ES2310197T3

ES2310197T3 - Metodo para la preparacion de moleculas de acido nucleico.

Info

Publication number: ES2310197T3
Application number: ES02023385T
Authority: ES
Inventors: Octavian Schatz; Timothy O'connell; Heinz Schwer; Thomas Waldmann
Original assignee: Sloning Biotechnology GmbH
Current assignee: Sloning Biotechnology GmbH
Priority date: 2002-10-18
Filing date: 2002-10-18
Publication date: 2009-01-01
Anticipated expiration: 2022-10-18
Also published as: US7695906B2; EP1411122A1; CA2502431C; US20060194202A1; ATE400650T1; AU2003278103A1; CA2502431A1; WO2004035781A1; EP1411122B1; DK1411122T3; DE60227525D1

Abstract

Un método para la fabricación de una molécula de ácido nucleico que comprende las etapas de a) proporcionar un primer oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario que tiene una modificación que permite al oligonucleótido acoplarse a una superficie, en el que el oligonucleótido comprende un sitio de reconocimiento de una primera enzima de restricción de tipo IIS que corta fuera de su sitio de reconocimiento, y dicho oligonucleótido comprende un saliente monocatenario, b) proporcionar un segundo oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario, en el que el oligonucleótido comprende un sitio de reconocimiento o una parte del mismo o una secuencia que es complementaria del mismo de una segunda enzima de restricción de tipo IIS que corta fuera de su sitio de reconocimiento, y dicho segundo oligonucleótido comprende un saliente monocatenario, c) ligar el primer y segundo oligonucleótidos mediante sus salientes, generando un primer producto de ligamiento, d) inmovilizar el primer producto de ligamiento en la superficie mediante la modificación, e) cortar el producto de ligamiento inmovilizado con la primera enzima de restricción de tipo IIS, liberando así un oligonucleótido alargado que tiene un saliente, f) combinar el oligonucleótido alargado con un oligonucleótido adicional al menos parcialmente bicatenario que tiene una modificación que permite al oligonucleótido acoplarse a una superficie, en el que el oligonucleótido adicional comprende un sitio de reconocimiento de una enzima de restricción de tipo IIS adicional que corta fuera de su sitio de reconocimiento, y dicho oligonucleótido comprende un saliente monocatenario, y ligar el segundo oligonucleótido alargado y el oligonucleótido adicional al menos parcialmente bicatenario mediante sus salientes, formando un producto de ligamiento adicional, g) inmovilizar el producto de ligamiento adicional en una superficie mediante la modificación, h) cortar el producto de ligamiento adicional con la enzima de restricción de tipo IIS adicional, liberando un oligonucleótido alargado que tiene un saliente, y i) opcionalmente, repetir las etapas f) a h).

Description

Método para la preparación de moléculas de ácido nucléico.

La presente invención se refiere a métodos para la fabricación de una molécula de ácido nucleico y a compuestos usados para ello.

Los ácidos nucleicos se usan de muchos modos diferentes en la biotecnología moderna. Aparte de moléculas de ácido nucleico comparativamente pequeñas tales como oligonucleótidos, se ponen a disposición moléculas de ácido nucleico de varias kilobases usando diferentes métodos de fabricación. Típicamente, para la síntesis del último tipo de moléculas de ácido nucleico, se usan una serie de oligonucleótidos sintéticos que tienen una longitud de 40 a 100 nucleótidos como módulos básicos y se unen conjuntamente. Estos bloques de construcción oligonucleotídicos comprenden una serie de productos de terminación así como secuencias defectivas, a pesar de tasas de acoplamiento comparativamente altas de aproximadamente 98 a 99% por etapa. Son especialmente problemáticos los productos n-1 (oligonucleótidos que contienen deleciones internas de un nucleótido), que aparecen como resultado de reacciones de formación de caperuza incompletas. Puesto que muchos oligonucleótidos tienen que ensamblarse para generar un gen completo, la probabilidad de crear un producto libre de errores es extremadamente baja para todos los procedimientos de síntesis conocidos. Dichos productos de síntesis defectivos son particularmente desventajosos si la molécula de ácido nucleico a sintetizar representa una secuencia de codificación y por tanto se generan productos de transcripción o traducción acortados debido a un desplazamiento de marco del marco abierto de lectura. Por lo tanto, es necesario purifi-
car los componentes oligonucleotídicos, ya que de otro modo la síntesis de genes complejos sería de hecho imposible.

En la técnica anterior, son conocidos métodos tales como el método denominado "de relleno de huecos", Según este método, se sintetizan una variedad de oligonucleótidos parcialmente superpuestos, se purifican y posteriormente hibridan en pares o en subgrupos. Después de la síntesis de las respectivas cadenas opuestas usando ADN polimerasa, se ligan los fragmentos individuales entre sí. El producto de ligamiento bicatenario generado de este modo puede clonarse como fragmentos parciales o hibridar con cebadores oligonucleotídicos terminales y amplificarse posteriormente en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Como alternativa, pueden hibridar oligonucleótidos complementarios entre sí y ligarse los fragmentos génicos así obtenidos mediante ligamiento enzimático o químico. Después de la purificación y/o clonación, pueden unirse entre sí estos fragmentos génicos. Ambos métodos son de uso limitado, ya que al aumentar la longitud de la molécula de ácido nucleico a sintetizar, aumenta la probabilidad de que se incorporen uno o varios oligonucleótidos con una secuencia incorrecta al producto final. Dichos errores se copian entonces por la ADN polimerasa. Además, pueden introducirse también errores de secuencia durante la reacción PCR.

La solicitud de patente internacional WO 99/47536 da a conocer un método de uso de síntesis en fase sólida para enlazar diferentes oligonucleótidos, de tal modo que se generan moléculas de ácido nucleico más largas. Más particularmente, el documento WO 99/47536 da a conocer un método en el que se ligan secuencialmente oligonucleótidos monocatenarios a una molécula iniciadora inmovilizada con una orientación definida. Es una desventaja de este método que se requiere un gran número de etapas individuales para la síntesis de genes grandes, dando como resultado un rendimiento reducido y un enriquecimiento en secuencias defectivas. También este método es difícil de automatizar, lo que es un prerrequisito para una síntesis rápida estandarizada.

La solicitud de patente internacional WO 00/75364 da a conocer una síntesis en fase sólida combinatoria de ácidos nucleicos que usa una colección de oligonucleótidos bicatenarios como bloques de construcción estandarizados. El uso de bloques de construcción estandarizados hace innecesario sintetizar un nuevo conjunto de oligonucleótidos para cada nueva síntesis. Estos oligonucleótidos de colección bicatenaria comparten generalmente una estructura global idéntica. En una versión preferida, contienen un bucle terminal, un tallo bicatenario y un saliente monocatenario corto. Hay dos clases diferentes de oligonucleótidos de colección, que se caracterizan por la presencia de diferentes sitios de reconocimiento de enzimas de restricción de tipo IIS en su secuencia y por la presencia o ausencia o el tipo de modificación interna. Los nucleótidos en el saliente y la región directamente adyacente forman la porción variable que contribuye realmente al ácido nucleico a sintetizar; la secuencia restante es generalmente idéntica en todos los oligonucleótidos que pertenecen a la misma clase.

Para construir un ácido nucleico bicatenario, se divide en primer lugar su secuencia en fragmentos menores (habitualmente de aproximadamente 20 pares de bases cada uno). Estos denominados bloques de alargamiento se sintetizan entonces en reacciones paralelas. En una de dichas reacciones, se ligan dos oligonucleótidos de colección bicatenarios, uno de cada clase, mediante apareamiento de salientes monocatenarios. Los productos de ligamiento de la misma se escinden posteriormente mediante la enzima de restricción de tipo IIS que es específica del oligonucleótido que dona nucleótidos. El efecto neto de dicho ciclo de ligamiento/restricción es la adición de un pequeño número de pares de bases, típicamente entre uno y cinco, a los oligonucleótidos de partida. Se repite entonces este procedimiento hasta que se completa la síntesis del bloque de alargamiento deseado.

En una segunda fase de reacción, la denominada transposición, se ligan por pares aquellos bloques de alargamiento que están adyacentes en el ácido nucleico a sintetizar después de haber escindido cada bloque con una enzima de restricción de tipo IIS diferente. Al repetir este procedimiento varias veces, la longitud del intermedio de transposición se duplica en cada etapa, mientras que el número de reacciones se divide a la mitad. Por tanto, puede generarse una molécula de ácido nucleico definida en muy pocos ciclos. La ventaja de este método reside en el ensamblaje combinatorio por pares de los fragmentos de la molécula de ácido nucleico a sintetizar, de manera independiente de secuencia. Por tanto, puede generarse cualquier bloque de alargamiento deseado a partir de una colección de ácido nucleico estandarizada con un número definido de elementos.

El número de elementos de dicha colección depende de la longitud de los salientes generados por la enzima de restricción de tipo IIS individual, así como del número de nucleótidos que se añaden a los oligonucleótidos en crecimiento en cada ciclo de alargamiento.

Aunque este método es adecuado para automatización, y como tal permite una síntesis apropiada de moléculas de ácido nucleico grandes, existe la necesidad en la técnica de mejorar este método para generar menos productos secundarios. Debido a una escisión incompleta con enzima de restricción de los intermedios ligados, pueden formarse productos secundarios a los que les falta uno o varios de los bloques nucleotídicos añadidos en cada etapa, que son capaces de ligarse en las reacciones de transposición posteriores. Dichos productos secundarios conducen a la formación de bloques de transposición incompletos y reducen el rendimiento del producto correcto.

Según la presente invención, se resuelve este problema en un primer aspecto mediante un método para la fabricación de una molécula de ácido nucleico que comprende las etapas de

a) proporcionar un primer oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario que tiene una modificación que permite al oligonucleótido acoplarse a una superficie, en el que el oligonucleótido comprende un sitio de reconocimiento de una primera enzima de restricción de tipo IIS que corta fuera de su sitio de reconocimiento, y dicho oligonucleótido comprende un saliente monocatenario fuera de su sitio de reconocimiento, y dicho segundo oligonucleótido comprende un saliente monocatenario,

c) ligar el primer y segundo oligonucleótidos mediante sus salientes, generando un primer producto de ligamiento,

d) inmovilizar el primer producto de ligamiento en la superficie mediante la modificación,

e) cortar el producto de ligamiento inmovilizado con la primera enzima de restricción de tipo IIS, liberando así un oligonucleótido alargado que tiene un saliente,

f) combinar el oligonucleótido alargado con un oligonucleótido adicional al menos parcialmente bicatenario que tiene una modificación que permite al oligonucleótido acoplarse a una superficie, en el que el oligonucleótido adicional comprende un sitio de reconocimiento de una enzima de restricción de tipo IIS adicional que corta fuera de su sitio de reconocimiento, y dicho oligonucleótido comprende un saliente monocatenario, y ligar el segundo oligonucleótido alargado y el oligonucleótido adicional al menos parcialmente bicatenario mediante sus salientes, formando un producto de ligamiento adicional,

g) inmovilizar el producto de ligamiento adicional en una superficie mediante la modificación,

h) cortar el producto de ligamiento adicional con la enzima de restricción de tipo IIS adicional, liberando un oligonucleótido alargado que tiene un saliente, y

i) opcionalmente, repetir las etapas f) a h).

Según la presente invención, se resuelve este problema en un segundo aspecto mediante un método para la fabricación de una molécula de ácido nucleico que comprende las etapas de

a) proporcionar un primer oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario que tiene una modificación que permite al oligonucleótido acoplarse a una superficie, en el que el oligonucleótido comprende un sitio de reconocimiento de una primera enzima de restricción de tipo IIS que corta fuera de su sitio de reconocimiento, y dicho oligonucleótido comprende un saliente monocatenario,

b) proporcionar un segundo oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario, en el que el oligonucleótido comprende un sitio de reconocimiento o una parte del mismo o una secuencia que es complementaria del mismo de una segunda enzima de restricción de tipo IIS que corta fuera de su sitio de reconocimiento, y dicho segundo oligonucleótido comprende un saliente monocatenario,

d) cortar el producto de ligamiento con la primera enzima de restricción de tipo IIS, generando así un oligonucleótido alargado que tiene un saliente y un primer oligonucleótido acortado,

e) inmovilizar el primer oligonucleótido acortado sobre una superficie mediante la modificación,

f) proporcionar un oligonucleótido adicional al menos parcialmente bicatenario que tiene una modificación que permite al oligonucleótido adicional acoplarse a una superficie, en el que el oligonucleótido adicional comprende un sitio de reconocimiento de una enzima de restricción de tipo IIS adicional que corta fuera de su sitio de reconocimiento, y dicho oligonucleótido comprende un saliente monocatenario.

g) combinar el oligonucleótido alargado con el oligonucleótido adicional y ligar el oligonucleótido alargado y el oligonucleótido adicional mediante sus salientes, formando un producto de ligamiento adicional,

h) cortar el producto de ligamiento adicional con la enzima de restricción de tipo IIS adicional, generando un oligonucleótido alargado que tiene un saliente y un oligonucleótido adicional acortado, y

i) opcionalmente, repetir las etapas e) a h).

En una realización de los métodos según la presente invención, el saliente es un saliente 5' o un saliente 3'.

En una realización adicional de los métodos según la presente invención, el saliente se selecciona del grupo que comprende un saliente de un nucleótido, un saliente de dos nucleótidos, un saliente de tres nucleótidos, un saliente de cuatro nucleótidos, un saliente de cinco nucleótidos, un saliente de seis nucleótidos y un saliente de siete nucleótidos.

En una realización adicional más de los métodos según la presente invención, se transfiere el oligonucleótido alargado a un nuevo recipiente de reacción donde se combina con el oligonucleótido adicional.

En una realización preferida de los métodos según la presente invención, el oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario comprende una región constante y una región variable, en el que la región constante contiene un sitio de reconocimiento de una enzima de restricción de tipo IIS, y la región variable contiene una secuencia de ácido nucleico que corresponde a una parte de la secuencia de ácido nucleico de la molécula de ácido nucleico a fabricar.

Según la presente invención, se resuelve este problema en un tercer aspecto mediante un método para la síntesis de una molécula de ácido nucleico que comprende las siguientes etapas:

a) proporcionar un primer oligonucleótido alargado ligado

i): proporcionando un primer oligonucleótido alargado, en el que el primer oligonucleótido alargado es preferiblemente el oligonucleótido alargado según el método del primer y/o segundo aspectos de la presente invención;

ii): proporcionado un segundo oligonucleótido alargado, en el que el segundo oligonucleótido alargado se genera preferiblemente partiendo del producto de ligamiento adicional según el método de cualquiera del primer y/o segundo aspectos de la presente invención, cortando el producto de ligamiento adicional con la segunda enzima de restricción de tipo IIS;

iii): ligando el primer y segundo oligonucleótidos alargados, en el que el primer y segundo oligonucleótidos alargados se ligan en disolución y se inmovilizan posteriormente en una superficie mediante la modificación, o el segundo oligonucleótido alargado se inmoviliza en una superficie mediante la modificación y posteriormente el primer oligonucleótido alargado se liga al mismo, generando en ambos casos un primer oligonucleótido alargado ligado,

b) proporcionar un segundo oligonucleótido alargado ligado,

i): proporcionando un tercer oligonucleótido alargado, en el que el tercer oligonucleótido alargado es el oligonucleótido alargado según el método del primer y/o segundo aspectos de la presente invención;

ii): proporcionando un cuarto oligonucleótido alargado, en el que el cuarto oligonucleótido alargado se genera partiendo del producto de ligamiento adicional según el método del primer y/o segundo aspectos de la presente invención, cortando el producto de ligamiento adicional con la segunda enzima de restricción de tipo IIS:

iii): ligando el tercer y cuarto oligonucleótidos alargados, en el que el tercer y cuarto oligonucleótidos alargados se ligan en disolución y posteriormente se inmovilizan en una superficie mediante la modificación, o el cuarto oligonucleótido alargado se inmoviliza en una superficie mediante la modificación y posteriormente el tercer oligonucleótido alargado se liga al mismo, generando en ambos casos un segundo oligonucleótido alargado ligado,

c) cortar el primer oligonucleótido alargado ligado con una enzima de restricción de tipo IIS, en el que la enzima de restricción es la primera enzima de restricción de tipo IIS, generando un primer oligonucleótido alargado ligado cortado;

d) cortar el segundo oligonucleótido alargado ligado con una enzima de restricción de tipo IIS, en el que la enzima de restricción es la segunda enzima de restricción de tipo IIS, generando un segundo oligonucleótido alargado ligado cortado;

e) combinar y ligar el primer oligonucleótido alargado ligado cortado y el segundo oligonucleótido alargado ligado cortado;

f) opcionalmente, repetir las etapas a) a e), en el que el producto de ligamiento de la etapa e) se usa como primer oligonucleótido alargado ligado y/o como segundo oligonucleótido alargado ligado.

El método de la invención para la fabricación de una molécula de ácido nucleico que comprende las etapas de

b) proporcionar un segundo oligonucleótido parcialmente bicatenario, en el que el oligonucleótido comprende un sitio de reconocimiento o una parte del mismo o una secuencia que es complementaria del mismo de una segunda enzima de restricción de tipo IIS que corta fuera de su sitio de reconocimiento, y dicho segundo oligonucleótido comprende un saliente monocatenario,

i) opcionalmente, repetir las etapas f) a h),

se designa también en la presente memoria como síntesis en fase sólida inversa (RSPS).

Como puede deducirse de la secuencia de etapas del método de RSPS, los oligonucleótidos primero y adicional actúan como moléculas donantes, mientras que el segundo oligonucleótido y el oligonucleótido alargado actúan como moléculas aceptoras. Ha de entenderse que el oligonucleótido alargado es funcionalmente igual que el segundo oligonucleótido en la segunda ronda o ciclo del método. De hecho, el oligonucleótido alargado comprende el segundo oligonucleótido y aquellos nucleótidos transferidos al mismo a partir del primer oligonucleótido y el oligonucleótido adicional, respectivamente, en rondas o ciclos posteriores del método.

Es una característica del método de RSPS de la invención que el oligonucleótido alargado se transfiera desde la reacción, preferiblemente desde el recipiente de reacción en el que se generó, a una reacción diferente, preferiblemente a un recipiente de reacción diferente, dejando los otros productos de reacción que podrían interferir con las reacciones posteriores en el recipiente de reacción anterior. Esto puede conseguirse al tener los oligonucleótidos primero y adicional una modificación que permite la inmovilización en una superficie tal como la superficie de un recipiente de reacción, por ejemplo, el pocillo de una placa de pocillos múltiples. Esta modificación permite una inmovilización específica del oligonucleótido en lugar de una inmovilización mediante los nucleótidos o grupos reactivos del mismo que forman el oligonucleótido. Una vez se escinden los productos de ligamiento del ligamiento del primer y segundo oligonucleótidos, y del oligonucleótido adicional y el oligonucleótido alargado, respectivamente, con la enzima de restricción de tipo IIS cuyo sitio de reconocimiento está contenido en los oligonucleótidos primero y adicional al menos parcialmente bicatenarios, respectivamente, se liberan los oligonucleótidos alargados mientras que los oligonucleótidos primero acortado y adicional acortado permanecen inmovilizados sobre la superficie. Los oligonucleótidos primero acortado y adicional acortado corresponden a los oligonucleótidos primero y adicional, respectivamente, excepto porque carecen de parte de los oligonucleótidos respectivos que se extendían más allá del sitio de escisión de las enzimas de restricción de tipo IIS primera y adicional antes de la escisión. Además de los oligonucleótidos primero acortado y adicional acortado, también los productos de ligamiento no escindidos, primeros oligonucleótidos no ligados y oligonucleótidos adicionales no ligados permanecen inmovilizados y por tanto retenidos en la reacción anterior, y más particularmente en el recipiente de reacción anterior.

Como se usa en cualquiera de los métodos según la presente invención, los oligonucleótidos que exhiben un saliente monocatenario se ligan con otros oligonucleótidos que tienen un saliente basándose en la complementariedad de bases. Preferiblemente, la complementariedad de bases de completa, concretamente, cualquiera de los pares de bases tiene apareamientos de bases perfectos según las normas de apareamiento de bases de Watson y Crack. Sin embargo, está también dentro de la presente invención que los salientes monocatenarios hibridados de los dos oligonucleótidos respectivos contengan al menos un par de bases con apareamiento erróneo. El número de apareamientos erróneos admisible depende de las condiciones de reacción tales como la concentración salina y la temperatura, y puede determinarse mediante ensayo rutinario de un experto en la técnica.

En un aspecto adicional, se proporciona un derivado del método de RSPS anteriormente mencionado. Dicho método para la fabricación de una molécula de ácido nucleico comprende las etapas de

a) proporcionar un primer oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario que comprende una modificación que permite al oligonucleótido acoplarse a una superficie, en el que el oligonucleótido comprende un sitio de reconocimiento de una primera enzima de restricción de tipo IIS que corta fuera de su sitio de reconocimiento, y dicho oligonucleótido comprende un saliente monocatenario,

b) inmovilizar el primer oligonucleótido en la superficie mediante la modificación,

c) proporcionar un segundo oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario, en el que el oligonucleótido comprende un sitio de reconocimiento o una parte del mismo de una segunda enzima de restricción de tipo IIS que corta fuera de su sitio de reconocimiento, y dicho segundo oligonucleótido comprende un saliente monocatenario que es preferiblemente complementario del saliente monocatenario del primer oligonucleótido,

d) ligar el primer y segundo oligonucleótidos mediante sus salientes, generando un primer producto de ligamiento,

h) proporcionar un oligonucleótido adicional al menos parcialmente bicatenario que comprende una modificación que permite al oligonucleótido acoplarse específicamente a una superficie, en el que el oligonucleótido contiene un sitio de reconocimiento de una enzima de restricción de tipo IIS primera o adicional y un saliente monocatenario que preferiblemente es complementario del saliente del oligonucleótido alargado,

i) inmovilizar el oligonucleótido adicional al menos parcialmente bicatenario sobre una superficie mediante su modificación,

h) combinar el oligonucleótido alargado con el oligonucleótido adicional inmovilizado, y ligarlos mediante sus salientes formando un producto de ligamiento adicional,

i) cortar el producto de ligamiento adicional resultante con la enzima de restricción de tipo IIS adicional, liberando un oligonucleótido alargado que tiene un saliente, y

j) opcionalmente, repetir las etapas f) a i).

Es una ventaja particular de ambas variantes de este método en comparación con el método publicado en el documento WO 00/75364 la retirada casi completa de productos secundarios que surgen como consecuencia de escisiones incompletas. En el procedimiento anteriormente citado, estos intermedios acortados compiten por el ligamiento con los bloques de alargamiento correctos en las transposiciones posteriores, en las que los pares de bloques de alargamiento se ensamblan en varias etapas para generar el ácido nucleico a fabricar. La variante de RSPS tiene la ventaja adicional de que es posible un cambio de tampón entre la etapa de unión y ligamiento, lo que permite que la reacción de ligamiento tenga lugar en condiciones de tamponación óptimas. A pesar de que se observa una eficacia de ligamiento reducida con sustratos inmovilizados, el rendimiento global del intermedio alargado después de un ciclo es mayor con la variante de RSPS. Esto es probablemente debido al hecho de que los productos de ligamiento formados están ya unidos a la fase sólida y no tienen que competir con los abundantes oligonucleótidos primeros y adicionales para unión a la superficie. Ya que el rendimiento del producto intermedio se reduce en cada ciclo (debido a que ambas reacciones de ligamiento y restricción prácticamente nunca alcanzan la terminación), los oligonucleótidos adicionales entrantes están en exceso, obstaculizando así la unión de los productos de ligamiento. Además, puesto que los oligonucleótidos primero y adicional son menores que los productos de ligamiento, se favorece su unión a la superficie. En la segunda y posteriores etapas, puede reducirse simplemente la concentración de los oligonucleótidos adicionales entrantes de modo que la capacidad de unión de la fase sólida supere la cantidad de oligonucleótidos modificados disponibles. Sin embargo, esto no es factible en el primer ciclo, porque se quiere operar en los límites de la capacidad de unión para maximizar el rendimiento de las reacciones.

En una subvariante del procedimiento de RSPS anteriormente descrito, se lleva a cabo el ligamiento de los oligonucleótidos primero y adicional con el oligonucleótido segundo o alargado después de la inmovilización del oligonucleótido primero y adicional, concretamente, invirtiendo el orden de las etapas c) y d). Aunque la eficacia de ligamiento de los sustratos inmovilizados es menor que en disolución, los productos de ligamiento no tienen que competir con los oligonucleótidos primero o adicional abundantes por la unión a la superficie.

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El método de la invención adicional para la fabricación de una molécula de ácido nucleico que comprende las etapas de

f) proporcionar un oligonucleótido adicional al menos parcialmente bicatenario que tiene una modificación que permite al oligonucleótido adicional acoplarse a una superficie, en el que el oligonucleótido adicional comprende un sitio de reconocimiento de una enzima de restricción de tipo IIS adicional que corta fuera de su sitio de reconocimiento, y dicho oligonucleótido comprende un saliente monocatenario,

i) opcionalmente, repetir las etapas e) a h)

se designa también en la presente memoria como el método de RLPS. Como puede deducirse de la secuencia de etapas del método de RLPS, este método es muy similar al método de RSPS dado a conocer en la presente memoria. De nuevo, se transfiere el oligonucleótido alargado, preferiblemente desde la primera reacción a una segunda reacción, concretamente posterior, en la que aún más preferiblemente la segunda reacción se lleva a cabo en un recipiente de reacción que es diferente del recipiente de reacción donde se llevó a cabo la primera reacción. La diferencia entre el método de RLPS y de RSPS reside en cambiar el orden de ligamiento, escisión con la enzima de restricción de tipo IIS e inmovilización. Según el método de RLPS, se somete el producto de ligamiento a escisión con la enzima de restricción de tipo IIS cuyo sitio de reconocimiento está contenido en los oligonucleótidos primero y adicional al menos parcialmente bicatenarios inmediatamente después del ligamiento y antes de la etapa de inmovilización. Esto significa que la enzima de restricción de tipo IIS escinde los productos de ligamento no inmovilizados de los oligonucleótidos primero y segundo al menos parcialmente bicatenarios y oligonucleótidos adicional y alargado, respectivamente, y que se inmovilizan el primer oligonucleótido acortado y los oligonucleótidos adicionales acortados. Además de los últimos oligonucleótidos, se retiran o apartan de reacciones posteriores cualquiera de los otros productos secundarios de la secuencia de etapas descrita con relación al método de RSPS.

Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que la secuencia particular de etapas de reacción del método de RSPS y de RLPS da como resultado la reducción de la variedad y número de subproductos indeseados, aumentando así la eficacia del método de la invención para la síntesis de la molécula de ácido nucleico a fabricar. Esta secuencia particular está en contraposición con el método por lo demás muy similar en muchos aspectos para la fabricación de moléculas de ácido nucleico descrito en el documento WO 00/75368, que es conocido y se designa en la presente memoria como el método de Sloning. Según el método de Sloning original, el oligonucleótido alargado permanece inmovilizado en una superficie, y los oligonucleótidos donantes se añaden a la fase líquida de la reacción.

La razón de este rendimiento mejorado es que el ligamento entre el primer y segundo oligonucleótidos y el oligonucleótido adicional y el oligonucleótido alargado en rondas posteriores de los métodos de la invención muestra un mayor rendimiento cuando ambos oligonucleótidos se mantienen en disolución en lugar de unirse uno de ellos a una superficie. Adicionalmente, la cinética de reacción puede controlarse mejor ya que la molaridad de los compuestos de reacción cambiaría en etapas posteriores por la transferencia de los subproductos descritos anteriormente. Típicamente, el oligonucleótido que proporciona una parte de la molécula de ácido nucleico a fabricar mediante el método de la invención, los oligonucleótidos donantes, concretamente, el primer oligonucleótido y los oligonucleótidos adicionales, están presentes en un nuevo recipiente de reacción tal como un pocillo de una placa de pocillos múltiples. La razón para ello es que, al hacer esto, ni el producto de ligamiento no escindido ni el oligonucleótido donante no escindido que permanecen inmovilizados mediante su modificación en una superficie se transfieren a una nueva reacción de ligamiento. Esto daría como resultado por otro lado falsos productos de ligamiento. Sin embargo, el ligamiento debería aparecer sólo entre el oligonucleótido alargado y el oligonucleótido adicional al menos parcialmente bicatenario, que sirve de nuevo como molécula donante y proporciona una parte adicional de la molécula de ácido nucleico a fabricar. Además, la etapa de inmovilización permite que se retiren todos los componentes de la reacción que pueden ser problemáticos en etapas posteriores.

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Colecciones para diferentes procedimientos de alargamiento

Es esencial para la presente invención que se usen al menos dos tipos de enzimas de restricción de tipo IIS diferentes. Básicamente, los métodos de la invención funcionan con cualquier tipo de enzima de restricción de tipo IIS. Preferiblemente, se usan aquellas enzimas de restricción de tipo IIS que proporcionan un saliente de tres nucleótidos de longitud en el extremo 5' tales como SapI, Eam1104I y los isoesquizómeros respectivos EarI, Ksp632I, o aquellas enzimas de restricción de tipo IIS que proporcionan un saliente de un nucleótido en el extremo 3' tales como BfiI, BmrI, BfuI, BciVI, BspPI, AclWI, AIwI, PleI, MlyI y PpsI.

Los oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios como se usan en los métodos de la invención tienen preferiblemente un diseño básico común. Esto significa que pueden generarse colecciones de bloques de construcción estandarizados que representan los oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios como se usan con respecto a los métodos de la invención. Los miembros de las colecciones difieren entre sí sólo en aquellos nucleótidos terminales que forman parte de la molécula de ácido nucleico a fabricar usando los métodos de la invención y los oligonucleótidos respectivos. Las colecciones de oligonucleótidos consisten habitualmente en una fila consecutiva de nucleótidos que pueden replegarse sobre sí mismos formando una cadena bicatenaria con un bucle interno. Como alternativa, pueden consistir en dos cadenas, a saber, una cadena superior y una inferior, que hibridan pero no se ligan de otro modo entre sí. En el último caso, la cadena superior tiene un nucleótido 5' terminal bloqueado, mientras que la cadena inferior tiene un nucleótido 3' terminal bloqueado. La cadena superior y la cadena inferior son al menos parcialmente complementarias entre sí y forman una estructura al menos parcialmente bicatenaria o dúplex. El extremo 3' de la cadena superior o el extremo 5' de la cadena inferior sobresalen respecto al extremo 5' de la cadena inferior o el extremo 3' de la cadena superior. La primera alternativa se designa también en la presente memoria como saliente 3', y la segunda alternativa se designa también en la presente memoria como saliente 5'. La longitud del saliente puede ser tan baja como de un nucleótido. La longitud del saliente puede ser por tanto de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más nucleótidos. Cualquier referencia al extremo 5' y al extremo 3', respectivamente, se hace suponiendo que tanto la notación de secuencia como la dirección de síntesis son del lado izquierdo al lado derecho.

El oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario puede estar formado mediante el plegamiento de una cadena sencilla autocomplementaria, generando un bucle que conecta la cadena superior y la cadena inferior del dúplex (un oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario unipartito) o asociando la cadena superior e inferior (un oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario bipartito). El diseño del oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario debería ser tal que satisfaga preferiblemente los dos siguientes requisitos. En primer lugar, la temperatura de fusión de la región bicatenaria debe ser suficientemente alta para evitar una desnaturalización de la estructura bicatenaria en las condiciones verificadas en la síntesis o el procedimiento de fabricación. En segundo lugar, el oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario tiene que tener una orientación que permita un ligamiento definido con otras moléculas oligonucleotídicas que tengan un saliente complementario en las mismas. Dicha orientación se crea bloqueando el extremo del oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario que es diferente del extremo definido por el extremo 3' sobresaliente de la cadena superior y el extremo 5' sobresaliente de la cadena inferior, respectivamente. En consecuencia, el extremo a bloquear se define por el extremo 5' de la cadena superior y el extremo 3' de la cadena inferior. Dicho bloqueo puede verificarse mediante la estructura de bucle o cualquier otra modificación adecuada conocida por el experto en la técnica. Las modificaciones adecuadas posibles pueden ser el resultado de la incorporación de compuestos de bajo peso molecular al oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario, en el que pueden usarse preferiblemente biotina, digoxigenina, tiocianato de fluoresceína (FITC), compuestos amino o ésteres de succinilo. Pueden tomarse ejemplos de oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios tanto unipartitos como bipartitos del documento WO 00/75368. Si no se menciona lo contrario, el término oligonucleótido como se usa en la presente memoria puede significar también oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario.

Además, los oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios comprenden un sitio de reconocimiento y un sitio de escisión de una enzima de restricción de tipo IIS. Las enzimas de restricción de tipo IIS se caracterizan por el hecho de que interaccionan con dos sitios discretos de un ADN bicatenario. Uno de dichos sitios es el sitio de reconocimiento de dicha enzima de restricción, que tiene típicamente una longitud de 4 a 7 pares de bases. El otro sitio es el sitio de escisión, que está apartado típicamente de 1 a 20 pares de bases del sitio de reconocimiento. Los sitios de reconocimiento de las enzimas de restricción son completa o parcialmente asimétricos. Como se usan en la presente memoria, los oligonucleótidos bicatenarios comprenden el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción de tipo IIS, que puede ser completa o parcialmente parte de la parte monocatenaria o de la parte bicatenaria del oligonucleótido. Para permitir un funcionamiento apropiado del método según la presente invención, la enzima de restricción de tipo IIS cuyo sitio de reconocimiento está contenido en el oligonucleótido primero y adicional al menos parcialmente bicatenarios, respectivamente y que se designa también en la presente memoria como la enzima de restricción de tipo IIS primera y adicional, respectivamente, y la enzima de restricción de tipo IIS cuyo sitio de reconocimiento está contenido en el segundo oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario y que se designa también en la presente memoria como segunda enzima de restricción de tipo IIS, deben ser diferentes. Lo mismo se aplica a la segunda enzima de restricción y a la enzima de restricción adicional.

La siguiente tabla proporciona algunas combinaciones posibles de secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción de tipo IIS.

1

Son combinaciones preferidas de primera enzima de restricción de tipo IIS (y adicional) y segunda para usar con respecto a la presente invención Eco31I/Esp3I (37ºC), BsaI/BsmBI (50ºC), BsmBI/BsaI (55ºC), BbsI/BspMI (37ºC), BspMI/BbsI (37ºC) BsrDI/BtsI (65ºC), BtsI/BsrDI (37ºC), BciVI/BmrI (37ºC), AarI/AceIII (37ºC), EciI/BseRI (37ºC) y BmrI/BciVI (37ºC). Las temperaturas entre paréntesis indican las temperaturas de incubación usadas para cada uno de los pares. Los isoesquizómeros de estas enzimas (BsaI: Bso31, Eco31I; BsmBI: Esp3I; BbsI: BpiI, BpuAI; BspMI: Acc36I; BsrDI:Bse3DI, BseMI; BmrI:BfiI) son alternativas potenciales.

Diseño de colecciones de oligonucleótidos

Además de los rasgos anteriormente mencionados, el primer y segundo oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios pueden comprender una modificación que permite el acoplamiento, unión o inmovilización del oligonucleótido respectivo a una superficie o matriz, en la que todos los términos se usan intercambiablemente. La inmovilización puede ser covalente o no covalente. La modificación puede ser terminal o no terminal, lo que significa que puede estar localizada en un nucleótido no terminal del fragmento de ADN bicatenario o en el nucleótido terminal del oligonucleótido. Se verifica preferiblemente la última modificación una vez que el oligonucleótido no exhibe la estructura de bucle sino que tiene la estructura bipartita anteriormente descrita. En dicha realización, la modificación se une preferiblemente al extremo 5' de la cadena superior o al extremo 3' de la cadena inferior. Dichas modificaciones comprender, entre otros, pero sin limitación, biotina, iminobiotina, digoxigenina, grupos sulfhidrilo, diciclohexilcarbodiimida, fluoresceína, acridina y rodamina. El oligonucleótido puede estar acoplado a una superficie, preferiblemente una matriz tal como la pared interna de una placa de pocillos múltiples, mediante avidina tal como estreptavidina, avidina monomérica, avidina modificada con tirosina o anticuerpos, particularmente aquellos anticuerpos dirigidos contra cualquiera de los compuestos anteriormente mencionados, grupos sulfhidrilo o cualquier otro compuesto adecuado capaz de unión específica de un ligando que pueda unirse a un oligonucleótido durante su síntesis o después de la síntesis.

En una realización preferida de los métodos de la invención, aparte de los oligonucleótidos primero y adicional al menos parcialmente bicatenarios, también el segundo oligonucleótido, y en consecuencia también el oligonucleótido alargado, comprenden este tipo de modificación. Sin embargo, dado el descubrimiento subyacente de los métodos de la invención, la modificación incorporada por el segundo oligonucleótido se selecciona de tal modo que, durante las etapas a) a i) de los métodos de la invención, el segundo oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario y cualquier oligonucleótido alargado que comprenda dicho segundo oligonucleótido no puedan ponerse en contacto con una reacción ni estar contenidos en un recipiente de reacción cuya superficie permita la inmovilización mediante la modificación. Según esto, la superficie no debería comprender un grupo o compuesto reactivo que permita o medie la unión del oligonucleótido a la superficie, particularmente no mediante la modificación. Si la modificación es, por ejemplo, biotina, la superficie respectiva no debería tener un recubrimiento de estreptavidina.

Según los métodos de la invención, los oligonucleótidos primero y adicional al menos parcialmente bicatenarios comprenden una parte de la molécula de ácido nucleico a fabricar. Como en el método de Sloning conocido en la técnica y descrito, entre otros, en el documento WO 00/75368, también en los presentes métodos de la invención la molécula de ácido nucleico a fabricar es una molécula de ácido nucleico bicatenaria que comprende una cadena superior que tiene un extremo 5' y un extremo 3' (leer de izquierda a derecha) (5' \rightarrow 3') y una cadena inferior que tiene un extremo 3' y un extremo 5' (leer de izquierda a derecha) (3' \rightarrow 5'). Ambas cadenas hibridan entre sí mediante apareamiento de bases. La molécula de ácido nucleico a fabricar se divide teóricamente en una serie de fragmentos cortos de ADN bicatenario con el fin de su fabricación. La longitud de estos fragmentos de ADN bicatenarios depende del número de nucleótidos transferidos desde los oligonucleótidos primero o adicional al segundo oligonucleótido y al oligonucleótido alargado, respectivamente. Estos nucleótidos transferidos se designan también en la presente memoria como nucleótidos variables. La parte de los oligonucleótidos de las colecciones respectivas como se describen en la presente memoria que comprende las posiciones variables se designa en la presente memoria como la región variable. El resto de los oligonucleótidos se designa en la presente memoria como región constante y comprende típicamente un sitio de reconocimiento de una enzima de restricción de tipo IIS o una parte de la misma y, opcionalmente, un bucle terminal. El número de nucleótidos transferidos por ciclo de reacción determina el tamaño de la colección a usar con respecto a los métodos según la presente invención. La parte de la molécula de ácido nucleico a transferir en una sola etapa desde un oligonucleótido primero o adicional parcialmente bicatenario al oligonucleótido segundo y alargado parcialmente bicatenario comprende por tanto ambas cadenas de los fragmentos de ADN bicatenarios individuales.

Debido a este diseño, los oligonucleótidos primero y adicional al menos parcialmente bicatenarios difieren entre sí principalmente en el(los) último(s) nucleótido(s) del extremo 3' de la cadena superior y el(los) último(s) nucleótido(s) del extremo 5' de la cadena inferior. Pueden residir diferencias adicionales en el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción de tipo IIS.

Para el diseño de las colecciones de oligonucleótidos primero, segundo y adicional al menos parcialmente bicatenarios, son aplicables las siguientes consideraciones. En primer lugar, el número de nucleótidos a transferir durante cada etapa de alargamiento y, en segundo lugar, la longitud del saliente monocatenario. Basándose en estas consideraciones, puede diseñarse una serie de colecciones de oligonucleótidos. Por ejemplo, en caso de que la síntesis se diseñe de tal modo que cada uno de los fragmentos de ADN bicatenarios que forman en su totalidad la molécula de ácido nucleico a sintetizar comprenda tres nucleótidos variables en cada cadena, concretamente en cada etapa de alargamiento se añaden tres nucleótidos tanto al extremo 3' de la cadena superior como al extremo 5' de la cadena inferior del segundo oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario o al oligonucleótido alargado respectivamente, y se verifique un saliente de tres nucleótidos, esto significa que tienen que proporcionarse un total de 4096 (=4^{6}) oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios diferentes como oligonucleótidos primero y adicional al menos parcialmente bicatenarios. Este tipo de colección requiere también un número distinto de segundos oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios. Para estos segundos oligonucleótidos, el criterio de diseño relevante es la longitud del saliente. Para un saliente de tres nucleótidos, el número total de segundos nucleótidos al menos parcialmente bicatenarios es de 64. Este número de segundos oligonucleótidos permite el acoplamiento y el ligamiento, respectivamente, a cualquier oligonucleótido primero y adicional parcialmente bicatenario, proporcionando también un saliente de tres nucleótidos.

Colección de la variante de alargamiento de saliente de tres nucleótidos

Como se discute con más detalle con respecto a la etapa de transposición en los siguientes párrafos, se requiere una categoría adicional de oligonucleótidos primero y adicional al menos parcialmente bicatenarios. En caso de que el procedimiento de alargamiento como se describe en los métodos para la fabricación de una molécula de ácido nucleico use oligonucleótidos alargados con un saliente de tres nucleótidos, se requiere una tercera clase de oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios para permitir una escisión específica de productos intermedios durante la fase de transposición. Esto es debido a que actualmente no se conoce un par adecuado de enzimas de restricción de tipo IIS con sitios de reconocimiento que puedan discriminarse. Para superar esta limitación, tiene que añadirse un nuevo sitio de reconocimiento de otra enzima de restricción de tipo IIS en la última etapa de alargamiento (antes de entrar en la fase de transposición durante la cual se combinan los fragmentos de ADN bicatenarios preformados por pares). Estos 64 oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios se designan en la presente memoria como oligonucleótidos de transición o anclajes de transición. El número de oligonucleótidos de transición aumenta a 320 oligonucleótidos de transición diferentes si se quiere variar las longitudes de los fragmentos de ADN bicatenarios. Dependiendo de la distancia del sitio de reconocimiento de la enzima de restricción de tipo IIS, que no genera el saliente de 3 nucleótidos desde el primer nucleótido del oligonucleótido alargado, esta enzima puede o no retirar un par de bases del oligonucleótido alargado. Esta opción es altamente ventajosa porque permite el desplazamiento de los extremos de los fragmentos de ADN bicatenario en un par de bases. De este modo, es posible evitar la formación de bloques de alargamiento que tienen salientes de cuatro nucleótidos que son autocomplementarios. La presencia de dichos salientes se esperaría que redujera el rendimiento de los productos de ligamiento correctos en la fase de transposición debido a la formación de subproductos autoligados. Para sintetizar cualquier ADN posible con una variante de saliente de tres nucleótidos, la colección de oligonucleótidos respectiva tendrá que comprender 4224 oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios o 4416 oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios, respectivamente, si se quiere evitar la posible formación de salientes autocomplementarios durante la fase de transposición.

Colección para la variante de alargamiento de saliente de un nucleótido

En caso de usar oligonucleótidos con salientes monocatenarios que tienen una longitud de una base y un número total de tres nucleótidos transferibles, el número de oligonucleótidos necesario se reduce a un total de 264. La colección respectiva consiste más particularmente en un total de 256 oligonucleótidos primeros y adicionales al menos parcialmente bicatenarios diferentes con tres nucleótidos variables en cada uno de los extremos 5' y 3', que están escalonados por un nucleótido. Si se cuenta cada posición variable en ambas cadenas, un total de 4 posiciones están ocupadas por nucleótidos variables, concretamente, el número total de variantes es de 256 (=4^{4}). Los oligonucleótidos primero y adicional contienen 6 o más pares de bases que actúan como sitio de reconocimiento de la enzima de restricción de tipo IIS, un número no especificado de pares de bases espaciadoras y, excepto para oligonucleótidos bipartitos, un bucle terminal. La inserción de pares de bases espaciadoras es necesaria porque la unión estable de las enzimas de restricción usadas depende a menudo de la presencia de nucleótidos adicionales fuera del sitio de reconocimiento. Además, son necesarios cuatro segundos oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios y cuatro oligonucleótidos de transición para hacer la transición desde un saliente de un nucleótido a un saliente de cuatro nucleótidos. Si van a transferirse cuatro pares de bases en cada etapa, la correspondiente variante de la colección de oligonucleótidos consiste en 1032 oligonucleótidos, concretamente, 1024 oligonucleótidos primeros y adicionales al menos parcialmente bicatenarios que tienen un saliente de un par de bases más cuatro segundos oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios y cuatro oligonucleótidos de transición.

Síntesis en fase sólida inversa

En el procedimiento de la invención llamado RSPS (síntesis en fase sólida inversa), el primer y segundo oligonucleótidos se ligan entre sí mediante sus salientes complementarios. Ha de entenderse que los salientes pueden ser sólo aquellos que no estén bloqueados ni por la modificación ni por la estructura de bucle como se especifica anteriormente. La reacción de ligamiento como tal es conocida por un experto en la técnica y puede realizarse según protocolos estándar tales como, entre otros, los descritos en los ejemplos adjuntos a la presente. En la reacción de ligamiento, se genera un producto de ligamiento que se designa en la presente memoria como primer producto de ligamiento. Dicho primer producto de ligamiento se inmoviliza posteriormente en una superficie o una matriz. La inmovilización ocurre preferiblemente mediante la modificación como se especifica anteriormente. Después de inmovilizar dicho primer producto de ligamiento, se escinde el producto de ligamiento con una enzima de restricción de tipo IIS. Más particularmente, la enzima de restricción es aquella cuyo sitio de reconocimiento se incorpora en el primer oligonucleótido que tiene la modificación usada para la inmovilización del primer producto de ligamiento en la superficie. Los oligonucleótidos primero y adicional se diseñan de tal modo que la escisión del primer producto de ligamiento libera un segundo oligonucleótido alargado. Los nucleótidos variables añadidos corresponden a una parte de la molécula de ácido nucleico a sintetizar. Más precisamente, el segundo oligonucleótido liberado se alarga por estos nucleótidos 3' del sitio de escisión de la cadena superior del primer oligonucleótido. Dicho segundo oligonucleótido alargado se designa también en la presente memoria como oligonucleótido alargado. Debido a las características de escisión de la enzima de restricción de tipo IIS cuyo sitio de reconocimiento se incorpora en el primer oligonucleótido, el oligonucleótido alargado tendrá de nuevo un saliente. Sin embargo, este saliente es diferente del segundo oligonucleótido usado originalmente. Este oligonucleótido alargado se transfiere después a una reacción adicional, que preferiblemente tiene lugar en un recipiente de reacción adicional. En dicho recipiente de reacción, está presente un oligonucleótido adicional al menos parcialmente bicatenario o se añade al mismo, en el que este oligonucleótido adicional al menos parcialmente bicatenario es de un diseño similar al del primer oligonucleótido, concretamente, tiene una modificación que permite acoplar el oligonucleótido a una superficie y comprende también un sitio de reconocimiento de una enzima de restricción de tipo IIS adicional que corta fuera de su sitio de reconocimiento. También este oligonucleótido adicional comprende un saliente monocatenario. El saliente del oligonucleótido adicional es parcial o totalmente complementario del saliente del oligonucleótido alargado. La enzima de restricción de tipo IIS cuyo sitio de reconocimiento se incorpora en el oligonucleótido adicional puede ser la misma o diferente que la enzima de restricción del primer oligonucleótido, concretamente la primera enzima de restricción de tipo IIS. Aparte de esto, de forma similar al diseño del primer oligonucleótido, también este oligonucleótido adicional comprende uno o varios nucleótidos que se convertirán en parte de la molécula de ácido nucleico a sintetizar. Como siguiente etapa, este oligonucleótido adicional se liga entonces al oligonucleótido alargado. Al repetir esta secuencia de etapas, la longitud del oligonucleótido alargado aumenta en el número de nucleótidos variables por ciclo. El oligonucleótido alargado normalmente no se inmoviliza, sino que se transfiere desde una reacción a la posterior. En comparación con el segundo oligonucleótido de partida, el oligonucleótido así alargado comprende ahora un fragmento de ADN bicatenario que es parte de la molécula de ácido nucleico a sintetizar.

Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que verificar esta secuencia particular de etapas, a saber, ligar los oligonucleótidos primero y adicional con los oligonucleótidos segundo o alargado en disolución, inmovilizar los productos de ligamiento y liberar posteriormente los oligonucleótidos alargados correctamente escindidos para uso en ciclos de reacción adicionales, es ventajoso frente a métodos conocidos en la técnica. Esta secuencia de etapas está en clara contraposición con el diseño original del método de Sloning como se describe en la solicitud de patente internacional WO 00/75368. Específicamente, esta secuencia inversa permite reducir en gran medida la variedad y número de subproductos. La razón de esto es que los presentes inventores han descubierto que el ligamiento entre el primer y segundo oligonucleótidos funciona con alto rendimiento cuando ambos oligonucleótidos se mantienen en disolución en lugar de unirse o inmovilizarse uno de ellos en una superficie. Adicionalmente, la cinética de reacción es más controlable ya que los productos de reacción erróneos cambian la molaridad de los reactivos para etapas adicionales. Típicamente, el oligonucleótido que proporciona una parte de la molécula de ácido nucleico a fabricar mediante el método de la invención, concretamente, el oligonucleótido donante que es preferiblemente el oligonucleótido primero y adicional, respectivamente, está presente en un nuevo recipiente de reacción tal como un pocillo de una placa de pocillos múltiples donde no está inmovilizado. La razón para ello es que, al hacer esto, ni el producto de ligamento no escindido ni el oligonucleótido donante no escindido, que están ambos inmovilizados mediante la modificación, se transfieren a una nueva reacción de ligamiento. En el método descrito en la solicitud de patente internacional WO 00/75368, una escisión incompleta del oligonucleótido inmovilizado en crecimiento podría dar como resultado la formación de productos de ligamiento incorrectos o incompletos. Mediante el uso particular de la etapa de inmovilización, se retiran todos los componentes de la reacción que pueden ser problemáticos en etapas posteriores.

Síntesis en fase líquida inversa

Básicamente, los métodos de la invención funcionan con cualquier enzima de restricción de tipo IIS. Preferiblemente, se usan aquellas enzimas de restricción de tipo IIS que generan un saliente de tres nucleótidos en el extremo 5' tales como SapI, Earn 1104I y los isoesquizómeros EarI, Ksp632I, o aquellas enzimas de restricción de tipo IIS que generan un saliente de un nucleótido tales como BfiI, FmrI, BfuI, BciVI, BspPI, AclWI, AlwI, PleI, MlyI y PpsI.

Como se describe con respecto al procedimiento de Sloning conocido en la técnica y, por ejemplo, sujeto a la solicitud de patente internacional WO 00/75368, se sintetizan oligonucleótidos bicatenarios alargados que tienen un saliente monocatenario en paralelo mediante los métodos según la presente invención para la fabricación de una molécula de ácido nucleico. Estos oligonucleótidos bicatenarios alargados, también designados en la presente memoria como bloques de alargamiento, tienen que ligarse entre sí para producir la molécula de ácido nucleico completa a fabricar. Mediante este ligamiento paralelo de los bloques de alargamiento, que se designa también como fase de transposición o transposición, puede sintetizarse cualquier molécula de ADN en muy pocas etapas, proporcionando productos más fiables y exactos a rendimientos superiores en comparación con los métodos conocidos en la técnica.

Los oligonucleótidos primero, adicional y segundo o alargado se designan también en la presente memoria como "intermedios de alargamiento". Cualquier producto anterior al ligamiento del anclaje de transición se designa como "producto de alargamiento". Tras la escisión, estos productos de alargamiento se designan como "productos de alargamiento cortados". Después del ligamiento del anclaje de transición, estos intermedios se denominan "bloques de alargamiento". Esta última frase refleja el hecho de que, excepto los correspondientes extremos, estos bloques están representados como tales en el ácido nucleico a fabricar. Un bloque de alargamiento es también un oligonucleótido alargado ligado como se define en la presente memoria, que se designa también en la presente memoria como producto de alargamiento o, después de la escisión con la enzima de restricción respectiva, como productos de alargamiento cortados. Según la definición dada anteriormente, los bloques de alargamiento que se cortaron se designan como "bloques de alargamiento cortados". El ligamiento de dos bloques de alargamiento da como resultado un primer bloque de transición, designándose todos los otros bloques de transición como "intermedios de transposición".

Variantes de transposición

Dados los métodos para la fabricación de una molécula de ácido nucleico, y más particularmente los bloques de alargamiento así generados como se describen en la presente memoria, hay básicamente dos alternativas para combinarlos en lo que se denomina la etapa de transposición. En la primera alternativa, sólo los oligonucleótidos primero y adicional al menos parcialmente bicatenarios comprenden una modificación para inmovilizar el oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario en una superficie. En consecuencia, los bloques de alargamiento obtenidos en la etapa h) e i), respectivamente, del método para la fabricación de una molécula de ácido nucleico según la presente invención carecen de una modificación que permita la unión a la matriz. Ya no pueden unirse selectivamente a una superficie o una matriz, permanecerán por lo tanto en disolución.

La segunda alternativa requiere que, tanto los oligonucleótidos primero y adicional al menos parcialmente bicatenarios como el segundo oligonucleótido y cualquier oligonucleótido alargado que comprenda dicho segundo oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario como resto tengan una modificación que permita la inmovilización en una superficie. Preferiblemente, las modificaciones de los oligonucleótidos primero y adicional y los oligonucleótidos segundo o alargado permiten la unión específica a diferentes soportes sólidos. Pueden verificarse ambas alternativas según la presente invención. Sin embargo, cada alternativa requiere una disposición distinta de los oligonucleótidos primero y adicional al menos parcialmente bicatenarios y de la orientación en que se disponen las partes de molécula de ácido nucleico que están unidas al oligonucleótido segundo y alargado.

En la primera alternativa, se proporcionan un primer bloque de alargamiento cortado y un segundo bloque de alargamiento cortado. El primer bloque de alargamiento cortado puede estar generado, pero no necesariamente, según un método para la fabricación de una molécula de ácido nucleico según la presente invención. Lo mismo se aplica también al segundo, tercer y cuarto bloques de alargamiento como se usan en el método para la síntesis de una molécula de ácido nucleico según la presente invención. Como se usa en el método de la invención para la síntesis de una molécula de ácido nucleico, el segundo bloque de alargamiento cortado y el cuarto bloque de alargamiento cortado pueden ser adicionalmente oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios en lugar de bloques de alargamiento cortados. Al ligar el primer y segundo bloques de alargamiento cortados y el tercer y cuarto bloques de alargamiento cortados, se generan el primer bloque de transposición y el segundo bloque de transposición, respectivamente. La etapa de ligamiento puede llevarse a cabo tanto con ambos bloques de alargamiento cortados en disolución como con uno de los dos bloques de alargamiento cortados inmovilizado en una superficie mediante una modificación proporcionada por el resto oligonucleotídico primero o adicional al menos parcialmente bicatenario del bloque de alargamiento cortado. Se cortan después el primer y segundo bloques de transposición con enzimas de restricción de tipo IIS distintas y diferentes, en las que la enzima de restricción es cualquier enzima de restricción IIS del primer tipo o enzima de restricción IIS del segundo tipo. El primer bloque de transposición que se corta con la enzima de restricción de tipo IIS se designa también en la presente memoria como el primer bloque de transposición cortado y el segundo bloque de transposición que se corta con la enzima de restricción de tipo IIS diferente se designa también en la presente memoria como segundo bloque de transposición cortado. Preferiblemente, la primera enzima de restricción de tipo IIS libera el primer bloque de transposición cortado, mientras que la segunda enzima de restricción de tipo IIS libera el segundo resto oligonucleotídico al menos parcialmente bicatenario del segundo bloque de transposición, en cuyo caso el segundo bloque de transposición cortado permanece inmovilizado en una superficie. Estos primer bloque de transposición cortado y segundo bloque de transposición cortado se combinan posteriormente y se ligan usando técnicas estándar. El producto de ligamiento generado puede usarse entonces en una etapa de ligamiento posterior como primer y/o segundo intermedio de transposición.

Al usar dos enzimas de restricción de tipo IIS diferentes para la generación del primer bloque de alargamiento cortado y el segundo bloque de alargamiento cortado, preferiblemente seleccionadas de las enzimas Esp3I, Eco31I, BsaI, BpiI, BbsI y BpuAI, se garantiza una orientación correcta de la parte de la molécula de ácido nucleico a fabricar. Usando este método particular, la secuencia se oligonucleótidos transferida a cualquier bloque de alargamiento se corresponde con parte de la secuencia de la molécula de ácido nucleico a fabricar. En otras palabras, si la molécula de ácido nucleico a fabricar consiste en los bloques de alargamiento 1 a 4, el bloque de transposición 1 proporciona los bloques de alargamiento 1 y 2 y el bloque de transposición 2 proporciona los bloques 3 y 4, respectivamente, en ese orden.

Transición de reacciones de alargamiento a transposición con diferente longitud de saliente

Para la transposición, es esencial que los salientes de los productos de alargamiento primero cortado y segundo cortado sean complementarios entre sí con respecto a la secuencia y número de bases de saliente. Los salientes monocatenarios de productos de alargamiento cortados que se corresponden con fragmentos de ADN bicatenarios adyacentes en la molécula de ácido nucleico a fabricar son automáticamente complementarios. Sin embargo, si los oligonucleótidos primero y adicional y los oligonucleótidos segundo o alargado contienen sitios de reconocimiento de enzimas de restricción de tipo IIS que generan salientes monocatenarios con diferentes longitudes, los productos de alargamiento resultantes tienen que modificarse de tal manera que los salientes producidos por la escisión de los oligonucleótidos alargados ligados con cualquiera de las al menos dos enzimas de restricción de tipo IIS diferentes se apareen entre sí antes de que puedan combinarse. Esto puede conseguirse usando un oligonucleótido adicional al menos parcialmente bicatenario diseñado particularmente en la última etapa de la fase de alargamiento. Este tipo de oligonucleótido adicional al menos parcialmente bicatenario particular se designa también en la presente memoria como oligonucleótido de transición.

Por ejemplo, si se usa la enzima de restricción de tipo IIS Earn 1104I para generar los oligonucleótidos alargados, se genera un saliente de tres nucleótidos en el extremo 5'. Para ligar diferentes productos de alargamiento mediante salientes monocatenarios producidos por diferentes enzimas de restricción de tipo IIS, no es posible usar salientes de tres nucleótidos, puesto que actualmente no hay enzimas de restricción de tipo IIS diferentes conocidas que reconozcan secuencias que puedan discriminarse. Por lo tanto, en una realización de los métodos de la invención, se transforma un saliente de tres nucleótidos de un oligonucleótido alargado en un saliente de cuatro nucleótidos para permitir el ligamiento de otro bloque de alargamiento con un saliente generado mediante la escisión con la enzima de restricción de tipo IIS Esp3I. Esto puede verificarse introduciendo una etapa de alargamiento adicional en la que se liga el oligonucleótido de transición al producto de alargamiento, este oligonucleótido de transición tiene un saliente de tres nucleótidos pero un sitio de reconocimiento de una enzima de restricción de tipo IIS productora de un saliente de cuatro nucleótidos tal como Eco31I. Después de escindir este último producto de ligamiento, se genera un saliente 5' de cuatro nucleótidos que es complementario del saliente del correspondiente bloque de alargamiento cortado siguiente, que se ha escindido con la enzima de restricción de tipo IIS Esp3I. Se da naturalmente una complementariedad de secuencia una vez se solapan los salientes del primer bloque de alargamiento cortado y el segundo bloque de alargamiento cortado entre sí por cuatro nucleótidos. Los oligonucleótidos de transición pueden diseñarse de tal modo que la escisión con Eco31I proporcione un bloque de alargamiento con el mismo nucleótido 3' terminal que antes del ligamiento, pero añadiendo un nucleótido al extremo 5' del oligonucleótido alargado. Como alternativa, pueden usarse oligonucleótidos de transición en los que el sitio de reconocimiento de Eco31I sea un par de bases más cercano al extremo de la molécula. Esto desplaza la posición de escisión un nucleótido arriba, produciendo un oligonucleótido alargado ligado cortado que se acorta en un nucleótido en su extremo 3'. El uso alternativo de cualquier tipo de anclaje de transición tiene una ventaja distinta: puede evitarse así la formación de salientes monocatenarios autocomplementarios de los bloques de alargamiento individuales.

Usando una enzima de restricción de tipo IIS generadora de un saliente de un nucleótido tal como BfuI, se aplican los mismos principios. En las etapas de transposición posteriores, se ligan posteriormente los bloques de alargamiento cortados primero y segundo entre sí. Uno de los dos bloques de alargamiento cortados correspondientes se corta siempre con la segunda enzima de restricción de tipo IIS, en el presente caso, por ejemplo, Esp3I. Al hacer esto, el bloque de alargamiento o el producto de la reacción de transposición pueden retirarse así de la reacción, particularmente de los recipientes de reacción tales como un pocillo, y pueden transferirse a un recipiente de reacción diferente. Del otro bloque de alargamiento cortado, se escinde el segundo resto oligonucleotídico al menos parcialmente bicatenario con la segunda enzima de restricción de tipo IIS respectiva. Esto deja un bloque de alargamiento inmovilizado en una superficie que comprende el oligonucleótido de transición y una parte de la molécula de ácido nucleico a fabricar.

Transposición semiinvertida (SIT)

En una realización adicional del procedimiento de transposición que usa bloques de alargamiento, las transposiciones pueden llevarse a cabo como las denominadas transposiciones semiinvertidas (SIT). El procedimiento de SIT se diseña para reducir significativamente el número de posibles productos secundarios, lo que da como resultado mayores rendimientos del producto correcto. En contraposición con el procedimiento de transposición descrito anteriormente, la mitad de los bloques de alargamiento de la molécula de ácido nucleico a sintetizar se sintetizan en orientación invertida.

Mientras que en las reacciones de transposición anteriormente descritas los bloques de alargamiento a combinar entre sí tienen que escindirse con dos enzimas de restricción de tipo IIS diferentes, el procedimiento de SIT se basa en el uso de sólo un tipo de enzima de restricción de tipo IIS durante todas las etapas de transposición, excepto la primera. Este procedimiento tiene varias ventajas: ya que se usa la misma enzima para todos los intermedios de transposición, pueden minimizarse las diferencias en el rendimiento de estos productos. Esto asegura que se ligan cantidades bastante comparables de productos intermedios. Para mejorar adicionalmente el rendimiento, se selecciona típicamente la enzima de restricción de tipo IIS con la mayor actividad para cortar la mayoría de los intermedios, limitando el uso de la enzima con menor actividad a una sola etapa. Finalmente, la probabilidad de formación de productos secundarios indeseados se reduce en gran medida porque los salientes monocatenarios a ligar se aparean sólo con aquellos bloques de alargamiento a los que se pretenden ajustar. Es una desventaja del procedimiento de SIT la generación de intermedios que tienen dos extremos libres en lugar de uno. Por lo tanto, es imposible usar una etapa con exonucleasa para retirar los productos secundarios no ligados.

Los bloques de construcción para la transposición semiinvertida son los bloques de alargamiento. En la primera etapa de una realización del procedimiento de SIT, se inmovilizan estos bloques de alargamiento sobre una superficie mediante la modificación causada por los oligonucleótidos de transición. Se cortan entonces todos los bloques de alargamiento inmovilizados con la enzima de restricción de tipo IIS cuyo sitio de reconocimiento reside en la porción de la molécula contribuida por el segundo oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario, produciendo así bloques de alargamiento cortados. Se corta entonces una vez más uno de cada par de bloques de alargamiento cortados inmovilizados que están adyacentes en la molécula de ácido nucleico a sintetizar. Esta vez, se usa la enzima de restricción de tipo IIS cuyo sitio de reconocimiento está comprendido en la porción de la molécula contribuida por el oligonucleótido adicional al menos parcialmente bicatenario o el oligonucleótido de transición. Como resultado, se generan fragmentos de ADN bicatenarios con dos extremos libres; permaneciendo unidos a la superficie los restos de las moléculas que contienen los bucles terminales. Se ligan entonces los bloques de alargamiento cortados y bloques de alargamiento cortados dos veces por pares, formando nuevos intermedios de transposición que duplican aproximadamente el tamaño de los bloques de alargamiento que entraron en la reacción de ligamiento. Puesto que los salientes monocatenarios de los bloques de alargamiento cortados son complementarios sólo de uno de los extremos libres de los bloques de alargamiento cortados dos veces, se sigue conservando la orientación de la reacción de ligamiento. Por lo tanto, todos los fragmentos cortados dos veces se ligan sólo en orientación inversa. Invertir la orientación de los intermedios de transposición de doble cortado en cada etapa asegura que sus salientes no se aparearán en la mayoría de los casos con los salientes de cualquier producto secundario no cortado eventualmente restante. En el método según la solicitud de patente internacional WO 00/75368, todos los productos secundarios generados por escisión y/o ligamiento incompleto pueden participar en reacciones posteriores porque los salientes monocatenarios producidos cortando con la otra enzima de restricción de tipo IIS tienen todos una secuencia idéntica. Debido a este cambio de orientación de los intermedios de transposición, es esencial que en las etapas precedentes se construyan las secuencias de cada dos bloques de alargamiento en orientación inversa respecto a la secuencia de la parte de la molécula de ácido nucleico a fabricar. Cuando se diseña una síntesis según el procedimiento de SIT, deben satisfacerse ciertas condiciones: los salientes monocatenarios de todos los intermedios no deben ser complementarios entre sí ni autocomplementarios. La última limitación puede superarse desplazando apropiadamente los límites de los bloques de alargamiento, lo que constituye el ácido nucleico a sintetizar como se describe anteriormente. En caso de que la molécula de ácido nucleico deseada contenga secuencias altamente repetitivas, puede no ser siempre posible cumplir la primera condición.

En una realización adicional del procedimiento de SIT, las transposiciones pueden llevarse a cabo sin la adición previa de un oligonucleótido de transición. Como en el caso anterior, se cortan primero todos los bloques de alargamiento inmovilizados con la enzima de restricción específica del segundo oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario, generando así productos de alargamiento cortados una vez con un extremo libre y un extremo bloqueado. Se escinden entonces cada dos bloques de alargamiento cortados una vez con la enzima de restricción específica del último oligonucleótido adicional al menos parcialmente bicatenario, produciendo un bloque de alargamiento cortado dos veces, que se libera del soporte sólido. Se ligan después estos bloques de alargamiento cortados dos veces con sus bloques de alargamiento cortados una vez apareados en orientación inversa respecto a su dirección de síntesis. Los salientes usados para este ligamiento tienen la misma longitud. Sin embargo, su longitud puede ser diferente de la longitud de los salientes producidos por la enzima de restricción cuyo sitio de reconocimiento reside en el resto de la molécula proporcionado por el último oligonucleótido adicional al menos parcialmente bicatenario. Los intermedios de transposición resultantes tienen de nuevo un extremo libre que es compatible con el saliente producido por la enzima de restricción específica del último oligonucleótido adicional al menos parcialmente bicatenario. De este modo, es posible unir fragmentos que tienen diferentes salientes. Con el procedimiento de SIT, se ensambla una molécula de ácido nucleico a fabricar que contiene los nucleótidos 1-80 como se muestra en la Fig. 12, habiéndose construido la mitad de los productos de alargamiento en orientación inversa.

Procedimientos de doble selección

En una realización adicional del procedimiento de transposición de la presente invención, el procedimiento de transposición puede diseñarse diferentemente para introducir una segunda selección usando oligonucleótidos que portan diferentes modificaciones. Los métodos de doble selección son aplicables respecto tanto al método RLPS como RSPS como se dan a conocer en la presente memoria. Es una característica común de estas variantes de transposición que tanto el oligonucleótido primero como adicional y segundo al menos parcialmente bicatenarios comprenden una modificación que permite la inmovilización de los oligonucleótidos respectivos en una superficie. Aquí, la modificación unida a los oligonucleótidos primero y adicional al menos parcialmente bicatenarios es diferente de la del segundo oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario. Por tanto, los oligonucleótidos primero y segundo alargados que comprenden dichos restos oligonucleotídicos primero o adicional y segundo al menos parcialmente bicatenarios comprenden dos modificaciones diferentes que permiten preferiblemente su inmovilización específica en una superficie tal como la pared recubierta del pocillo. Preferiblemente, los primer y segundo oligonucleótidos ligados alargados se construyen de manera similar al método para la fabricación de una molécula de ácido nucleico como se da a conocer en la presente memoria, tal como RSPS y RLPS, respectivamente. Una vez se completa un bloque de alargamiento, se corta con la primera de las dos enzimas de restricción cuyos sitios de reconocimiento están contenidos en su secuencia. Se liga entonces preferiblemente a un bloque de alargamiento adicional, que se corta con la segunda de las dos enzimas de restricción cuyos sitios de reconocimiento están contenidos en su secuencia, formando así un primer bloque de transposición. Se lleva a cabo preferiblemente el ligamiento en disolución. Se sintetizan las diversas partes de la molécula de ácido nucleico a fabricar en reacciones independientes usando las diversas reacciones de alargamiento dadas a conocer en la presente memoria.

Está también dentro de la presente invención verificar el procedimiento estándar del método de Sloning como se describe en la solicitud de patente internacional WO 00/75368. Se transfiere un primer bloque de alargamiento a un recipiente de reacción cuya superficie está recubierta de tal modo que permita a la modificación unirse al segundo oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario ahora parte del bloque de alargamiento respectivo, inmovilizando así el primer bloque de alargamiento. Se transfiere el segundo bloque de alargamiento a un recipiente de reacción diferente. Se recubre diferentemente la superficie de dicho recipiente de reacción diferente para permitir la inmovilización del segundo bloque de alargamiento en la superficie mediante la modificación unida al resto contribuido por el último oligonucleótido adicional al menos parcialmente bicatenario. Se escinde posteriormente el segundo bloque de alargamiento inmovilizado con la enzima de restricción de tipo IIS cuyo sitio de reconocimiento está contenido en el resto contribuido por el último oligonucleótido adicional al menos parcialmente bicatenario. Esto libera un segundo bloque de alargamiento cortado que comprende el segundo resto oligonucleotídico al menos parcialmente bicatenario con la modificación respectiva y una parte de la molécula de ácido nucleico a fabricar. En paralelo o posteriormente, se escinde el primer bloque de alargamiento con la enzima de restricción de tipo IIS cuyo sitio de reconocimiento está contenido en el resto contribuido por el segundo oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario. Tras dicha escisión, se libera un primer bloque de alargamiento cortado que comprende una parte de la molécula de ácido nucleico a fabricar y, además, el resto contribuido por el último oligonucleótido adicional al menos parcialmente bicatenario. Los bloques de alargamiento cortados liberados carecen simplemente del segundo o último oligonucleótido adicional al menos parcialmente bicatenario o una parte del mismo, respectivamente.

Se transfieren preferiblemente los bloques de alargamiento cortados así liberados a un recipiente de reacción diferente donde se lleva a cabo el ligamiento de dichos dos bloques de alargamiento cortados usando métodos estándar. El oligonucleótido ligado así creado se llama un bloque de transposición. Este bloque de transposición comprende un primer resto contribuido por el último oligonucleótido adicional al menos parcialmente bicatenario y un segundo resto contribuido por el segundo oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario del segundo bloque de alargamiento, reteniendo ambos sus diferentes modificaciones respectivas. Además, este bloque de transposición comprende las partes de la molécula de ácido nucleico a sintetizar proporcionadas tanto por el primero como el segundo bloques de alargamiento.

Se lleva a cabo la misma serie de reacciones con pares adicionales de bloques de alargamiento, produciendo bloques de transposición adicionales. Se inmovilizan entonces de nuevo los bloques de transposición resultantes en la primera o segunda superficie modificada en virtud de una de sus modificaciones; se repiten estas etapas de transposición hasta que se completa la molécula de ácido nucleico a fabricar.

Dependiendo del esquema de reacción y de las diferentes enzimas de tipo IIS usadas, puede tener que invertirse o no la orientación del resto que forma las partes de la molécula de ácido nucleico a sintetizar y a transferir en las etapas de transposición.

La presente invención se ilustra adicionalmente ahora por referencia a la siguientes figuras y ejemplos, en los que

las Fig. 1A-Fig. 1F muestran las diversas etapas del método de RSPS con oligonucleótidos que tienen un saliente de tres nucleótidos en el extremo 5';

las Fig. 2A-Fig. 2F muestran las diversas etapas del método de RSPS con oligonucleótidos que tienen un saliente de un nucleótido en el extremo 3';

las Fig. 3A-Fig. 3E muestran las diversas etapas del método de RLPS con oligonucleótidos que tienen un saliente de tres nucleótidos en el extremo 5';

las Fig. 4A-Fig. 4E muestran las diversas etapas del método de RLPS con oligonucleótidos que tienen un saliente de un nucleótido en el extremo 3'.

las Fig. 5A-Fig. 5J muestran la transición desde la fase de alargamiento a la fase de transposición para la variante de saliente de tres nucleótidos;

las Fig. 6A-Fig. 6D muestran la transición desde la fase de alargamiento a la fase de transposición para al variante de saliente de un nucleótido;

las Fig. 7A-Fig. 7D muestran el procedimiento de transposición semiinvertido como realización del método de transposición usado para la fabricación de la molécula de ácido nucleico;

las Fig. 8A-Fig. 8C ilustran la realización de la transposición según el procedimiento de doble selección o ping-pong;

la Fig. 9 muestra la combinación del procedimiento de doble selección y el método de SIT dado a conocer;

la Fig. 10 muestra la disposición de los bloques de alargamiento a usar en la transposición según el método de doble selección;

la Fig. 11 muestra las reacciones según el procedimiento de SIT con diferentes longitudes de saliente;

la Fig. 12 muestra una comparación de la eficacia del método de SPS del documento WO 00/35768 y el método de RLPS para la fabricación de moléculas de ácido nucleico según la presente invención

Se representa el método según la presente invención, que se designa en la presente memoria como RSPS, en sus diversas etapas en las Fig. 1A-F. La Fig. 1A muestra un primer y segundo oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios en los que el primer oligonucleótido se designa también como primer oligonucleótido de anclaje y el segundo oligonucleótido se designa también como oligonucleótido ligador cebador de secuenciación. El primer oligonucleótido de anclaje comprende un sitio de reconocimiento de la enzima de restricción de tipo IIS Eam1 104A y, además de esto, una parte de la molécula de ácido nucleico a fabricar que, en el presente caso y dado el sitio de escisión de Eam1104I, está en TAC de la cadena superior y en GCG de la cadena inferior (ambos en la orientación 5'\rightarrow3'). El saliente del primer oligonucleótido de anclaje es complementario del saliente respectivo en el extremo 5' del oligonucleótido ligador cebador de secuenciación. El oligonucleótido ligador cebador de secuenciación comprende un sitio de reconocimiento de una enzima de restricción de tipo IIS, en este caso de Esp3I. Tanto el primer oligonucleótido de anclaje como el oligonucleótido ligador cebador de secuenciación muestran una estructura unipartita, lo que significa que la cadena superior y la cadena inferior son parte de un oligonucleótido contiguo, que puede formar una estructura bicatenaria con un bucle interno, en el presente caso constituido por cuatro T. Esta estructura de bucle es una posible modificación de extremos no salientes, que no se van a ligar según la presente invención. El primer oligonucleótido de anclaje comprende adicionalmente una modificación que permite la inmovilización específica en una superficie. En el presente caso, el primer oligonucleótido de anclaje comprende un grupo biotina que permite la inmovilización en una superficie recubierta con estreptavidina. El oligonucleótido ligador cebador de secuenciación y el oligonucleótido de anclaje se ligan posteriormente, generando un primer producto de ligamiento (Fig. 1B). El ligamiento está mediado por la ADN ligasa T4 después de hibridar los salientes complementarios del primer oligonucleótido de anclaje y el oligonucleótido ligador cebador de secuenciación. Posteriormente, se inmoviliza el primer producto de ligamiento sobre una superficie recubierta con estreptavidina. La estreptavidina se une específicamente a la modificación de biotina del resto del primer oligonucleótido de anclaje del primer producto de ligamiento (Fig. 1C). La modificación de superficies tales como el recubrimiento con estreptavidina es bien conocida en la técnica y se describe, por ejemplo, en Huang S.C., Swerdlow H., Caldwell C.D. Anal. Biochem. 1994; 222: 441-9.

En una etapa posterior, se lava el primer producto de ligamiento inmovilizado, preferiblemente dos veces, usando un tampón. Además, se inactiva la actividad ligasa restante calentando la reacción a 65ºC durante 10 min. Mediante etapas de lavado posteriores, se retira realmente de la reacción cualquier producto diferente del primer producto de ligamiento, permitiendo así una calibración exacta de los parámetros de reacción necesarios para etapas posteriores del método. Una de las siguientes etapas es la escisión del primer producto de ligamiento usando la enzima de restricción de tipo IIS Eam1104I, que se designa también en la presente memoria como la primera enzima de restricción de tipo IIS (Fig. 1D-1E). Debido a la disposición particular de la parte de la molécula de ácido nucleico que se proporciona en esta etapa distal del sitio de escisión de la enzima de restricción de tipo IIS respectiva, se genera un oligonucleótido alargado y se libera del primer producto de ligamiento, mientras que el primer oligonucleótido o la parte restante del mismo, respectivamente, está (o permanece) inmovilizado en la superficie. Debido a esta disposición, el primer oligonucleótido sirve realmente como molécula donante y el segundo oligonucleótido como molécula aceptora. El oligonucleótido alargado, que se designa también como ligador cebador de secuenciación alargado, es por tanto el segundo oligonucleótido que ha incorporado ahora la parte originalmente contenida en el primer oligonucleótido y que se ha donado por el primer oligonucleótido, y que corresponde a una parte de la molécula de ácido nucleico a fabricar. Se transfiere después este oligonucleótido alargado a una nueva reacción, típicamente a un nuevo recipiente de reacción. En dicho recipiente de reacción, se ha proporcionado ya o se añade al mismo un oligonucleótido adicional (Fig. 1F). Este oligonucleótido adicional tiene un diseño similar al del primer oligonucleótido. Esto significa que también este oligonucleótido adicional es al menos parcialmente bicatenario y tiene una modificación que permite el acoplamiento del oligonucleótido a una superficie. También comprende un sitio de reconocimiento de la enzima de restricción de tipo IIS adicional que corta fuera de su sitio de reconocimiento, y dicho oligonucleótido comprende un saliente monocatenario. Este oligonucleótido adicional se caracteriza más particularmente de tal modo que comprenda de nuevo una parte de la molécula de ácido nucleico a sintetizar. Este fragmento del oligonucleótido adicional, designado en la Fig. 1F como segundo oligonucleótido de anclaje, es distal del sitio de escisión de la enzima de restricción de tipo IIS respectiva. La distancia entre el sitio de reconocimiento y el sitio de escisión de la enzima de restricción particular del oligonucleótido adicional determina el tamaño del fragmento de ADN a transferir: en el presente caso, un tramo de tres nucleótidos (CGC) en la cadena superior y tres nucleótidos (ATA) en la cadena inferior. Posteriormente, se repiten las etapas descritas anteriormente para añadir otro tramo de tres nucleótidos a ambos extremos del segundo oligonucleótido alargado. Al repetir este procedimiento en cada ronda, se añaden otros tres nucleótidos al oligonucleótido alargado. Por tanto, el segundo oligonucleótido original contiene finalmente un fragmento de ADN bicatenario típicamente de aproximadamente 20 pares de bases, que forma una parte de la molécula de ácido nucleico a fabricar. Una vez se han completado todas las etapas de alargamiento, este fragmento se designa también en la presente memoria como "bloque de alargamiento".

Las Fig. 2A-Fig. 2F muestran el método según la presente invención, más particularmente el método de RSPS que usa oligonucleótidos que tienen un saliente de un nucleótido de longitud en el extremo 3'.

De nuevo, el primer oligonucleótido, designado también en la presente memoria como primer oligonucleótido de anclaje, es de estructura unipartita, concretamente, las dos cadenas de nucleótidos que forman la estructura bicatenaria son parte de un oligonucleótido contiguo que puede formar una estructura bicatenaria con un bucle interno. Esta estructura de bucle está compuesta por cuatro T, en la que una de dichas cuatro T, preferiblemente la más distal, comprende una modificación adicional que permite la inmovilización del primer oligonucleótido en una superficie. En el presente caso, la modificación es un residuo de biotina. El primer oligonucleótido comprende un sitio de reconocimiento específico de BfuI, que se designa también como primera enzima de restricción de tipo IIS. Se unen nucleótidos adicionales a ambas cadenas distales al sitio de escisión de BfuI. En el presente caso, se añade la secuencia 5' CCGT 3' a la cadena superior y la secuencia 3' AGGC 5' a la cadena inferior. Por tanto, el primer oligonucleótido comprende un saliente de un nucleótido en el extremo 3' y un total de tres pares de bases en la doble cadena que definen la especie particular de este oligonucleótido de anclaje. El segundo oligonucleótido es también en el presente caso de estructura unipartita, en la que las dos cadenas que forman la estructura bicatenaria del segundo oligonucleótido están ligadas de nuevo por un bucle de cuatro nucleótidos. En el presente caso, el bucle está formado por cuatro T (Fig. 2A). El segundo oligonucleótido comprende un sitio de reconocimiento de Esp3I, que se designa también en la presente memoria como segunda enzima de restricción de tipo IIS. Se ligan tanto el primer como el segundo oligonucleótidos usando protocolos estándar, dando como resultado el primer producto de ligamiento representado en la Fig. 2B. Se inmoviliza posteriormente este primer producto de ligamiento en una superficie mediante la modificación de biotina del primer oligonucleótido y el primer producto de ligamiento, respectivamente. Se recubre la superficie con estreptavidina, lo que permite la retención específica de la especie oligonucleotídica biotinilada. Se lava posteriormente el primer producto de ligamiento así inmovilizado usando protocolos estándar, preferiblemente con tampones que permitan la retirada de cualquiera de los ingredientes de reacción, particularmente cualquier segundo oligonucleótido no ligado restante y la ligasa típicamente inactivada térmicamente (2C). En una etapa adicional, se escinde el producto de ligamiento inmovilizado con BfuI (Fig. 2D-2E). BfuI genera dos productos de escisión, un segundo oligonucleótido alargado y un primer oligonucleótido acortado. El primer oligonucleótido carece de los cuatro nucleótidos de la cadena superior y los cuatro nucleótidos de la cadena inferior que habían estado anteriormente presentes distales al sitio de escisión. A este respecto, este primer oligonucleótido actúa como donante, mientras que el segundo oligonucleótido actúa como aceptor. En comparación con el segundo oligonucleótido usado en la etapa representada en la Fig. 2A, el segundo oligonucleótido comprende ahora aquellos nucleótidos donados o transferidos desde el primer oligonucleótido al segundo oligonucleótido, que se designa ahora en la presente memoria como oligonucleótido alargado. El oligonucleótido alargado puede transferirse a un recipiente de reacción diferente, mientras que los subproductos tales como el primer producto de ligamiento no escindido y el primer oligonucleótido no ligado permanecen unidos a la superficie mediante la modificación de biotina. Se combina entonces el oligonucleótido alargado con un oligonucleótido adicional que actúa de nuevo como donante de los nucleótidos siguientes en la secuencia de la molécula de ácido nucleico a fabricar, cuya primera parte está ya unida al oligonucleótido alargado.

Como puede deducirse de la descripción anteriormente dada, resulta evidente que el método funciona tanto con oligonucleótidos que comprenden un saliente 5' como con oligonucleótidos que comprenden un saliente 3'.

El método según la presente invención, que se designa en la presente memoria también como RLPS, se representa en sus diversas etapas en las Fig. 3A-3E. La Fig. 3A muestra los dos oligonucleótidos, en los que el primer oligonucleótido se designa también como el primer oligonucleótido de anclaje y el segundo oligonucleótido se designa también como oligonucleótido ligador cebador de secuenciación. El primer nucleótido de anclaje tiene un diseño que es realmente el mismo que el del primer oligonucleótido según el método de RSPS, como se describe en las Fig. 1A-1F y las Fig. 2A-2F, respectivamente. Lo mismo se aplica al oligonucleótido ligador cebador de secuenciación (Fig. 3A). Se ligan el primer y segundo oligonucleótidos usando protocolos estándar mediante sus salientes, generando un primer producto de ligamiento (Fig. 3B). En contraposición con el método de RSPS, se escinde posteriormente el primer producto de ligamiento así obtenido con la primera enzima de restricción de tipo IIS, en el presente caso Earn 1104I. Esto da como resultado un primer oligonucleótido acortado y un segundo oligonucleótido alargado, en el que el último se designa también como oligonucleótido alargado (Fig. 3C). Como se describe para el método de RSPS, el primer oligonucleótido comprende una parte de la molécula de ácido nucleico a fabricar. Esta parte se ha transferido al segundo oligonucleótido.

En una etapa posterior, el primer oligonucleótido acortado así obtenido y el segundo oligonucleótido alargado se separan inmovilizando el primer oligonucleótido, más particularmente el primer oligonucleótido acortado, mediante la modificación en una superficie (Fig. 3D). El oligonucleótido alargado, originado a partir del segundo oligonucleótido por transferencia de una parte de la molécula de ácido nucleico a fabricar, se mantiene en disolución y puede someterse a etapas de alargamiento adicionales. Esto se hace típicamente transfiriendo la disolución de reacción a un recipiente de reacción tal como un pocillo de una placa de pocillos múltiples, en la que la superficie de la placa se recubre para permitir una interacción específica con la modificación del primer oligonucleótido acortado. En el presente caso, la modificación del primer oligonucleótido y el primer oligonucleótido acortado, respectivamente, es una biotina y el fondo y las paredes del recipiente de reacción se recubren con estreptavidina. Se inmoviliza el primer oligonucleótido acortado en dicha superficie, mientras que el oligonucleótido alargado está contenido en la fase líquida de la reacción. Se transfiere posteriormente la fase líquida o una parte de la misma a un nuevo recipiente de reacción al que se añade un oligonucleótido de anclaje (Fig. 3E). Básicamente, este segundo oligonucleótido de anclaje es el oligonucleótido adicional según el método de RLPS, que difiere del primer oligonucleótido en los nucleótidos que se van a transferir desde el segundo oligonucleótido de anclaje al oligonucleótido alargado obtenido a partir de las etapas precedentes. Puede repetirse esta secuencia de reacción una o varias veces, dando como resultado un oligonucleótido alargado que tiene una pluralidad de grupos nucleotídicos transferidos desde el primer oligonucleótido y oligonucleótidos adicionales posteriores al segundo oligonucleótido, formando así una parte de la molécula de ácido nucleico a fabricar.

Las Fig. 4A-4E ilustran el método de RLPS con oligonucleótidos que tienen un saliente de un nucleótido en el extremo 3'. Como puede deducirse de las Fig. A-E, las etapas llevadas a cabo son esencialmente las mismas que se explican con respecto al método de RLPS, usando oligonucleótidos que tienen un saliente de tres nucleótidos en el extremo 5'. La única diferencia reside en la longitud y localización del saliente.

Las Fig. 5A-5J muestran la adición de un anclaje de transición y la primera etapa de transposición con oligonucleótidos alargados que tienen un saliente de tres nucleótidos en el extremo 5'. Como se representa en la Fig. 5A, se proporcionan dos oligonucleótidos alargados ligados que se designan en la presente memoria como producto de alargamiento nº 1 y producto de alargamiento nº 2. El producto de alargamiento nº 1 contiene la primera parte de la molécula de ácido nucleico a fabricar, en comparación con la parte de la molécula de ácido nucleico a fabricar, mientras que el producto de alargamiento nº 2 contiene la segunda parte de la molécula de ácido nucleico a fabricar. El orden de la secuencia se toma desde la cadena superior de la molécula de ácido nucleico bicatenaria respectiva a fabricar, estando el extremo 5' en el lado izquierdo y estando el extremo 3' en el lado derecho (5'\rightarrow3'). En el presente caso, tanto el primer producto de alargamiento como el segundo producto de alargamiento contienen sitios de reconocimiento de dos tipos de enzimas de restricción de tipo IIS diferentes, siendo la enzima de restricción Earn 1104I la primera y siendo la enzima de restricción de tipo IIS adicional Esp3I la segunda enzima de restricción de tipo IIS.

Tras la escisión de tanto el producto de alargamiento nº 1 como del producto de alargamiento nº 2 con Eam1104I, se liberan los productos de alargamiento cortados respectivos (Fig. 5A-5B). Ambos productos de escisión tienen un saliente monocatenario de tres nucleótidos de longitud en el extremo 5'. Se transfieren ambos productos de alargamiento a nuevos recipientes de reacción, donde se añade un oligonucleótido adicional al menos parcialmente bicatenario, en este caso un denominado anclaje de transición. Los anclajes de transición se caracterizan por la propiedad de que comprenden un sitio de reconocimiento de una enzima de restricción de tipo IIS que produce un saliente monocatenario que es diferente en su longitud de su saliente original antes de la escisión. Aparte de esto, la secuencia de reacciones es la misma que en las etapas de alargamiento precedentes.

En el presente caso, los oligonucleótidos adicionales al menos parcialmente bicatenarios se designan también como anclaje de transición nº 1 y anclaje de transición nº 2, que se añaden a dichas dos reacciones independientes. El anclaje de transición nº 1 y el anclaje de transición nº 2 se eligen para aparearse con los salientes de los primer y segundo oligonucleótidos alargados. Ambos anclajes de transición comprenden un sitio de reconocimiento de una enzima de restricción de tipo IIS adicional, en este caso Eco31I (Fig. 5C).

En la siguiente etapa, se liga el primer producto de alargamiento cortado con el correspondiente oligonucleótido de transición (anclaje de transición nº 1) y se liga el segundo producto de alargamiento cortado con el oligonucleótido de transición necesario (anclaje de transición nº 2). Los productos de ligamiento de los mismos (bloque de alargamiento nº 1 y bloque de alargamiento nº 2) (Fig. 5D, E y F) comprenden ahora dos sitios de reconocimiento diferentes de enzimas de restricción de tipo IIS (en el presente caso, Esp3I y Eco31I), que producen salientes de longitud idéntica. Se inmovilizan posteriormente ambos productos de ligamiento en pocillos de reacción separados mediante su modificación contenida en el resto de anclaje de transición (Fig. 5F). Ya que cada uno de los productos de ligamiento comprende una parte de la molécula de ácido nucleico a fabricar, y dichas partes son partes consecutivas de la molécula de ácido nucleico a fabricar, la siguiente etapa de transposición combina dichas dos partes, creando un fragmento mayor de la molécula de ácido nucleico a fabricar. En esta etapa de transposición, se escinde el bloque de alargamiento nº 1 con Eco31I, concretamente, la enzima de restricción de tipo IIS adicional, liberando así un primer bloque de alargamiento cortado que tiene un saliente de cuatro nucleótidos en el extremo 5' (Fig. 5G). Este producto liberado retiene el sitio de reconocimiento de la segunda enzima de restricción de tipo IIS (Esp3I). El bloque de alargamiento nº 2 sigue inmovilizado en la superficie mediante la modificación y se escinde posteriormente con Esp3I (la segunda enzima de restricción de tipo IIS). Mediante esta escisión, se genera un oligonucleótido adicional, más particularmente un segundo bloque de alargamiento cortado que, aparte del segundo oligonucleótido original, comprende todos los nucleótidos que se han generando en las etapas de alargamiento anteriores. La única diferencia es que este bloque de alargamiento cortado comprende ahora un saliente monocatenario de cuatro nucleótidos en el extremo 5' (Fig. 5H). En la etapa final, se combinan el bloque de alargamiento cortado nº 1 y el bloque de alargamiento cortado nº 2 como se generan en las etapas descritas en las Fig. 5G y 5H y se ligan, generando un primer bloque de transposición (Fig. 5I, J).

El bloque de transposición resultante puede someterse a su vez a etapas de transposición adicionales, proporcionando bloques de transposición mayores. Todos los bloques de transposición generados de este modo comprenden sitios de reconocimiento de dos enzimas de restricción de tipo IIS diferentes, que producirán salientes monocatenarios complementarios si los productos de transposición respectivos contienen fragmentos consecutivos de la molécula de ácido nucleico a fabricar. Ha de observarse que los oligonucleótidos de transición pueden contribuir o no con nucleótidos a la molécula de ácido nucleico a fabricar dependiendo del número de nucleótidos distales al sitio de escisión.

La Fig. 6 muestra la adición de anclajes de transición a productos de alargamiento que tienen un saliente monocatenario de una base en el extremo 3'.

Se representan los procedimientos respectivos en las Fig. 6A-6D. Todas las etapas de transposición posteriores son en principio idénticas a las representadas en las Fig. 5E-5J. La diferencia más importante de este procedimiento reside en el hecho de que se usa BfuI como enzima de restricción de tipo IIS adicional, que crea un saliente de un nucleótido en el extremo 3'. Las anclajes de transición tienen que diseñarse en consecuencia para contener un saliente de un nucleótido (como se representa en la Fig. 6C). Como en el ejemplo anterior, las anclajes de transición proporcionan el sitio de reconocimiento de una enzima de restricción de tipo IIS que produce un saliente que es compatible con el producido por la segunda enzima de restricción de tipo IIS (aquí Esp3I).

El método de transposición semiinvertida es una forma particular de la etapa de transposición usada típicamente en el método para la fabricación de una molécula de ácido nucleico según la presente invención. En la Fig. 7A, se proporcionan un primer y segundo bloques de alargamiento. Ha de observarse que, básicamente, el primer bloque de alargamiento puede producirse mediante cualquiera de los métodos dados a conocer en la presente memoria tales como el método de RSPS o el método de RLPS. Sin embargo, está también dentro de la presente invención que dicho primer bloque de alargamiento y dicho segundo bloque de alargamiento, respectivamente, puedan producirse según la descripción para la generación de oligonucleótidos alargados sometidos a etapas de transposición como se describe en la solicitud de patente internacional WO 00/75364 o en la solicitud de patente europea 011 27 864.5.

El primer y segundo bloques de alargamiento se mantienen preferiblemente en diferentes recipientes de reacción tales como pocillos individuales de una placa de pocillos múltiples. Se inmovilizan ambos bloques de alargamiento en una superficie mediante la modificación proporcionada por el resto oligonucleotídico primero o adicional del bloque de alargamiento respectivo. En el presente caso, la enzima de restricción de tipo IIS primera o adicional es Eco31I y la segunda enzima de restricción de tipo IIS es Esp3I (Fig. 7A). Tanto el primer como el segundo bloques de alargamiento se escinden con Esp3I y se lavan posteriormente (Fig. 7B). Debido a este tratamiento, se retiran los restos del segundo oligonucleótido del primer y segundo bloques de alargamiento. Además, tanto el primer como el segundo bloques de alargamiento tienen en el presente caso un saliente de cuatro nucleótidos de longitud en el extremo 5' (Fig. 7B). Se corta posteriormente el producto de escisión resultante de la escisión del primer bloque de alargamiento, que se designa también en la presente memoria como primer bloque de alargamiento cortado, con la primera enzima de restricción de tipo IIS, en este caso Eco31I (Fig. 7C).

El oligonucleótido bicatenario lineal así liberado, una parte de la molécula de ácido nucleico a fabricar, se transfiere posteriormente como parte del sobrenadante de la reacción de escisión respectiva a un recipiente de reacción adicional que contiene el segundo bloque de alargamiento cortado inmovilizado en la superficie del recipiente de reacción mediante la modificación (Fig. 7D). Aquí, la modificación es biotina y la fase sólida estreptavidina. Mediante los salientes complementarios del oligonucleótido transferido lineal al menos parcialmente bicatenario y el segundo bloque de alargamiento cortado inmovilizado, pueden ligarse ambas moléculas según protocolos estándar. El producto de ligamiento comprende a su vez un saliente, en el presente caso un saliente de cuatro nucleótidos de longitud en el extremo 5', que es la base de reacciones de transposición adicionales como se describen en la presente memoria.

Al transferir el oligonucleótido bicatenario lineal liberado desde el primer bloque de alargamiento cortado al segundo producto de alargamiento, se invierte la orientación de este fragmento anterior. Esto asegura que los productos secundarios generados por una escisión incompleta con enzima de restricción en las etapas precedentes no contienen en la mayoría de los casos el saliente complementario necesario para un ligamiento apropiado con el bloque de transposición correcto. Para proporcionar la base de este cambio de orientación, es esencial que en las etapas de alargamiento precedentes la secuencia de cada dos bloques de alargamiento se constituya en orden inverso en comparación con la secuencia de la molécula de ácido nucleico o parte de la misma a fabricar.

La Fig. 8 ilustra la realización del procedimiento de transposición designado en la presente memoria como método de doble selección o ping-pong, respectivamente.

Como se representa en la Fig. 8A, se ligan cuatro productos de alargamiento diferentes en disolución con sus anclajes de transición respectivos (que tienen salientes complementarios). En el presente caso, la modificación de los anclajes de transición es biotina y la modificación unida a los productos de alargamiento es FITC. En reacciones independientes, se ligan los productos de alargamiento con los anclajes de transición. Los productos de ligamiento respectivos son en principio oligonucleótidos ligados adicionales. Sin embargo, por razones de simplificación, se designan en la presente memoria como bloques de alargamiento. Estos bloques de alargamiento se unen entonces a un soporte sólido (Fig. 8B), en el que el primer y tercer bloques de alargamiento se unen a una superficie que interacciona específicamente con FITC, que en el presente caso es un pocillo de una microplaca recubierta con un anticuerpo anti-FITC, mientras que el segundo y cuarto bloques de alargamiento se unen mediante la modificación proporcionada por el resto de anclaje de transición. En el presente caso, la última modificación es biotina y la superficie respectiva es un pocillo de una microplaca recubierto con estreptavidina (Fig. 8B). Los bloques de alargamiento así inmovilizados se lavan entonces y se escinden posteriormente con Eco31I (bloques de alargamiento biotinilados) o Esp3I (bloques de alargamiento marcados con FITC).

En todos los casos, se usan adicionalmente los productos de escisión liberados, mientras que los restos que permanecen inmovilizados en los pocillos se excluyen de reacciones posteriores, puesto que constituyen productos secundarios indeseados. Los bloques de alargamiento cortados así creados se combinan y ligan por pares, preferiblemente en disolución, creando un primer bloque de transposición que de nuevo porta ambas modificaciones ("B" y "F") (Fig. 8D). Estos primeros bloques de transposición se usan entonces para llevar a cabo una etapa de transposición adicional. Como se muestra en la Fig. 8E, se inmovilizan de nuevo los diferentes primeros bloques de transposición en pocillos recubiertos con estreptavidina o anticuerpo anti-FITC de tal manera que cada uno de un par de bloques de transposición adyacentes en el ácido nucleico a fabricar se una a la otra superficie. En contraposición con las reacciones de escisión anteriores, los bloques de transposición unidos a anticuerpo anti-FITC se cortan ahora con Esp3I, mientras que los bloques de transposición unidos a estreptavidina se cortan con Eco31I (Fig. 8F). De nuevo, se llevan los fragmentos de ADN liberados a través de etapas de transposición adicionales, mientras que los bloques de transposición no escindidos permanecen unidos a su soporte sólido respectivo. Sin embargo, todas las transposiciones adicionales pueden producir productos secundarios bicatenarios lineales resultantes de un ligamiento incompleto durante el ciclo anterior (fragmentos 2 y 3 en la Fig. 8F). Al inmovilizar los productos de escisión liberados de una reacción (en este caso, la escisión con Esp3I), puede eliminarse el fragmento 3 (aunque a expensas de una eficacia de ligamiento ligeramente menor con un reactante unido a un soporte sólido). El fragmento 2 se transferiría como producto secundario de la reacción de escisión con Eco31I. Debido a su saliente compatible, puede formar también un producto de ligamiento con el bloque de transposición correcto 3-4F, conduciendo por tanto a la formación del producto secundario 2-3-4F además del intermedio de transposición correcto 1-2-3-4F (Fig. 8F). Tras la escisión con Esp3I y la transferencia de estos dos productos liberados a pocillos recubiertos con estreptavidina, sólo el producto correcto, el intermedio de transposición B1-2-3-4F, puede unirse a la superficie, mientras que el producto secundario 2-3-4F se separa por lavado. De manera análoga, mediante la unión alternada de los intermedios de transposición a soporte sólido recubierto con anticuerpo anti-FITC o estreptavidina, se retira eficazmente de los ciclos posteriores cualquiera de los productos secundarios. Ya que los intermedios van de un lado a otro entre los dos tipos diferentes de soporte sólido, este mecanismo se designa también en la presente memoria como mecanismo de ping-pong.

La Fig. 9 muestra una combinación del procedimiento de doble selección y el método de SIT dado a conocer en la presente memoria. En primer lugar, se inmovilizan todos los bloques de alargamiento mediante una de las dos modificaciones presentes, en el presente caso mediante FITC (F). Entonces, se cortan todos los bloques de alargamiento con la enzima de restricción de tipo IIS cuyo sitio de reconocimiento está contenido en el resto contribuido por el segundo oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario. Esta enzima de restricción de tipo IIS se usa sólo en la primera etapa de transposición (Fig. 9A). En todas las etapas de transposición posteriores, sólo se requiere la enzima de restricción de tipo IIS cuyo sitio de reconocimiento está contenido en el resto proporcionado por el último oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario. En consecuencia, se minimiza la variación de la eficacia de escisión en las etapas de transposición individuales, porque dos enzimas de restricción de tipo IIS diferentes exhiben diferentes eficacias de escisión. Para una máxima estandarización, es por lo tanto favorable usar sólo una enzima.

Después de la primera escisión, se liberan todos los bloques de alargamiento cortados de la superficie a la que se unieron en virtud de la modificación suministrada por el segundo oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario. Los bloques de alargamiento cortados retienen ahora sólo una modificación, concretamente, aquella que estaba contribuida por el último oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario. Se unen entonces todos los bloques de alargamiento cortados a una superficie mediante la modificación restante, en el presente caso biotina. Se escinde entonces una segunda vez cada uno de un par de bloques de alargamiento cortados, esta vez con la enzima de restricción de tipo IIS cuyo sitio de reconocimiento está contenido en el resto contribuido por el último oligonucleótido adicional al menos parcialmente bicatenario. Esto libera fragmentos bicatenarios cortados dos veces lineales que se ligan entonces en orientación inversa con sus bloques de alargamiento inmovilizados cortados una vez respectivos, proporcionando los primeros bloques de transposición (Fig. 9B, lado izquierdo). Para generar los siguientes bloques de transposición mayores, se escinde de nuevo cada uno de un par de bloques de transposición con la enzima de restricción de tipo IIS cuyo sitio de reconocimiento está contenido en el resto contribuido por el último oligonucleótido adicional al menos parcialmente bicatenario, produciendo intermedios de transposición bicatenarios lineales. Estos se ligan de nuevo posteriormente con sus bloques de transposición inmovilizados cortados una vez respectivos (Fig. 9C). Como en todos los procedimientos de SIT, la orientación de los intermedios transferidos se invierte en cada etapa.

La Fig. 10 muestra la disposición de los bloques de alargamiento para transposiciones estándar así como para el método de SIT dado a conocer en la presente memoria.

La Fig. 11 muestra otra realización del procedimiento de SIT, en la que se combinan los bloques de alargamiento con salientes de diferente longitud sin necesidad de anclajes de transición. Aquí, se cortan primero los productos de alargamiento inmovilizados con la enzima de restricción cuyo sitio de reconocimiento estaba contribuido por el segundo oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario, en este caso generando bloques de alargamiento cortados que tienen un saliente de 4 nucleótidos (Fig. 11 A). Estos bloques de alargamiento cortados una vez siguen unidos a la superficie. En la siguiente etapa, se escinde cada uno de un par de bloques de alargamiento cortados con la enzima de restricción de tipo IIS cuyo sitio de reconocimiento está contribuido por el último oligonucleótido adicional al menos parcialmente bicatenario, liberando así fragmentos bicatenarios cortados dos veces lineales con un saliente de 3 nucleótidos en un lado y un saliente de 4 nucleótidos en el otro lado (Fig. 11B). Se ligan estos fragmentos con sus bloques de alargamiento inmovilizados cortados una vez respectivos mediante sus salientes de 4 nucleótidos (Fig. 11C). Los productos de ligamiento resultantes contienen sólo un extremo libre, en el presente caso tienen un saliente de 3 nucleótidos. En etapas posteriores, se escinde cada uno de un par de primeros bloques de transposición complementarios con la enzima de restricción de tipo IIS cuyo sitio de reconocimiento está contribuido por el último oligonucleótido adicional al menos parcialmente bicatenario durante la última etapa de alargamiento. Esto libera bloques de transposición bicatenarios cortados dos veces que poseen salientes de 3 nucleótidos en ambos lados de la molécula. Ya que los salientes con un número impar de nucleótidos no pueden ser nunca autocomplementarios, sólo las parejas de ligamiento pretendidas tienen salientes complementarios de apareamiento perfecto y se seleccionan por tanto para ligamientos adicionales de bloques de transposición mayores.

La Fig. 12 muestra un gel de poliacrilamida que exhibe los productos de reacción y subproductos del método de SPS como se detalla en el documento WO 00/75364 y el método de RLPS según la presente invención. Las condiciones de las reacciones respectivas son fundamentalmente diferentes en los procedimientos anteriores: en el método de SPS según el documento WO 00/75364, se construyen los bloques de alargamiento en la fase sólida, mientras que la presente invención describe la construcción de bloques de alargamiento en la fase líquida, lo que permite seleccionar los oligonucleótidos correctamente alargados. Por tanto, los nucleótidos a añadir en cada etapa no derivan del oligonucleótido ligador cebador de secuenciación no inmovilizado en el método de SPS, sino del anclaje inmovilizado, también designado en la presente memoria como oligonucleótido primero o adicional al menos parcialmente bicatenario en el caso del procedimiento de RLPS. Esta es la razón por la que los productos de reacción pueden compararse sólo indirectamente. La Fig. 12A muestra los oligonucleótidos ligadores cebadores de secuenciación acortados liberados de un alargamiento según el método de SPS. El análisis en gel directo del anclaje alargado no es posible, puesto que está inmovilizado en una superficie y por tanto no disponible como molécula intacta. La presencia del oligonucleótido ligador cebador de secuenciación acortado que ha actuado como donante en el ciclo de ligamiento/restricción no es más que una evidencia indirecta de un ciclo de reacción exitoso. No se observa la formación de productos secundarios hasta que los oligonucleótidos alargados se escinden del oligonucleótido de anclaje, concretamente, el primer oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario, que en este caso actúa sin embargo como aceptor en lugar de como donante. Se analizaron estos productos secundarios, que surgen de la restricción incompleta de los oligonucleótidos de anclaje alargados, escindiendo el oligonucleótido de anclaje alargado de la superficie usando la enzima de restricción de tipo IIS cuyo sitio de reconocimiento está contenido en el oligonucleótido de anclaje (Fig. 12B). La banda de migración más lenta corresponde al producto de alargamiento correcto, mientras que la presencia de bandas de migración más rápida es indicativa de la formación de productos secundarios que no se escindieron en ciclos anteriores con la enzima de restricción de tipo IIS cuyo sitio de reconocimiento está contenido en el oligonucleótido ligador cebador de secuenciación. Al invertir la arquitectura del procedimiento como se describe anteriormente, todos dichos productos secundarios permanecen unidos a la superficie según los procedimientos de RSPS y RLPS según la presente invención. Por tanto, sólo se observan oligonucleótidos correctamente alargados en la Fig. 12C.

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Ejemplo 1 Síntesis en fase sólida inversa

A continuación, se describe con más detalle la síntesis en fase sólida inversa como ya se ha representado en las Fig. 1A-1F y Fig. 2A-2F, respectivamente.

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a) Ligamiento del primer y segundo oligonucleótidos

En un recipiente de reacción, se combinan 20-200 pmol del segundo oligonucleótido, que no está biotinilado sino fosforilado en el extremo 5', contenido en un volumen de 25-200 \mul de 1 x tampón ligasa con 20-200 pmol de un primer oligonucleótido correspondiente al primer oligonucleótido de anclaje (que tiene una modificación de biotina y está fosforilado en el extremo 5') en 25-200 \mul de 1 x tampón ligasa, y se ligan mediante el saliente monocatenario complementario que comprende típicamente 1-5 bases añadiendo 5 U de ADN ligasa T4. Se realiza la reacción de ligamiento a 25ºC durante 15 min en un agitador. Posteriormente, se inactiva térmicamente la ligasa durante 10 min a 65ºC.

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b) Acoplamiento del producto de ligamiento a la matriz

Antes del uso, se rehidratan pocillos recubiertos con estreptavidina tales como placas de 96 pocillos con 200 \mul de 1 x TE/NaCl 1 M, pH 7,5 durante 15 min a 25ºC en un agitador, y se lavan posteriormente dos veces con TE. Se introduce la mezcla de ligamiento preparada en la etapa a) en un pocillo rehidratado y se incuba a 25ºC durante 15 min. Los productos de ligamiento se unen al lado interior del pocillo mediante la base biotinilada del primer oligonucleótido. Posteriormente, se retira el sobrenadante y se lava el pocillo cuatro veces con tampón TE.

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c) Digestión de restricción con enzimas de restricción de tipo IIS

Se añaden 10-300 U de una enzima de restricción tal como Eam1104I o BfuI en 25-200 \mul de 1x tampón de reacción al pocillo de reacción. Se escinde el producto de ligamiento mediante dicha enzima de restricción y se libera el oligonucleótido alargado que tiene un saliente. Se realiza la reacción en un agitador durante 60 min a una temperatura que sea óptima para la enzima de restricción usada, tal como 37ºC. Posteriormente, se inactiva térmicamente la enzima a una temperatura recomendada por el suministrador.

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d) Transferencia del sobrenadante

Se transfiere entonces el sobrenadante de la etapa anterior que incluye el oligonucleótido alargado a un nuevo recipiente de reacción exento de estreptavidina y se combina a una concentración de 20-200 pmol y tampón ligasa con un oligonucleótido adicional que, en el presente caso como se representa en las Fig. 1A-1F, es el segundo oligonucleótido de anclaje.

Se repiten las etapas a)-d) como se describen anteriormente hasta 7 veces con el oligonucleótido alargado.

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Ejemplo 2 Síntesis en fase líquida inversa

A continuación, se describe con más detalle la síntesis en fase líquida inversa como se representa en las Fig. 3A-3E y las Fig. 4A-4E, respectivamente.

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a) Ligamiento del primer y segundo oligonucleótidos

En un recipiente de reacción, se combinan 20-200 pmol del segundo oligonucleótido no biotinilado que está fosforilado en el extremo 5', contenido en 25-200 \mul de 1x tampón ligasa, con 20-200 pmol del primer oligonucleótido contenido en 25-200 \mul de 1x tampón ligasa, en el que el primer oligonucleótido está fosforilado en el extremo 5' y tiene una modificación de biotina que es la modificación necesaria para la inmovilización del primer oligonucleótido en una superficie que está recubierta con estreptavidina. Tras la adición de 5 U de ADN ligasa T4, se ligan el primer y segundo oligonucleótidos mediante sus salientes monocatenarios complementarios que tienen una longitud de 1 a 5 bases. Se realiza el ligamiento a 25ºC durante 15 minutos. En una etapa adicional, se inactiva térmicamente la ligasa calentando la reacción a 65ºC durante 10 minutos.

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b) Digestión de restricción con enzima de restricción de tipo IIS

Se añaden 10-300 U de una enzima de restricción tal como Eam1104I al recipiente que contiene el producto de la reacción de ligamiento. La enzima de restricción es una enzima de restricción de tipo IIS que corta el segundo oligonucleótido alargado del primer oligonucleótido, que se reduce así en longitud en la parte de la molécula de ácido nucleico a transferir al segundo oligonucleótido. El sitio de escisión respectivo está contenido en la secuencia del primer oligonucleótido de anclaje. El tiempo de reacción es de 60 minutos a la temperatura de reacción que sea óptima para la enzima respectiva. Dicha temperatura de reacción es típicamente de 37ºC. Se mantiene la reacción en un agitador. Posteriormente, se inactiva térmicamente la enzima de restricción a una temperatura recomendada por el suministrador.

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c) Acoplamiento del producto de ligamiento digerido a la matriz

Antes de su uso, se rehidratan placas recubiertas con estreptavidina tales como placas de 96 pocillos con 200 \mul de 1x TE/NaCl 1M, pH 7,5 durante 15 minutos a 25ºC en un agitador, y se lavan posteriormente dos veces
con TE.

Se añade posteriormente la reacción de restricción a un pocillo rehidratado y se incuba en un agitador a 25ºC durante 15 minutos. Los primeros oligonucleótidos escindidos en las etapas precedentes y, posiblemente, los productos de ligamiento no escindidos, entre otros, están inmovilizados en la pared interna del pocillo mediante la modificación de biotina del primer oligonucleótido o el primer oligonucleótido acortado.

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d) Transferencia del sobrenadante

Se transfiere posteriormente el sobrenadante de la reacción que contiene el producto de ligamiento alargado cortado a un nuevo recipiente de reacción que no tiene una superficie recubierta con estreptavidina. Se añaden al sobrenadante tampón ligasa y 20-200 pmol del oligonucleótido de anclaje adicional, concretamente, el oligonucleótido adicional al menos parcialmente bicatenario. Se repite esta secuencia de etapas a) a d) preferiblemente hasta 7 veces usando el mismo segundo oligonucleótido o el oligonucleótido alargado que comprende en el extremo una parte creciente de la molécula de ácido nucleico a fabricar.

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Ejemplo 3 Transposición semiinvertida

Como se expone anteriormente, la invención proporciona un método altamente eficaz para la fabricación de una molécula de ácido nucleico que puede dividirse en una primera etapa de alargamiento y, una vez está disponible un producto de alargamiento tal como los oligonucleótidos alargados descritos en la presente memoria, se combinan posteriormente entre sí, designándose también la última etapa como etapa de transposición o procedimiento de transposición. Se describe con más detalle a continuación el método de SIT representado también en las
Fig. 7A-7C.

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a) Retirada del resto del oligonucleótido alargado correspondiente al segundo oligonucleótido

Para cada pocillo, se añaden 10-300 U de una enzima de restricción tal como Esp3I, que es la segunda enzima de restricción de tipo IIS, a dos recipientes de reacción que contienen el primer bloque de alargamiento y el segundo bloque de alargamiento en 25-200 \mul de tampón de reacción, respectivamente. Tanto el sitio de reconocimiento como el sitio de escisión respectivos están contenidos en la secuencia del segundo resto oligonucleotídico del mismo. Tanto el primer como el segundo bloques de alargamiento cortados permanecen inmovilizados en la superficie, ya que la superficie de los recipientes de reacción respectivos o, más preferiblemente, el pocillo recubierto con estreptavidina, interacciona con el grupo biotina. El tiempo de reacción es de aproximadamente 60 minutos a la temperatura que sea óptima para la enzima de restricción de tipo IIS. Los restos del segundo oligonucleótido del primer y segundo bloques de alargamiento se retiran conjuntamente con el sobrenadante global. Posteriormente, se lavan cuatro veces los productos de restricción inmovilizados con tampón TE.

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b) Retirada del primer resto oligonucleotídico al menos parcialmente bicatenario del primer bloque de alargamiento

Se añaden aproximadamente 10-100 U de una enzima de restricción tal como Eco31I contenida en 25-200 \mul de tampón de reacción al pocillo que contiene el primer bloque de alargamiento cortado que escinde el primer resto oligonucleotídico del primer oligonucleótido ligado alargado cortado. El tiempo de reacción es de aproximadamente 60 minutos en un agitador a una temperatura de reacción que sea óptima para la enzima de restricción, tal como 37ºC. Posteriormente, se inactiva térmicamente la enzima, por ejemplo, manteniendo la reacción a 65ºC durante 10 minutos. Se transfiere la molécula de ácido nucleico bicatenaria así liberada conjuntamente con los otros componentes contenidos en el sobrenadante a un pocillo que contiene el resto de molécula de ácido nucleico que es el siguiente resto a seguir en la secuencia de la molécula de ácido nucleico a fabricar. La última molécula de ácido nucleico está unida mediante la modificación de biotina a una superficie tal como la superficie interna de un pocillo.

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c) Etapas de ligamiento

El ligamiento del oligonucleótido bicatenario liberado (etapa b) y el primer bloque de alargamiento cortado (etapa a) ocurre mediante ADN ligasa T4 (5 U) en 50-200 \mul de 1x tampón ligasa contenidos en ATP 0,1 mM, DTT 1 mM. El tiempo de ligamiento es de aproximadamente 60 minutos a 25ºC en un agitador. Posteriormente, se inactiva térmicamente la ligasa a 65ºC durante 10 minutos.

Se repiten los ciclos de reacción a) a b) tan a menudo hasta que todos los bloques de alargamiento y transposición estén combinados formando la molécula de ácido nucleico a fabricar.

Los rasgos de la presente invención dados a conocer en la memoria descriptiva, las reivindicaciones y/o los dibujos pueden ser material, tanto separadamente como en cualquier combinación de los mismos, para verificar la invención en las diversas formas de la misma.

<110> Sloning Biotechnology GmbH

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<120> Método para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

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<130> S 10010 EP

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<140> EP 02023385.4

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<141> 18-10-2002

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<160> 61

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<170> PatentIn versión 3.1

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<210> 1

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<211> 11

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (7) .. (11)

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<223> cualquier nucleótido

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<400> 1

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3

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<210> 2

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<211> 11

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

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<221> misc_feature

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<222> (7) .. (11)

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<223> cualquier nucleótido

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<400> 2

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<210> 3

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<211> 12

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

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<221> misc_feature

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<222> (7) .. (12)

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<223> cualquier nucleótido

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<400> 3

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<210> 4

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<211> 14

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (7) .. (14)

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<223> cualquier nucleótido

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<400> 4

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

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<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7) .. (8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7) .. (8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7) .. (12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7) .. (11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7) .. (17)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7) .. (16)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8) .. (15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7) .. (17)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7) .. (17)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8) .. (11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7) .. (10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7) .. (11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7) .. (11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7) .. (14)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7) .. (12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7) .. (8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7) .. (8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7) .. (11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7) .. (12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7) .. (16)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7) .. (17)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7) .. (17)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cualquier nucleótido

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8) .. (15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido ligador cebador de secuenciación en las Fig. 1A y Fig. 3A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 1. oligonucleótido de anclaje en las Fig. 1A y Fig. 3A

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (19) .. (19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> nucleótido biotinilado

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia que aparece en las Fig. 1B, Fig. 1C, Fig. 1D y Fig. 3B

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> los extremos 5' y 3' están ligados

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (29) .. (29)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> nucleótido biotinilado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia izquierda en la Fig. 1E

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia derecha en las Fig. 1E, Fig. 3C y Fig. 3E

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (16) .. (16)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> nucleótido biotinilado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia izquierda en las Fig. 1F y Fig. 3E

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (19) .. (19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> nucleótido biotinilado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido ligador cebador de secuenciación en las Fig. 2A y Fig. 4A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 1. nucleótido de anclaje en las Fig. 2A y Fig. 4A

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (21) .. (21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> nucleótido biotinilado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia aparece en las Fig. 2B, Fig. 2C, Fig. 2D y Fig. 4B

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (32) .. (32)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> nucleótido biotinilado

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> los extremos 5' y 3' están ligados

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia izquierda en las Fig. 2E, Fig. 2F, Fig. 4C, Fig. 4D y Fig. 4E

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

38

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia derecha en las Fig. 2E, Fig. 4C y Fig. 4D

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (17) .. (17)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> nucleótido biotinilado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 2. oligonucleótido de anclaje en las Fig. 2F y Fig. 4E

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (21) .. (21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> nucleótido biotinilado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia aparece en la Fig. 5A (a la izquierda del texto "producto de alargamiento nº 1")

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (47) .. (47)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> nucleótido biotinilado

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> los extremos 5' y 3' están ligados

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia aparece en la Fig. 5A (izquierda del texto "producto de alargamiento nº 2")

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (47) .. (47)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> nucleótido biotinilado

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> los extremos 5' y 3' están ligados

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia aparece en la Fig. 5B (izquierda del texto "producto de alargamiento cortado nº 1 con saliente de 3 nucleótidos en el extremo 5'") y en la Fig. 5C (secuencia izquierda a la izquierda del texto "transición nº 1")

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia aparece en la Fig. 5B (izquierda del texto "producto de alargamiento cortado nº 2 con saliente de 3 nucleótidos en el extremo 5'") y en la Fig. 5C (secuencia izquierda a la izquierda del texto "transición nº 2")

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia aparece en la Fig. 5C (secuencia derecha a la izquierda del texto "transición nº 1")

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (16) .. (16)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> nucleótido biotinilado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia aparece en la Fig. 5C (secuencia derecha a la izquierda del texto "transición nº 2")

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (16) .. (16)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> nucleótido biotinilado

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia aparece en las Fig. 5D, Fig. 5E, Fig. 5F y Fig. 5G (en cada caso a la izquierda del texto "bloque de alargamiento nº 1")

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (47) .. (47)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> nucleótido biotinilado

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> los extremos 5' y 3' están ligados

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia aparece en las Fig. 5D, Fig. 5E, Fig. 5F, Fig. 7A (en cada caso a la izquierda del texto "bloque de alargamiento nº 2") y en la Fig. 5H (a la derecha del texto "bloque de alargamiento nº 2")

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (47) .. (47)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> nucleótido biotinilado

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> los extremos 5' y 3' están ligados

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia aparece en la Fig. 5G (a la izquierda del texto "bloque de alargamiento cortado con Eco31I"), Fig. 5I (encima del texto "bloque de alargamiento cortado 1"), Fig. 7B y Fig. 7C (en cada caso a la izquierda del texto "bloque de alargamiento cortado nº 1")

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia aparece en la Fig. 5H (a la derecha del texto "anclaje de transición alargado"), Fig. 5I (a la derecha del texto "bloque de alargamiento cortado 1"), Fig. 7B (a la izquierda del texto "bloque de alargamiento cortado nº 2") y Fig. 7D (a la izquierda del texto "bloque de alargamiento cortado nº 2")

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (37) .. (37)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> nucleótido biotinilado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 136

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia aparece en la Fig. 5J

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (67) .. (67)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> nucleótido biotinilado

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> los extremos 5' y 3' están ligados

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 106

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia aparece en la Fig. 6A (a la izquierda del texto "producto de alargamiento nº 1")

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (52) .. (52)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> nucleótido biotinilado

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> los extremos 5' y 3' están ligados

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 106

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia aparece en la Fig. 6A (a la izquierda del texto "producto de alargamiento nº 2")

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (52) .. (52)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> nucleótido biotinilado

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> los extremos 5' y 3' están ligados

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia aparece en la Fig. 6B (a la izquierda del texto "producto de alargamiento cortado nº 1 con saliente de tres nucleótidos en el extremo 5'") y Fig. 6C (secuencia izquierda a la izquierda del texto "transición nº 1")

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia aparece en la Fig. 6C (secuencia izquierda a la izquierda del texto "transición nº 1")

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (13) .. (13)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> nucleótido biotinilado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

55

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia aparece en la Fig. 6B (a la izquierda del texto "producto de alargamiento nº 2 con saliente de 3 nucleótidos en el extremo 5'") y la Fig. C (a la izquierda del texto "transición nº 2")

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia aparece en la Fig. 6C (secuencia derecha a la izquierda del texto "transición nº 2")

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (13) .. (13)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> nucleótido biotinilado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 98

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia aparece en la Fig. 6D (a la izquierda del texto "bloque de alargamiento nº 1")

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (48) .. (48)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> nucleótido biotinilado

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> los extremos 5' y 3' están ligados

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 98

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia aparece en la Fig. 6D (a la izquierda del texto "bloque de alargamiento nº 2")

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (48) .. (48)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> nucleótido biotinilado

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> los extremos 5' y 3' están ligados

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia aparece en la Fig. 7A (a la izquierda del texto "bloque de alargamiento nº 1")

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (47) .. (47)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> nucleótido biotinilado

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> los extremos 5' y 3' están ligados

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) .. (4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> saliente monocatenario no complementado por la cadena complementaria

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5) .. (20)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ácido nucleico bicatenario complementado por la SEC ID Nº 48. La cadena complementaria continúa en su dirección 5' con un saliente de 4 nucleótidos (GCAT)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) .. (4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> saliente monocatenario no complementado por la cadena complementaria

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) .. (4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ácido nucleico bicatenario complementado por la SEC ID Nº 47. La cadena complementaria continúa en su dirección 5' con un saliente de 4 nucleótidos (CAGG)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ácido nucleico para la fabricación de moléculas de ácido nucleico

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia aparece en la Fig. 7D (a la derecha del texto "saliente complementario de la etapa de transposición posterior")

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (57) .. (57)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> nucleótido biotinilado

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> los extremos 5' y 3' están ligados

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

63

Claims

1. Un método para la fabricación de una molécula de ácido nucleico que comprende las etapas de

i) opcionalmente, repetir las etapas f) a h).

2. Un método para la fabricación de una molécula de ácido nucleico que comprende las etapas de

i) opcionalmente, repetir las etapas e) a h).

3. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que el saliente es un saliente 5' o un saliente 3'.

4. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el saliente se selecciona del grupo que comprende un saliente de un nucleótido, un saliente de dos nucleótidos, un saliente de tres nucleótidos, un saliente de cuatro nucleótidos, un saliente de cinco nucleótidos, un saliente de seis nucleótidos y un saliente de siete nucleótidos.

5. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el oligonucleótido alargado se transfiere a un nuevo recipiente de reacción donde se combina con el oligonucleótido adicional.

6. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario comprende una región constante y una región variable, en el que la región constante contiene un sitio de reconocimiento de una enzima de restricción de tipo IIS y la región variable contiene una secuencia de ácido nucleico que corresponde a una parte de la secuencia de ácido nucleico de la molécula de ácido nucleico a fabricar.

7. Un método para la síntesis de una molécula de ácido nucleico que comprende las siguientes etapas:

a) proporcionar un primer oligonucleótido alargado ligado

i): proporcionando un primer oligonucleótido alargado, en el que el primer oligonucleótido alargado es preferiblemente el oligonucleótido alargado según el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6;

ii): proporcionado un segundo oligonucleótido alargado, en el que el segundo oligonucleótido alargado se genera preferiblemente partiendo del producto de ligamiento adicional según el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, cortando el producto de ligamiento adicional con la segunda enzima de restricción de tipo IIS;

b) proporcionar un segundo oligonucleótido alargado ligado,

i): proporcionando un tercer oligonucleótido alargado, en el que el tercer oligonucleótido alargado es el oligonucleótido alargado según el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6;

ii): proporcionando un cuarto oligonucleótido alargado, en el que el cuarto oligonucleótido alargado se genera partiendo del producto de ligamiento adicional según el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, cortando el producto de ligamiento adicional con la segunda enzima de restricción de tipo IIS;