ES2310172T3 - Utilizacion de un polisacarido sulfatado de bajo peso molecular para el tratamiento de trombosis. - Google Patents
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Abstract
Utilización de un polisacárido sulfatado susceptible de ser obtenido por despolimerización radical de un fucano bruto procedente de Pheophíceas, teniendo dicho polisacárido una masa molar inferior o igual a 10 000 g/mol, para la obtención de un medicamento destinado a la prevención o al tratamiento de la trombosis vascular.
Description
Utilización de un polisacárido sulfatado de bajo
peso molecular para el tratamiento de trombosis.
La presente invención tiene por objeto la
utilización de un polisacárido sulfatado con masa molar inferior o
igual a 10.000 g/mol, susceptible de ser conseguido por
despolimerización radical de un fucano en bruto procedente de
Pheophíceas, para la obtención de un medicamento activo contra la
trombosis arterial y contra la restenosis arterial.
La trombosis consiste en la formación de un
coágulo (trombo) en el aparato circulatorio, cuyo coágulo obstruye
el paso del vaso sanguíneo en el que se forma. El coágulo es
consecuencia de la activación patológica de los fenómenos
fisiológicos de la hemostasis, es decir, fenómenos que concurren en
la prevención y en la interrupción de las hemorragias.
La trombosis pone en marcha un proceso complejo
que implica la activación en cascada de diferentes factores que
conducen a la formación de la trombina, enzima clave de la
coagulación, y a continuación a la fibrinoformación. La formación
del trombo empieza por la adherencia de las plaquetas al tejido
conjuntivo subendotelial, que ha quedado desnudo por una lesión del
endotelio vascular. Las plaquetas se agregan entre sí y el agregado
se envuelve de una red de fibrina, que retiene o aprisiona
igualmente los glóbulos blancos y glóbulos rojos formando el
trombo.
La trombosis arterial difiere de la trombosis
venosa por el hecho de que aparece de modo más frecuente en una
arteria lesionada por la presencia de una placa de ateroma; esta
lesión se caracteriza por otra parte por la proliferación y
emigración hacia la "íntima" de las células musculares lisas de
la "media". La trombosis arterial se produce frecuentemente
cuando tiene lugar la rotura de la placa del ateroma, con pérdida de
continuidad del endotelio vascular. La adherencia y la agregación
de las plaquetas juegan un papel primordial en el fenómeno de la
trombosis arterial.
El conjunto del proceso de respuesta a la lesión
de una arteria implica numerosos fenómenos biológicos celulares que
reducen modificaciones del fenotipo de las células musculares lisas
(CML), así como la expresión de factores de crecimiento que
favorecen la proliferación de las células endoteliales.
En el tratamiento de la trombosis venosa, se
utilizan de manera clásica anticoagulantes, en especial heparina,
que poseen la propiedad de inhibir la trombina y su formación.
La heparina es un polisacárido sulfatado
constituido por unidades de glucosamina y ácidos urónicos ligados
en 1-4, en los que los grupos sulfatos se encuentran
presentes sobre la función amina de la glucosamina y/o sobre
funciones alcohol de la glucosamina y del ácido urónico. Este
polisacárido, cuyas características anticoagulantes son bien
conocidas, es utilizado en la actualidad de manera amplia en el
tratamiento de accidentes trombóticos. La heparina presenta, no
obstante, efectos secundarios muy importantes (hemorragias, riesgo
de trombopenia inmunoalérgica) y es poco eficaz en la trombosis
arterial. Además, el origen animal de este producto es susceptible
de comportar riesgo potencial de contaminación por agentes
infecciosos no convencionales.
Técnicas de despolimerización química o
enzimática han permitido conseguir, a partir de HNF (heparina no
fraccionada, cuyo peso molecular es aproximadamente de 15.000
g/mol), cadenas de polisacáridos de bajo peso molecular, es decir,
de peso molecular comprendido entre 2.000 y 10.000 g/mol,
denominadas HBPM (Heparinas de Bajo Peso Molecular). Numerosas HBPM
han sido sintetizadas y son comercializadas especialmente con las
denominaciones Enoxaparine®, Reviparine®, Dalteparine®,
Fraxiparine®, Tinzaparine®, Certoparine®, Opocrine®, Parnaparine®,
etc.
Se ha demostrado mediante estudios clínicos que
en la profilaxis de los accidentes tromboembólicos venosos, las
HBPM poseen una eficacia idéntica o incluso superior a la de HNF. No
obstante, las HBPM no impiden el riesgo hemorrágico y pueden
comportar, de igual manera que el HNF, si bien con menor frecuencia,
una trombopenia inmunoalérgica.
Por otra parte, se ha demostrado, en particular
por M. Lerch y otros (European Heart Journal, Août 1998, 19, 495) y
H. Rickli y otros (European Heart Journal, Août 1998, 19, 470), que
las HBPM (respectivamente, Reviparin® y Fraxiparin®) son ineficaces
para luchar contra la restenosis después de la angioplastia, es
decir, el fenómeno de reaparición de un estrechamiento de la
abertura de una arteria relacionado con la intervención de una
sonda con globo hinchable en cirugía vascular.
Existen otros polisacáridos sulfatados además de
las heparinas, por ejemplo los fucanos. Estos polisacáridos
sulfatados, de peso molecular elevado (100 a 800 kDa), se encuentran
presentes en las paredes celulares de los tallos de las algas de
color oscuro. Se trata de polímeros de L-fucosa
sulfatada que pueden igualmente contener D-xilosa,
D-galactosa, D-manosa y ácidos
urónicos, estos últimos no sulfatados, contrariamente a los de la
heparina. Los fucanos difieren igualmente de la heparina por el
hecho de que no comprenden aminoazúcares.
Los fucanos poseen diferentes propiedades que
hacen especialmente interesante su explotación en numerosos campos
terapéuticos.
En particular, se ha demostrado que fracciones
de fucano de reducida masa molar obtenidas por hidrólisis ácido,
tal como se describe en la Patente Europea 0 403 377, presentan una
actividad anticoagulante (S. Colliec y otros, Thromb. Res., 1991,
64, 143-154) y antitrombótica por vía intravenosa
(S. Mauray y otros, Thrombosis and Haemostasis, 1995, 74(5),
1280-1285) y por vía subcutánea (J. Millet y otros,
Trombosis and Haemostasis, 1999, 81, 391-395)
comparable a la de las heparinas de bajo peso molecular.
Igualmente se ha demostrado que estas mismas
fracciones de fucano son capaces de inhibir, igual que la heparina,
el crecimiento de las células musculares lisas vasculares en cultivo
(D. Logeart y otros, Eur. J. Cell. Biol., 1997, 74,
376-384 y 385-390). Los efectos
observados son reversibles, no están relacionados a una acción
citotóxica y dependen de la concentración del compuesto en el medio
de cultivo. Este efecto antiproliferante sobre el crecimiento de
las células musculares lisas parece específico, puesto que no se ha
observado en estas concentraciones, ninguna inhibición sobre el
crecimiento de líneas fibroblásticas, y que estos compuestos son
capaces de potencializar el crecimiento de células endoteliales en
cultivo (J. L. Giraux y otros, Eur. J. Cell. Biol., 1998, 77,
352-359).
Giraux y otros han demostrado en Thromb.
Haemost., 1998, 80, 692-695, que estas mismas
fracciones de fucano obtenidas por hidrólisis ácida, según el
protocolo descrito en la Patente Europea 0 403 377, inducen in
vitro la liberación de TFPI (Tissue Factor- Pathway Inhibitor)
por las células endoteliales de la vena del cordón umbilical
humano, efecto que podría contribuir a la acción antitrombótica de
estas fracciones de fucano.
Por otra parte, se ha demostrado en la solicitud
de Patente EP 0 846 129 que fragmentos de fucano, obtenidos por
despolimerización radical de un fucano de Pheophíceas en presencia
de un catalizador metálico y de peróxido de hidrógeno y que posee
una masa molar inferior o igual a 10.000 g/mol, conservan, in
vitro, las propiedades anticoagulantes del fucano en bruto.
Estos fragmentos de fucano, obtenidos por despolimerización radical
de un fucano de alto peso molecular, son distintos en cuanto su
estructura química, a los fragmentos de fucano obtenidos por
hidrólisis ácida de un fucano bruto, tal como se ha demostrado en la
solicitud de Patente EP 0 846 129.
Además de HNF, las HBPM y los fucanos, otros
agentes anticoagulantes han sido descritos a causa de su acción
antitrombótica (inhibición de la formación del trombo y/o de su
crecimiento): se trata especialmente de los héparinoides (mezcla de
glicosaminoglicanos de bajo peso molecular, por ejemplo Orgaran®
comercializado por Organon Inc.), antivitaminas K y las hirudinas.
Las hirudinas, por ejemplo Lepirudin (Refludan®) comercializado por
Behrinwerke AG - Hoechst Marion Roussel o la Desirudin (Revasc®)
comercializado por Novartis - Rhône Poulenc Rorer, pueden comportar
igualmente a la heparina no fraccionada, riesgo hemorrágico
importante.
En la trombosis arterial, son utilizables dos
tipos de compuestos o en el estudio (Samama M. M. y Desnoyer P.C.,
"Les bases pharmacologiques des traitements antithrombotiques -
Agents antithrombotiques actuels et futurs", 1995, Edition
Masson) (Bases farmacológicas de los tratamientos antitrombóticos -
Agentes antitrombóticos actuales y futuros, 1995, Edición Masson):
se trata de antiagregantes plaquetarios, por ejemplo ácido
acetilsalicílico, dipiridamol, ticlopidina, clopidogrel, el
anticuerpo GPIIb/IIIa, fibrinolíticos (estreptoquinasa, uroquinasa,
etc.), que disuelven el coágulo por activación del sistema
fibrinolítico y liberación de plasmina (enzima proteolítica capaz
de lisar con rapidez el coágulo de fibrina).
La utilización de estos compuestos debe ser
asociada frecuentemente a una intervención endoscópica para agrandar
el paso de la arteria que se ha estrechado, tal como una
angioplastia. No obstante, estos tratamientos no son
suficientemente eficaces a plazo medio, puesto que tiene lugar
frecuentemente una restenosis de las arterias desobstruidas de este
modo, y ello después de pocos meses después del tratamiento.
Por esta razón, parece que los agentes
antitrombóticos descritos anteriormente no permiten prevenir o
tratar de manera eficaz una trombosis arterial o una restenosis,
problema esencial después de una angioplastia. A continuación, de
una cirugía de este tipo el endotelio presenta una disfunción con
respecto al endotelio original. La agresión parietal inducida por
esta cirugía se puede traducir por un fenómeno de
descompartimentación: pérdida del endotelio y comunicaciones
directas entre el compartimiento sanguíneo y las células musculares
lisas. A esta agresión, la pared responde mediante un proceso que
asocia una emigración, una proliferación, una destrucción y una
secreción de matriz extracelular por las células musculares lisas en
posición íntima, seguido de un retorno del endotelio, lo que
contribuye a su regruesamiento, y por lo tanto, al estrechamiento
de la abertura. Este fenómeno de cicatrización parietal puede
participar en la patología en sí misma, tal como las estenosis
anastomóticas sobre las prótesis vasculares y las restenosis después
de dilatación endoluminal.
Teniendo en cuenta el estado actual de la
técnica, se observa la necesidad de un agente activo contra la
trombosis y las restenosis arteriales.
Los inventores se han propuesto por objetivo
conseguir un agente que puede ser utilizado para la obtención de un
medicamento activo contra la trombosis y las restenosis arteriales,
cuyo medicamento:
- -
- presenta actividad contra la trombosis vascular, en especial contra la trombosis venosa, y de manera especialmente ventajosa contra la trombosis arterial, y ello cuando es administrado por vía parenteral,
- -
- no presenta riesgo de hemorragia importante,
- -
- no presenta el riesgo potencial de contaminación viral relacionada con productos de origen animal,
- -
- permite obtener la prevención de la oclusión arterial dentro del marco de la prevención de la restenosis, en particular después de una angioplastia.
Los inventores han descubierto que de manera
inesperada estos objetivos son conseguidos por la utilización de un
polisacárido sulfatado susceptible de ser obtenido por
despolimerización radical de un fucano bruto procedente de
Pheophíceas, teniendo dicho polisacárido una masa molar inferior o
igual a 10.000 g/mol.
La presente invención tiene por objetivo la
utilización de un polisacárido sulfatado susceptible de ser obtenido
por despolimerización radical de un fucano bruto procedente de
Pheophíceas, teniendo dicho polisacárido una masa molar inferior o
igual a 10.000 g/mol, para la obtención de un medicamento destinado
a la prevención o al tratamiento de la trombosis vascular.
De manera especialmente ventajosa, la
utilización de un polisacárido sulfatado de este tipo, permite
obtener un efecto antitrombótico que no se ve acompañado de riesgo
de hemorragia importante.
Dicho polisacárido sulfatado es susceptible de
ser obtenido, tal como se describe en la solicitud de Patente EP 0
846 129. A título de ejemplo, el tipo de Pheophíceas del que procede
dicho polisacárido sulfatado es Ascophyllum nodosum, Fucus
vesiculosus, Pelvetia canaliculata o Undaria
pinnatifida.
De manera especialmente ventajosa, el origen
vegetal del polisacárido utilizado en la presente invención elimina
cualquier riesgo de contaminación viral del sujeto al que es
administrado.
Según una forma de realización ventajosa de la
utilización según la invención, dicho medicamento está destinado a
la prevención o al tratamiento de trombosis venosa.
Según otra forma de realización ventajosa de la
utilización según la invención, dicho medicamento está destinado a
la prevención o al tratamiento de la trombosis arterial, proceso en
el que la formación de trombos y depósitos plaquetarios juegan un
papel importante.
Según una disposición ventajosa de esta forma de
realización, dicho medicamento está destinado a la prevención de la
restenosis arterial, fenómeno precursor de una trombosis
arterial.
En efecto, dentro del marco de la prevención de
la trombosis arterial es particularmente ventajoso intentar
prevenir la restenosis arterial, patología que cuando se declara
puede conducir a la trombosis de la arteria.
El polisacárido sulfatado utilizado en la
presente invención, tiene preferentemente una masa molar inferior a
5.000 g/mol.
Según otra forma de realización ventajosa de la
presente invención, dicho medicamento está destinado a ser
administrado por vía parenteral, preferentemente por vía intravenosa
o subcutánea.
En el conejo, en un modelo de trombosis venosa
experimental, después de inyección por vía subcutánea, se observa
la misma actividad antitrombótica para dosis de HBPM y de
polisacárido sulfatado (polisacárido susceptible de ser obtenido
por despolimerización radical de un fucano bruto procedente de
Pheophíceas, tal como se ha indicado anteriormente) respectivamente
iguales a 1 mg/kg y 10 mg/kg, es decir, para una dosis de
polisacárido sulfatado 10 veces superior a la de una HBPM.
Si es posible la extrapolación en el hombre, las
dosis diarias de dicho medicamento están comprendidas
preferentemente entre 150 y 300 mg (administración de forma
preventiva) o entre 450 y 600 mg (administración de forma curativa)
por vía subcutánea; se comprenderá no obstante que los técnicos en
la materia adaptarán estas dosis en función de la edad, peso y
patología del paciente, especialmente del riesgo trombogénico.
En la forma de utilización relativa a la
prevención de la restenosis arterial, dicho medicamento está
destinado ventajosamente a su administración por vía local, por
ejemplo, por difusión endoparietal.
La difusión endoparietal consiste en la
administración local del compuesto farmacéutico, por ejemplo, por
medio de un pequeño globo. El paso repetido del globo en la
intervención quirúrgica de angioplastia, tiene por efecto suprimir
el endotelio y estresar las células musculares y la matriz
extracelular del media. Como respuesta a la desendotelialización se
reproducirá una agregación plaquetaria en el lugar de la lesión,
liberando localmente PDGF (Platelet Derived Growth Factor) (Factor
de Crecimiento Derivado de Plaquetas). Como respuesta al estrés del
medio, el FGF intracelular almacenado en la matriz, será liberado
nuevamente. Estos factores de crecimiento inducirán la activación,
la emigración y la proliferación de las células musculares
lisas.
La técnica de difusión endoparietal permite una
destribución tópica endovascular del principio activo presente en
dicha composición farmacéutica. Se pueden utilizar diferentes tipos
de globos, tales como catéteres con doble globo aislando una cámara
de perfusión o globos recubiertos de un gel o incluso catéteres no
oclusivos.
\newpage
Además de las disposiciones anteriores, la
invención comprende adicionalmente otras disposiciones que se
comprenderán ante la descripción siguiente, que se refiere a
ejemplos de medición de la actividad antitrombótica, del riesgo
hemorrágico y de efecto anticoagulante de polisacáridos sulfatados
obtenidos por despolimerización de un fucano de Pheophíceas, así
como al estudio de los efectos de estos polisacáridos sobre la
agregación plaquetaria.
Se debe comprender, no obstante, que estos
ejemplos se indican únicamente a título ilustrativo del objeto de
la invención no constituyendo limitación alguna de la misma.
Ejemplo
1
En este ejemplo y en los siguientes, salvo
indicación contraria, las referencias del fucano de bajo peso
molecular son las siguientes:
- -
- la heparina estándar no fraccionada (HNF) es una heparina TERHORMON TH/023 (150 UI/mg) facilitada por Terdobliate (Novara, Italia). Su masa molecular media es aproximadamente de 15.000 g/mol;
- -
- la heparina de bajo peso molecular (HBPM) es facilitada por Pharmacia (Francia) con la denominación Fragmine® (lote 94134, 2.500 UI anti-Xa/0,2 ml). Su masa molecular media es aproximadamente 5.000 g/mol.
Las concentraciones requeridas en HNF y HBPM se
obtienen por dilución con suero fisiológico.
El fucano de bajo peso molecular (FBPM)
utilizado es obtenido por despolimerización radical de un fucano de
Pheophíceas (Ascophyllum nodosum) de acuerdo con el
procedimiento descrito en la solicitud de Patente EP 0 846 129. El
protocolo de puesta en práctica es el siguiente:
25 litros de extracto acuoso de fucano, obtenido
según el protocolo descrito por Nishino y otros (Carbohydrate
Research, 1989, 186, 119-129) adaptado a la alga
Ascophyllum nodosum, se introducen en un reactor con una
capacidad de 45 litros dotado de un dispositivo de agitación que
gira a 100 revoluciones/minuto. La temperatura es llevada y
mantenida a 60ºC. 75 g de acetato de cobre (Fluka) son añadidos, es
decir, una concentración de 0,02 M de acetato de cobre. El pH es
ajustado a 7,5 con ayuda de 400 ml aproximadamente de sosa 2 N (NaOH
a 400 g/l, Panréac). Se añade entonces peróxido de hidrógeno a una
concentración de 10 a 13% con un caudal de 85 ml/minuto, durante 4
horas.
El medio reactivo es filtrado sobre filtros de
microfibras de vidrio, cuyo diámetro de los poros es de 2,6 \mum
(filtros Wathman con la referencia GF/D 1823-150),
con la finalidad de eliminar el precipitado de color verde formado
en la reacción de despolimerización. El cobre residual es retenido a
continuación por paso sobre una resina (Chelex® 20, Biorad): el
extracto despolimerizado es introducido con un caudal de 13 a 15
l/h, en una columna de cristal con una sección de 113 cm^{2}
conteniendo 5 litros de resina previamente pasivada. A la salida de
la columna, la solución de fucano despolimerizado es decolorada y
tiene un pH comprendido entre 10 y 11.
La resina utilizada es regenerada a continuación
según las condiciones operativas indicadas por el fabricante.
La solución de fucano despolimerizado obtenida
en lo anterior es sometida a ultrafiltración sobre un sistema
Pellicon® (Millipore) dotado de dos membranas de polisulfonas de 1
kDalton (Filtron). Se efectúa el seguimiento de la conductividad a
lo largo de este procedimiento, realizado con 10 volúmenes de agua
sometida a osmosis.
Después de concentración hasta el volumen final
de 4 a 5 litros, el producto es liofilizado. El rendimiento,
calculado sobre el liofilizado, es de 27%.
267 g de fucano despolimerizado obtenido en lo
anterior (fucano liofilizado) son disueltos en 3 l de agua sometida
a osmosis y la solución es homogeneizada. 10 ml de esta solución se
extraen para análisis de fucano antes de la etapa de reducción de
los monosacáridos terminales de las cadenas de polisacáridos.
Separadamente, se disuelven 202 g de borohidruro
de sodio en 3 l de agua. La solución de borohidruro es añadida a
continuación a la solución de fucano. La reacción es inmediata y muy
efervescente. Después de 2 horas la reacción es interrumpida por
adición de ácido acético 10 N (ácido acético glacial, Panréac) hasta
obtener un pH neutro. El volumen de ácido añadido es de 400 ml.
Después de neutralización, la solución es
filtrada sobre microfibras de vidrio (filtro Wathman de referencia
GF/D 1822-290) y se somete a una
ultrafiltración/diafiltración sobre un sistema Pellicon® (Millipore)
equipado de dos membranas polisulfonadas con umbral de corte de 1
kDalton (Filtron). El volumen inicial es de 9 l; la conductividad
inicial es de 16,5 mS y desciende a 3,5 mS al final de la
ultrafiltración/diafiltración. Después de una concentración hasta
7,5 l, el producto es filtrado sucesivamente sobre filtros de
diámetros de poros de 2,6 \mum (GF/D Wathman), a continuación 0,7
\mum (GF/F Wathman) y finalmente 0,2 \mum (filtros Wathman de
nitrato de celulosa, referencia 7182-09). El volumen
final a liofilizar es de 7,75 l. El rendimiento global de la
reducción es de 60%, siendo debido este reducido valor a las
numerosas manipulaciones realizadas en esta etapa.
El rendimiento total del procedimiento de
obtención de un fucano de bajo peso molecular (despolimerización y
reducción) es por consiguiente de 16,2%.
La etapa de reducción no modifica la actividad
anticoagulante y la composición química de fucano como se detallará
a continuación (ver tabla I).
La tabla I resume las características del
producto (fucano despolimerizado) antes y después de la etapa de
reducción, a saber su masa molar (Mc: masa molar cromatográfica
determinada en el máximo del pico), su índice de polidispersidad
(correspondiente a la relación M_{p}/M_{n}, siendo M_{p}: masa
molecular media en peso y M_{n}: masa molecular media en número),
su contenido en osas neutras (fucosa, galactosa, xilosa), en ácido
urónico, en sulfato (SO_{3}Na), así como la medida de la actividad
anticoagulante del producto por TCA (Temps de Céphaline Activée)
(Tiempo de Cefalina Activada), expresada en cantidad de producto
añadido a 1 ml de PPP (Plasma Pauvre en Plaquettes) (Plasma Pobre
en Plaquetas) necesario para doblar el tiempo de coagulación
testigo (39 segundos).
El contenido en osas neutras ha sido medido
según la técnica descrita por Mopper y otros (environ. Sci.
Technol., 1992, 26, nº1, 133-138). Los otros
parámetros han sido medidos, tal como se ha indicado en la solicitud
de Patente EP 0 846 129.
Resulta de la tabla I que el procedimiento de
reducción descrito en lo anterior, realizado después de la
despolimerización radical, permite obtener un fucano de bajo peso
molecular poco polidisperso, sin modificar globalmente su
composición química y sin desulfatarlo.
La trombosis venosa experimental es la de
Wessler y otros (1959) utilizando el factor X activado (FXa) como
agente hipercoagulante (Mauray y otros, Throm. Haemost., 1995, 74,
1280-5 y Millet y otros, Throm. Haemost., 1992, 67,
176-9).
Tal como se describe por Millet y otros (Throm.
Haemost., 1999, 81, 391-395), los productos son
administrados por vía subcutánea, habiéndose comprobado efecto de
dosis y cinética del efecto.
El FBPM presenta una actividad dependiente de
dosis que se manifiesta desde la dosis de 2,5 mg/kg, con una
reducción significativa y próxima a 35% en peso de los trombos. Esta
actividad es próxima a 100% para la dosis de 10 mg/kg.
Actividades de 50%, 80% y 90% han sido obtenidas
para dosis respectivas de Fragmine® de 80, 100 y 200 UI
anti-Xa/kg (Millet y otros, 1999, ibid).
El cálculo matemático, utilizando una regresión
logarítmica, permite la determinación de la dosis de FBPM necesaria
para disminuir de 80% (DE 80) el peso de los trombos testigo. De
este modo, el DE 80 del FBPM, por vía subcutánea, es de 7,4
(5,6-9,8) mg/kg.
Tal como se ha observado por Millet y otros,
1999 (ibid) sobre el fucano de bajo peso molecular obtenido
por hidrólisis ácida y tomando la Fragmine® como producto de
referencia, el FBPM muestra en los conejos, una cinética de la
actividad antitrombótica más precoz y más duradera.
\vskip1.000000\baselineskip
Los animales utilizados son conejos macho
neo-zelandeses homozigóticos de 2 a 2,5 kg de peso
medio. Después de estabulación de los animales durante 6 días en el
criadero, éstos son utilizados en periodo de ayuno.
Después de premedicación de los animales con
Imalgene®, éstos son anestesiados mediante una inyección intravenosa
de pentobarbital sódico a 1% en la vena marginal de la oreja. La
inyección se lleva a cabo lentamente con control del reflejo de la
pupila y de la respiración. Se inyectan aproximadamente de 4 a 5 ml
de pentobarbital a un conejo de 2 kg.
Se descubren una arteria carótida y una vena
yugular opuesta. Se coloca una derivación
arterio-venosa entre estos dos vasos. Esta
derivación se compone de 2 catéteres de polietileno (diámetro
exterior 1,9 mm) de 12,5 cm de longitud, estando conectados esos
dos catéteres entre sí mediante un tercer catéter de un diámetro
interior de 1,57 mm y de una longitud de 6 cm, en el interior del
cual está colocado un hilo de seda.
Los catéteres son siliconados (Sigmacote®,
Sigma). Se fija una anilla Doppler de 1,3 mm de diámetro alrededor
del catéter introducido en la carótida con la finalidad de apreciar
la variación de velocidad del flujo sanguíneo representativa de la
oclusión.
Un primer grupo de conejos, que servirá de
control, recibe suero fisiológico, otros tres grupos reciben
respectivamente una solución de HNF (1 mg/kg) y dos soluciones de
FBPM (1 mg/kg y 2 mg/kg). Las diversas soluciones y sus disolventes
(suero fisiológico) son administradas con un volumen de 1 ml/kg, por
inyección intravenosa en una vena marginal de la oreja (opuesta a
la que sirve para mantenerla anestesia del animal), 5 minutos antes
de la creación de la situación trombogénica.
\vskip1.000000\baselineskip
La tabla II resume los tiempos de oclusión (en
minutos) en función de las dosis de FBP y de HNF administradas por
inyección intravenosa. El símbolo *** indica el umbral significativo
de una probabilidad igual o inferior a 0,1% (p \leq 0,001 en la
prueba estadística de Student).
Aparece de estos resultados que el FBPM,
administrado por vía intravenosa en el modelo de Umetsu adaptado al
conejo, presenta una actividad antitrombótica arterial con dosis
próximas a las responsables de una actividad antitrombótica
venosa.
Se observa el doblamiento del tiempo de oclusión
5 minutos después de una administración por vía intravenosa de FBPM
con una dosis de 1 mg/kg (dosis próxima a la de DE 80 antitrombótica
venosa). La HNF administrada a la dosis de 1 mg/kg, en las mismas
condiciones, aumenta aproximadamente 4 veces el tiempo necesario
para la obtención de una obstrucción vascular total en los animales
testigo. Por otra parte, se debe observar que esta dosis
corresponde a 10 veces la DE 80 antitrombótica venosa de HNF.
Se procede igual que lo indicado anteriormente,
habiéndose administrado las diferentes soluciones y sus disolventes
(suero fisiológico) con un volumen de 1 ml/kg, por vía subcutánea, 2
horas antes de la creación de la situación trombogénica. Los
animales son repartidos en tres grupos: un primer grupo, que servirá
de control, recibe suero fisiológico, mientras que los otros grupos
reciben respectivamente soluciones de FBPM con una dosis de 7,5
mg/kg y HBPM con una dosis de 60 UI anti-Xa/kg.
La tabla III resume los tiempos de oclusión (en
minutos) en función de las dosis de FBPM y de HBPM administradas
por inyección subcutánea.
Aparece de los resultados indicados que para las
dosis de pruebas en administración subcutánea, el FBPM dobla los
tiempos de oclusión en animales testigo, mientras que el HBPM no
tiene ningún efecto.
Contrariamente a lo que se ha observado para el
HNF (en inyección intravenosa) y para el HBPM (inyección
subcutánea), la dosis de FBPM necesaria para doblar el tiempo de
oclusión arterial es muy próximo a la DE 80 antitrombótica venosa
(es decir, 7,4 mg/kg), con la diferencia de las heparinas, para las
que es necesario multiplicar por un factor próximo a 10 la dosis
antitrombótica venosa para obtener una dosis activa en trombosis
arterial.
Solamente se ha estudiado la administración por
vía intravenosa en este modelo.
Los animales utilizados son ratas macho Wistar
con peso variable entre 240 y 390 g. Después de estabulación de los
animales durante 6 días en criadero, éstos son utilizados en periodo
de ayuno.
Después de anestesia con carbonato de etilo al
15% (10 ml/kg; Prolabo, Paris, Francia), se ha expuesto una arteria
carótida, se han liberado cuidadosamente de los tejidos y de los
nervios que los rodean y se ha colocado un bloque de
"parafilm" bajo la carótida. Una sonda Doppler ha sido colocada
alrededor de la carótida (lado cefálico). La señal Doppler es
ajustada de manera que se tenga una reflexión máxima y se asimila a
un valor de 100%.
Después de un periodo de estabilización del
flujo sanguíneo, se coloca un disco de papel filtro Wathman (3 mm
de diámetro) sobre la carótida de forma distal con respecto a la
sonda. Dos microlitros de una solución de FeCl_{3} (Osi, Paris,
Francia) a 25% en ácido clorhídrico 1M son depositados sobre el
papel de filtro, que es colocado entonces en la vertical del
parafilm en contacto con la carótida al descubierto. Se ha puesto
en marcha un cronómetro. Después de 30 segundos de contacto del
papel de filtro, éste ha sido retirado. La formación del trombo es
seguida por análisis de la señal Doppler.
La evaluación de la trombosis, expresada en
minutos, consiste en medir el intervalo de tiempo que separa la
aplicación del FeCl_{3} del momento en el que la señal Doppler
vuelve a recuperar la línea de base, reduciendo de este modo una
oclusión total.
Los animales son repartidos en tres grupos
principales, recibiendo uno de ellos el suero fisiológico (grupo de
control), y recibiendo los otros respectivamente FBPM (con dosis
variables entre 1,25 a 10 mg/kg) y HNF (con dosis de 1,25 y 2,5
mg/kg). El suero fisiológico, así como las soluciones de FBPM y HNF,
son inyectadas por vía intravenosa, con un volumen de 1 ml/kg, 5
minutos antes de la inducción de la trombosis.
La tabla IV resume los tiempos de oclusión
arterial (en minutos), así como el factor de multiplicación del
tiempo de oclusión (calculado con relación al tiempo de oclusión
testigo), en función de las dosis de FBPM y HNF administradas por
vía intravenosa. Los símbolos *** y ** indican los umbrales de
carácter significativo de una probabilidad respectivamente igual o
inferior a 0,1% y 1% (respectivamente, p\leq0,001 y p\leq0,01 en
la prueba estadística de Student).
Tal como se observa en la tabla, el tiempo de
oclusión es de 20,5 minutos después de una inyección de HNF con una
dosis de 1,25 mg/kg y de 60 minutos cuando el HNF es administrado
con una dosis de 2,5 mg/kg, es decir más de 5 veces el tiempo
testigo.
En cuanto al FBPM, presenta una actividad
significativa dependiente de la dosis. Desde una dosis de 2,5 mg/kg,
la inyección de FBPM induce un retardo significativo del tiempo de
oclusión arterial, con el tiempo que aparece con un valor más del
doble con respecto al tiempo de los animales testigo.
Un cálculo matemático (regresión lineal) permite
deducir de los resultados anteriores las dosis de FBPM y de HNF
necesarias para doblar el tiempo de oclusión arterial, que son
próximas a 2 mg/kg para FBPM y de 1,25 mg/kg para HNF.
Ejemplo
2
En conejos, el riesgo hemorrágico de FBP y del
HBPM es evaluado por la medición del alargamiento de los tiempos de
hemorragia, según el modelo de Carter y otros modificado por
Doutreepuich y otros (Thromb. Res., 1979, 15,
581-586), después de administración de los productos
por vía subcutánea, 2 horas antes de la inducción de la hemorragia,
con dosis próximas a la de DE 80 antitrombótica venosa y de 5 veces
esta dosis.
El fucano de bajo peso molecular (FBPM) y los
animales utilizados son idénticos a los descritos en el ejemplo 1.
En el caso de la inyección a 1 x DE 80, la heparina de bajo peso
molecular (HBPM) es la Fragmine® tal como se describe en el ejemplo
1; en el caso de inyección a 5 x DE 80, se trata de Tinzaparine® (10
000 UI anti-Xa/0,5 ml; lote Q 6369B), facilitada
por la Société Innohep (Francia).
Con una dosis que permite doblar el tiempo
testigo de oclusión arterial, correspondiente a la de DE 80
antitrombótica venosa, el FBPM y el HBPM administrados por vía
subcutánea no tiene actividad hemorragipara. Se observa igualmente
que para esta dosis, y a diferencia del FBPM, el HBPM es inactivo en
los conejos en el modelo de trombosis arterial según el modelo de
Umetsu.
Con 5 veces esta dosis, ni el HBPM, ni el FBPM
inducen aumento significativo del tiempo de hemorragia.
\vskip1.000000\baselineskip
En ratones, el riesgo hemorrágico de FBPM, del
HNF y del HBPM es evaluado por la medición del alargamiento de los
tiempos de hemorragias, según el modelo de Dejana y otros (Throm.
Haemost., 1982, 48, 108-111). El FBPM, el HNF y los
animales utilizados son idénticos a los descritos en el ejemplo
1.
Los compuestos son administrados por vía
intravenosa con dosis de 5 y 10 mg/kg para el FBPM (dosis que
corresponden respectivamente a 2,5 veces y 5 veces la dosis que
dobla el tiempo de oclusión (TO) testigo (ver tabla IV), de 750 y 1
500 UI anti-Xa/kg para HBPM (Fragmine®) y de 1 mg/kg
para HNF, 5 minutos antes de la inducción de la hemorragia.
La tabla V resume, en porcentajes, la
prolongación de los tiempos de hemorragia obtenidos.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Resulta de esta tabla que a 2,5 veces la dosis
necesaria para doblar el tiempo de oclusión testigo, el FBPM
aumenta bien menos el tiempo de hemorragia que el HBPM. Para 5 veces
esta dosis, las prolongaciones de los tiempos de hemorragia son
similares para los productos.
Por lo tanto, en comparación con una HNF y una
HBPM; resulta de la tabla V que el FBPM presenta riesgo hemorrágico
moderado.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizan plasmas procedentes de:
- -
- conejos en los que ha sido inducida una trombosis venosa, según el método de Wessler;
- -
- ratas utilizadas en la experiencia de trombosis arterial, según el ejemplo 1, cuyas ratas han recibido, por vía intravenosa, dosis próximas a la necesaria para doblar el tiempo de oclusión testigo, es decir 2,5 mg/kg de FBPM o 1,25 mg/kg de HNF, o dosis dobles, es decir, 5 mg/kg HNF.
\vskip1.000000\baselineskip
La inyección de una solución salina fisiológica
sirve de control. El plasma de los animales es extraído justamente
después de la formación del saco venoso.
La medición del tiempo de cefalina activada (TCK
o TCA) es realizado de la forma siguiente:
- -
- para los plasmas extraídos en conejos, 100 \mul de plasma y 100 \mul de reactivo CKPrest (Stago, Asnières, Francia) se incuban durante 3 minutos a 37ºC, y después se añaden 100 \mul de CaCl_{2} para poner en marcha la coagulación. Se obtiene de esta manera una medición del TCK (Tiemo de Cefalina Kaolin);
- -
- para los plasmas extraídos en las ratas, el TCA es medido en el autómata ACL 3000 (Delhomme, Paris, Francia). 53 \mul de plasma y 53 \mul de cefalina activada por ácido elágico (facilitado por IL, Paris, Francia, con la referencia 97570-10) son puestos en contacto, después de incubación a 37ºC. La incubación es iniciada por la añadidura de 53 \mul de CaCl_{2}. El aumento de turbidez debido a la formación de coágulos fibrinosos es detectado por nefelometría.
La medición del tiempo de trombina (TT) se
efectúa del modo siguiente:
- -
- para los plasmas extraídos en conejos, se pone en presencia 100 \mul de trombina (trombina humana facilitada por Fibrindex Ortho Diagnostic Système, Roissy, France) con 200 \mul de plasma, después de incubación durante 2 minutos a 37ºC. La adición de la trombina al plasma dispara el proceso de formación del coágulo de fibrina;
- -
- para los plasmas extraídos en ratas, el TT es medido en el autómata ACL 3000 descrito anteriormente. El plasma y la trombina humana (referencia 0880, Stago, Asnières, Francia), después de incubación a 37ºC, son puestos en contacto volumen a volumen (75 \mul). La formación de un coágulo de fibrina aumenta la turbidez, que es detectada por nefelometría en el autómata de coagulación.
\vskip1.000000\baselineskip
\bulletEfecto anticoagulante en ratas
(administración de los compuestos por vía intravenosa)
En las ratas, la inyección intravenosa de FBPM
prolonga el TCA y el TT de manera significativa, pero de forma muy
inferior a lo que se observa con el HNF.
\bulletEfecto anticoagulante en
conejos (administración de los compuestos por vía
subcutánea)
Los resultados de los TCK obtenidos en conejos,
expresados en segundos, se resumen en la siguiente tabla VI. Los
símbolos * y ** indican los umbrales de significatividad de una
probabilidad respectivamente igual o inferior a 5% y 1%
(respectivamente, p \leq 0,05 y p \leq 0,01 en la prueba
estadística de Student).
Se desprende de la tabla VI que el HBPM
(Fragmine®), administrado a dosis comprendidas entre 50 a 200 UI
anti-Xa/kg, 2 horas antes de las extracciones de
sangre, no induce, excepto con una fuerte dosis (200 UI
anti-Xa/kg) una elevación significativa del TCK
(35,3% de aumento con respecto al grupo de control).
El TCK no sufre modificación significativa
alguna para la dosis de FBPM de 7,5 mg/kg, administrada por vía
subcutánea 2 horas antes de las extracciones sanguíneas. Con la
dosis de 10 mg/kg, se observa un aumento discreto pero
significativo (17% de aumento).
Los resultados de los TT obtenidos con los
conejos, expresados en segundos, se resumen en la siguiente tabla
VII. El símbolo ** indica el umbral de carácter significativo de una
probabilidad igual o inferior a 1% (p\leq0,01 en la prueba
estadística de Student).
\vskip1.000000\baselineskip
Se desprende de la tabla VII que el tiempo de
trombina medio (TT) no experimenta modificación significativa para
las dosis de FBPM comprobadas, administradas por vía subcutánea 2
horas antes de las extracciones sanguíneas. Se observa que la HBPM
(Fragmine®), a las dosis de la prueba, aumenta el TT.
Ejemplo
3
Los FBPM y el HNF son los descritos en el
ejemplo 1. El HBPM es Tizaparine®, de la firma Innohep.
Los FBPM y HBPM son inyectados, por vía
subcutánea, con dosis próximas a 5 x DE 80 (5 veces la dosis
necesaria para disminuir el 80% el peso medio de los trombos
testigo) determinada según el modelo de trombosis venosa, según
Wessler (DE 80 de la Tinzaparine® por inyección subcutánea: 80 UI
anti-Xa/kg). De este modo, los FBPM y HBPM son
inyectados, a las dosis respectivas de 37,5 mg/kg y de 400 UI
anti-Xa/kg. En cuanto al HNF, es administrado por
vía intravenosa a una dosis próxima a 10 x DE 80, es decir, a razón
de 1 mg/kg.
Trombina bovina en 100 U NIH (National Institute
of Health)/ml, (Sigma, referencia 4648), conservada a -70ºC, es
descongelada y diluida a 1/10 en suero fisiológico, y después es
conservada en hielo durante la experimentación. Se añaden a 300
\mul de PRP (Plasma Riche en Plaquettes) (Plasma Rico en
Plaquetas), obtenido por centrifugación de sangre de animales
durante 10 minutos a 400 g, y preincubados durante 1 minuto a 37ºC,
100 \mul de tampón PBS y una cantidad de trombina (cantidad
próxima a 8 \mul) necesaria para tener una concentración final
próxima a 0,2 U NIH/ml.
Una solución de ADP a 100 \mum (referencia
0494, Stago, Asnières, Francia), conservada a -20ºC, es
descongelada, diluida a 1/25 y 1/12,5 en tirode cálcico (NaCl 138,6
mM; KCl 2,8 mM; NaHCO_{3} 11,9 mM; MgCl_{2} 1,1 mM;
NaH_{2}PO_{4} 0,33 mM; glucosa 11,2 mM; CaCl_{2} 4 \muM;
Laboratoires FOURNIER) y puesta en hielo durante el tiempo de la
experimentación. Después de incubación a 300 \mul de PRP a 37ºC
durante 1 minuto, la agregación plaquetaria es iniciada por 100
\mul de una solución de ADP (concentración final de 1 y 2
\muM).
Los FBPM y HNF son inyectados por vía
intravenosa, 5 minutos antes de las extracciones sanguíneas, con
dosis respectivas de 2,5 y 5 mg/kg para el FBPM y de 1,25 y 2,5
mg/kg para el HNF.
Los protocolos de agregación plaquetaria son
similares a los descritos anteriormente, con las diferencias
siguientes para el protocolo de agregación a la trombina: el tampón
añadido al PRP es un tampón tirode recalcificado, y la
concentración final en trombina es de 0,6 U NIH/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
Los FBPM y HBPM (con una dosis de 5 x DE 80) y
el HNF (con una dosis de 10 X DE 80) inhiben a 100% la agregación
plaquetaria inducida por la trombina, pero no inhiben la agregación
plaquetaria inducida por 1 \muM y 2 \muM de ADP.
Los FBPM y HNF inhiben a 100% la agregación
plaquetaria inducida por la trombina.
Inversamente a lo que se ha indicado después de
la inyección de HNF (ausencia de inhibición o inhibición muy
reducida de la agregación plaquetaria), el FBPM, cualquiera que sea
la dosis inyectada, reduce de 35% a 45% la agregación plaquetaria
inducida por el ADP, sin que se pueda observar efecto.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
El tratamiento de las estenosis arteriales por
vía endovascular es una técnica practicada corrientemente. Consiste
en introducir en la arteria un pequeño globo que se hincha en la
posición de la estenosis (operación de angioplastia) con el
objetivo de restablecer un calibre vascular normal. La angioplastia
es seguida muy frecuentemente de la colocación de un stent que
permite, gracias a su fuerza de expansión radial, mantener el
calibre de la arteria. Esta técnica es utilizada frecuentemente en
los tratamientos de las estenosis ateromatosas coronarias, iliacas
o renales. El traumatismo parietal inducido por la angioplastia y la
colocación del stent es desgraciadamente responsable de la
restenosis del vaso en un 20 a 30% de los casos en el hombre. Esta
restenosis es debida en gran parte a la proliferación y emigración
de las células musculares lisas (CML) del media hacia la
íntima del vaso. La aparición de hiperplasia neointimal reduce el
calibre del stent, favorece la isquemia de la parte situada más
adelante según la corriente y es causa en el hombre de una morbidad
y una mortalidad no despreciables.
Se pueden utilizar fracciones de polisacárido
sulfatado susceptibles de ser obtenidas por despolimerización
radical de un fucano bruto procedente de pheophíceas, teniendo dicho
polisacárido una masa molar inferior o igual a 10 000 g/mol, de
acuerdo con la invención, para prevenir la restenosis arterial, tal
como se demuestra a continuación en un modelo de restenosis en
conejos en la arteria iliaca.
\vskip1.000000\baselineskip
Los animales son conejos New Zealand con un peso
medio de 3,5 a 4 kg. Son anestesiados con pentobarbital.
Se implantan en 5 conejos 10 stents iliacos. Un
stent es posicionado en cada arteria iliaca (zona carotídica). La
colocación de cada uno de los stents es precedida de 3 angioplastias
de 1 minuto a 10 atmósferas (atm). El stent es colocado bajo una
presión de 10 atmósferas durante 30 segundos.
Los animales son tratados a continuación durante
14 días con FBPM obtenido en el ejemplo 1, inyectado 2 veces al día
por vía intramuscular con una dosis de 10-mg/kg/24h.
El grupo testigo está constituido por 6 arterias con stents en 3
conejos.
Después de 14 días, los animales son
sacrificados. Se extrae la aorta abdominal baja y las arterias
iliacas, que son fijadas bajo presión (en formol) e incluidas en
metacrilato. Se efectúan a continuación cortes con microtomo con la
finalidad de realizar análisis histológicos e histomorfométricos, y
calcular la superficie de las arterias.
\vskip1.000000\baselineskip
Las mediciones de superficie realizadas
(íntima, media, relaciones íntima/media e
íntima/limitante elástica interna), reunidas en la tabla
VIII (en la que "n" representa el número de mediciones
efectuadas), indican una disminución de la hiperplasia en la íntima
en el grupo de animales tratados con FBPM. Esta disminución de la
hiperplasia en la íntima es muy importante (del orden de 60%).
Se debe observar igualmente que además de la
disminución de la superficie de la íntima y de las relaciones
íntima/media y de íntima/limitante elástica interna,
el fucano no tiene efecto sobre la superficie de la media,
lo que revela inhibición específica de la proliferación de las
CML.
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (12)
1. Utilización de un polisacárido sulfatado
susceptible de ser obtenido por despolimerización radical de un
fucano bruto procedente de Pheophíceas, teniendo dicho polisacárido
una masa molar inferior o igual a 10 000 g/mol, para la obtención
de un medicamento destinado a la prevención o al tratamiento de la
trombosis vascular.
2. Utilización, según la reivindicación 1,
caracterizada porque dicho medicamento está destinado a la
prevención o tratamiento de la trombosis venosa.
3. Utilización, según la reivindicación 1,
caracterizada porque dicho medicamento está destinado a la
prevención o tratamiento de la trombosis arterial.
4. Utilización, según la reivindicación 3, para
la prevención de la restenosis arterial.
5. Utilización, según una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque dicho
polisacárido sulfatado tiene una masa molar inferior a 5 000
g/mol.
6. Utilización, según una de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque dicho
medicamento está destinado a ser administrado por vía
parenteral.
7. Utilización, según la reivindicación 6,
caracterizada porque dicho medicamento está destinado a ser
administrado por vía intravenosa.
8. Utilización, según la reivindicación 6,
caracterizada porque dicho medicamento está destinado a ser
administrado por vía subcutánea.
9. Utilización, según la reivindicación 8,
caracterizada porque dicho medicamento está destinado a ser
administrado de forma preventiva.
10. Utilización, según la reivindicación 8,
caracterizada porque dicho medicamento está destinado a ser
administrado de forma curativa.
11. Utilización, según la reivindicación 4,
caracterizada porque dicho medicamento está destinado a ser
administrado por vía local.
12. Utilización, según la reivindicación 11,
caracterizada porque dicho medicamento está destinado a ser
administrado por difusión endoparietal.
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