ES2310558T3 - Peptidos tolerogenicos. - Google Patents

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Abstract

Péptido humano tolerogénico, proteína básica de la mielina (MBP) 30-44, que puede unirse a una molécula del MHC de clase I o II sin transformación antigénica adicional, para su utilización en el tratamiento y/o la prevención de la esclerosis múltiple.

Description

Péptidos tolerogénicos.
La presente invención se refiere a un péptido tolerogénico y a su utilización en el tratamiento y/o la prevención de la esclerosis múltiple. La presente invención se refiere también a una composición farmacéutica que comprende una pluralidad de dichos péptidos tolerogénicos.
Antecedentes
En una respuesta inmunitaria adaptativa, los linfocitos T pueden reconocer epítopos internos de un antígeno proteico. Las células presentadoras de antígeno (APC) toman antígenos proteicos y los degradan en fragmentos peptídicos cortos. Un péptido puede unirse a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I o II dentro de la célula y llevarse hasta la superficie celular. Cuando se presenta en la superficie celular junto con una molécula del MHC, el péptido puede reconocerse por una célula T (por medio del receptor de células T (TCR)), en cuyo caso el péptido es un epítopo de célula T.
Los epítopos de células T desempeñan un papel fundamental en la respuesta inmunitaria adaptativa frente a cualquier antígeno, ya sea propio o extraño. El papel fundamental desempeñado por los epítopos de células T en enfermedades de hipersensibilidad (que incluyen alergia, enfermedades autoinmunitarias y rechazo de trasplante) se ha demostrado a través de la utilización de modelos experimentales. Es posible inducir enfermedades inflamatorias o alérgicas mediante inyección de péptidos sintéticos (basados en la estructura de epítopos de células T) en combinación con un adyuvante.
Por el contrario, se ha demostrado que es posible inducir tolerancia inmunológica frente a epítopos peptídicos particulares mediante la administración de epítopos peptídicos en forma soluble. Se ha demostrado que la administración de antígenos peptídicos solubles es un medio eficaz para inhibir la enfermedad en la encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE - un modelo para la esclerosis múltiple (EM)) (Metzler y Wraith (1993) Int. Immunol. 5:1159-1165; Liu y Wraith (1995) Int. Immunol. 7:1255-1263; Anderton y Wraith (1998) Eur. J. Immunol. 28:1251-1261); y modelos experimentales de artritis, diabetes y uveorretinitis (revisado en Anderton y Wraith (1998) tal como anteriormente). También se ha demostrado que ésta es un medio para tratar una enfermedad en curso en EAE (Anderton y Wraith (1998) tal como anteriormente).
La utilización de péptidos tolerogénicos para tratar o prevenir la enfermedad ha atraído una atención considerable. Una razón para esto es que se ha demostrado que ciertos epítopos tolerogénicos pueden regular por disminución respuestas de células T para distintos antígenos dentro del mismo tejido. Este fenómeno, conocido como "supresión transeúnte" significa que debería ser posible inducir tolerancia a más de un epítopo (preferentemente todos los epítopos) dentro de un antígeno dado, y a más de un antígeno para una enfermedad dada, utilizando un péptido tolerogénico particular (Anderton y Wraith (1998) tal como anteriormente). Esto obviaría la necesidad de identificar todos los antígenos patógenos dentro de una enfermedad particular.
Los péptidos son también una opción favorable para el tratamiento debido a su coste relativamente bajo y al hecho de que pueden producirse análogos peptídicos con propiedades inmunológicas alteradas. Los péptidos pueden modificarse por tanto para alterar sus interacciones o bien con MHC o TCR.
Un posible problema de este enfoque es que se ha demostrado que no todos los péptidos que actúan como epítopos de células T pueden inducir tolerancia. El péptido 89-101 proteína básica de la mielina (MBP) es un antígeno inmunodominante tras la inmunización y es también un inmunógeno muy eficaz en cuanto tanto a la sensibilización para la reactividad de células T como a la inducción de EAE. Sin embargo, se ha demostrado que este péptido es ineficaz para inducir tolerancia cuando se administra en disolución (Anderton y Wraith (1998), tal como anterior-
mente).
Se han propuesto varias explicaciones para la jerarquía observada en la capacidad de los epítopos de células T para inducir tolerancia (revisado en Anderton y Wraith (1998) tal como anteriormente). En particular, se ha propuesto que existe una correlación entre la afinidad del péptido por el MHC y tolerogenicidad (Liu y Wraith (1995) tal como anteriormente), pero esto no concuerda con algunas de las observaciones. Por ejemplo, MBP[89-101], que no es tolerogénica, se une a I-A^{s} con una afinidad relativamente alta. Por tanto no es sencillo predecir qué péptidos inducirán tolerancia.
Si existiera una explicación de porqué solamente una proporción de los epítopos peptídicos pueden inducir tolerancia, esto facilitaría la selección de péptidos tolerogénicos útiles en el tratamiento y la prevención de trastornos de hipersensibilidad.
Fragmentos de proteína básica de la mielina (MBP) y su uso para el tratamiento de la esclerosis múltiple (EM) se conocen en la técnica anterior, por ejemplo en los documentos US nº 5.858.980; o WO 00/11027.
Sumario de la invención
La presente invención ha demostrado que si un epítopo peptídico presenta un tamaño apropiado para presentarse por APC inmaduras sin transformación antigénica, éste puede inducir tolerancia inmunológica. La observación de que algunos epítopos de células T son tolerogénicos y otros no pueden inducir tolerancia puede explicarse por tanto por el hecho de que algunos epítopos requieren transformación adicional antes de que puedan presentarse por una molécula del MHC. Estos epítopos que requieren transformación adicional no inducen tolerancia cuando se administran en una forma soluble, a pesar de su capacidad para inducir enfermedad cuando se inyectan en combinación con
adyuvante.
Los epítopos que no requieren transformación adicional pueden inducir tolerancia, y se han denominado "apítopos" (Antigen Processing Independent epiTOPES) en la presente invención.
Este hallazgo proporciona un procedimiento basado en las reglas para la selección de epítopos de células T tolerogénicos que obvia la necesidad de examinar la capacidad tolerogénica de un péptido in vivo. Esto es particularmente ventajoso en el desarrollo de estrategias para tratar o prevenir enfermedades para las que no hay disponible ningún modelo animal. Incluso para enfermedades que presentan un modelo animal, el procedimiento de selección debería hacer más sencillo y seguro el desarrollo de composiciones de inducción de tolerancia, debido a que proporciona un mecanismo mediante el cual la capacidad de inducción de tolerancia de un péptido puede someterse a prueba en células T humanas (antígeno de reconocimiento junto con moléculas del MHC humanas) in vitro, antes de su utilización in vivo.
El procedimiento implica seleccionar un péptido tolerogénico que comprende la etapa que consiste en seleccionar un péptido que puede unirse a una molécula del MHC de clase I o clase II sin transformación adicional.
Por ejemplo, puede que el péptido pueda unirse una molécula del MHC de clase II sin transformación adicional.
En la técnica son conocidos varios procedimientos para seleccionar péptidos que pueden actuar como epítopos de células T para un antígeno dado. Habitualmente, por tanto, se utilizará el procedimiento para seleccionar un péptido tolerogénico a partir de una pluralidad de péptidos comprendiendo cada uno un epítopo de células T.
Con el fin de investigar si un péptido puede unirse a una molécula del MHC de clase I o II sin transformación adicional, puede estudiarse la capacidad del péptido para unirse a moléculas del MHC de clase I o II utilizando un sistema de presentación independiente de la transformación antigénica (APIPS). En una forma de realización preferida, por tanto, el procedimiento comprende las etapas siguientes:
(i)
tratar un APIPS con un péptido; y
(ii)
analizar la unión del péptido a moléculas del MHC de clase I o II dentro del APIPS.
Un péptido seleccionado mediante el procedimiento puede ser útil en el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad. En particular, el péptido puede ser útil en el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad que está mediada por células T autorreactivas. Las reacciones de hipersensibilidad son particularmente susceptibles de tratamiento/prevención utilizando el péptido de la presente invención, por ejemplo alergia, autoinmunidad y rechazo de trasplante.
Los presentes inventores han identificado varios apítopos para la proteína básica de la mielina, que es un autoantígeno en la esclerosis múltiple. En un primer aspecto, por tanto, la presente invención se refiere a un péptido humano tolerogénico, proteína básica de la mielina (MBP) 30-44, útil en el tratamiento y/o la prevención de la esclerosis múltiple.
Se sabe que algunos péptidos pueden inducir tolerancia a otros epítopos del mismo antígeno, e incluso otros epítopos de un antígeno distinto (mediante el fenómeno conocido como supresión transeúnte). Sin embargo, los presentes inventores predicen que con el fin de suprimir de manera adecuada todas las células T autorreactivas, sería ventajoso que se administrara una combinación de diversos apítopos al paciente para tratar/prevenir una esclerosis múltiple. En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una pluralidad de péptidos (incluyendo el péptido según el primer aspecto de la invención), basándose cada péptido en un epítopo de células T.
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Breve descripción de las figuras
La figura 1 muestra un ejemplo típico del perfil cinético de derivado proteico purificado de Mycobacterium tuberculosis (PPD) y MBP en pacientes con esclerosis múltiple (EM) e individuos sanos. Se someten a prueba células mononucleares de sangre periférica (PBMC) aisladas a partir de un paciente (A) con EM y un individuo (B) normal para determinar su capacidad para proliferar en presencia de PPD y MBP completa; el perfil cinético de la respuesta proliferativa frente a MBP se compara con el de PPD de antígeno secundario.
La figura 2 es una tabla que resume las respuestas de PBMC frente a MBP y sus péptidos en pacientes con EM. Se analizan ciertos individuos en tres puntos temporales separados, con un periodo de aproximadamente de 4 a 7 meses entre cada punto temporal.
La figura 3 es una tabla que resume las respuestas de PBMC frente a MBP y péptidos MBP en individuos sanos. Transcurren entre 4 y 7 meses entre cada punto temporal.
La figura 4 muestra un ejemplo de un paciente con EM (EM 49) que responde a múltiples péptidos en 2 puntos temporales diferentes, pero para el que el perfil de reconocimiento durante el segundo punto temporal, medido 4 meses más tarde, difiere significativamente. Se cultivaron PBMC en presencia de MBP y un panel de péptidos que comprende la longitud completa de MBP, y se midió la proliferación mediante la captación de 3H-timidina. La amplia respuesta proliferativa de células T observada en el primer punto temporal fue significativamente diferente a la respuesta medida 7 meses más tarde (segundo punto temporal).
La figura 5 muestra un ejemplo de un paciente cuya amplia respuesta de epítopo (primer punto temporal) remite (segundo punto temporal) y reaparece a lo largo de un periodo de doce meses (tercer punto temporal).
La figura 6 muestra un mapa de la especificidad fina de las regiones peptídicas identificadas en el ensayo de respuesta cinética que se obtiene a través de la utilización de TCC generado a partir de pacientes con EM e individuos sanos. La mayoría de los péptidos utilizados en ensayos de selección presentan 15 meros de longitud, sin embargo pocos presentan 10 meros y 1 péptido presenta 17 meros. Se somete a prueba la especificidad de cada TCC al menos dos veces.
La figura 7a es una tabla que muestra la caracterización de epítopos de células T dentro de una proteína básica de la mielina reconocida por linfocitos T de pacientes con EM.
La figura 7b es una tabla que muestra que todos los epítopos de células T no se presentan necesariamente por APC fijadas y por tanto no apítopos.
Las figuras 8 y 9 muestran la presentación de diversos péptidos MBP a clones de células T por APC fijadas y vivas. Figura 8A - 30-44, figura 8B - 110-124, figura 9A -130- 144, figura 9B - 156-170.
La figura 10 es una tabla que muestra valores de índice de estimulación (IE) pico para MBP y péptidos MBP en pacientes con EM obtenidos en tres puntos temporales separados. Las muestras para el segundo punto temporal se recogieron 4-8 meses tras el 1^{er} punto temporal, y las muestras para el 3^{er} punto temporal se obtuvieron 3-5 meses tras el segundo punto temporal. Se midió cpm de fondo para cada día y variaba entre 80-700 cpm; una respuesta positiva (negrita) se definió según IE>3 y \deltacpm>1000. (No fue posible recoger muestras para los tres puntos temporales de los pacientes EM 19 y EM 67).
La figura 11 es una tabla que muestra valores de índice de estimulación (IE) pico para MBP y péptidos MBP en individuos sanos. Se midió cpm de fondo para cada día y variaba entre 80-700 cpm; una respuesta positiva (negrita) se definió según IE>3 y dcpm> 1000.
La figura 12 muestra la respuesta de células T aisladas a partir de un ratón transgénico DR2:MBP82-100 frente a la presentación de péptidos MBP anidados en la región 77-100 por APC.
La figura 13 muestra la respuesta del clon de células T MS17:A3 frente a la presentación de péptidos MBP anidados en la región 125-148 por APC.
La figura 14 es una ilustración del reconocimiento de epítopos de células T dentro de la secuencia 89-101 de MBP. Hay tres epítopos de células T distintos pero solapantes dentro de la secuencia: 89-94, 92-98 y 95-101. Se muestra el potencial para la escisión entre los residuos 94 y 95 mediante la acción de asparaginil endopeptidasa (AEP).
La figura 15 muestra la capacidad de los péptidos MBP 87-96 (A) y 89-101 (B) para actuar como un apítopo para células T que responden frente al epítopo 89-94.
Descripción detallada de la invención
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un péptido humano tolerogénico, proteína básica de la mielina (MBP) 30-44.
Tolerancia
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "tolerogénico" significa que puede de inducir tolerancia.
La tolerancia es la falta de respuesta frente a un antígeno. La tolerancia a antígenos propios es una característica esencial del sistema inmunitario, cuando se pierde, puede dar como resultado una enfermedad autoinmunitaria. El sistema inmunitario adaptativo debe mantener la capacidad para responder frente a una enorme variedad de agentes infecciosos mientras que evita un ataque autoinmunitario de los antígenos propios contenidos dentro de sus propios tejidos. Esto se controla en gran medida por la sensibilidad de los linfocitos T inmaduros frente a la muerte celular apoptótica en el timo (tolerancia central). Sin embargo, no se detectan todos los antígenos propios en el timo, de modo que la muerte de timocitos autorreactivos permanece incompleta. Por tanto, existen también mecanismos mediante lo que puede adquirirse tolerancia por linfocitos T autorreactivos maduros en los tejidos periféricos (tolerancia periférica). Una revisión de los mecanismos de tolerancia central y periférica se facilita en Anderton et al (1999) (Immunological Reviews 169:123-137).
La tolerancia puede resultar de o caracterizarse por la inducción de una energía en al menos una parte de las células T CD4+. Con el fin de activar una célula T, un péptido debe asociarse con una APC "profesional" que pueda suministrar dos señales frente a células T. La primera señal (señal 1) se suministra por el complejo MHC-péptido sobre la superficie celular de la APC y se recibe por la célula T por medio del TCR. La segunda señal (señal 2) se suministra por moléculas coestimuladoras sobre la superficie de la APC, tal como CD80 y CD86, y se recibe por CD28 sobre la superficie de la célula T. Se cree que cuando una célula T recibe la señal 1 en ausencia de señal 2, no se activa y, de hecho, se vuelve anérgica. Las células T anérgicas no responden a una exposición antigénica posterior, y puede que puedan suprimir otras respuestas inmunitarias. Se cree que las células T anérgicas están implicadas en la mediación de la tolerancia de células T.
Sin desear limitarse por la teoría, los presentes inventores predicen que los péptidos que requieren una transformación antes de que puedan presentarse junto con moléculas del MHC no inducen tolerancia porque tienen que tratarse por células presentadoras de antígeno maduras. Las células presentadoras de antígeno maduras (tales como macrófagos, células B y células dendríticas) pueden realizar una transformación antigénica, pero también suministrar tanto señales 1 como 2 a una célula T, conduciendo a la activación de células T. Por otro lado, los apítopos podrán unirse a MHC de clase II en APC inmadura. Por tanto se presentarán a las células T sin coestimulación, conduciendo a tolerancia y anergia de células T.
Por supuesto, apítopos también pueden unirse a moléculas del MHC en la superficie celular de APC madura. Sin embargo, el sistema inmunitario contiene una mayor abundancia de APC inmadura que madura (se ha sugerido que menos del 10% de células dendríticas están activadas, Summers et al. (2001) Am. J. Pathol. 159: 285-295). La posición por defecto para un apítopo será por tanto de anergia/tolerancia, en lugar de activación.
Se ha demostrado que, cuando la tolerancia se induce por inhalación de péptido, la capacidad de las células T CD4+ específicas de antígeno para proliferar se ve reducida. También, la producción de IL-2, la producción de IL-4 y IFN-\gamma por estas células se regula por disminución, pero la producción de IL-10 se aumenta. Se ha demostrado que la neutralización de IL-10 en ratones en un estado de tolerancia inducida por péptido restablece por completo la propensión a enfermedad. Se ha propuesto que una población de células reguladoras persiste en el estado tolerante que produce IL-10 y media la regulación inmunitaria (Burkhart et al (1999) Int. Immunol. 11: 1625-1634).
La inducción de tolerancia puede monitorizarse por tanto mediante diversas técnicas incluyendo:
(a)
la propensión reducida a contraer la enfermedad para la que el péptido es un epítopo diana in vivo;
(b)
la inducción de anergia en células T CD4+ (que pueden detectarse mediante exposición posterior con antígeno in vitro);
(c)
cambios en la población de células T CD4+, incluyendo
(i)
reducción en la proliferación;
(ii)
regulación por disminución en la producción de IL-2, IFN-\gamma e IL-4; y
(iii)
aumento en la producción de IL-10.
Epítopos independientes de la transformación antigénica (APÍTOPOS)
Los péptidos de la presente invención se seleccionaron porque se predice que son tolerogénicos mediante un procedimiento que comprende la etapa que consiste en seleccionar un péptido que puede unirse a una proteína del MHC de clase I o II sin transformación adicional. Tales péptidos se conocen en la presente memoria como "apítopos" (Antigen Independent epiTOPES).
La presentación en la superficie celular de péptidos derivados de un antígeno dado no es aleatoria y tiende a estar dominada por un pequeño número de epítopos que aparecen frecuentemente. La dominancia de un péptido particular dependerá de muchos factores, tales como la afinidad relativa para unirse a la molécula del MHC, punto espacio-temporal de la generación dentro de la APC y resistencia a la degradación. La jerarquía de epítopo para un antígeno puede cambiar con la progresión de una respuesta inmunitaria, que presenta importantes implicaciones para la autotolerancia y autoinmunidad. Es probable que las regiones dominantes inmunodominantes sean buenas tolerógenas. Por tanto, en una forma de realización preferida, el apítopo de la presente invención se basa en un epítopo dominante.
Sin embargo, tras una respuesta inmunitaria primaria frente a los péptidos inmunodominantes, la "propagación" de los epítopos puede producirse hasta determinantes subdominantes (Lehmann et al (1992) Nature 358:155-157). La presentación de epítopos subdominantes puede ser importante para provocar la autoinmunidad. El apítopo de la presente invención puede basarse por tanto en un epítopo subdominante.
Para cualquier antígeno dado puede existir también epítopos crípticos. Los epítopos crípticos son los que pueden estimular una respuesta de células T cuando se administran como un péptido pero que no producen una respuesta de este tipo cuando se administran como un antígeno completo. Puede que durante la transformación del antígeno en péptidos en la APC se destruya el epítopo críptico. Los presentes inventores han demostrado que el péptido 92-98 es un epítopo críptico para MBP (ejemplo 2C). De manera interesante existe un supuesto sitio de escisión para la asparaginil endopeptidasa dentro de esta región peptídica, lo que puede significar que durante la transformación natural no se genera por la APC ningún péptido que contiene esta región.
Un epítopo críptico puede actuar como un apítopo in vitro, porque puede que pueda unirse a una molécula del MHC sin transformación adicional, e inducir anergia en una célula T que reconoce el epítopo críptico. Sin embargo, sería poco probable que un apítopo de este tipo fuera terapéuticamente útil porque debería no poder tolerar las células T que reconocen un epítopo transformado de manera natural del antígeno.
Los epítopos para un antígeno pueden identificarse midiendo la respuesta de células T frente a los péptidos solapantes que comprenden todo el antígeno (véase a continuación) cuando se presenta por APC. Tales estudios dan como resultado habitualmente "conjuntos anidados" de péptidos, y el epítopo mínimo para un clon/una línea de células T puede evaluarse midiendo la respuesta frente a péptidos truncados.
No puede asumirse que un epítopo mínimo de un antígeno se comportará como un apítopo. Posiblemente se requerirán aminoácidos que flanquean el epítopo mínimo para la unión óptima al MHC. El apítopo debe concebirse para comprender la posibilidad de que puedan existir ligeras diferencias entre los epítopos mínimos de diferentes clones de células T.
Debe enfatizarse la posibilidad de que no sea posible identificar un apítopo para todos los epítopos. Existe una clara evidencia de que algunos epítopos se unen al MHC de un modo que depende de la carga del MHC en endosomas y por tanto requieren transformación (Viner et al (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92:2214-2218). Esto es otra razón de porqué no puede asumirse que cada epítopo mínimo se comportará inevitablemente como un apítopo.
Identificación de péptidos que contienen epítopos de células T
Existen varios procedimientos conocidos en la técnica para identificar los epítopos de células T dentro de un antígeno dado.
Pueden identificarse epítopos transformados de manera natural mediante análisis de espectrofotometría de masas de péptidos eluidos a partir de APC cargada con antígeno. Existen APC que o bien se han estimulado para captar antígeno, o bien se han forzado para producir la proteína de manera intracelular mediante transformación con el gen apropiado. Normalmente las APC se incuban con proteína o bien en disolución o bien dirigidas de manera adecuada a la superficie celular de APC. Tras la incubación a 37ºC se lisan las células en detergente y se purifica la proteína de clase II mediante, por ejemplo cromatografía de afinidad. El tratamiento del MHC purificado con un medio químico adecuado (por ejemplo, condiciones ácidas) da como resultado la elución de péptidos a partir del MHC. Se separa este conjunto de péptidos y se compara el perfil con el péptido de APC control tratada del mismo modo. Se analizan (por ejemplo mediante espectrometría de masas) los picos únicos para las células alimentadas/que expresan proteína y se identifican los fragmentos peptídicos. Este procedimiento genera habitualmente información sobre la gama de péptidos (habitualmente encontrados en "conjuntos anidados") generados a partir de un antígeno particular mediante transformación antigénica.
Otro procedimiento para identificar epítopos es examinar una biblioteca sintética de péptidos que solapan y comprenden la longitud del antígeno en un ensayo in vitro. Por ejemplo, pueden utilizarse péptidos que tienen 15 aminoácidos de longitud y que solapan en 5 ó 10 aminoácidos. Se someten a prueba los péptidos en un sistema de presentación de antígeno que comprende células presentadoras de antígeno y células T. Por ejemplo, el sistema de presentación de antígeno puede ser una preparación de esplenocitos de ratón, una preparación de células humanas de amígdala o PBMC.
De manera alternativa, el sistema de presentación de antígeno puede comprender un clon/una línea de células T particular y/o un tipo de células presentadoras de antígeno particular.
Puede medirse la activación de células T mediante la proliferación de células T (por ejemplo utilizando incorporación de ^{3}H-timidina) o producción de citocinas. La activación de células T CD4+ de tipo TH1 puede detectarse por ejemplo mediante la producción de IFN\gamma que puede detectarse mediante técnicas convencionales, tales como un ensayo ELISPOT.
Los estudios de péptidos solapantes indican habitualmente la zona del antígeno en la que se sitúa un epítopo. El epítopo mínimo para una célula T particular puede evaluarse entonces midiendo la respuesta frente a péptidos truncados. Por ejemplo si se obtiene una respuesta frente al péptido que comprende los residuos 1-15 en la biblioteca solapante, pueden utilizarse conjuntos que están truncados en ambos extremos (es decir, 1-14, 1-13, 1-12 etc. y 2-15, 3-15, 4-15 etc.) para identificar el epítopo mínimo.
Los presentes inventores predicen que la identificación de regiones inmunodominantes de un antígeno utilizando ensayos in vitro (especialmente los que utilizan líneas de células T) presenta un patrón sesgado de reactividad peptídica. En el estudio para identificar epítopos de MBP que se describe en los ejemplos, se utiliza un ensayo de respuesta cinética en el que se mide la proliferación de PBMC de pacientes con EM e individuos sanos frente a una biblioteca de péptidos solapantes. Este ensayo se basa en el hallazgo de que, aunque las células T de individuos normales y pacientes con EM responden de una manera similar frente a antígeno proteico purificado, responden de un modo diferente frente a péptidos basados en la secuencia de MBP. Las células Tde pacientes con EM responden con una mayor magnitud y cinética más rápida frente a antígenos peptídicos en comparación con donantes sanos normales. Esto permite la selección e identificación del epítopo frente al que responde el paciente particular en un momento particular. En el estudio descrito en la presente memoria, este enfoque ha revelado varias regiones que contienen epítopo que no se identificaron utilizando técnicas convencionales. Además se muestra que el reconocimiento de células T muestra un patrón cíclico, apareciendo en un punto temporal, remitiendo y reapareciendo posteriormente en una fecha posterior.
El ensayo cinético descrito por los inventores proporciona una herramienta valiosa porque revela el epítopo al que está respondiendo un paciente en un momento particular. Esta información puede utilizarse para confeccionar un enfoque de administración de apítopo terapéutico para un paciente particular identificando y administrando un apítopo para el epítopo relevante (si existe uno). Esta información puede permitir también preparar un patrón general para la progresión de enfermedad, de modo que puede concebirse la composición terapéutica para incluir apítopos para los epítopos que es probable que estén presentes en una fase dada durante la enfermedad.
Sistemas de presentación independiente de la transformación antigénica (APIPS)
Una vez se ha identificado un epítopo, la siguiente etapa es investigar si también se comporta como un apítopo.
Un apítopo debe presentarse a las células T sin necesidad de transformación antigénica. Teniendo péptidos identificados que contienen epítopos de células T, pueden identificarse apítopos utilizando un sistema libre de transformación. Pueden someterse a prueba péptidos truncados y análogos de péptido para determinar la activación utilizando un sistema de presentación independiente de transformación antigénica (APIPS).
Los ejemplos de APIPS incluyen:
a)
APC fijada (con o sin anticuerpos frente a CD28);
b)
membranas lipídicas que contienen moléculas del MHC de clase I o II (con o sin anticuerpos frente a CD28); y
c)
MHC recombinante o natural purificado en forma unida a placa (con o sin anticuerpos frente a CD28).
Se conoce el uso de APC fijada para investigar las respuestas de células T, por ejemplo en estudios para investigar el epítopo mínimo dentro de un polipéptido, midiendo la respuesta frente a péptidos truncados (Fairchild et al (1996) Int. Immunol. 8: 1035-1043). Las APC pueden fijarse utilizando, por ejemplo formaldehído (habitualmente paraformaldehído) o glutaraldehído.
Pueden prepararse membranas lipídicas (que pueden ser membranas planas o liposomas) utilizando lípidos artificiales o pueden ser fracciones de microsoma/membrana plasmática de APC.
En su utilización, el APIPS puede aplicarse a los pocillos de una placa de cultivo de tejidos. Entonces se añaden los antígenos peptídicos y se detecta la unión del péptido a la parte del MHC del APIPS mediante la adición de clones o líneas de células T seleccionados. La activación del clon o la línea de células T puede medirse mediante cualquiera de los procedimientos conocidos en la materia, por ejemplo mediante la incorporación de ^{3}H-timidina o la secreción de citocinas.
Péptidos
El primer aspecto de la invención se refiere a un péptido.
La presente invención proporciona un péptido tolerogénico, proteína básica de la mielina (MBP) 30-44, que puede unirse a una molécula del MHC de clase I o II sin transformación de antígeno adicional, para su utilización en el tratamiento y/o la prevención de la esclerosis múltiple.
El término "péptido" se utiliza en el sentido normal para referirse a una serie de residuos, normalmente L-aminoácidos, conectados entre sí normalmente mediante enlaces peptídicos entre los grupos \alpha-amino y carboxilo de aminoácidos adyacentes.
El péptido de la presente invención puede prepararse utilizando procedimientos químicos (Peptide Chemistry, A practical Textbook. Mikos Bodansky, Springer-Verlag, Berlín.). Por ejemplo, pueden sintetizarse péptidos mediante técnicas en fase sólida (Roberge JY et al (1995) Science 269: 202-204), escindirse de la resina y purificarse mediante cromatografía líquida de alta resolución preparativa (por ejemplo, Creighton (1983) Proteins Structures and Molecular Principles, WH Freeman y Co, Nueva York NY). La síntesis automatizada puede lograrse, por ejemplo, utilizando el sintetizador de péptidos ABI 43 1 A (Perkin Elmer) según las instrucciones proporcionadas por el fabricante.
El péptido puede prepararse de manera alternativa mediante medios recombinantes, o mediante escisión de un polipéptido más largo. Por ejemplo, el péptido puede obtenerse mediante escisión del antígeno diana. La composición de un péptido puede confirmarse mediante análisis o secuenciación de aminoácidos (por ejemplo, el procedimiento de degradación de Edman).
El péptido de la invención puede derivarse de la proteína básica de la mielina (MBP), un antígeno diana.
Un antígeno diana es una molécula (por ejemplo una proteína o glicoproteína) que se transforma por APC y se reconoce por las células T durante el transcurso de la enfermedad. El antígeno diana dependerá, por supuesto, de la enfermedad diana. Puede que un péptido pueda derivarse de un fragmento del antígeno que se produce mediante la transformación natural del antígeno por una APC.
Para fines prácticos, existen otras características diversas que el péptido debe mostrar. Por ejemplo, el péptido debe ser soluble a una concentración que permite su utilización in vivo. Preferentemente el péptido debe ser soluble a concentraciones de hasta 0,5 mg/ml, más preferentemente el péptido debe ser soluble a concentraciones de hasta 1 mg/ml, lo más preferentemente el péptido debe ser soluble a concentraciones de hasta 5 mg/ml.
Para administración intranasal el volumen máximo de dosis que puede tomarse utilizando los procedimientos actuales es de aproximadamente 200 \mul por fosa nasal. Si el péptido es soluble a 1 mg/ml, una dosis doble en cada fosa nasal permite administrar 800 \mug al paciente. No es habitual administrar más de 5 mg en ninguna dosis individual.
También es importante que el péptido sea suficientemente estable in vivo para ser terapéuticamente útil. Los presentes inventores han descubierto que in vivo, 30 minutos tras la administración la cantidad total de un péptido de prueba desciende hasta aproximadamente el 50%, 4 horas tras la administración la cantidad desciende hasta aproximadamente el 30%, pero que tras 5 días el péptido es todavía detectable (aproximadamente al 5%). La semivida del péptido in vivo debe ser de por lo menos 10 minutos, preferentemente de por lo menos 30 minutos, más preferentemente de por lo menos 4 horas, más preferentemente de por lo menos 24 horas.
Los presentes inventores han descubierto que tras la administración intranasal, la cantidad de péptido en el ganglio linfático de drenaje alcanza el pico aproximadamente a las 4 horas tras la administración, sin embargo todavía puede detectarse el péptido (a niveles de aproximadamente el 5% como máximo) tras 5 días. Preferentemente el péptido es suficientemente estable para estar presente a una concentración terapéuticamente activa en el ganglio linfático de drenaje durante el tiempo suficiente para ejercer un efecto terapéutico.
El péptido debe mostrar también una buena biodisponibilidad in vivo. El péptido debe mantener una conformación in vivo que le permita unirse a una molécula del MHC en la superficie celular sin el debido impedimento.
Enfermedades diana
El péptido del primer aspecto de la invención es para su utilización en el tratamiento y/o la prevención de la esclerosis múltiple.
Es probable que un apítopo para el MHC de clase II sea particularmente útil en enfermedades que están mediadas por respuestas de células T CD4+. Por ejemplo, las enfermedades que se demuestran o mantienen mediante una respuesta de células T CD4+ inapropiada o excesiva. Esto incluye enfermedades autoinmunitarias tales como la esclerosis múltiple (EM).
La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad inflamatoria crónica caracterizada por múltiples lesiones desmielinizantes a lo largo de la sustancia blanca del SNC y que se producen en diversos sitios y momentos (McFarlin y McFarland, 1982 New England J. Medicine 307:1183-1188 y 1246-1251). Se cree que la EM está mediada por células T autorreactivas.
El péptido puede derivarse de una de proteína básica de la mielina (MBP) autoantigénica. Posiblemente la MBP es más apropiada que la proteína proteolipídica (PLP), porque PLP es altamente hidrófoba y los péptidos derivados de ella tienden a amontonarse. La MBP es inmonogénica y los linfocitos T específicos de MBP presentan actividad encefalitogénica en animales (Segal et al., 1994 J. Neuroimmunol. 51:7-19; Voskuhl et al., 1993 J. Neuroimmunol 42:187-192; Zamvil et al., 1985 Nature 317:355-8).
Pueden utilizarse apítopos para el MHC de clase I, por ejemplo, para modificar respuestas de CD8+ antivirales de una manera tolerogénica.
Composición farmacéutica
Los presentes inventores predicen que, a pesar de la "supresión transeúnte" puede ser necesario seleccionar como diana un número diferente de clones de células T para inducir tolerancia de manera eficaz. Por tanto, puede administrarse una pluralidad de péptidos a un individuo con el fin de prevenir o tratar una enfermedad.
En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende una pluralidad de apítopos, incluyendo el péptido del primer aspecto de la invención.
La composición farmacéutica puede comprender, por ejemplo entre 2 y 50 apítopos, preferentemente entre 2 y 15 apítopos.
La composición farmacéutica puede comprender uno o más de los péptidos MBP que los presentes inventores han demostrado que actúan como apítopos, que incluyen los siguientes péptidos: 80-94, 83-99, 81-95, 82-96, 83-97, 84-98, 110-124, 130-144, 131-145, 132-146 y 133-147.
La composición farmacéutica puede estar en forma de kit, en el que se proporcionan algunos o cada uno de los apítopos por separado para la administración simultánea, por separado o secuencial.
De manera alternativa (o además) si la composición farmacéutica (o cualquier parte de la misma) va a administrarse en múltiples dosis, cada dosis debe envasarse por separado.
La composición farmacéutica puede comprender una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz del o cada apítopo y opcionalmente un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.
También, en las composiciones farmacéuticas de la presente invención, el o cada apítopo puede combinarse con cualquier aglutinante(s), lubricante(s), agente(s) de suspensión, agente(s) de recubrimiento o agente(s) de solubilización adecuado.
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Administración
El péptido debe administrarse en forma soluble en ausencia de adyuvante.
Preferentemente el péptido se administra por vía mucosa.
Los estudios han demostrado que el péptido, cuando se administra en forma soluble por vía intraperitoneal (i.p.), por vía intravenosa (i.v.) o por vía intranasal (i.n.) o por vía oral puede inducir tolerancia de células T (Anderton y Wraith (1998) tal como anteriormente; Liu y Wraith (1995) tal como anteriormente; Metzler y Wraith (1999) Immunology 97:257-263).
Preferentemente el péptido se administra por vía intranasal.
Los estudios en ratones han demostrado que la duración de la administración de péptido requerida para inducir tolerancia depende de la frecuencia de precursor de las células T en el receptor (Burkhart et al (1999) tal como anteriormente). En muchos estudios experimentales, se ha demostrado que se requieren dosis repetidas de péptido para inducir tolerancia (Burkhart et al (1999) tal como anteriormente). Por tanto la dosis exacta y el número de dosis dependerán del individuo, sin embargo, en una realización preferida se administra una pluralidad de
dosis.
Si se administra una pluralidad de péptidos simultáneamente, pueden estar en forma de un "cóctel" que es adecuado para la administración en dosis únicas o múltiples. De manera alternativa puede resultar preferido administrar dosis múltiples pero variar las concentraciones relativas de los péptidos entre dosis.
En una forma de realización preferida puede seguirse un protocolo de "escalada de dosis", en el que se administra una pluralidad de dosis a un paciente en concentraciones ascendentes. Se ha utilizado un enfoque de este tipo, por ejemplo, para los péptidos de fosfolipasa A2 en aplicaciones inmunoterapéuticas contra la alergia al veneno de abeja (Müller et al (1998) J. Allergy Clin Immunol. 101:747-754 y Akdis et al (1998) J. Clin. Invest. 102:98-106).
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Ejemplos
Los siguientes ejemplos se proporcionan a título ilustrativo y no limitativo de la presente invención. La invención hace particularmente referencia a las formas de realización específicas descritas en estos ejemplos.
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Ejemplo 1
Identificación de epítopos de células T en MBP Materiales y Procedimientos Antígenos
Se prepara MBP humana a partir de la sustancia blanca del cerebro tal como se describe por Deibler et al. (Deibler et al., 1972 Preparative Biochemistry 2:139), y se evalúa su pureza mediante SDS-PAGE. Se usan MBP y derivado proteico purificado (PPD) de Mycobacterium tuberculosis (UK Central Veterinary Laboratory, Surrey) en ensayos proliferativos a concentraciones óptimas determinadas previamente; la concentración óptima para cada antígeno es de 50 \mug/ml. Se sintetiza un panel de péptidos solapantes de 15 meros que abarca toda la molécula de MBP utilizando la química F-moc convencional en un sintetizador de péptidos múltiple Abimed AMS 422 (Abimed, Langenfeld, Alemania). Cada péptido se desplaza en 5 aa y solapa en 10 aa. Se producen 33 péptidos que se reúnen en grupos de 3 y se someten a prueba los conjuntos a la concentración óptima de 50 \mug/ml, de modo que in vitro cada péptido está presente a una concentración de 16,6 \mug/ml.
Pacientes y sujetos control
Los sujetos de este estudio consisten en 12 pacientes con EM confirmada clínicamente o confirmada con apoyo del laboratorio (Poser et al., 1983), con un intervalo de edades de 29-51 años. Ocho de los 12 pacientes están implicados en un ensayo de interferón-\beta, en cambio todos los demás pacientes con EM no han recibido tratamiento de corticosteroides durante al menos 3 meses antes del comienzo del estudio. El grupo control consistía en 13 individuos sanos con un intervalo de edades de 25-55 años, y ninguna había recibido tratamiento inmunosupresor durante al menos 3 meses antes de obtenerse la muestra de sangre.
Medio de cultivo de tejidos
Se utiliza medio RPMI-1640 complementado con HEPES 20 mM (Sigma, Poole, UK), penicilina (100 U/ml), sulfato de estreptomicina (100 mg/ml) y L-glutamina 4 mM (todos de Life Technologies, Paisley, Escocia), como medio de cultivo de tejidos. Se utiliza medio sin suero para lavar los linfocitos y TCL. Para todos los ensayos y las condiciones de cultivo, se complementa el medio con plasma autólogo inactivado por calor al 10%.
Condiciones de cultivo y ensayos proliferativos de células T
Se extrae sangre periférica citrada (50-100 ml) mediante punción venosa de cada sujeto después de obtenerse el consentimiento informado por escrito. Se aíslan células mononucleares de sangre periférica (PBMC) a partir de la sangre mediante centrifugación por densidad en Histopaque-1077 (Sigma, Poole, UK), y se cultivan en volúmenes de 1,5 ml en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos (Nunc International, Costar, Coming Inc. Nueva York, US) a una concentración de 1 x 10^{6} células por ml, que contienen o bien PPD, MBP o bien péptidos de MBP. Se incuban las placas a 37ºC en una atmósfera humidificada del 5% de CO_{2}/95% de aire. Entre los días 5 y 14 se retiran alícuotas por duplicado de 100 \mul de cada cultivo, se transfieren para una placa de microtitulación de fondo redondo de 96 pocillos y se someten a pulsos con 0,4 \muCi de [^{3}H]-Timidina (Amersham International, Amersham, UK). Tras 18 horas se recogen las células en placas de fibra de vidrio (LKB-Wallac, Turku, Finland) utilizando un colector 96 Mach 111 (Tomtec, Orange, Nueva Jersey, US). Se determina la incorporación de [^{3}H]-timidina utilizando un contador de centelleo líquido Microbeta (LKB-Wallac). Los pocillos de prueba que contienen antígeno se consideran positivos cuando el \deltacpm >1000 y el índice de estimulación (IE) > 3, cuando IE = CPM del cultivo que contiene antígeno/CPM del cultivo sin antígeno.
Generación de líneas de células T y clones de células T
Se generan líneas de células T (TCL) específicas para MBP de 8 pacientes con EM y 2 donantes control sanos. Se separan PBMC de cada sujeto tal como se describió anteriormente y se siembran en placa a 1 x 10^{6} células/ml en placas de 6 pocillos en presencia de MBP (50 \mug/ml); se congela regularmente una parte de las PBMC de cada sujeto y se almacena para reestimulaciones posteriores. Siete días después se alimentan las células con medio reciente que contiene IL-2 al 2% (Lymphocult-HT; Biotest LTD., Birmingham, UK), y en el día 12 de cultivo se reestimulan todas las células con antígeno, IL-2 y PBMC autólogas irradiadas (2500 Rad) como una fuente de células presentadoras de antígeno (APC), a una razón celular de 1 célula T:5 APC. Se expanden las células en IL-2 cada 3-4 días, y en el día 14 se reestimulan con antígeno, IL-2 y PBMC, tal como se describió anteriormente. En el día de la primera reestimulación se examinan las células para determinar la proliferación específica para MBP. En resumen, 2 x 10^{4} células T y 1 x 10^{5} PBMC autólogas irradiadas se cultivan por triplicado, en placas de fondo redondo de 96 pocillos, en presencia de MBP. Se cultivan las células durante 2 días y se someten a pulsos con 0,4 \muCi de (^{3}H)-timidina a/pocillo durante las últimas 18 horas del cultivo. Entonces se recogen las células tal como se describió anteriormente, y se considera que una TCL es específica para MBP con un \deltacpm > 1000 y un IE>3.
Tras 3 ciclos de reestimulación/expansión se clonan las TCL utilizando PHA (Sigma, Poole, Dorset, UK)) en presencia de PBMC autólogas irradiadas como APC. Se siembran las células T en placa en condiciones de dilución limitantes a 0,1 células/pocillo, 0,3 células/pocillo y 1 célula/pocillo y se cultivan en placas Terasaki (Nunc International, Costar) con 1 x 10^{4} PBMC irradiadas, PHA 5 \mug/ml e IL-2 al 2%. Tras 10-12 días, se expanden los pocillos positivos para el crecimiento en placas de fondo redondo de 96 pocillos, utilizando 1 x 10^{5} PBMC irradiadas, PHA 5 \mug/ml e IL-2. Tres días después se alimentan los pocillos con medio reciente que contiene IL-2, y en el día 7 se expanden los clones en placas de 48 pocillos utilizando 5 x 10^{5} PBMC irradiadas, PHA e IL-2; en este punto se someten a prueba los clones en ensayos de proliferación para determinar las respuestas específicas frente a MBP. Se expanden los clones específicos para MBP una semana después sobre placas de 24 pocillos, utilizando 1 x 10^{6} PBMC irradiadas con PHA o Dynabeads (Dynal, UK) e IL-2. Se mantienen los clones en placas de 24 pocillos utilizando un ciclo de reestimulación/expansión de 7-10 días, esencialmente tal como se describió anteriormente. Se somete a prueba la capacidad de los clones de células T (TCC) para reconocer el panel de péptidos MBP mediante ensayos de proliferación, tal como se describió anteriormente.
Resultados Reconocimiento de péptido-MBP entre los pacientes con EM e individuos sanos
Los presentes inventores utilizan un ensayo de respuesta cinética en el que PBMC de pacientes con EM y sujetos sanos se someten a prueba para determinar su capacidad para responder a un panel de péptidos sintéticos de 15 meros solapantes que COMPRENDE la longitud completa de la MBP humana. Se examina la respuesta proliferativa de PBMC de cada cultivo en 5 puntos temporales a lo largo de un periodo de 2 semanas, y el perfil cinético de la respuesta frente a MBP y péptidos se compara con la respuesta frente a PPD, representando el último una respuesta secundaria/antígeno de memoria. No se APRECIA ninguna diferencia significativa en la respuesta de PBMC frente a MBP y/o péptidos entre pacientes con tratamiento con interferón-\beta y aquéllos sin tratamiento (datos no mostrados). La respuesta frente a MBP tanto en pacientes con EM como en controles sanos alcanzó el pico más tarde que la respuesta frente a PPD, siguiendo de ese modo las características cinéticas de la respuesta frente a un antígeno no de memoria. La figura 1 muestra un ejemplo típico del perfil cinético para PPD y MBP en pacientes con EM e individuos sanos.
Tal como se muestra en la figura 2, los dos péptidos más comúnmente reconocidos por pacientes con EM son 90-114 y 75-99 (6/12 pacientes cada uno), seguido de las regiones 30-54, 135-159 y 150-170 (5/12 pacientes), y 1-24 y 105-129 (4/12 pacientes). Tres pacientes responden a los aa 15-39 y 120-144. Dos pacientes reconocen 45-69, y ninguno de los pacientes con EM responde a la región 60-84.
Según la figura 10, cuando todos los pacientes son HLA-DR2 positivos, los dos péptidos más comúnmente reconocidos por pacientes con EM son 90-114 y 75-99 (6/11 pacientes cada uno), seguido de las regiones 120-144, 135-159 y 150-170 (5/11 pacientes), y 1-24, 15-39, 30-54 y 105-129 (4/11 pacientes). Tres pacientes responden a los aa 45-69, y de nuevo ninguno de los pacientes con EM responde a la región 60-84.
En contraste, los individuos sanos reconocen significativamente menos péptidos, respondiendo solamente 2 sujetos control a más de 2 péptidos (C y J; figura 3). Los individuos control C y J son los dos únicos que reconocen los aa 60-84, una región no vista por este grupo de pacientes. De manera interesante, ambos individuos expresan el alelo DRB1* 0701. Ninguno de los donantes sanos reconoce las regiones 45-69 y 105-129, mientras que 4 individuos sanos reconocen 75-99 y 150-170; tres individuos sanos reconocen 135-159; dos individuos sanos reconocen 1-24, 30-54, 60-84 y 120-144; y un individuo reconoce 15-39 y 90-114. En total, 8/13 de los individuos sanos no responden a ninguno de los péptidos solapantes, mientras que solamente 1/12 de los pacientes con EM (EM 19) constantemente no reconocen los péptidos MBP. De manera notable este paciente es el único en no responder a proteína MBP.
La figura 11 también muestra la respuesta de individuos sanos frente a péptidos MBP. En este estudio, solamente 1 sujeto control responde a más de 2 péptidos (N11). N11 es también el único individuo que reconoce los aa 60-84, una región no vista por este grupo de pacientes. Ninguno de los donantes sanos reconoce las regiones 15-39, 45-69 y 105-129, mientras que dos individuos sanos reconocen 120-144 y 135-159; y un individuo reconoce 1-24, 30-54, 60-84, 75-99, 90-114 y 150-170. En total, 9/12 de los individuos sanos no responden a ninguno de los péptidos solapantes.
En total, el día en el que la respuesta a MBP y/o péptidos alcanzó el pico no difería significativamente entre individuos sanos y pacientes, y la cinética en ambos grupos se asemejaba a aquéllas de una respuesta antigénica primaria. Además, la magnitud de la respuesta frente a MBP y péptidos no difería entre pacientes e individuos sanos.
Cambios en el reconocimiento de péptido-MBP a lo largo del tiempo
Habiéndose establecido que los pacientes con EM responden a un amplio espectro de péptidos MBP, los presentes inventores decidieron examinar si el reconocimiento de PBMC en los mismos individuos está centrado y es estable a lo largo del transcurso de aproximadamente de 4-12 meses. Tal como se muestra en las figuras 2, 10 y 3 ni los pacientes con EM ni los individuos sanos mostraron el mismo patrón de reconocimiento de péptidos.
La figura 4 representa un ejemplo de un paciente con EM (EM 49) que responde a múltiples péptidos en 2 puntos temporales diferentes, pero el perfil de reconocimiento durante el segundo punto temporal, medido 4 meses después, difiere significativamente. Es decir, en el segundo ensayo cinético la respuesta de PBMC frente a los aa 15-39, 30-54 y 150-170 persiste, sin embargo la respuesta frente a 75-99 y 105-129 remite y se desplaza a las regiones 90-114 y 135-159.
La figura 5 (EM 60) ilustra un ejemplo de un paciente cuya respuesta amplia frente a epítopo remite hasta una respuesta centrada a lo largo del periodo de 4 meses. Los individuos sanos que se someten a prueba en la segunda vez no responden a ninguno de los péptidos (figura 3).
En total, los resultados demuestran que los pacientes con EM no muestran patrones fijos de reconocimiento. En cada paciente la respuesta de PBMC frente a varios péptidos puede persistir, remitir y desplazarse a nuevas regiones de MBP, tal como se observa en el paciente EM 49.
Ciclo de reconocimiento de péptido
Cuando se analiza la respuesta de PBMC frente a péptidos en 3 o más puntos temporales diferentes a lo largo de un periodo de 12 meses, se pone de manifiesto que en ciertos pacientes el reconocimiento de epítopo parece fluctuar en lugar de desplazarse irreversiblemente a nuevas regiones peptídicas. Por ejemplo, tal como se muestra en las figuras 2 y 10, el paciente EM 60 muestra un patrón cíclico de reconocimiento para los aa 120-144 y 135-159; es decir, los residuos 120-144 y 135-159 se encuentra entre muchos reconocidos en el primer punto temporal sometido a prueba, la respuesta frente a estas 2 regiones remite en el segundo punto temporal y luego reaparece en el tercer punto temporal medido 4 meses después. El perfil cinético del paciente EM 41 demuestra, de manera similar, que el reconocimiento de los aa 135-159 fluctúa a lo largo de varios puntos temporales (véanse las figuras 2 y 10).
Entre el grupo control sano (figura 3), un individuo (M) muestra una respuesta fluctuante frente a las regiones 75-99 y 135-159, un segundo individuo (F) reconoce 75-99 en dos de los tres puntos temporales analizados, mientras que un tercer sujeto (D) muestra una respuesta cíclica frente al residuo 15-39.
Mapeo fino de la respuesta frente a MBP
Se generan TCC de 8 pacientes con EM y 2 individuos sanos, y se utilizan para aclarar la especificidad fina de las regiones peptídicas identificadas en el ensayo de respuesta cinética. Se somete a prueba la especificidad de cada TCC mediante su respuesta proliferativa frente al panel de péptidos de 15 meros. El clon SD:A7 reconoció la región 1-24, y dentro de esta región este TCC respondió a los aa 5-19. La región 30-54 se reconoce por 4 clones (MS49:D3, MS49:C8, MS49:A8, MS49:B6) y el epítopo dentro de esta región es 30-44. Un clon (MS39:D7) de un paciente con EM reconoce el péptido 60-74, y de manera interesante un individuo sano responde a esta región (60-84) en nuestro ensayo de respuesta cinética. Cinco clones (MS43:A7, MS41:B6, MS41:A2, MS41:C6, N5:8) reconocen los aa 83-99 que están contenidos en la región 75-99. Un paciente produjo TCC específico para los aa 110-124 (MS60:A2, MS60:B3), contenidos dentro del conjunto 105-129, y otro TCC del mismo paciente es específico para 130-144 (MS60:E1), encontrado dentro de la región 120-144. Cinco individuos producen clones que reconocen epítopos dentro de la región 135-159: MS60:F7, MS60:D1, MS59:F1 y N5:19 reconoce los aa 140-154; MS57:A1 es específico para 140-149, y MS17:A3 de TCC responde a la secuencia 130-144. Este panel de clones demuestra claramente la presencia de al menos 2 epítopos de células T dentro de la región 135-159 de MBP. Por último, la región 150-170 se reconoce por 2 clones específicos para los aa 156-169. La especificidad de todos los TCC se resume en la figura 6.
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Ejemplo 2
Identificación de apítopos en MBP Materiales y procedimientos Ensayo de presentación de antígeno utilizando un APIPS
La presentación de los péptidos a los clones de células T se mide mediante proliferación. Se fijan las APC en paraformaldehído al 0,5% y se siembran en placa a 1 x 10^{5} células por pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos. Los clones de células T se siembran en placa a 2 x 10^{4} células por pocillo en presencia de concentraciones variables de péptido. Tras la incubación durante 48 h a 37ºC, se mide la proliferación mediante la incorporación de [^{3}H]timidina a lo largo de 16-20 h. Se comparan los resultados con la capacidad de las células T para responder al epítopo presentado por APC vivas.
La presentación de péptidos a células T aisladas a partir de ratón transgénico DR2:MBP82-100 fue esencialmente tal como se describió anteriormente con la excepción de que las APC se sembraron en placa a 5 x 10^{5} células por pocillo, las células T se sembraron en placa a 1 x 10^{5} células por pocillo, y se dejó avanzar la incubación durante 72 h antes de la adición de [^{3}H]-timidina.
Resultados
En este experimento, los péptidos que se han identificado como epítopos en el ejemplo anterior se examinan para determinar su capacidad para presentarse utilizando un APIPS. Los resultados se muestran en la figura 7b. De los cinco epítopos examinados hasta ese momento, se encontró que cuatro eran apítopos (30-44, 80-94, 110-124 y 130-144) y se encontró que uno actuaba como un epítopo pero no como un apítopo (156-170).
Ejemplo 2A
Investigación de péptidos MBP 30-44, 110-124, 130-144 y 156-170
Con el fin de investigar si diversos péptidos MBP son apítopos, se investiga su capacidad para presentarse a células T por APC fijadas. Las células Mgar (HLA-DR2+ve) vivas o sometidas a pulsos previamente se someten a pulsos previamente con el péptido en suero, o suero solo durante 3,5 horas. Entonces se elimina el péptido en exceso de las células y se añade el clon de célula T apropiado. La respuesta proliferativa de células T se mide mediante la captación de ^{3}H-timidina.
Tal como se representa en las figuras 8 y 9, los péptidos 30-44 (figura 8A), 110-124 (figura 8B), y 130-144 (figura 9A) pueden presentarse por APC fijadas sin transformación adicional. Por tanto se definen estos péptidos como apítopos. El péptido 156-170, por otro lado, requiere transformación adicional para la presentación a células T (figura 9B). Las APC fijadas no pueden presentar este epítopo a células T, de modo que 156-170 no es un apítopo.
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Ejemplo 2B
Identificación de apítopos dentro de las regiones 77-100 y 125-148 de MBP
Para cualquier epítopo dado, puede existir uno o más apítopos, que pueden presentarse a APC sin transformación adicional. Se investiga la presencia de apítopos dentro dos regiones de MBP incubando células Mgar (HLA-DR2+ve) vivas o fijadas en p-formaldehído se incuban con péptidos solapantes en suero de las regiones de MBP 77-100 (figura 12) y 125-148 (figura 13) o en suero solo. Se añadieron las células T y tras 72 h (figura 12) o tras 48 h (figura 13) se midió la respuesta proliferativa de células T mediante captación de H-timidina. Para MBP 77-100, las células T se aíslan a partir de un ratón transgénico DR2: MBP 82-100, mientras que para MBP 130-144 se utilizó el clon de célula T MS17:A3.
Para la región de MBP 77-100 los siguientes péptidos se definen como apítopos:
MBP 83-99 ENPVVHFFKNIVTPRTP
MBP 80-94 TQDENPVVHFFKNIV
MBP 81-95 QDENPVVHFFKNIVT
MBP 82-96 DENPVVHFFKNIVTP
MBP 83-97 ENPVVHFFKNIVTPR
MBP 84-98 MPVVHFFKNIVTPRT
La secuencia de MBP mínima reconocida por las células T de ratón transgénico DR2 MBP 82-100 es la región 85-94.
Para la región de MBP 125-148 los siguientes péptidos se definen como apítopos:
MBP 130-144 RASDYKSAHKGFKGV
MBP 131-145 ASDYKSAHKGFKGVD
MBP 132-146 SDYKSAHKGFKGVDA
MBP 133-147 DYKSAHKGFKGVDAQ
La secuencia de MBP mínima reconocida por el clon de célula T MS17:A3 es la región 133-144.
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Ejemplo 2C
Investigación de la región 89-101 de MBP
Los presentes inventores han demostrado anteriormente que, en contraste con otros epítopos de células T de mielina, la administración de péptido 89-101 en forma soluble no previene la encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE) murina inducida con o bien la mielina completa o bien el propio péptido 89-101 (Anderton y Wraith (1998) Eur. J. Immunol. 28:1251).
MBP 89-101 comprende tres epítopos de células T
Con el fin de investigar la reactividad de células T frente a la región 81-111 de MBP, células de ganglio linfático de ratones sensibilizados con 81-111 se estimulan con 81-111 in vitro y estas células se someten a prueba con un panel de péptidos solapantes de 10 meros con desplazamientos de dos residuos que cubren la región 81-111 (concretamente: 81-90, 83-92, 85-94, 87-96, 89-98, 91-100, 93-102, 95-104, 97-106, 99-108 y 101-111). El patrón de respuesta frente a péptidos que comprenden la 89-101 muestra la capacidad de estimulación para 5 péptidos adyacentes (87-96 N terminal hasta 95-104) reflejando la presencia de al menos dos (y tal vez tres) epítopos distintos.
Con el fin de investigar esta región adicionalmente, se generan tres sublíneas de la línea de células T que responden a 81-111 original y éstas se someten a prueba de nuevo con un panel de péptidos solapantes de 10 meros con desplazamiento de un residuo que cubre la región 84-106. Los resultados revelan la existencia de tres epítopos de células T distintos pero solapantes dentro de la secuencia 89-101: 89-94, 92-98 y 95-101 (véase la figura 14).
El péptido MBP 92-98 es un epítopo críptico
Las tres líneas de células T (TCL) específicas de epítopo muestran diferencias interesantes cuando se someten a prueba para determinar la reactividad frente al péptido 89-101 y MBP recombinante completa. Las tres TCL responden al péptido (89-101) pero solamente las TCL específicas de 89-94 y 95-101 responden a MBP completa. Esto indica que la transformación antigénica de la MBP intacta genera preferentemente ligandos para células T que reconocen 89-94 y 95-101 pero no las que reconocen 92-98. Esto sugiere que el epítopo 92-98 es críptico (es decir no puede generarse mediante transformación de antígeno nativo). Parece que el péptido MBP 89-101 puede tomar parte en tres interacciones distintas con la molécula del MHC dando como resultado ligandos de péptido/MHC que se reconocen por tres poblaciones de células T separadas. Sin embargo la transformación de MBP solamente genera ligandos para dos de estas poblaciones de células T (ver la figura 14).
La inducción de EAE requiere el reconocimiento de células T de epítopos autoantigénico expresados en el SNC como resultado de la degradación de MBP intacta. La inmunización de ratones con péptidos que comprenden solamente uno de los tres epítopos de células T identificados anteriormente muestra que solamente los que contienen un epítopo transformado de manera natural (89-94 ó 95-101) pueden inducir EAE. Esto apoya adicionalmente el hallazgo de que 92-98 es un epítopo críptico.
El péptido MBP 92-98 es el epítopo dominante para la región 89-101 de MBP
Tal como se mencionó anteriormente, la región 89-101 contiene tres péptidos distintos pero solapantes. De éstos, el péptido 92-98 parece ser dominante para esta región. Por ejemplo, cuando se generan clones de células T a partir de ratones sensibilizados con el péptido 89-101, los seis clones que se generaron responden al 92-98. Utilizando péptidos análogos a 89-101 que contienen sustituciones de alanina individuales en cada posición, se ha descubierto que la sustitución de cualquiera de las posiciones 92-98 conduce a una falta de receptividad, mostrando que la alteración de cualquier residuo dentro del núcleo de 92-98 presenta efectos enormes sobre el reconocimiento de este epítopo.
El péptido MBP 89-101 no produce tolerancia de las células T relevantes para EAE que reconocen un epítopo de MBP transformado de manera natural.
Para resumir los hallazgos anteriores, los presentes inventores han descubierto que a) la secuencia 89-101 presenta el potencial de generar 3 epítopos de células T distintos; b) solamente dos de estos epítopos (89-94 y 95-101) se generan mediante transformación antigénica de MBP intacta (tanto in vitro cono in vivo); c) solamente los péptidos que contienen los epítopos transformados de manera natural y no los que contiene un epítopo críptico son eficaces para inducir EAE; d) el péptido 89-101 no protege frente a EAE en experimentos de tratamiento con péptido.
Esta información proporciona una base para investigar la hipótesis de que el péptido 89-101 no produce tolerancia frente a EAE a través de un fallo en unir directamente las células T relevantes para la enfermedad. Con el fin de apoyar la hipótesis, el péptido (89-101) debe no inducir tolerancia al epítopo encefalitogénico principal (89-94) puesto que no se unirá directamente al elemento de restricción del MHC (I-A^{s}) en la conformación apropiada. En otras palabras, 89-101 no actuará como un apítopo para células T que responden a 89-94.
Con el fin de someter a prueba esta posibilidad se realizan experimentos de tolerancia con los péptidos 89-101 y 87-96 (figura 15 A & B). El péptido 87-96 contiene el epítopo (89-94) más eficaz para inducir EAE.
Procedimientos
Los ratones recibieron 200 \mug de péptido en PBS o PBS sola por vía intraperitoneal en los días -8, -6 y -4 antes de 100 \mug de péptido en adyuvante completo de Freund en el día 0. Tras 10 días, se cultivaron células de ganglio linfático de drenaje (6 x 10^{5} por pocillo) en medio X-Vivo 15 complementado con 2-mercaptoetanol 5 x 10^{-5} M y L-glutamina 2 M con o sin antígeno durante 72 horas. Se sometieron a pulsos los cultivos durante las 16 horas finales con 0,5 \muCi de ^{3}H.timidina y se midió la incorporación utilizando un contador de centelleo líquido. Los resultados se expresan como recuentos medios por minuto para cultivos por triplicado.
Resultados
La sensibilización con 87-96 indujo una respuesta de memoria fuerte para sí mismo y una respuesta más débil para 89-101 (figura 15 A y B \Box y \circ respectivamente). Esto concuerda con la necesidad de transformación antigénica para generar 89-94 a partir de 89-101. La utilización de 87-96 como tolerógeno antes de sensibilizar con 87-96 suprimió las respuestas de memoria tanto frente a 87-96 como a 89-101 (figura 15A \blacksquare y \bullet). Esto se corresponde con células T reactivas a 89-94, una vez que se hace que no respondan in vivo, que no responden in vitro a 89-94 tanto si se generan a partir de 89-96 como de 89-101. De manera crucial, sin embargo, la utilización de 89-101 como el tolerógeno antes de sensibilizar con 87-96 no inhibió las respuestas de memoria o bien a 87-96 o bien a 89-101 (figura 15 B A \blacksquare y \medbullet). Estos datos demuestran que la administración de péptido 89-101 en forma tolerogénica no produce tolerancia al epítopo encefalitogénico transformado de manera natural basado en la secuencia 89-94: el péptido 89-101 no se comporta como un apítopo para el epítopo 89-94.
Sin desear limitarse por la teoría, los presentes inventores creen que las observaciones pueden explicarse por la posición del péptido 89-101 en el sitio de unión del péptido del MHC. Si el péptido se une de preferentemente modo que la región 92-98 está en el hueco de unión a péptido, entonces se reconocerá por células T específicas de MBP92-98. Esto explicaría porqué, cuando se sensibilizan los ratones con el péptido MBP89-101, todos los clones de células T generados reconocen el epítopo MBP92-98. Igualmente, cuando se utiliza 89-101 para producir tolerancia de las células T, producirá tolerancia principalmente de las células que reconocen el epítopo MBP92-98. Si MBP92-98 es un epítopo críptico, no se genera por transformación natural del antígeno completo y las células T que reconocen este epítopo probablemente no existirán in vivo. Incluso si una célula de células T específica de MBP92-98 existiese in vivo, no sería relevante para la enfermedad. Por tanto, 89-101 no previene EAE inducida con MBP completa.
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Ejemplo 3
Tratamiento con péptido para un modelo de ratón de EM
Los presentes inventores han demostrado anteriormente que una única dosis de antígeno peptídico administrado de manera sistémica tanto por vía intraperitoneal (Liu y Wraith (1995) Int Immunol 8:1255-1263) como por vía intranasal (Metzler y Wraith (1993) 5:1159-1165) protegerá de manera eficaz a los ratones de encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE) durante hasta tres meses (Metzler y Wraith (1999) Immunology 97:257-263). Se necesitaron al menos 5 dosis de péptido para inducir tolerancia en el ratón transgénico Tg4 (Burkhart et al (1999) 11:1625-1634) que expresa un receptor de células T específico de EAE (Liu et al (1995) Immunity 3:407-415). Un trabajo reciente ha demostrado que la vía intranasal (IN) es más segura que la vía intraperitoneal (IP) en el ratón Tg4, incluso si ambos enfoques son igualmente seguros en el ratón no transgénico.
Se somete a prueba el péptido 83-99 de MBP en el ratón transgénico Fug/D6 que expresa tanto la molécula del MHC clase II HLADR2 apropiada como un TCR de un clon de célula T humana específico para este péptido. Se tratan los ratones con péptido siguiendo la dosis convencional utilizada para el tratamiento del ratón transgénico Tg4 (protocolo Tg4) o el protocolo de desensibilización de escalada de dosis de péptido que se ha utilizado en el tratamiento de pacientes que padecen alergia (protocolo de desensibilización).
Protocolo Tg4: Se tratan los grupos de ratones mediante administración intranasal de péptido 83-99 (4 mg/ml en solución salina tamponada con fosfato (PBS)) o PBS sola en un volumen total de 25 \mul. Se tratan los ratones cada 1^{er} y 5º día de la semana durante 5 semanas dando un total de 10 dosis. Al comienzo de la de semana 6 se le inyecta a cada ratón el péptido 83-99 en adyuvante completo de Freund (CFA) y también recibe una inyección i.p. de toxina de la tos ferina (200 ng) en los días 1 y 3. Se monitoriza la progresión de EAE durante al menos 30 días.
Protocolo de desensibilización: Se tratan los grupos de ratones mediante administración intranasal de una dosis en escalada de péptido 83-99 o PBS sola en un volumen total de 25 \mul. La escalada de dosis comienza a 0,1 \mug y avanza hasta 1, 3, 6, 12, 50 y luego tres veces 100 \mug. Se tratan los ratones cada 1^{er} y 5º día de la semana durante 5 semanas dando un total de 10 dosis. Al comienzo de la de semana 6 se le inyecta a cada ratón el péptido 83-99 en el adyuvante completo de Freund (CFA) y también recibe una inyección i.p. de toxina de la tos ferina (200 ng) en los días 1 y 3. Se monitoriza la progresión de EAE durante por lo menos 30 días.
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Ejemplo 4
Administración nasal de un cóctel de apítopo a pacientes con EM
Se prepara una vacuna que comprende los péptidos MBP 30-44, 83-99, 110-124 y 130-144 (es decir algunos de los epítopos de MBP que se han identificado como apítopos). Se administra la vacuna a treinta y cinco pacientes en un ensayo de fase Ia/Ib. El ensayo es un ensayo cruzado simple en el que los pacientes permanecen sin tratamiento durante tres meses seguido de una dosis única de péptido (Ia). Entonces se monitorizan los pacientes durante tres meses tras la dosis única de vacuna para evaluar la seguridad. Entonces el tratamiento consiste en administración dos veces por semana mediante administración intranasal. Para cada paciente: se analiza la actividad clínica mensualmente mediante obtención de imágenes por resonancia magnética; se monitoriza la actividad inmunológica utilizando un ensayo de respuesta cinética para la proliferación; y se monitoriza la producción de citocinas utilizando un ELISA basado en células.
El ensayo inicialmente implica el tratamiento de 5 pacientes que padecen enfermedad progresiva crónica (PC). Se seleccionan estos pacientes basándose en actividad MRI baja y en primer lugar se tratan con la dosis más alta de péptidos. Se inicia el tratamiento en el grupo de pacientes con PC porque son los que demuestran con la mayor probabilidad cualquier efecto dañino posible tal como se demuestra mediante un aumento en la actividad MRI. El tratamiento de los pacientes con recaída remitentes empieza una vez está claro que el tratamiento de dosis tanto única como múltiple es seguro en el grupo con PC. Se recluta un grupo más grande de 30 pacientes con recaída remitentes basándose en si experimentan lesiones por MRI crecientes durante un periodo de monitorización de 3 meses. Se dividen éstos en tres grupos que deben tratarse con una dosis de péptido alta, media o baja.
1
Abreviaturas: APC = células presentadoras de antígeno; MHC = complejo mayor de histocompatabilidad; TCR = receptor de células T; EAE = encefalomielitis autoinmunitaria experimental; APÍTOPO = epítopo independiente de la transformación antigénica; APIPS = sistema de presentación independiente de la transformación antigénica; aa = aminoácido; EM = Esclerosis múltiple; MBP = proteína básica de la mielina; PLP = proteína proteolipídica; TCL = línea de células T; TCC = clon de células T; PBMC = células mononucleares de sangre periférica; PPD = derivado proteico purificado de Mycobacterium tuberculosis; PHA = fitohemaglutinina
<110> The University of Bristol
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<120> PROCEDIMIENTO DE SELECCIÓN DE PÉPTIDOS
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<130> P9611WO LCH
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<140> PCT/GB01/03702
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<141> 17-08-2001
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<150> 0020618.5
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<151> 21-08-2000
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<150> 0114547.3
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<151> 14-06-2001
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<160> 11
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<170> PatentIn versión 3.0
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<210> 1
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<211> 17
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 1
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2 
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<210> 2
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<211> 15
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 15
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 15
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 15
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 5
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6 
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<210> 6
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<211> 15
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 6
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7 
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<210> 7
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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8 
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<210> 8
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<210> 9
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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Claims (8)

1. Péptido humano tolerogénico, proteína básica de la mielina (MBP) 30-44, que puede unirse a una molécula del MHC de clase I o II sin transformación antigénica adicional, para su utilización en el tratamiento y/o la prevención de la esclerosis múltiple.
2. Composición farmacéutica para tratar/prevenir la esclerosis múltiple que comprende un péptido según la reivindicación 1.
3. Composición farmacéutica según la reivindicación 2, que comprende una pluralidad de péptidos MBP humanos tolerogénicos.
4. Composición farmacéutica según la reivindicación 3, que comprende entre 2 y 15 péptidos MBP humanos tolerogénicos.
5. Composición farmacéutica según la reivindicación 4, que comprende 4 péptidos MBP humanos tolerogénicos.
6. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 en forma de un kit, en la que algunos o cada uno de los péptidos se proporcionan por separado para administración simultánea, por separado o secuencial.
7. Péptido o composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para su administración intranasal.
8. Utilización de un péptido según la reivindicación 1, en la preparación de una composición farmacéutica para su utilización en el tratamiento y/o la prevención de la esclerosis múltiple.
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