ES2309224T3 - Polipeptidos recombinantes. - Google Patents

Abstract

Un polipéptido de fusión que comprende un primer polipéptido formado por aminoácidos de X a Y del polipéptido descrito en SEQ. ID. N.º: 10, donde X está seleccionado entre las posiciones 110 y 173 de SEQ. ID. N.º: 10, e Y está seleccionado entre las posiciones 179 y 270 de SEQ. ID. N.º: 10, fusionado con un segundo polipéptido heterólogo y cuyo polipéptido de fusión es capaz de formar un trímero.

Description

Polipéptidos recombinantes.

La presente solicitud reclama el beneficio de la Solicitud Provisional estadounidense n.º 60/343.315, presentada el 21 de diciembre de 2001.

Introducción

La presente invención está dirigida, en parte, a las composiciones relacionadas con dominios de polipéptidos con inmunogenicidad reducida que son capaces de inducir trímeros en polipéptidos heterólogos, polipéptidos de fusión que comprenden dichos dominios de inducción de trímeros, ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de la invención, y métodos que los elaboren y utilicen.

Antecedentes

La estructura de un polipéptido es un factor muy importante para su actividad. A menudo, un polipéptido adecuadamente plegado necesita asociarse consigo mismo o con distintos polipéptidos para poder ser activo. Más a menudo aún, estas interacciones se dan como homodímeros y cuentan con un complejo activo, aunque en ocasiones también se dan los heterodímeros. Los motivos de trimerización definidos suelen ser dominios coiled coil (Burkhar et al., 2001, Trends in Cell Biol., 11:82), e incluyen dominios de trimerización SPD (Patentes estadounidenses N.º 5.716.805 y 6.190.886).

Aunque falta un motivo coiled coil distintivo, las moléculas adicionales que se sabe que necesitan una trimerización para su actividad óptima incluyen a la superfamilia del factor de la necrosis tumoral, como TNF-alfa, linfotoxina-alfa y CD40L (TNFSF5), entre otras. Sin la trimerización, muchos polipéptidos de la superfamilia de los TNF tendrán una actividad baja o ausente (Fanslow et al., (1994) Seminars Immunology, 6:267-278). CD40 es un polipéptido de transmembrana miembro de una superfamilia de receptores del factor de la necrosis tumoral, y participa en la estimulación de proliferación y diferenciación de las células humorales y de inmunidad celular. En especial, CD40 participa en el cambio de isotipo y es importante para la activación de las células T y para la producción de las citoquinas tipo 1 como respuesta ante antígenos proteicos (Noelle, R, (1996) Immunity, 4:415; y Borrow et al., (1996) J. Exp. Med., 183:2129).

Se ha demostrado que CD40L (TNFSF5) suele estar activo en una forma unida a membrana, sin embargo, esta forma es difícil de administrar como fármaco. Se ha descubierto que la versión soluble de CD40L (TNFSF5) tiene una actividad de estimulación bastante baja, pero, al trimerizar CD40L (TNFSF5) soluble mediante un dominio mutado de cremallera de leucina GCN4, se consigue una activación significativa de las células diana (Fanslow et al., (1994) Seminars Immunology, 6:267-278; Morris et al., (1999) J. Biol. Chem., 274:418-423; Patente estadounidense n.º 5.716.805).

Una limitación significativa del uso del dominio de trimerización de cremallera de leucina mutante en un polipéptido de fusión terapéutico es que las cremalleras de leucina suelen ser proteínas nucleares, es decir, intracelulares. Por ello, aunque el polipéptido pueda ser de la misma especie que el de un sujeto tratado con el polipéptido, si no lo ha visto el sistema inmunitario, esto puede provocar que el polipéptido sea reconocido como un agente extraño cuando se exprese de forma extracelular, y que esto ocasione una respuesta inmune en el sujeto. Esta respuesta es especialmente perjudicial para la administración continuada o a largo plazo de un polipéptido de fusión a un paciente. La presente invención tiene como objeto este tema, al facilitar dominios de polipéptidos que tendrán una inmunogenicidad reducida, además de propiedades de trimerización.

Resumen de la invención

La presente invención hace referencia, en parte, a un polipéptido capaz de inducir la trimerización cuando se fusiona con un polipéptido heterólogo, con polipéptidos de fusión que comprenden el dominio de trimerización, ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de la invención y métodos que los elaboren y utilicen. Más especialmente, la presente invención está dirigida a un polipéptido de fusión que comprende un primer polipéptido capaz de formar un trímero fusionado con un segundo polipéptido heterólogo que tenga una actividad biológica deseada. También se contempla que la fusión de un primer polipéptido capaz de formar un trímero y un segundo polipéptido heterólogo con el primer polipéptido tiene como resultado un aumento de la actividad biológica del segundo polipéptido cuando se compara con la actividad de un monómero del segundo polipéptido.

En un aspecto, la invención abarca un polipéptido de fusión que consta de un primer polipéptido formado por aminoácidos de X a Y del polipéptido descrito en SEQ. ID. N.º: 10 donde X es 110 a 154, e Y es 201 a 270, fusionado con un segundo polipéptido heterólogo, y donde el polipéptido de fusión es capaz de formar un trímero.

En otro aspecto, la invención abarca un polipéptido de fusión que comprende un primer polipéptido formado por aminoácidos de X a Y del polipéptido descrito en SEQ. ID. N.º: 10, donde X es 110 a 173, e Y es 179 a 270, fusionado con un segundo polipéptido heterólogo, y donde el polipéptido de fusión es capaz de formar un trímero.

Por otro lado, la invención abarca un polipéptido de fusión que comprende un primer polipéptido formado por aminoácidos de X a Y del polipéptido descrito en SEQ. ID. N.º: 10, donde X es 110 a 154, e Y es 201 a 270, con al menos una sustitución de un aminoácido, donde el primer polipéptido es al menos en un 80% idéntico al polipéptido descrito en SEQ. ID. N.º: 10, y donde dicho primer polipéptido está fusionado con un segundo polipéptido heterólogo cuya capacidad para trimerizarse está retenida.

En otro aspecto, la invención abarca un dominio de polipéptido que comprende un primer polipéptido formado por aminoácidos de X a Y del polipéptido descrito en SEQ. ID. N.º: 10, donde X es 110 a 173, e Y es 179 a 270, con al menos una sustitución de un aminoácido, donde el primer polipéptido es al menos en un 80% idéntico al polipéptido descrito en SEQ. ID. N.º: 10, cuya capacidad para trimerizarse está retenida y donde dicho primer polipéptido está fusionado con un segundo polipéptido heterólogo.

En todavía otro aspecto, la invención hace referencia a un polipéptido de fusión que comprende aminoácidos 154 a 203 del polipéptido descrito en SEQ. ID. N.º: 10, o, de modo alternativo, la invención hace referencia a un polipéptido de fusión que comprende aminoácidos 120 a 180 del polipéptido descrito en SEQ. ID. N.º: 10.

La invención también contempla que el polipéptido capaz de formar trímeros, como se ha descrito anteriormente y mediante la especificación actual, tiene al menos tres repeticiones heptavalentes. No obstante, se entiende que el polipéptido de trimerización puede tener cuatro repeticiones heptavalentes, cinco repeticiones heptavalentes, seis repeticiones heptavalentes, siete repeticiones heptavalentes o más, según sea la voluntad del experto en la materia.

Todavía en otro aspecto, la invención abarca ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de la invención. Los métodos de creación de vectores recombinantes que comprenden los ácidos nucleicos de la invención también entran dentro del alcance de la invención. Por otro lado, los polipéptidos codificados por las moléculas de ácido nucleico de la invención son no inmunogénicos en los sujetos a los que se les administra.

Además, se observa que los ácidos nucleicos de la invención pueden ser transfectados a células hospedadoras para producir polipéptidos recombinantes. En otro aspecto, la invención abarca un método para producir un polipéptido codificado por el ácido nucleico de la invención, que comprende las fases de crecimiento de una célula hospedadora transfectada con ácidos nucleicos de la invención en condiciones favorables para la expresión del polipéptido, y que, opcionalmente, aísla dicho polipéptido.

Todavía en otro aspecto, la invención abarca un método de construcción de un vector de expresión recombinante que consta de las fases de unión de un primer ácido nucleico que comprende nucleótidos de X a Y del ácido nucleico descrito en SEQ. ID. N.º: 9, donde X es nucleótidos de 331 a 460, e Y es nucleótidos de 601 a 808, y un segundo ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo con el primer ácido nucleico en un sitio de clonación compatible de un vector de expresión, seguido por la amplificación y aislamiento de dicho vector de expresión recombinante.

Todavía en otro aspecto, la invención abarca un método de construcción de un vector de expresión recombinante que comprende las fases de unión de un primer ácido nucleico que comprende nucleótidos de X a Y del ácido nucleico descrito en SEQ. ID. N.º: 9, donde X es nucleótidos de 331 a 508, e Y es nucleótidos de 546 a 808, y un segundo ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo con el primer ácido nucleico en un sitio de clonación compatible de un vector de expresión, seguido por la amplificación y aislamiento de dicho vector de expresión recombinante.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Ácidos nucleicos de los oligonucleótidos utilizados para la construcción de un polinucleótido que codifica un polipéptido de fusión (la secuencia 34 es SEQ. ID. N.º: 1, la secuencia 33 es SEQ. ID. N.º: 2, la secuencia 32 es SEQ. ID. N.º: 3, y la secuencia 35 es SEQ. ID. N.º: 4) de un receptor scavenger macrófago CD40L (TNFSF5). La secuencia inferior (SEQ. ID. N.º: II)

\hbox{describe las
secuencias de una construcción formada  uniendo las secuencias
32-35.}

Figuras 2A-B. La Figura 2A describe la secuencia del ácido nucleico (SEQ. ID. N.º: 5) que codifica el péptido de secreción IL2 fusionado con el dominio de trimerización del receptor scavenger, que está fusionado con un dominio de unión al receptor de CD40L (TNFSF5). El polipéptido de fusión codificado por el ácido nucleico se describe en SEQ. ID. N.º: 6. La Figura 2B describe la secuencia del ácido nucleico (SEQ. ID. N.º: 7) que codifica el péptido de secreción de la hormona del crecimiento humano fusionado con el dominio de trimerización del receptor scavenger, que está fusionado con un dominio de unión al receptor de CD40L (TNFSF5). El polipéptido de fusión codificado por el ácido nucleico se describe en (SEQ 10 N.º: 8).

La Figura 3 describe una técnica Western Blot que demuestra la expresión del polipéptido de fusión CD40L (TNFSF5). Las flechas indican la situación del polipéptido de fusión en el gel.

Los pocillos 1 y 2 son de control por el uso del polipéptido de trimerización CD40L (TNFSF5) de la isoleucina, y los pocillos 3-6 son dominios de trimerización del receptor scavenger fusionados con el dominio de unión al receptor de CD40L (TNFSF5).

Figura 4. La región codificante del ácido nucleico (SEQ. ID. N.º: 9) que codifica el receptor scavenger macrófago humano A se describe incluyendo el polipéptido codificado (SEQ. ID. N.º: 10).

Descripción detallada de la invención

La presente invención hace referencia, en parte, a un dominio de polipéptido capaz de inducir trímeros en polipéptidos heterólogos, polipéptidos de fusión que comprenden el dominio de inducción de trímeros, ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos, y métodos de elaboración y uso de los polipéptidos.

En una realización, la invención se refiere a una porción del dominio extracelular del polipéptido del receptor scavenger macrófago (SR-A) correspondiente a una región coiled coil, es decir, el dominio de trimerización. La región coiled coil del SR-A tiene propiedades de trimerización (Frank et al., 2000, J. Biol. Chem., 275:11672-11677). Así, este dominio es útil en la presente invención para facilitar un dominio de trimerización con inmunogenicidad reducida o inexistente, fusionada con un polipéptido heterólogo.

Por ello, en una realización, la invención se refiere a un polipéptido de fusión que comprende un primer polipéptido formado por aminoácidos de X a Y del polipéptido descrito en SEQ. ID. N.º: 10, donde X es 110 a 154, e Y es 201 a 270 fusionado con un segundo polipéptido heterólogo. En otra realización, la invención se refiere a un polipéptido de fusión que comprende un fragmento del polipéptido SR-A que comprende aminoácidos de X a Y del polipéptido descrito en SEQ. ID. N.º: 10, donde X es 110 a 173, e Y es 179 a 270 fusionado con un segundo polipéptido
heterólogo.

En una realización particular, la invención se refiere a un polipéptido de fusión que comprende aminoácidos 154 a 203 del polipéptido descrito en SEQ. ID. N.º: 10 fusionado con un segundo polipéptido heterólogo. En otra realización particular, la invención se refiere a un polipéptido de fusión que comprende aminoácidos 120 a 180 del polipéptido descrito en SEQ. ID. N.º: 10 fusionado con un segundo polipéptido heterólogo.

En otra realización, la invención se refiere a un polipéptido de fusión que comprende un primer polipéptido formado por aminoácidos de X a Y del polipéptido descrito en SEQ. ID. N.º: 10, donde X es 110 a 154, e Y es 201 a 270, con al menos una sustitución de un aminoácido, donde el primer polipéptido es al menos en un 80% idéntico al polipéptido descrito en SEQ. ID. N.º: 10, cuya capacidad para trimerizarse está retenida, y donde dicho primer polipéptido está fusionado con un segundo polipéptido heterólogo. Y todavía en otra realización, la invención se refiere a un polipéptido de fusión que comprende un primer polipéptido formado por aminoácidos de X a Y del polipéptido descrito en SEQ. ID. N.º: 10, donde X es 110 a 173, e Y es 179 a 270, con al menos una sustitución de un aminoácido, donde el primer polipéptido es al menos en un 80% idéntico al polipéptido descrito en SEQ. ID. N.º: 10, cuya capacidad para trimerizarse está retenida, y donde dicho primer polipéptido está fusionado con un segundo polipéptido
heterólogo.

En otra realización, la invención se refiere a un polipéptido de fusión que comprende un primer polipéptido formado por aminoácidos 154 a 203 del polipéptido descrito en SEQ. ID. N.º: 10, con al menos una sustitución de un aminoácido, donde el primer polipéptido es al menos en un 80% idéntico al polipéptido descrito en SEQ. ID. N.º: 10, cuya capacidad para trimerizarse está retenida, y donde dicho primer polipéptido está fusionado con un segundo polipéptido heterólogo. Todavía en otra realización, la invención se refiere a un polipéptido de fusión que comprende un primer polipéptido formado por aminoácidos 154 a 203 del polipéptido descrito en SEQ. ID. N.º: 10, donde dicho primer polipéptido está fusionado con un segundo polipéptido heterólogo.

En las realizaciones anteriores, el segundo polipéptido heterólogo tiene preferiblemente una actividad biológica deseada. Dicha actividad biológica, como lo entenderá cualquier experto en la materia, puede definirse como la unión de un ligando a un receptor, unión de un receptor a un ligando, afinidad de unión de un polipéptido de tipo inmunoglobulina a su antígeno cognado, o similar. Además, la actividad biológica puede ser una actividad enzimática.

En una realización, el polipéptido de fusión de la invención tiene inmunogenicidad reducida, y, en el modelo preferente, el polipéptido de fusión es no inmunogénico.

En un aspecto, varias especies de receptores scavenger macrófagos pueden servir como motivos de trimerización para un polipéptido de fusión, en particular, se contempla que los polipéptidos de receptores scavenger bovinos, (número de acceso de Genbank X54183), de múridos (número de acceso de Genbank L04275), humanos (número de acceso de Genbank XM_005021) y/o de simios pueden utilizarse según los estudios de la presente invención. Debe entenderse que esta no es una lista exhaustiva, y que hay receptores scavenger macrófagos de otras especies que entran dentro del alcance de la invención.

Una secuencia consenso de un polipéptido coiled coil, en lo que se refiere a la invención, sigue el patrón básico establecido en Burkhard et al., (2001, Trends Cell Biol., 11:82). Las posiciones de los aminoácidos en las repeticiones heptavalentes se suelen designar alfabéticamente como "a.b.c.d.e.f.g." Las posiciones "a" y "d" son restos apolares y hay una preferencia muy marcada por los aminoácidos que se encuentran en dichas posiciones. Un experto en la materia entenderá que un resto apolar puede ser alanina, isoleucina, glicina, prolina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, valina y tirosina. Los restos particulares en cada una de esas posiciones pueden determinar la naturaleza de la estructura secundaria y terciaria del coiled coil, es decir, diméricos frente a triméricos. De hecho, se ha llevado a cabo la mutación específica para rediseñar las cremalleras de leucina diméricas dentro de cremalleras de isoleucina triméricas por mutación de los restos en las posiciones a y d (patente estadounidense n.º 5.716.805).

Se puede hacer una lista de programas informáticos que pueden ayudar a la identificación de los polipéptidos coiled coil útiles para la presente invención. Por ejemplo, FOLDER se ha utilizado para identificar dominios especiales basados en identidad de secuencias (Srinivasan et al., (1993) Prot. Sci., 2:277-289), y puede usarse para identificar o modificar un dominio coiled como el utilizado en este documento. Los aminoácidos de CD40L (TNFSF5) se analizaron utilizando el programa Folder para estudiar y predecir la propensión a la trimerización de varias repeticiones heptavalentes diferentes dentro de los dominios coiled coil de CD40L (TNFSF5). Además, el programa multicoil (Harbury et al., (1993) Science, 262:1401) puede utilizarse para confirmar que una secuencia, por ejemplo una secuencia de receptor scavenger como los polipéptidos humanos, múridos y bovinos, son coiled coils. Este programa es de una utilidad especial cuando una secuencia nativa muta para alterar las propiedades de un polipéptido, como, por ejemplo, para aumentar la trimerización y/o disminuir la inmunogenicidad. Por ello, un programa informático puede analizar un polipéptido de trimerización mutante para determinar si mantiene las características necesarias.

En una realización, un polipéptido de trimerización de la invención tiene una identidad de secuencia de al menos un 80% (de al menos 85%, de al menos 90%, de al menos 95%, de al menos 97,5%, o de al menos 99% y/o de al menos 99,5%) con un polipéptido de trimerización creado de forma natural, por ejemplo, el polipéptido descrito en SEQ ID NO: 10; dicha identidad de secuencia se determina mediante la comparación de los aminoácidos de los polipéptidos cuando se alinean de manera que maximizan la superposición y la identidad mientras que se minimizan los huecos o gaps de las secuencias. La identidad porcentual de dos aminoácidos o dos ácidos nucleicos puede determinarse por inspección visual y cálculos matemáticos o, mas preferiblemente, la comparación se efectúa comparando la información de secuencia a través de un programa informático. Un programa informático a modo de ejemplo y preferente es GAP, paquete Wisconsin de Genetics Computer Group (GCG, Madison, Wisconsin), versión 10.0 (Deveraux et al., (1984), Nucl. Acids Res. 12: 387). Los parámetros preferentes por defecto del programa GAP incluyen: (1) La implementación de GCG de una matriz de comparación unaria (que contiene un valor de 1 para las identidades y de 0 para las no identidades) para nucleótidos, y la matriz ponderada de comparación de aminoácidos de Gribskov and Burguess, Nucl. Acids Res. 14:6745, (1986), tal y como lo describe Schwartz and Dayhoff, eds., (1979) Atlas of Polypeptide Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358, u otras matrices de comparación; (2) una penalización de 30 por cada hueco, y una penalización adicional de 1 para cada símbolo de cada hueco para secuencias de aminoácidos, o una penalización de 50 para cada hueco y una penalización adicional de 3 por cada símbolo de cada hueco para secuencias de nucleótidos; (3) ninguna penalización para huecos finales; y (4) ninguna penalización máxima para huecos largos.

En una realización, un polipéptido de trimerización de la invención comprende una secuencia que tiene una identidad de al menos el 80% con aminoácidos de X a Y del polipéptido descrito en SEQ. ID. N.º: 10, donde X es 110 a 154, e Y es 201 a 270. En otra realización, el polipéptido de trimerización de la invención comprende una secuencia que tiene una identidad de al menos el 80% con los aminoácidos de X a Y del polipéptido descrito en SEQ. ID. N.º: 10, donde X es 110 a 173, e Y es 179 a 270.

También pueden utilizarse otros programas de comparación de secuencias utilizados por los expertos en la materia, como, por ejemplo, el programa BLASTN, versión 2.0.9 que se puede utilizar a través del sitio web de The National Library of Medicine (biblioteca nacional de medicina) www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/wblast2.cgi, o el algoritmo del UW-BLAST 2.0. Los ajustes de los parámetros estándar por defecto del UW-BLAST 2.0 se describen en la siguiente dirección de Internet: sapiens.wustl.edu/blast/blast/#Features. Además, el algoritmo de BLAST utiliza la matriz de sustitución para aminoácidos BLOSUM62, y pueden utilizarse parámetros adicionales, como: (A) inclusión de un filtro para segmentos de máscara de la secuencia de consulta que tiene una complejidad de composición baja (tal y como determina el programa SEG de Wootton and Federen (Computers and Chemistry, 1993); ver también Wootton and Federhen, 1996, Analysis of compositionally biased regions in sequence databases, Methods Enzymol. 266: 554-71) o segmentos que consisten en repeticiones internas de corta periodicidad (tal y como determina el programa XNU de Claverie and States (Computers and Chemistry, 1993)), y (B) un umbral de significación estadística para el informe de coincidencias con las secuencias de la base de datos, o E-score (la probabilidad esperada de coincidencias encontrada sobre todo por azar, de conformidad al modelo estadístico de Karlin and Altschul (1990); si la significancia estadística adscrita a una coincidencia es mayor que su umbral E-score, no se informará de la coincidencia); los valores preferidos del umbral E-score son 0,5 o, para aumentar la preferencia, 0,25, 0,1, 0,05, 0,01, 0,001, 0,0001, 1e-5, 1e-10, 1e-15, 1e-20, 1e-25, 1e-30, 1e-40, 1e-50, 1e-75, o 1e-100.

Un dominio de trimerización puede fusionarse con un polipéptido heterólogo en el amino-terminal, carboxi-terminal y/o ambos. Asimismo, el dominio de trimerización puede ser interno al polipéptido heterólogo. Independientemente de la situación de la fusión del dominio de trimerización y el polipéptido heterólogo, hay que entender que el dominio de trimerización mantiene su capacidad de inducir trímeros (homotrímeros y/o heterotrímeros), y que el polipéptido heterólogo también mantiene su actividad biológica.

Tal y como se utiliza en este documento, el término "polipéptido de fusión" se refiere a un polipéptido contiguo expresado a partir de una molécula única de ácido nucleico, donde el ácido nucleico codifica en el mismo marco de lectura dos o más polipéptidos heterólogos, o dominios de un polipéptido colocados de forma diferente a como se habrían colocado de forma natural. Además de los polipéptidos de la invención, otros ejemplos de polipéptidos de fusión incluyen un dominio Fc de un anticuerpo o un dominio de cremallera de leucina fusionado con un dominio extracelular soluble de un polipéptido de transmembrana, es decir, DC40L (TNFSF5). WO 93/08207 y WO 96/40918 describen la preparación de formas solubles oligoméricas de CD40L (TNFSF5), donde se incluye un polipéptido de fusión de inmunoglobulina y un polipéptido de fusión de cremallera de leucina mutada, respectivamente; los métodos de producción y ensayo de los productos allí tratados también son aplicables a las composiciones de la presente invención. La fusión de un dominio de trimerización con un polipéptido heterólogo puede darse a través de un agente de unión, como una etiqueta de epítopo, o de un agente de enlace que ayude en la formación estructural.

Hay que entender que todo fragmento de polipéptido que tenga una actividad biológica deseada puede expresarse como una fusión de polipéptidos de multimerización de la invención. Los ejemplos incluyen, sin que sirva de limitación, los polipéptidos de transmembrana y los polipéptidos no de transmembrana, como enzimas, hormonas y citoquinas. En especial, se contempla a los polipéptidos de fusión de GM-CSF, IL3, GM-CSF e IL3, M-CSF, y a los miembros de la familia del receptor de la hematopoyetina (Cosman, et al., (1990) Trends Biochem. Sci., 15:265). También se contemplan los homo y hetero oligómeros.

En una lista que figura más abajo se incluyen ejemplos adicionales de polipéptidos heterólogos que pueden trimerizarse, pero no se limitan a la superfamilia del factor de la necrosis tumoral. Cada par aparece en la lista primero por el ligando, seguido del receptor correspondiente cuando un ligando tiene más de un receptor. La nomenclatura para los símbolos de los miembros de la familia de TNF está descrita en Locksley et al. (2001, Cell, 104:487:501), donde el ligando está indicado por la superfamilia del factor de la necrosis tumoral (TNFSF), y los receptores están indicados por la superfamilia del receptor del factor de la necrosis tumoral (TNFRSF) en orden numérico.

El símbolo del ligando o receptor del miembro de la familia del TNF aparece primero, seguido de un número de Acceso a Genbank en doble paréntesis, que es seguido a su vez de varios nombres comunes para el miembro de la familia del que se trate: TNFSF1 ((n.º de Acceso a Genbank X01393), TNFB, Linfotoxina (LT)-alfa) y su receptor del factor de la necrosis tumoral TNFRSF1A ((N.º de Acceso a Genbank M75866), TNF-R); TNFSF2 ((N.º de Acceso a Genbank X02910) factor de necrosis tumoral (TNF)) y su receptor TNFRSF1B ((N.º de Acceso a Genbank M32315) TNF-R); TNFSF3 ((N.º de Acceso a Genbank L11016) LT-beta) y su receptor TNFRSF3 ((N.º de Acceso a Genbank L04270) LTBR, TNFR2-RP, CD18, TNR-RP, TNFCR, TNF-R-III); TNFSF4 ((N.º de Acceso a Genbank D90224) OX-40L) y su receptor TNFRSF4 ((N.º de Acceso a Genbank X75962) OX40); TNFSF5 ((N.º de Acceso a Genbank X67878) CD40L) y su receptor TNFRSF5 ((N.º de Acceso a Genbank X60592) CD40); TNFSF6 ((N.º de Acceso a Genbank U11821) FasL) y sus receptores TNFRSF6 (N.º de Acceso a Genbank M67454) FAS, CD95) y TNFRSF6B ((N.º de Acceso a Genbank AF104419) DcR3); TNFSF7 ((N.º de Acceso a Genbank L08096) CD70, CD27L) y su receptor TNFRSF7 ((N.º de Acceso a Genbank M63928) CD27); TNFSF8 ((N.º de Acceso a Genbank L09753) CD30LG) y su receptor TNFRSF8 ((N.º de Acceso a Genbank M83554) CD30); TNFSF9 ((N.º de Acceso a Genbank U03398) 4-1BB-L) y su receptor TNFRSF9 ((N.º de Acceso a Genbank L12964) 4-1BB); TNFSF10 ((N.º de Acceso a Genbank U37518) TRAIL) y sus receptores TNFRSF10A ((N.º de Acceso a Genbank U90875) DR4), TNFRSF10B ((N.º de Acceso a Genbank AF012628) DR5, KILLER, TRAIL-R2), TNFRSF10C ((N.º de Acceso a Genbank AF012536) Dcr1, TRAILR3), y TNFRSF10D ((N.º de Acceso a Genbank AF029761) Dcr2, TRAILR4); TNFSF11 ((N.º de Acceso a Genbank AF013171) RANKL, OPGL) y sus receptores TNFRSF11A ((N.º de Acceso a Genbank AF018253 RANK) y TNFRSF11B (N.º de Acceso a Genbank U94332) OPG); TNFSF12 ((N.º de Acceso a Genbank AF030099) TWEAK) y sus receptores TNFRSF12 ((N.º de Acceso a Genbank U72763) DR3, TRAMP) y TNFRSF12L (DR3L); TNFSF13 ((N.º de Acceso a Genbank NM_003808) APRIL) y sus receptores TNFRSF13 y TNFSF13B ((N.º de Acceso a Genbank AF136293) THANK, BLYS); TNFSF14 ((N.º de Acceso a Genbank AF036581) LIGHT, LT-gamma, HVEM-L) y su receptor TNFRSF14 ((N.º de Acceso a Genbank U70321) HVEM, ATAR, TR2, LIGHTR, HVEA); TNFSF15 ((N.º de Acceso a Genbank AF039390) TL1, VEGI) y su receptor TNFRSF15; TNFSF16 y su receptor TNFRSF16 ((N.º de Acceso a Genbank M14764) receptor del factor del crecimiento nervioso (NGFR), p75NTR); TNFSF17 y su receptor TNFRSF17 ((N.º de Acceso a Genbank Z29574) BeMA); TNFSF18 ((N.º de Acceso a Genbank AF125303) AITRL TL6 hGITRL) y su receptor TNFRSF18 ((N.º de Acceso a Genbank AF125304) AITR, GITR); TNFSF19 y su receptor TNFRSF19 (N.º de Acceso a Genbank AF173166); TNFSF20 y su receptor TNFRSF20 (Locksley et al., 2001, Cell, 104:487:501). En un modelo específico, un polipéptido que puede utilizarse como un polipéptido heterólogo por los métodos y composiciones de la invención es CD40L (TNFSF5).

Con el polipéptido de fusión pueden fusionarse polipéptidos adicionales para facilitar la pureza, como, por ejemplo, las etiquetas de epítopo pueden situarse en el amino-término, en el carboxi-término o en la zona interna. Las etiquetas de epítopo más conocidas incluyen, por ejemplo, las etiquetas de histidina, las etiquetas FLAG y los GST, entre otros. Se observa además que una etiqueta de epítopo puede modificarse genéticamente para que cuente con un lugar de escisión proteolítica entre la etiqueta y el resto del polipéptido, de manera que la etiqueta puede escindirse y eliminarse del polipéptido de fusión. Los ejemplos de enzimas proteolíticas conocidas que reconocen aminoácidos únicos en los polipéptidos incluyen el Factor Xa y la trombina, y están disponibles en el mercado.

La invención contempla unos multímeros de orden superior de un polipéptido de fusión de la invención, de manera que cuenta con una actividad aumentada respecto de un polipéptido no multimerizado. Tal y como se utiliza en este documento, un "multímero" o un "polipéptido multimerizado" puede incluir un dímero, un trímero, un tetrámero, un dímero de un trímero, un trímero de un trímero, un dímero de un tetrámero, un trímero de un tetrámero, etc. Los ejemplos de dominios de multimerización adicional pueden incluir las cremalleras de leucina o dominios Fc. De conformidad con lo anterior, un polipéptido que conste de un dominio de dimerización (es decir, un dominio Fc) y de un dominio de trimerización (es decir, un dominio alfa de trimerización de un receptor scavenger) pueden inducir a un dímero de un trímero de forma que se asocien seis polipéptidos. Asimismo se observa que estos multímeros pueden tener una bioactividad mayor que los monómeros o los multímeros de orden inferior. Por ejemplo, se observa que un trímero tendrá una actividad mayor que un dímero.

Los términos "inmunogenicidad reducida" o "ausencia de inmunogenicidad" se entienden como que una terapia, como el polipéptido de la invención, fracasa a la hora de inducir una respuesta inmune considerable en el sujeto, preferiblemente un humano, al que se ha administrado. Una respuesta inmune considerable es una respuesta que se puede evaluar; los expertos en la materia lo reconocerán como una respuesta inducida por el polipéptido de la invención. Esta definición no incluye las variaciones normales debidas a las diferencias en los reagentes utilizados en las pruebas, la variabilidad de las muestras o donde haya otro tipo de imperfecciones en los procesos de prueba. Una respuesta inmune puede evaluarse a través de una variedad de técnicas habituales, como el uso de una prueba de inmunoabsorción enzimática (ELISA o enzyme linked immunosorbent assay) para detectar anticuerpos elaborados como respuesta a una terapia mediante la medición de la producción de citoquina por el sujeto en plazos de tiempo adecuados posteriores a la administración del polipéptido, y/o por la medición de la proliferación de unos tipos especiales de células inmunes, entre otros métodos conocidos.

Un método ilustrativo para la reducción o eliminación de la inmunogenicidad en un polipéptido terapéutico es el uso de polipéptidos derivados de las mismas especies a las que se trate. Por ejemplo, cuando un polipéptido va a administrarse a un humano, el polipéptido deberá ser un derivado humano. Si en este ejemplo no hay polipéptidos humanos disponibles, los polipéptidos pueden humanizarse para reducir la inmunogenicidad. La humanización de un polipéptido puede llevarse a cabo, por ejemplo, de forma análoga a los anticuerpos humanizantes, donde una secuencia de anticuerpos de un ratón se humaniza mediante la mutación de unos aminoácidos individuales para que estos correspondan a secuencias de polipéptidos humanos, de forma que el anticuerpo no induzca una respuesta fuerte humana contra los anticuerpos del ratón cuando se administre.

Los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos precedentes también están dentro del alcance de la invención. Estos ácidos nucleicos pueden clonarse y mutarse mediante técnicas reconocidas, y se propagan normalmente en plásmidos u otros vectores (Sambrook et al. eds., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Los vectores también pueden incluir composiciones adicionales para facilitar la replicación en células procariotas y/o eucariotas, la integración del constructo dentro de un cromosoma eucariota, y marcadores para ayudar en la selección de y/o cribado de células que contengan el constructo. Los vectores de la invención son vectores de ADN recombinantes que incluyen, sin que sirva de limitación, plásmidos, fagos, fagómidos, cósmidos, virus, retrovirus y similares que se utilizan para insertar polinucleótidos heterólogos dentro de una célula.

Tal y como se utiliza en este documento, el término "unión" se entiende como dos moléculas que se aproximan la una a la otra por interacción de afinidad o/y por enlace covalente como, por ejemplo, la unión de nucleótidos entre sí en la clonación, mediante vínculo cruzado químico, o mediante algún otro método similar de unión. Los nucleótidos pueden obtenerse a partir de fuentes genómicas, de cADN o de vectores conectados a ácidos nucleicos heterólogos mediante digestión tradicional y ligación en la clonación, o mediante amplificación de fragmentos deseados de secuencias durante la PCR, entre otros métodos.

En una realización, una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión de la invención está unida de forma operativa a un elemento de control heterólogo. Un ácido nucleico está "unido operativamente" cuando está colocado dentro de una relación funcional con otro ácido nucleico. "Unido operativamente" también puede hacer referencia a que dos moléculas diferentes de ácido nucleico que codifican distintos polipéptidos tienen una transcripción inducida de forma simultánea. En caso de los ácidos nucleicos unidos operativamente, también pueden ser contiguos en una única unidad transcripcional, mientras que su traducción está dirigida desde uno o más puntos de inicio ribosomales. Además, unido operativamente puede hacer referencia a dos regiones de codificación de polipéptidos que se unen en fase, de forma que codifican un único polipéptido contiguo, es decir, un polipéptido de fusión.

Un potenciador o silenciador está unido operativamente a un ácido nucleico cuando está situado respecto del ácido nucleico de tal forma que aumenta o disminuye la transcripción del ácido nucleico. Los potenciadores o silenciadores pueden estar situados encima, debajo o alojados dentro de las regiones codificadoras del ácido nucleico.

Los vectores de expresión pueden ser de expresión de un polipéptido de fusión de la invención en células procariotas (como la E. Coli) o eucariotas (como células de insectos (que usen vectores de expresión de baculovirus), células de levadura, células vegetales o células de mamífero). Las células hospedadoras adecuadas son, entre otras, las células procariotas, eucariotas y vegetales, y esto se trata con mayor profundidad en Goeddel, (1990) Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA. La expresión de proteínas en procariotas se da con mayor frecuencia en E. Coli, con vectores que contienen promotores inducibles o constitutivos que dirigen la expresión de la proteína. Los ejemplos de los vectores de expresión de E. Coli inducibles adecuados son, entre otros, pTrc (Amann et al., (1988) Gene 69:301-315) y pET 11d (Studier et al., (1990) Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California 60 - 89).

En otra realización, el vector de expresión es un vector de expresión de levadura. Los ejemplos de vectores para la expresión en la levadura S. cerevisiae son, entre otros, pYepSec1 (Baldari et al., (1987) EMBO J. 6:229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz, (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54:113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA), y pPicZ (Invitrogen Corp, San Diego, CA). De forma alternativa, el vector de expresión es un vector de expresión de baculovirus del tipo, por ejemplo, las series pAc (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165). En otra realización, un ácido nucleico de la invención está expresado en células de mamífero mediante un vector de expresión de mamífero. Los ejemplos de vectores de expresión de mamífero son numerosos, e incluyen, sin que sirva de limitación, pCDM8 (Seed (1987) Nature 329:840) y pMT2PC (Kaufman et al., (1987) EMBO J. 6:187-195).

Un vector de expresión recombinante de mamífero puede también diseñarse de modo que sea capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico preferiblemente en un tipo de célula especial (como los elementos reguladores específicos de tejido, que se utilizan para expresar el ácido nucleico). Los elementos reguladores específicos de tejido se conocen entre los expertos en la materia. Algunos ejemplos de promotores específicos de tejido adecuados, sin que sirva de limitación, incluyen el promotor de albúmina (específico del hígado; Pinkert et al., (1987) Genes Dev. 1:268-277), promotores específicos linfoides (Calame and Eaton (1988) Adv. Immunol. 43:235-275), en especial, promotores de receptores de células T (Winoto and Baltimore (1989) EMBO J. 8:729-733), inmunoglobulinas (Banerji et al. (1983) Cell 33:729-740; Queen and Baltimore (1983) Cell 33:741-748), y promotores específicos de las glándulas mamarias (por ejemplo, el promotor del suero de la leche; Patente estadounidense N.º 4.873.316 y Publicación de Solicitud Europea N.º 264.166).

Otro aspecto de la invención pertenece a las células hospedadoras en las que se ha introducido un vector de expresión recombinante de la invención. Los términos "célula hospedadora" y "célula hospedadora recombinante" se utilizan de forma intercambiable en este documento. Se entiende que dichos términos se refieren no sólo a la célula objeto en particular, sino a la progenie o progenie potencial de dicha célula. Dado que pueden darse ciertas modificaciones en generaciones sucesivas debido bien a mutaciones, bien a influencias ambientales, dicha progenie, de hecho, puede no ser idéntica a la célula precursora, pero seguirán incluidas dentro del alcance del término tal y como se utiliza en este documento. Una célula hospedadora puede ser procariota (como E. Coli), eucariota (como las células de los insectos, células de la levadura o células de mamífero) o células vegetales.

Las células utilizadas en la invención pueden ser modificadas genéticamente para expresar un polipéptido de fusión de la invención. Por modificado genéticamente se entiende que la célula ha sido transfectada, transformada o transducida con una molécula de polinucleótido recombinante y/o alterada de alguna otra manera (como por recombinación homóloga y activación genética), de forma que provoque que dicha célula exprese el polipéptido de fusión. Los métodos y vectores para células modificadas genéticamente y/o las líneas celulares son bien conocidos entre los expertos en la materia; por ejemplo, se ilustran varias técnicas en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. (Wiley & Sons, New York, (1988) and quarterly updates) y en Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Laboratory Press).

Se observa asimismo que los polipéptidos de fusión de la invención pueden expresarse en animales transgénicos, como, por ejemplo, ratones, cabras o vacas. Como último ejemplo, la expresión del polipéptido de fusión puede ser designada de forma que se segregue en la leche del animal. Un animal transgénico puede producirse al introducir el ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión de la invención dentro de un ovocito fertilizado o una célula madre embrionaria. Dichas células hospedadoras pueden así utilizarse para crear animales transgénicos no humanos.

El vector ADN puede introducirse en las células mediante las técnicas convencionales de transformación o de transfección. Tal y como se utilizan en este documento, los términos "transformación" y "transfección" se refieren a una serie de técnicas reconocidas para la introducción de ácido nucleico extraño en una célula hospedadora, incluida la coprecipitación de fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediante DEAE-dextrano, lipofección o electroporación. En Sambrook, et al. y otros manuales de laboratorio pueden encontrarse métodos adecuados de transformación o transfección de células hospedadoras. Para la transfección estable de células de mamíferos, se sabe que, en función del vector de expresión y la técnica de transfección utilizada, únicamente una fracción pequeña de las células puede integrar en su genoma el ADN transfectado. Para identificar y seleccionar estos integrantes, un gen que codifica un marcador seleccionable (por ejemplo para la resistencia a los antibióticos) suele introducirse en la célula hospedadora junto con el gen de interés. Los marcadores seleccionables preferidos incluyen aquellos que ofrecen una resistencia a fármacos como el G418, la higromicina y el metotrexato. Las células transfectadas de forma estable con el ácido nucleico introducido pueden identificarse por selección de fármacos.

En otra realización, la fusión de un polipéptido de trimerización de la invención con un segundo polipéptido heterólogo que es un ligando puede provocar una señalización aumentada a través del receptor del ligando. Entre otras causas, el mecanismo de este aumento puede darse por una unión y activación aumentadas del receptor, de forma que el receptor haya aumentado su actividad biológica. Por ejemplo, CD40L (TNFSF5) multimerizado ha demostrado que, cuando se administra a una población celular, aumenta la proliferación celular inmune respecto a las células no tratadas (ver ejemplo a continuación) y respecto a las células tratadas con CD40L (TNFSF5) no multimerizado, por lo que, de conformidad con la invención, cuando CD40L (TNFSF5) soluble se fusiona con un polipéptido de trimerización del dominio de la invención, éste cuenta con un aumento de actividad respecto de CD40L (TNFSF5) soluble que no se ha trimerizado.

Los términos "aumentado" o "ampliado" se entienden como que incluyen toda elevación ponderable de la actividad biológica respecto de su medición en un control no tratado. Un aumento puede ser del 10%, 20%, 30% 40% o más, y los aumentos pueden exceder el 100% de la actividad de los controles. Los ejemplos de los ensayos para medir aumentos incluyen, sin que sirva de limitación, la evaluación de la liberación de citoquina, inducción de la expresión de la superficie molecular, aumento o descenso de la proliferación celular, aumento o descenso de la muerte celular apoptótica y activación bioquímica, como patrones de fosforilación. En un ejemplo en especial, la adición de CD40L (TNFSF5) trimerizado a las células puede tener como resultado la inhibición de la secreción de IgE inducido por IL-4, o la expresión ampliada de CD23 en cultivos mixtos de linfocitos. En un modelo especial de la invención, los multímeros de trímeros de la invención tiene una actividad mayor que la actividad de los trímeros no multimerizados.

Todavía en otra realización, la fusión de un polipéptido de multimerización, como un dominio de trimerización, con un segundo polipéptido heterólogo que sea un receptor puede tener como resultado el descenso de la señalización a través del receptor nativo correspondiente. Entre otras causas, el mecanismo de esta reducción puede darse por la unión competitiva del polipéptido soluble con el ligando del receptor, donde esta unión evita que el ligando active el receptor. Por ejemplo, la administración de TNFR:Fc (es decir, Etanercept), un dímero, tiene como resultado la reducción de la señalización a través del receptor del TNF-alfa de las células no tratadas medidas, en parte, por los síntomas reducidos de la enfermedad (Spencer-Green, 2000, Ann. Rheum. Dis., 59 Suppl 1, pp. 46-9). Por tanto, un multímero de un TNFR conforme a la invención puede inhibir la inflamación mediada por el TNF-alfa.

El término "reducido" se entiende como que incluye toda disminución ponderable de la actividad biológica respecto de su medición en un control no tratado. Más especialmente, un descenso puede ser del 10%, del 20% o más, hasta de un 100%. Los ejemplos de los ensayos para medir estas reducciones incluyen, sin que sirva de limitación, el aumento o descenso de la liberación de citoquina, inducción de la expresión de la superficie molecular, aumento o descenso de la proliferación celular, aumento o descenso de la muerte celular apoptótica y activación bioquímica, como patrones de fosforilación.

La actividad del polipéptido de fusión está parcialmente determinada por su afinidad a un patrón de unión (como un receptor o un ligando). La afinidad de las moléculas trimerizadas para sus patrones de unión respectivos puede medirse mediante un análisis de interacción bioespecífico (BIA), que es un biosensor, es decir, un instrumento que combina un mecanismo de reconocimiento biológico con un mecanismo de detección o transductor. Un ejemplo de biosensor es BIOcore TM (Pharmacia). Éste hace uso del fenómeno óptico de la resonancia del plasmón superficial para controlar la interacción entre dos moléculas biológicas. Los pares de moléculas con constantes de afinidad entre 10^{5} y 10^{10} M^{-1}, y las constantes de índice de asociación entre 10^{3} y 10^{6} M^{-1}s^{-1} son adecuados para este método.

También se observa que, como los trímeros (o multímeros de mayor orden) cuentan con más lugares de unión para su patrón de unión que los dímeros o monómeros, los polipéptidos multimerizados de la invención también tendrán una avidez mayor para los patrones de unión que los monómeros o dímeros (o multímeros de menor orden). Este mayor grado de avidez aumenta la unión específica de los multímeros a sus patrones de unión. Así, en un modelo se observa que los polipéptidos de la invención pueden unirse a moléculas terapéuticas heterólogas para ofrecer una mayor eficacia a las células diana que expresan un patrón de unión. Los ejemplos de moléculas heterólogas que pueden unirse incluyen, sin que sirva de limitación, fracciones radiactivas, por ejemplo I^{125} e Y^{90}, y/o polipéptidos toxinas, como ricina o la toxina botulínica. El vínculo puede establecerse mediante técnicas de unión cruzada conocidas entre los expertos en la materia.

Preparados Farmacéuticos y Modos de Administración

Los polipéptidos de la invención pueden formularse como compuestos aptos para su administración en pacientes que necesitan tratamiento. Dichos compuestos son útiles para el tratamiento de desórdenes relacionados con la inmunidad y/o para el aumento de la estimulación de una respuesta inmune que de otra forma sería normal. Una dosis terapéutica eficaz se refiere a una cantidad del compuesto suficiente para obtener una mejora de los síntomas de, por ejemplo, inmunodeficiencia o condiciones o enfermedades inflamatorias. Asimismo, cuando un polipéptido de la invención se administra conjuntamente con otro elemento terapéutico, las dosis se modifican para evitar posibles interacciones entre los agentes terapéuticos.

Dosis Eficaz

La toxicidad y la eficacia terapéutica de los compuestos pueden determinarlas los procesos farmacéuticos habituales sobre cultivos celulares o animales de experimentación, como para determinar el LD50 (la dosis letal para el 50% de la población) y el ED50 (la dosis terapéutica eficaz para el 50% de la población). La proporción de la dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico, y puede expresarse como la proporción LD50/ED50. Se prefieren los compuestos que muestran índices terapéuticos amplios.

Mientras que los compuestos que muestran efectos secundarios tóxicos pueden utilizarse, hay que tener sumo cuidado a la hora de elaborar un sistema de administración que dirija dichos compuestos al lugar del tejido afectado para minimizar el daño potencial a las células no infectadas y así reducir los efectos secundarios.

Los datos obtenidos de los ensayos con cultivos de células y los estudios con animales pueden utilizarse para formular un abanico de dosis para su uso en humanos. La dosis de dichos compuestos recae preferiblemente dentro de un ámbito de concentraciones circulantes que incluyen el ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosis puede variar dentro de este ámbito en función de la presentación empleada y la vía de administración utilizada. Para todo compuesto utilizado en el método de la invención, la dosis eficaz terapéutica puede estimarse inicialmente a partir de los ensayos con cultivos de células. Puede formularse una dosis en modelos animales para lograr un ámbito de concentración de plasma circulante que incluya el IC50 (es decir, la concentración del compuesto de la prueba que alcanza una inhibición medio máxima de los síntomas) tal y como se determina en un cultivo de células previo a su administración a un paciente.

Cuando se administra otro producto terapéutico en combinación con los polipéptidos de la invención (co-administración), los polipéptidos de la invención pueden administrarse bien antes, a la vez o después de la administración del segundo producto terapéutico. La administración simultánea abarca la mezcla de polipéptidos de la invención con el segundo producto terapéutico antes de su administración al paciente, o la administración al paciente en infusiones separadas, aunque al mismo tiempo. También se observa que la dosis del segundo producto terapéutico debería ser coherente con los márgenes terapéuticos establecidos, aunque debería poder darse un aumento de la eficacia del producto terapéutico cuando se use combinado con un polipéptido de la invención que sea mayor que la suma de ambos por separado, por lo que se daría una sinergia. Así, en caso de sinergia, se entenderá que las dosis pueden disminuirse respecto de los márgenes recomendados a raíz del aumento de la eficacia.

En una realización de la invención, un polipéptido de la invención se administra una vez a la semana para tratar los diversos desórdenes médicos que hemos tratado en este documento; en otro modelo, se administra al menos dos veces a la semana, y en otro modelo se administra al menos una vez al día. Un paciente adulto es una persona con al menos 18 años de edad. En caso de ser inoculada, la cantidad eficaz, por dosis para adulto, de un polipéptido de la invención oscila desde aproximadamente 1-500 mg/m^{2}, o aproximadamente 1-200 mg/m^{2}, o aproximadamente 1-40 mg/m^{2} o aproximadamente 5-25 mg/m^{2}. Como alternativa, puede administrarse una dosis fija cuya cantidad puede oscilar desde 2-500 mg/m^{2}, 2-100 mg/m^{2} o desde aproximadamente 10-80 mg/dosis. Si la dosis se va a administrar más de una vez a la semana, los ejemplos de intervalos de las dosis serán los mismos que los descritos anteriormente o menores. Preferiblemente, los polipéptidos de la invención se administrarán dos o más veces a la semana y con un intervalo de 25-100 mg/dosis.

En un modelo de la invención, las distintas indicaciones descritas más abajo se considerarán por administración de un preparado aceptable para su inoculación que contenga un polipéptido de la invención a 80-100 mg/dosis, o, como alternativa, que contenga 80 mg por dosis. La dosis puede administrarse en dosis bisemanales, semanales o separadas por varias semanas (por ejemplo de 2 a 8).

Si se utiliza una vía de administración de los polipéptidos de la invención distinta de la inyección, la dosis se ajustará adecuadamente de conformidad con las prácticas médicas habituales. Por ejemplo, si la vía de administración es la inhalación, la dosis podrá ser de una a siete veces a la semana en intervalos desde 10 mg/dosis hasta 50 mg/dosis.

En muchos casos, se obtendrá la mejora de un paciente mediante inyección de una dosis de hasta aproximadamente 100 mg de los polipéptidos de la invención de una a tres veces por semana durante un periodo de al menos tres semanas, aunque puede ser necesario un tratamiento para periodos más largos para inducir el grado deseado de mejora. Para situaciones crónicas incurables, por ejemplo, pacientes con fallos en la médula ósea causada por un desorden genético, la administración podrá continuarse indefinidamente.

Para pacientes pediátricos (edades entre 4 y 17 años) el plan adecuado abarca la inyección subcutánea de 0,4 mg/kg hasta 5 mg/kg de los polipéptidos de la invención, administrados mediante inyección subcutánea una o más veces por semana.

Formulaciones y Uso

Las composiciones farmacéuticas para el uso de las composiciones de la presente invención pueden formularse de la forma convencional mediante uno o más portadores o excipientes fisiológicamente aceptables. Así, los compuestos y sus sales y solutos fisiológicamente aceptables pueden formularse para la administración por inhalación o insuflación (ya sea oral o nasal) o para administración oral, parenteral o rectal.

Para la administración oral, las composiciones pueden tener forma de tabletas o pastillas formuladas de la forma convencional.

Los compuestos pueden formularse para administración parenteral por inyección, como por inyecciones en bolo o infusión continua. Las formulaciones para las inyecciones pueden presentarse en forma de una única dosis, como en ampollas o en contenedores multidosis, con un conservante añadido. Las composiciones pueden tener diversas formas, como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación como agentes de suspensión, estabilizantes y/o de dispersión. De forma alternativa, el principio activo puede aparecer en forma de polvo para su constitución con un vehículo adecuado, como, por ejemplo, agua esterilizada sin pirógenos, antes de su uso.

Los compuestos también pueden formularse como composiciones rectales como supositorios o enemas de retención, del tipo a supositorios convencionales como de manteca de cacao y otros glicéridos.

Además de las formulaciones descritas anteriormente, los compuestos también pueden ser formulados para su inyección. Dichas formulaciones suelen almacenarse como soluciones acuosas que pueden congelarse y descongelarse, pero que también pueden prepararse como muestras liofilizadas para un almacenamiento más largo. Estas formulaciones suelen presentarse en una solución isotónica con la sangre humana, a saber, sobre 150 mM y tamponada. Los tamponadores habituales incluyen el fosfato de sodio y el acetato de sodio, y su pH oscila entre 1 y 14, pero suelen estar entre 4,5 y 6. Estas formulaciones también pueden tener poliol (como sorbitol, trehalosa, sucrosa, etc.), y un surfactante (como el polisorbato, polisorbato 80, etc.) y no requieren cloruro sódico para hacer la solución isotónica.

Los polipéptidos de la invención también pueden formularse como una preparación depot. Dichas formulaciones de acción prolongada pueden administrarse por implantación (por ejemplo, subcutánea o intramuscular) o por inoculación intramuscular. Así, por ejemplo, los componentes pueden presentarse con materiales hidrófobos o poliméricos adecuados (como, por ejemplo, una emulsión en un aceite apto) o resinas de intercambio iónico, o como derivados solubles con moderación, por ejemplo, una sal soluble en poca cantidad.

Las composiciones pueden, si se quiere, presentarse en un paquete o dispositivo dispensador que puede contener una o más dosis que tengan el principio activo. El paquete puede tener, por ejemplo, un envoltorio de metal o plástico, como una caja de plástico. El paquete o dispositivo dispensador puede ir acompañado de las instrucciones para su administración.

Ejemplos Clonación

Los constructos se han conseguido mediante la unión de tres ácidos nucleicos diferentes: 1) el dominio de unión al receptor (RBD) de CD40L (TNFSF5) humano, como el 0,4 kb XbaI-NotI, previamente fusiona con una deleción de CD40L (TNFSF5) 194W tal y como se describe en Morris et al., (1999, J. Biol. Chem., 274:418-423); 2) el fragmento AvrII-XbaI de la secuencia de trimerización del receptor scavenger generado tal y como se describe más adelante; 3) y el fragmento 5,6 kb Spe1-Not1 consistente en el vector de expresión pSMAG que contiene las secuencias de señal y el promotor transcripcional. Los ácidos nucleicos resultantes se describen en SEQ. ID. N.º: 5 y 7.

El fragmento AvrII-XbaI que consta de las 7 repeticiones heptavalentes a partir de la secuencia de codificación del receptor scavenger se generó mediante hibridación y unión de dos conjuntos de oligonucleótidos sintéticos que se muestran en la Figura 1 (oligosecuencias SR). La secuencia de oligonucleótidos se ha diseñado de tal forma que contenga un solapamiento del sitio de restricción AvrII en el extremo 5' y un solapamiento del sitio de restricción XbaI (secuencia compatible) en el extremo 3' del fragmento del receptor scavenger sintético. El sitio XbaI es TCTAGA, el sitio de restricción AvrII es C/CTAGG, y el sitio de restricción SpeI es A/CTAGT. La unión de SpeI con AvrII genera la secuencia ACTAGG que codifica los aminoácidos treonina y arginina, respectivamente (código de letras de aminoácidos únicos T y R).

Los oligos 33 (SEQ. ID. N.º: 2) y 35 (SEQ. ID. N.º: 4) se han fosforilado mediante la polinucleótido-quinasa de T4 y ATP a 37ºC durante una hora. Las preparaciones de oligonucleótidos adecuadas se mezclaron entre sí en dos recipientes de reacción separados (tubos eppendorf) en una concentración de 2 \mug/ml, y se templó por calentamiento cada par de oligonucleótidos a 95ºC durante 2 minutos; se mantuvo a 65ºC durante 3 minutos, y se dejó enfriar de forma gradual a temperatura ambiente (25ºC) durante 45 minutos. El oligo 32 (SEQ. ID. N.º: 3) se apareó con el oligo complementario 35, y el oligo 33 se apareó con el oligo complementario 34 (SEQ. ID. N.º: 1). Los dos conjuntos de reacciones se mezclaron entre sí y se unieron durante una hora mediante ADN Ligasa (ver SEQ. ID. N.º: 11). La reacción de unión se analizó mediante electroforesis en un gel al 3% de agarosa Nusieve® al 3%, y los aproximadamente 150 fragmentos de pares de bases correspondientes al fragmento del receptor scavenger AvrII se visualizaron y se aislaron del gel.

Estos ácidos nucleicos se clonaron en la parte superior (es decir, extremo N-terminal) del dominio de unión al receptor (RBD) de CD40L (TNFSF5) mediante unión a un fragmento Not1-SpeI que contiene el (RBD) de CD40L (TNFSF5) y un fragmento Not1-SpeI que contiene el vector pSMAG y la secuencia de la señal. Estos ácidos nucleicos de receptores scavenger sustituyen a los ácidos nucleicos que codifican la cremallera de luceina muteina que se utilizó previamente para trimerizar/estabilizar los trímeros de CD40L (TNFSF5) soluble. El vector de expresión pSMAG utilizado para estos constructos contenía el promotor de transcripción y, bien la secuencia de señal IL2, bien la secuencia de señal de la hormona de crecimiento humano (GH) para permitir la secreción de CD40L (TNFSF5).

El ácido nucleico de los constructos finales se analizó en un secuenciador automático. Se obtuvo la secuencia de la secuencia de señal mediante el cruce del RBD de CD40L (TNFSF5), que confirmó la unión correcta. La Figura 2A describe un polipéptido de fusión de la invención en donde los aminoácidos 1 a 24 son el péptido de señal IL2, los aminoácidos 25 a 39 son secuencias de agentes de unión, los aminoácidos 40 a 88 son el dominio de trimerización, los aminoácidos 89 a 95 son secuencias de agentes de unión, y los aminoácidos 96 a 244 son las secuencias de deleción 194W de CD40L (TNFSF5) y la Figura 2B describe un polipéptido de fusión de la invención en donde los aminoácidos 1 a 25 son el péptido de señal IL2, los aminoácidos 26 a 29 son secuencias de agentes de unión, los aminoácidos 30 a 78 son el dominio de trimerización, los aminoácidos 79 a 85 son secuencias de agentes de unión, y los aminoácidos 86 a 234 son las secuencias de deleción 194W de CD40L (TNFSF5).

Expresión

Las células COS se transfectaron con ADN plásmido con 2 \mug en cada pocillo de un recipiente de transfección de 6 pocillos, y el medio de crecimiento / condicionado se recogió transcurridos 3 días y se analizó mediante la técnica Western Blot en SDS PAGE utilizando un anticuerpo policlonal anti CD40L (TNFSF5). El resultado de la técnica Western Blot, que se muestra en la Figura 3, demuestra que tanto la cremallera de isoleucina CD40L (TNFSF5) (Morris et al., (1999) J. Biol. Chem., 274:418-423), como las dos formas del receptor scavenger (SR)-CD40L (TNFSF5), descritas anteriormente, se han expresado y secretado. Los pocillos 1, 3 y 5 contienen la recolección de un sobrenadante en una dilución 1:10, y los pocillos 2, 4 y 6 contienen un sobrenadante en una dilución 1:30. Los pocillos que contienen una recolección de un sobrenadante de las células transfectadas son: los pocillos 1 y 2, que contienen una cremallera de isoleucina CD40L (TNFSF5) cADN; los pocillos 4 y 6, que contienen una secuencia de la señal de la hormona del crecimiento unida a un dominio de trimerización del receptor scavenger CD40L (TNFSF5) (GH-SR-CD40L); los pocillos 5 y 6, que contienen una secuencia de señal IL2 unida al dominio de trimerización del receptor scavenger CD40L (TNFSF5) (IL2-SR-CD40L).

Bioactividad

Se analizó el medio de recolección de la transfección para comprobar la bioactividad en un ensayo de proliferación de células B, tal y como lo describe Morris et al., (1999, J. Biol. Chem., 274:418-423). La coestimulación de la proliferación de las células B de la sangre humana se evaluó mediante un cultivo de PBMC (E) deplecionado de células T en placas de microtitulación de 96 pocillos de fondo redondo (1 x 10^{5} células en 200 \mul) durante 4 días en presencia de una titulación de huCD40L (TNFSF5). Las células fueron pulsadas con timidina tritiada (91 \muci/pocillo) para el periodo final de 18 horas del cultivo. Las células cultivadas con 1 \mug/ml de cremallera de isoleucina CD40L (TNFSF5) se incluyó como un control positivo. Las células de control se incluyeron como control negativo. Las células B son las únicas células del E prep. que proliferarán en respuesta al CD40L (TNFSF5). Los resultados demuestran que los supernadantes de la transfección que contienen el dominio de trimerización del receptor scavenger fusionados con RBD de CD40L (TNFSF5), con la secuencia de señal de la hormona del crecimiento, son aproximadamente tan activos como la forma de cremallera de leucina de CD40L (TNFSF5).

Equivalentes y Referencias

El alcance de la presente invención no debe verse limitado por los modelos específicos descritos en este documento, cuya intención es ofrecer ilustraciones únicas de aspectos individuales de la invención, y los métodos y componentes funcionalmente equivalentes se encuentran dentro del ámbito de aplicación de la invención. De hecho, varias modificaciones de la invención, además de aquellas mostradas y descritas en este documento, serán fáciles de comprender para los expertos en la materia a partir de las descripciones aportadas y de sus dibujos correspondientes.

<110> Reddy, Pranhitha

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> RECOMBINANT POLYPEPTIDES

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> 01017/30002

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<140> US 10/326,186

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 2002-12-20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 60/343,315

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2001-12-21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn version 3.1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\hskip0.8cm

1

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\hskip0.8cm

2

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\hskip0.8cm

3

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\hskip0.8cm

4

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 743

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(735)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0.8cm

5

\hskip0.8cm

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 244

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0.8cm

7

\hskip0.8cm

8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 713

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(705)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0.8cm

9

\hskip0.8cm

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 234

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0.8cm

11

\hskip0.8cm

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1077

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1077)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0.8cm

13

\hskip0.8cm

14

\hskip0.8cm

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 358

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0.8cm

16

\hskip0.8cm

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 174

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0.8cm

18

Claims (21)

1. Un polipéptido de fusión que comprende un primer polipéptido formado por aminoácidos de X a Y del polipéptido descrito en SEQ. ID. N.º: 10, donde X está seleccionado entre las posiciones 110 y 173 de SEQ. ID. N.º: 10, e Y está seleccionado entre las posiciones 179 y 270 de SEQ. ID. N.º: 10, fusionado con un segundo polipéptido heterólogo y cuyo polipéptido de fusión es capaz de formar un trímero.

2. Un polipéptido de fusión que comprende un primer polipéptido fusionado con un segundo polipéptido heterólogo, donde

el primer polipéptido consiste en aminoácidos de X a Y del polipéptido descrito en SEQ. ID. N.º: 10, donde X está seleccionado entre las posiciones 110 y 173 de SEQ. ID. N.º: 10, e Y está seleccionado entre las posiciones 179 y 270 de SEQ. ID. N.º: 10, con al menos una sustitución de un aminoácido,

la secuencia de aminoácidos del primer polipéptido es al menos idéntica en un 80% de su longitud a la secuencia de aminoácidos del polipéptido descrito en SEQ. ID. N.º: 10 entre las posiciones X e Y de SEQ. ID. N.º: 10, y

el polipéptido de fusión es capaz de formar un trímero.

3. El polipéptido de fusión de la reivindicación 1, donde el primer polipéptido consta de los aminoácidos de 154 a 203 del polipéptido descrito en SEQ. ID. N.º: 10.

4. El polipéptido de fusión de las reivindicaciones 1, 2 o 3, donde el segundo polipéptido es un fragmento soluble de un polipéptido de la superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNFRSF).

5. El polipéptido de fusión de las reivindicaciones 1, 2 o 3, donde el segundo polipéptido es un fragmento soluble de un ligando de la superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNFSF).

6. El polipéptido de fusión de la reivindicación 4, donde el segundo polipéptido es un fragmento soluble de un polipéptido seleccionado entre el grupo de los polipéptidos de la superfamilia de los receptores del factor de necrosis tumoral que consta de TNFRSF1A, TNFRSF1B, TNFRSF3, TNFRSF4, TNFRSF5, TNFRSF6, TNFRSF6B, TNFRSF7, TNFRSF8, TNFRSF9, TNFRSF10A, TNFRSF10B, TNFRSF10C, TNFRSF10D, TNFRSF11A, TNFRSF11B, TNFRSF12, TNFRSF13B, TNFRSF14, TNFRSF16, TNFRSF17, TNFRSF18 y TNFRSF19.

7. El polipéptido de fusión de la reivindicación 6, donde el polipéptido de fusión es capaz de inhibir la señalización de un receptor de la superfamilia de receptores de la familia de necrosis tumoral.

8. El polipéptido de fusión de la reivindicación 7, donde dichos primer y segundo polipéptidos de dicho polipéptido de fusión están codificados por ácidos nucleicos derivados de un humano.

9. El polipéptido de fusión de cualesquiera reivindicaciones de la 1 a la 8, donde dicho polipéptido de fusión es no inmunogénico.

10. El polipéptido de fusión de la reivindicación 5, donde el segundo polipéptido es un fragmento soluble de un polipéptido seleccionado entre el grupo formado por TNFSF1 TNFSF2, TNFSF3, TNFSF4, TNFSF5, TNFSF6, TNFSF7, TNFSF8, TNFSF9, TNFSF10, TNFSF11, TNFSF12, TNFSF13, TNFSF14, TNFSFI5 y TNFSF18.

11. El polipéptido de fusión de la reivindicación 10, donde el polipéptido de fusión es capaz de aumentar la señalización de un receptor de la superfamilia de receptores de la familia de necrosis tumoral.

12. El polipéptido de fusión de cualesquiera reivindicaciones de la 1 a la 11, donde dichos primer y segundo polipéptidos de dicho polipéptido de fusión están codificados por ácidos nucleicos derivados de un humano.

13. El polipéptido de fusión de la reivindicación 12, donde dicho polipéptido de fusión es capaz de formar un multímero de un trímero.

14. El polipéptido de fusión de la reivindicación 13, donde el segundo polipéptido heterólogo consta de los aminoácidos descritos como aminoácidos del 96 al 244 de SEQ. ID. N.º: 6.

15. Un ácido nucleico que codifica el polipéptido de fusión de cualesquiera reivindicaciones de la 1 a la 14.

16. Una célula hospedadora que consta de un ácido nucleico de la reivindicación 15, donde dicho ácido nucleico está operativamente unido a un elemento de control heterólogo.

17. Una célula hospedadora transfectada con un ácido nucleico conforme a la reivindicación 15.

\newpage

18. Un método de producción de un polipéptido de fusión codificado por el ácido nucleico de la reivindicación 15, que comprende las fases de crecimiento de una célula hospedadora transfectada con dicho ácido nucleico en condiciones favorables para la expresión del polipéptido de fusión, y que aísla dicho polipéptido de fusión.

19. Un vector recombinante que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 15.

20. Un método de construcción de un vector de expresión recombinante que comprende las fases de unión de un primer ácido nucleico que consta de los nucleótidos de X a Y del ácido nucleico descrito en SEQ. ID. N.º: 9, donde X está seleccionado entre las posiciones 331 a 508 de SEQ. ID. N.º: 9, e Y está seleccionado entre las posiciones 546 y 808 de SEQ. ID. N.º: 9, y un segundo ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo con el primer ácido nucleico en un lugar de clonación compatible de un vector de expresión, seguido de la ampliación y aislamiento de dicho vector de expresión recombinante.

21. El método de la reivindicación 20, donde el segundo ácido nucleico codifica un fragmento soluble de un polipéptido seleccionado entre el grupo que consta de TNFSF1, TNFSF2, TNFSF3, TNFSF4, TNFSF5, TNFSF6, TNFSF7, TNFSF8, TNFSF9, TNFSF10, TNFSF11, TNFSF12, TNFSF13, TNFSF14, TNFSF15, TNFSF18, TNFRSF1A, TNFRSF1B, TNFRSF3, TNFRSF4, TNFRSF5, TNFRSF6, TNFRSF6B, TNFRSF7, TNFRSF8, TNFRSF9, TNFRSF10A, 1NFRSF10B, TNFRSF10C, TNFRSF10D, TNFRSF11A, TNFRSF11B, TNFRSF12, TNFRSF13B, TNFRSF14, TNFRSF15, TNFRSF16, TNFRSF17, TNFRSF18 y TNFRSF19.