proteínas, con las perlas recubiertas obtenidas de (i),
- (iii)
- se mezclan las perlas recubiertas con antígeno mediante la unión del antígeno seleccionado a los anticuerpos no humanos unidos a la perla en (i) con una muestra de suero de un paciente que se somete a estudio, y
- (iv)
- se detecta el anticuerpo del paciente frente al antígeno de células sanguíneas que procede de la muestra unido dado el caso al antígeno unido a la perla, con ayuda de una prueba para detectar anticuerpos anti-humanos específica mediante aglutinación en una tarjeta de gel,
de una manera no previsible sin más
puede facilitarse un procedimiento para detectar anticuerpos frente
a antígenos de células sanguíneas en una muestra, que permite
detectar estos de modo y manera fácil. A este respecto, este
procedimiento presenta las ventajas mencionadas anteriormente con
respecto al estado de la
técnica.
Variante
2
Una leve modificación del procedimiento según la
invención para detectar anticuerpos frente a antígenos de células
sanguíneas se representa cuando
- (i)
- se recubren perlas, que presentan un diámetro de 2-4 \mum y una densidad de 1,1-1,8 g/cm^{3}, con anticuerpos específicos de especie, no anti-humanos,
- (ii)
- se solubilizan células habituales o se llevan a disolución antígenos de células sanguíneas obtenidos mediante técnica genética o química de proteínas,
- (iii)
- se incuba el solubilizado obtenido de (ii) o la disolución de antígenos de células sanguíneas obtenidos mediante técnica genética o química de proteínas con anticuerpos específicos que proceden de la especie definida en (i) y dirigidos frente al antígeno que va a detectarse,
- (iv)
- se aíslan los complejos formados en (iii) con las perlas de (i) mediante centrifugación, y
- (v)
- se somete a estudio directamente o después suero que contiene anticuerpos que procede de pacientes en la prueba de aglutinación.
Variante
3
Además se logra debido a que en un procedimiento
in vitro
- (i)
- se recubre una microesfera ("perla"), que presente un diámetro de 2-4 \mum y una densidad de 1,1-1,8 g/cm^{3}, con un anticuerpo dirigido frente al antígeno de células sanguíneas específico que va a detectarse,
- (ii)
- se somete a un tratamiento muestras de sangre del paciente que va a someterse a estudio con las células sanguíneas contenidas en las mismas, mediante el cual se solubilizan los antígenos contenidos en la membrana de las células sanguíneas, y dado el caso se produce una fracción enriquecida en antígeno,
- (iii)
- se mezclan las perlas recubiertas obtenidas de (i) con la muestra obtenida de (ii),
- (iv)
- se detecta el antígeno de células sanguíneas que procede de la muestra, unido dado el caso a los anticuerpos unidos a la perla, con ayuda de una prueba para detectar anticuerpos específica mediante aglutinación en una tarjeta de gel.
Variante
4
Además es posible detectar antígenos sanguíneos
en muestras,
- (i)
- recubriéndose perlas, que presentan un diámetro de 2-4 \mum y una densidad de 1,1-1,8 g/cm^{3}, con anticuerpos específicos de especie, no anti-humanos,
- (ii)
- solubilizándose células sanguíneas de pacientes que van a someterse a estudio,
- (iii)
- incubándose el solubilizado obtenido de (ii) con anticuerpos específicos que proceden de la especie definida en (i) y dirigidos frente al antígeno que va a detectarse,
- (iv)
- aislándose los complejos formados en (iii) con las perlas de (i) mediante centrifugación, y
- (v)
- sometiendo a estudio la muestra en la prueba de aglutinación.
Especialmente, los procedimientos según la
invención son
\bullet fáciles y rápidos de manejar y
\bullet seguros y económicos de realizar,
Mientras que para la realización de los sistemas
descritos hasta ahora en el estado de la técnica, era necesario
hasta ahora prácticamente siempre el uso o la preparación rápida de
células de prueba nativas, el procedimiento según la invención
puede prescindir de esto. Especialmente, las perlas que pueden
usarse según la invención, recubiertas acabadas ofrecen una
estabilidad de almacenamiento esencialmente más elevada como células
de prueba nativas. Además, estas perlas recubiertas pueden
facilitarse teóricamente en cantidades ilimitadas y pueden estar
disponibles en caso necesario, de modo que se obtiene también a
partir de esto una simplificación esencial.
Es esencial para la presente invención que se
realice la detección de antígenos de células sanguíneas o
anticuerpos dirigidos frente a estos, en la que se extraen a partir
de la muestra los antígenos nativos por medio de los anticuerpos
monoclonales, dirigidos frente ellos. Sólo con esta modificación del
procedimiento esencial con respecto al estado de la técnica puede
solucionarse el objetivo técnico mencionado anteriormente de manera
tan fácil y segura con esfuerzo reducido.
Las perlas recubiertas acabadas, que pueden
usarse según la invención son las perlas obtenidas de la etapa (ii)
en la variante 1, las perlas obtenidas de la etapa (iv) en la
variante 2, las perlas obtenidas de la etapa (i) en la variante 3,
así como las perlas obtenidas de la etapa (i) en la variante 4.
Estas perlas pueden conservarse durante largo
tiempo, esencialmente más tiempo que en el caso de las células de
prueba nativas.
Dado que el material de partida biológico puede
preparase en laboratorios especiales organizados especialmente para
esto, se reduce también el riesgo de infección biológica para el
personal encargado.
Según la invención se detectan antígenos de
células sanguíneas o anticuerpos dirigidos frente a los mismos.
Hasta el momento se han descrito más de 700 antígenos eritrocitarios
distintos. De otras células sanguíneas se han descrito aún más
antígenos. Todos estos antígenos tienen o pueden tener relevancia
clínica. Por tanto, está claro para el experto que con la presente
invención pueden detectarse todos estos antígenos en principio de
manera rápida y segura.
Una recopilación de tales antígenos de células
sanguíneas se encuentra por ejemplo en Issitt, P. y Anstee, D.
(Hgb.): APPLIED BLOOD GROUP SEROLOGY, Montgomery Scientific
Publications, Durham, Carolina del Norte, EE.UU. Antígenos del
grupo sanguíneo especialmente importantes, que se detectan
preferiblemente con ayuda de la presente invención, son: AB0; C,
C^{w}, c, D, E, e, K, k, Fy (a), Fy (b), Jk (a), Jk (b), S, s, M,
N, P (1), Le (a), Le (b).
Los anticuerpos igualmente necesarios están
disponibles ya en grandes cantidades. Ejemplos de tales anticuerpos
son: anti-Jka (empresa DiaClon),
anti-Jkb (empresa DiaClon), anti-Lea
(DiaClon), anti-Leb (DiaClon), sueros de prueba Rh
de la empresa BIOLITH DIAGNOSTIKA, Hann. Münden, Alemania
(anti-D, anti-C,
anti-c, anti-C^{w},
anti-E, anti-e, sueros de prueba del
sistema MNS (anti-M, anti-N,
anti-S) o también los sueros de la empresa Dade
(por ejemplo anti-K_{1}). En total se ofrecen
comercialmente a escala mundial más de 600 anticuerpos monoclonales
distintos frente a antígenos de células sanguíneas.
En casos en los que no se disponga de tales
anticuerpos, pueden producirse estos o bien de manera policlonal o
bien de manera monoclonal. El experto conoce bien los métodos para
producir anticuerpos.
Para la realización de la solubilización de las
células sanguíneas o de sus antígenos pueden emplearse los
protocolos que también se usan en los procedimientos ya descritos en
el estado de la técnica. Tal como ya se ha expuesto en otra parte,
una ventaja muy esencial de la presente invención se basa en que
debido a la esencialmente elevada conservación de las perlas
recubiertas pueden realizarse estos protocolos a gran escala en los
laboratorios organizados para esto.
Para la producción de las perlas recubiertas que
pueden usarse según la invención deben unirse los anticuerpos
específicos a las perlas.
Preferiblemente se facilita esta unión por medio
del complejo avidina/biotina o estreptavidina, uniéndose los
anticuerpos biotinilados a microvehículos recubiertos con
estreptavidina o avidina. El experto conoce bien los métodos
correspondientes, y se describen detalladamente en el documento de
patente estadounidense 6.203.706.
Se prefiere especialmente cuando un anticuerpo
dirigido frente al antígeno que va a detectarse, que está
biotinilado, reacciona primero con las células nativas (células de
prueba), después se solubilizan las células y se separa de la
mezcla básica de reacción el complejo formado de antígeno y
anticuerpo biotinilado y perlas recubiertas con estreptavidina o
con avidina (microvehículo).
Este complejo formado puede usarse entonces de
dos maneras:
1.) Si se detecta la presencia de un anticuerpo
dirigido frente al antígeno en el suero de un paciente, entonces
puede incubarse el complejo formado directamente con el suero.
Entonces, los anticuerpos presentes eventualmente reaccionan con el
antígeno y se unen al complejo. Dado que estos anticuerpos que van a
detectarse son de origen humano, la unión de los anticuerpos que
van a detectarse puede realizarse tras la separación del complejo
de la muestra básica de prueba por medio de un anticuerpo
anti-anticuerpo humano usando el método de tarjeta
de gel.
Sigue un listado de métodos: prueba habitual de
anti-globulina humana, prueba de tarjeta (Y.
Lapierre et al., (1990), Transfusion
30(2):109-113), ELISA (detección en placas de
microtitulación), microchip, difusión capilar, citometría de flujo,
radioinmunoanálisis (RIA; por ejemplo marcado de las perlas con
yodo^{125}) etc.
2.) Si se realiza la detección directa del
antígeno, entonces puede realizarse directamente la unión de un
segundo anticuerpo al complejo mencionado anteriormente de antígeno
y anticuerpo biotinilado y las perlas recubiertas con
estreptavidina o con avidina mediante los mismos métodos. Para esto
se detecta de nuevo el segundo anticuerpo por medio de un
anticuerpo específico de especie con ayuda del método de tarjeta de
gel, debiendo dirigirse el anticuerpo específico de especie frente
a la especie, de la que procede el segundo anticuerpo.
Variantes especialmente preferidas del sistema
de detección según la invención para detectar antígenos de células
sanguíneas o anticuerpos dirigidos frente a estos de las muestras de
suero comprenden por tanto:
Un procedimiento in vitro para detectar
anticuerpos frente a antígenos de células sanguíneas en una muestra
de suero de un paciente, en el que
- (i)
- se pone en contacto anticuerpo no humano, biotinilado dirigido frente al antígeno que va a detectarse con células de prueba humanas, que portan los antígenos de células sanguíneas nativas, correspondientes,
- (ii)
- se somete el complejo formado de (i) a condiciones, en las que se solubilizan las células sanguíneas,
- (iii)
- se separa de la muestra el complejo de antígeno y anticuerpo biotinilado con ayuda de las micropartículas recubiertas con estreptavidina o con avidina,
- (iv)
- se pone en contacto el complejo formado en (iii) con una muestra de suero de un paciente que va a someterse a estudio, y
- (v)
- se detectan en caso de presencia de anticuerpos específicos en la muestra de suero los complejos formados de anticuerpo biotinilado, antígeno y anticuerpo humano del suero tras la separación del complejo de la muestra con una prueba para detectar anticuerpos anti-humanos mediante aglutinación en una tarjeta de gel.
\vskip1.000000\baselineskip
Así como
Un procedimiento in vitro para detectar
antígenos de células sanguíneas seleccionados, en el que
- (i)
- se pone en contacto el anticuerpo dirigido frente al antígeno que va a detectarse con células de prueba humanas, que portan los antígenos de células sanguíneas nativas, correspondientes,
- (ii)
- se somete el complejo formado de (i) a condiciones en las que se solubilizan las células sanguíneas,
- (iii)
- se separa el complejo de antígeno y anticuerpo biotinilado con ayuda de micropartículas recubiertas con estreptavidina o con avidina a partir de la muestra,
- (iv)
- se pone en contacto el complejo formado en (iii) con un segundo anticuerpo, preferiblemente marcado, dirigido frente al antígeno, y
- (v)
- se detecta el complejo formado de anticuerpo biotinilado, antígeno y anticuerpo secundario tras la separación del complejo de la muestra mediante aglutinación en una tarjeta de gel.
\vskip1.000000\baselineskip
También se tiene en cuenta una unión química del
anticuerpo a las perlas.
Como perlas se entienden para los fines de la
presente invención en general microvehículos en forma de esfera de
distintos materiales.
Preferiblemente se utilizan a este respecto
partículas de estreptavidina ferromagnéticas (por ejemplo,
estreptavidina Dynabeads M280).
\vskip1.000000\baselineskip
Las propiedades físicas de estas partículas son
las siguientes:
Diámetro: 2-4 mm
Densidad: 1,1-1,8 g/cm^{3}
Superficie: 4-8 m^{2}/g
Momento másico magnético: 100 \pm 25x
10-6 m^{3}/kg
La suspensión contiene preferiblemente 10 mg/ml
de partícula, que corresponde a 6,7 x 10^{8} /ml.
\vskip1.000000\baselineskip
Las propiedades de unión de las partículas son
preferiblemente las siguientes:
1 mg de estreptavidina Dynabeads M280 pueden
unir 5-10 mg de un anticuerpo biotinilado (100% de
saturación de la estreptavidina unida de manera covalente a la
superficie de poliestireno).
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
Las ventajas de estas partículas son:
Debido a las propiedades paramagnéticas, estas
partículas son adecuadas para aislar complejos
bionita-anticuerpo-antígeno a
partir de una mezcla heterogénea, tal como por ejemplo lisado
celular, mediante el simple uso de un imán (concentrador magnético
de partículas).
\vskip1.000000\baselineskip
Estas partículas presentan sin embargo las
siguientes desventajas:
- No están presentes partículas fluorescentes de
color.
- Queda excluida la investigación en la
citometría de flujo.
De manera especialmente preferida según la
invención pueden usarse por tanto partículas de poliestireno con
estreptavidina de alta densidad con fluorescencia roja, que son
ampliamente conocidos y pueden obtenerse comercialmente.
\vskip1.000000\baselineskip
Las propiedades físicas de estas partículas son
las siguientes:
Diámetro: 2-4 mm
Densidad: 1,1-1,8 g/cm^{3}
\vskip1.000000\baselineskip
Las propiedades de unión de estas partículas son
preferiblemente las siguientes:
La densidad de estreptavidina y el
comportamiento con respecto a la unión
biotina-anticuerpo son de manera correspondiente a
Dynabeads (véase anteriormente).
\vskip1.000000\baselineskip
Las ventajas de estas partículas son:
- tienen fluorescencia roja, por lo que se
facilita la lectura.
- el control de la calidad puede realizarse
también en citometría de flujo.
En conjunto, las partículas deberían estar
compuestas preferiblemente por poliestireno y presentan un diámetro
de 2-4 \mum. Se prefiere especialmente que estas
micropartículas porten en la superficie restos epoxilo, carboxilo
y/o amino o grupos tosilo.
Sin embargo está claro para el experto en la
técnica que las micropartículas que pueden usarse según la invención
pueden estar formadas por una gran cantidad de diferentes
materiales. El campo de la tecnología de las micropartículas es
ampliamente conocido por el experto en la técnica y hay muchas
micropartículas diferentes que pueden obtenerse comercialmente, que
pueden usarse potencialmente según la invención. El tamaño de las
micropartículas se ha descrito anteriormente.
Tras la unión del segundo anticuerpo al complejo
perla-primer anticuerpo-antígeno se
detecta este segundo anticuerpo. Para ello puede marcarse o bien
este segundo anticuerpo por ejemplo mediante fluorescencia o
enzimáticamente, o también puede utilizarse un tercer anticuerpo
marcado contra este segundo anticuerpo. Si se realiza una prueba de
aglutinación, no es necesario un marcado del anticuerpo.
Tales pruebas y procedimientos de detección los
conoce el experto en la técnica. Según la invención pueden usarse
pruebas de aglutinación en una tarjeta de gel.
Es inherente a la presente invención el hecho de
que los componentes individuales del procedimiento de detección
según la invención los conoce el experto en la técnica. Sin embargo
no se preveía de ningún modo que una combinación de estas etapas
individuales llevara a un procedimiento que ofrece sorprendentemente
de manera extremadamente favorable una solución sencilla para una
necesidad de tal modo intensa del ámbito técnico.
Especialmente pueden proporcionarse según la
invención también kits para detectar antígenos de células sanguíneas
o anticuerpos dirigidos frente a antígenos de células sanguíneas,
comprendiendo al menos perlas esféricas, que presentan un diámetro
de 2-4 \mum y una densidad de
1,1-1,8 g/cm^{3}, un anticuerpo específico frente
a un antígeno de célula sanguínea, así como una tarjeta de gel, que
contiene un anticuerpo anti-anticuerpo humano
específico.
Bajo otra forma de realización, el kit para
detectar antígenos de células sanguíneas comprende al menos perlas
esféricas, que presentan un diámetro de 2-4 \mum y
una densidad de 1,1-1,8 g/cm^{3}, un primer
anticuerpo dirigido frente al antígeno que ha de detectarse y una
tarjeta de gel, que contiene un segundo anticuerpo específico de
especie, que está dirigido frente al segundo anticuerpo dirigido
frente al antígeno que ha de detectarse. Está claro que también
otros kits, que contienen los componentes necesarios esencialmente
descritos en el procedimiento según la invención.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Los siguientes ejemplos explican en mayor
detalle la invención. No deben entenderse de ningún modo como
limitativos.
- Tampón de solubilización:
- 1,21 g de Tris
- \quad
- NaCl hasta 950 ml
- \quad
- pH 7,4
- \quad
- Adición de 5 ml de Triton X-100
- \quad
- NaCl hasta 1000 ml
Se sedimentan las células de prueba
(trombocitos) durante 1 min. en una centrífuga de mesa (fabricante:
Hettich) a 10000 U/min. Se aspira el sobrenadante y se lleva el
sedimento celular a 100 \mul de tampón de solubilización.
Ejemplo 2 de
comparación
Se biotiniló un anticuerpo
anti-GPIIa-IIIb específico (empresa
BioTest) y se añadió en disolución a perlas recubiertas con
estreptavidina. Se demostró la unión del anticuerpo a las perlas. En
este caso se ha demostrado que la presencia de zinc 1 mM estimula
la unión.
A continuación se incuban las perlas con células
sanguíneas solubilizadas y se añade un segundo anticuerpo marcado
con fluorescencia. Un planteamiento de prueba positivo se
caracteriza por una adición aumentada del anticuerpo secundario en
el complejo, lo que podía medirse de nuevo mediante la fluorescencia
mediada por el mismo del complejo de perla-primer
anticuerpo-antígeno-segundo
anticuerpo separado.
Así pudo detectarse el antígeno
GPIIa-IIIb en la sangre de manera sorprendentemente
sencilla.
Ejemplo
3
En lugar de una prueba basada en marcado con
fluorescencia se realizó una prueba de aglutinación (Gelkartentest,
empresa Diamed, Suiza).
También de esta manera pudo detectarse así el
antígeno GPIIa-IIIb en la sangre de manera
sorprendentemente sencilla.
Ejemplo 4 de
comparación
En lugar de una prueba de Elisa se detectaron
las perlas marcadas con el segundo anticuerpo por medio de
citometría de flujo.
También de esta manera pudo detectarse el
antígeno GPIIa-IIIb de manera sorprendentemente
sencilla.
Ejemplo
5
Realización de una prueba según la invención con
el uso de partículas de estreptavidina de la empresa Diamed.
20 \mul de suero (30 min. a 56ºC
inactivado)
Propiedades físicas:
Diámetro: 2-4 \mum
Densidad: 1,1-1,8 g/cm^{3}
La suspensión contiene el 0,075% de partículas
(v/v), por tanto se utilizaron estas perlas en un volumen de 50
\mul (en comparación con 10 \mul de Dynabeads).
Propiedades de unión:
La densidad y el comportamiento de
estreptavidina con respecto a la unión
biotina-anticuerpo son correspondientes a
Dynabeads.
Ventajas: Las partículas tienen fluorescencia
roja, por lo que se facilita la lectura y el control de la calidad
puede llevarse a cabo también por medio de métodos bien conocidos
por el experto de citometría de flujo.
Desventajas: se produce necesariamente el
bloqueo de las partículas tras el recubrimiento con
PBS-BSA, dado que existe una alta absortividad de
estas partículas.
Tampón
- Tampón de partículas
- Disolución de PBS 10 mM, pH 7,4, Tween 20 al 0,1%
- PBS-BSA (al 2%):
- Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco x10
- \quad
- dilución 1:10 en agua destilada
- \quad
- pH 7,2
- \quad
- Adición de albúmina de bovina al 22% (1:10)
- Tampón de solubilización:
- 1,21 g Tris
- \quad
- NaCl hasta 950 ml
- \quad
- pH 7,4
- \quad
- Adición de 5 ml de Triton X-100
- \quad
- NaCl hasta 1000 ml
\vskip1.000000\baselineskip
Anticuerpos usados:
Filtración tras biotinilización en unidades de
filtro Millipore Ultrafree-MC 30 (Millipore
Corporation, Bedford, EE.UU.), límite de filtración, membrana de 30
kDa: celulosa regenerada de baja unión
Se somete a prueba la aglutinación espontánea y
se realizan controles negativos. Cada nuevo acoplamiento o carga se
controla de manera cuantitativa en un ensayo de citometría de flujo.
A este respecto se incuban las partículas recubiertas con antígeno
con un anticuerpo marcado con fluorescencia que está dirigido de
manera específica frente al antígeno. La intensidad de
fluorescencia que puede medirse de manera sencilla mediante
citometría de flujo sobre la superficie de las partículas es
proporcional al grado de recubrimiento.
Control de calidad: Realización de sueros
control positivos y negativos
\vskip1.000000\baselineskip
La biotina es una vitamina (244 Dalton) que
actúa como co-factor de las carboxilasas. Mediante
su tamaño reducido, la biotina no influye por regla general en las
propiedades de una macromolécula tras la unión. Los grupos
reactivos para la biotina son grupos
\varepsilon-amino de lisina y tirosina
(NHS-biotina) con la formación de un enlace amina.
Dado que los anticuerpos pueden contener lisina también en la zona
de las regiones variables, la biotinilización puede conducir a una
pérdida de la detección de antígenos. Para descartar o reducir este
efecto debe encontrarse para cada anticuerpo una concentración
óptima de biotina (exceso de biotina), en la que no se perturben
zonas funcionales de la unión a anticuerpo (Ternynck and Avrameas
1990). Se ha demostrado ventajosa la aplicación de
NHS-LC-biotina para macromoléculas
tales como por ejemplo glicoproteínas. A este respecto mediante una
cadena adicional con 6 moléculas de carbono (espaciador de
hexanoato, 22 A) se inhiben posibles impedimentos estéricos de las
macromoléculas. Tras haber llevado el
sulfo-NHS-LC-biotina
a disolución se recomienda un rápido tratamiento, dado que la
biotina disuelta es muy propensa a la hidrólisis.
\vskip1.000000\baselineskip
Se disuelve la proteína en 1 ml de PBS y se
calculan los mmoles del exceso de biotina (factor
10-15): mmoles de proteína x (12 ó 20) = mmoles de
adición de reactivo de biotina: mmoles de biotina a pipetear x 556*
= mg de reactivo de biotina a añadir (* 556 es la MG de la
sulfo-NHS-LC-biotina)
Cálculo: mg de proteína/MG de proteína= mmoles de proteína.
Por ejemplo 1,3/150000= 8,7x 10^{-6} mmol de
IgG
8,7x 10^{-6} x 20= 1,73x 10^{-4} mmol de
reactivo de biotina
1,73x 10^{-4} x 556= 0,096373 mg de biotina
(0,1 mg)
- 1.
- Antes de abrir dejar que la sulfo-NHS-LC-biotina alcance temperatura ambiente.
- 2.
- Disolver 1 mg de sulfo-NHS-LC-biotina en 1000 \mul de dH_{2}O (1 \mug = 1 \mul).
- 3.
- Incubación durante 30 min. a temperatura ambiente (de manera alternativa 2 horas de incubación en hielo).
- 4.
- Eliminar la biotina no conjugada mediante centrifugación con filtro Millipore MC 30 en PBS.
- 5.
- El ajuste del centrifugado varía dependiendo de la proteína, por regla general son suficientes 10-15 minutos a 10000 U/min., de manera alternativa 30 min. a 3500 U/min.
- 6.
- Conservar el anticuerpo biotinilado a 4ºC en 0,01% de azida de sodio.
\vskip1.000000\baselineskip
La detección del grado de biotinilización tiene
lugar de manera fotométrica con ayuda del reactivo HABA (ácido
2-hidroxiazobenceno-4-carboxílico).
Para esto se mide solamente en primer lugar la absorción a 500 nm
del reactivo HABA (360 \mul) y se anota, para añadir entonces la
muestra biotinilada (40 \mul). 5 minutos tras la adición se
detecta de nuevo la absorción a 500 nm. Dependiendo del contenido en
biotina de la muestra tiene lugar un cambio de color en la molécula
de HABA mediante una unión competitiva, es decir cuanto mayor es
\DeltaA mayor es el grado de biotinilización de la muestra.
1. A500 = (0,9) x (A500 de reactivo HABA) -
(A500 de la proteína biotinilada)
2. mmol/ml de la proteína biotinilada = mg de
proteína biotinilada/ml de la muestra
3. \mumoles de biotina/ml de mezcla de
reacción = A500
De manera alternativa para la prueba con
reactivo de HABA puede producirse una curva de calibración de la
biotinilización para cada proteína utilizada. Según esta curva puede
calcularse la cantidad óptima de biotina, que es distinta para cada
proteína, exclusivamente por proteína y carga.
En la figura 2 se muestra una curva de
calibración de este tipo.
Sueros: En primer lugar descongelar los sueros
control desde -20ºC con cuidado a 4ºC, separar por centrifugación
(2 min. a 13.000 U/min.; centrífuga Eppendorf)
\vskip1.000000\baselineskip
Separar por centrifugación 2 x 10^{7} células
de prueba (tipificadas) durante 1 min. a 10000 U/min. en el tubo
Eppendorf, aspirar el sobrenadante, resuspender el sedimento celular
en 30 \mul PBS-BSA al 2%
se añaden a cada mezcla básica 10 \mul de
anticuerpo monoclonal biotinilado específico de glicoproteína, para
cada anticuerpo utilizado debe detectarse previamente mediante
valoración tras la biotinilización una dilución óptima (véase
Ausschluss der Spontan-Agglutination) CD 41 1:60, CD
42a y CD49b 1:10, anticuerpos HLA 1:200 !Las variaciones dependen
de la carga!
incubar 30 minutos a 37ºC
lavar los trombocitos de prueba 3 veces con 100
\mul de PBS (centrifugar durante 1 min. a 10000 U/min., aspirar
el sobrenadante y llevar el sedimento de trombocitos a 100 \mul de
PBS.
Tras el último paso de lavado se lisan los
sedimentos en cada caso en 100 \mul de tampón de solubilización,
se mezclan individualmente con la pipeta
incubar durante 30 min. a 4ºC
aislamiento de antígenos en partículas de
polímero con estreptavidina
separar por centrifugación los lisados durante
30 min. a 13000 U/min. (4ºC, se eliminan los restos de membrana
celular)
durante la centrifugación de los lisados lavar
las partículas de estreptavidina DiaMed 1 vez con tampón de
partículas durante 1 min. a 10000 U/min
añadir 10 \mul de partículas (concentración
del 0,5%) a 70 \mul del lisado de trombocitos
incubación durante 30 min. a 37ºC
lavar las partículas 1 x con 100 \mul de
tampón de partículas, 1 min. 10000 U/min
aspirar el sobrenadante
las partículas están recubiertas con antígeno y
tras la resuspensión en tampón de partículas pueden llevarse a una
concentración del 0,075% en el sistema de prueba.
\vskip1.000000\baselineskip
Añadir 20 \mul de suero al sedimento de
partículas, resuspender bien el sedimento
incubación durante 30 min. a 37ºC
pipetear 100 \mul de tampón de partículas a
las partículas
lavar 2 veces con en cada caso 100 \mul de
tampón de partículas
llevar a 50 \mul de tampón de partículas,
mezclar con cuidado el sedimento
pipetear la suspensión de partículas
directamente sobre la tarjeta de cabra anti-humana
(Diamed; explicado en Y. Lapierre et al., (1990),
Transfusion 30(2):109-113)
centrifugar la tarjeta sin incubación adicional
en tarjetas DiaMed a 900 U/min. y durante 10 min.
Valoración del hallazgo, véase la figura 1.
Se reconoce claramente la alta sensibilidad de
la prueba.
Hasta el momento se sometieron a prueba 34
sueros de distinta reactividad. La comparación con el MAIPA muestra
una sensibilidad y especificidad comparables.
En el caso de N=8 sueros pudo detectarse de
manera paralela la especificidad anti-Pla 1
en el caso de N=2 sueros no pudo detectarse
anti-Pla 2 a pesar del hallazgo previo ni en MAIPA
ni en la prueba de tarjetas
en el caso de N=4 sueros pudieron detectarse
anticuerpos de la especificidad anti Bra
en el caso de N=4 sueros pudieron detectarse
autoanticuerpos de distinta especificidad
N=8 sueros se mostraron negativos en MAIPA y
prueba de tarjetas
N=8 sueros podían reaccionar de manera no
específica en ambas pruebas
en el caso de una duración de prueba de
30-45 minutos (con la utilización de partículas
recubiertas previamente), el gasto de tiempo y de trabajo es
mínimo.
\vskip1.000000\baselineskip
Valoración (véase la figura 1)
Positivo: Las perlas aglutinadas forman una
línea roja sobre el gel o se distribuyen en el gel (++++ a +)
Negativo: Sedimento de partículas compacto en el
fondo de la cavidad de la tarjeta ID.
Claims (11)
1. Procedimiento in vitro para detectar
anticuerpos dirigidos frente a antígenos de células sanguíneas o
antígenos de células sanguíneas en muestras de seres humanos,
caracterizado porque a partir de la muestra se extraen los
anticuerpos nativos dirigidos frente a antígenos de células
sanguíneas o los antígenos nativos de células sanguíneas usando
anticuerpos monoclonales con perlas, que presentan un diámetro de
2-4 \mum y una densidad de
1,1-1,8 g/cm^{3}, y se conduce la detección de los
anticuerpos dirigidos frente a antígenos de células sanguíneas o de
los antígenos de células sanguíneas unidos a las perlas mediante
aglutinación en una tarjeta de gel, que contiene un anticuerpo
específico de especie adecuado para la detección que está dirigido
frente a la especie de la que procede el anticuerpo frente al
antígeno de células sanguíneas que va detectarse o el anticuerpo
usado para detectar el antígeno de células sanguíneas.
2. Procedimiento in vitro para detectar
anticuerpos dirigidos frente a antígenos de células sanguíneas en
muestras de seres humanos según la reivindicación 1,
caracterizado porque
- (i)
- se recubren las perlas con anticuerpos no humanos, dirigidos frente al antígeno de células sanguíneas específico,
- (ii)
- se mezclan antígenos de células sanguíneas seleccionados, específicos, correspondientes, que dado el caso pueden obtenerse mediante solubilización de células sanguíneas habituales en sí ya conocidas del estado de la técnica o también mediante métodos recombinantes o de química de proteínas, con las perlas recubiertas obtenidas de (i),
- (iii)
- se mezclan los complejos producidos a partir de las perlas recubiertas con anticuerpos no humanos y los antígenos de células sanguíneas seleccionados con una muestra de suero de un paciente que va a someterse a estudio, y
- (iv)
- se detectan los anticuerpos de células sanguíneas dado el caso unidos a los complejos del paciente mediante aglutinación en la tarjeta de gel.
3. Procedimiento in vitro para detectar
anticuerpos frente a antígenos de células sanguíneas según la
reivindicación 1, caracterizado porque
- (i)
- se recubren las perlas con anticuerpos específicos de especie, no anti-humanos,
- (ii)
- se solubilizan células habituales o se llevan a disolución antígenos de células sanguíneas obtenidos mediante técnica genética o química de proteínas,
- (iii)
- el solubilizado obtenido de (ii) o la disolución de antígenos de células sanguíneas obtenidos mediante técnica genética o química de proteínas se incuba con anticuerpos específicos que proceden de la especie definida en (i) y dirigidos frente al antígeno,
- (iv)
- se aíslan los complejos formados en (iii) con las perlas de (i) mediante centrifugación,
- (v)
- se incuba directamente o después con suero que contiene anticuerpos que proceden del paciente, y
- (vi)
- se detectan los anticuerpos unidos a los complejos mediante aglutinación en la tarjeta de gel.
4. Procedimiento in vitro para detectar
antígenos de células sanguíneas según la reivindicación 1,
caracterizado porque
- (i)
- se recubren las perlas con anticuerpos dirigidos frente a los antígenos de células sanguíneas específicos que van a detectarse,
- (ii)
- se someten a tratamiento las muestras de sangre de un paciente que va a someterse a estudio con las células sanguíneas contenidas en las mismas, mediante el cual se solubilizan los antígenos contenidos en la membrana de las células sanguíneas, y dado el caso se produce una fracción enriquecida en antígenos,
- (iii)
- se mezclan las perlas recubiertas obtenidas de (i) con la muestra obtenida de (ii),
- (iv)
- se incuban el complejo de las perlas, los anticuerpos dirigidos frente a los antígenos de células sanguíneas específicos que van a detectarse y los antígenos de células sanguíneas con anticuerpos, que son específicos para el antígeno de células sanguíneas, y
- (v)
- se detectan los anticuerpos unidos a los complejos mediante aglutinación en la tarjeta de gel.
\newpage
5. Procedimiento in vitro para detectar
antígenos de células sanguíneas según la reivindicación 1,
caracterizado porque
- (i)
- se recubren las perlas con anticuerpos específicos de especie, no anti-humanos,
- (ii)
- se solubilizan células sanguíneas del paciente que va a someterse a estudio,
- (iii)
- se incuba el solubilizado obtenido de (ii) con anticuerpos específicos que proceden de la especie definida en (i) y dirigidos frente al antígeno que va detectarse,
- (iv)
- se aíslan los complejos formados en (iii) con las perlas de (i) mediante centrifugación,
- (v)
- se incuban los complejos con anticuerpos, que están dirigidos frente al antígeno, y
- (vi)
- se detectan los anticuerpos unidos a los complejos mediante aglutinación en la tarjeta de gel.
6. Procedimiento in vitro para detectar
anticuerpos frente a antígenos de células sanguíneas en una muestra
de suero de un paciente según la reivindicación 1,
caracterizado porque
- (i)
- se ponen en contacto anticuerpos biotinilados, no humanos dirigidos frente al antígeno con células de prueba humanas, que portan los correspondientes antígenos nativos de células sanguíneas,
- (ii)
- se somete el complejo formado de (i) a condiciones en las que se solubilizan las células sanguíneas,
- (iii)
- se separa de la muestra el complejo de antígeno y anticuerpo biotinilado con ayuda de las perlas recubiertas con estreptavidina o avidina,
- (iv)
- se pone en contacto el complejo formado en (iii) con una muestra de suero de un paciente que va a someterse a estudio, y
- (v)
- se detectan, en caso de existencia de anticuerpos específicos en la muestra de suero, complejos formados de anticuerpo biotinilado, antígeno y anticuerpo humano del suero tras la separación del complejo de la muestra mediante aglutinación en la tarjeta de gel.
7. Procedimiento in vitro para detectar
antígenos de células sanguíneas seleccionados según la
reivindicación 1, caracterizado porque
- (i)
- se ponen en contacto anticuerpos biotinilados dirigidos frente al antígeno que va a detectarse con células humanas que proceden de la muestra que va a someterse a estudio, que dado el caso portan los antígenos correspondientes nativos de células sanguíneas,
- (ii)
- se somete el complejo formado de (i) a condiciones en las que se solubilizan las células sanguíneas,
- (iii)
- se separa de la muestra el complejo de antígeno y anticuerpo biotinilado con ayuda de las perlas recubiertas con estreptavidina o avidina,
- (iv)
- se pone en contacto el complejo formado en (iii) con un segundo anticuerpo preferiblemente marcado, dirigido frente al antígeno, y
- (v)
- se detectan los complejos formados de anticuerpo biotinilado, antígeno y segundo anticuerpo tras la separación del complejo de la muestra mediante aglutinación en la tarjeta de gel.
8. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores, en el que se usan anticuerpos
enzimáticamente marcados o marcados con fluorescencia.
9. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores, en el que los anticuerpos biotinilados
se unen por medio de perlas recubiertas de estreptavidina y/o
avidina.
10. Kit para detectar anticuerpos dirigidos
frente a antígenos de células sanguíneas, que comprende al menos
perlas, que presentan un diámetro de 2-4 \mum y
una densidad de 1,1-1,8 g/cm^{3}, un anticuerpo
específico frente a un antígeno de células sanguíneas, así como una
tarjeta de gel que contiene un anticuerpo
anti-anticuerpo humano específico.
11. Kit para detectar antígenos de células
sanguíneas, que comprende al menos perlas, que presentan un diámetro
de 2-4 \mum y una densidad de
1,1-1,8 g/cm^{3}, un primer anticuerpo dirigido
frente al antígeno que va a detectarse, un segundo anticuerpo
dirigido frente al antígeno que va a detectarse y una tarjeta de gel
que contiene un segundo anticuerpo específico de especie que está
dirigido frente al segundo anticuerpo dirigido frente al antígeno
que va a detectarse.
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| DE10122806 | 2001-05-10 | ||
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