ES2309998T3

ES2309998T3 - Cepa de bordetella que expresa la fha hibrida.

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Publication number: ES2309998T3
Application number: ES97944948T
Authority: ES
Inventors: Nathalie Mielcarek; Camille Locht; Gilles Riveau; Odile Poulain-Godefroy; Andre Capron
Original assignee: Institut Pasteur de Lille; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Institut Pasteur
Current assignee: Institut Pasteur de Lille; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Institut Pasteur
Priority date: 1996-10-11
Filing date: 1997-10-09
Publication date: 2008-12-16
Anticipated expiration: 2017-10-09
Also published as: ATE403675T1; FR2754543B1; PT941241E; DE69738888D1; US6660261B1; EP0941241A1; DK0941241T3; JP4370541B2; WO1998016553A1; AU725137B2; CA2267851A1; AU4627897A; EP0941241B1; FR2754543A1; JP2001507568A; CA2267851C

Abstract

CEPA DE BORDETELLA DEFICIENTE EN LA PRODUCCION DE TOXINA Y QUE EXPRESA UNA PROTEINA HIBRIDA QUE COMPRENDE AL MENOS UNA PARTE DE HEMAGLUTINA FILAMENTOSA (FHA) Y AL MENOS UNA PARTE DE UNA PROTEINA HETEROLOGA RESPECTO A LA FHA. EL GEN QUE CODIFICA LA TOXIMA SE HA ELIMINADO O AL MENOS SE HA SUPRIMIDO PARCIALMENTE O MUTADO PARA PRODUCIR UNA TOXINA INACTIVA. ESTA CEPA PUEDE UTILIZARSE COMO VACUNA. LA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A LIPOSOMAS QUE CONTIENEN AL MENOS UNA PARTE DE LA PROTEINA FHA Y AL MENOS UNA PROTEINA HETEROLOGA A LA PROTEINA FHA, ASI COMO A LA UTILIZACION DE LA FHA PARA LA ESTIMULACION DE RESPUESTAS INMUNITARIAS.

Description

Cepa de Bordetella que expresa la FHA híbrida.

La presente invención se refiere a una cepa de Bordetella pertussis deficiente en la producción de toxina PTX y que expresa una proteína híbrida.

La misma se refiere asimismo a su uso inmunoprofiláctico y/o terapéutico, y en particular a título de vacunas.

Otro objeto de la presente invención es el uso de la FHA para la estimulación de la respuesta inmunitaria.

La tos ferina, cuyo agente mayoritariamente responsable es la bacteria Gram negativa Bordetella pertussis, sigue siendo una enfermedad infecciosa de actualidad en el mundo. Se declaran más de 50 millones de casos por año y la mortalidad se estima en 500.000 fallecimientos por año, principalmente en los lactantes. La mortalidad es especialmente elevada en los países en vías de desarrollo en los que la vacunación es insuficiente y en los que la tos ferina representa una de las mayores causas de mortalidad infantil. La introducción de vacunas celulares, compuestas por B. pertussis inactivadas químicamente o mediante el calor ha producido una reducción espectacular de la incidencia de la tos ferina. Sin embargo, han aparecido unas limitaciones en cuanto a su uso durante estas dos últimas décadas. Varios informes han emitido así la hipótesis de una relación entre la administración de la vacuna celular contra la tos ferina y ciertos efectos secundarios graves.

Además, la necesidad de administrar varias dosis vacunales para obtener una protección óptima, la variabilidad en la eficacia de los diferentes lotes de vacunas, y la resurgencia de la enfermedad en los adultos debida a una debilitación a lo largo del tiempo de la inmunidad post-vacunal en ausencia de recuerdos tardíos, son tantos inconvenientes que han llevado al desarrollo de vacunas acelulares. Sin embargo, los antígenos protectores que componen estas vacunas de nueva generación, generalmente cualificadas de más eficaces, más seguras y más inmunógenas que las vacunas celulares, no se han definido claramente todavía, y siguen siendo necesarias múltiples inyecciones. Además las correlaciones serológicas con la protección en los niños no han sido determinadas aún. Por último, el coste de producción de estas vacunas es más elevado que el de las anteriores, lo que representa un problema importante para los países en vías de desarrollo que son los que más las solicitan.

Por otro lado, se ha demostrado que la infección natural por B. pertussis conlleva una protección a largo plazo, mientras que la inducida por la vacunación es de una duración limitada (Bass, J.W. et al. 1987. Pediatr. Infect. Dis. J. 6:141-144; Jenkinson, D. 1988. Br. Med. J. 296:612-614). Las razones de esta diferencia no son claras, lo que ilustra la falta de conocimientos en lo referente a los mecanismos inmunitarios implicados en cada caso. Una de las explicaciones potenciales se basa en una mejor inducción de una memoria inmunológica a nivel del tracto respiratorio después de una infección, comparada con la obtenida después de una inmunización parenteral. Además, una respuesta celular T de tipo Th1, que podría desempeñar una función importante en la inmunidad protectora, se induce tras la infección natural, mientras que la inmunización con la vacuna acelular se traduce más bien en una fuerte respuesta Th2 (Mills, K.H.G. et al. 1993. J. Med. Microbiol. 39:163-164). Por último, la infección estimula la producción de IgA contra los antígenos de B. pertussis en el suero y en las secreciones, mientras que estos anticuerpos se detectan raramente en los individuos vacunados (Shahin, R. et al. 1992. In J.E. Ciardi et al. Eds. Genetically Engineered Vaccines. Plenum Pres N.Y.).

El conjunto de estas observaciones deja pensar que una protección de larga duración contra la tos ferina se obtendría más mediante una vacunación con la ayuda de bacterias vivas atenuadas administradas a nivel de las mucosas respiratorias, puertas de entrada naturales durante la infección por B. pertussis. Trabajos anteriores han mostrado que la inmunización de ratones con unas cepas vivas atenuadas, espontáneas (Vesselinova-Jenkins, C.K. 1985. Dev. Biol. Stand. 61:517-524) o aroA (Roberts, F. et al. 1990. Infect. Immun. 58:732-739), de B. pertussis protege contra una segunda infección. Sin embargo, estas cepas adolecen del inconveniente de estar mal caracterizadas y conservar una cierta toxicidad, o de haber perdido en gran parte su capacidad de colonización y necesitar así varias administraciones para inducir una inmunidad protectora eficaz.

La toxina de B. pertussis es una proteína oligomérica compuesta por cinco sub-unidades denominadas S1 a S5. Se puede sub-dividir en dos grandes campos, denominados el protómero A (compuesto por S1) y el oligómero B (compuesto por S2 a S5). El oligómero B es responsable de la interacción de la toxina con sus receptores en la superficie de las células dianas, y el protómero A (o S1) se inyecta en la célula diana y expresa en ella una actividad enzimática de ADP-ribosil-transferasa (Tamura et al., Biochemistry 21, 5516-5522, 1982). Se han clonado y secuenciado los genes que codifican las cinco sub-unidades (Locht y Keith, Science 232, 1258-1264, 1986) y se ha establecido la estructura cristalina (Stein et al., Structure 2, 45-47, 1994). Se han descrito varias mutaciones en el gen de la toxina como responsables de la desactivación genética de esta molécula. Estas mutaciones pueden encontrarse en el gen de S1 (para repaso véase Locht y Antoine. Biochimie 77, 333-340, 1995) y/o en los genes que codifican el oligómero B (véase como ejemplo Lobet et al. J. Exp. Med. 177, 79-87, 1993). La toxina se puede evidenciar mediante reactividad inmunológica con unos anticuerpos policlonales o monoclonales, tales como por ejemplo el anticuerpo 1B7 mencionado a continuación, o mediante su actividad biológica, tal como la actividad sobre las células "Chinese Hamster Ovary" tal como se ha descrito por Hewlett et al. (Infect. Immun. 40,1198-1203,1983).

\newpage

La FHA es la adhesina principal producida y segregada por B. pertussis (para repaso véase Locht et al., Mol. Microbiol., 9, 653-660, 1993). Se ha clonado el gen de estructura de la FHA, denominado fhaB, (Brown, D.R. et al. 1987. Infect. Immun. 55:154-161; Relman, D.A. et al. 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86:2637-2641; Delisse-Gathoye, A.M. et al. 1990. Infect. Immun. 58:2895-2905) y codifica para un precursor (FHAB) de aproximadamente 367 kDa. La forma madura (220 kDa) corresponde a los dos tercios N-terminales de FHAB y posee una estructura denominada "en horquilla" (Makhov et al., J. Mol. Biol., 241, 110-124, 1994). Aunque la parte C-terminal de FHAB no esté presente en la forma madura, ésta posee unas características interesante tales como varias regiones consideradas ricas en prolina y un sitio RGD. Además, esta parte C-terminal del precursor parece desempeñar una función importante en la secreción de la FHA. Corriente abajo de la región N-terminal de la FHA se encuentran dos regiones repetidas, respectivamente A y B, seguidas por un sitio sensible a la proteolisis y por una secuencia RGD. El sitio de maduración de FHAB se sitúa aproximadamente a 1.000 aminoácidos corriente abajo de esta secuencia RGD. El dominio N-terminal de FHAB desempeña una función esencial en la secreción de la proteína madura puesto que una deleción en fase de esta región parece inhibir totalmente la biogénesis de la FHA. La secreción de la FHA depende de una proteína accesoria denominada FhaC, presente a nivel de la membrana externa de B. pertussis. Esta proteína está codificada por el gen FhaC localizado corriente abajo de FahB y separado de este último mediante otros tres genes, fimB, fimC y fimD, que codifican para las fimbrias. Se ha propuesto un mecanismo de secreción de la FHA que implica una escisión y después una modificación de la parte N-terminal de FHAB, seguida de una interacción entre esta región y la proteína accesoria FHAC.

La variedad de los mecanismos de fijación de la FHA permite la adherencia de B. pertussis a numerosos tipos de células eucariotas. Aunque la toxina de B. pertussis está implicada en la adherencia de la bacteria a las células epiteliales del tracto respiratorio, la FHA desempeña una función preponderante en esta interacción. La FHA puede interactuar con unos glucoconjugados y el dominio de reconocimiento de los carbohidratos se ha identificado en la región de la FHA delimitada por los aminoácidos 1141 a 1279, que correspondía al bucle de la estructura "en horquilla" que contiene ya el sitio RGD en posición 1097-1099. La FHA es asimismo la adhesina principal implicada en el mecanismo de adherencia de B. pertussis a las células epiteliales no ciliadas. Una actividad de fijación de esta molécula sobre la heparina, glicosaminoglicano sulfatado, presente en cantidad no despreciable en el mucus bronquial así como en la matriz extracelular y en la superficie de numerosas células epiteliales, es responsable de la adherencia de la bacteria sobre estas células. Unos estudios recientes ponen en evidencia un sitio de fijación a la heparina específico localizado en la región N-terminal de la FHA, probablemente en la región comprendida entre los aminoácidos 442 y 863 (Hannah et al., Infect. Immun, 62, 5010-5019, 1994).

Además de esta actividad de adherencia sobre las células epiteliales y no ciliadas, la FHA es capaz de enlazarse específicamente a CR3 (CD11b/CD18, aMb2) presente sobre los macrófagos y los monocitos (Relman et al., Cell, 61, 1375-1382, 1990). Esta fijación de B. pertussis, a través de la FHA, al CR3 permite la internalización de las bacterias en los macrófagos por una vía que no genera ningún catabolismo oxidativo.

Debido a su importancia en la adherencia de B. pertussis a diferentes tipos celulares, se ha considerado la FHA como un antígeno principal para la vacunación contra la tos ferina. La administración de una vacuna celular a unos ratones o a niños conlleva la producción de anticuerpos anti-FHA en su suero. Además, la vacunación de niños de 18 meses con una vacuna acelular induce unas proporciones elevadas de anticuerpos anti-FHA así como una respuesta celular T específica. Estas características inmunes se vuelven a encontrar en las personas convalecientes después de una tos ferina.

Sin embargo, el perfil isotópico de la respuesta anti-FHA en niños que han recibido la vacuna celular difiere del de los individuos que padecen tos ferina. Mientras que la proporción de inmunoglobulina G (IgG) sérica específica es similar, la respuesta IgA2 anti-FHA es más importante en los enfermos que en las personas vacunadas. Esta diferencia es todavía más marcada a nivel de las secreciones nasofaríngeas y de la saliva en las que se observa un aumento de la proporción de IgA anti-FHA en la mayoría de los enfermos varias semanas después del inicio de los síntomas. De manera similar, se encuentran unas proporciones elevadas de IgA anti-FHA en las secreciones nasales de ratones infectados con la cepa virulenta de B. pertussis, en un periodo que alcanza hasta 26 semanas después de la infección. Se puede obtener asimismo una respuesta inmune, al mismo tiempo IgAs e IgG, contra la FHA en las vías respiratorias del ratón después de la vacunación intranasal con la FHA purificada.

Se han localizado sobre la FHA unos epítopos de células B y T potencialmente protectores. Así, se ha determinado una región inmunodominante en la región C-terminal de la FHA madura. Es reconocida por las células B murinas y por los linfocitos T CD4+ humanos que reconocen asimismo la parte N-terminal de la FHA.

Se han descrito unas proteínas de fusión recombinantes que comprenden una parte de la FHA y unos péptidos heterólogos en la solicitud FR 94 04 661 (nº de publicación 2.718.750) (INSTITUT PASTEUR, INSTITUT PASTEUR DE LILLE, INSERM). En esta solicitud, se preparan y expresan en unos cultivos celulares, unos ADN recombinantes que contienen una secuencia que codifica para un polipéptido heterólogo, fusionada en el mismo marco de lectura con una secuencia que codifica para una parte por lo menos del precursor de la FHA, en particular unos cultivos de Bordetella detoxificados o atenuados.

Uno de los objetivos de esta solicitud es la exposición del péptido recombinante en la superficie de células procariotas, en particular con fines de vacunación. Se observará que la detoxificación, o la atenuación, de células recombinantes se menciona sólo a título accesorio, y que por otro lado ningún ejemplo o ningún modo de realización particular ilustran esta eventualidad. En particular, esta solicitud no precisa de qué manera se detoxifican o atenúan las
células.

Se desprende por lo tanto del análisis del estado de la técnica que se conocían unos medios de vacunación contra la tos ferina, pero que inducían unos efectos secundarios.

El solicitante se ha dedicado por lo tanto a encontrar unos medios de vacunación contra la tos ferina, pero también contra otros agentes patógenos, desprovistos de efectos secundarios, fáciles de utilizar y que se pueden preparar con un bajo coste.

Ha demostrado en primer lugar de manera sorprendente, que la administración intranasal de una cepa desprovista del gen de la toxina de B. pertussis induce una producción elevada de anticuerpos dirigidos contra la hemaglutinina filamentosa (FHA), y que es posible así estimular la respuesta inmunitaria contra un antígeno heterólogo fusionado con la FHA.

Ha demostrado por otro lado que la FHA integrada en unos liposomas que contienen otros péptidos que presentan unos epítopos, permite mejorar la fijación de estos liposomas sobre las mucosas de las vías respiratorias.

Por último, ha demostrado que la FHA presentaba de manera general unas propiedades inmunoestimulantes.

La presente invención se refiere por lo tanto en primer lugar a una cepa de Bordetella pertussis deficiente en la producción de toxina PTX, mediante eliminación, deleción parcial o mutación del gen de la toxina PTX y que expresa y expone en su superficie una proteína híbrida que comprende por lo menos una parte de la hemaglutinina filamentosa (FHA) y por lo menos una parte de una proteína heteróloga frente a FHA.

De manera ventajosa, la proteína heteróloga que constituye una parte de la proteína híbrida, comprende por lo menos un epítopo de una proteína susceptible de ser expresada por unos agentes patógenos durante afecciones de las vías respiratorias superiores o inferiores.

Así, dicha proteína híbrida puede comprender una parte de la proteína FHA y una parte de la proteína Sm28GST de Schistosoma mansoni. Esta proteína particular se puede expresar en una cepa de la especie B. pertussis, y ser en particular la cepa BPNX depositada con el nº I-1770 el 8 de octubre de 1996 en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos del Instituto Pasteur (CNCM).

Una cepa según la presente invención se puede obtener mediante la eliminación del gen de la toxina del genoma de una cepa virulenta que expresa dicha proteína híbrida, o mediante deleción parcial o mediante mutación con el fin de producir una toxina inactiva.

La eliminación puede efectuarse mediante cualquier método conocido por el experto en la materia, y en particular cruzando la cepa virulenta con una cepa movilizante, y después seleccionando, con la ayuda de marcadores adaptados en función de las cepas las células que han perdido el gen. Dicha pérdida de la capacidad de la cepa virulenta para expresar la toxina resulta de un doble acontecimiento de recombinación homóloga entre la cepa virulenta y un plásmido de la cepa movilizante. El experto en la materia puede referirse para la obtención de cepas atenuadas al método descrito por Antoine y Locht (1990, Infect. Immun, 58, 1518-1526).

Las características de las cepas deficientes en la producción de toxina, así seleccionadas, se pueden verificar mediante diferentes técnicas, en particular mediante la transferencia western.

Las cepas virulentas que expresan la proteína híbrida se pueden obtener mediante las técnicas conocidas por el experto en la materia, y en particular ser obtenidas como se describe en la solicitud FR-94.04.661 mencionada anteriormente. Los ADN recombinantes que comprenden por un lado una secuencia que codifica para un péptido heterólogo y, por otro lado, una secuencia para una parte de la FHA se obtienen mediante los métodos conocidos por el experto en la materia, y en particular tal como se describe en el ejemplo V de la solicitud FR 94.04.661. Este ejemplo llega a la fusión de la región 190-211 de la glutatión-S-transferasa de 28 kDa (Sm28GST) de Schistosoma mansoni, con la proteína FHA truncada. Se seleccionan los ADN recombinantes que codifican para las proteínas híbridas, se verifica la secuen-
cia según unos métodos conocidos por el experto en la materia, y después se transfieren en unas células de Bordetella.

El experto en la materia podrá referirse eventualmente, para la realización de la presente invención, a unos manuales generales que tratan de estas técnicas, y en particular al siguiente manual: Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning: Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor New York, USA, o a una de sus recientes reediciones.

La proteína heteróloga, cuya secuencia está comprendida en la proteína híbrida, puede ser cualquier secuencia proteína antigénica, en particular unos antígenos de Bordetella, de Shigella, de Neisseria, de Borrellia, unas toxinas o toxoides diftéricos, tetánicos o coléricos, unos antígenos víricos, en particular de la hepatitis B, de la hepatitis C, del poliovirus o de VIH, o unos antígenos parasitarios tales como los de los Plasmodium, de los Schistosoma o de los toxoplasmas. También puede comprender un epítopo de una proteína susceptible de ser expresada mediante unos patógenos durante infecciones mucosales o durante infecciones sistémicas.

Dichas cepas se pueden usar para la vacunación del ser humano o de animales contra de diversos agentes patógenos. Se puede administrar en particular por vía intranasal.

La presente invención se refiere por lo tanto además a unos medicamentos y a unas vacunas que contienen dichas cepas, o a unas composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad farmacológicamente eficaz de dichas cepas, y eventualmente uno o varios excipientes farmacológicamente compatibles.

Otro objeto de la presente invención consiste en el uso de dichas cepas para la preparación de un medicamento o de una vacuna para el tratamiento de las afecciones de las vías respiratorias inferiores o superiores, de las infecciones mucosales o de las infecciones sistémicas.

Se observará que las cepas según la presente invención presentan unas actividades sorprendentes. En efecto, tal como lo muestran los siguientes ejemplos, las cepas que expresan unas proteínas híbridas y cuyo gen de la toxina se ha eliminado, inducen una producción de anticuerpos mucho más elevada que la obtenida con la cepa parental virulenta, cuando estas dos cepas se administran por vía intranasal. La administración intranasal, por ejemplo mediante vaporización nasal, permite eliminar los riesgos de contaminación relacionados con una inyección a través de la piel y evita asimismo la destrucción de las vacunas administradas por vía oral en el entorno ácido del estómago.

La presente solicitud describe asimismo unos liposomas que comprenden por lo menos una parte de la proteína FHA, así como por lo menos una proteína heteróloga a la proteína FHA.

Dicha proteína heteróloga puede ser la que compone la proteína híbrida descrita anteriormente. Así, puede comprender por lo menos un epítopo de una proteína susceptible de ser expresada durante afecciones de las vías respiratorias superiores o inferiores. Dichos liposomas se pueden obtener de una manera conocida por el experto en la materia, mediante un procedimiento que comprende la mezcla de la FHA, de la proteína heteróloga y de los lípidos, y después la rehidratación de la película lipídica. Se pueden usar con fines terapéuticos para la preparación de medicamentos y de vacunas para la estimulación de la respuesta inmunitaria frente a un epítopo determinado.

La presente solicitud se refiere por lo tanto a unos medicamentos que contienen dichos liposomas, así como a unas composiciones farmacéuticas que contienen unas cantidades farmacológicamente eficaces de dichos liposomas, así como eventualmente unos excipientes farmacéuticamente compatibles.

La fijación de la FHA en la superficie de los liposomas presenta la ventaja de apuntar hacia el tejido mucoso la administración de la proteína heteróloga. La FHA presentará así dos acciones: por un lado una acción de apuntado de los liposomas, debido a una propiedad de adherencia particular frente a los tejidos mucosos, y por otro lado unas propiedades inmunoestimulantes que permitirán aumentar la respuesta inmune frente a unos antígenos de la proteína heteróloga.

La presente invención se ilustra, no obstante, sin por ello estar limitada, mediante los ejemplos siguientes.

La figura 1A ilustra la colonización de los pulmones de ratones OF1 mediante las cepas de B. pertussis BPSM (PTX^{+}, FHA^{+}), BPRA (PTX^{-}, FHA^{+}), y BP347 (PTX^{-}, FHA^{-}, PRN^{-}, Fim^{-}, AcHly^{-}).

La figura 1B ilustra por su parte, la colonización de los pulmones por las bacterias BPSM de ratones, previamente inmunizados intranasalmente mediante las cepas de la figura 1A o mediante S. typhimurium. Tres horas después de la infección, se han sacrificado 3 ratones por grupo, y se ha estimado el número de B. pertussis viables por pulmón. Los demás grupos de ratones se analizaron una o varias semanas después de la infección tal como se muestra en la figura. Las barras representan las desviaciones estándares de la media (SEM).

La figura 2A representa unos pulmones de ratones OF1 sanos (1) y 7 días después de la administración nasal de 5 x 10^{6} bacterias de las cepas BPSM (2), BPRA (3).

Las figuras 2B a 2D son unas secciones de pulmones 14 días después de la administración intranasal de 5 x 10^{6} bacterias de las cepas BPSM (2C), BPRA (2D); el control corresponde a unos ratones sanos (2B). La coloración de los núcleos celulares se obtiene mediante tratamiento con hematoxilina.

La figura 3 ilustra la respuesta IgG anti-FHA 28 días después de la administración intranasal de ratones OF1 por las cepas BPSM, BPRA y BP347, y 28 días después de la segunda infección por BPSAM (día 63). La evaluación de la proporción de anticuerpos se determinó mediante ELISA para tres ratones por grupo y por tiempo.

Las figuras 4A a 4D representan las cinéticas de la distribución isotópica anti-FHA. Se han analizado los sueros de tres ratones por tiempo para la presencia de anticuerpos anti-FHA de isotipo IgG1 (4A), IgG2a (4B), IgG2b (4C) e IgA (4D) mediante la técnica ELISA.

Las figuras 5A y 5B representan las cinéticas de la respuesta sérica IgG2a contra los antígenos de B. pertussis. Se han analizado los sueros de tres ratones por tiempo para la presencia de anticuerpos anti-BP347 (5A) y anti-BPSM (5B) mediante la técnica ELISA.

La figura 6 representa la cinética de la respuesta sérica IgG anti-FHA después de la administración de cepas de B. pertussis BPSM (PTX^{+}), BPRA (PTX^{-}) y BPDS1 (S1-; oligómero B+). Se han determinado las proporciones de anticuerpos mediante ELISA para tres ratones por grupo y por tiempo.

La figura 7 ilustra el análisis mediante transferencia western de los sobrenadantes de cultivo de las cepas no-recombinantes BPSM (PTX^{+}) (pocillo 4), BPRA (PTX^{-}) (pocillo 1) y de las cepas recombinantes que expresan la proteína FHA-Sm28GST BPGR60 (PTX^{+}) (pocillo 3) y BPNX (PTX^{-}) (pocillo 2) usando el anticuerpo monoclonal 1B7 dirigido contra la sub-unidad S1 de PTX. El pocillo 5 corresponde al marcador de peso molecular.

La figura 8 representa la cinética de la respuesta sérica IgG anti-Sm28GST después de la administración intranasal a ratones OF1 de cepas recombinantes de B. pertussis BPGR60 (PTX^{+}) y BPNX (PTX^{-}).

La figura 9 es una inmunotransferencia (immunoblot) de diferentes preparaciones liposomales (Sm28GST sola, pocillos 6 y 13, Sm28GST con tres dosis diferentes de FHA 60 \mug/ml (pocillos 3 y 10), 6 \mug/ml (pocillos 4 y 11) y 0,6 \mug/ml (pocillos 5 y 12)) analizadas después de la transferencia de un gel SDS-PAGE sobre nitrocelulosa. Los pocillos 1 y 8 corresponden a la Sm28GST no incluida en unos liposomas. Los pocillos 2 y 9 corresponden a la FHA no incluida en unos liposomas. El pocillo 7 es el del marcador de peso molecular.

Los pocillos 1 a 6 se han revelado con un anticuerpo específico para la FHA, y los pocillos 8 a 13 con un anticuerpo específico para la Sm28GST (190-211). La Sm28GST dimerizada migra indiferentemente en presencia de fosfolípidos. La presencia de FHA no modificó la cantidad de Sm28GST incorporada a los liposomas.

Las figuras 10A y 10B ilustran respectivamente las respuestas séricas IgG (H+L) anti-Sm28GST y anti-FHA (pool de sueros 1/40, revelación a 1 hora en ABTS). Se han practicado dos instilaciones por vía nasal el D1 y D14. Se han analizado los sueros el D1 y D27, y a D36 y D43 después de una infección por B. pertussis que tuvo lugar el D28.

Las figuras 11A y 11B ilustran respectivamente las respuestas séricas IgA anti-Sm28GST y anti-FHA (suero de grupo 1/40, revelación en OPD). Dos instilaciones por vía nasal el D1 y D4. Se han analizado los sueros el D-1 y D27, y el D36 y D43 después de una infección por B. pertussis que tuvo lugar el D28.

Ejemplo 1 Protección contra una infección por B. pertussis previamente inmunizada con diferentes cepas deficientes en la producción de uno o de varios factores de virulencia

Se ha usado la cepa salvaje de B. pertussis PBSM (Menozzi, F.D. et al. 1994, Infect. Immunol., 62, 769-778) como referencia para la protección contra una segunda infección con BPSM. Se ha comparado la eficacia de la cepa BPRA (Antoine R. et al. 1990. Infect. Immun. 58:1518-1526), deficiente en la producción de la toxina de pertussis (PTX) con la cepa BP347, que posee una inserción del transposón Tn5 en su genoma que conlleva una incapacidad para expresar los factores de virulencia tales como la PTX, la toxina adenilato-ciclasa (Ac-Hly), las fimbrias, la pertactina y la FHA (Weiss, A.A. et al. 1983. Infect. Immun. 42:33-41). Se ha administrado una cepa de Salmonella typhimurium aroA (Hoiset, S.K. et al. 1981. Nature 291:238-241) por vía intranasal a un grupo de ratones como control de infección por unas bacterias Gram negativas. Se han instilado 5 x 10^{6} bacterias B. pertussis en suspensión en PBS estéril (células rascadas de un cultivo sobre medio sólido, Bordet Gengou con sangre desfibrinada de cordero (BG); Bordet, J. y Gengou, O. 1906. Ann. Institut Pasteur (Paris). 20:731-741) nasalmente a razón de 25 \mul por narina, a unos ratones OF1 (cepa no pura, ratones hembras de 4 semanas) bajo anestesia con pentobarbital. Se han centrifugado las bacterias S. typhimurium que proceden de un cultivo una noche a 37ºC en medio líquido LB durante 10 min a 6.000 rpm, y se ha resuspendido el residuo en PBS estéril a una concentración de 2 x 10^{3} bacterias/ml. Entonces, los ratones se han instilado con 50 \mul de la disolución bacteriana. Se han extraído los pulmones de 3 ratones 3 horas después de la inyección, y después 7, 14, 21, 28 y 35 días después de la inyección. Entonces, se han homogeneizado los pulmones en 5 ml de PBS estéril, y después se han contado las bacterias 3 a 4 días después del esparcido de los triturados sobre un medio sólido BG que contiene 100 \mug/ml de estreptomicina y 25 \mug/ml de ácido nalidíxico (BGSN). Para simplificar, se ha usado el término "ratones X" para "ratones inmunizados X".

En un primer momento, se ha verificado la capacidad de las diferentes cepas atenuadas de B. pertussis a colonizar el tracto respiratorio de los ratones. Tal como lo muestra la figura 1A, el número de bacterias BPRA aumenta en los pulmones de los ratones durante los siete primeros días tras la instilación, y después caen durante las cuatro semanas siguientes, de la misma manera que la cepa salvaje BPSM, pero su cinética de eliminación es más rápida. La cepa BP347, deficiente en la producción de los factores de virulencia, es incapaz de multiplicarse durante la primera semana, y 14 días después de la inmunización, no se encuentra ninguna bacteria en los pulmones. Por último, S. typhimurium, microorganismo que coloniza el tracto gastrointestinal después de una infección por vía oral, se elimina rápidamente puesto que es incapaz de colonizar las mucosas de las vías respiratorias. Un grupo de ratones de control recibió intranasalmente 50 \mul de PBS estéril.

Se ha realizado una segunda infección intranasal con la cepa salvaje (5 x 10^{6} bacterias BPSM/50 \mul PBS) 35 días después de la inmunización nasal de los ratones con las diferentes cepas bacterianas. Los ratones de control PBS y los ratones S. typhimurium muestran una curva de colonización similar (figura 1B). En los animales BPSM y BPRA, el número de bacterias disminuye rápidamente después de la segunda infección mediante BPSM. Siete días más tarde, la cantidad de bacterias presentes en los pulmones de los ratones BPRA es 300 veces más baja que en los ratones PBS, y es parecida a la observada en los ratones BPSM. Por el contrario, durante la primera semana tras la infección, las bacterias BPSM parecen colonizar los pulmones de los ratones BP347 de la misma manera que los pulmones de los ratones PBS. Sin embargo, una semana más tarde, los animales BP347 presentan una reducción del número de bacterias del orden de 100 veces en comparación con el grupo PBS. Veintiún días después la segunda infección, no se ha detectado ninguna bacteria en los pulmones de los ratones BPSM, mientras que se observa una disminución del orden de 130 veces para los ratones BPRA y de 12 veces para los ratones BP347 en comparación con los ratones PBS. Cuatro semanas después de la infección, se alcanza la eliminación casi total de las bacterias en los ratones BPRA, mientras que existen todavía en los ratones PB347.

Estos resultados indican que únicamente la cepa BPRA, deficiente en la producción de PTX, se comporta in vivo de manera similar a la cepa salvaje y que una primo-infección por una de las dos cepas protege contra una colonización eficaz de las mucosas respiratorias por la cepa salvaje.

Ejemplo 2 Análisis histológico de la inflamación a nivel de los pulmones inducida por la administración intranasal de una cepa de B. pertussis deficiente en la producción de la toxina de pertussis

Se inmunizan los ratones con 5 x 10^{6} bacterias (mismo protocolo de inmunización que el descrito en el ejemplo 1) que proceden de la cepa salvaje BPSM o de la cepa BPRA (PTX-). Se verifica el número de bacterias administradas mediante extracción de los pulmones 3 horas después de la administración intranasal y mediante el recuento de las bacterias después del esparcido de los triturados pulmonares. Siete días después de la administración, la observación muestra unos pulmones de ratones BPSM voluminosos y hemorrágicos y tienen un volumen idéntico a los de los ratones de control (figura 2a).

Para analizar la intensidad de la infiltración celular, se extraen los pulmones 14 días después de la administración de una u otra de las cepas de B. pertussis. Se fijan los pulmones desde la extracción en paraformaldehído al 4%, durante una noche a 4ºC. Después del lavado, se deshidratan los órganos mediante baños sucesivos de etanol (Merck) con unas concentraciones crecientes, y después se ponen en contacto con 1-butanol (Merck) durante 24 horas a 4ºC para mejorar la infiltración de la parafina. La inclusión se realiza entonces mediante infiltración de la parafina (Paraplast Lancer) durante 4 a 5 horas a 56ºC. Las secciones sobre láminas de 6 \mum de grosor se realizan mediante microtomo. Previamente a la marcación, se desparafinan las secciones con tolueno (Merck) y se rehidratan. La rehidratación de las secciones, realizada mediante unos baños de alcohol en concentraciones decrecientes, se termina mediante un baño de tampón TBS (10 mM de Tris HCl, 150 mM de NaCl, pH 7,4). La coloración de los núcleos celulares se efectúa por contacto durante 10 min con hematoxilina, seguido de un aclarado de las láminas durante 40 min con agua corriente. Las fotografías de las secciones se realizan con un objetivo x10. Se observa una infiltración celular a nivel de los pulmones al mismo tiempo en los ratones BPSM y BPRA, siendo los pulmones de un ratón sano usados como control negativo (figura 2b). Sin embargo, mientras que la infiltración celular es ligera y está limitada a la periferia de las vías superiores para los ratones BPRA (figura 2d), aparece masiva y ha llegado hasta los alvéolos de los pulmones para los ratones PBSM (figura 2c).

Estas observaciones indican que la cepa BPRA, deficiente en la producción de PTX, induce una reacción inflamatoria a nivel pulmonar mucho más baja que la provocada por la administración nasal de la cepa salvaje BPSM.

Ejemplo 3 Análisis de la respuesta inmune sérica anti-FHA después de la administración intranasal de las diferentes cepas bacterianas

Se determinan los títulos de la respuesta IgG total anti-FHA en el suero de los ratones 28 días después de la administración intranasal de las cepas de B. pertussis (BPSM, BPRA, BP347), así como un mes después de una segunda infección con BPSM (mismo protocolo que el descrito en el ejemplo 1). Se sangran los ratones mediante punción a nivel del plexo retroorbital, y se conservan los sueros a -20ºC hasta su análisis mediante la técnica ELISA.

Durante el intervalo de tiempo de 28-63 días, los títulos de la respuesta IgG anti-FHA se han duplicado en cada grupo de ratones inmunizados mediante las diferentes cepas de B. pertussis (figura 3). De manera interesante, los ratones BPRA presentan una respuesta anti-FHA 4 veces superior a la observada en los ratones BPSM, diferencia observada 28 días después de la inmunización o después de la segunda infección por BPSM. Estos resultados se vuelven a encontrar indistintamente cuando los ensayos ELISA se efectúan contra FHA purificada a partir de la cepa BPSM o BPRA.

Con el fin de determinar si las diferencias en la respuesta sérica anti-FHA de los ratones BPSM y BPRA eran únicamente cuantitativas y/o cualitativas, se ha realizado el perfil de la respuesta anti-FHA mediante ELISA.

El análisis de las cinéticas de respuesta específica muestra, 14 días después de la administración intranasal, la presencia de IgG1 (figura 4a), de IgG2a (figura 4b) y de IgG2b (figura 4c) en el suero de los ratones BPRA, mientras que se detectan unos IgG2a y unos IgG2b en los ratones BPSM únicamente un mes después de la inmunización. En estos dos grupos de ratones, la segunda infección por BPSM ha inducido un aumento de la respuesta IgG2a e IgG2b anti-FHA. Por otro lado, mientras que se observa un fuerte aumento de la respuesta IgG1 específico en los ratones BPRA, se detecta una producción baja y transitoria en los ratones BPSM una semana después de la segunda infección. Un mes después de esta infección, se detecta una disminución de la proporción de IgG1 y de IgG2b en el suero de los ratones BPRA mientras que la proporción de IgG2a sigue siendo estable. El análisis de la respuesta IgA sérica anti-FHA muestra, una semana después de la segunda infección por BPSM, una producción elevada de IgA específica en el suero de los ratones BPSM (figura 4d). Una semana más tarde, se alcanza este nivel de IgA sérica en los ratones BPRA, seguido 7 días más tarde por la detección de IgA anti-FHA en el suero de los ratones BP347 y de los ratones S. typhimurium.

Estas cinéticas de distribución de la respuesta isotípica anti-FHA demuestran por lo tanto una respuesta sérica específica más precoz y más elevada en el suero de los ratones BPRA (PTX-) en comparación con la encontrada en los ratones BPSM (PTX+).

Una de las hipótesis que podría explicar estos resultados sería que la cantidad de FHA expresada en la superficie y/o segregada por la cepa BPRA sea superior a la producida por la cepa salvaje BPSM. Se ha realizado un análisis mediante inmunotransferencia con la ayuda de un anticuerpo policlonal de rata anti-FHA, sobre unos sobrenadantes de cultivo y unos lisados celulares que proceden de un cultivo líquido de las diferentes cepas de B. pertussis en un medio Stainer-Scholte (Stainer, D.W., y Scholte, M.J. 1971. J. Gen. Microbiol. 63:211-220) que contiene 1 g/l de 2,6-O-dimetil-\beta-ciclodextrina (Imaizumi, A. et al. 1983. Infect. Immun. 41:1138-1143). Este estudio demostró unas cantidades similares de FHA producidas por la cepa BPRA y BPSEM.

Una actividad potencialmente inmunorreguladora de la PTX, que actuaría como un elemento inmunosupresor, podría ser el origen de la baja intensidad de la respuesta anti-FHA en los ratones BPSM (PTX+) comparada con la obtenida en los ratones BPRA (PTX-). Un estudio de la respuesta IgG2a, más sensible que la respuesta IgG total, contra los antígenos totales de las bacterias BP347 y BPSM se realizó sobre los sueros de cada grupo de ratones. Para preparar los antígenos totales, las bacterias han sido estriadas sobre unas cajas BGS, y después de 48 horas de cultivo, se resuspendieron a una concentración de 2,5 x 10^{9} bacterias/ml en PBS que contiene 0,5 mM de PMSF y 1 mM de EDTA. La suspensión celular se lisa después mediante dos pasos sucesivos en una prensa de French. Las proporciones de anticuerpos dirigidos contra los antígenos de la cepa BP347 (anticuerpos anti-BP347) son similares en los sueros de los ratones BPSM y BPRA (figura 5a), mientras que se observan ligeras diferencias en cuanto a los niveles de la respuesta anti-BPSM con una respuesta más elevada en los ratones BPRA, probablemente relacionada con la proporción de IgG2a anti-FHA (figura 5b). Además, mientras que el nivel de los anticuerpos anti-BP347 disminuye progresivamente en el suero de los ratones BPSM y BPRA, la respuesta IgG2a anti-BPSM continúa aumentando por lo menos hasta 28 días después de la segunda infección por BPSM, de manera paralela a la respuesta IgG2a anti-FHA.

Ejemplo 4 Estudio de la función de la actividad enzimática de PTX sobre la respuesta sérica anti-FHA

La PTX es una proteína oligomérica compuesta por 5 sub-unidades, denominadas S1 a S5. Esta holotoxina posee una estructura de tipo A-B en la que A corresponde a la sub-unidad S1 que expresa la actividad enzimática ADP-ribosiltransferasa y NAD glucohidrolasa (Katada. T. et al. 1983. Arch. Biochem. Biophys. 224:290-298). Esta proteína posee 2 cisteínas que forman un puente disulfuro cuando la toxina es segregada por la bacteria. Una de estas cisteínas (cis-41) está situada en la proximidad del sito de fijación del NAD sobre la enzima (Locht, C. et al. 1990. J. Biol. Chem. 265:4552-4559) y es esencial para la estabilidad de la sub-unidad S1 en B. pertussis. Con el fin de determinar la función de la actividad enzimática de PTX sobre la respuesta anti-FHA, un grupo de ratones recibió 5 x 10^{6} bacterias de una cepa de B. pertussis que contiene el gen que codifica la toxina integrada en el cromosoma y denominada BPRA(pPt2), o BPDS1, en la que se suprimió el residuo cis-41 de S1 (Antoine, R. et al. 1990. Infect. Immun. 58:1518-1526). La sub-unidad S1 es indetectable en el sobrenadante de cultivo de esta cepa, pero el oligómero B, componente que permite la fijación a las células dianas, se puede ensamblar y segregar. La capacidad de la cepa BPDS1 para colonizar el tracto respiratorio de los ratones así como la infiltración celular observada a nivel pulmonar 14 días después de la administración es idéntica a la de la cepa BPRA. Se ha analizado la cinética de la respuesta sérica anti-FHA después de la administración de la cepa BPDS1 por vía intranasal (5 x 10^{6} bacterias/50 \mul de PBS) durante 2 meses. La proporción observada de anticuerpo IgG anti-FHA de los ratones BPDS1 es similar a la de los ratones BPRA y superior a la detectada en el suero de los ratones BPSM (figura 6).

Estos resultados indican que la actividad enzimática de PTX está implicada en la reducción de la respuesta sérica contra la adhesina principal de B. pertussis, la FHA.

Ejemplo 5 Construcción cromosómica de una cepa recombinante deficiente en la producción de toxina de B. pertussis (BPNX) que expresa una proteína Sm28GST modificada de S. mansoni

Se ha construido una cepa recombinante atenuada de B. pertussis con el fin de verificar la correlación entre la deleción cromosómica del gen que codifica para PTX y el aumento de la respuesta anticuerpo sérico dirigida contra un antígeno heterólogo fusionada con la FHA después de la administración intranasal de esta cepa recombinante atenuada. El antígeno heterólogo modelo es una glutatión S-transferasa de 28 kDa de Schistosoma mansoni (Sm28GST) (Balloul, J.M. et al. 1987. Nature (Londres). 326:149-153).

Para eliminar el gen de PTX del genoma de la cepa virulenta BPGR60 (Sm^{R}, Gens, Nal^{R}) de B. pertussis, que expresa una Sm28GST modificada de S. mansoni en fusión con la FHA (Renault-Mongénie, G. et al. 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:7944-7949), se cruza ésta sobre un medio sólido BG con la cepa movilizante E. coli: S17-1 (pRIT13295) (Sm^{s}; Gen^{R}, Nal^{s}), que posee el plásmido pRIT13295 las regiones flanqueantes 5' y 3' del gen PTX (Antoine, Locht 1990 Infect. Immun. 58:1518-1526). Los acontecimientos de doble recombinación homóloga tienen lugar a nivel de las regiones flanqueantes de este gen. Después de la conjugación, las bacterias que han sufrido los dos acontecimientos de recombinación se seleccionan sobre unos medios selectivos tal como se ha descrito anteriormente (Antoine, y Locht, 1990. Infect. Immun. 58:1518-1526).

La conservación de la antigenicidad de la proteína de fusión FHA-Sm28GST y la pérdida de la capacidad de la cepa recombinante atenuada BPNX para expresar la PTX se verifican mediante transferencia western después de la separación de la fracción proteica procedente del sobrenadante de cultivo y la asociada a las células por SDS-PAGE sobre un gel al 10%. El reconocimiento de la proteína de fusión se realiza usando unos anticuerpos policlonales de ratas dirigidos contra la FHA y unos anticuerpos policlonales de ratas dirigidos contra el péptido 190-211 de la Sm28GST. La toxina se identifica en los sobrenadantes de cultivo de las cepas BPSM y BPGR60 con la ayuda de un anticuerpo monoclonal de los ratones 1B7 dirigida contra S1 (Sato et al., Infect. Immun., 46, 422-428, 1984) mientras que no se detecta en los sobrenadantes de las cepas BPRA y BPNX (figura 7).

Se ha depositado la cepa BPNX el 8 de octubre de 1996 a la CNCM con el nº I-1770.

Ejemplo 6 Inmunogenicidad de la cepa recombinante BPNX

Se ha verificado la colonización de la cepa recombinante BPNX en el ratón OF1 (tal como se ha descrito para la cepa BPRA en el ejemplo 1) y muestra una cinética de colonización de los pulmones idéntica a la de la cepa salvaje de B. pertussis.

La intensidad de la respuesta sérica IgG anti-Sm28GST obtenida en unos ratones que han recibido 5 x 10^{6} bacterias/50 \mul por vía intranasal de la cepa BPNX se compara con la obtenida después de la administración de la cepa BPGR60. Se efectúa una reestimulación de los ratones, 2 meses después de la inmunización con las cepas recombinantes de B. pertussis, mediante administración intranasal de 20 \mug de antígeno recombinante (rSm28GST producida en E. coli) en PBS. La cinética de la respuesta inmune sérica se efectúa sobre unos grupos de 3 a 5 ratones para cada tiempo.

Mientras que no se obtiene ninguna respuesta sérica específica de la Sm28GST después de la administración nasal de la cepa recombinante virulenta BPGR60, se detectan unos IgG anti-Sm28GST a partir del 14º día después de la administración de la cepa recombinante atenuada BPNX, y su producción aumenta de manera continua hasta 35 días después de la administración (figura 8). Dos meses después de la inmunización, se observa una ligera disminución de esta proporción de anticuerpo sérico anti-Sm28GST en los ratones BPNX mientras que esta respuesta todavía no se detecta en los ratones BPGR60. En las semanas siguientes al recuerdo con la rSm28GST, se demuestra una producción de anticuerpos anti-Sm28GST en los ratones BPGR60, pero sigue siendo más baja que la obtenida en los ratones BPNX.

Estos resultados muestran por lo tanto una correlación entre la deleción cromosómica del gen que codifica para la PTX y el aumento de la respuesta anticuerpo sérico dirigida contra un antígeno heterólogo fusionado a la FHA. Para cantidades de bacterias similares, una sola administración por vía intranasal de una cepa recombinante atenuada de B. pertussis permite por lo tanto inducir una respuesta sérica específica del antígeno heterólogo fusionado a la FHA, mientras que era necesario un recuerdo con la cepa recombinante virulenta.

Ejemplo 7 Preparación de liposomas que contienen un antígeno de interés y que presentan en superficie la FHA

El antígeno usado es la enzima glutatión S-transferasa de S. mansoni, proteína de 28 kD, que induce una inmunidad protectora en el mamífero, reduciendo el número de gusanos adultos y disminuyendo la fecundidad de estos gusanos. Se ha usado el modelo Sm28GST como antígeno de interés para la mejora de estos liposomas.

El principio es fijar la FHA, adhesina principal de B. pertussis que posee por lo menos tres actividades de fijación con varios tipos celulares, en la superficie de los liposomas para que éstos se adhieran a las mucosas mediante este medio. Los resultados obtenidos muestran que la presencia de la FHA en la superficie de liposomas que contienen la Sm28GST induce un efecto dosis respuesta sobre la respuesta sérica específica de la Sm28GST. Este efecto sería debido al hecho de que la presencia de esta adhesina de B. pertussis en la superficie de los liposomas conlleva un aumento del número de partículas que alcanzan los sitios inductores. Por otro lado, se observa una homogeneización de la respuesta sérica específica después de la administración de estos liposomas Sm28GST/FHA.

Se han usado unos liposomas DPPC/DMPG (dipalmitoilfosfatidilcolina: dimiristoilfosfatidilglicerol) en una relación 9/1 formados mediante hidratación de preparaciones secas (Phillips; N. et al. 1996. Vaccine. 14:898-904). Se purificó la FHA a partir de sobrenadantes de cultivo de B. pertussis (cepa BPRA) mediante el paso sobre una columna de heparina. Se ha verificado que las propiedades observadas no se debían a la presencia de endotoxinas en esta preparación. Se han usado unos ratones OF1 (outbred) cuya heterogeneidad genética es la más representativa de lo que se puede observar en una población humana.

La administración de liposomas DPPC/DMPG que contienen Sm28GST a ratones OF1 ha permitido obtener una respuesta inmune sérica y segregadora específica de la Sm28GST.

Con el fin de observar un efecto de mejora de la respuesta inmune debida al uso de FHA en la superficie de los liposomas, se han determinado las condiciones sub-límites de obtención de una respuesta inmune con unos liposomas Sm28GST. La instilación nasal con 15 días de intervalo de liposomas preparados con diferentes dosis de Sm28GST (5 mg/ml; 1 mg/ml, 0,2 mg/ml) para una cantidad de 2 \mum de fosfolípidos por animal y por inyección ha mostrado que la cantidad de 1 mg/ml proporcionaba una respuesta inmune baja pero detectable.

Se han determinado asimismo las condiciones de preparación de los liposomas que permiten obtener la presencia de FHA en la superficie. La FHA posee unas secuencias hidrófobas que deberían permitirle insertarse fácilmente en los liposomas. Sin embargo, la adición de FHA a unos liposomas Sm28GST ya preparados no ha proporcionado resultados satisfactorios. Por el contrario, cuando se ha añadido la FHA a la disolución de Sm28GST para la rehidratación de la película lipídica y la preparación de liposomas, permitió obtener unos liposomas mixtos. La presencia de FHA y de Sm28GST en la superficie del liposoma se ha visualizado usando un anticuerpo policlonal contra la FHA, o un anticuerpo policlonal contra la Sm28GST.

Ejemplo 8 Aumento de la respuesta inmune en función de la cantidad de FHA

Se han inmunizado unos ratones OF1 mediante dos instilaciones con 15 días de intervalo (conteniendo 5 grupos una quincena de animales cada uno). Se ha inmunizado un grupo de control con PBS, se ha inmunizado un grupo con unos liposomas preparados con 1 mg/ml de Sm28GST. Los otros tres grupos comprendían unos liposomas preparados con 1 mg/ml de Sm28GST y respectivamente 0,6 \mug/ml; 6 \mug/ml; 60 \mug/ml de FHA. Se verificó mediante transferencia western después de la separación de la preparación liposomal mediante SDS-PAGE usando un gel al 12% que la cantidad de Sm28GST incorporada en los liposomas era idéntica que en los límites de resolución de la técnica, en ausencia o independientemente de la cantidad de FHA presente en la disolución de partida. El reconocimiento de las proteínas se realiza usando unos anticuerpos policlonales de ratas dirigidos contra la FHA, y unos anticuerpos policlonales de ratas dirigidos contra el péptido 190-211 de la Sm28GST (figura 9).

Se sangraron los ratones 2 semanas después de la última inyección. El análisis de los grupos de suero ha mostrado un aumento de la respuesta anti-Sm28GST IgG(H+L) directamente dependiente de la cantidad de FHA usada (figura 10). La respuesta anti-FHA IgG(H+L) se detectó únicamente en el grupo que comprende la dosis más alta de FHA (figura 10).

El análisis de los sueros individuales ha mostrado una homogeneización de la respuesta en el grupo que comprende una dosis alta de FHA (tabla). El análisis de los isotipos obtenidos ha demostrado una respuesta mixta: (presencia de IgG1, de IgG2a y de IgG2b). Las curvas obtenidas tienen el mismo perfil que la curva IgG(H+L) al mismo tiempo para la Sm28GST y para la FHA. Asimismo, se obtuvo una respuesta mixta para unos liposomas que contienen únicamente la Sm28GST. Por lo tanto, no se ha observado ningún efecto de polarización de la respuesta.

TABLA

1

Claims

1. Cepa de Bordetella pertussis deficiente en la producción de toxina PTX, mediante eliminación, deleción parcial o mutación del gen de la toxina PTX y que expresa y expone en su superficie una proteína híbrida que comprende por lo menos una parte de la hemaglutinina filamentosa (FHA) y por lo menos una parte de una proteína heteróloga frente a la FHA.

2. Cepa según la reivindicación 1, caracterizada porque la proteína heteróloga comprende por lo menos un epítopo de una proteína susceptible de ser expresada durante afecciones de las vías respiratorias superiores o inferiores.

3. Cepa según la reivindicación 1, caracterizada porque la proteína heteróloga comprende por lo menos un epítopo de una proteína susceptible de ser expresada por unos patógenos durante infecciones mucosales.

4. Cepa según la reivindicación 1, caracterizada porque la proteína heteróloga comprende por lo menos un epítopo de una proteína susceptible de ser expresada por unos patógenos durante infecciones sistémicas.

5. Cepa según la reivindicación 1, caracterizada porque dicha proteína híbrida comprende una parte de la proteína FHA y una parte de la proteína Sm28GST de Schistosoma mansoni.

6. Cepa BPNX según una de las reivindicaciones 1 y 5, caracterizada porque es la depositada con el nº I-1770 el 8 de octubre de 1996 en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos del Instituto Pasteur (CNCM).

7. Procedimiento de obtención de una cepa según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el gen que codifica para la toxina se elimina de la cepa virulenta que expresa la proteína híbrida o se suprime por lo menos parcialmente o se muta con el fin de producir una toxina inactiva.

8. Medicamento o vacuna que comprende una cepa según una de las reivindicaciones 1 a 6, u obtenida según la reivindicación 7.

9. Composición farmacéutica que contiene una cantidad farmacológicamente eficaz de una cepa según una de las reivindicaciones 1 a 6, u obtenida según la reivindicación 7, y eventualmente uno o varios excipientes farmacéuticamente compatibles.

10. Uso de una cepa según una de las reivindicaciones 1 a 6, u obtenida según la reivindicación 7, para la preparación de un medicamento o de una vacuna destinados al tratamiento de las afecciones de las vías respiratorias inferiores o superiores.

11. Uso de una cepa según una de las reivindicaciones 1 a 6, u obtenida según la reivindicación 7, para la preparación de un medicamento o de una vacuna destinados al tratamiento de las infecciones mucosales.

12. Uso de una cepa según una de las reivindicaciones 1 a 6, u obtenida según la reivindicación 7, para la preparación de un medicamento o de una vacuna destinados al tratamiento de las infecciones sistémicas.