ES2310037T3 - Metodo y dispositivo para separar magneticamente particulas seleccionadas, en particular, celulas biologicas. - Google Patents
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Abstract
Método para separar magnéticamente partículas objetivo de un tipo seleccionado a partir de una muestra con el fin de obtener una concentración de partículas objetivo de la muestra o un empobrecimiento de la muestra en cuanto a partículas objetivo, el cual está compuesto por los siguientes pasos: la obtención (en un contenedor 10) de una mezcla de muestra de dichas partículas magnéticas con una afinidad selectiva para marcar magnéticamente dichas partículas objetivo; la introducción de un líquido tampón a través de un tubo (12) que incluye una entrada que puede conectarse a una fuente de líquido tampón (11), y una salida para el líquido tampón; después de introducir un flujo de dicho líquido tampón a través de dicho tubo (12), la introducción de la mezcla de muestra en el líquido tampón que fluye a través de dicho tubo de tal manera que el líquido tampón forme un portador líquido continuo para dicha mezcla de muestra cuando ambos se introducen a través de dicho tubo; y la aplicación de un campo magnético a través de dicho tubo (12) en una estación de magnetización (13) para conseguir que las partículas marcadas magnéticamente mencionadas se separen y queden retenidas en el líquido tampón dentro del tubo de la estación de magnetización; caracterizado por el hecho de que dicho tubo (12) en la zona de la estación de magnetización (13) posee una forma alargada en zigzag formando varios tramos (12a-12f) paralelos interconectados; y por el hecho de que dicho campo magnético se genera mediante imanes (33, 35) montados sobre elementos centrales magnetizables que definen un circuito magnético cerrado que incluye un primer entrehierro entre los imanes y un segundo entrehierro entre los elementos centrales magnetizables, pasando el citado tubo a través de los dos entrehierros, y por el hecho de que se prevé un circuito magnético cerrado para cada tramo (12a-12g) del tubo de alimentación.
Description
Método y dispositivo para separar magnéticamente
partículas seleccionadas, en particular, células biológicas.
El presente invento hace referencia a un método
y a un dispositivo para separar magnéticamente partículas de un
tipo determinado (en adelante, denominadas "partículas
objetivo") a partir de una muestra según las reivindicaciones 1
y 13 respectivamente.
El invento resulta especialmente útil para
separar magnéticamente células biológicas de un tipo seleccionado,
por ejemplo, un tipo seleccionado de linfocitos presentes en una
muestra de sangre y, por tanto, en adelante el invento se
describirá teniendo en cuenta dichas aplicaciones.
Existe bibliografía que describe un gran número
de aplicaciones relacionadas con la separación magnética de células
biológicas, como es el caso de la patente estadounidense 4.710.472 y
las muchas publicaciones que se citan en dicho documento. En muchas
de estas aplicaciones no sólo es preciso separar uno o varios tipos
de células (en adelante, denominadas "células objetivo"), sino
también mantener la calidad de las membranas celulares de las
células objetivo y/o de las células no objetivo. Por consiguiente,
en un proceso de selección positiva, las células objetivo se
separan de una muestra para su examen o se utilizan en investigación
o con finalidades diagnósticas o clínicas; mientras que en un
proceso de empobrecimiento, se empobrecen las células objetivo de
la muestra para examinar o utilizar las células no objetivo. La
separación de las células objetivo de las células no objetivo y la
conservación de las membranas de ambos tipos de células son aspectos
fundamentales en las investigaciones actuales sobre poblaciones de
linfocitos y su función en la detección prematura del cáncer.
Una técnica que se emplea en la actualidad para
separar células biológicas utiliza las Columnas de Separación
MiniMACS (Miltenyi Biotec GmbH). Esta técnica se sirve de
microesferas paramagnéticas extremadamente pequeñas, de unos 50 nm
de diámetro, es decir, aproximadamente un millón de veces más
pequeñas en volumen que las células eucatióticas en comparación con
el tamaño de un virus. Dichas microesferas magnéticas se fabrican
con afinidades selectivas para determinadas células, es decir, las
células objetivo, de tal modo que marcan magnéticamente las células
objetivo. La muestra se introduce en una columna de separación
magnética provista de un cuerpo magnético permeable a los líquidos,
por ejemplo, malla o lana de acero, y se aplica un campo magnético a
través de la columna de tal forma que las células marcadas
magnéticamente quedan retenidas en el cuerpo magnético permeable al
líquido, mientras que las células no marcadas pasan a través de la
columna. Sin embargo, en este proceso conocido, se descubrió que
las membranas de las células quedaban muy dañadas por culpa del
cuerpo magnético permeable a los líquidos, lo cual reducía la
efectividad de la técnica para la investigación o finalidades
clínicas.
La patente
US-A-4.738.733 hace referencia a un
separador de partículas magnetizables que consiste en una unidad de
aplicación para la aplicación y el transporte de la muestra y el
tampón, una unidad separadora de plástico o vidrio para la
extracción de las partículas magnetizables y una unidad recolectora.
La unidad separadora está provista de uno o varios electroimanes
que, gracias a su fuerza magnética, son capaces de retener las
partículas magnetizables en la unidad separadora.
La patente
US-A-5.711.871 hace referencia a
dispositivos de separación magnética mejorados destinados a
procedimientos de separación magnética. Los dispositivos de
separación mejorados contienen matrices que proporcionan poros o
canales uniformes que reducen la cantidad de aire y de sustancias no
objetivo que se quedan atrapados, disminuyendo la pérdida de
sustancias objetivo mediante disrupción mecánica. Las células
objetivo, procedentes de varios sistemas y órganos, u otras células
biológicas objetivo se marcan junto con un elemento de unión
específico adecuado, y se aíslan utilizando el dispositivo y los
métodos del presente documento. En su forma más sencilla, el
sistema de separación de células del presente documento posee dos
componentes principales: un separador magnético y un reactivo
separador de células. Un tipo de dispositivo de separación más
complejo consta de pasajes para líquidos, contenedores de
recolección y almacenamiento y una columna de separación. El
conjunto de circuitos del líquido puede realizarse con válvulas
integradas, o bien las válvulas pueden aplicarse externamente a los
conductos del líquido.
La patente
US-A-4.904.391 describe un sistema
mejorado para extraer células de médula ósea en el cual las células
se unen con anticuerpos monoclonales conjugados con partículas
magnéticas, dicho sistema comprende una cámara provista de entradas
y salidas para dejar pasar por la cámara una muestra líquida que
contenga médula ósea y anticuerpos magnéticos conjugados unidos a
las células, así como una fuente de campo magnético asociada a la
cámara; donde la mejora comprende un campo magnético no uniforme con
una pendiente ascendente desde la entrada a la salida.
El método de separación magnética de partículas
objetivo se define en la reivindicación 1 del presente invento. El
dispositivo para separar magnéticamente partículas objetivo se
define en la reivindicación 13 del presente invento.
Es un objetivo del presente invento proporcionar
un método para separar magnéticamente partículas objetivo de un
tipo seleccionado a partir de una muestra de tal manera que afecte
en menor grado a las membranas que la técnica conocida mencionada.
Otro de los objetivos del presente invento consiste en proporcionar
un dispositivo para separar magnéticamente partículas objetivo de
conformidad con el método novedoso.
\newpage
Según uno de los aspectos del presente invento,
se proporciona un método para separar magnéticamente partículas
objetivo de un tipo seleccionado a partir de una muestra con el fin
de crear una concentración de partículas objetivo en la muestra o
empobrecer la muestra de partículas objetivo, el cual está compuesto
de los siguientes pasos: crear una mezcla de muestra con partículas
magnéticas con una afinidad selectiva para marcar las partículas
objetivo; añadir un líquido tampón a través de un tubo que cuenta
con una entrada que puede conectarse a una fuente de líquido tampón
y una salida para dicho líquido tampón; introducir la mezcla de
muestra en el líquido tampón de tal manera que dicho líquido tampón
forme un portador líquido continuo para la mezcla de muestra a
medida que ambas sustancias se introducen en el tubo; y aplicar un
campo magnético a través del tubo en una estación de magnetización
ubicada en su interior para hacer que las partículas objetivo
marcadas magnéticamente se separen y queden retenidas en el líquido
tampón dentro del tubo en la estación de magnetización. Dicho
método resulta especialmente útil en caso de un proceso de
empobrecimiento, en el que se empobrece la muestra de partículas
objetivo para realizar un examen diagnóstico, una investigación, o
bien con finalidades clínicas.
Según otras características enumeradas en las
formas de realización preferentes aquí descritas, las partículas
objetivo marcadas magnéticamente de la mezcla de muestra, que se
separan y quedan retenidas en el líquido tampón en la estación de
magnetización del tubo, a continuación se extraen del tubo al dejar
de introducir mezcla de muestra en el líquido tampón y de aplicar
el campo magnético a través del tubo, mientras se añade líquido
tampón por el tubo para eliminar las partículas objetivo marcadas
magnéticamente con el líquido tampón. Este método es especialmente
útil en un proceso de selección positiva, donde las partículas
objetivo deben separarse para utilizarse en exámenes diagnósticos,
investigaciones, o bien con finalidades clínicas.
Según otro aspecto del presente invento, se
proporciona un dispositivo para separar magnéticamente partículas
objetivo de un tipo seleccionado a partir de una muestra con el fin
de crear una concentración de partículas objetivo en la muestra o
de empobrecer la muestra en lo que respecta a partículas objetivo,
el cual comprende: un tubo para introducir un líquido tampón
procedente de un suministro de líquido tampón desde un extremo de
entrada del tubo hacia un extremo de salida del tubo; un orificio de
entrada para introducir en el tubo líquido tampón y una mezcla de
muestra con partículas magnéticas con una afinidad selectiva para
marcar magnéticamente las partículas objetivo, de tal manera que el
líquido tampón forme un portador líquido continuo para las
partículas objetivo marcadas magnéticamente a medida que se
introduce el líquido tampón por el tubo; medios para crear un campo
magnético a través del tubo en una estación de magnetización ubicada
en su interior para conseguir que las partículas objetivo marcadas
magnéticamente se separen y queden retenidas en el líquido tampón
dentro del tubo en la estación de magnetización; y un contenedor
situado en el extremo de salida del tubo para recoger el líquido
tampón y la muestra empobrecida de partículas objetivo. En los casos
en los que el dispositivo deba usarse en un proceso de selección
positiva, éste comprenderá asimismo un segundo contenedor que puede
ubicarse en el extremo de salida del tubo en lugar del contenedor
mencionado anteriormente; además, la aplicación del campo magnético
y la introducción de la mezcla en el líquido tampón se suspenden
para hacer que el líquido tampón introducido por el tubo elimine
las partículas objetivo marcadas magnéticamente y las deposite en el
segundo contenedor.
Se ha descubierto que dicho método y dicho
dispositivo posibilitan la separación de tipos seleccionados de
partículas, (partículas objetivo), concretamente, células biológicas
(células objetivo), sin provocar daños no deseados ni a las
partículas objetivo ni a las partículas no objetivo. Por tanto, el
líquido tampón, que forma un portador líquido continuo tanto para
las partículas objetivo como para las partículas no objetivo, crea
un volumen líquido constante que protege físicamente las dos clases
de partículas (o células) durante las dos fases del proceso,
minimizando así los daños causados a los dos tipos de partículas
durante las dos fases.
Si bien el método y el dispositivo del presente
invento son especialmente útiles para separar tipos seleccionados
de células biológicas, el método y el dispositivo también pueden
utilizarse para separar otras clases de partículas, por ejemplo,
determinadas proteínas. Asimismo, aunque el método y el dispositivo
descritos emplean preferentemente las microesferas magnéticas
disponibles en el mercado, se valorará que otras partículas
magnéticas con una afinidad selectiva con las partículas objetivo
puedan emplearse para marcar magnéticamente las partículas
objetivo.
En la descripción que viene a continuación se
incluyen otras características y ventajas del invento.
Para comprender mejor el invento, se hará
referencia a los dibujos adjuntos, a saber:
La figura 1 muestra esquemáticamente los
elementos básicos de una realización del dispositivo;
La figura 2 muestra esquemáticamente un sistema
que incluye un dispositivo similar al de la figura 1 y los
principales controles del mismo;
La figura 3 muestra los elementos básicos de una
segunda forma de realización de un dispositivo construido según el
presente invento;
La figura 4 muestra una vista en sección
transversal por la línea 4-4 de la figura 3;
La figura 5 muestra una vista en sección
transversal por la línea 5-5 de la figura 4;
La figura 6 muestra una vista tridimensional
detallada de los soportes para imán y sus imanes correspondientes a
un lado de la estación de magnetización del dispositivo según las
figuras de la 3 a la 5; y
La figura 7 muestra otro dispositivo construido
según el presente invento.
El dispositivo mostrado en la figura 1 es
especialmente útil para separar magnéticamente determinados tipos
de células objetivo, como linfocitos, glóbulos rojos y/o macrófagos
de una muestra de sangre. El dispositivo mostrado comprende un
contenedor de muestra 10 que contiene la muestra de sangre. Antes o
después de introducir la muestra de sangre en el contenedor 10, se
mezcla con las partículas magnéticas, preferentemente con las
microesferas magnéticas disponibles en el mercado, con una afinidad
selectiva para marcar magnéticamente las células objetivo de la
muestra de sangre en el contenedor 10. El dispositivo incluye
asimismo otro contenedor 11 que sirve para suministrar el líquido
tampón que se utilizará en el proceso de separación magnética. El
líquido tampón del contenedor 11 puede ser cualquier tipo de líquido
tampón disponible en el mercado, como solución salina normal 1, PBS
o similar.
El dispositivo mostrado en la figura 1 también
incluye un tubo de alimentación 12 para hacer pasar el líquido
tampón desde el contenedor de tampón 11 a través de una estación de
magnetización 13 hasta un contenedor de recogida 14. En la forma de
realización de la figura 1, la introducción de líquido tampón a
través del tubo de alimentación 12 se realiza por gravedad y en
vacío. Para ello, los dos contenedores de suministro 10 y 11 están
colocados por encima del contenedor de recogida 14; y el contenedor
de recogida 14 incluye un tubo de vacío 15 que se comunica por un
extremo con el interior del contenedor de recogida y, por el extremo
opuesto, con una fuente de vacío 16.
La muestra de sangre del contenedor de muestra
10 incluye células objetivo marcadas magnéticamente y células no
objetivo. La muestra de sangre se introduce a través de la línea 17
por un orificio de entrada 12a al tubo de alimentación 12 en un
punto por encima de la estación de magnetización 13. Sin embargo,
antes de introducir la muestra en el tubo de alimentación 12, se
llena dicho tubo de alimentación con líquido tampón desgasificado
del contenedor 1, creando así un caudal predeterminado.
Preferentemente, el caudal es menor a una gota por segundo; un
caudal preferente sería entre 6 y 8 gotas por minuto. Es posible
preestablecer el caudal controlando la fuente de vacío 16, o bien
controlando una o varias válvulas del modo que se describirá con más
detalle en referencia a la figura 2.
De este modo, el líquido tampón del contenedor
11 funciona como portador líquido continuo de las células objetivo
marcadas magnéticamente y de las células no objetivo presentes en la
muestra de sangre que se ha introducido desde el contenedor 10 a
través del orificio de entrada 12a, a medida que tanto el líquido
tampón como la mezcla -que incluye las células objetivo y las
células no objetivo-, fluyen a través del tubo de alimentación 12
por la estación de magnetización 13. Los imanes 18 de la estación de
magnetización 13 crean un campo magnético a través del tubo de
alimentación 12 que es suficiente para separar y retener las células
objetivo marcadas magnéticamente dentro del líquido tampón en la
estación de magnetización 13 a medida que el líquido tampón, con
las células no magnetizadas y otros constituyentes de la muestra de
sangre, desemboca por el extremo de salida del tubo de alimentación
12 en el contenedor de recogida 14. El contenedor de recogida 14
recibe el líquido tampón junto con las células no objetivo de la
muestra de sangre, ya que las células objetivo de la muestra de
sangre marcadas magnéticamente (incluidas las partículas magnéticas
mezcladas) permanecen en estasis debido al flujo magnético
producido por los imanes 18 en la estación de magnetización 13.
El contenido del contenedor de recogida 14 es el
resultado de un proceso de empobrecimiento ejecutado en la muestra
original, puesto que dicho contenido incluye todos los elementos
originales de la muestra salvo las células objetivo marcadas
magnéticamente (y las partículas magnéticas añadidas a la muestra
original en el contenedor 10) que se separan y quedan retenidas en
la estación de magnetización 13. De este modo, el contenido del
contenedor 14 puede examinarse o utilizarse con finalidades
diagnósticas, clínicas o de investigación de la misma manera que se
utilizan los resultados de cualquier otro proceso de empobrecimiento
al que se somete la muestra original.
Si también se desea someter la muestra original
a un proceso de selección positiva (es decir, para utilizar las
células objetivo separadas con finalidades diagnósticas, clínicas y
de investigación), dicho proceso puede llevarse a cabo de la
siguiente manera: (a) continuar alimentando con líquido tampón el
tubo 12; (b) suspender el suministro de mezcla procedente del
contenedor de muestra 10 y la aplicación del campo magnético en la
estación de magnetización 13; y (c) sustituir el contenedor de
recogida 14 con otro contenedor de recogida (no se muestra) para
recoger las células objetivo que el líquido tampón elimina al pasar
por el tubo de alimentación 12. Generalmente, sería preferente que,
tras suspender la introducción de muestra del contenedor de muestra
10, se retrasase brevemente la interrupción del campo magnético en
la estación de magnetización 13 y el intercambio de los dos
contenedores, para dar tiempo a que el líquido tampón aclare las
partículas objetivo marcadas magnéticamente que se encuentran
situadas en la estación de magnetización 13 antes de que dichas
partículas se arrastren al segundo contenedor de recogida.
Los imanes 18 de la estación de magnetización 13
pueden ser imanes permanentes que puedan extraerse físicamente o
retirarse de la estación de magnetización al eliminar las células
objetivo marcadas magnéticamente. De manera alternativa, estos
imanes 18 pueden ser electroimanes que reciban electricidad a través
de conectores 19 (figura 2) durante la fase de separación magnética
y dejen de recibirla durante la fase de eliminación.
Se observará que el líquido tampón suministrado
desde el contenedor de líquido tampón 11 proporciona un volumen de
fluido constante y continuo y de este modo forma un portador líquido
continuo para todos los constituyentes de la mezcla de muestra
suministrada desde el contenedor de muestra 10. Esto es así durante
la fase inicial de empobrecimiento, en la que la muestra original
empobrecida de células objetivo se recoge en el contenedor 14; así
como en la fase de selección positiva, en la que las células
objetivo, que se separan y quedan retenidas en la estación de
magnetización 13, son arrastradas por el líquido tampón hasta otro
contenedor de recogida. De este modo, el líquido tampón protege
tanto las células objetivo como las células no objetivo durante las
dos fases del proceso de separación para así disminuir
considerablemente la posibilidad de dañar o romper las membranas
celulares en comparación con el proceso convencional con MiniMACS
descrito anteriormente. Asimismo, y tal como se describirá más
adelante, el método ilustrado en la figura 1 puede automatizarse muy
fácilmente y conseguir una mayor capacidad de producción y una
mejora de la eficiencia en el proceso de separación.
A continuación se expone un ejemplo de
utilización del dispositivo y el método descritos con respecto a la
figura 1 para separar magnéticamente células objetivo seleccionadas
a partir de una muestra de sangre: se obtuvo una muestra de
linfocitos a partir de sangre normal y sana utilizando un gradiente
de Ficoll normal. Dicha muestra se dividió en dos grupos: el grupo
de control y el experimental. Se añadieron microesferas magnéticas
CD19 comercializadas (suministradas por Miltenyi Biotec GmbH) a los
linfocitos experimentales con el fin de marcar únicamente las
células B de la muestra. Tras realizar el marcaje con microesferas
CD19, las células se aclararon dos veces con PBS.
El dispositivo de separación se preparó
rellenando y aclarando el tubo de alimentación 12 con tampón
desgasificado procedente del depósito del tampón. Durante la
separación, el sistema se mantiene lleno de tampón
desgasificado.
La mezcla de linfocitos marcada se introdujo en
el sistema mediante una jeringa de 1 ml (sin pistón) provista de
una aguja de 0,4x13 insertada en un punto superpuesto del sistema de
tubos. El sistema de vacío mantuvo un caudal constante de 6 gotas
por minuto. Después de que toda la mezcla marcada hubiera entrado en
el sistema, se retiró la aguja y se dejó funcionar el sistema hasta
que otros 400 \mul de tampón atravesaron el sistema de
separación. Seguidamente, se detuvo el flujo. Se retiró el tubo de
recogida, se marcó con la letra "A" y se sustituyó por un
segundo tubo.
Se interrumpió el campo magnético, se
restableció el flujo y se aclaró la línea con 500 \mul de líquido
tampón. Se detuvo el flujo de nuevo y se retiró el segundo tubo,
marcándolo con la letra "B".
Las células del grupo de control y los tubos
"A" y "B" se examinaron a doble ciego con un microscopio
óptico para comprobar el estado de la membrana y hacer el recuento
celular mediante un hemocitómetro.
No se observaron cambios en cuanto a la calidad
celular entre la muestra de control y la muestra experimental.
Generalmente, las células B comprenden entre un 8 y un 11% de la
población total de linfocitos. Los resultados de esta separación
generaron un 8,8% de células B, lo cual demuestra la capacidad de
aislar una población específica sin afectar a la calidad
celular.
Al utilizar microesferas CD19 (Miltenyi Biotec
GmbH) para marcar los linfocitos B, se esperaba obtener una cosecha
de aproximadamente un 10% de la población total de linfocitos. Los
resultados reales, según observación mediante el microscopio
óptico, Cellscan y FACS, fueron los siguientes:
1. Se produjo una cosecha que oscilaba entre un
8,8% y un 11,1%. El análisis con FACS de dichas células revelaba un
97% de población pura de las células deseadas.
2. La calidad de la membrana no resultó afectada
por el proceso. Dicha observación se verificó mediante el
microscopio óptico y un examen Cell Scan.
3. Se esperaba que las poblaciones de linfocitos
no marcadas (células no objetivo) contuviesen aproximadamente un
95% de linfocitos T y comprendiesen aproximadamente un 90% de la
población total de linfocitos. El análisis FACS de estas células
reveló una media de un 93% de poblaciones puras de linfocitos T. La
observación al microscopio confirmó que dichos linfocitos T
comprendían una media de un 90% de la población total de
linfocitos.
En el ejemplo descrito anteriormente, el campo
magnético se generaba mediante imanes permanentes de neodimio; el
sistema de tubos estaba compuesto por tubos de infusión de 0,80 mm,
y el líquido tampón poseía la siguiente composición: 0,15 ml EDTA
(ácido etilendiaminotetraacético); 1,10 ml BSA 796 (albúmina sérica
bovina); 13,75 ml PBS (solución salina tampón fosfatada sin calcio
ni magnesio); produciendo un total de 15,00 ml de tampón.
La figura 2 muestra esquemáticamente el sistema
básico de la figura 1 pero provisto de los controles principales
para automatizar el funcionamiento del sistema.
Así pues, el sistema mostrado en la figura 2
incluye un controlador por microprocesador, designado en general
con el número 20, para controlar el funcionamiento del sistema. Las
entradas al controlador 20 comprenden un selector de flujo 21 para
preestablecer el caudal de alimentación de líquido tampón del
contenedor de tampón 11; un sensor de burbujas de aire 22 para
detectar la presencia de burbujas de aire en el tubo de alimentación
del tampón 12, y un sensor de burbujas de aire 23 para detectar la
presencia de burbujas de aire en el tubo de alimentación de la
muestra 17. Estos sensores protegen la integridad del nivel
constante de fluido cerrando el flujo de fluido (el sensor 22
cierra la válvula 27 y el sensor 23, la válvula 28) si se detecta
una burbuja de aire. El controlador 20 también incluye una entrada
procedente de un sensor de caudal 29 para detectar el caudal que
entra en el contenedor 14.
El controlador 20, controla a su vez los
electroimanes 18 en la estación de magnetización 13 a través de la
línea 24 conectada a sus respectivos conectores 19, la fuente de
vacío 16 a través de la línea 25 y/o una válvula de vacío 26, el
caudal de alimentación del líquido tampón a través de la válvula 27
de la línea de alimentación 12, y el caudal de alimentación de
muestra a través de la válvula 28 de la línea de muestra 17.
Las figuras de la 3 a la 6 muestran una forma de
realización preferente de la unidad magnética de la estación de
magnetización 13 según el presente invento con el fin de permitir
que la estación de magnetización ocupe un tramo considerablemente
más largo del líquido tampón que transporta la muestra, aumentando
así la producción y/o la eficiencia del proceso de separación
total. Así pues, mientras que en el dispositivo mostrado en las
figuras 1 y 2, la estación de magnetización 13 ocupa una extensión
rectilínea del tubo de alimentación 12, en la figura 3 la estación
de magnetización, designada en dicha figura con el número 30, está
estructurada de tal modo que ocupa una extensión alargada y en
zigzag del tubo de alimentación 12.
Como se muestra en concreto en la figura 4, la
estación de magnetización 30 incluye una placa de montaje trasera
31 y una placa de montaje delantera 32 unidas por los pasadores 32a
presentes en la placa 32 que encajan por fricción en los postes de
apertura 31a de la placa 31. La placa de montaje trasera 31 sirve de
base para varios imanes permanentes 33, cada uno de los cuales está
sustentado por un elemento central magnetizable 34; y de manera
similar, la placa de montaje delantera 32 sirve de base para varios
imanes permanentes 35, cada uno de los cuales está sustentado por
un elemento central magnetizable 36.
Los imanes permanentes 33 y 35 están alineados
entre sí y los elementos centrales magnetizables 34 y 36 están a su
vez alineados entre sí, de tal manera que definen dos circuitos
magnéticos cerrados, uno con los entrehierros AG_{1}, AG_{2} y
el otro con los entrehierros AG_{1}, AG_{3}, cada tramo del tubo
de alimentación 12 atraviesa los tres entrehierros de AG_{1} a
AG_{3}, de tal modo que el campo magnético producido por los
imanes permanentes es efectivo en un tramo considerable del tubo de
alimentación.
La placa de montaje trasera 31 posee montaje
móvil sobre un par de balancines 37, 38. Cada balancín incluye un
montaje basculante 37a, 38a sobre la parte trasera de la placa de
montaje 31 y otro montaje basculante 37b, 38b sobre una abrazadera
39, 40 deslizable sobre los pasadores 41, 42 que se proyectan desde
una superficie de apoyo 42. La abrazadera 39 es deslizable sobre el
pasador superior 41, y la abrazadera 40 es deslizable sobre el
pasador inferior 42 fijado a la superficie de apoyo 43 bajo el
pasador 41. Las dos abrazaderas 39, 40 están desviadas hacia fuera
por muelles de espiral 44, 45 sobre sus pasadores correspondientes
41, 43.
Tal como se muestra en la figura 5, la placa
trasera 31 está provista de tres postes de apertura 31a en su
extremo superior y tres postes similares en su extremo inferior,
escalonados respecto a los postes del extremo superior. Los
pasadores 32a de la placa de montaje delantera 32 están dispuestos
de tal manera que se alojen en los postes de apertura 31a de la
placa 31. De este modo, cuando se extrae la placa delantera 32, el
tubo de alimentación 12 puede enrollarse alrededor de los postes
superiores e inferiores 31a de la placa trasera 31 en zigzag
(figura 5) de forma que se crean tramos de dirección descendente y
tramos de dirección ascendente 12a-g. El último
tramo de dirección descendente 12g está conectado al contenedor de
recogida 14 de la figura 3.
Como se muestra en la figura 6, se prevé un imán
33 para cada tramo 12a-12g del tubo de alimentación.
Como el ejemplo expuesto muestra siete de dichos tramos, la figura
6 representa siete imanes 33 y sus respectivos elementos centrales
34. En este caso, habrá el número correspondiente de imanes 35 y de
elementos centrales 36 sustentados por la placa delantera 32,
estando los imanes 35 de la placa delantera alineados con los imanes
33 de la placa trasera. Tal como se ha mencionado anteriormente,
cada par de imanes y de elementos centrales definen tres
entrehierros (AG_{1}-AG_{3}, figura 4) para cada
tramo 12a-12g del tubo de alimentación, de modo que
el campo magnético de la estación de magnetización actúa sobre una
extensión considerable del tubo de alimentación. Los pasadores 32a
de la placa delantera 32, con el mismo número y disposición que los
postes 32a para que se alojen en dichos postes al acoplar la placa
delantera 35 con la placa trasera 31, están diseñados para que
encajen por fricción cuando los pasadores se alojan en los postes.
Los postes 31 también están diseñados para definir un espacio,
indicado como 46 (figura 4), entre los imanes 33, 35 apoyados en
las dos placas 31, 33 para alojar el tramo correspondiente
12a-12g del tubo de alimentación 12.Después de
aplicar el tubo de alimentación en zigzag sobre los postes de
apertura 31a de la placa trasera 31, la placa delantera 32 se
coloca introduciendo los pasadores 32a por los postes 31a. Cuando
los pasadores 32a se alojan en los postes 31a, los pasadores
engranan con las abrazaderas 39, 40, empujándolas hacia la
superficie fija 43 contra los muelles 44, 45. La placa trasera 31
se desplaza por medio de balancines 37, 38 hacia la placa delantera
37 para apresar firmemente los respectivos tramos del tubo de
alimentación 12 entre dos grupos de imanes
33, 35.
33, 35.
La figura 7 muestra un dispositivo similar al de
la figura 3, salvo que el dispositivo de la figura 7 está provisto
adicionalmente de una cámara de mezcla 100 en el orificio de entrada
112a del tubo de alimentación 112 para premezclar la mezcla de
muestra aplicada a través del tubo de entrada 110, y el líquido
tampón aplicado a través de la entrada 111, antes de introducirlo,
a través del tubo 112, a la estación de magnetización 130. El
dispositivo de la figura 7 también está provisto de una bomba 132,
por ejemplo una bomba peristáltica, en el extremo de salida del
tubo 112 para controlar la alimentación del líquido del mismo hacia
el contenedor de recogida (14, figura 3).
En todas las realizaciones descritas
anteriormente, el campo magnético puede controlarse según la
aplicación concreta para generar una intensidad de campo
predeterminada. Para ello, el entrehierro magnético puede
modificarse al utilizar imanes permanentes; y cuando se usa
electroimanes, puede variarse la corriente, por ejemplo, a través
del microprocesador 20 de la figura 2.
Aunque el invento se ha descrito hasta ahora en
referencia a células objetivo seleccionadas de una muestra de
sangre, cabe destacar que el invento podría utilizarse también para
muchas otras aplicaciones de selección de otras partículas objetivo
de un cuerpo, por ejemplo proteínas seleccionadas u otros tipos de
partículas. Asimismo, aunque se prefiere la utilización de
microesferas magnéticas, se observará que también es posible
emplear otras partículas magnéticas en el proceso. Además, pueden
incluirse otros sensores, por ejemplo, para la radioactividad, la
conductividad, etc. Resultarán evidentes muchas otras variaciones,
modificaciones y aplicaciones del presente invento.
Claims (26)
1. Método para separar magnéticamente partículas
objetivo de un tipo seleccionado a partir de una muestra con el fin
de obtener una concentración de partículas objetivo de la muestra o
un empobrecimiento de la muestra en cuanto a partículas objetivo,
el cual está compuesto por los siguientes pasos: la obtención (en un
contenedor 10) de una mezcla de muestra de dichas partículas
magnéticas con una afinidad selectiva para marcar magnéticamente
dichas partículas objetivo; la introducción de un líquido tampón a
través de un tubo (12) que incluye una entrada que puede conectarse
a una fuente de líquido tampón (11), y una salida para el líquido
tampón; después de introducir un flujo de dicho líquido tampón a
través de dicho tubo (12), la introducción de la mezcla de muestra
en el líquido tampón que fluye a través de dicho tubo de tal manera
que el líquido tampón forme un portador líquido continuo para dicha
mezcla de muestra cuando ambos se introducen a través de dicho tubo;
y la aplicación de un campo magnético a través de dicho tubo (12)
en una estación de magnetización (13) para conseguir que las
partículas marcadas magnéticamente mencionadas se separen y queden
retenidas en el líquido tampón dentro del tubo de la estación de
magnetización; caracterizado por el hecho de que dicho tubo
(12) en la zona de la estación de magnetización (13) posee una
forma alargada en zigzag formando varios tramos
(12a-12f) paralelos interconectados; y por el hecho
de que dicho campo magnético se genera mediante imanes (33, 35)
montados sobre elementos centrales magnetizables que definen un
circuito magnético cerrado que incluye un primer entrehierro entre
los imanes y un segundo entrehierro entre los elementos centrales
magnetizables, pasando el citado tubo a través de los dos
entrehierros, y por el hecho de que se prevé un circuito magnético
cerrado para cada tramo (12a-12g) del tubo de
alimentación.
2. Método según la reivindicación 1,
caracterizado por el hecho de que los elementos centrales
magnetizables mencionados también definen un tercer entrehierro por
el que también pasa el tubo citado.
3. Método según la reivindicación 1,
caracterizado por el hecho de que el citado campo magnético
(13) se genera mediante imanes permanentes (33, 35) montados sobre
elementos centrales magnetizables (34, 36) que definen un circuito
magnético cerrado, estando los imanes permanentes (33, 35) alineados
entre sí y los elementos centrales (34, 36), a su vez, alineados
entre sí, de tal modo que describen dos circuitos magnéticos
cerrados, uno que incluye el primer entrehierro (AG_{2}) y un
tercer entrehierro (AG_{1}) y el otro que incluye el segundo
entrehierro (AG_{3}) y el tercer entrehierro (AG_{1}), para cada
tramo (12a-12g) del tubo de alimentación.
4. Método según la reivindicación 1, 2 o 3,
caracterizado por el hecho de que la mezcla de muestra se
introduce en el mencionado líquido tampón por un punto (12a)
situado entre el extremo de entrada del tubo (12) y la estación de
magnetización (13).
5. Método según la reivindicación 1, 2 o 3,
caracterizado por el hecho de que las partículas objetivo que
están marcadas magnéticamente por las partículas magnéticas
presentes en la mezcla de muestra y que quedan separadas y
retenidas en el líquido tampón del tubo (12) de la estación de
magnetización (13), a continuación se extraen del tubo,
suspendiendo así la introducción de dicha mezcla de muestra en el
líquido tampón y la aplicación del campo magnético a través del
tubo, mientras se hace pasar líquido tampón a través del tubo (12)
para eliminar las partículas objetivo marcadas magnéticamente con el
líquido tampón.
6. Método según la reivindicación 1, 2 o 3,
caracterizado por el hecho de que el líquido tampón y la
mezcla de muestra se hacen pasar por el tubo hasta un contenedor de
recogida (14) por la fuerza de la gravedad.
7. Método según la reivindicación 6,
caracterizado por el hecho de que se aplica vacío (16) a
dicho contenedor de recogida (12) para controlar la alimentación
del líquido tampón y mezcla de muestra en dicho contenedor de
recogida.
8. Método según la reivindicación 6,
caracterizado por el hecho de que se aplica presión positiva
al tubo para controlar el suministro de líquido tampón y mezcla de
muestra en el contenedor de recogida.
9. Método según la reivindicación 1, 2 o 3,
caracterizado por el hecho de que las partículas objetivo son
células biológicas seleccionadas presentes en dicha muestra.
10. Método según la reivindicación 9,
caracterizado por el hecho de que la muestra es una muestra
de sangre y las células objetivo son un tipo seleccionado de
linfocitos presentes en dicha muestra de sangre.
11. Método según la reivindicación 1, 2 o 3
caracterizado por el hecho de que las partículas magnéticas
mezcladas con la muestra tienen forma de microesferas
magnéticas.
12. Método según la reivindicación 1, 2 o 3
caracterizado por el hecho de que el campo magnético se
controla para generar una intensidad de campo predeterminada.
13. Dispositivo para separar magnéticamente
partículas objetivo de un tipo seleccionado a partir de una muestra
con el fin de obtener una concentración de partículas objetivo
presentes en la muestra, o un empobrecimiento de dichas partículas
objetivo de la muestra, compuesto por: una fuente de suministro de
líquido tampón (11); un tubo (12) para la introducción de líquido
tampón desde la fuente de líquido tampón por un extremo de entrada
(12a) del tubo hasta un extremo de salida del tubo; un contenedor de
muestra (10) que contiene una mezcla de dicha muestra y partículas
magnéticas con una afinidad selectiva que marcan magnéticamente las
partículas objetivas; un tubo de alimentación (17) que conecta el
contenedor (10) al extremo de entrada (12a) del tubo (12) para
poder hacer pasar la mezcla por el tubo tras generarse un flujo de
líquido tampón en el mismo, de tal forma que el líquido tampón
forme un portador líquido continuo para las partículas objetivo
marcadas magnéticamente de la mezcla introducida por el tubo;
medios para generar un campo magnético (18) a través del tubo de la
estación de magnetización (13); y un contenedor (14) ubicado en el
extremo de salida del tubo para recoger el líquido y la muestra
desprovista de las partículas objetivo; caracterizado por el
hecho de que el tubo (12) de la estación de magnetización (13)
posee una configuración alargada en zigzag formando varios tramos
(12a-12f) paralelos interconectados, y por el hecho
de que el campo magnético se genera mediante imanes (33, 35)
montados sobre elementos centrales magnetizables que describen un
circuito magnético cerrado que incluye un primer entrehierro entre
los imanes y un segundo entrehierro entre los elementos centrales
magnetizables, pasando el tubo a través de los dos entrehierros, y
por el hecho de que existe un circuito magnético cerrado para cada
tramo (12a-12g) del tubo de alimentación.
14. Dispositivo según la reivindicación 13
caracterizado por el hecho de que los elementos centrales
magnetizables también describen un tercer entrehierro por el que
también pasa el tubo.
15. Dispositivo según la reivindicación 13
caracterizado por el hecho de que el campo magnético (13) se
genera mediante imanes permanentes (33, 35) montados sobre
elementos centrales magnetizables (34, 36) que definen un circuito
magnético cerrado, donde los imanes permanentes (33, 35) están
alineados entre sí y los elementos centrales magnetizables (34, 36)
están a su vez alineados entre sí, de tal modo que describen dos
circuitos magnéticos cerrados, uno que incluye el primer (AG_{2})
y el tercer entrehierro (AG_{1}), y el otro que incluye el
segundo (AG_{3}) y el tercer entrehierro (AG_{1}) para cada
tramo (12a-12g) del tubo de alimentación.
16. Dispositivo según la reivindicación 13, 14 o
15 caracterizado por el hecho de que el tubo (12) incluye
una primera conexión que conecta el suministro de líquido tampón
(11) al extremo de entrada del tubo, y una segunda conexión (12a)
para introducir la mezcla de muestra en el líquido tampón en un
punto situado entre el extremo de entrada del tubo y la estación de
magnetización (13).
17. Dispositivo según la reivindicación 13 o 14
caracterizado por el hecho de que el contenedor (14) está
situado por debajo del extremo de entrada del tubo de tal modo que
el líquido tampón y la mezcla de muestra se hacen pasar por el tubo
hasta el contenedor por la fuerza de la gravedad.
18. Dispositivo según la reivindicación 17
caracterizado por el hecho de que el contenedor (14) se
conecta a una fuente de succión (16) para controlar la alimentación
de líquido tampón y mezcla de muestra por el tubo.
19. Dispositivo según la reivindicación 17
caracterizado por el hecho de que el tubo (112) comprende una
bomba positiva (132) para controlar la alimentación de líquido
tampón y mezcla de muestra por el tubo.
20. Dispositivo según la reivindicación 13, 14 o
15 caracterizado por comprender un segundo contenedor que se
coloca en el extremo de salida del tubo (12) en lugar del contenedor
mencionado en primer lugar; y por el hecho de que tanto la
aplicación del campo magnético como la introducción de mezcla de
muestra en el líquido tampón se suspenden para hacer que el líquido
tampón que se introduce en el tubo elimine las partículas objetivo
marcadas magnéticamente hacia el segundo contenedor.
21. Dispositivo según la reivindicación 13, 14 o
15 caracterizado por comprender un sensor de burbujas de
aire (22) para detectar la presencia de aire en el interior del
líquido tampón introducido en el tubo, un sensor de burbujas de
aire (23) para detectar la presencia de aire en la mezcla de muestra
introducida en el tubo y un controlador (20) controlado por dichos
sensores para interrumpir el flujo del tampón o de la muestra al
detectarse burbujas de aire.
22. Dispositivo según la reivindicación 13, 14 o
15 caracterizado por el hecho de que el campo magnético (13)
se genera mediante imanes (33, 35) montados sobre elementos
centrales magnetizables (34, 36) que definen un circuito magnético
cerrado que incluye un primer entrehierro AG_{1} entre los imanes
y un segundo entrehierro AG_{2} entre los elementos centrales
magnetizables; atravesando el tubo (12) ambos entrehierros.
23. Dispositivo según la reivindicación 22
caracterizado por el hecho de que los elementos centrales
magnetizables también describen un tercer entrehierro AG_{3} por
el que también pasa el tubo (12).
24. Dispositivo según la reivindicación 13, 14 o
15 caracterizado por el hecho de que los medios de generación
de campo magnético (13) incluyen imanes permanentes que pueden
separarse físicamente de la proximidad del tubo para suspender la
aplicación del campo magnético a través del tubo en la estación de
magnetización.
25. Dispositivo según la reivindicación 13, 14 o
15 caracterizado por el hecho de que los medios de generación
de campos magnéticos incluyen un electroimán (18, 19) que puede
desenergizarse para interrumpir la aplicación del campo magnético a
través del tubo en la estación de magnetización.
26. Dispositivo según la reivindicación 13, 14 o
15 caracterizado por un sistema de control (20) para
controlar el campo magnético y generar una intensidad de campo
predeterminada.
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