ES2310052T3

ES2310052T3 - Composiciones y metodos para la inmunoterapia especifica de wt1.

Info

Publication number: ES2310052T3
Application number: ES99951690T
Authority: ES
Inventors: Alexander Gaiger; Martin Cheever
Original assignee: Corixa Corp
Current assignee: Corixa Corp
Priority date: 1998-09-30
Filing date: 1999-09-30
Publication date: 2008-12-16
Anticipated expiration: 2019-09-30
Also published as: HK1039782B; CN100486995C; KR100752065B1; JP2002525099A; CA2349442A1; MXPA01003344A; AR021849A1; TR200101482T2; JP4235984B2; DE69938970D1; IL142216A; CN1336935A; MY139226A; WO2000018795A2; PL348595A1; ATE399179T1; WO2000018795A3; EP1117687A2; SA00200872B1; HK1039782A1

Abstract

Un polipéptido en el que el polipéptido es una porción inmunógena de un polipéptido de WT1 nativo y consiste en una secuencia seleccionada entre SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 144.

Description

Composiciones y métodos para la inmunoterapia específica de WT1.

Campo técnico

La presente invención se refiere en general a la inmunoterapia de enfermedades malignas tales como leucemia y cánceres. La invención está relacionada más específicamente con composiciones para generar o aumentar una respuesta inmune a WT1, y al uso de tales composiciones para prevenir y/o tratar enfermedades malignas.

Fundamento de la invención

El cáncer y la leucemia son problemas de salud significativos en los Estados Unidos y en todo el mundo. Aunque se han hecho avances en la detección y el tratamiento de tales enfermedades, no se dispone actualmente de vacuna u otro método con éxito universalmente para la prevención o el tratamiento de cáncer y leucemia. El manejo de las enfermedades confía actualmente en una combinación de diagnosis temprana y tratamiento agresivo, que puede incluir uno o más de una variedad de tratamientos tales como cirugía, radioterapia, quimioterapia y terapia con hormonas. El transcurso del tratamiento para un cáncer particular se selecciona a menudo en base a una variedad de parámetros de pronóstico, incluyendo un análisis de marcadores de tumores específicos. Sin embargo, el uso de marcadores establecidos conduce a menudo a un resultado que es difícil de interpretar, y se continúa observando alta mortalidad en muchos pacientes con cáncer.

Las inmunoterapias tienen el potencial de mejorar sustancialmente el tratamiento y la supervivencia de cáncer y leucemia. Datos recientes demuestran que la leucemia puede curarse por inmunoterapia en el contexto de trasplante de médula ósea (por ejemplo, infusiones de linfocitos del donante). Tales terapias pueden implicar la generación o aumento de una respuesta inmune a un antígeno asociado a tumor (TAA). Sin embargo, hasta la fecha, se conocen relativamente pocos TAAs, y la generación de una respuesta inmune contra tales antígenos, con raras excepciones, no se ha mostrado ser beneficiosa terapéuticamente.

Por consiguiente, hay necesidad en la técnica de métodos mejorados para la prevención y terapia de leucemia y cáncer. La presente invención satisface estas necesidades y proporciona además otras ventajas relacionadas.

Sumario de la invención

Explicado brevemente, esta invención proporciona composiciones y sus métodos de uso para la diagnosis y terapia de enfermedades tales como leucemia y cáncer. En particular, la presente invención proporciona el polipéptido de la reivindicación 1, que comprende una porción inmunógena de un WT1 nativo. Dentro de ciertas realizaciones, el polipéptido comprende no más de 16 residuos de aminoácidos consecutivos de un polipéptido de WT1 nativo. La porción inmunógena se une preferiblemente a una molécula de MHC clase I y/o clase II.

Dentro de aspectos adicionales, se describen también polipéptidos que comprenden una variante de una porción inmunógena de una proteína de WT1, en la que la variante difiere de la porción inmunógena debido a sustituciones en entre 1 y 3 posiciones de aminoácidos dentro de la porción inmunógena de tal modo que se aumenta la capacidad de la variante para reaccionar con antisueros específicos para el antígeno y/o linajes de células T o clones con relación a una proteína de WT1 nativa.

La presente invención proporciona además polinucleótidos de WT1 que codifican un polipéptido de WT1 como se ha descrito antes.

Dentro de otros aspectos, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas y vacunas. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender un polipéptido como se ha descrito antes y/o uno o más entre (i) un polinucleótido de WT1; (ii) un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un polipéptido de WT1; (iii) una célula T que reacciona específicamente con un polipéptido de WT1 o (iv) una célula que presenta antígeno que expresa un polipéptido de WT1, en combinación con un vehículo o excipiente aceptable farmacéuticamente. Las vacunas comprenden un polipéptido como se ha descrito antes y/o uno o más entre (i) un polinucleótido de WT1; (ii) una célula que presenta antígeno que expresa un polipéptido de WT1 o (iii) un anticuerpo anti-idiotípico, y un aumentador de la respuesta inmune no específico. Dentro de ciertas realizaciones, están presentes menos de 23 residuos de aminoácidos consecutivos, preferiblemente menos de 17 residuos de aminoácidos, de un polipéptido de WT1 nativo dentro de un polipéptido de WT1 empleado dentro de tales composiciones farmacéuticas y vacunas. El aumentador de la respuesta inmune puede ser un coadyuvante. Preferiblemente, un aumentador de la respuesta inmune aumenta una respuesta de células T.

Se describen también métodos para aumentar o inducir una respuesta inmune en un paciente, que comprenden administrar a un paciente una composición farmacéutica o vacuna como se ha descrito antes. En ciertas realizaciones, el paciente es un ser humano.

Se describen también métodos para inhibir el desarrollo de una enfermedad maligna en un paciente, que comprenden administrar a un paciente una composición farmacéutica o vacuna como se ha descrito antes. Las enfermedades malignas incluyen, aunque sin limitarse a ellas, leucemias (por ejemplo, mieloide aguda, linfocítica aguda y mieloide crónica) y cánceres (por ejemplo, cáncer de pecho, de pulmón, de tiroides o gastrointestinal o un melanoma). El paciente puede, aunque no lo necesita, estar afligido con la enfermedad maligna, y la administración de la composición farmacéutica o vacuna puede inhibir el comienzo de tal enfermedad, o puede inhibir la progresión y/o metástasis de una enfermedad existente.

La presente invención proporciona además, dentro de otros aspectos, métodos para separar células que expresan WT1 de médula ósea y/o sangre periférica o fracciones de ellas, que comprenden poner en contacto médula ósea, sangre periférica o una fracción de médula ósea o sangre periférica con células T que reaccionan específicamente con un polipéptido de WT1, en los que la etapa de puesta en contacto se realiza en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la separación de células positivas en WT1 hasta menos del 10%, preferiblemente menos del 5% y más preferiblemente menos del 1%, del número de células mieloides o linfáticas en la médula ósea, sangre periférica o fracción. La médula ósea, la sangre periférica y las fracciones pueden obtenerse de un paciente afligido con una enfermedad asociada con expresión de WT1, o pueden obtenerse de un mamífero humano o no humano no afligido con tal enfermedad.

Dentro de aspectos relacionados, se describen también métodos para inhibir el desarrollo de una enfermedad maligna en un paciente, que comprenden administrar a un paciente médula ósea, sangre periférica o una fracción de médula ósea o sangre periférica preparadas como se ha descrito antes. Tales médula ósea, sangre periférica o fracciones pueden ser autólogas, o pueden derivarse de un animal humano o no humano relacionado o no relacionado (por ejemplo, singénico o alogénico).

En otros aspectos, la presente invención proporciona métodos para estimular (o cebar) y/o expandir células T, que comprenden poner en contacto células T con un polipéptido de WT1 en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la estimulación y/o expansión de células T. Tales células T pueden ser autólogas, alogénicas, singénicas o células T específicas para WT1 no relacionadas, y pueden estimularse in vitro o in vivo. Pueden estar presentes, dentro de ciertas realizaciones, células T expandidas dentro de médula ósea, sangre periférica o una fracción de médula ósea o sangre periférica, y pueden ser (aunque no se necesita) clónicas. Dentro de ciertas realizaciones, pueden estar presentes células T en un mamífero durante la estimulación y/o expansión. Pueden usarse células T específicas para WT1, por ejemplo, dentro de infusiones de linfocitos del donante.

Dentro de aspectos relacionados, se describen métodos para inhibir el desarrollo de una enfermedad maligna en un paciente, que comprenden administrar a un paciente células T preparadas como se ha descrito antes. Tales células T pueden ser, dentro de ciertas realizaciones, autólogas, singénicas o alogénicas.

La presente descripción proporciona además, dentro de otros aspectos, métodos para comprobar la eficacia de una inmunización o terapia para una enfermedad maligna asociada con expresión de WT1 en un paciente. Tales métodos se basan en comprobar respuestas de anticuerpos, células TCD4+ y/o células TCD8+ en el paciente. Dentro de tales ciertos aspectos, un método puede comprender las etapas de: (a) incubar una primera muestra biológica con uno o más entre: (i) un polipéptido de WT1; (ii) un polinucleótido que codifica un polipéptido de WT1; o (iii) un antígeno que presenta células que expresan un polipéptido de WT1, en el que la primera muestra biológica se obtiene de un paciente antes de una terapia o inmunización, y en el que la incubación se realiza en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que se formen inmunocomplejos; (b) detectar inmunocomplejos formados entre el polipéptido de WT1 y anticuerpos en la muestra biológica que se unen específicamente al polipéptido de WT1; (c) repetir las etapas (a) y (b) usando una segunda muestra biológica obtenida del mismo paciente tras terapia o inmunización; y (d) comparar el número de inmunocomplejos detectados en la primera y segunda muestras biológicas, y comprobar a partir de ellos la eficacia de la terapia o inmunización en el paciente.

Dentro de ciertas realizaciones de los métodos anteriores, la etapa de detección comprende (a) incubar los inmunocomplejos con un reactivo de detección que sea capaz de unirse a los inmunocomplejos, en el que el reactivo de detección comprende un grupo informador, (b) separar reactivo de detección no unido y (c) detectar la presencia o ausencia del grupo informador. El reactivo de detección puede comprender, por ejemplo, un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, capaz de unirse a los anticuerpos que se unen específicamente al polipéptido de WT1 o una molécula tal como Proteína A. Dentro de otras realizaciones, un grupo informador se une al polipéptido de WT1, y la etapa de detección comprende separar polipéptido de WT1 no unido y detectar subsiguientemente la presencia o ausencia del grupo informador.

Dentro de aspectos adicionales, los métodos para comprobar la eficacia de una inmunización o terapia para una enfermedad maligna asociada con expresión de WT1 en un paciente puede comprender las etapas de: (a) incubar una primera muestra biológica con uno o más entre: (i) un polipéptido de WT1; (ii) un polinucleótido que codifica un polipéptido de WT1; o (iii) un antígeno que presenta células que expresan un polipéptido de WT1, en el que la muestra biológica comprende células T CD4+ y/o CD8+ y se obtiene de un paciente antes de una terapia o inmunización, y en el que la incubación se realiza en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la activación específica, proliferación y/o lisis de células T; (b) detectar una magnitud de activación, proliferación y/o lisis de las células T; (c) repetir las etapas (a) y (b) usando una segunda muestra biológica que comprende células T CD4+ y/o CD8+, en el que la segunda muestra biológica se obtiene del mismo paciente tras terapia o inmunización; y (d) comparar la magnitud de activación, proliferación y/o lisis de las células T en la primera y segunda muestras biológicas, y comprobar a partir de ellas la eficacia de la terapia o inmunización en el paciente.

La presente descripción proporciona además métodos para inhibir el desarrollo de una enfermedad maligna asociada con expresión de WT1 en un paciente, que comprende las etapas de: (a) incubar células T CD4+ y/o CD8+ aisladas de un paciente con uno o más entre: (i) un polipéptido de WT1; (ii) un polinucleótido que codifica un polipéptido de WT1; o (iii) una célula que presenta antígeno que expresa un polipéptido de WT1, de tal modo que proliferen las células T; y (b) administrar al paciente una cantidad eficaz de las células T proliferadas, e inhibir por ello el desarrollo de una enfermedad maligna en el paciente. Dentro de ciertas realizaciones, la etapa de incubar las células T puede repetirse una o más veces.

Dentro de otros aspectos, la presente descripción proporciona métodos para inhibir el desarrollo de una enfermedad maligna asociada con expresión de WT1 en un paciente, que comprende las etapas de: (a) incubar células T CD4+ y/o CD8+ aisladas de un paciente con uno o más entre: (i) un polipéptido de WT1; (ii) un polinucleótido que codifica un polipéptido de WT1; o (iii) una célula que presenta antígeno que expresa un polipéptido de WT1, de tal modo que proliferen las células T; (b) clonar una o más células que proliferaron; y (c) administrar una cantidad eficaz de las células T clonadas.

Dentro de otros aspectos, se proporcionan métodos para determinar la presencia o ausencia de una enfermedad maligna asociada con la expresión de WT1 en un paciente, que comprende las etapas de: (a) incubar células T CD4+ y/o CD8+ aisladas de un paciente con uno o más entre: (i) un polipéptido de WT1; (ii) un polinucleótido que codifica un polipéptido de WT1; o (iii) una célula que presenta antígeno que expresa un polipéptido de WT1; y (b) detectar la presencia o ausencia de activación específica de las células T, determinando por ello la presencia o ausencia de una enfermedad maligna asociada con expresión de WT1. Dentro de ciertas realizaciones, la etapa de detección comprende detectar la presencia o ausencia de proliferación de las células T.

Dentro de aspectos adicionales, la presente descripción proporciona métodos para determinar la presencia o ausencia de una enfermedad maligna asociada con expresión de WT1 en un paciente, que comprende las etapas de: (a) incubar una muestra biológica obtenida de un paciente con uno o más entre: (i) un polipéptido de WT1; (ii) un polinucleótido que codifica un polipéptido de WT1; o (iii) una célula que presenta antígeno que expresa un polipéptido de WT1, en el que la incubación se realiza en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que se formen inmunocomplejos; y (b) detectar inmunocomplejos formados entre el polipéptido de WT1 y anticuerpos en la muestra biológica que se unen específicamente al polipéptido de WT1; y determinar por ello la presencia o ausencia de una enfermedad maligna asociada con expresión de WT1.

Éstos y otros aspectos de la presente invención se harán evidentes con referencia a la siguiente descripción detallada y los dibujos adjuntos.

Descripción breve de los dibujos

La Figura 1 representa una comparación de las secuencias de proteínas de WT1 de ratón (MO) y humana (HU) (SEQ ID NOS: 320 y 319 respectivamente).

La Figura 2 es un manchas de Western que ilustra la detección de anticuerpos específicos de WT1 en pacientes con malignidad hematológica (AML). La pista 1 muestra marcadores de peso molecular; la pista 2 muestra un testigo positivo (linaje celular de leucemia humana positivo en WT1 inmunoprecipitado con anticuerpo específico de WT1); la pista 3 muestra un testigo negativo (linaje celular positivo en WT1 inmunoprecipitado con sueros de ratón); y la pista 4 muestra un linaje celular positivo en WT1 inmunoprecipitado con sueros de un paciente con AML. Para las pistas 2-4, el inmunoprecipitado se separó por electroforesis en gel y se sondó con un anticuerpo específico de WT1.

La Figura 3 es un manchas de Western que ilustra la detección de una respuesta de anticuerpo específico de WT1 en ratones B6 inmunizados con TRAMP-C, un linaje celular de tumor positivo en WT1. Las pistas 1, 3 y 5 muestran marcadores de peso molecular, y las pistas 2, 4 y 6 muestran un testigo positivo específico de WT1 (N180, Santa Cruz Biotechnology, polipéptido que se extiende 180 aminoácidos de la región N-terminal de la proteína de WT1, que migra en las manchas de Western a 52 kD). El anticuerpo primario usado fue WT180 en la pista 2, sueros de ratones B6 no inmunizados en la pista 4 y sueros de los ratones B6 inmunizados en la pista 6.

La Figura 4 es un manchas de Western que ilustra la detección de anticuerpos específicos de WT1 en ratones inmunizados con péptidos de WT1 representativos. Las pistas 1, 3 y 5 muestran marcadores de peso molecular, y las pistas 2, 4 y 6 muestran un testigo positivo específico de WT1 (N180, Santa Cruz Biotechnology, polipéptido que se extiende 180 aminoácidos de la región N-terminal de la proteína de WT1, que migra en las manchas de Western a 52 kD). El anticuerpo primario usado fue WT180 en la pista 2, sueros de ratones B6 no inmunizados en la pista 4 y sueros de los ratones B6 inmunizados en la pista 6.

Las Figuras 5A a 5C son gráficos que ilustran la estimulación de respuestas de células T proliferativas en ratones inmunizados con péptidos de WT1 representativos. Los ensayos de incorporación de timidina se realizaron usando un linaje de células T y dos clones diferentes, como se indica, y los resultados se expresaron como cpm. Los testigos indicados en el eje x fueron no antígeno (no Ag) y B6/medios; los antígenos usados fueron p6-22 humano (p1), p117-139 (p2) o p244-262 humano (p3).

Las Figuras 6A y 6B son histogramas que ilustran la estimulación de respuestas de células T proliferativas en ratones inmunizados con péptidos de WT1 representativos. Tres semanas después de la tercera inmunización, se cultivaron células de bazo de ratones que se habían inoculado con Vacuna A o Vacuna B con medio solo (medio) o células de bazo y medio (B6/no antígeno), las células de bazo de B6 se pulsaron con los péptidos p6-22 (p6), p117-139 (p117), p244-262 (p244) (Vacuna A; Figura 6A) o p287-301 (p287), p299-313 (p299), p421-435 (p421) (Vacuna B; Figura 6B) y células de bazo pulsadas con un péptido testigo irrelevante (péptido irrelevante) a razón de 25 \mug/ml y se ensayó en ellas después de 96 h la proliferación por incorporación de (^{3}H) timidina. Las barras representan el índice de estimulación (SI), que se calcula como la media de los pocillos experimentales dividida por la media del testigo (células de bazo de B6 con no antígeno).

Las Figuras 7A-7D son histogramas que ilustran la generación de linajes de células T proliferativas y clones específicos para p117-139 y p6-22. Tras inmunización in vivo, las tres estimulaciones in vitro iniciales (IVS) se realizaron usando los tres péptidos de Vacuna A o B, respectivamente. Se realizaron IVS subsiguientes como estimulaciones de péptidos simples usando sólo los dos péptidos relevantes p117-139 y p6-22. Se derivaron clones de ambos linajes de células T específicos para p6-22 y p117-139, como se indica. Las células T se cultivaron con medio solo (medio) o células de bazo y medio (B6/no antígeno), células de bazo de B6 pulsadas con los péptidos p6-22 (p6), p117-139 (p117) o un péptido testigo irrelevante (péptido irrelevante) a razón de 25 \mug/ml y se ensayó en ellas después de 96 h la proliferación por incorporación de (^{3}H) timidina. Las barras representan el índice de estimulación (SI), que se calcula como la media de los pocillos experimentales dividida por la media del testigo (células de bazo de B6 con no antígeno).

Las Figuras 8A y 8B presentan los resultados de Análisis TSITES de WT1 humano (SEQ ID NO: 319) para péptidos que tienen el potencial de obtener respuestas de Th. Las regiones indicadas por "A" son puntos medios AMPHI de bloques, "R" indica residuos que se equiparan con el motivo Rothbard/Taylor, "D" indica residuos que se equiparan con el motivo IAd y "d" indica residuos que se equiparan con el motivo IEd.

Las Figuras 9A y 9B son gráficos que ilustran la obtención de CTL específicos para péptido de WT1 en ratones inmunizados con péptidos de WT1. La Figura 9A ilustra la lisis de células objetivo por linajes celulares alogénicos y la Figura 9B muestra la lísis de linajes celulares revestidos de péptido. En cada caso, el % de lisis (determinado por ensayos de liberación de cromo estándares) se muestra en tres relaciones efector:objetivo indicadas. Se proporcionan resultados para células de linfoma (LSTRA y E10), así como E10 + p235-243 (E10+P235). Se hace referencia también aquí a las células E10 como células EL-4.

Las Figuras 10A-10D son gráficos que ilustran la obtención de CTL específicos para WT1, que destruyen linajes celulares de tumores positivos en WT1 pero no destruyen linajes celulares negativos en WT1, tras la vacunación de ratones B6 con péptido de WT1 P117. La Figura 10A ilustra que las células T de ratones B6 no inmunizados no destruyen linajes celulares de tumores positivos en WT1. La Figura 10B ilustra la lisis de las células objetivo por linajes celulares alogénicos. Las Figuras 10C y 10D demuestran la lisis de linajes celulares de tumores positivos en WT1, en comparación con linajes celulares negativos en WT1 en dos experimentos diferentes. Además, las Figuras 10C y 10D muestran la lisis de linajes celulares revestidos de péptido (linaje celular negativo en WT1 E10 revestido con el péptido de WT1 relevante P117). En cada caso, el % de lisis (determinado por ensayos de liberación de cromo estándares) se muestra en tres relaciones efector:objetivo indicadas. Se proporcionan resultados para células de linfoma (E10), células de cáncer de próstata (TRAMP-C), un linaje celular de fibroblastos transformado (BLK-SV40), así como E10+p117.

Las Figuras 11A y 11B son histogramas que ilustran la capacidad de los CTL específicos de péptido P117-139 representativo para lisar células tumorales positivas en WT1. Tres semanas después de la tercera inmunización, células de bazo de ratones que se habían inoculado con los péptidos p235-243 o p117-139 se estimularon in vitro con el péptido relevante y se ensayó su capacidad para lisar objetivos incubados con péptidos de WT1 así como células tumorales positivas y negativas en WT1. Las barras representan el % de lisis específica media en ensayos de liberación de cromo realizados por triplicado con una relación E:T de 25:1. La Figura 11A muestra la actividad citotóxica del linaje de células T específicas de p235-243 contra el linaje celular negativo en WT1 EL-4 (EL-4, WT1 negativo); EL-4 pulsado con el péptido relevante (usado para inmunización así como para reestimulación) p235-243 (EL-4+p235); EL-4 pulsado con los péptidos irrelevantes p117-139 (EL-4+p117); p126-134 (EL-4+p126) o p130-138 (EL-4+p130) y las células tumorales positivas en WT1 BLK-SV40 (BLK-SV40, WT1 positivo) y TRAMP-C (TRAMP-C, WT1 positivo), como se indica. La Figura 11B muestra la actividad citotóxica del linaje de células T específico de p117-139 contra EL-4; EL-4 pulsado con el péptido relevante P117-139 (EL-4+p117) y EL-4 pulsado con los péptidos irrelevantes p123-131 (EL-4+p123), o p128-136 (EL-4+p128); BLK-SV40 y TRAMP-C, como se indica.

Las Figuras 12A y 12B son histogramas que ilustran la especificidad de la lisis de células tumorales positivas en WT1, como se demuestra por inhibición del objetivo frío. Las barras representan el % de lisis específica media en ensayos de liberación de cromo realizados por triplicado con una relación E:T de 25:1. La Figura 12A muestra la actividad citotóxica del linaje de células T específicas de p117-139 contra el linaje celular negativo en WT1 EL-4 (EL-4, WT1 negativo); el linaje de células tumorales positivo en WT1 TRAMP-C (TRAMP-C, WT1 positivo); células TRAMP-C incubadas con un exceso de diez veces (comparado con el objetivo caliente) de células EL-4 pulsadas con el péptido relevante p117-139 (TRAMP-C + objetivo frío p117) sin marcado con ^{51}Cr y células TRAMP-C incubadas con EL-4 pulsado con un péptido irrelevante sin marcado con ^{51}Cr (TRAMP-C + objetivo frío irrelevante), como se indica. La Figura 12B muestra la actividad citotóxica del linaje de células T específico de p117-139 contra el linaje de células negativo en WT1 EL-4 (EL-4, WT1 negativo); el linaje de células tumorales positivo en WT1 BLK-SV40 (BLK-SV40, WT1 positivo); células BLK-SV40 incubadas con el objetivo frío relevante (BLK-SV40 + objetivo frío p117) y células BLK-SV40 incubadas con el objetivo frío irrelevante (BLK-SV40 + objetivo frío irrelevante), como se indica.

Las Figuras 13A-13C son histogramas que representan una evaluación del epítope de CTL de 9 meros dentro de p117-139. Se ensayó el linaje de CTL específico para tumores de p117-139 contra péptidos dentro de aa 117-139 que contiene o que carece de un motivo de unión de H-2^{b} clase I apropiado y tras la reestimulación con p126-134 o p130-138. Las barras representan el % de lisis específica media en ensayos de liberación de cromo realizados por triplicado con una relación E:T de 25:1. La Figura 13A muestra la actividad citotóxica del linaje de células T específicas de p117-139 contra el linaje celular negativo en WT1 EL-4 (EL-4, WT1 negativo) y células EL-4 pulsadas con los péptidos p117-139 (EL-4 + p117), p119-127 (EL-4 + p119), p120-128 (EL-4 + p120), p123-131 (EL-4 + p123), p126-134 (EL-4 + p126), p128-136 (EL-4 + p128) y p130-138 (EL-4 + p130). La Figura 13B muestra la actividad citotóxica del linaje de CTL tras reestimulación con p126-134 contra el linaje de células negativo en WT1 EL-4, células EL-4 pulsadas con p117-139 (El-4 + p117), p126-134 (EL-4 + p126) y el linaje de células tumorales positivo en WT1 TRAMP-C. La Figura 13C muestra la actividad citotóxica del linaje de CTL tras reestimulación con p130-138 contra EL-4, células EL-4 pulsadas con p117-139 (EL-4 + p117), p130-138 (EL-4 + p130) y el linaje de células tumorales positivo en WT1 TRAMP-C.

Descripción detallada de la invención

Como se ha indicado antes, la presente invención se dirige en general a composiciones y métodos para la inmunoterapia y diagnosis de enfermedades malignas. Las composiciones descritas aquí pueden incluir polipéptidos de WT1 de la presente invención, polinucleótidos de WT1, células que presentan antígeno (APC, por ejemplo, células dendríticas) que expresan un polipéptido de WT1, agentes tales como anticuerpos que se unen a un polipéptido de WT1 y/o células del sistema inmune (por ejemplo, células T) específicas para WT1. Los polipéptidos de WT1 de la presente invención comprenden generalmente al menos una porción de un producto génico de Tumor de Wilms (WT1). Las secuencias de ácidos nucleicos de la invención sujeto comprenden generalmente una secuencia de ADN o ARN que codifica todo o una porción de tal polipéptido, o que es complementaria de tal secuencia. Los anticuerpos son generalmente proteínas del sistema inmune, o fragmentos de unión a antígeno de las mismas, que son capaces de unirse a una porción de un polipéptido de WT1. Las células T que pueden emplearse dentro de tales composiciones son generalmente células T (por ejemplo, CD4^{+} y/o CD8^{+}) que son específicas para un polipéptido de WT1. Ciertos métodos descritos aquí emplean además células que presentan antígeno que expresan un polipéptido de WT1 como se proporciona aquí.

La presente invención se basa en el descubrimiento de que una respuesta inmune producida contra un producto génico de Tumor de Wilms (WT) (por ejemplo, WT1) puede proporcionar un beneficio profiláctico y/o terapéutico para pacientes afligidos con enfermedades malignas caracterizadas por expresión de genes de WT1 aumentada. Tales enfermedades incluyen, aunque sin limitarse a ellas, leucemias (por ejemplo, leucemia mieloide aguda (AML), leucemia mieloide crónica (CML), leucemia linfocítica aguda (ALL) y ALL de la infancia), así como muchos cánceres tales como cánceres de pulmón, pecho, tiroides y gastrointestinal, y melanomas. El gen de WT1 se identificó originalmente y se aisló sobre la base de supresión citogenética en el cromosoma 11p13 en pacientes con tumor de Wilms (véase Call et al., Patente de los EE.UU. Nº 5.350.840). El gen consiste en 10 exones y codifica un factor de transcripción de dedo de zinc, y se proporcionan secuencias de proteínas de WT1 de ratón y humanas en la Figura 1 y SEQ ID NOs: 319 y 320.

Polipéptidos de WT1

Dentro del contexto de la presente invención, un polipéptido de WT1 es un polipéptido que comprende al menos una porción inmunógena de un WT1 nativo (es decir, una proteína de WT1 expresada por un organismo que no está modificado genéticamente) o una variante del mismo, como se describe aquí. Un polipéptido de WT1 puede ser de cualquier longitud, siempre que comprenda al menos una porción inmunógena de una proteína nativa o una variante de ella. En otras palabras, un polipéptido de WT1 puede ser un oligopéptido (es decir, consistente en un número relativamente pequeño de residuos de aminoácidos, tal como 8-10 residuos, unidos por enlaces péptido), una proteína de WT1 de longitud completa (por ejemplo, presente dentro de un animal humano o no humano, tal como un ratón) o un polipéptido de tamaño intermedio. Dentro de ciertas realizaciones, se prefiere el uso de polipéptidos de WT1 que contienen un número pequeño de residuos de aminoácidos consecutivos de un polipéptido de WT1 nativo. Tales polipéptidos se prefieren para ciertos usos en los que se desea la generación de una respuesta de células T. Por ejemplo, tal polipéptido de WT1 puede contener menos de 23, preferiblemente no más de 18 y más preferiblemente no más de 15 residuos de aminoácidos consecutivos, de un polipéptido de WT1 nativo. Son generalmente adecuados para tales fines polipéptidos que comprenden nueve residuos de aminoácidos consecutivos de un polipéptido de WT1 nativo. Pueden estar presentes secuencias adicionales derivadas de la proteína nativa y/o secuencias heterólogas dentro de cualquier polipéptido de WT1, y tales secuencias pueden (aunque no necesitan) poseer propiedades inmunógenas o antígenas adicionales. Los polipéptidos como se proporcionan aquí pueden asociarse además (covalente o no covalentemente) con otros compuestos polipéptidos o no polipéptidos.

Una "porción inmunógena" según se usa aquí es una porción de un polipéptido que es reconocida (es decir, unida específicamente) por un receptor antígeno superficial de células B y/o células T. Ciertas porciones inmunógenas preferidas se unen a una molécula de MHC clase I o clase II. Según se usa aquí, se dice que una porción inmunógena "se une a" una molécula de MHC clase I o clase II si tal unión es detectable usando un ensayo conocido en la técnica. Por ejemplo, puede evaluarse indirectamente la capacidad de un polipéptido para unirse a MHC clase I comprobando la capacidad para promover la incorporación de \beta2-microglobulina marcada con ^{125}I (\beta2m) a complejos heterotrimétricos de MHC clase I/\beta2m/péptido (véase Parker et al., J. Immunol. 152:163, 1994). Alternativamente, pueden emplearse ensayos de competencia de péptidos funcionales que son conocidos en la técnica. Ciertas porciones inmunógenas tienen una o más de las secuencias indicadas dentro de una o más de las Tablas II-XIV. Las porciones inmunógenas representativas incluyen, aunque sin limitarse a ellas, RDLNALLPAVPSLGGGG (residuos de WT1 humano 6-22; SEQ ID NO: 1), PSQASSGQARMFPNAPYLPSCLE (residuos de WT1 humano y de ratón 117-139; SEQ ID NOs: 2 y 3 respectivamente), GATLKGVAAGSSSSVKWTE (residuos de WT1 humano 244-262; SEQ ID NO: 4), GATLKGVAA (residuos de WT1 humano 244-252; SEQ ID NO: 88), CMTWNQMNL (residuos de WT1 humano y de ratón 235-243; SEQ ID NOs: 49 y 258 respectivamente), SCLESQPTI (residuos de WT1 de ratón 136-144; SEQ ID NO: 296), SCLESQPAI (residuos de WT1 humano 136-144; SEQ ID NO: 198); NLYQMTSQL (residuos de WT1 humano y de ratón 225-233; SEQ ID NOs: 147 y 284 respectivamente); ALLPAVSSL (residuos de WT1 de ratón 10-18; SEQ ID NO: 255); o RMFPNAPYL (residuos de WT1 humano y de ratón 126-134; SEQ ID NOs: 185 y 293 respectivamente). Se proporcionan aquí porciones inmunógenas adicionales, y otras pueden identificarse generalmente usando técnicas muy conocidas, tales como las resumidas en Paul, Fundamental Immunology, 3ª ed., 243-247 (Raven Press, 1993) y las referencias citadas allí. Las técnicas representativas para identificar porciones inmunógenas incluyen examinar en polipéptidos la capacidad para reaccionar con antisueros específicos de antígenos y/o linajes de células T o clones. Una porción inmunógena de un polipéptido de WT1 nativo es una porción que reacciona con tales antisueros y/o células T en un nivel que no es sustancialmente menor que la reactividad del WT1 de longitud completa (por ejemplo, en un ensayo ELISA y/o de reactividad de células T). En otras palabras, una porción inmunógena puede reaccionar dentro de tales ensayos en un nivel que es similar o mayor que la reactividad del polipéptido de longitud completa. Tales exámenes pueden realizarse generalmente usando métodos muy conocidos por los de experiencia ordinaria en la técnica, tales como los descritos en Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988.

Alternativamente, pueden identificarse porciones inmunógenas usando análisis de ordenador, tales como el programa Tsites (véase Rothbard y Taylor, EMBO J. 7:93-100, 1988; Deavin et al., Mol. Immunol. 33:145-155, 1996), que busca motivos péptido que tengan el potencial de obtener respuestas de Th. Pueden identificarse péptidos de CTL con motivos apropiados para unirse a MHC clase I o clase II de ratón y humana según BIMAS (Parker et al., J. Immunol. 152:163, 1994) y otros análisis de predicción de unión de péptidos de HLA. Para confirmar inmunogenicidad, puede ensayarse un péptido usando un modelo de ratón transgénico de HLA A2 y/o un ensayo de estimulación in vitro usando células dendríticas, fibroblastos o células de sangre periférica.

Como se ha indicado antes, una composición puede comprender una variante de una proteína de WT1 nativo. Una "variante" de polipéptido, como se usa aquí, es un polipéptido que difiere de un polipéptido nativo en una o más sustituciones, supresiones, adiciones y/o inserciones de tal modo que se mantenga la inmunogenicidad del polipéptido (es decir, la capacidad de la variante para reaccionar con antisueros específico de antígenos y/o linajes de células T o clones no está disminuida sustancialmente con relación al polipéptido nativo). En otras palabras, puede aumentarse o inalterarse la capacidad de una variante para reaccionar con antisueros específicos de antígenos y/o linajes de células T o clones, con relación al polipéptido nativo, o puede disminuirse en menos del 50%, y preferiblemente menos del 20%, con relación al polipéptido nativo. Tales variantes pueden identificarse generalmente modificando una de las secuencias de polipéptidos anteriores y evaluando la reactividad del polipéptido modificado con antisueros y/o células T como se describe aquí. Se ha encontrado, dentro del contexto de la presente invención, que un número relativamente pequeño de sustituciones (por ejemplo, de 1 a 3) dentro de una porción inmunógena de un polipéptido de WT1 puede servir para aumentar la capacidad del polipéptido para obtener una respuesta inmune. Pueden identificarse generalmente sustituciones adecuadas usando programas de ordenador, como se ha descrito antes, y confirmarse el efecto en base a la reactividad del polipéptido modificado con antisueros y/o células T como se describe aquí. Por consiguiente, dentro de ciertas realizaciones preferidas, un polipéptido de WT1 comprende una variante en la que están sustituidos de 1 a 3 residuos de aminoácidos dentro de una porción inmunógena de tal modo que la capacidad para reaccionar con antisueros específicos de antígenos y/o linajes de células T o clones es sustancialmente mayor que la del polipéptido no modificado. Tales sustituciones están situadas preferiblemente dentro de un lugar de unión de MHC del polipéptido, que pueden identificarse como se ha descrito antes. Las sustituciones preferidas permiten una unión aumentada a moléculas de MHC clase I o clase II.

Ciertas variantes contienen sustituciones conservadoras. Una "sustitución conservadora" es una en la que un aminoácido es sustituido por otro aminoácido que tiene propiedades similares, de tal modo que un experto en la técnica de química de péptidos esperaría que la estructura secundaria y la naturaleza hidropática del polipéptido fueran sustancialmente inalteradas. Las sustituciones de aminoácidos pueden hacerse generalmente sobre la base de similitud de polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los residuos. Por ejemplo, los aminoácidos cargados negativamente incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos cargados positivamente incluyen lisina y arginina; y los aminoácidos con grupos de cabeza polares no cargados que tienen valores de hidrofilicidad similares incluyen leucina, isoleucina y valina; glicina y alanina; asparagina y glutamina; y serina, treonina, fenilalanina y tirosina. Otros grupos de aminoácidos que pueden representar cambios conservadores incluyen: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; y (5) phe, tyr, trp, his. Una variante puede contener, también o alternativamente, cambios no conservadores. Las variantes pueden modificarse también (o alternativamente) mediante, por ejemplo, la supresión o adición de aminoácidos que tienen influencia mínima en la inmunogenicidad, estructura secundaria y naturaleza hidropática del polipéptido.

Como se ha indicado antes, pueden conjugarse polipéptidos de WT1 a una secuencia señal (o líder) en el extremo N-terminal de la proteína que dirige co-traductoramente o post-traductoramente la transferencia de la proteína. Un polipéptido puede conjugarse también, o alternativamente, a un enlazador u otra secuencia para facilidad de síntesis, purificación o identificación del polipéptido (por ejemplo, poli-His), o para aumentar la unión del polipéptido a un soporte sólido. Por ejemplo, un polipéptido puede conjugarse a una región de inmunoglobulina Fc.

Pueden prepararse polipéptidos de WT1 usando alguna de una variedad de técnicas muy conocidas. Pueden prepararse a partir del polinucleótido polipéptidos recombinantes codificados por un polinucleótido de WT1 como se describe aquí. En general, cualquiera de una variedad de vectores de expresión conocidos por los de experiencia ordinaria en la técnica puede emplearse para expresar polipéptidos de WT1 recombinantes. La expresión puede conseguirse en cualquier célula hospedante apropiada que se haya transformado o transfectado con un vector de expresión que contenga una molécula de ADN que codifique un polipéptido recombinante. Las células hospedantes adecuadas incluyen células procariotas, de levadura y eucariotas superiores. Preferiblemente, las células hospedantes empleadas son E.coli, levadura o un linaje celular de mamífero tal como COS o CHO. Los sobrenadantes de sistemas de hospedante/vector adecuados que segregan proteína o polipéptido recombinantes en medios de cultivo pueden concentrarse primero usando un filtro disponible comercialmente. El concentrado puede aplicarse después a una matriz de purificación adecuada tal como una matriz de afinidad o una resina de intercambio iónico. Finalmente, pueden emplearse una o más etapas de HPLC de fase inversa para purificar adicionalmente un polipéptido recombinante. Tales técnicas pueden usarse para preparar polipéptidos nativos o variantes de ellos. Por ejemplo, pueden prepararse generalmente polinucleótidos que codifican una variante de un polipéptido nativo usando técnicas de mutagénesis estándares, tales como mutagénesis específica para el lugar dirigida por oligonucleótido, y pueden separarse secciones de la secuencia de ADN para permitir la preparación de polipéptidos truncados.

Ciertas porciones y otras variantes pueden generarse también por medios sintéticos, usando técnicas muy conocidas por los de experiencia ordinaria en la técnica. Por ejemplo, pueden sintetizarse polipéptidos que tengan menos de aproximadamente 500 aminoácidos, preferiblemente menos de aproximadamente 100 aminoácidos y más preferiblemente menos de aproximadamente 50 aminoácidos. Pueden sintetizarse polipéptidos usando cualquiera de las técnicas en fase sólida disponibles comercialmente, tales como el método de síntesis en fase sólida de Merrifield, en el que se añaden secuencialmente aminoácidos a una cadena de aminoácidos creciente. Véase Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2146, 1963. El equipo para síntesis automatizada de polipéptidos está disponible comercialmente de suministradores tales como Applied BioSystems, Inc. Foster City, CA) y puede hacerse funcionar según las instrucciones del fabricante.

En general, los polipéptidos y polinucleótidos como se describen aquí son aislados. Un polipéptido o polinucleótido "aislado" es uno que se separa de su entorno original. Por ejemplo, una proteína de origen natural se aísla si se separa de algunos o todos los materiales coexistentes en el sistema natural. Preferiblemente, tales polipéptidos son al menos aproximadamente 90% puros, más preferiblemente al menos aproximadamente 95% puros y aún más preferiblemente al menos aproximadamente 99% puros. Un polinucleótido se considera que está aislado si, por ejemplo, se clona en un vector que no es parte del entorno natural.

Dentro de aspectos adicionales, la presente invención proporciona miméticos de polipéptidos de WT1. Tales miméticos pueden comprender aminoácidos enlazados a uno o más miméticos de aminoácidos (es decir, pueden sustituirse uno o más aminoácidos dentro de la proteína de WT1 por un aminoácido mimético) o pueden ser totalmente miméticos no péptidos. Un aminoácido mimético es un compuesto que es similar conformacionalmente a un aminoácido, de tal modo que puede sustituirse por un aminoácido dentro de un polipéptido de WT1 sin disminuir sustancialmente la capacidad para reaccionar con antisueros específicos de antígenos y/o linajes celulares T o clones. Un mimético no péptido es un compuesto que no contiene aminoácidos, y que tiene una conformación global que es similar a un polipéptido de WT1, de tal modo que la capacidad del mimético para reaccionar con antisueros específicos de WT1 y/o linajes celulares T o clones no disminuye sustancialmente con relación a la capacidad de un polipéptido de WT1. Tales miméticos pueden diseñarse en base a técnicas estándares (por ejemplo, resonancia magnética nuclear y técnicas de ordenador) que evalúan la estructura tridimensional de una secuencia de péptido. Pueden diseñarse miméticos en los que una o más de las funcionalidades de cadenas secundarias del polipéptido de WT1 se sustituyen por grupos que no tienen necesariamente el mismo tamaño o volumen, pero tienen propiedades químicas y/o físicas similares que producen respuestas biológicas similares. Debe entenderse que, dentro de las realizaciones descritas aquí, un mimético puede ser sustituido por un polipéptido de WT1.

Polinucleótidos de WT1

Cualquier polinucleótido que codifique un polipéptido de WT1 como se describe aquí es un polinucleótido de WT1 abarcado por la presente invención. Tales polinucleótidos pueden ser de cadena sencilla (de codificación o antisentido) o de doble cadena, y pueden ser moléculas de ADN (genómico, cADN o sintético) o de ARN. Pueden estar presentes secuencias de codificación o no codificación adicionales, aunque no se necesitan, dentro de un polinucleótido de la presente invención, y un polinucleótido puede, aunque no se necesita, estar enlazado a otras moléculas y/o materiales de soporte.

Los polinucleótidos de WT1 pueden codificar una proteína de WT1 nativa, o pueden codificar una variante de WT1 como se describe aquí. Las variantes de polinucleótidos pueden contener una o más sustituciones, adiciones, supresiones y/o inserciones de tal modo que no se disminuya la inmunogenicidad del polipéptido codificado, con relación a una proteína de WT1 nativa. El efecto sobre la inmunogenicidad del polipétido codificado puede valorarse generalmente como se describe aquí. Las variantes preferidas contienen sustituciones, supresiones, inserciones y/o adiciones de nucleótidos en no más del 20%, preferiblemente en no más del 10%, de las posiciones de nucleótidos que codifican una porción inmunógena de una secuencia de WT1 nativa. Ciertas variantes son sustancialmente homólogas a un gen nativo, o una porción del mismo. Tales variantes de polinucleótidos son capaces de hibridarse bajo condiciones moderadamente rigurosas con una secuencia de ADN de origen natural que codifica un polipéptido de WT1 (o una secuencia complementaria). Las condiciones moderadamente rigurosas adecuadas incluyen prelavado en una solución de 5 x SSC, 0,5% de SDS, EDTA 1,0 mM (pH 8,0); hibridación a 50ºC-65ºC, 5 x SSC, durante la noche; seguido por lavado dos veces a 65ºC durante 20 minutos con cada uno entre 2 x, 0,5 x y 0,2 x SSC que contiene 0,1% de SDS). Tales secuencias de ADN de hibridación están también dentro del alcance de esta invención.

Se apreciará por los de experiencia ordinaria en la técnica que, como resultado de la degeneración del código genético hay muchas secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido WT1. Algunos de estos polinucleótidos tienen una homología mínima con la secuencia de nucleótidos de cualquier gen nativo. No obstante, se consideran específicamente por la presente invención polinucleótidos que varían debido a diferencias en la utilización del
codón.

Una vez que se identifica una porción inmunógena de WT1, como se ha descrito antes, puede prepararse un polinucleótido de WT1 usando cualquiera entre una variedad de técnicas. Por ejemplo, un polinucleótido de WT1 puede multiplicarse de cADN preparado a partir de células que expresan WT1. Tales polinucleótidos pueden multiplicarse mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR). Para este método, pueden diseñarse cebadores específicos de secuencia en base a la secuencia de la porción inmunógena y pueden comprarse o sintetizarse. Por ejemplo, los cebadores adecuados para multiplicación por PCR de un gen de WT1 humano incluyen: primera etapa - P118: 1434-1414: 5' GAG AGT CAG ACT TGA AAG CAGT 3' (SEQ ID NO: 5) y P135: 5' CTG AGC CTC AGC AAA TGG GC 3' (SEQ ID NO: 6); segunda etapa - P136: 5' GAG CAT GCA TGG GCT CCG ACG TGC GGG 3' (SEQ ID NO: 7) y P137: 5' GGG GTA CCC ACT GAA CGG TCC CCG A 3' (SEQ ID NO: 8). Los cebadores para multiplicación por PCR de un gen de WT1 de ratón incluyen: primera etapa: - P138: 5' TCC GAG CCG CAC CTC ATG 3' (SEQ ID NO: 9) y P139: 5' GCC TGG GAT GCT GGA CTG 3' (SEQ ID NO: 10), segunda etapa - P140: 5' GAG CAT GCG ATG GGT TCC GAC GTG CGG 3' (SEQ ID NO: 11) y P141: 5' GGG GTA CCT CAA AGC GCC ACG TGG AGT TT 3' (SEQ ID NO: 12).

Puede usarse después una porción multiplicada para aislar un gen de longitud completa de una genoteca de ADN genómico humano o de una genoteca de cADN adecuada, usando técnicas bien conocidas. Alternativamente, puede construirse un gen de longitud completa a partir de múltiples fragmentos de PCR. Pueden prepararse también polinucleótidos de WT1 sintetizando componentes oligonucleótidos y ligando entre sí los componentes para generar el polinucleótido completo.

Pueden sintetizarse también polinucleótidos de WT1 por cualquier método conocido en la técnica, incluyendo síntesis química (por ejemplo, síntesis química de fósforoamidita en fase sólida). También pueden introducirse modificaciones en una secuencia de polinucleótido usando técnicas de mutagénesis estándares, tales como mutagénesis específica para el lugar dirigida por oligonucleótido (véase Adelman et al., DNA 2:183, 1983). Alternativamente, pueden generarse moléculas de ARN por transcripción in vitro o in vivo de secuencias de ADN que codifican un polipéptido de WT1, siempre que el ADN se incorpore a un vector con un promotor de polimerasa de ARN adecuado (tal como T7 o SP6). Ciertas porciones pueden usarse para preparar un polipéptido codificado, como se describe aquí. Además, o alternativamente, puede administrarse una porción a un paciente de tal modo que el polipéptido codificado se genere in vivo (por ejemplo, transfectando células que presentan antígeno tales como células dendríticas con una construcción de cADN que codifique un polipéptido de WT1, y administrando al paciente las células transfectadas).

Pueden usarse en general polinucleótidos que codifican un polipéptido de WT1 para producir el polipéptido, in vitro o in vivo. Pueden usarse también polinucleótidos de WT1 que sean complementarios de una secuencia de codificación (es decir, polinucleótidos antisentido) como sonda o para inhibir la expresión de WT1. Pueden introducirse también en las células de tejidos construcciones de cADN que puedan transcribirse en ARN antisentido para facilitar la producción de ARN antisentido.

Cualquier polinucleótido puede modificarse adicionalmente para aumentar la estabilidad in vivo. Las modificaciones posibles incluyen, aunque sin limitarse a ellas, la adición de secuencias flanqueantes en los extremos 5' y/o 3'; el uso de enlaces fósforotioato o 2' O-metilo en lugar de fosfodiesterasa en la cadena principal; y/o la inclusión de bases no tradicionales tales como inosina, queosina y wybutosina, así como acetil-, metil-, tio- y otras formas modificadas de adenina, citidina, guanina, timina y uridina.

Las secuencias de nucleótidos como se describen aquí pueden unirse a una variedad de otras secuencias de nucleótidos usando técnicas de ADN recombinante establecidas. Por ejemplo, un polinucleótido puede clonarse en cualquiera de una variedad de vectores de clonación, incluyendo plásmidos, fagémidos, derivados de fago lambda y cósmidos. Los vectores de particular interés incluyen vectores de expresión, vectores de replicación, vectores de generación de sondas y vectores de determinación de secuencia. En general, un vector contendrá un origen de replicación funcional en al menos un organismo, lugares de endonucleasas de restricción convenientes y uno o más marcadores seleccionables. Otros elementos dependerán del uso deseado, y serán evidentes para los de experiencia ordinaria en la técnica.

Dentro de ciertas realizaciones, pueden formularse polinucleótidos para permitir la entrada en una célula de un mamífero, y expresarse en ella. Tales formulaciones son particularmente útiles con fines terapéuticos, como se describe después. Los de experiencia ordinaria en la técnica apreciarán que hay muchas formas para conseguir expresión de un polinucleótido en una célula objetivo, y puede emplearse cualquier método adecuado. Por ejemplo, puede incorporarse un polinucleótido a un vector vírico tal como, aunque sin limitarse a ellos, adenovirus, virus adeno-asociado, retrovirus o viruela u otro virus de viruela (por ejemplo, virus de la viruela aviar). Las técnicas para incorporar ADN a tales vectores son muy conocidas por los de experiencia ordinaria en la técnica. Un vector retrovírico puede transferir o incorporar adicionalmente un gen para un marcador seleccionable (para ayudar en la identificación o selección de células transducidas) y/o un resto de fijación de objetivo, tal como un gen que codifica un ligando para un receptor en una célula objetivo específica, para hacer específico al objetivo del vector. La fijación de objetivo puede conseguirse también usando un anticuerpo, por métodos conocidos por los de experiencia ordinaria en la técnica. Pueden usarse construcciones de cADN dentro de tal vector, por ejemplo, para transfectar linajes celulares humanos o de animales de uso en el establecimiento de modelos de tumores positivos en WT1 que pueden usarse para realizar experimentos de protección de tumores e inmunoterapia adoptiva para demostrar inhibición del crecimiento del tumor o leucemia o lisis de tales células.

Otras formulaciones terapéuticas para polinucleótidos incluyen sistemas de dispersión coloidal, tales como complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, perlas y sistemas basados en lípidos que incluyen emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mezcladas y liposomas. Un sistema coloidal preferido de uso como vehículo de entrega in vitro e in vivo es un liposoma (es decir, una vesícula de membrana artificial). La preparación y uso de tales sistemas son muy conocidos en la técnica.

Anticuerpos y fragmentos de ellos

La presente invención proporciona además agentes de unión, tales como anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de ellos, que se unen específicamente a un polipéptido de WT1. Según se usa aquí, se dice que un agente "se une específicamente" a un polipéptido de WT1 si reacciona en un nivel detectable (dentro de, por ejemplo, un ELISA) con un polipéptido de WT1, y no reacciona detectablemente con proteínas no relacionadas en condiciones similares. Según se usa aquí, "unión" se refiere a una asociación no covalente entre dos moléculas separadas, de tal modo que se forma un "complejo". La capacidad para unirse puede evaluarse, por ejemplo, determinando una constante de unión para la formación del complejo. La constante de unión es el valor obtenido cuando se divide la concentración del complejo por el producto de las concentraciones de componentes. En general, se dice que dos compuestos "se unen" en el contexto de la presente invención cuando la constante de unión para la formación de complejo excede de aproximadamente 10^{3} l/mol. La constante de unión puede determinarse usando métodos muy conocidos en la
técnica.

Cualquier agente que satisfaga los requisitos anteriores puede ser un agente de unión. En una realización preferida, un agente de unión es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Ciertos anticuerpos están disponibles comercialmente de, por ejemplo, Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Alternativamente, pueden prepararse anticuerpos por cualquiera de una variedad de técnicas conocidas por los de experiencia ordinaria en la técnica. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. En general, pueden producirse anticuerpos por técnicas de cultivo de células, incluyendo la generación de anticuerpos monoclonales como se describe aquí, o mediante transfección de genes de anticuerpos en hospedantes células bacterianas o de mamífero adecuadas, con el fin de permitir la producción de anticuerpos recombinantes. En una técnica, un inmunógeno que comprende el polipéptido se inyecta inicialmente en cualquiera de una variedad de mamíferos (por ejemplo, ratones, ratas, conejos, ovejas o cabras). En esta etapa, los polipéptidos de esta invención pueden servir como inmunógeno sin modificación. Alternativamente, particularmente para polipéptidos relativamente cortos, puede obtenerse una respuesta inmune superior si se une el polipéptido a una proteína vehículo, tal como albúmina de suero de bovino o hemocianina de lapa ojo de cerradura. El inmunógeno se inyecta en el animal hospedante, preferiblemente según un programa predeterminado que incorpora una o más inmunizaciones de refuerzo, y se sangra a los animales periódicamente. Pueden purificarse después anticuerpos policlonales específicos para el polipéptido a partir de tales antisueros mediante, por ejemplo, cromatografía de afinidad, usando el polipéptido acoplado a un soporte sólido adecuado.

Pueden prepararse anticuerpos monoclonales específicos para el polipéptido antígeno de interés, por ejemplo, usando la técnica de Kohler y Milstein, Eur. J. Immunol. 6:511-519, 1976, y mejoras de ella. Brevemente, estos métodos implican la preparación de linajes celulares inmortales capaces de producir anticuerpos que tengan la especificidad deseada (es decir, reactividad con el polipéptido de interés). Tales linajes celulares pueden producirse, por ejemplo, de células de bazo obtenidas de un animal inmunizado como se ha descrito antes. Las células de bazo se inmortalizan después mediante, por ejemplo, fusión con un compañero de fusión célula de mieloma, preferiblemente uno que sea singénico con el animal inmunizado. Puede emplearse una variedad de técnicas de fusión. Por ejemplo, las células de bazo y las células de mieloma pueden combinarse con un detergente no iónico durante unos pocos minutos y ponerse después en placa con baja densidad en un medio selectivo, que soporte el crecimiento de células híbridas, pero no células de mieloma. Una técnica de selección preferida usa selección HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina). Después de un tiempo suficiente, usualmente alrededor de 1 a 2 semanas, se observan colonias de híbridos. Se seleccionan colonias simples y se ensaya en sus sobrenadantes de cultivo la actividad de unión frente al polipéptido. Se prefieren hibridomas que tengan altas reactividad y especificidad.

Pueden aislarse anticuerpos monoclonales de los sobrenadantes de colonias de hibridomas en crecimiento. Además, pueden emplearse diversas técnicas para aumentar el rendimiento tales como inyección del linaje celular del hibridoma en la cavidad peritoneal de un hospedante vertebrado adecuado, tal como un ratón. Los anticuerpos monoclonales pueden cosecharse después del fluido ascítico o la sangre. Pueden separarse contaminantes de los anticuerpos por técnicas convencionales, tales como cromatografía, filtración en gel, precipitación y extracción. Los polipéptidos de esta invención pueden usarse en el procedimiento de purificación en, por ejemplo, una etapa de cromatografía de afinidad.

Dentro de ciertas realizaciones, puede preferirse el uso de fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos. Tales fragmentos incluyen fragmentos Fab, que pueden prepararse usando técnicas estándares. Brevemente, pueden purificarse inmunoglobulinas de suero de conejo por cromatografía de afinidad en columnas de perlas de Proteína A (Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) y digerirse mediante papaína para producir fragmentos Fab y Fc. Los fragmentos Fab y Fc pueden separarse por cromatografía de afinidad en columnas de perlas de proteína A.

Pueden acoplarse anticuerpos monoclonales y fragmentos de ellos a uno o más agentes terapéuticos. Los agentes adecuados a este respecto incluyen trazadores radioactivos y agentes quimioterapéuticos, que pueden usarse, por ejemplo, para purgar médula ósea autóloga in vitro. Los agentes terapéuticos representativos incluyen radionúclidos, inductores de diferenciación, fármacos, toxinas y derivados de ellos. Los radionúclidos preferidos incluyen ^{90}Y, ^{123}I, ^{125}I, ^{131}I, ^{186}Re, ^{188}Re, ^{211}At y ^{212}Bi. Los fármacos preferidos incluyen metotrexato y análogos de pirimidina y purina. Los inductores de diferenciación preferidos incluyen ésteres de forbol y ácido butírico. Las toxinas preferidas incluyen ricina, abrina, toxina de la difteria, toxina del cólera, gelonina, exotoxina de Pseudomonas, toxina de Shigella y proteína antivírica de hierba carmesí. Con fines de diagnóstico, puede usarse acoplamiento de agentes radioactivos para facilitar el trazado de metástasis o para determinar la localización de tumores positivos en WT1.

Un agente terapéutico puede acoplarse (por ejemplo, unirse covalentemente) a un anticuerpo monoclonal adecuado directa o indirectamente (por ejemplo, mediante un grupo enlazador). Es posible una reacción directa entre un agente y un anticuerpo cuando cada uno posee un sustituyente capaz de reaccionar con el otro. Por ejemplo, un grupo nucleófilo, tal como un grupo amino o sulfhidrilo, en uno puede ser capaz de reaccionar con un grupo que contenga carbonilo, tal como un anhídrido o un haluro de ácido, o con un grupo alquilo que contenga un buen grupo lábil (por ejemplo, un haluro) en el otro.

Alternativamente, puede ser deseable acoplar un agente terapéutico y un anticuerpo mediante un grupo enlazador. Un grupo enlazador puede funcionar como un espaciador para distanciar un anticuerpo de un agente con el fin de evitar interferencia con capacidades de unión. Un grupo enlazador puede servir también para aumentar la reactividad química de un sustituyente en un agente o un anticuerpo, y aumentar así la eficacia de acoplamiento. Un aumento de la reactividad química puede facilitar también el uso de agentes, o grupos funcionales en agentes, que no sería posible de otro modo.

Será evidente para los expertos en la técnica que puede emplearse como grupo enlazador una variedad de reactivos bifuncionales o polifuncionales, homo y heterofuncionales (tales como los descritos en el catálogo de la Pierce Chemical Co., Rockford, IL). El acoplamiento puede efectuarse, por ejemplo, a través de grupos amino, grupos carboxilo, grupos sulfhidrilo o residuos de hidratos de carbono oxidados. Hay numerosas referencias que describen tal metodología, por ejemplo, la Patente de los EE.UU. Nº 4.671.958, de Rodwell et al.

En donde un agente terapéutico sea más potente cuando está libre de la porción de anticuerpo de los inmunoconjugados de la presente invención, puede ser deseable usar un grupo enlazador que sea divisible durante o por internalización en una célula. Se ha descrito un cierto número de grupos enlazadores divisibles diferentes. El mecanismo para la liberación intracelular de un agente de estos grupos enlazadores incluye división por reducción de un enlace disulfuro (por ejemplo, Patente de los EE.UU. Nº 4.489.710 de Spitler), por irradiación de un enlace fotolábil (por ejemplo, Patente de los EE.UU. Nº 4.625.014 de Senter et al.), por hidrólisis de cadenas secundarias de aminoácidos derivadas (por ejemplo, Patente de los EE.UU. Nº 4.638.045 de Kohn et al.), por hidrólisis mediada por complemento de suero (por ejemplo, Patente de los EE.UU. Nº 4.671.958 de Rodwell et al.) e hidrólisis catalizada por ácidos (por ejemplo, Patente de los EE.UU. Nº 4.569.789 de Blattler et al.).

Puede ser deseable acoplar más de un agente a un anticuerpo. En una realización, se acoplan moléculas múltiples de un agente a una molécula de anticuerpo. En otra realización, puede acoplarse a un anticuerpo más de un tipo de agente. Independientemente de la realización particular, pueden prepararse de una variedad de formas inmunoconjugados con más de un agente. Por ejemplo, más de un agente puede acoplarse directamente a una molécula de anticuerpo, o pueden usarse enlazadores que proporcionan múltiples lugares para incorporación. Alternativamente, puede usarse un vehículo. Un vehículo puede llevar los agentes de una variedad de formas, incluyendo enlace covalente directamente o mediante un grupo enlazador. Los vehículos adecuados incluyen proteínas tales como albúminas (por ejemplo, Patente de los EE.UU. Nº 4.507.234 de Kato et al.), péptidos y polisacáridos tales como aminodextrano (por ejemplo, Patente de los EE.UU. Nº 4.699.784 de Shih et al.). Un vehículo también puede llevar un agente por enlace no covalente o por encapsulación, tal como dentro de una vesícula de liposoma (por ejemplo, Patentes de, los EE.UU. Nº 4.429.008 y 4.873.088). Los vehículos específicos para agentes radionúclidos incluyen pequeñas moléculas radiohalogenadas y compuestos de quelación. Por ejemplo, la Patente de los EE.UU. Nº 4.735.792 describe pequeñas moléculas radiohalogenadas representativas y su síntesis. Puede formarse un quelato de radionúclido a partir de compuestos de quelación que incluyen los que contienen átomos de nitrógeno y azufre como átomos donantes para unir el radionúclido metal u óxido de metal. Por ejemplo, la Patente de los EE.UU. Nº 4.673.562 de Davison et al. describe compuestos de quelación representativos y su síntesis.

Puede usarse una variedad de vías de administración para los anticuerpos e inmunoconjugados. Típicamente, la administración será intravenosa, intramuscular, subcutánea o en la base de un tumor reseccionado. Será evidente que la dosis precisa del conjugado anticuerpo/inmunoconjugado variará dependiendo del anticuerpo usado, la densidad de antígeno en el tumor y la velocidad de eliminación del anticuerpo.

También se proporcionan aquí anticuerpos anti-idiotípicos que imitan una porción inmunógena de WT1. Tales anticuerpos pueden producirse frente a un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a una porción inmunógena de WT1, usando técnicas muy conocidas. Los anticuerpos anti-idiotípicos que imitan una porción inmunógena de WT1 son los anticuerpos que se unen a un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a una porción inmunógena de WT1, como se describe aquí.

Células T

Las composiciones inmunoterapéuticas pueden comprender también, o alternativamente, células T específicas para WT1. Tales células pueden prepararse generalmente in vitro o ex vivo, usando procedimientos estándares. Por ejemplo, pueden estar presentes células T dentro de (o aisladas de) médula ósea, sangre periférica o una fracción de médula ósea o sangre periférica de un mamífero, tal como un paciente, usando un sistema de separación de células disponible comercialmente, tal como el sistema CEPRATE®, disponible de CellPro Inc., Bothell WA (véase también Patente de los EE.UU. Nº 5.240.856; Patente de los EE.UU. Nº 5.215.926; documento WO 89/06280; documento 91/16116 y documento WO 92/07243). Alternativamente, pueden derivarse células T de seres humanos relacionados o no relacionados, animales no humanos, linajes celulares o cultivos.

Pueden estimularse células T con polipéptido de WT1, polinucleótido que codifica un polipéptido de WT1 y/o una célula que presenta antígeno (APC) que expresa un polipéptido de WT1. Tal estimulación se realiza en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la generación de células T que sean específicas para el polipéptido de WT1. Preferiblemente, un polipéptido o polinucleótido de WT1 está presente dentro de un vehículo de entrega, tal como una microesfera, para facilitar la generación de células T específicas del antígeno. Brevemente, las células T, que pueden ser aisladas de un paciente o un donante relacionado o no relacionado por técnicas rutinarias (tales como por centrifugación con gradiente de densidad de Ficoll/Hypaque de linfocitos de sangre periférica) se incuban con polipéptido de WT1. Por ejemplo, pueden incubarse células T in vitro durante 2-9 días (típicamente 4 días) a 37ºC con polipéptido de WT1 (por ejemplo, 5 a 25 \mug/ml) o células que sintetizan una cantidad comparable de polipéptido de WT1. Puede ser deseable incubar una parte alícuota separada de una muestra de células T en ausencia de polipéptido de WT1 para servir como testigo.

Las células T se consideran específicas para un polipéptido de WT1 si las células T destruyen células objetivo revestidas con un polipéptido de WT1 o que expresan un gen que codifica tal polipéptido. La especificidad de células T puede evaluarse usando cualquiera de una variedad de técnicas estándares. Por ejemplo, dentro de un ensayo de liberación de cromo o ensayo de proliferación, un índice de estimulación de más de dos veces en lisis y/o proliferación, en comparación con testigos negativos, indica especificidad de células T. Tales ensayos pueden realizarse, por ejemplo, como se describe en Chen et al., Cancer Res. 54:1065-1070, 1994. Alternativamente, la detección de la proliferación de células T puede conseguirse mediante una variedad de técnicas conocidas. Por ejemplo, la proliferación de células T puede detectarse midiendo una proporción aumentada de síntesis de ADN (por ejemplo, mediante cultivos de marcado con impulsos de células T con timidina tritiada y midiendo la cantidad de timidina tritiada incorporada a ADN). Otras formas de detección de células T incluyen medir aumentos de producción de interleuquina-2 (IL-2), flujo de Ca^{2+} o absorción de colorante, tal como 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio. Alternativamente, puede medirse la síntesis de linfoquinas (tales como interferón-gamma) o puede cuantificarse el número relativo de células T que pueden responder a un polipéptido de WT1. El contacto con un polipéptido de WT1 (200 ng/ml-100 \mug/ml, preferiblemente 100 ng/ml-25 \mug/ml) durante 3-7 días debe producir un aumento de al menos dos veces en la proliferación de las células T y/o el contacto como se ha descrito antes durante 2-3 horas debe producir activación de las células T, como se mide usando ensayos de citoquina estándares en los que un aumento de dos veces en el nivel de liberación de citoquina (por ejemplo, TNF o IFN-\gamma) es indicativo de activación de células T (véase Coligan et al., Current Protocols in Immunology, vol. 1, Wiley Interscience (Greene 1988). Pueden expandirse células T específicas de WT1 pueden expandirse usando técnicas estándares. Dentro de realizaciones preferidas, las células T se derivan de un paciente o un donante relacionado o no relacionado y se administran al paciente tras estimulación y
expansión.

Las células T que se han activado en respuesta a un polipéptido de WT1, polinucleótido o APC que expresan WT1 pueden ser CD4^{+} y/o CD8^{+.} La activación específica de células T CD4^{+} o CD8^{+} puede detectarse de una variedad de formas. Los métodos para detectar la activación de células T específicas incluyen detectar la proliferación de células T, la producción de citoquinas (por ejemplo, linfoquinas) o la generación de actividad citolítica (es decir, generación de células T citotóxicas específicas para WT1). Para células T CD4^{+}, un método preferido para detectar activación de células T específicas es la detección de la proliferación de células T. Para células T CD8^{+}, un método preferido para detectar activación de células T específicas es la detección de la generación de actividad citolítica.

Con fines terapéuticos, pueden expandirse en número in vitro o in vivo células T CD4^{+} y/o CD8^{+} que proliferan en respuesta al polipéptido de WT1, polinucleótido o APC. La proliferación de tales células T in vitro puede conseguirse de una variedad de formas. Por ejemplo, las células T pueden re-exponerse a polipéptido de WT1, con o sin la adición de factores de crecimiento de células T, tales como interleuquina-2, y/o células estimuladoras que sintetizan un polipéptido de WT1. Se prefiere la adición de células estimuladoras cuando se generan respuestas de células T CD8^{+}. Las células T pueden desarrollarse hasta grandes cantidades in vitro con retención de especificidad en respuesta a re-estimulación intermitente con polipéptido de WT1. Brevemente, para la estimulación in vitro primaria (IVS), pueden ponerse en matraces grandes cantidades de linfocitos (por ejemplo, más de 4 x 10^{7}) con medios que contengan suero humano. Puede añadirse directamente polipéptido de WT1 (por ejemplo, péptido a razón de 10 \mug/ml), junto con toxoide de tétano (por ejemplo, 5 \mug/ml). Los matraces pueden incubarse después (por ejemplo, 37ºC durante 7 días). Para una segunda IVS, se cosechan después células T y se ponen en nuevos matraces con 2-3 x 10^{7} células mononucleares de sangre periférica irradiadas. El polipéptido de WT1 (por ejemplo, 10 \mug/ml) se añade directamente. Los matraces se incuban a 37ºC durante 7 días. El día 2 y el día 4 después de la segunda IVS, pueden añadirse 2-5 unidades de interleuquina-2 (IL-2). Para una tercera IVS, las células T pueden ponerse en pocillos y estimularse con las propias células B transformadas con EBV del individuo revestidas con el péptido. Puede añadirse IL-2 los días 2 y 4 de cada ciclo. Tan pronto como se muestra que las células son células T citotóxicas específicas, pueden expandirse usando un ciclo de estimulación de 10 días con mayor IL-2 (20 unidades) los días 2, 4 y 6.

Alternativamente, una o más células T que proliferan en presencia de polipéptido de WT1 pueden expandirse en número por clonación. Los métodos para clonar células son muy conocidos en la técnica, e incluyen dilución limitante. Pueden purificarse células T que responden de la sangre periférica de pacientes sensibilizados por centrifugación con gradiente de densidad y formación de rosetones de glóbulos rojos de oveja y establecerse en cultivo estimulando con el antígeno nominal en presencia de células de carga autólogas irradiadas. Con el fin de generar linajes de células T CD4^{+}, el polipéptido de WT1 se usa como estímulo antígeno y linfocitos de sangre periférica (PBL) o linajes de células linfoblastoides (LCL) autólogos inmortalizados por infección con virus de Epstein Barr se usan como células que presentan antígeno. Con el fin de generar linajes de células T CD8^{+}, pueden usarse como células estimuladoras células que presentan antígeno autólogas transfectadas con un vector de expresión que produce polipéptido de WT1. Los linajes de células T establecidos pueden clonarse 2-4 días después de la estimulación con antígeno poniendo en placa células T estimuladas con una frecuencia de 0,5 células por pocillo en placas de fondo plano de 96 pocillos con 1 x 10^{6} células PBL o LCL irradiadas e interleuquina-2 recombinante (rIL2) (50 U/ml). Los pocillos con desarrollo clonal establecido pueden identificarse en aproximadamente 2-3 semanas después de la puesta en placa inicial y re-estimularse con antígeno apropiado en presencia de células que presentan antígeno autólogas, y expandirse a continuación por adición de dosis bajas de rIL2 (10 U/ml) 2-3 días después de la estimulción con antígeno. Pueden mantenerse clones de células T en placas de 24 pocillos por re-estimulación periódica con antígeno y rIL2 aproximadamente cada dos semanas.

Dentro de ciertas realizaciones, pueden cebarse células T alogénicas (es decir, sensibilizarse a WT1) in vivo y/o in vitro. Tal cebado puede conseguirse poniendo en contacto células T con un polipéptido de WT1, un polinucleótido que codifique tal polipéptido o una célula que produzca tal polipéptido en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir el cebado de células T. En general, las células T se consideran cebadas si, por ejemplo, el contacto con un polipéptido de WT1 produce proliferación y/o activación de las células T, medidas por ensayos de proliferación, liberación de cromo y/o liberación de citoquina estándares como se describe aquí. Un índice de estimulación de aumento de mas de dos veces en la proliferación o lisis, o un aumento de más de tres veces en el nivel de citoquina, en comparación con testigos negativos, indica especificidad de células T. Pueden emplearse células cebadas in vitro, por ejemplo, dentro de un trasplante de médula ósea o como infusión de linfocitos de donante.

Composiciones farmacéuticas y vacunas

Dentro de ciertos aspectos, pueden incorporarse polipéptidos, polinucleótidos, antibióticos y/o células T a composiciones farmacéuticas o vacunas. Alternativamente, una composición farmacéutica puede comprender una célula que presenta antígeno (por ejemplo, una célula dendrítica) transfectada con un polinucleótido de WT1 de tal modo que la célula que presenta antígeno exprese un polipéptido de WT1. Las composiciones farmacéuticas comprenden uno o más de tales compuestos o células y un vehículo o excipiente aceptable fisiológicamente. Ciertas vacunas pueden comprender uno o más de tales compuestos o células y un aumentador de la respuesta inmune no específico, tal como un coadyuvante o un liposoma (en el que se incorpora el compuesto). Las composiciones farmacéuticas y vacunas pueden contener adicionalmente un sistema de entrega, tal como microesferas biodegradables que se describen, por ejemplo, en las Patentes de los EE.UU. Nº 4.897.268 y 5.075.109. Las composiciones farmacéuticas y vacunas dentro del alcance de la presente invención pueden contener también otros compuestos, que pueden ser biológicamente activos o inactivos.

Dentro de ciertas realizaciones, se diseñan composiciones farmacéuticas y vacunas para obtener respuestas de células T específicas para un polipéptido de WT1 en un paciente, tal como un ser humano. En general, las respuestas de células T pueden favorecerse mediante el uso de polipéptidos relativamente cortos (por ejemplo, que comprenden menos de 23 residuos de aminoácidos consecutivos de un polipéptido de WT1 nativo, preferiblemente 4-16 residuos consecutivos, más preferiblemente 8-16 residuos consecutivos y aún más preferiblemente 8-10 residuos consecutivos). Alternativamente, o además, una vacuna puede comprender un aumentador de la respuesta inmune no específico que aumenta preferentemente una respuesta de células T. En otras palabras, el aumentador de la respuesta inmune puede aumentar el nivel de una respuesta de células T a un polipéptido de WT1 en una cantidad que es proporcionalmente mayor que la cantidad por la que se aumenta una respuesta de anticuerpo. Por ejemplo, cuando se compara con un coadyuvante de base aceitosa estándar, tal como CFA, un aumentador de la respuesta inmune que aumenta preferentemente una respuesta de células T puede aumentar una respuesta de células T proliferativa en al menos dos veces, una respuesta lítica en al menos el 10% y/o activación de células T en al menos dos veces comparado con linajes celulares testigo negativos en WT1, mientras no aumenta detectablemente una respuesta de anticuerpo. La cantidad por la que se aumenta una respuesta de células T o anticuerpo a un polipéptido de WT1 puede determinarse generalmente usando cualquier técnica representativa conocida en la técnica, tal como las técnicas proporcionadas aquí.

Una composición farmacéutica o vacuna puede contener ADN que codifique uno o más de los polipéptidos como se ha descrito anteriormente, de tal modo que el polipéptido se genere in situ. Como se ha indicado antes, el ADN puede estar presente dentro de cualquiera de una variedad de sistemas de entrega conocidos por los de experiencia ordinaria en la técnica, incluyendo sistemas de expresión de ácidos nucleicos, sistemas de expresión bacterianos y víricos y sistemas de expresión de mamíferos. Los sistemas de expresión de ácidos nucleicos apropiados contienen las secuencias de ADN, cADN y ARN necesarias para expresión en el paciente (tales como un promotor y señal de terminación adecuados). Los sistemas de entrega bacterianos implican la administración de una bacteria (tal como Bacillus-Calmette-Guerrin) que expresa una porción inmunógena del polipéptido en su superficie celular. En una realización preferida, el ADN puede introducirse usando un sistema de expresión vírico (por ejemplo, viruela u otro virus de viruela, retrovirus o adenovirus), que puede implicar el uso de un virus competente en replicación no patógeno (defectuoso). Las técnicas para incorporar ADN a tales sistemas de expresión son muy conocidas por los de experiencia ordinaria en la técnica. El ADN también puede ser "desnudo", como se describe, por ejemplo, en Ulmer et al., Science 259:1745-1749, 1993 y se revisa por Cohen, Science 259:1691-1692, 1993. La absorción de ADN desnudo puede aumentarse revistiendo el ADN en perlas biodegradables, que se transportan eficazmente a las células.

Como se ha indicado antes, una composición farmacéutica o vacuna puede comprender una célula que presenta antígeno que expresa un polipéptido de WT1. Con fines terapéuticos, como se describe aquí, la célula que presenta antígeno es preferiblemente una célula dendrítica autóloga. Tales células pueden prepararse y transfectarse usando técnicas estándares, tales como las descritas por Reeves et al., Cancer Res. 56:5672-5677, 1996; Tuting et al., J-. Immunol. 160:1139-1147, 1996; y Nair et al., Nature Biotechnol. 16:364-369, 1998). La expresión de un polipéptido de WT1 en la superficie de una célula que presenta antígeno puede confirmarse por estimulación in vitro y proliferación estándar así como ensayos de liberación de cromo, como se describe aquí.

Aunque puede emplearse cualquier vehículo adecuado conocido por los de experiencia ordinaria en la técnica en las composiciones farmacéuticas de esta invención, el tipo de vehículo variará dependiendo del modo de administración. Las composiciones de la presente invención pueden formularse para cualquier manera apropiada de administración, incluyendo por ejemplo administración tópica, oral, nasal, intravenosa, intracraneal, intraperitoneal, subcutánea o intramuscular. Para administración parenteral, tal como inyección subcutánea, el vehículo comprende preferiblemente agua, solución salina, alcohol, una grasa, una cera o un tampón. Para administración oral, puede emplearse cualquiera de los vehículos anteriores o un vehículo sólido, tal como manitol, lactosa, almidón, estearato magnésico, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa y carbonato magnésico. Pueden emplearse también como vehículos para las composiciones farmacéuticas de esta invención microesferas biodegradables (por ejemplo, polilactato, poliglicolato). Para ciertas aplicaciones tópicas, se prefiere una formulación como una crema o loción, usando componentes bien conocidos.

Tales composiciones pueden comprender también tampones (por ejemplo, solución salina tamponada neutra o solución salina tamponada con fosfato), hidratos de carbono (por ejemplo, glucosa, manosa, sacarosa o dextranos), manitol, proteínas, polipéptidos o aminoácidos tales como glicina, antioxidantes, agentes de quelación tales como EDTA o glutationa, coadyuvantes (por ejemplo, hidróxido de aluminio) y/o agentes de conservación. Alternativamente, las composiciones de la presente invención pueden formularse como un liofilizado. Los compuestos pueden encapsularse también dentro de liposomas usando tecnología muy conocida.

Cualquiera de una variedad de aumentadores de la respuesta inmune, no específicos, tales como coadyuvantes, puede emplearse en las vacunas de esta invención. Muchos coadyuvantes contienen una sustancia diseñada para proteger el antígeno de catabolismo rápido, tales como hidróxido de aluminio o aceite mineral, y un estimulador de respuestas inmunes, tales como lípido A, o proteínas derivadas de Bortadella perfussis o Mycobacterium tuberculosis. Los aumentadores de la respuesta inmune no específicos adecuados incluyen coadyuvantes basados en alumbre (por ejemplo, Alhydrogel, Rehydragel, fosfato de aluminio, Algammulin, hidróxido de aluminio), coadyuvantes basados en aceites (coadyuvante de Freund (FA), Specol, RIBI, TiterMax, Montanide ISA50 o Seppic MONTANIDE ISA 720; citoquinas (por ejemplo, GM-CSF o ligando de Flat3); microesferas; coadyuvantes basados en copolímeros de bloques no iónicos; coadyuvantes basados en bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDA) AS-1, AS-2 (Smith Kline Beecham); coadyuvantes basados en sistema Ribi Adjuvant; QS21 (Aquila); coadyuvantes basados en saponina (saponina cruda, la saponina Quil A), coadyuvantes basados en muramilo dipéptido (MDP) tales como SAF (coadyuvante Syntex en su forma microfluidizada (SAF-m)); bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDA); coadyuvantes basados en complemento humano m. vaccae y derivados; coadyuvantes basados en complejo estimulante inmune (iscom); toxinas inactivadas; y agentes infecciosos atenuados (tales como M. tuberculosis).

Como se ha indicado antes, dentro de ciertas realizaciones, se escogen aumentadores de la respuesta inmune por su capacidad para obtener preferentemente o aumentar una respuesta de células T (por ejemplo, CD4^{+} y/o CD8^{+}) a un polipéptido de WT1. Tales aumentadores de la respuesta inmune son muy conocidos en la técnica, e incluyen (aunque sin limitarse a ellos) Montanide ISA50, Seppic MONTANIDE ISA 720, citoquinas (por ejemplo, GM-CSF, ligando de Flat3), microesferas, coadyuvantes basados en bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDA), AS-1 (Smith Kline Beecham), AS-2 (Smith Kline Beecham), coadyuvantes basados en sistema Ribi Adjuvant; QS21 (Aquila), coadyuvantes basados en saponina (saponina cruda, la saponina Quil A), coadyuvante Syntex en su forma microfluidizada (SAF-m), MV, ddMV (Genesis), coadyuvantes basados en complejo estimulante inmune (iscom) y toxinas inactivadas.

Las composiciones y vacunas descritas aquí pueden administrarse como parte de una formulación de liberación sostenida (es decir, una formulación tal como una cápsula o esponja que efectúa una liberación lenta de compuesto tras la administración). Tales formulaciones pueden prepararse generalmente usando tecnología muy conocida y administrarse mediante, por ejemplo, implantación oral, rectal o subcutánea, o por implantación en el lugar objetivo deseado. Las formulaciones de liberación sostenida pueden contener un polipéptido, polinucleótido, anticuerpo o célula dispersos en una matriz vehículo y/o contenidos dentro de un depósito rodeado por una membrana controladora de la velocidad. Los vehículos de uso dentro de tales formulaciones son biocompatibles, y pueden ser también biodegradables; preferiblemente, la formulación proporciona un nivel relativamente constante de liberación del componente activo. La cantidad de compuesto activo contenido dentro de una formulación de liberación sostenida depende del lugar de implantación, la velocidad y la duración esperada de liberación y de la naturaleza del estado a tratar o prevenir.

Terapia de enfermedades malignas

En aspectos adicionales de la presente invención, las composiciones y vacunas descritas aquí pueden usarse para inhibir el desarrollo de enfermedades malignas (por ejemplo, enfermedades progresivas o metastáticas o enfermedades caracterizadas por una carga de tumores pequeños tal como una enfermedad residual mínima). En general, tales métodos pueden usarse para prevenir, retrasar o tratar una enfermedad asociada con expresión de WT1. En otras palabras, los métodos terapéuticos proporcionados aquí pueden usarse para tratar una enfermedad asociada con WT1 existente, o pueden usarse para prevenir o retrasar el comienzo de tal enfermedad en un paciente que está libre de enfermedad o que está afligido con una enfermedad que no está asociada todavía con expresión de WT1.

Según se usa aquí, una enfermedad está "asociada con expresión de WT1" si las células enfermas (por ejemplo, células tumorales) en algún momento durante el transcurso de la enfermedad generan niveles más altos detectablemente de un polipéptido de WT1 que células normales del mismo tejido. La asociación de la expresión de WT1 con una enfermedad maligna no requiere que esté presente WT1 en un tumor. Por ejemplo, la sobreexpresión de WT1 puede estar implicada con iniciación de un tumor, pero puede perderse subsiguientemente la expresión de proteína. Alternativamente, una enfermedad maligna que no se caracteriza por un aumento de la expresión de WT1 puede, en un momento posterior, progresar a una enfermedad que se caracteriza por expresión de WT1 aumentada. Por consiguiente, cualquier enfermedad maligna en la que se expresen antes células enfermas, se expresen actualmente o se espera que se expresen subsiguientemente niveles aumentados de WT1 se considera estar "asociada con expresión de WT1".

La inmunoterapia puede realizarse usando cualquiera de una variedad de técnicas, en la que los compuestos o células proporcionados aquí funcionan para separar de un paciente células que expresan WT1. Tal separación puede tener lugar como resultado de aumento o inducción de una respuesta inmune en un paciente específica para WT1 o una célula que expresa WT1. Alternativamente, pueden separarse células que expresan WT1 ex vivo (por ejemplo, por tratamiento de médula ósea, sangre periférica o una fracción de médula ósea o sangre periférica autólogas). Las fracciones de médula ósea o sangre periférica pueden obtenerse usando cualquier método estándar en la técnica.

Dentro de tales métodos, pueden administrarse a un paciente composiciones farmacéuticas y vacunas. Según se usa aquí, un "paciente" se refiere a cualquier animal de sangre caliente, preferiblemente un ser humano. Un paciente puede o no estar afligido con una enfermedad maligna. Por consiguiente, las composiciones farmacéuticas y vacunas anteriores pueden usarse para prevenir el comienzo de una enfermedad (es decir, profilácticamente) o para tratar a un paciente afligido con una enfermedad (por ejemplo, para prevenir o retrasar la progresión y/o metástasis de una enfermedad existente). Un paciente afligido con una enfermedad puede tener una enfermedad residual mínima (por ejemplo, una baja carga de tumor en un paciente con leucemia en remisión completa o parcial o un paciente con cáncer tras la reducción de la carga de tumor después de cirugía, radioterapia y/o quimioterapia). Tal paciente puede inmunizarse para inhibir una recaída (es decir, prevenir o retrasar la recaída o disminuir la gravedad de una recaída). Dentro de ciertas realizaciones preferidas, el paciente está afligido con una leucemia (por ejemplo, AML, CML, ALL o ALL de la infancia), un síndrome mielodisplástico (MDS) o un cáncer (por ejemplo, cáncer gastrointestinal, de pulmón, de tiroides o pecho o un melanoma), en el que el cáncer o leucemia es positivo en WT1 (es decir, reacciona detectablemente con un anticuerpo anti-WT1, como se proporciona aquí, o expresa mARN de WT1 en un nivel detectable por RT-PCR, como se describe aquí) o padece una enfermedad autoinmune dirigida contra células que expresan WT1.

Las composiciones proporcionadas aquí pueden usarse solas o en combinación con regímenes terapéuticos convencionales tales como cirugía, irradiación, quimioterapia y/o trasplante de médula ósea (autóloga, singénica, alogénica o no relacionada). Como se discute después con mayor detalle, los agentes de unión y células T como se proporcionan aquí pueden usarse para purgar células estaminales autólogas). Tal purga puede ser beneficiosa antes de, por ejemplo, trasplante de médula ósea o transfusión de sangre o componentes de ella. Los agentes de unión, las células T, las células que presentan antígeno (APC) y las composiciones proporcionadas aquí pueden usarse adicionalmente para expandir y estimular (o cebar) células T específicas de WT1 autólogas, alogénicas, singénicas o no relacionadas in vitro o
in vivo. Tales células T específicas de WT1 pueden usarse, por ejemplo, dentro de infusiones de linfocitos del donante.

Las vías y frecuencia de administración, así como la dosificación, variarán de individuo a individuo, y pueden establecerse fácilmente usando técnicas estándares. En general, las composiciones farmacéuticas y vacunas pueden administrarse por inyección (por ejemplo, intracutánea, intramuscular, intravenosa o subcutánea), intranasalmente (por ejemplo, por aspiración) u oralmente. En algunos tumores, las composiciones farmacéuticas o vacunas pueden administrarse localmente (mediante, por ejemplo, rectocoloscopia, gastroscopia, videoendoscopia, angiografía u otros métodos conocidos en la técnica). Preferiblemente, pueden administrarse entre 1 y 10 dosis durante un período de 52 semanas. Preferiblemente, se administran 6 dosis, a intervalos de 1 mes, y pueden darse periódicamente después vacunaciones de refuerzo. Pueden ser apropiados métodos alternados para pacientes individuales. Una dosis adecuada es una cantidad de un compuesto que, cuando se administra como se ha descrito antes, es capaz de promover una respuesta inmune anti-tumores que es al menos 10-50% superior al nivel basal (es decir, sin tratar). Tal respuesta puede comprobarse midiendo los anticuerpos anti-tumor en un paciente o por generación dependiente de vacuna de células efectoras citolíticas capaces de destruir las células tumorales del paciente in vitro. Tales vacunas también deben ser capaces de causar una respuesta inmune que conduzca a un resultado clínico mejorado (por ejemplo, remisiones completas o parciales más frecuentes, o mayor supervivencia libre de enfermedad y/o global) en pacientes vacunados en comparación con pacientes no vacunados. En general, para composiciones farmacéuticas y vacunas que comprenden uno o más polipéptidos, la cantidad de cada polipéptido presente en una dosis varía de aproximadamente 100 \mug a 5 mg. Los tamaños de dosis adecuados variarán con la talla del paciente, pero variarán típicamente de alrededor de 0,1 ml a aproximadamente 5 ml.

En general, un régimen de dosificación y tratamiento apropiado proporciona el(los) compuesto(s) activo(s) en una cantidad suficiente para proporcionar beneficio terapéutico y/o profiláctico. Tal respuesta puede comprobarse estableciendo un resultado clínico mejorado (por ejemplo, remisiones completas o parciales más frecuentes, o supervivencia libre de enfermedad y/o global más larga) en pacientes tratados en comparación con pacientes no tratados. Los aumentos de respuestas inmunes preexistentes a WT1 se correlacionan generalmente con un resultado clínico mejorado. Tales respuestas inmunes pueden evaluarse generalmente usando ensayos de proliferación, citotoxicidad o citoquina estándares, que pueden realizarse usando muestras obtenidas de un paciente antes y después del tratamiento.

Dentro de aspectos adicionales, los métodos para inhibir el desarrollo de una enfermedad maligna asociada con expresión de WT1 implican la administración de células T autólogas que se han activado en respuesta a un polipéptido de WT1 o APC que expresan WT1, como se ha descrito antes. Tales células T pueden ser CD4^{+} y/o CD8^{+}, y pueden hacerse proliferar como se ha descrito antes. Las células T pueden administrarse al individuo en una cantidad eficaz para inhibir el desarrollo de una enfermedad maligna. Típicamente, se administran aproximadamente 1 x 10^{9} a 1 x 10^{11} células/m^{2} intravenosamente, intracavitariamente o en el lecho de un tumor reseccionado. Será evidente para los expertos en la técnica que el número de células y la frecuencia de administración dependerán de la respuesta del paciente.

Dentro de ciertas realizaciones, las células T pueden estimularse antes de un trasplante de médula ósea autóloga. Tal estimulación puede tener lugar in vivo o in vitro. Para estimulación in vitro, médula ósea y/o sangre periférica (o una fracción de médula ósea o sangre periférica) obtenida de un paciente puede ponerse en contacto con un polipéptido de WT1, un polinucleótido que codifica un polipéptido de WT1 y/o unas APC que expresan un polipéptido de WT1 en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la estimulación de células T como se ha descrito antes. Médula ósea, células estaminales de sangre periférica y/o células T específicas de WT1 pueden administrarse a un paciente usando técnicas estándares.

Dentro de realizaciones relacionadas, células T de un donante relacionado o no relacionado pueden estimularse antes de un trasplante de médula ósea singénica o alogénica (relacionada o no relacionada). Tal estimulación puede tener lugar in vivo o in vitro. Para estimulación in vitro, médula ósea y/o sangre periférica (o una fracción de médula ósea o sangre periférica) obtenida de un donante relacionado o no relacionado puede ponerse en contacto con un polipéptido de WT1, un polinucleótido WT1 y/o APC que expresa un polipéptido de WT1 en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la estimulación de células T como se ha descrito antes. Pueden administrarse después a un paciente médula ósea, células estaminales de sangre periférica y/o células T específicas de WT1 usando técnicas estándares.

Dentro de otras realizaciones, células T específicas de WT1 como se describen aquí pueden usarse para separar células que expresan WT1 de médula ósea, sangre periférica o una fracción de médula ósea o sangre periférica autólogas (por ejemplo, sangre periférica (PB) enriquecida en CD34+ antes de la administración a un paciente). Tales métodos pueden realizarse poniendo en contacto médula ósea o PB con tales células T en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la reducción de células que expresan WT1 a menos del 10%, preferiblemente menos del 5% y más preferiblemente menos del 1%, del número total de células mieloides o linfáticas en la médula ósea o sangre periférica. La extensión en que se han separado tales células puede determinarse fácilmente por métodos estándares tales como, por ejemplo, análisis de PCR cualitativo y cuantitativo, morfología, inmunohistoquímica y análisis FACS. La médula ósea o PB (o una fracción de ellas) pueden administrarse después a un paciente usando técnicas estándares.

Métodos de diagnóstico

La presente invención proporciona además métodos para detectar una enfermedad maligna asociada con expresión de WT1, y para comprobar la eficacia de una inmunización o terapia para tal enfermedad. Tales métodos se basan en el descubrimiento, dentro de la presente invención, de que una respuesta inmune específica para proteína de WT1 puede detectarse en pacientes afligidos con tales enfermedades, y que métodos que aumentan tales respuestas inmunes pueden proporcionar un beneficio preventivo o terapéutico.

Para determinar la presencia o ausencia de una enfermedad maligna asociada con expresión de WT1, puede ensayarse en un paciente el nivel de células T específicas para WT1. Dentro de ciertos métodos, una muestra biológica que comprende células T CD4^{+} y/o CD8^{+} aisladas de un paciente se incuba con un polipéptido de WT1, un polinucleótido que codifica un polipéptido de WT1 y/o unas APC que expresan un polipéptido de WT1, y se detecta la presencia o ausencia de activación específica de las células T, como se describe aquí. Las muestras biológicas adecuadas incluyen, aunque sin limitarse a ellas, células T aisladas. Por ejemplo, pueden aislarse células T de un paciente por técnicas rutinarias (tales como centrifugación con gradiente de densidad de Ficoll/Hipaque de linfocitos de sangre periférica). Las células T pueden incubarse in vitro durante 2-9 días (típicamente 4 días) a 37ºC con polipéptido de WT1 (por ejemplo, 5-25 \mug/ml). Puede ser deseable incubar otra parte alícuota de una muestra de células T en ausencia de polipéptido de WT1 para servir como testigo. Para células T CD4-, la activación se detecta preferiblemente evaluando la proliferación de las células T. Para células T CD8+, la activación se detecta preferiblemente evaluando la actividad citolítica. Un nivel de proliferación que sea al menos dos veces mayor y/o un nivel de actividad citolítica que sea al menos 20% superior que en pacientes libres de enfermedad indica la presencia de una enfermedad maligna asociada con expresión de WT1. Puede hacerse una correlación adicional, usando métodos muy conocidos en la técnica, entre el nivel de proliferación y/o la actividad citolítica y la respuesta predicha a la terapia. En particular, puede esperarse que muestren una mayor respuesta a la terapia pacientes que presentan una respuesta de anticuerpos más alta, proliferativa y/o lítica.

Dentro de otros métodos, se ensaya en una muestra biológica obtenida de un paciente el nivel de anticuerpo específico para WT1. La muestra biológica se incuba con un polipéptido de WT1, un polinucleótido que codifica un polipéptido de WT1 y/o unas APC que expresan un polipéptido de WT1 en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir formarse inmunocomplejos. Se detectan después inmunocomplejos formados entre el polipéptido de WT1 y anticuerpos en la muestra biológica que se unen específicamente al polipéptido de WT1. Una muestra biológica para uso dentro de tales métodos puede ser cualquier muestra obtenida de un paciente de la que se esperaría que contuviera anticuerpos. Las muestras biológicas adecuadas incluyen sangre, sueros, ascites, médula ósea, efusión pleural y fluido cerebroespinal.

La muestra biológica se incuba con el polipéptido de WT1 en una mezcla de reacción en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir formarse inmunocomplejos entre el polipéptido y anticuerpos específicos para WT1. Por ejemplo, una muestra biológica y el polipéptido de WT1 pueden incubarse a 4ºC durante 24-48 horas.

Tras la incubación, se ensaya la presencia de inmunocomplejos en la mezcla de reacción. La detección de inmunocomplejos formados entre el polipéptido de WT1 y anticuerpos presentes en la muestra biológica puede conseguirse por una variedad de técnicas conocidas, tales como radioinmunoensayos (RIA) y ensayos de inmunosorbente enlazado a enzima (ELISA). Los ensayos adecuados son muy conocidos en la técnica y se describen ampliamente en la bibliografía científica y de patentes (por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Los ensayos que pueden usarse incluyen, aunque sin limitarse a ellos, la técnica de inmunoensayo sandwich de anticuerpos monoclonales dobles de David et al. (Patente de los EE.UU. 4.376.110); ensayos sandwich de anticuerpos monoclonal-policlonal (Wide et al., en Kirkham y Hunter, reds., Radioimmunoassay Methods, E. y S. Livingstone, Edimburgo, 1970); el método de "manchas de western" de Gordon et al. (Patente de los EE.UU. 4.452.901); inmunoprecipitación de ligando marcado (Brown et al., J. Biol. Chem. 255:4980-4983, 1980); ensayos de inmunosorbente enlazado a enzima como se describe, por ejemplo, por Raines y Ross (J. Biol. Chem. 257:5154-5160, 1982); técnicas inmunocitoquímicas, incluyendo el uso de fluorocromos (Brooks et al., Clin. Exp. Immunol. 39:477, 1980); y neutralización de actividad (Bowen-Pope et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:2396-2400, 1984). Otros inmunoensayos incluyen, aunque sin limitarse a ellos, los descritos en las Patentes de los EE.UU. Nº: 3.817.827; 3.850.752; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074 y 4.098.876.

Con fines de detección, el polipéptido de WT1 puede estar marcado o no marcado. Puede usarse polipéptido de WT1 no marcado en ensayos de aglutinación o en combinación con reactivos de detección marcados que se unen a los inmunocomplejos (por ejemplo, anti-inmunoglobulina, proteína G, proteína A o una lectina y anticuerpos secundarios, o fragmentos de unión a antígeno de ellos, capaces de unirse a los anticuerpos que se unen específicamente al polipéptido de WT1). Si el polipéptido de WT1 está marcado, el grupo informador puede ser cualquier grupo informador adecuado conocido en la técnica, incluyendo radioisótopos, grupos fluorescentes, grupos luminiscentes, enzimas, biotina y partículas de colorante.

Dentro de ciertos ensayos, se inmoviliza polipéptido de WT1 no marcado en un soporte sólido. El soporte sólido puede ser cualquier material conocido por los de experiencia ordinaria en la técnica al que pueda incorporarse el polipéptido. Por ejemplo, el soporte sólido puede ser un pocillo de ensayo en una placa de microtitulación o una membrana de nitrocelulosa u otra adecuada. Alternativamente, el soporte puede ser una perla o disco, tal como vidrio, fibra de vidrio, látex o un material plástico tal como poliestireno o poli(cloruro de vinilo). El soporte también puede ser una partícula magnética o un sensor de fibra óptica, tal como los descritos, por ejemplo, en la Patente de los EE.UU. Nº 5.539.681. El polipéptido puede inmovilizarse en el soporte sólido usando una variedad de métodos conocidos por los expertos en la técnica, que se describen ampliamente en la bibliografía de patentes y científica. En el contexto de la presente invención, el término "inmovilización" se refiere a asociación no covalente, tal como adsorción, e incorporación covalente (que puede ser un enlace directo entre el antígeno y grupos funcionales en el soporte o puede ser un enlace mediante un agente de reticulación). Se prefiere la inmovilización por adsorción a un pocillo en una placa de microtitulación o a una membrana. En tales casos, la adsorción puede conseguirse poniendo en contacto el polipéptido de WT1, en un tampón adecuado, con el soporte sólido durante una extensión de tiempo adecuada. El tiempo de contacto varía con la temperatura, pero está típicamente entre alrededor de 1 hora y aproximadamente 1 día. En general, es suficiente para inmovilizar una cantidad adecuada de polipéptido poner en contacto un pocillo de una placa de microtitulación de plástico (tal como poliestireno o poli(cloruro de vinilo)) con una cantidad de polipéptido variable de alrededor de 10 ng a aproximadamente 10 \mug, y preferiblemente de alrededor de 100 ng a aproximadamente 1 \mug.

Tras la inmovilización, se bloquean típicamente los lugares de unión de proteína restantes en el soporte. Cualquier agente de bloqueo adecuado conocido por los de experiencia ordinaria en la técnica, tal como albúmina de suero de bovino, Tween 20® (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), suero de cabra normal inactivado por calor (NGS) o BLOTTO (solución tamponada de leche en polvo sin grasa que contiene también un agente de conservación, sales y un agente antiespumación). El soporte se incuba después con una muestra biológica de la que se sospecha que contiene anticuerpo específico. La muestra puede aplicarse neta o, más a menudo, puede diluirse, usualmente en una solución tamponada que contiene una pequeña cantidad (0,1%-5,0% en peso) de proteína, tal como BSA, NGS o BLOTTO. En general, un tiempo de contacto apropiado (es decir, tiempo de incubación) es un período de tiempo que es suficiente para detectar la presencia de anticuerpo que se une específicamente a WT1 dentro de una muestra que contiene tal anticuerpo. Preferiblemente, el tiempo de contacto es suficiente para conseguir un nivel de unión que sea al menos aproximadamente 95% del conseguido en el equilibrio entre anticuerpo unido y no unido. Los de experiencia ordinaria en la técnica reconocerán que el tiempo necesario para conseguir equilibrio puede determinarse fácilmente ensayando el nivel de unión que tiene lugar durante un período de tiempo. A temperatura ambiente, es generalmente suficiente un tiempo de incubación de aproximadamente 30 minutos.

La muestra no unida puede separarse después lavando el soporte sólido con un tampón apropiado, tal como PBS que contiene 0,1% de Tween 20®. Puede añadirse después un reactivo de detección que se une a los inmunocomplejos y que comprende un grupo informador. El reactivo de detección se incuba con el inmunocomplejo durante una extensión de tiempo suficiente para detectar el anticuerpo unido. Puede determinarse generalmente una extensión de tiempo apropiada ensayando el nivel de unión que tiene lugar durante un período de tiempo. El reactivo de detección no unido se separa después y se detecta el reactivo de detección unido usando el grupo informador. El método empleado para detectar el grupo informador depende de la naturaleza del grupo informador. Para grupos radioactivos, son generalmente apropiados métodos de recuento de escintilación o autorradiográficos. Pueden usarse métodos espectroscópicos para detectar colorantes, grupos luminiscentes y grupos fluorescentes. La biotina puede detectarse usando avidina, acoplada a un grupo informador diferente (comúnmente un grupo radioactivo o fluorescente o una enzima). Los grupos informadores enzimas (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, beta-galactosidasa, fosfatasa alcalina y glucosa oxidasa) pueden detectarse generalmente por adición de sustrato (generalmente, durante un período específico de tiempo), seguida por análisis espectroscópico u otro de los productos de reacción. Independientemente del método específico empleado, un nivel de reactivo de detección unido que sea al menos dos veces mayor que el fondo (es decir, el nivel observado para una muestra biológica obtenida de un individuo libre de enfermedad) indica la presencia de una enfermedad maligna asociada con expresión de WT1.

En general, los métodos para comprobar la eficacia de una inmunización o terapia implican comprobar cambios en el nivel de anticuerpos o células T específicos para WT1 en el paciente. Los métodos en los que se comprueban niveles de anticuerpos pueden comprender las etapas de: (a) incubar una primera muestra biológica, obtenida de un paciente antes de una terapia o inmunización, con un polipéptido de WT1, en la que la incubación se realiza en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir formarse inmunocomplejos; (b) detectar inmunocomplejos formados entre el polipéptido de WT1 y anticuerpos en la muesta biológica que se unen específicamente al polipéptido de WT1; (c) repetir las etapas (a) y (b) usando una segunda muestra biológica tomada del paciente tras terapia o inmunización, y (d) comparar el número de inmunocomplejos detectados en la primera y segunda muestras biológicas. Alternativamente, pueden emplearse un polinucleótido que codifica un polipéptido de WT1, o unas APC que expresan un polipéptido de WT1, en lugar del polipéptido de WT1. Dentro de tales métodos, se detectan inmunocomplejos entre el polipéptido de WT1 codificado por el nucleótido, o expresado por las APC, y anticuerpos en la muestra biológica.

Los métodos en los que se comprueba la activación de células T y/o el número de precursores específicos de WT1 pueden comprender las etapas de (a) incubar una primera muestra biológica que comprende células CD4^{+} y/o CD8^{+} (por ejemplo, médula ósea, sangre periférica o una fracción de ellas), obtenida de un paciente antes de una terapia o inmunización, con un polipéptido de WT1, en la que la incubación se realiza en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir activación específica, proliferación y/o lisis de células T; (b) detectar una magnitud de activación, proliferación y/o lisis de las células T; (c) repetir las etapas (a) y (b) usando una segunda muestra biológica que comprende células T CD4^{+} y/o CD8^{+}, y tomada del mismo paciente tras terapia o inmunización; y (d) comparar la magnitud de activación, proliferación y/o lisis de células T en la primera y segunda muestras biológicas. Alternativamente, pueden emplearse un polinucleótido que codifica un polipéptido de WT1, o unas APC que expresan un polipéptido de WT1, en lugar del polipéptido de WT1.

Una muestra biológica de uso dentro de tales métodos puede ser cualquier muestra obtenida de un paciente de la que se esperaría que contuviera anticuerpos, células T CD4^{+} y/o células T CD8^{+}. Las muestras biológicas adecuadas incluyen sangre, sueros, ascites, médula ósea, efusión pleural y fluido cerebroespinal. Una primera muestra biológica puede obtenerse antes de iniciar la terapia o inmunización o durante un régimen de terapia o vacunación. La segunda muestra biológica debe obtenerse de la misma manera, pero en un tiempo después de terapia o inmunización adicionales. La segunda muestra biológica puede obtenerse al terminarse, o durante terapia o inmunización, con la condición de que al menos una porción de la terapia o inmunización tenga lugar entre el aislamiento de la primera y segunda muestras biológicas.

Las etapas de incubación y detección para ambas muestras pueden realizarse generalmente como se ha descrito antes. Un aumento significativo estadísticamente del número de inmunocomplejos en la segunda muestra con relación a la primera muestra refleja terapia o inmunización con éxito.

Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no a manera de limitación.

Ejemplos Ejemplo 1 Identificación de una respuesta inmune a WT1 en pacientes con malignidades hematológicas

Este ejemplo ilustra la identificación de una respuesta inmune existente en pacientes con una malignidad hematológica.

Para evaluar la presencia de respuestas de anticuerpos específicas de WT1 preexistentes en pacientes, se analizaron sueros de pacientes con AML, ALL, CML y varias anemias aplásticas usando análisis de manchas de Western. Se ensayó en los sueros la capacidad para inmunoprecipitar WT1 del linaje celular leucémico humano K562 (American Type Culture Collection, Manassas, VA). En cada caso, se separaron inmunoprecipitados por electroforesis en gel, se transfirieron a membrana y se sondaron con el anticuerpo anti WT1 WT180 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). Este análisis de manchas de Western identificó anticuerpos específicos de WT1 potenciales en pacientes con malignidad hematológica. Un manchas de Western representativo que presentaba los resultados para un paciente con AML se muestra en la Figura 2. Una proteína de 52 kD en el inmunoprecipitado generado usando el suero del paciente se reconoció por el anticuerpo específico de WT1. La proteína de 52 kD migró con el mismo tamaño que el testigo positivo.

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Ejemplo 2 Inducción de anticuerpos a WT1 en ratones inmunizados con linajes celulares que expresan WT1

Este ejemplo ilustra el uso de células que expresan WT1 para inducir una respuesta de anticuerpo específico de WT1 in vivo.

La detección de anticuerpos existentes a WT1 en pacientes con leucemia implicó fuertemente que es posible inmunizar a proteína de WT1 para obtener inmunidad a WT1. Para ensayar si la inmunidad a WT1 puede generarse por vacunación, se inyectaron ratones con TRAMP-C, un linaje celular de tumor positivo en WT1 de origen B6. Brevemente, se inmunizaron ratones B6 machos con 5 x 10^{6} células TRAMP-C subcutáneamente y se reforzaron dos veces con 5 x 10^{6} células a intervalos de tres semanas. Tres semanas después de la inmunización final, se obtuvieron sueros y se prepararon suspensiones de células simples de bazos en medio RPMI 1640 (GIBCO) con \beta-2-mercaptoetanol 25 \muM, 200 unidades de penicilina por ml, L-glutamina 10 mM y 10% de suero de bovino fetal.

Tras inmunizar a TRAMP-C, era detectable una respuesta de anticuerpo específica de WT1 en los animales inmunizados. Un manchas de Western representativo se muestra en la Figura 3. Estos resultados muestran que inmunización a proteína de WT1 puede obtener una respuesta inmune a proteína de WT1.

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Ejemplo 3 Inducción de Th y respuestas de anticuerpo en ratones inmunizados con péptidos de WT1

Este ejemplo ilustra la capacidad de inmunización con péptidos de WT1 para obtener una respuesta inmune específica para WT1.

Se identificaron péptidos adecuados para obtener respuestas de Ab y células T proliferativas según el programa Tsites (Rothbard y Taylor, EMBO J 7:93-100, 1988; Deavin et al., Mol. Immunol. 33:145-155, 1996), que busca motivos de péptidos que tengan el potencial para obtener respuestas de Th. Se sintetizaron y se determinó la secuencia de los péptidos mostrados en la Tabla I.

TABLA I

1

Para inmunización, los péptidos se agruparon como sigue:

Grupo A:: p6-22 humano: 10,9 mg en 1 ml (101 \mul = 100 \mug)

\quad: p117-139 humano/ratón: 7,6 mg en 1 ml (14 \mul = 100 \mug)

\quad: p244-262 humano: 4,6 mg en 1 ml (22 \mul = 100 \mug)

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Grupo B:: p287-301 humano/ratón: 7,2 mg en 1 ml (14 \mul = 100 \mug)

\quad: p299-313 de ratón: 6,6 mg en 1 ml (15 \mul = 100 \mug)

\quad: p421-435 humano/ratón: 3,3 mg en 1 ml (30 \mul = 100 \mug)

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Testigo:: (péptido de FBL 100 \mug) + CFA/IFA

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Testigo:: (péptido de CD45 100 \mug) + CFA/IFA

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El Grupo A contenía péptidos presentes dentro de la porción del término amino de WT1 (exón 1) y el Grupo B contenía péptidos presentes dentro del término carboxi, que contiene una región de cuatro dedos de zinc con homología de secuencia con otras proteínas de unión a ADN. Dentro del Grupo B, p287-301 y p299-313 se derivaban del exón 7, dedo de zinc 1, y p421-435 se derivaba del exón 10, dedo de zinc IV.

Se inmunizaron ratones B6 con un grupo de péptidos de WT1 o con un péptido testigo. Se disolvieron los péptidos en 1 ml de agua estéril para inyección, y se inmunizaron ratones B6 3 veces a intervalos de tiempo de tres semanas. Los coadyuvantes usados fueron CFA/IFA, GM-CSF y Montinide. Se determinó después la presencia de anticuerpos específicos para WT1 como se ha descrito en los Ejemplos 1 y 2, y se evaluaron las respuestas de células T proliferativas usando un ensayo de incorporación de timidina estándar, en el que se cultivaron células en presencia de antígeno y se evaluó la proliferación midiendo la radioactividad incorporada (Chen et al., Cancer Res. 54:1065-1070, 1994). En particular, se cultivaron linfocitos en placas de 96 pocillos a razón de 2 x 10^{5} células por pocillo con 4 x 10^{5} células de bazo singénicas irradiadas (3000 rads) y el péptido designado.

La inmunización de ratones con el grupo de péptidos designado como Grupo A obtuvo una respuesta de anticuerpo a WT1 (Figura 4). No se detectaron anticuerpos tras inmunización a Vacuna B, que es consecuente con una falta de respuesta de células T auxiliares de la inmunización con Vacuna B. p117-139 obtuvo respuestas de células T proliferativas (Figuras 5A-5C). Los índices de estimulación (SI) variaron entre 8 y 72. También se mostró que otros péptidos (p6-22 y p299-313) obtienen respuestas de células T proliferativas. La inmunización con p6-22 produjo un índice de estimulación (SI) de 2,3 y la inmunización con np299-313 produjo un SI de 3,3. Los testigos positivos incluían células T estimuladas con ConA, así como células T estimuladas con antígenos conocidos, tales como CD45 y FBL, y linajes de células T alogénicas (DeBrujin et al., Eur. J. Immunol. 21:2963-2970, 1991).

Las Figuras 6A y 6B muestran la respuesta proliferativa observada para cada uno de los tres péptidos dentro de la Vacuna A (Figura 6A) y la Vacuna B (Figura 6B). La Vacuna A obtuvo respuestas de células T proliferativas a los péptidos inmunizantes p6-22 y p117-139, con índices de estimulación (SI) variables entre 3 y 8 (líneas medianas). No se detectó respuesta proliferativa a p244-262 (Figura 6A).

Se realizaron estimulaciones in vitro subsiguientes como estimulaciones de péptidos simples usando sólo p6-22 y p117-139. La estimulación del linaje de células T específico de Vacuna A con p117-139 produjo proliferación a p117-139 sin respuesta a p6-22 (Figura 7A). Los clones derivados del linaje eran específicos para p117-139 (Figura 7B). Por contraste, la estimulación del linaje de células T específico de Vacuna A con p6-22 produjo proliferación a p6-22 sin respuesta a p117-139 (Figura 7C). Los clones derivados del linaje eran específicos para p6-22 (Figura 7D).

Estos resultados muestran que la vacunación con péptidos de WT1 puede obtener respuestas de anticuerpos a proteína de WT1 y respuestas de células T proliferativas a los péptidos inmunizantes.

Ejemplo 4 Inducción de respuestas de CTL en ratones inmunizados con péptidos de WT1

Este ejemplo ilustra la capacidad de péptidos de WT1 para obtener inmunidad de CTL.

Se identificaron péptidos (9 meros) con motivos apropiados para unirse a MHC clase I usando un análisis de predicción de unión de pépidos BIMAS HLA (Parker et al., J. Immunol. 152:163, 1994). Los péptidos identificados dentro de tales análisis se muestran en las Tablas II-XLIV. En cada una de estas tablas, la puntuación refleja la afinidad de unión teórica (mitad de tiempo de disociación) del péptido a la molécula MHC indicada.

Se muestran adicionalmente en las Figuras 8A y 8B, y en la Tabla XLV, péptidos identificados usando el programa Tsites (Rothbard y Taylor, EMBO J. 7:93-100, 1988; Deavin et al., Mol. Immunol. 33:145-155, 1966), que busca motivos de péptidos que tienen el potencial de obtener respuestas de Th.

TABLA II

3

4

TABLA III

7

TABLA III (continuación)

8

TABLA IV

10

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TABLA V

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TABLA V (continuación)

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TABLA VI

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TABLA VI (continuación)

20

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TABLA VII

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TABLA VII (continuación)

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TABLA VII (continuación)

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TABLA VIII

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TABLA VIII (continuación)

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TABLA IX

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TABLA IX (continuación)

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TABLA X

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TABLA X (continuación)

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TABLA X (continuación)

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TABLA XI

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TABLA XI (continuación)

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TABLA XII

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TABLA XII (continuación)

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TABLA XIII

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TABLA XIII (continuación)

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TABLA XIV

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TABLA XIV (continuación)

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TABLA XV

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TABLA XV (continuación)

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TABLA XV (continuación)

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TABLA XVI

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TABLA XVI (continuación)

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TABLA XVII

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TABLA XVII (continuación)

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TABLA XVIII

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TABLA XVIII (continuación)

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TABLA XIX

64

TABLA XIX (continuación)

66

TABLA XX

68

TABLA XX (continuación)

71

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TABLA XXI

72

TABLA XXI (continuación)

74

TABLA XXII

75

TABLA XXII (continuación)

78

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TABLA XXIII

79

TABLA XXIII (continuación)

81

TABLA XXIV

83

TABLA XXIV (continuación)

85

TABLA XXV

87

TABLA XXV (continuación)

90

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TABLA XXVI

91

TABLA XXVI (continuación)

93

TABLA XXVII

94

TABLA XXVII (continuación)

95

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TABLA XXVIII

97

TABLA XXVIII (continuación)

98

TABLA XXIX

101

TABLA XXIX (continuación)

103

TABLA XXX

105

TABLA XXX (continuación)

108

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TABLA XXXI

109

TABLA XXXI (continuación)

111

TABLA XXXII

112

TABLA XXXII (continuación)

113

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TABLA XXXIII

115

TABLA XXXIII (continuación)

116

TABLA XXXIV

119

TABLA XXXIV (continuación)

121

TABLA XXXV

123

TABLA XXXV (continuación)

126

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TABLA XXXVI

127

TABLA XXXVI (continuación)

129

TABLA XXXVII

130

TABLA XXXVII (continuación)

131

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TABLA XXXVIII

133

TABLA XXXVIII (continuación)

134

TABLA XXXIX

137

TABLA XXXIX (continuación)

139

TABLA XL

142

TABLA XL (continuación)

144

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TABLA XLI

145

TABLA XLI (continuación)

147

TABLA XLII

149

TABLA XLII (continuación)

150

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TABLA XLIII

152

TABLA XLIII (continuación)

153

TABLA XLIII (continuación)

155

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TABLA XLIV

156

TABLA XLIV (continuación)

158

TABLA XLV

160

Se seleccionaron ciertos péptidos de CTL (mostrados en la Tabla XLVI) para un estudio adicional. Para cada péptido en la Tabla XLVI, se proporcionan puntuaciones obtenidas usando análisis de predicción de unión de péptidos BIMAS HLA.

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TABLA XLVI

161

162

Se confirmó la unión de péptido a MHC de ratón C57B1/6 usando el linaje celular de leucemia RMA-S, como se describe por Ljunggren et al., Nature 346:476-480, 1990. En breve, se cultivaron células RMA-S durante 7 horas a 26ºC en medio completo suplementado con 1% de FCS. Se añadió un total de 10^{6} células RMA-S a cada pocillo de una placa de 24 pocillos y se incubaron solas o con el péptido designado (25 \mug/ml) durante 16 horas a 26ºC y 3 horas adicionales a 37ºC en medio completo. Se lavaron después las células tres veces y se colorearon con anticuerpo anti D^{b} o anti-K^{b} conjugado a isotiocianato de fluoresceína (PharMingen, San Diego, CA). Las células marcadas se lavaron dos veces, se resuspendieron y se fijaron en 500 \mul de PBS con 1% de paraformaldehído y se analizó su intensidad de fluorescencia en un citómetro de flujo (Becton-Dickinson FACSCalibur®). Se midió el porcentaje de aumento de moléculas D^{b} o K^{d} en la superficie de las células RMA-S por la intensidad fluorescente media aumentada de las células incubadas con péptido en comparación con la de las células incubadas en medio solo.

Se inmunizaron ratones con los péptidos capaces de unirse a MHC clase I de ratón. Tras la inmunización, se estimularon in vitro células de bazo y se ensayó su capacidad para lisar objetivos incubados con péptidos de WT1. Se evaluaron CTL con un ensayo de liberación de cromo estándar (Chen et al., Cancer Res. 54:1065-1070, 1994). Se incubaron 10^{6} células objetivo a 37ºC con 150 \muCi de ^{51}Cr sodio durante 90 minutos, en presencia o ausencia de péptidos específicos. Se lavaron células tres veces y se resuspendieron en RPMI con 5% de suero de bovino fetal. Para el ensayo, se incubaron 10^{4} células objetivo marcadas con ^{51}Cr con diferentes concentraciones de células efectoras en un volumen final de 200 \mul en placas de 96 pocillos de fondo en U. Se separaron sobrenadantes después de 4 a 7 horas a 37ºC, y se determinó el porcentaje de lisis específica mediante la fórmula:

% de lisis específica = 100 x (liberación experimental - liberación espontánea)/(liberación máxima - liberación espontánea)

Los resultados, presentados en la Tabla XLVII, muestran que algunos péptidos de WT1 se unen a moléculas de MHC clase I, lo que es esencial para generar CTL. Además, varios de los péptidos eran capaces de obtener CTL específicos de péptidos (Figuras 9A y 9B), determinado usando ensayos de liberación de cromo. Tras la inmunización a péptidos de CTL, se generaron linajes de CTL específicos de péptidos p10-18 humano, p136-144 humano, p136-144 de ratón y p235-243, y se establecieron clones. Estos resultados indican que CTL específicos de péptidos pueden destruir células malignas que expresan WT1.

TABLA XLVII

163

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Ejemplo 5 Uso de un polipéptido de WT1 para obtener CTL específicos de WT1 en ratones

Este ejemplo ilustra la capacidad de un polipéptido de WT1 representativo para obtener inmunidad de CTL capaz de destruir linajes celulares de tumores positivos en WT1.

Se identificó como se ha descrito antes, usando análisis de predicción de unión de péptidos TSITES y BIMAS HLA, p117-139, un péptido con motivos apropiados para unirse a MHC clase I y clase II. Se inmunizaron ratones como se ha descrito en el Ejemplo 3. Después de la inmunización, se estimularon in vitro células de bazo y se ensayó su capacidad para lisar objetivos incubados con péptidos de WT1, así como células tumorales positivas y negativas en WT1. Los CTL se evaluaron con un ensayo de liberación de cromo estándar. Los resultados, presentados en las Figuras 10A-10D, muestran que p117 puede obtener CTL específicos de WT1 capaces de destruir células tumorales positivas en WT1, mientras que no se observó destrucción de células negativas en WT1. Estos resultados demuestran que CTL específicos de péptidos destruyen de hecho células malignas que expresan WT1 y que la vacuna y terapia de células T son eficaces contra malignidades que expresan WT1.

Se realizaron inmunizaciones similares usando los péptidos de unión de MHC clase I de 9 meros p136-144, p225-233, p235-243 así como el péptido de 23 meros p117-139. Tras la inmunización, se estimularon in vitro células de bazo con cada uno de los 4 péptidos y se ensayó su capacidad para lisar objetivos incubados con péptidos de WT1. Se generaron CTL específicos para p136-144, p235-243 y p117-139, pero no para p225-233. Los datos de CTL para p235-243 y p117-139 se presentan en las Figuras 11A y 11B. Los datos para los péptidos p136-144 y p225-233 no se representan.

La lisis de CTL demanda que los péptidos de WT1 objetivo se elaboren endógenamente y se presenten en asociación con moléculas de MHC clase I de células tumorales. Se ensayó la capacidad de los CTL específicos de péptidos de WT1 anteriores para lisar linajes celulares positivos frente a negativos en WT1. Los CTL específicos para p235-243 lisaron objetivos incubados con los péptidos de p235-243, pero no lisaron linajes celulares que expresaban proteínas de WT1 (Figura 11A). En marcado contraste, los CTL específicos para p117-139 lisaron objetivos incubados con péptidos p117-139 y lisaron también células malignas que expresan WT1 (Figura 11B). Como testigo negativo, CTL específicos para p117-139 no lisaron EL-4 negativo en WT1 (al que también se hace referencia aquí como E10).

La especificidad de la lisis específica de WT1 se confirmó por inhibición de objetivo frío (Figuras 12A-12B). Se pusieron en placa células efectoras para diversas relaciones efector:objetivo en placas de fondo en U de 96 pocillos. Se añadió un exceso de diez veces (en comparación con objetivo caliente) del objetivo revestido de péptido indicado sin marcado con ^{51}Cr. Finalmente, se añadieron 10^{4} células objetivo marcadas con ^{51}Cr por pocillo y se incubaron las placas a 37ºC durante 4 horas. El volumen total por pocillo fue 200 \mul.

La lisis de TRAMP-C por CTL específicos de p117-139 se bloqueó del 58% al 36% por EL-4 incubado con el péptido relevante p117-139, pero no con EL-4 incubado con un péptido irrelevante (Figura 12A). De modo similar, la lisis de BLK-SV40 se bloqueó del 18% al 0% por EL-4 incubado con el péptido relevante p117-139 (Figura 12B). Los resultados validan que CTL específicos de péptidos de WT1 destruyen específicamente células malignas por reconocimiento de WT1 elaborado.

Varios segmentos con motivos de CTL putativos están contenidos dentro de p117-139. Para determinar la secuencia precisa del epítope de CTL, se sintetizaron todos los péptidos de 9 meros potenciales dentro de p117-139 (Tabla XLVIII). Se mostró que dos de estos péptidos (p126-134 y p130-138) se unen a moléculas H-2^{b} clase I (Tabla XLVIII). Los CTL generados por inmunización con p117-139 lisaron objetivos incubados con p126-134 y p130-138, pero no los otros péptidos de 9 meros dentro de p117-139 (Figura 13A).

Los CTL específicos de p117-139 se reestimularon con p126-134 o p130-138. Tras la reestimulación con p126-134 o p130-138, ambos linajes de células T demostraron lisis específicas de péptidos, pero sólo CTL específicos de p130-138 mostraron lisis de un linaje de células tumorales positivo en WT1 (Figuras 13B y 13C). Así, p130-138 parece ser el epítope elaborado naturalmente.

TABLA XLVIII

165

Ejemplo 6 Identificación de mARN específico de WT1 en linajes celulares de tumores de ratón

Este ejemplo ilustra el uso de RT-PCR para detectar mARN específico de WT1 en células y linajes celulares.

Se aislaron células mononucleares por centrifugación con gradiente de densidad, y se congelaron inmediatamente y guardaron a -80ºC hasta analizarse en ellas por RT-PCR la presencia de mARN específico de WT1. Se realizó generalmente RT-PCR como se describe por Fraizer et al., Blood 86:4704-4706, 1995. Se extrajo ARN total de 10^{7} células según procedimientos estándares. Los glóbulos de ARN se resuspendieron en 25 \mul de agua tratada con pirocarbonato de dietilo y se usaron directamente para transcripción inversa. La región de dedo de zinc (exones 7 a 10) se multiplicó por PCR como un cADN de ratón de 330 pb. La multiplicación se realizó en un termociclador durante una o, cuando fue necesario, dos rondas secuenciales de PCR. Se usaron AmpliTaq DNA Polymerase (Perkin Elmer Celus, Norwalk, CT), MgCl_{2} 2,5 mM y 20 pmoles de cada cebador en un volumen de reacción total de 50 \mul. Se sometieron a electroforesis partes alícuotas de veinte \mul de los productos de PCR en geles de 2% de agarosa coloreados con bromuro de etidio. Los geles se fotografiaron con película Polaroid (Polaroid 667, Polaroid Ltd., Hertfordshire, Inglaterra). Se tomaron precauciones contra contaminación cruzada siguiendo las recomendaciones de Kwok e Higuchi, Nature 339:237-238, 1989. Los testigos negativos incluían las mezclas de reactivos de cADN y PCR con agua en lugar de cADN en cada experimento. Para evitar negativos falsos, se evaluó para cada muestra la presencia de ARN intacto y la generación de cADN adecuado mediante una PCR testigo usando cebadores de \beta-actina. Se excluyeron del análisis las muestras que no se multiplicaban con estos cebadores.

Los cebadores para multiplicación de WT1 en linajes celulares de ratones fueron: p115: 1458-1478: 5' CCC AGG CTG CAA TAA GAG ATA 3' (cebador directo; SEQ ID NO:21); y p116: 1767-1787: 5' ATG TTG TGA TGG CGG ACC AAT 3' (cebador inverso; SEQ ID NO: 22) (véase Inoue et al., Blood 88:2267-2278, 1996; Fraizer et al., Blood 86:4704-4706, 1995).

Los cebadores de beta actina usados en las reacciones testigo fueron: 5' GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA 3' (cebador sentido; SEQ ID NO: 23); y 5' GTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC 3' (cebador antisentido; SEQ ID NO: 24).

Los cebadores para uso en multiplicación de WT1 humano incluyen: p117: 954-974: 5' GGC ATC TGA GAC CAG TGA GAA 3' (SEQ ID NO: 25); y p118: 1434-1414: 5' GAG AGT CAG ACT TGA AAG CAGT 3' (SEQ ID NO: 5). Para RT-PCR anidada, los cebadores pueden ser: p119: 1023-1043: 5' GCT GTC CCA CTT ACA GAT GCA 3' (SEQ ID NO: 26); y p120: 1345-1365 5' TCA AAG CGC CAG CTG GAG TTT 3' (SEQ ID NO: 27).

La Tabla XLVIII muestra los resultados de análisis de PCR de WT1 de linajes celulares de tumores de ratones. Dentro de la Tabla IV, (+++) indica un fuerte producto de multiplicación de PCR de WT1 en la RT PCR de primera etapa, (++) indica un producto de multiplicación de WT1 que es detectable por RT-PCR de WT1 de primera etapa, (+) indica un producto que es detectable sólo en la segunda etapa de RT PCR de WT1 y (-) indica PCR de WT1 negativa.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA XLIX

167

Se apreciará de lo anterior que, aunque se han descrito aquí realizaciones específicas de la invención con fines de ilustración, pueden hacerse diversas modificaciones sin desviarse del alcance de la invención. Por consiguiente, la invención no está limitada excepto por las reivindicaciones adjuntas.

<110> Gaiger, Alexander

\hskip1cm

Cheever, Martin A.

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<120> COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA INMUNOTERAPIA ESPECÍFICA DE WT1

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<130> 210121.465C1

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<140> US

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<141> 25-03-1999

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<160> 326

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<170> FastSEQ para Windows Versión 3.0

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<210> 1

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<211> 17

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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<400> 1

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168

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<210> 2

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<211> 23

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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<400> 2

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169

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<210> 3

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<211> 23

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 3

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\hskip1cm

170

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<210> 4

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<211> 19

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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<400> 4

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171

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<210> 5

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> Homo sapien

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<400> 5

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\hskip1cm

172

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<210> 6

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Homo sapien

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<400> 6

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\hskip1cm

173

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<210> 7

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<211> 27

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<212> ADN

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<213> Homo sapien

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<400> 7

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\hskip1cm

174

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<210> 8

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<211> 25

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<212> ADN

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<213> Homo sapien

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<400> 8

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\hskip1cm

175

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<210> 9

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<211> 18

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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<400> 9

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\hskip1cm

176

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<210> 10

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<211> 18

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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<400> 10

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\hskip1cm

177

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<210> 11

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<211> 27

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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<400> 11

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\hskip1cm

178

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<210> 12

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<211> 29

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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<400> 12

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\hskip1cm

179

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<210> 13

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<211> 17

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 13

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\hskip1cm

180

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<210> 14

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<211> 19

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 14

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\hskip1cm

181

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<210> 15

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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<400> 15

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\hskip1cm

182

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<210> 16

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 16

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\hskip1cm

183

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<210> 17

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<211> 14

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 17

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\hskip1cm

184

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<210> 18

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<211> 14

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

185

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

186

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\hskip1cm

187

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

188

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

189

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

190

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

191

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

192

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

193

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

194

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

195

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

196

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

197

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

198

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

199

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

200

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

201

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

202

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

203

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

204

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

205

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

206

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

207

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

208

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

209

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

210

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

211

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

212

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

213

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

214

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

215

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

216

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

217

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

218

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

219

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

220

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

221

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

222

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

223

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

224

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

225

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

226

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

227

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

228

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

229

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

230

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

231

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

232

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

233

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

234

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

235

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

236

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

237

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

238

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

239

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

240

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

241

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

242

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

243

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 77

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

244

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 78

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\hskip1cm

245

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 79

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\hskip1cm

246

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 80

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\hskip1cm

247

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 81

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

248

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 82

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

249

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 83

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\hskip1cm

250

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 84

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\hskip1cm

251

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 85

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 85

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

252

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 86

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

253

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 87

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

254

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 88

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

255

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 89

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

256

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 90

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

257

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 91

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 91

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

258

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 92

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 92

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

259

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 93

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

260

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 94

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 94

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

261

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 95

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 95

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

262

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 96

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

263

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 97

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 97

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

264

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 98

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 98

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

265

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 99

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 99

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

266

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 100

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 100

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

267

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 101

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 101

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

268

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 102

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

269

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 103

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 103

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

270

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 104

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 104

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

271

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 105

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 105

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

272

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 106

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 106

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

273

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 107

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 107

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

274

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 108

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

275

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 109

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

276

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 110

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 110

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

277

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 111

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 111

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

278

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 112

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

279

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 113

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 113

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\hskip1cm

280

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 114

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 114

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\hskip1cm

281

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 115

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 115

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\hskip1cm

282

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 116

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 116

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\hskip1cm

283

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 117

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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<400> 117

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\hskip1cm

284

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 118

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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<400> 118

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\hskip1cm

285

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 119

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 119

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\hskip1cm

286

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 120

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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<400> 120

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\hskip1cm

287

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 121

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 121

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\hskip1cm

288

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<210> 122

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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<400> 122

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\hskip1cm

289

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<210> 123

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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\hskip1cm

290

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<210> 124

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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<400> 124

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\hskip1cm

291

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 125

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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<400> 125

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\hskip1cm

292

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<210> 126

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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\hskip1cm

293

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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\hskip1cm

294

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\vskip0.400000\baselineskip

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 128

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\hskip1cm

295

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 129

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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<400> 129

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\hskip1cm

296

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 130

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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<400> 130

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\hskip1cm

297

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<210> 131

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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<400> 131

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\hskip1cm

298

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<210> 132

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 132

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\hskip1cm

299

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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<400> 133

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\hskip1cm

300

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\vskip0.400000\baselineskip

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 134

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\hskip1cm

301

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<213> Homo sapien

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\hskip1cm

302

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\vskip0.400000\baselineskip

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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\hskip1cm

303

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\vskip0.400000\baselineskip

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 137

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\hskip1cm

304

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 138

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

\newpage

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<400> 138

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\hskip1cm

305

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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<400> 139

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\hskip1cm

306

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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\hskip1cm

307

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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<400> 141

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\hskip1cm

308

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 142

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\hskip1cm

309

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<210> 143

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

\newpage

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<400> 143

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\hskip1cm

310

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<210> 144

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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\hskip1cm

311

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 145

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\hskip1cm

312

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 146

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 146

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\hskip1cm

313

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<210> 147

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 147

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\hskip1cm

314

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 148

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

\newpage

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<400> 148

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\hskip1cm

315

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 149

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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<400> 149

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\hskip1cm

316

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\vskip0.400000\baselineskip

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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\hskip1cm

317

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 151

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 151

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\hskip1cm

318

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 152

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 152

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\hskip1cm

319

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<210> 153

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

\newpage

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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<400> 154

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\hskip1cm

321

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<210> 155

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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\hskip1cm

322

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<213> Homo sapien

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<400> 156

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323

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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<400> 157

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324

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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\hskip1cm

325

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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326

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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\hskip1cm

327

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328

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331

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<212> PRT

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<212> PRT

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\hskip1cm

334

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<213> Homo sapien

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345

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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367

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 201

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 201

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

368

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 202

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 202

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

369

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 203

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 203

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\hskip1cm

370

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 204

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

\newpage

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<400> 204

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

371

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 205

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 205

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\hskip1cm

372

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 206

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 206

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\hskip1cm

373

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 207

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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<400> 207

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\hskip1cm

374

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 208

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 208

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\hskip1cm

375

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<210> 209

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 209

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\hskip1cm

376

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 210

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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<400> 210

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\hskip1cm

377

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 211

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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<400> 211

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\hskip1cm

378

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 212

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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<400> 212

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

379

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<210> 213

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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<400> 213

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\hskip1cm

380

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<210> 214

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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<400> 214

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\hskip1cm

381

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<210> 215

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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<400> 215

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\hskip1cm

382

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 216

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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<400> 216

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\hskip1cm

383

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<210> 217

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 217

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\hskip1cm

384

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<210> 218

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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<400> 218

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\hskip1cm

385

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 219

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 219

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\hskip1cm

386

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 220

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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<400> 220

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\hskip1cm

387

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 221

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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<400> 221

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\hskip1cm

388

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 222

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 222

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\hskip1cm

389

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 223

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 223

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\hskip1cm

390

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 224

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<211> 9

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 224

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\hskip1cm

391

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 225

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<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 225

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

392

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 226

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 226

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\hskip1cm

393

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 227

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 227

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\hskip1cm

394

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 228

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 228

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\hskip1cm

395

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 229

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 229

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\hskip1cm

396

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 230

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 230

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

397

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 231

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 231

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\hskip1cm

398

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 232

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 232

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\hskip1cm

399

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 233

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 233

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\hskip1cm

400

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 234

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 234

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\hskip1cm

401

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 235

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 235

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\hskip1cm

402

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 236

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 236

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\hskip1cm

403

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 237

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 237

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

404

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 238

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 238

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

405

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 239

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 239

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

406

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 240

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 240

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

407

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 241

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 241

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

408

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 242

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 242

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

409

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 243

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 243

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

410

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 244

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 244

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

411

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 245

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 245

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

412

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 246

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 246

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

413

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 247

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 247

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

414

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 248

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 248

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

415

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 249

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 249

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

416

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 250

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 250

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

417

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 251

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 251

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

418

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 252

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 252

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

419

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 253

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 253

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

420

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 254

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 254

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

421

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 255

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 255

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

422

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 256

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<211> 9

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 256

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

423

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 257

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 257

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

424

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 258

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 258

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

425

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 259

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 259

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

426

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 260

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 260

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

427

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 261

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 261

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

428

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 262

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 262

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

429

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 263

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 263

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

430

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 264

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 264

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

431

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 265

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 265

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

432

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 266

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 266

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

433

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 267

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 267

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

434

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 268

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 268

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

435

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 269

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 269

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

436

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 270

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 270

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

437

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 271

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 271

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

438

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 272

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 272

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

439

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 273

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 273

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

440

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 274

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 274

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

441

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 275

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 275

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

442

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 276

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 276

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

443

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 277

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 277

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

444

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 278

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 278

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

445

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 279

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 279

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

446

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 280

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 280

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

447

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 281

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 281

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

448

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 282

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 282

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

449

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 283

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 283

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

450

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 284

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 284

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

451

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 285

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 285

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

452

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 286

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 286

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

453

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 287

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 287

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

454

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 288

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 288

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

455

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 289

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 289

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

456

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 290

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 290

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

457

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 291

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 291

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

458

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 292

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 292

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

459

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 293

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 293

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

460

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 294

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 294

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

461

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 295

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 295

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

462

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 296

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 296

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

463

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 297

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 297

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

464

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 298

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 298

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

465

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 299

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 299

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

466

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 300

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 300

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

467

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 301

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 301

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

468

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 302

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 302

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

469

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 303

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 303

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

470

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 304

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 304

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

471

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 305

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 305

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

472

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 306

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 306

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

473

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 307

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 307

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

474

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 308

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 308

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

475

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 309

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 309

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

476

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 310

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 310

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

477

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 311

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 311

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

478

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 312

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 312

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

479

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 313

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 313

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

480

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 314

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 314

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

481

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 315

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 315

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

482

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 316

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 316

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

483

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 317

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 317

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

484

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 318

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 318

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

485

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 319

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 449

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 319

\vskip1.000000\baselineskip

486

487

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 320

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 449

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 320

\vskip1.000000\baselineskip

488

489

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 321

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien y Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 321

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

490

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 322

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien y Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 322

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

491

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 323

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien y Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 323

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

492

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 324

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien y Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 324

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

493

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 325

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien y Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 325

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

494

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 326

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien y Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 326

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

495

Claims

1. Un polipéptido en el que el polipéptido es una porción inmunógena de un polipéptido de WT1 nativo y consiste en una secuencia seleccionada entre SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 144.

2. Un polinucleótido que codifica el polipéptido según la reivindicación 1.

3. Una composición farmacéutica que comprende un vehículo o excipiente aceptable farmacéuticamente en combinación con un polipéptido según la reivindicación 1.

4. Una composición farmacéutica que comprende un vehículo o excipiente aceptable farmacéuticamente en combinación con un polinucleótido según la reivindicación 2.

5. Una composición farmacéutica, que comprende:

(a): un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente al polipéptido de la reivindicación 1; y

(b): un vehículo o excipiente aceptable farmacéuticamente.

6. Una composición farmacéutica, que comprende:

(a): una célula T que reacciona específicamente con el polipéptido de la reivindicación 1; y

(b): un vehículo o excipiente aceptable farmacéuticamente.

7. Una composición farmacéutica, que comprende:

(a): una célula que presenta antígeno que expresa el polipéptido de la reivindicación 1; y

(b): un vehículo o excipiente aceptable farmacéuticamente.

8. Una vacuna que comprende:

(a): el polipéptido según la reivindicación 1; y

(b): un aumentador de la respuesta inmune no específico que aumenta preferentemente una respuesta de células T en un paciente.

9. Una vacuna que comprende:

(a): un polinucleótido según la reivindicación 2; y

10. Una vacuna según las reivindicaciones 8 o 9, en la que el aumentador de la respuesta inmune es un coadyuvante.

11. Una vacuna según las reivindicaciones 8 o 9, en la que el aumentador de la respuesta inmune comprende un coadyuvante basado en el sistema Ribi Adjuvant.

12. Una vacuna según las reivindicaciones 8 o 9, en la que el aumentador de la respuesta inmune comprende GM-CSF.

13. Una vacuna según las reivindicaciones 8 o 9, en la que el aumentador de la respuesta inmune se selecciona del grupo constituido por Montanide ISA50, Seppic MONTANIDE ISA 720, ligando de Flt3, una microesfera, un coadyuvante basado en bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDA), AS-1, AS-2, QS21, un coadyuvante basado en saponina, un coadyuvante Syntex en su forma microfluidizada, MV, ddMV, un coadyuvante basado en complejo estimulante inmune (iscom) y una toxina inactivada.

14. Una vacuna, que comprende:

(b): un aumentador de la respuesta inmune no específico.

\newpage

15. Una vacuna, que comprende:

(a): un anticuerpo anti-idiotípico o un fragmento de unión a antígeno del mismo que es unido específicamente por un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido según la reivindicación 1; y

(b): un aumentador de la respuesta inmune no específico.

16. Una vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 14 o 15, en la que el aumentador de la respuesta inmune es un coadyuvante.

17. Una vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 14 o 15, en la que el aumentador de la respuesta inmune aumenta preferentemente una respuesta de células T en un paciente.

18. El uso de la composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 3-7, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad maligna asociada con expresión de WT1 en un paciente humano.

19. El uso de la vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 8-17, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad maligna asociada con expresión de WT1 en un paciente humano.

20. El uso de la composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 3-7, para la fabricación de un medicamento para inhibir el desarrollo de una enfermedad maligna asociada con expresión de WT1 en un paciente humano.

21. El uso de la vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 8-17, para la fabricación de un medicamento para inhibir el desarrollo de una enfermedad maligna asociada con expresión de WT1 en un paciente humano.

22. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, en el que la enfermedad maligna es una leucemia.

23. El uso según la reivindicación 22, en el que la leucemia es leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica aguda o leucemia mieloide crónica.

24. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, en el que la enfermedad maligna es un cáncer.

25. El uso según la reivindicación 24, en el que el cáncer es cáncer de pecho, pulmón, tiroides o gastrointestinal o un melanoma.

26. Un método in vitro para separar células que expresan WT1 de médula ósea, sangre periférica o una fracción de médula ósea o sangre periférica, que comprende poner en contacto médula ósea, sangre periférica o una fracción de médula ósea o sangre periférica con células T que reaccionan específicamente con un polipéptido de WT1 según la reivindicación 1, en el que la etapa de puesta en contacto se realiza en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la separación de células positivas en WT1 a menos del 10% del número de células mieloides o linfocíticas en la médula ósea, sangre periférica o una fracción de médula ósea o sangre periférica.

27. El uso de médula ósea, sangre periférica o una fracción de médula ósea o sangre periférica preparadas según el método de la reivindicación 26, para la fabricación de un medicamento para inhibir el desarrollo de una enfermedad maligna asociada con expresión de WT1 en un paciente.

28. El uso según la reivindicación 27, en el que la médula ósea, sangre periférica o fracción es autóloga.

29. El uso según la reivindicación 27, en el que la médula ósea, sangre periférica o fracción es singénica o alogénica.

30. Un método in vitro para estimular y/o expandir células T, que comprende poner en contacto células T con un polipéptido de WT1 según la reivindicación 1, un polinucleótido según la reivindicación 2 y/o una célula que presenta antígeno que expresa un polipéptido de WT1 según la reivindicación 1, en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la estimulación y/o expansión de células T.

31. El método según la reivindicación 30, en el que las células T están presentes dentro de médula ósea, sangre periférica o una fracción de médula ósea o sangre periférica.

32. El método según la reivindicación 30, en el que la médula ósea, sangre periférica o fracción se obtienen de un paciente afligido con una enfermedad maligna asociada con expresión de WT1.

33. El método según la reivindicación 30, en el que la médula ósea, sangre periférica o fracción se obtienen de un mamífero que no está afligido con una enfermedad maligna asociada con expresión de WT1.

34. El método según la reivindicación 30, en el que las células T son clonadas antes de la expansión.

35. El uso de células T obtenibles por el método de una cualquiera de las reivindicaciones 30 a 34, para la fabricación de un medicamento para inhibir el desarrollo de una enfermedad maligna asociada con expresión de WT1 en un paciente.

36. El uso de uno cualquiera o más de los siguientes:

(a): un polipéptido según la reivindicación 1;

(b): un polinucleótido según la reivindicación 2;

(c): una célula que presenta antígeno que expresa un polipéptido según la reivindicación 1;

(d): un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un polipéptido de WT1 de la reivindicación 1; y

(e): una célula T que reacciona específicamente con un polipéptido de WT1 de la reivindicación 1; para la fabricación de un medicamento para comprobar la eficacia de una inmunización o terapia para una enfermedad maligna asociada con expresión de WT1 en un paciente.

37. El uso de uno cualquiera o más de los siguientes:

(a): un polipéptido según la reivindicación 1;

(b): un polinucleótido según la reivindicación 2;

(d): una célula T que reacciona específicamente con un polipéptido de WT1 de la reivindicación 1; para la fabricación de un medicamento para determinar la presencia o ausencia de una enfermedad maligna asociada con expresión de WT1 en un paciente.

38. El uso según la reivindicación 37, en el que la enfermedad maligna es un cáncer o una leucemia.

39. Un polipéptido según la reivindicación 1 o un polinucleótido según la reivindicación 2 de uso como sustancia terapéutica activa.

40. Un polipéptido según la reivindicación 1 o un polinucleótido según la reivindicación 2 de uso para aumentar o inducir una respuesta inmune en un paciente.

41. Un polipéptido según la reivindicación 1 o un polinucleótido según la reivindicación 2 de uso para inhibir el desarrollo de una enfermedad maligna asociada con expresión de WT1 en un paciente humano.