PL213585B1 - Peptyd tolerogenny, kompozycja farmaceutyczna zawierajaca ten peptyd, peptyd lub kompozycja farmaceutyczna do podawania i zastosowanie peptydu tolerogennego - Google Patents

Description

Niniejszy wynalazek dotyczy peptydu tolerogennego, kompozycji farmaceutycznej zawierającej peptyd tolerogeny, peptydu lub kompozycji do podawania i zastosowania peptydu tolerogennego.

Tło wynalazku

W adaptatywnej odpowiedzi immunologicznej limfocyty T są zdolne do rozpoznawania wewnętrznych epitopów antygenu białkowego. Komórki prezentujące antygen (APC)(ang. antigen presenting cells) przyjmują antygeny białkowe i degradują je do krótkich, peptydowych fragmentów. Peptyd może wiązać się wewnątrz komórki z cząsteczką głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) klasy I lub II i zostać przeniesionym na powierzchnię komórki. Peptyd ten gdy występuje na powierzchni komórki w połączeniu z cząsteczką MHC, może być rozpoznany przez komórkę T (za pośrednictwem receptora komórki T (TCR)), w tym przypadku peptyd jest epitopem komórki T.

Epitop komórki T odgrywa kluczową rolę w adaptatywnej odpowiedzi immunologicznej na każdy, zarówno własny jak i obcy antygen. Kluczowa rola odgrywana przez epitopy komórki T w chorobach z nadwrażliwością (obejmujących alergię, choroby autoimmunologiczne i odrzut przeszczepu) była wykazana w modelach doświadczalnych. Chorobę ze stanem zapalnym lub alergią można wywołać wstrzykując syntetyczne peptydy (opierając się na strukturze epitopów komórki T) w połączeniu z adiuwantem.

Przeciwnie to tego, pokazano że możliwe jest wywołanie tolerancji immunologicznej w stosunku do szczególnych epitopów peptydowych przez podanie epitopów peptydowych w postaci rozpuszczalnej. Pokazano, że podanie rozpuszczalnych antygenów peptydowych jest skutecznym sposobem zahamowania choroby w przypadku eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE-model stwardnienie rozsianego (MS)) (Metzler i Wright (1993) Int. Immunol. 5:1159 -1165; Liu i Wright (1995) Int. Immunol. 7:1255-1263; Anderton i Wright (1998) Eur. J. Immunol. 28:1251-1261) i w doświadczalnych modelach zapalenia stawów, cukrzycy i zapaleniu naczyniówki i siatkówki (przeglądu których dokonali jak powyżej Anderton i Wright (1998)). Pokazano również, że jest to sposób leczenia powyższych chorób w EAE (Anderton i Wright (1998) jak wyżej).

Zastosowanie tolerogennych polipeptydów w leczeniu lub zapobieganiu chorobie wzbudziło znaczne zainteresowanie. Jednym z powodów było to, że pokazano iż określone tolerogenne epitopy mogą w obrębie tej samej tkanki hamować odpowiedź komórek T na określone antygeny. Zjawisko to znane jako supresja oboczna oznacza, że stosując określony tolerogenny peptyd powinno być możliwe wywołanie tolerancji na więcej niż jeden epitop (korzystnie wszystkie epitopy) w danym antygenie i na więcej niż jeden antygen w danej chorobie, (Anderton i Wright (1998) jak powyżej). Powinno to zapobiec konieczności identyfikowania wszystkich patogenicznych antygenów związanych z określoną chorobą.

Peptydy są również korzystną opcją w leczeniu z uwagi na ich względnie niski koszt i fakt, że analogi peptydowe mogą być wytworzone w postaci ze zmienionymi właściwościami immunologicznymi. Tak więc, peptydy mogą być zmodyfikowane w celu zmiany ich oddziaływania zarówno z MHC lub TCR.

Jednym możliwym problemem w tym podejściu jest to, iż pokazano, że nie wszystkie peptydy działające jako epitopy komórki T są zdolne do wywołania tolerancji. Zasadowe białko mieliny (MBP), peptyd 89-101, jest antygenem immunodominującym, po immunizacji również bardzo skutecznym immunogenem w kategoriach zarówno inicjowania reaktywności komórki T jak i indukcji ΕΑΕ. Jednakże, wykazano że gdy peptyd ten jest podany w roztworze to jest on nieskuteczny w indukowaniu tolerancji (Anderton i Wright (1998), jak powyżej).

Zaproponowano szereg wytłumaczeń zaobserwowanej hierarchii zdolności epitopów komórki T do wywołania tolerancji (przeglądu dokonali Anderton i Wright (1998), jak powyżej). W szczególności zaproponowano, że istnieje zależność pomiędzy powinowactwem peptydu do MHC a tolerogenicznością (Liu i Wright (1995), jak powyżej), lecz to nie zgadza sie z pewnymi obserwacjami. Przykładowo _S

MBP [89-101], które nie jest tolerogeniczne wiąże się ze względnie wysokim powinowactwem z I-A^S. Tak więc, nie ułatwia to przewidywania, który z peptydów będzie indukował tolerancję.

Jeśli istniałoby racjonalne wytłumaczenie dlaczego jedynie część epitopów peptydowych jest zdolna do wywołania tolerancji mogło by to umożliwić dobór tolerogennych peptydów użytecznych w leczeniu i zapobieganiu chorób z nadwrażliwością.

PL 213 585 B1

Streszczenie wynalazku

Niniejszy wynalazek pokazuje, że jeśli epitop peptydowy ma odpowiednią wielkość by był prezentowany przez niedojrzałe APC bez obróbki antygenu to powinien indukować tolerancję immunologiczną. Obserwacja, że niektóre epitopy komórki T są tolerogeniczne, podczas gdy inne nie są zdolne do wywołania tolerancji może być wyjaśnione faktem, że niektóre epitopy wymagają dalszej obróbki nim będą zdolne prezentacji przez cząsteczkę MHC. Te epitopy, które wymagają dalszej obróbki nie indukują tolerancji, wtedy gdy są podawane w postaci rozpuszczalnej mimo ich zdolności do indukcji choroby gdy są wstrzyknięte w połączeniu z adiuwantem.

Epitopy, które nie wymagają dalszej obróbki a są zdolne do indukowania tolerancji zostały określone jako apitopy (ang. Antigen Proccessing Independent epiTOPES).

Odkrycie to dostarcza metody doboru tolerogennych epitopów komórki T, co stwarza potrzebę sprawdzenia zdolności peptydu do wywoływania tolerancji in vivo. Jest to szczególnie korzystne w opracowaniu strategii leczenia lub zapobiegania w chorobach, dla których niedostępne są modele zwierzęce. Nawet w przypadku chorób, które mają model zwierzęcy, sposób doboru powinien uczynić opracowanie kompozycji tolerogennych prostszym i bezpieczniejszym ponieważ dostarcza on mechanizmu dzięki któremu zdolność indukcji tolerancji przez peptyd może być testowana na ludzkich komórkach T (rozpoznających antygen w połączeniu z ludzkimi cząsteczkami MHC) in vitro, przed użyciem in vivo.

Przedmiotem wynalazku jest peptyd tolerogenny zdolny do wiązania się z cząsteczką MHC klasy I lub II bez dalszej obróbki antygenu, który jest peptydem zasadowego białka mieliny (MBP): 30-44 do zastosowania w leczeniu i/lub zapobieganiu chorobie stwardnienia rozsianego.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna do zastosowania w leczeniu i/lub zapobieganiu chorobie stwardnienia rozsianego, charakteryzująca się tym, że zawiera peptyd według wynalazku zdefiniowany powyżej.

Kompozycja według wynalazku korzystnie zawiera mnogość tolerogennych peptydów MBP, a bardziej korzystnie zawiera od 2 do 15 indukujących tolerancję peptydów MBP. W najkorzystniejszym rozwiązaniu kompozycja zawiera 4 tolerogenne peptydy MBP.

W innym korzystnym rozwiązaniu kompozycja według wynalazku jest w postaci zestawu, i charakteryzuje się tym, że pewien lub każdy z peptydów są dostarczane osobno do podawania jednoczesnego, oddzielnego lub kolejnego.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest peptyd lub kompozycja farmaceutyczna jak zdefiniowano powyżej do podawania donosowego.

Wynalazek dotyczy także zastosowania peptydu zdefiniowanego powyżej do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia i/lub do zapobiegania stwardnia rozsianego.

W niniejszym wynalazku opisano metodę doboru peptydu wywołującego tolerancję obejmującą etapy doboru peptydu, który jest zdolny do wiązania cząsteczki MHC klasy I lub klasy II bez dalszej obróbki. Peptyd taki jest zdolny do wiązania cząsteczki klasy II bez dalszej obróbki.

Nauce znanych jest szereg sposobów badania przesiewowego peptydów zdolnych do działania jako epitopy komórki T dla danego antygenu. Sposób badania przesiewowego stosuje się powszechnie w celu doboru wywołującego tolerancję peptydu spośród wielu peptydów, z których każdy zawiera epitop komórki T.

Celem badania czy peptyd jest zdolny do wiązania MHC klasy I lub II bez dalszej obróbki jest stwierdzenie czy peptyd ten ma zdolność do wiązania cząsteczek klasy I lub II przy pomocy systemu prezentacji antygenu niezależnego od jego obróbki (APIPS). W takim przypadku, sposób obejmuje następujące etapy:

(i) działanie na APIPS peptydem i (ii) analizę wiązania peptydu z cząsteczkami MHC klasy I i II bez APIPS.

Niniejszy wynalazek dostarcza peptydu dobranego metodą z opisaną powyżej.

Peptyd według wynalazku może być użyteczny w leczeniu i/lub zapobieganiu chorobie zależnej od autoreaktywnych komórek T. Reakcje nadwrażliwości są szczególnie łagodzone w leczeniu/zapobieganiu przy pomocy peptydu według niniejszego wynalazku, przykładowo alergii, reakcji autoimmunologicznej i odrzucie przeszczepu.

Wiadomo, że niektóre peptydy są zdolne do indukcji tolerancji zarówno na inne epitopy tego samego antygenu jak i inne epitopy z odmiennych antygenów (dzięki zjawisku znanemu jako supresja oboczna). Jednakże, przewiduje się, że dla odpowiedniego zahamowania wszystkich autoreaktywnych komórek T korzystnym będzie połączenie różnych epitopów podanych pacjentowi dla

PL 213 585 B1 leczenia/zapobiegania szczególnej chorobie. Tak więc niniejszy wynalazek dostarcza kompozycję farmaceutyczną zawierającą liczne peptydy według wynalazku, każdy peptyd oparty jest na epitopie komórki T.

Ogólna strategia leczenia i/lub zapobiegania chorobie podmiotu może obejmować następujące etapy:

(i) identyfikację związanego z chorobą antygenu;

(ii) identyfikację epitopu tego antygenu; i (iii) podanie epitopu podmiotowi.

Opis Figur rysunku

Fig. 1 przedstawia typowy przykład profilu kinetyki dla pochodnych białka oczyszczonego z Mycobacterium tuberculosis (PPD) i MBP u pacjentów ze stwardnieniem rozsianym (MS) i u osób zdrowych. Jednojądrowe komórki z krwi obwodowej (PBMC) wyizolowane od pacjenta z MS (A) i od osoby zdrowej (B) badano z uwagi na ich zdolność do proliferacji w obecności PPD i pełnego MBP; profil kinetyki odpowiedzi przez proliferację na MBP jest porównany z tym, dla drugorzędowego antygenu PPD.

Fig. 2 jest tabelą podsumowującą odpowiedzi PBMC na MBP i jego peptydy, u pacjentów z MS. Określone osoby badano w trzech niezależnych momentach, co około 4 do 7 miesięcy.

Fig. 3 jest tabelą podsumowującą odpowiedzi PBMC na MBP i peptydy MBP u osób zdrowych. Przerwy pomiędzy badaniami wynosiły 4 i 7 miesięcy.

Fig. 4 przedstawia przykład pacjenta z MS (MS49), który odpowiada na wiele peptydów w dwóch różnych punktach czasowych, lecz u którego wyraźnie różni się profil rozpoznawania w drugim punkcie czasowym, mierzony 4 miesiące później. PBMC hodowano w obecności MBP i zestaw ₃ peptydów obejmował pełnej długości MBP i proliferację mierzono przez pomiar pobierania ³H tymidyny. Ogólna odpowiedź przez proliferację komórki T obserwowana w pierwszym punkcie czasowym różniła się znacząco od odpowiedzi zmierzonej 7 miesięcy później (drugi punkt czasowy).

Fig. 5 przedstawia przykład pacjenta, u którego szeroka odpowiedź na epitop (pierwszy punkt czasowy) zanika (drugi punkt czasowy) i pojawia się ponownie po 12 miesiącach (trzeci punkt czasowy).

Fig. 6 przedstawia mapę z dokładnie wyszczególnionymi obszarami białka zidentyfikowanymi w oznaczeniu kinetyki odpowiedzi, którą uzyskano przy pomocy TCC wytworzonymi przez pacjentów MS i osoby zdrowe. Większość peptydów użytych w oznaczeniach peptydowych miała długość 15 aminokwasów, jednakże kilka miało długość 10 aminokwasów, a jeden peptyd 17. Specyficzność każdego TCC badano przynajmniej dwukrotnie.

Fig. 7a jest tabelą przedstawiającą opis epitopów komórki T w zasadowym białku mieliny rozpoznawanych przez limfocyty T z pacjentów MS.

Fig. 7b jest tabelą pokazującą, ze wszystkie epitopy komórki T niekoniecznie są prezentowane przez utrwalone APC i co za tym idzie nie są apitopami.

Fig. 8 i 9 przedstawia prezentację różnych peptydów MBP klonom komórki T przez żywe i utrwalone APC. Fig. 8A- 30-44, Fig. 8B- 110-124, Fig. 9A- 130-144, Fig. 9B- 156-170.

Fig. 10 jest tabelą przedstawiającą maksymalne wartości Indeksu Pobudzenia (SI) (ang. Stimulation Index) przez MBP i peptydy MBP u pacjentów MS otrzymane dla trzech niezależnych punktów czasowych. Próbki dla drugiego punktu czasowego zbierano 4-8 miesięcy po pierwszym punkcie czasowym i próbki dla trzeciego punktu czasowego otrzymano 3-5 miesięcy po drugim punkcie czasowym. Wartość tła wyrażoną w cpm zmierzono dla każdego dnia i mieściła się ona w zakresie 80-700 cpm; pozytywną odpowiedź (pogrubione) określono zgodnie z SI>3 i 8 cpm>1000. (Było niemożliwym zebranie próbek dla wszystkich trzech punktów czasowych od pacjentów MS19 i MS61).

Fig. 11 jest tabelą przedstawiającą maksymalne wartości Indeksu Pobudzenia (SI) przez MBP i peptydy MBP u osób zdrowych. Wartość tła wyrażoną w cpm zmierzono dla każdego dnia i mieściła się ona w zakresie 80-700 cpm; pozytywną odpowiedź (pogrubione) określono zgodnie z SI>3 i dcpm>1000.

Fig. 12 przedstawia odpowiedź komórek T wyizolowanych z transgenicznej myszy DR2:MBP82 -100 na prezentowane przez APC polipeptydy MBP zagnieżdżone w rejonie 77-100.

Fig. 13 przedstawia odpowiedź klonu komórki T MS17.A3 na prezentowanie przez APC zagnieżdżonych peptydów MBP w rejonie 125-148.

Fig. 14 jest ilustracją rozpoznawania epitopu komórki T w obrębie sekwencji MBP 89-101. Istnieją tu trzy różne zachodzące na siebie epitopy komórki T w obrębie sekwencji: 89-94, 92-98

PL 213 585 B1 i 95-101. Przedstawiona jest możliwość cięcia pomiędzy aminokwasami 94 i 95 przez działanie endopeptydazy asparginylowej.

Fig. 15 przedstawia zdolność peptydów MBP 87-96 (A) i 89-101 (B) do działania jako apitop dla komórek T reagujących na epitop 89-94.

Szczegółowy opis wynalazku Tolerancja.

W użytym tu znaczeniu tolerogenność oznacza zdolność do indukowania tolerancji.

Tolerancja to utrata reakcji na antygen. Tolerancja własnych antygenów jest zasadniczą cechą układu odpornościowego, gdy dojdzie do jej utraty wynikiem może być choroba autoimmunologiczna. Dostosowujący się system immunologiczny musi zachować zdolność do odpowiedzi na ogromną różnorodność czynników zakaźnych unikając równocześnie autoimmunologicznego ataku na własne antygeny zawarte w swoich własnych tkankach. W znacznym stopniu jest to kontrolowane przez podatność niedojrzałych limfocytów T na śmierć komórki przez apoptozę w grasicy (tolerancja centralna). Jednakże, nie wszystkie własne antygeny są wykrywane w grasicy co powoduje, że śmierć tymocytów reaktywnych względem własnych antygenów nie jest całkowita. Tak więc występują również mechanizmy, dzięki którym nabyta może być tolerancja przez dojrzałe limfocyty T reaktywne względem własnych antygenów w tkankach obwodowych (tolerancja obwodowa). Przegląd mechanizmów centralnej i obwodowej tolerancji przedstawił Anderton i wsp. (1999) (Immunological Reviews 169:123-137).

Tolerancja może być wynikiem anergii lub charakteryzować się indukcją anergii przynajmniej u części komórek T CD4+. Dla aktywowania komórki T peptyd musi wiązać się z profesjonalnym APC zdolnym do dostarczenia komórkom T dwóch sygnałów. Pierwszy sygnał (sygnał 1) jest dostarczany przez kompleks MHC-peptyd na powierzchnię komórki APC i jest odebrany przez komórkę T via TCR. Drugi sygnał (sygnał 2) jest dostarczany przez współpobudzenie cząsteczek na powierzchni APC, takich jak CD80 i CD86 i odebrany przez znajdującą się na powierzchni komórki T CD28. Jest prawdą, że gdy komórka T otrzymuje sygnał 1 przy braku sygnału 2 to nie jest aktywowana i w rzeczywistości staje się anergiczną. Anergiczne komórki T są oporne na kolejne pobudzenie antygenem i mogą być zdolne do hamowania innych odpowiedzi immunologicznych. Anergiczne komórki T wydają się uczestniczyć w tolerancji zależnej od komórki T.

Przewiduje się, że peptydy, które wymagają obróbki zanim będą zaprezentowane w połączeniu z cząsteczkami MHC nie indukują tolerancji ponieważ muszą one być przeniesione przez dojrzałe komórki prezentujące antygen. Dojrzałe komórki prezentujące antygen (takie jak makrofagi, komórki B i komórki dendrytyczne) są zdolne do prezentowania antygenu, lecz również do dostarczenia zarówno sygnału pierwszego jak i drugiego do komórki T, co prowadzi do aktywacji komórki T. Z drugiej strony apitopy będą zdolne do wiązania MHC klasy II na niedojrzałych APC. Tak więc będą prezentowane na komórkach T bez współpobudzenia co prowadzi do anergii komórki T i tolerancji.

Oczywiście apitopy są również zdolne do wiązania cząsteczek MHC na powierzchni komórki dojrzałego APC. Jednakże, system immunologiczny zawiera ogromny nadmiar niedojrzałych APC względem dojrzałych (sugerowano, że mniej niż 10% komórek dendrytycznych jest aktywowana, Summers i wsp. (2001) Am. J. Pathol. 159: 285-295). Co za tym idzie domyślnym stanem apitopu będzie raczej anergia/tolerancja niż aktywacja.

Pokazano, że gdy tolerancja jest indukowana przez inhalację peptydu zdolność do proliferacji specyficznych dla antygenu komórek T CD4+ jest zredukowana. Również wytwarzanie przez te komórki IL-2, IFN-γ i IL-4 jest obniżone lecz zwiększone jest wytwarzanie IL-10. Pokazano, że u myszy neutralizacja IL-10 w stanie wywołanej peptydem tolerancji w pełni odtwarza podatność na chorobę. Zaproponowano, że populacja komórek regulatorowych pozostająca w stanie tolerancji wytwarza

IL-10 i uczestniczy w regulacji odporności (Burkhart i wsp. (1999) Int. Immunol. 11: 1625-1634). Indukcja tolerancji może, co za tym idzie, być śledzona różnymi sposobami obejmującymi:

(a) ograniczoną podatność na zapadanie na chorobę, dla której in vivo peptyd jest docelowym epitopem;

(b) indukcję anergii komórek T CD4+ (która następnie może być wykryta przez podanie in vitro antygenu);

(c) zmianę populacji komórki T, CD4+ obejmującą (i) ograniczenie proliferacji;

(ii) hamowanie wytwarzania IL-2, IFN-γ i IL-4; i (iii) zwiększenie wytwarzania IL-10.

PL 213 585 B1

Epitopy Antygenu Nie Wymagające Obróbki (APITOPY).

Sposób badania zdolności tolerogennych peptydu obejmuje etap doboru peptydu zdolnego do wiązania białka MHC klasy I lub II bez dalszej obróbki. Peptydy takie są określone tu jako apitopy (ang. Antigen Proccessing Independent epiTOPES).

Prezentacja na powierzchni komórki peptydów pochodzących z danego antygenu nie jest losowa i wykazuje skłonność do bycia zdominowaną przez małą liczbę często występujących epitopów. Dominowanie szczególnego peptydu będzie zależało od licznych czynników, takich jak względne powinowactwo do wiązania cząsteczki MHC, czasoprzestrzennego punktu wytworzenia w APC i odporności na degradację. Hierarchia epitopu antygenu może zmieniać się wraz z rozwojem odpowiedzi immunologicznej co ma ważne konsekwencje dla tolerancji antygenów własnych i autoodporności. Przypuszczalnie dobrze tolerowane będą obszary immunodominujących determinat. Tak więc, w korzystnej postaci apitop według niniejszego wynalazku opiera się na epitopie dominującym.

Jednakże, po pierwotnej odpowiedzi immunologicznej na immunodominujące peptydy może wystąpić rozprzestrzenienie się epitopu na subdominujące determinanty (Lehmann i wsp. (1992) Nature 358:155-157). Prezentowanie subdominujących epitopów może być ważne w wyzwalaniu odpowiedzi autoimmunologicznej. Co za tym idzie apitopy z niniejszego wynalazku mogą być oparte na subdominującym apitopie.

Dla każdego danego antygenu mogą również występować kryptyczne epitopy. Kryptyczne epitopy to te, które mogą pobudzać odpowiedź komórki T gdy są podane jako peptyd, lecz które utraciły zdolność do wytworzenia takiej odpowiedzi, gdy są podane jako pełny antygen. Może zdarzyć się, że podczas obróbki antygenu do peptydów w APC kryptyczny epitop jest zniszczony. Pokazano, że peptyd 92-98 jest kryptycznym epitopem dla MBP (Przykład 2C). Interesujące, że w tym obszarze peptydu występuje potencjalne miejsce cięcia dla endopeptydazy asparaginylowej co może oznaczać, że podczas naturalnej obróbki APC nie wytwarzają peptydów posiadających ten obszar.

Kryptyczne epitopy mogą działać in vitro jako apitopy co oznacza, że mogą być zdolne do wiązania z cząsteczką MHC bez dalszej obróbki i indukują anergię w rozpoznającej kryptyczny epitop komórce T. Jednakowoż, takie epitopy najprawdopodobniej nie będą użyteczne terapeutycznie ponieważ powinny być niezdolne do wywoływania tolerancji komórek T rozpoznających epitopy antygenu powstające przez naturalną obróbkę.

Epitopy antygenu mogą być zidentyfikowane przez pomiar odpowiedzi komórki T na zachodzące na siebie peptydy obejmujące cały antygen (patrz poniżej) gdy są prezentowane przez APC. Takie badania powinny zaowocować zagnieżdżonymi zestawami peptydów i minimalnym epitopem dla szczególnej linii/klonu komórki T. co może być ocenione pomiar odpowiedzi na skrócone peptydy.

Nie można zakładać, że minimalny epitop antygenu będzie się zachowywał jak apitop. Równie dobrze aminokwasy otaczające minimalny epitop będą wymagane dla optymalnego wiązania z MHC. Apitop powinien być zaprojektowany tak, aby uwzględniał możliwość subtelnych różnic pomiędzy minimalnymi epitopami różnych klonów komórki T.

Należy podkreślić, że zidentyfikowanie apitopu dla wszystkich epitopów może być niemożliwe. Istnieje jasny dowód, że niektóre epitopy wiążą MHC w sposób zależny od wprowadzania MHC do endosomów i co za tym idzie wymagają obróbki (Viner i wsp. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92:2214 -2218). Jest to kolejnym powodem, dla którego nie można przyjmować, że każdy minimalny epitop będzie z pewnością zachowywał się jak apitop.

Identyfikacja peptydów zawierających epitopy komórki T.

Istnieje szereg, znanych nauce sposobów identyfikacji w obrębie danego antygenu epitopów komórki T.

Podlegające naturalnej obróbce epitopy mogą być zidentyfikowane za pomocą analizy spektrometrii masowej peptydów wymytych z APC niosących antygen. Są one tymi APC, które zarówno mogą pobierać antygen lub mogą być zmuszone do wewnątrzkomórkowego wytwarzania białka przez transformację odpowiednim genem. Typowo, APC są inkubowane z białkiem zarówno w roztworze lub dogodnie zlokalizowanym na powierzchni komórki APC. Po inkubacji w 37°C komórki są poddawane lizie w detergencie, a białko klasy II jest oczyszczane przykładowo przez chromatografię powinowactwa. Działanie na oczyszczony MHC dogodnym nośnikiem chemicznym (przykładowo w środowisku kwaśnym) prowadzi do wymycia peptydów z MHC. Tą pulę peptydów oddziela się i porównuje się profil z peptydem otrzymanym z APC kontrolnych, traktowanych w ten sam sposób. Piki unikalne dla komórek wyrażających/pobierających białko są analizowane (przykładowo za pomocą spektrometrii masowej) a fragmenty peptydu są identyfikowane. Procedura ta zazwyczaj dostarcza informacji

PL 213 585 B1 o zakresie peptydów (zazwyczaj w postaci zagnieżdżonych zestawów) wytworzonego przez obróbkę antygenu ze szczególnego antygenu.

Innym sposobem identyfikacji epitopów jest przeszukiwanie w testach in vitro biblioteki syntetycznych peptydów, które zachodzą na siebie i obejmują całą długość antygenu. Przykładowo, użyte mogą być peptydy o długości 15 aminokwasów zachodzące na siebie pięcioma lub dziesięcioma aminokwasami. Peptydy są testowane w systemie prezentującym antygen obejmującym komórki prezentujące antygen i komórki T. Przykładowo, system prezentujący antygen może być preparatem mysich splenocytów, preparatem ludzkich komórek z migdałków lub PBMC. Alternatywnie, system prezentujący antygen może zawierać szczególną linię/klon komórki T i/lub szczególny typ komórki prezentującej antygen.

Aktywacja komórki T może być zmierzona przez proliferację komórki T (przykładowo przy po₃ mocy włączania ³H tymidyny) lub wytwarzania cytokiny. Aktywacja komórek T CD4+ typu TH1 może przykładowo być wykryta przez wytwarzanie IFN-γ, co może być wykryte typowymi sposobami takimi jak oznaczenie ELISPOT.

Badania nad zachodzącymi peptydami zazwyczaj wskazują na obszary antygenu, w których umiejscowiony jest epitop. Minimalny epitop dla poszczególnej komórki T może następnie być oceniony przez pomiar odpowiedzi na skrócone peptydy. Przykładowo, jeśli odpowiedź jest uzyskana na peptydy zawierające aminokwasy 1-15 w bibliotece zachodzących na siebie peptydów, to dla identyfikacji minimalnego epitopu mogą być użyte zestawy, które są skrócone na obu końcach (np. 1-14, 1-13, 1-12 itp. i 2-15, 3-15, 4-15 itp.).

Identyfikacja immunodominujących obszarów antygenu przy pomocy oznaczeń in vitro (szczególnie tych wykorzystujących linie komórki T) jest wydedukowana dla przedstawienia zmienionego wzoru reaktywności peptydu. W badaniach dla identyfikacji epitopów MBP, które opisano w przykładach, użyto oznaczeń kinetyki odpowiedzi, w których mierzona jest proliferacja PBMC pochodzących od pacjentów z MS i osób zdrowych przeciw bibliotece zachodzących na siebie peptydów. Oznaczenie to jest oparte na odkryciu, że choć komórki T od osób zdrowych i pacjentów z MS reagują w podobny sposób na oczyszczony antygen białkowy, to reagują odmiennie na peptydy których sekwencja oparta jest na MBP. Komórki pacjentów z MS reagują silniej i kinetyka reakcji jest gwałtowniejsza w przypadku antygenów peptydowych w porównaniu z normalnymi, zdrowymi dawcami. Uniemożliwia to wyszukiwanie celem identyfikacji epitopów, na które określony pacjent reaguje w danym momencie. W opisanych tu badaniach podejście to ujawniło szereg obszarów zawierających epitop, których nie zidentyfikowano standardowymi sposobami. Ponadto pokazało, że rozpoznanie komórki T wykazuje cykliczny wzór pojawiając się w określonym momencie, zanikając i następnie pojawiając się później.

Opisane badania kinetyki dostarcza wartościowego narzędzia ponieważ ujawniają epitop, na który pacjent odpowiada w określonym czasie. Informacja ta może być użyta dla indywidualnego opracowania sposobu leczenia z podaniem apitopu określonemu pacjentowi przez zidentyfikowanie i podanie apitopu dla odpowiedniego epitopu (jeśli taki jest jeden). Informacja ta może również umożliwić opisanie ogólnego wzoru postępu choroby tak, że kompozycja lecznicza może być zaprojektowana tak aby zawierała apitopy dla epitopów, które przypuszczalnie występują w danym stadium choroby.

Systemy prezentacji niezależne od obróbki antygenu (APIPS).

Gdy epitop zostanie zidentyfikowany, następnym etapem jest badanie czy zachowuje się on również jak apitop.

Apitop musi być prezentowany komórkom T bez potrzeby obróbki antygenu. Posiadając już zidentyfikowane peptydy zawierające epitopy komórki T przy pomocy systemu bez obróbki, mogą być zidentyfikowane apitopy. Skrócone białka i analogi peptydu mogą być przetestowane pod względem aktywacji przy pomocy systemu prezentacji niezależnego od obróbki antygenu (APIPS).

Przykłady APIPS obejmują:

a) utrwalony APC (z lub bez przeciwciał dla CD28);

b) błony lipidowe zawierające cząsteczki MHC klasy I lub II (z lub bez przeciwciał dla CD28); i

c) oczyszczone naturalne lub zrekombinowane MHC w postaci związanej z szalką (z lub bez przeciwciał dla CD28).

Znane jest zastosowanie utrwalonych APC dla badań odpowiedzi komórki T, przykładowo w badaniach wykrywających w peptydzie minimalny epitop, przez pomiar odpowiedzi na skrócone peptydy (Fairchild i wsp. (1996) Int. Immunol. 8:1035-1043). APC mogą być utrwalone przy pomocy, przykładowo formaldehydu (zazwyczaj paraformaldehydu) lub aldehydu glutarowego.

PL 213 585 B1

Błony lipidowe (które mogą być błonami płaskimi lub liposomami) mogą być przygotowane przy pomocy sztucznych lipidów lub mogą być frakcjami plazmatycznych błon/mikrosomów z APC.

W użyciu, APIPS może być nałożony do studzienek płytek do hodowli tkankowej. Następnie dodawane są antygeny peptydowe i wiązanie peptydu do części MHC APIPS wykrywa się przez dodanie wybranych linii lub klonów komórki T. Aktywowanie linii lub klonu komórki T może być zmierzo₃ ne jakimkolwiek znanym sposobem, przykładowo przez wbudowanie ³H-tymidyny lub wydzielanie cytokiny.

Peptydy.

Pierwsza postać wynalazku dotyczy peptydów.

Termin peptyd jest użyty w normalnym znaczeniu oznaczając ciągi aminokwasów, typowo L-aminokwasów połączonych jeden z drugim typowo przez wiązania peptydowe pomiędzy grupami α-aminowymi i karboksylowymi kolejnych aminokwasów. Termin obejmuje zmodyfikowane peptydy i syntetyczne analogi peptydów.

Peptyd według niniejszego wynalazku może mieć jakąkolwiek długość i jest zdolny do wiązania się z cząsteczką MHC klasy I lub II bez dalszej obróbki.

Peptydy wiążące cząsteczki MHC klasy I mają typowo długość 7 do 13, częściej 8 do 10 aminokwasów. Wiązanie peptydu jest stabilizowane na jego dwóch końcach przez kontakt pomiędzy atomami łańcucha głównego peptydu i niezmienne miejsca w wiążącej peptyd bruździe wszystkich cząsteczek MHC klasy I. Na obu końcach bruzdy występują niezmienne miejsca wiążące amino i karboksylowy koniec peptydu. Zmiany w długości peptydu są dostosowywane przez skręcanie się wiązań peptydowych często przy resztach proliny lub glicyny, co umożliwia wymaganą giętkość.

Peptydy wiążące się z cząsteczkami MHC klasy II mają typowo długość pomiędzy 8 i 20 aminokwasów, częściej mają 10 do 17 aminokwasów długości i mogą być znacznie dłuższe. Peptydy te leżą w rozwiniętej konformacji wzdłuż bruzdy wiążącej peptyd MHC II, która (podobnie jak bruzda wiążąca peptyd MHC klasy I) jest otwarta na obu końcach. Peptyd jest utrzymany w miejscu głównie dzięki kontaktowi podstawowych atomów łańcucha w konserwowanych aminokwasach, które układają się wzdłuż bruzdy wiążącej peptyd.

Peptyd według niniejszego wynalazku może być przygotowany przy pomocy metod chemicznych (Peptide Chemistry, A Practical Textbook, Mikos Bodansky, Springer-Verlag, Berlin). Przykładowo, peptydy mogą być zsyntetyzowane sposobami na fazie stałej (Roberge JY i wsp. (1995) Science 269:202-204), odcięte od żywicy i oczyszczone przez preparatywną, wysoko rozdzielczą chromatografię cieczową (np. Creighton (1983) Proteins Structures And Molecular Principles, WH Freeman and Co., Nowy Jork NY). Automatyczna synteza może być przeprowadzona przykładowo przy pomocy ABI 43 1 A Peptide Sythesiser (Perkin Elmer) zgodnie z instrukcją załączoną przez producenta. Alternatywnie, peptyd może być przygotowany sposobami wykorzystującymi rekombinację lub odcięty od dłuższego polipeptydu. Przykładowo, peptyd może być uzyskany przez odcięcie od docelowego antygenu. Kompozycja peptydu może być potwierdzona przez analizę aminokwasu lub sekwencjonowanie (np. procedura degradacji Edmana).

W korzystnej postaci peptyd pochodzi z docelowego antygenu. Docelowy antygen jest cząsteczką (przykładowo białkiem lub glikoproteiną), która jest obrobiona przez APC i rozpoznana podczas trwania choroby przez komórki T. Docelowy antygen będzie oczywiście zależał od docelowej choroby. Korzystnie, peptyd pochodzi od fragmentu antygenu, który powstał przez naturalną obróbkę antygenu przez APC.

Dla celów praktycznych istnieją różne inne cechy, które peptyd powinien posiadać. Przykładowo, peptyd powinien być rozpuszczalny w stężeniach pozwalających na jego użycie in vitro. Korzystnie, peptyd powinien być rozpuszczalny w stężeniach 0,5 mg/ml, korzystniej peptyd powinien być rozpuszczalny w stężeniach do 1 mg/ml, najkorzystniej peptyd powinien być rozpuszczalny w stężeniu do mg/ml.

Dla podania donosowego maksymalna objętość dawki, która może być podana przy pomocy obecnych procedur wynosi około 200 μl na nozdrze. Jeśli peptyd jest rozpuszczony w stężeniu 1 mg/ml, podwójna dawka do każdego nozdrza umożliwia podanie pacjentowi 800 μg. Jest niezwykłym podanie więcej niż 5 μg jakiejkolwiek pojedynczej dawce.

Również ważne jest że peptyd jest dostatecznie stabilny in vivo i aby był użyteczny terapeutycznie. Odkryto, że w warunkach in vivo 30 minut po podaniu całkowita ilość testowanego peptydu spada do około 50%, 4 godziny po podaniu ilość spada do około 30%, lecz po 5 dniach peptyd jest nadal wykrywalny (w ilości wynoszącej około 5%). Półokres trwania peptydu in vivo powinien wynosić

PL 213 585 B1 przynajmniej 10 minut, korzystnie przynajmniej 30 minut, korzystniej przynajmniej 4 godziny i najkorzystniej przynajmniej 24 godziny.

Odkryto, że po podaniu donosowym ilość peptydu osiąga maksymalny poziom w węźle limfatycznym w 4 godziny po podaniu, jednak peptyd jest nadal wykrywalny (na poziomie około 5%) po 5 dniach. Korzystnie peptyd jest dostatecznie stabilny, aby występował w terapeutycznie aktywnym stężeniu w węźle limfatycznym przez czas dostatecznie długi dla uzyskania skutku leczniczego.

Peptyd powinien również wykazywać dobrą biodostępność in vivo. Peptyd powinien zachowywać in vivo konformację umożliwiającą wiązanie się z cząsteczką MHC na powierzchni komórki bez przeszkód.

Choroby docelowe.

Peptyd według wynalazku jest przeznaczony dla zastosowania w leczeniu i/lub zapobieganiu chorobie stwardnienia rozsianego.

Apitop dla MHC klasy II jest prawdopodobnie szczególnie użyteczny w chorobach, w których pośredniczą odpowiedzi komórki T CD4+. Przykładowo, choroby spowodowane przez lub utrzymywane przez nieodpowiednią lub nadmierną odpowiedź komórki T CD4+. Do chorób tych należą choroby autoimmunologiczne takie jak stwardnienie rozsiane.

Stwardnienie rozsiane (MS) jest przewlekłą chorobą ze stanem zapalnym charakteryzującą się licznymi, wielokrotnymi ubytkami z rozsianą demielinizacją w substancji białej CNS i występującymi w różnych miejscach i czasie (McFarlin i McFarland, 1982 New England J. Medicine 307: 1183-1188 i 1246-1251). Uważa się, że MS zależy od autoreaktywnych komórek T.

Peptyd przypuszczalnie będzie też użyteczny w leczeniu chorób z nadmiernym uczuleniem. Reakcje naduczuleniowe obejmują:

(i) alergie, wynikające z nieodpowiedniej odpowiedzi na nieszkodliwe substancje obce;

(ii) chorób autoimmunologicznych wynikających z odpowiedzi na własne antygeny tkankowe; i (iii) odrzut przeszczepu będący wynikiem reakcji na przeszczep.

Przykłady alergii obejmują lecz nie są ograniczone do: gorączki siennej, nabytej astmy, alergii na ugryzienia i ukłucia owadów, alergii na pokarm i leki, uczuleniowego nieżytu nosa, astmy oskrzelowej, przewlekłego zapalenia oskrzeli, zespołu anafilaksji, pokrzywki, obrzęku naczynioruchowego, atopowego zapalenia skóry, alergicznego kontaktowego zapalenia skóry, rumienia guzowatego, rumienia wielopostaciowego, zespołu Stevens-Johnson, zapalenia nosa i spojówki, zapalenia spojówki, zapalenia żył z nekrozą skóry, choroby ze stanem zapalnym płuc, pęcherzowe choroby skóry.

Przykłady chorób autoimmunologicznych obejmują, lecz nie są ograniczone do: reumatoidalnego zapalenia stawów (RA), ciążowego osłabienia mięśni (MG), stwardnienia rozsianego (MS), ogólnego tocznia rumieniowatego (SLE), autoimmunologicznego zapalenia tarczycy (zapalenie tarczycy Hashimoto), choroby Gravesa, choroby ze stanem zapalnym jelita, autoimmunologicznego zapalenia błony naczyniowej i śluzówki, zapalenia wielomięśniowego i w określonych rodzajach cukrzycy, ogólnego zapalenia żył, zapalenia wielomięśniowego - zapalenia mięśnia i skóry, stwardnienia ogólnego (łuszczyca), zespołu Sjogren'a, zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa i pokrewnych zesztywniających zwyrodnień stawów, gorączki reumatoidalnej, zapalenia płuc z nadwrażliwością, alergicznej oskrzelowo - płucnej aspergillozie, pylicy płuc wywołanej kurzem nieorganicznym, sarkoidozy, autoimmunologicznej anemii hematolitycznej, immunologicznych chorób płytek, chorób wywołanych zimnem takich jak kriofibrynogenemia i autoimmunologicznych mnogich endokrynopatii.

W medycynie klinicznej powszechnie jest przeszczepianych wiele tkanek w tym nerka, wątroba, serce, płuco, skóra, rogówka i szpik kostny. Wszystkie przeszczepy z wyjątkiem rogówki i czasem szpiku obecnie zazwyczaj wymagają długotrwałej immunosupresji.

W pewnej postaci wynalazku peptyd jest użyty w leczeniu i/lub zapobieganiu cukrzycom. W tej postaci peptyd może być wyprowadzony z docelowego antygenu IA2.

Peptyd może pochodzić od jednego z autoantygowych zasadowych białek mieliny (MBP) lub białka proteolipidu (PLP). MBP jest przypuszczalnie bardziej odpowiednie niż PLP, ponieważ PLP jest wysoce hydrofobowe i pochodzące od niego peptydy wykazują skłonność do sklejania się ze sobą. MBP jest immunogeniczne i specyficzne wobec MBP limfocyty T mają aktywność powodującą zapalenie mózgu u zwierząt (Segal i wsp., 1994 J. Neuroimmunol. 51:7-19; Voskuhl i wsp., 1993 J. Neuroimmunol. 42:187-192; Zamvil i wsp., 1985 Nature 317:355-8).

Apitopy dla MHC klasy I mogą być użyte przykładowo w celu modyfikacji przeciw wirusowych odpowiedzi CD8+ w sposób powodujący tolerancję.

PL 213 585 B1

Kompozycja farmaceutyczna.

W niniejszym wynalazku przewiduje się, że pomimo supresji obocznej niezbędnym może być kierowanie szeregu różnych klonów komórki T w celu skuteczniejszej tolerancji. Dlatego dla zapobieżenia chorobie lub celu leczenia choroby można podawać osobnikowi wiele peptydów.

W następnym aspekcie niniejszy wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznej zawierającej liczne epitopy.

Kompozycja farmaceutyczna może zawierać przykładowo od dwóch do 50 apitopów, korzystnie pomiędzy 2 i 15 apitopów.

Kompozycja farmaceutyczna może zawierać jeden lub więcej peptydów MBP, które wykazują działanie takie jak apitopy według wynalazku, które obejmują następujące peptydy 80-94, b3-99, 81-95, 82-96, 83-97, 84-98, 110-124, 130-144, 131-145, 132-146, i 133-147.

Apitopy mogą pochodzić z tego samego lub różnych docelowych antygenu(ów). Korzystnie apitopy są zarówno wszystkie zdolne do wiązania MHC klasy I lub wszystkie są zdolne do wiązania MHC klasy II bez dalszej obróbki. W korzystnej postaci wszystkie apitopy w kompozycji farmaceutycznej są zarówno zdolne do wiązania MHC klasy I lub klasy II bez dalszej obróbki.

Kompozycja farmaceutyczna może być w postaci zestawu, w którym niektóre lub każdy z apitopów jest dostarczony niezależnie dla równoczesnego, oddzielnego lub sekwencyjnego podania.

Alternatywnie (lub ponadto) jeśli kompozycja farmaceutyczna (lub jakakolwiek jej część) jest podana w wielu dawkach, każda dawka może być zapakowana oddzielnie.

Kompozycja farmaceutyczna może zawierać terapeutycznie lub profilaktycznie skuteczną ilość każdego apitopu i ewentualnie farmaceutycznie akceptowalny nośnik, rozpuszczalnik lub wypełniacz.

Również w kompozycjach farmaceutycznych według niniejszego wynalazku określony lub każdy epitop może być zmieszany z jakimkolwiek lepiszczem(ami), lubrykantem(ami), czynnikiem(ami) zawieszającymi, czynnikiem(ami) powlekającymi lub czynnikiem(ami) rozpuszczającymi.

Podawanie

Peptyd powinien być podany w postaci rozpuszczonej bez adjuwanta.

Korzystnie, peptyd jest podany przez śluzówkę.

Badania pokazały, że peptyd gdy podany dootrzewnowo (i.p.) w postaci rozpuszczonej, dożylnie (i.v.) lub donosowo (i.n.) lub doustnie może indukować tolerancję komórki T (Anderton i Wright (1998) jak wyżej; Liu i Wright (1995) jak wyżej; Metzler i Wright (1999) Immunology 97 :257-263).

Korzystnie, peptyd jest podawany donosowo.

Badania na myszach pokazały, że czas podawania peptydu wymagany dla indukcji tolerancji zależy od częstości prekursora komórek T u biorcy (Burkhart i wsp. (1999) jak wyżej). W wielu badaniach doświadczalnych pokazano, że powtarzane dawki peptydu są wymagane dla indukcji tolerancji (Burkhart i wsp. (1999) jak wyżej). Dokładna dawka i liczba dawek peptydu będzie co za tym idzie zależała od osobnika, jednakże w korzystnej postaci podanych jest wiele dawek.

Jeśli wiele peptydów jest podanych równocześnie mogą być one w postaci koktajlu, który jest dogodny dla podania w pojedynczej lub wielu dawkach. Alternatywnie, korzystne może być podanie wielu dawek, lecz różniących się stężeniem peptydu pomiędzy dawkami.

W korzystnej postaci można postępować zgodnie z protokołem nasilania dawki, gdzie wiele dawek jest podanych w określonych stężeniach pacjentowi. Podejście takie zostało zastosowane przykładowo dla peptydów A2 fosfolipazy w immunoterapeutycznych zastosowaniach przeciw uczuleniu na jad (M^ler i wsp. (1998) J. Allergy Clin. Immunol. 101: 747-754 i Akdis i wsp. (1998) J. Clin. Invest. 102:98-106).

Przykłady

Poniższe przykłady służą do zilustrowania wynalazku.

P r z y k ł a d 1 - Identyfikacja epitopów komórki T w MBP.

Materiały i metody.

Antygeny

Ludzki MBP jest przygotowany z białej substancji mózgu jak to opisali Deibler i wsp. (Deibler i wsp., 1972 Preparative Biochemistry 2:139), a jego czystość oceniano w SDS-PAGE. MBP i oczyszczone pochodne białka Mycobacterium tuberculosis (PPD) (UK Central Veterinary Laboratory, Surrey) użyto do oznaczania proliferacji we wcześniej określonych optymalnych stężeniach; optymalne stężenie dla każdego antygenu wynosiło 50 μg/ml. Zestaw 15 aminokwasowych zachodzących na siebie peptydów pokrywających całą cząsteczkę MBP jest zsyntetyzowany przy pomocy standardowej chemii F-moc przy pomocy syntetyzera peptydów Abimed AMS 422 (Abimed, Langenfeld, Niemcy).

PL 213 585 B1

Każdy peptyd jest przesunięty względem innego o pięć aminokwasów i pokrywa się co 10 aminokwasów. Wytworzono 33 peptydy, które połączono w grupy po trzy i pule testowano w optymalnym stężeniu 50 μg/ml tak, że in vitro każdy peptyd jest prezentowany w stężeniu 16,6 μg/ml.

Pacjenci i grupy kontrolne.

Grupy badane obejmują dwunastu pacjentów z rozpoznanym klinicznie lub laboratoryjnie MS (Poser i wsp., 1983) w zakresie wiekowym 29-51 lat. Ośmiu z dwunastu pacjentów uczestniczy w leczeniu interferonem-β, podczas gdy inni pacjenci MS nie byli poddani leczeniu kortykosterydami przez okres ostatnich trzech miesięcy przed rozpoczęciem badania. Grupa kontrolna obejmuje 13 zdrowe osoby w wieku od 25 do 55 lat, z których żadna nie została poddana leczeniu z immunosupresją przez ostatnie 3 miesiące przed pobraniem próbki krwi.

Pożywki do hodowli tkankowej.

Jako pożywka do hodowli tkankowej użyta została pożywka RPMI-1640 uzupełniona 20 mM HEPES (Sigma, Poole, UK), penicyliną (100 U/ml), siarczanem streptomycyny (100 mg/ml) i 4 mM L-glutaminą (wszystkie z Life Technologies, Paisley, Szkocja). Pożywkę bez surowicy użyto dla płukania komórek Iimfoidalnych i TCL. Dia wszystkich warunków hodowli i oznaczeń pożywka jest uzupełniona 10% inaktywowaną termicznie autologiczną plazmą.

Warunki hodowli i oznaczenia proliferacji komórki T.

Krew obwodową cytrynianową (50-100 ml) zebrano przez nakłucie żylne od każdego podmiotu po otrzymaniu zgody na piśmie. Z krwi wyizolowano obwodowe, jednojądrowe komórki krwi (PBMC) przez wirowanie w gradiencie gęstości na Histopaque-1077 (Sigma, Poole, UK) i hodowano w 1,5 ml objętości na 24-studzienkowych płytkach (Nunc International, Costar, Corning Inc., Nowy Jork, USA) w stężeniu 1 x 10⁶ komórek na ml zawierających zarówno PPD, MBP lub peptydy MBP. Płytki inkubowano w 37°C w wilgotnej atmosferze z 5% CO2/95% powietrze. Pomiędzy dniami 5 i 14 pobierano z każdej hodowli 100 μl próbki w dwóch powtórzeniach, przenoszono je do 96-studzienkowej płytki do ₃ mikromiareczkowania o studzienkach z okrągłym dnem i podawano impulsowi 0,4 μφ [ H] tymidyny (Amersham International, Amersham, UK). Po 18 godzinach komórki zbierano na macie z włókna szklanego (LKB-Wallac, Turku, Finlandia) stosując urządzenie Mach 111 Harvester 96 (Tomtec, ₃

Orange, New Jersey, USA). Wbudowanie [³H] tymidyny określono stosując cieczowy licznik scyntylacyjny Microbeta (LKB-Wallac). Testowe studzienki zawierające antygen są uznane za pozytywne gdy 5cpm>1000 i Indeks Pobudzenia (SI)>3, gdzie SI=CPM hodowli zawierającej antygen/CPM hodowli bez antygenu.

Wytwarzanie linii komórkowych T i klonów komórki T.

Specyficzne dla MBP linie komórkowe komórki T (TCL) wygenerowano z 8 pacjentów MS i z 2 zdrowych dawców kontrolnych. PBMC od każdego podmiotu rozdzielono jak opisano powyżej i nałożono w ilości 1 x 10⁶ komórek/ml do 6-studzienkowych płytek w obecności MBP (50 μg/ml); porcja PBMC od każdego podmiotu jest zawsze zamrażana i przechowywana do kolejnych restymulacji. Siedem dni później komórki są dokarmiane świeżą pożywką zawierającą 2% IL-2 (Lymphocult-HT; Biotest LTD., Birmingham, UK) i 12 dnia hodowli wszystkie komórki są ponownie pobudzane antygenem IL-2 i napromieniowywane (2500 radów) autologiczne PBMC jako źródło komórek prezentujących antygen (APC) przy następującej proporcji komórek - 1 komórka T na 5 APC. Komórki są posiewane w IL-2 co 3-4 dni i dnia 14 są ponownie pobudzone antygenem IL-2 i PBMC jak to opisano powyżej. W dniu pierwszego ponownego pobudzenia komórki są badane pod względem specyficznej prolifera45 cji MBP. W skrócie, 2 x 10⁴ komórek T i 1 x 10⁵ napromieniowanych, autologicznych PBMC hodowano w trzech powtórzeniach na płytkach o 96 okrągło dennych studzienkach w obecności MBP. Komórki ₃ hodowano przez dwa dni i podano impulsowi ( H)-tymidyny w ilości 0,4 μCi/studzienkę podczas ostatnich 18 godzin hodowli. Następnie komórki zebrano jak opisano powyżej i TCL było uznawane jako specyficzne dla MBP przy 5cpm>1000 i SI>3.

Po 3 cyklach pobudzania/posiewanie TCL sklonowano przy pomocy PHA (Sigma, Poole, Dorset, UK)) w obecności autologicznych, napromieniowanych PBMC jako APC. Komórki T nanoszono przy warunkach ograniczonych rozcieńczeń wynoszących 0,1 komórki/studzienkę, 0,3 komórki/studzienkę i 1 komórka/studzienkę i hodowano je na szalkach Terasaki (Nunc International Costar) z 1 x 10⁴ napromieniowanych PBMC 5 μg/ml PHA i 2% IL-2. Po 10-12 dniach komórki z szalek, w których zaobserwowano wzrost rozprowadzono na płytkach z 96 okrągło dennymi studzienkami ₅ stosując 1 x 10 napromieniowanych PBMC, 5 μg/ml PHA i IL-2. Trzy dni później komórki w studzienkach są dokarmiane świeżą pożywką zawierającą IL-2 i dnia siódmego klony rozprowadzano na 48₅

-studzienkowych płytkach przy pomocy 5 x 10⁵ napromieniowanych PBMC, PHA i IL-2; w tym

PL 213 585 B1 momencie klony są badane w oznaczeniach proliferacji na specyficzność odpowiedzi na MBP. MBP-specyficzne klony rozprowadzano dwa tygodnie później na 24-studzienkowych płytkach przy pomocy

I x 10⁶ napromieniowanych PBMC z PHA lub Dynabeads (Dynal, UK) i IL-2. Klony te są utrzymywane w 24-studzienkowych płytkach stosując 7-10 dniowe cykle ponowne pobudzanie/namnażanie, zasadniczo jak to opisano powyżej. Zdolność klonów komórki T (TCC) do rozpoznania zestawu peptydów MBP jest testowana przez oznaczenia proliferacji jak to opisano powyżej.

Wyniki

Rozpoznawanie peptydu MBP u pacjentów z MS i u osób zdrowych.

Zastosowano oznaczanie kinetyki odpowiedzi w której testowano PBMC od pacjentów MS i osób zdrowych z uwagi na ich zdolność do odpowiedzi na zestaw zachodzących na siebie 15 aminokwasowych syntetycznych peptydów pokrywających pełną długość ludzkiego MBP. Odpowiedź proliferacyjną PBMC z każdej hodowli badano w 5 punktach czasowych przez okres 2 tygodni i porównano profile kinetyczne odpowiedzi na MBP i peptydy z odpowiedzią na PPD, ta ostatnia przedstawia wtórną odpowiedź/pamięć antygenowa. Nie stwierdzono istotnych różnic w odpowiedzi PBMC na MBP i/lub peptydy między pacjentami leczonych interferonem-β i tymi, którzy nie byli leczeni (wyniki nie prezentowane). Odpowiedź na MBP zarówno i u pacjentów MS jak i zdrowych osób stanowiących grupę kontrolną osiąga maksimum później niż odpowiedź na PPD, przez co następuje po charakterystyce kinetyki odpowiedzi na nieprzypominający antygen. Fig. 1 przedstawia typowy przykład profilu kinetyki dla PPD i MBP u pacjentów i osób zdrowych.

Jak pokazano na Fig. 2, dwoma peptydami najczęściej rozpoznawanymi przez pacjentów z MS są peptydy 90-114 i 75- 99 (6/12 pacjentów każdy), następnie obszary 30-54, 135-159 i 150-170 (5/12 pacjentów) i 1-24 i 105-129 (4 na 12 pacjentów). Trzech pacjentów reaguje na 15-39 i 120-144. Dwóch pacjentów rozpoznaje 45-69 i żaden z pacjentów z MS nie rozpoznaje obszaru 60-84.

Zgodnie z Fig. 10, gdzie wszyscy pacjenci są HLA-DR2 pozytywni, dwoma peptydami najczęściej rozpoznawanymi przez pacjentów z MS są 90-114 i 75-99 (6 na 11 pacjentów każdy), a następnie obszary 120-144, 135-159 i 150-170 (5 na 11 pacjentów) i 1-24, 15-39, 30-54 i 105-129 (4 na

II pacjentów). Pacjenci ci reagują na aminokwasy 45-69 i żaden z pacjentów nie rozpoznaje obszaru 60-84.

Przeciwnie do powyższego, osoby zdrowe rozpoznają znacząco mniej peptydów i jedynie 2 osoby z grupy kontrolnej reagują na więcej niż dwa peptydy (C i J; Fig. 3). Osoby z grup kontrolnych C i J są jedynymi dwiema osobami rozpoznającymi aminokwasy 60-84, obszar niedostrzegany przez tą grupę pacjentów. Co interesujące, obie te osoby mają ekspresję allelu DRB1* 0701. Obszary 45-69 i 105-129 nie są rozpoznawane przez żadnego zdrowego dawcę, podczas gdy 75-99 i 150-170 są rozpoznawane przez 4 zdrowe osoby; 135-159 jest rozpoznawany przez 3 zdrowe osoby; 1-24, 30 -54, 60-84 i 120-144 jest rozpoznawany przez dwie zdrowe osoby; a 15-39 i 90-114 są rozpoznawane jedynie przez jedną osobę. Ogólnie, 8 na 13 zdrowych osób nie reaguje na żaden z zachodzących na siebie peptydów, podczas gdy jedynie 1 na 12 pacjentów MS (MS 19) konsekwentnie nie rozpoznaje peptydów MBP. Co interesujące, pacjent ten jest unikalny jeśli chodzi o nie rozpoznawanie białka MBP.

Figura 11 przedstawia również reakcję osób zdrowych na białka MBP. W badaniach tych jedynie 1 osoba z grupy kontrolnej reagowała na więcej niż 2 peptydy (N11). N11 jest również jedyną osobą rozpoznającą aminokwasy 60-84, obszar nie dostrzegany przez tą grupę pacjentów. Obszary 15-39, 45-69 i 105-129 nie są rozpoznawane przez żadnego ze zdrowych dawców, podczas gdy 120 -144 i 135-159 są rozpoznawane przez dwóch zdrowych dawców; i 1-24, 30-54, 60-84, 75-99, 90-14 i 150-170 rozpoznała jedna osoba. Ogólnie, 9 na 12 zdrowych osób nie reaguje na żaden z zachodzących na siebie peptydów.

Ogólnie dzień w którym pojawia się reakcja na MBP i/lub był maksimum (pik) dla peptydów nie różnił się znacząco pomiędzy osobami zdrowymi a pacjentami, a kinetyka dla obu grup przypomina tą dla pierwotnej odpowiedzi antygenowej. Ponadto, wielkość odpowiedzi na MBP i peptydy nie różni się między pacjentami i osobami zdrowymi.

Rozpoznawanie zmian MBP-peptyd w czasie.

Określiwszy odpowiedź pacjentów z MS na szeroki wachlarz peptydów MBP zdecydowano się zbadać czy rozpoznanie PBMC u tych samych osób jest skupione i stałe przez czas wynoszący około 4-12 miesięcy. Jak przedstawiono na Fig. 2, 10 i 3 ani pacjenci z MS ani osoby zdrowe nie ujawniły tego samego wzoru rozpoznania peptydu.

PL 213 585 B1

Figura 4 przedstawia przykład pacjenta z MS (MS 49), który reaguje na wiele peptydów w dwóch różnych punktach czasowych, lecz profil rozpoznawania w drugim punkcie czasowym mierzony 4 miesiące później, różni się znacząco. To znaczy, w drugim badaniu kinetyki odpowiedź PBMC na 15-39, 30-54 i 150-170 utrzymywała się, jednak odpowiedź na 75-99 i 105-129 zanikała i przesuwała się na obszary 90-114 i 135-159.

Figura 5 (MS 60) ilustruje przykłady pacjentów, u których odpowiedź epitopu ogranicza się do odpowiedzi zogniskowanej przez okres 4 miesięcy. Osoby zdrowe badane po raz drugi nie reagowały na żaden z peptydów (Fig. 3).

Ogólnie wyniki pokazują, że pacjenci z MS nie wykazują zestawu wzorów rozpoznawania. U każdego z pacjentów odpowiedź PBMC na kilka peptydów może utrzymywać się, ulegać zanikowi i przesunąć się na nowe obszary MBP jak to zaobserwowano u pacjenta MS 49.

Cykliczność rozpoznawania peptydu.

Gdy analizowano odpowiedź PBMC na peptydy w trzech lub więcej różnych punktach czasowych przez okres 12 miesięcy, staje się jasnym, że u określonych pacjentów rozpoznawanie epitopu okazuje się raczej wahać niż nieodwracalnie przesuwać na nowe obszary peptydu. Przykładowo, jak pokazano na Fig. 2 i 10 pacjent MS60 ujawnia cykliczny wzór rozpoznawania aminokwasów 120-144 i 135-159; to jest reszty aminokwasowe 120-144 i 135-159 znajdują się wśród rozpoznawanych w pierwszym punkcie czasowym badania, reakcja na te 2 obszary zanika podczas drugiego badania i następnie pojawia się ponownie w trzecim punkcie czasowym pomiaru 4 miesiące później. Profil kinetyczny pacjenta MS41 ujawnia podobnie, że rozpoznawanie aminokwasów 135-159 waha się w kilku punkach czasowych (Fig. 2 i 10).

W grupie kontrolnej zdrowych osób (Fig. 3) jedna osoba (M) ujawnia wahania odpowiedzi na obszary 75-99 i 135-159, druga osoba (F) rozpoznaje 75-99 w dwóch z trzech badanych punktach czasowych, w których przeprowadzono badania, podczas gdy trzecia osoba (D) ujawnia cykliczną odpowiedź na reszty aminokwasowe 15-39.

Precyzyjne mapowanie odpowiedzi na MBP.

TCC generowano od 8 pacjentów z MS i od 2 osób zdrowych, i użyto dla wyjaśnienia dokładanej specyficzności obszarów peptydu zidentyfikowanych w oznaczeniach kinetyki odpowiedzi. Specyficzność każdego TCC badano poprzez jego odpowiedź poprzez proliferacje na zestaw 15-merowych peptydów. Klon SD:A7 rozpoznawał obszar 1-24 i w obrębie tego obszaru TCC reagowały na aminokwasy 5-19. Obszar 30-54 jest rozpoznawany przez 4 klony (MS49:D3, MS49:C8, MS49:A8, MS49:B6) a epitopem w obrębie tego obszaru jest 30-44. Jeden klon (MS39:D7) od pacjenta z MS rozpoznaje peptyd 60-74 i co interesujące jedna zdrowa osoba reaguje na ten obszar (60-84) w badaniu kinetyki odpowiedzi. Pięć klonów (MS43:A7, MS41:B6, MS41:A2, MS41:C6, N5:8) rozpoznaje aminokwasy 83-99 zawarte w obszarze 75-99. Jeden pacjent wytwarzał TCC specyficzne dla aminokwasów 110-124 (MS60:A2, MS60:B3) zawarte w puli 105-129 i inne TCC od tego samego pacjenta są specyficzne względem 130-144 (MS60:E1), stwierdzonych w obszarze 120-144. Pięć osób wytwarza klony rozpoznające epitopy w obszarze 135-159: MS60:F7, MS60:D1, MS59:F1 i N5:19 rozpoznaje aminokwasy 140-154; MS57:A1 jest specyficzny dla 140-149 i TCC MS17:A3 odpowiada na sekwencję 130-144. Ten zestaw klonów jasno pokazuje obecność co najmniej 2 epitopów komórki T w obszarze 135-159 MBP. Ostatecznie, obszar 150-170 jest rozpoznawany przez dwa klony specyficzne dla aminokwasów 156-169. Specyficzność wszystkich TCC podsumowano na Fig. 6.

P r z y k ł a d 2 - Identyfikacja epitopów w MBP.

Materiały i metody.

Oznaczenie prezentacji antygenu przy pomocy APIPS.

Prezentacja peptydów klonom komórki T jest mierzona przez proliferację. APC są utrwalone ₅ w 0,5% paraformaldehydzie i nanoszone w ilości 1 x 10⁵ komórek na 96-studzienkową płytkę do hodowli tkankowej. Klony komórek T są nakładane w ilości 2 x 10⁴ komórek na studzienkę w obecności różnych stężeń peptydów. Po inkubacji przez 48 godz., w 37°C proliferacje mierzy się przez włączanie ₃

[³H] tymidyny przez 16-20 godz. Wyniki są porównane ze zdolnością komórek T do odpowiedzi na epitop prezentowany przez żywe APC.

Prezentacja peptydów komórkom T wyizolowanym z transgenicznej myszy DR2:MBP82-100 by₅ ła zasadniczo taka jak opisano powyżej z wyjątkiem tego, że APC posiano w ilości 5 x 10⁵ komórek na ₅ studzienkę. Komórki T posiano w ilości 1 x 10⁵ komórek na studzienkę i inkubację prowadzono przez ₃ godz. przed dodaniem [³H] tymidyny.

PL 213 585 B1

Wyniki

W doświadczeniach tych peptydy zidentyfikowane jako epitopy we wcześniejszych przykładach są sprawdzane z uwagi na ich zdolność do bycia prezentowanymi przez APIPS. Wyniki przedstawiono na Fig. 7B. Z pięciu przebadanych do tej pory epitopów w przypadku czterech stwierdzono, że są apitopami (30-44, 80-94, 110-124 i 130-144) i w przypadku jednego stwierdzono, że działa jako epitop lecz nie jako apitop (156-170).

P r z y k ł a d 2A. Badanie peptydów MBP 30-44, 110-124, 130-144 i 156-170.

Celem badania czy różne peptydy MBP są apitopami sprawdzano ich zdolność do bycia prezentowanymi komórkom T przez utrwalone APC. Żywe lub wcześniej poddane pulsowi komórki Mgar (HLA-DR2+ve), podano pulsowo peptyd w surowicy lub samą surowicę przez 3,5 godziny. Następnie z komórek usuwano nadmiar peptydu i dodano odpowiedni klon komórki T. Proliferacyjną odpowiedź ₃ komórki T zmierzono na podstawie wychwytu ³H-tymidyny.

Jak pokazano na Fig. 8 i 9, peptydy 30-44 (Fig. 8A), 110-124 (Fig. 8B) i 130-144 (Fig. 9A) mogą być prezentowane przez utrwalone APC bez dalszej obróbki. Co za tym idzie peptydy te są określone jako apitopy. Z drugiej strony peptyd 156-170 wymaga dalszej obróbki aby był prezentowany na komórkach T (Fig. 9B). Utrwalone APC są niezdolne do prezentowania tego epitopu komórkom T, tak więc 156-170 nie jest apitopem.

P r z y k ł a d 2B - Identyfikacja apitopów w obrębie obszarów 77-100 i 125-148 MBP.

Dla każdego danego epitopu może występować jeden lub więcej apitopów zdolnych do bycia prezentowanymi APC bez dalszej obróbki. Obecność apitopów w dwóch obszarach MBP badano inkubując żywe lub utrwalone p-formaldehydem komórki Mgar (HLA-DR2+ve) inkubowane z zachodzącymi na siebie peptydami w surowicy z obszarów MBP 77-100 (Fig. 12) i 125-148 (Fig. 13) lub w samej surowicy. Dodano komórki T i po 72 godz. (Fig. 12) lub po 48 godzinach (Fig. 13) proliferacyjną ₃ odpowiedź komórki T mierzono wychwytem ³H-tymidyny. Dla MBP 77-100 komórki T wyizolowano z transgenicznych myszy DR2:MBP 82-100, podczas gdy dla MBP 130-144 użyto klonu komórek MS17:A3.

Dla obszaru 77-100 MBP poniższe peptydy są zdefiniowano jako apitopy:

MBP 83-99 ENPVVHFFKNIVTPRTP

MBP 80-94 TQDENPVVHFFKNIV

MBP 81-95 QDENPVVHFFKNIVT

MBP 82-96 DENPVVHFFKNIVTP

MBP 83-97 ENPVVHFFKNIVTPR

MBP 84-98 MPVVHFFKNIVTPRT

Minimalna sekwencja MBP rozpoznawana przez komórki T z transgenicznej myszy DR2 MBP 82-100 jest obszarem 85-94.

Dla obszaru 125-148 MBP następujące peptydy zdefiniowano jako apitopy:

MBP 130-144 RASDYKSAHKGFKGV

MBP 131-145 ASDYKSAHKGFKGVD

MBP 132-146 SDYKSAHKGFKGVDA

MBP 133-147 DYKSAHKGFKGVDAQ

Minimalną sekwencją MBP rozpoznawaną przez klon MS17.-A3 komórki T jest obszar 133-144.

P r z y k ł a d 2C. Badania obszaru MBP 89-101.

Wcześniej pokazano, że w przeciwieństwie do pozostałych mielinowych epitopów komórki T podanie peptydu 89-121 w rozpuszczonej postaci nie zapobiega u myszy doświadczalnie wywołanemu autoimmunologicznemu zapaleniu mózgu i rdzenia (EAE) wywołanemu przez całą mielinę lub sam peptyd 89-101 (Anderton i Wright (1998) Eur. J. Immunol. 28 : 1251).

MBP 89-101 zawiera trzy epitopy komórki T.

W celu zbadania reaktywności komórki T na obszar 81-111 z MBP komórki węzła Iimfatycznego z myszy pobudzone 81-111 indukowano in vitro 81-111 i komórki te badano wobec zestawu zachodzących na siebie 10-merowych peptydów przesuniętych względem siebie o dwa aminokwasy i pokrywających obszar 81-111 (konkretnie 81-90, 83-92, 85-94, 87-96, 89-98, 91-100, 93-102, 95-104, 97-106, 99-108 i 101-111). Wzór odpowiedzi na peptydy pokrywające obszar 89-101 ujawnił zdolność do pobudzania pięciu kolejnych peptydów (N-koniec 87-96 do 95-104) oddając występowanie przynajmniej dwóch (i przypuszczalnie trzech) oddzielnych epitopów.

PL 213 585 B1

W celu dalszego zbadania tego obszaru wygenerowano trzy sub-linie z pierwotnej linii komórki T reagującej na 81-111 i były one następnie re-testowane zestawem nachodzących na siebie 10-aminokwasowych peptydów przesuniętych względem siebie o 1 aminokwas i pokrywających rejon 84-106. Wyniki ujawniły występowanie trzech różnych, lecz zachodzących na siebie epitopów komórki T w obrębie sekwencji 89-101: 89-94, 92-98 i 95-101 (patrz Fig. 14).

Peptyd MBP 92-98 jest kryptycznym epitopem.

Trzy specyficzne epitopowo linie komórki T (TCL) ujawniają interesujące różnice, gdy są badane z uwagi na reaktywność na peptyd 89-101 i całe zrekombinowane MBP. Wszystkie trzy TCL reagują na peptyd (89-101) lecz jedynie specyficzny wobec 89-94 i 95-101 TCL reaguje na cały MBP. Wykazuje to, że obróbka antygenowa nienaruszonego MBP preferencyjnie generuje ligandy dla komórek T rozpoznające 89-94 i 95-101 lecz nie rozpoznające 92-98. Sugeruje to, że epitop 92-98 jest kryptyczny (tj. nie może być wytworzony przez obróbkę naturalnego antygenu). Wydaje się, że peptyd 89-101 MBP może uczestniczyć w trzech różnych oddziaływaniach z cząsteczką MHC prowadząc do peptydu/ligandów MHC, które są rozpoznawane przez trzy niezależne populacje komórki T. Jednakże obróbka MBP generuje jedynie ligandy dla dwóch z tych populacji komórki T (patrz Fig. 14).

Indukcja EAE wymaga rozpoznania przez komórkę T autoantygenowych epitopów wyrażanych w CNS jako wynik degradacji nienaruszonego MBP. Immunizacja myszy peptydami daje tylko jeden z trzech wcześnie zidentyfikowanych epitopów komórki T pokazując, że jedynie one zawierają epitop powstały w wyniku naturalnej obróbki (89-94 lub 95-101) i są zdolne do indukcji EAE. To dodatkowo potwierdza spostrzeżenie, że 92-98 jest epitopem kryptycznym.

Peptyd MBP 92-98 jest dominującym epitopem dla obszaru MBP 89-101.

Jak wspomniano powyżej obszar 89-101 zawiera trzy wyróżnialne, lecz zachodzące na siebie peptydy. Spośród nich peptyd 92-98 wydaje się być dominującym dla tego rejonu. Przykładowo, gdy klony komórki T są gerowane z myszy pobudzonych peptydem 89-101 wszystkie sześć wytworzonych klonów reaguje na 92-98. Stosując analogi peptydów 89-101 zawierające pojedyncze podstawienia w każdym miejscu alaniną stwierdzono, że podstawienie każdego miejsca w 92-98 prowadzi do utraty reaktywności, pokazując że zmiana jakiegokolwiek aminokwasu w obrębie rdzenia 92-98 ma ogromny wpływ na rozpoznawanie tego epitopu.

Peptyd MBP 89-101 traci zdolność do wywoływania tolerancji komórek T rozpoznających naturalnie obrabiany epitop MBP, zależnej od EAE.

Streszczając powyższe odkrycie stwierdzono, że a) sekwencja 89-101 posiada zdolność do generowania różnych epitopów komórki T; b) jedynie dwa z tych epitopów (89-94 i 95-101) są wytworzone przez obróbkę antygenową niezmienionego MBP (zarówno in vitro jak i in vivo); c) jedynie peptydy posiadające naturalnie obrabiane epitopy, a nie te posiadające epitop kryptyczny są skuteczne w indukcji EAE; d) peptyd 89-101 nie posiada zdolności do ochrony przeciw EAE w doświadczeniach z leczeniem peptydem.

Informacja ta dostarcza podstawy dla badania hipotezy, że peptyd 89-101 utracił zdolność wywoływania tolerancji względem EAE przez utratę bezpośredniego łączenia się z komórkami T związanymi z chorobą. Dla wsparcia tej hipotezy peptyd (89-101) powinien utracić zdolność do wywoływania tolerancji względem głównego epitopu związanego z zapaleniem mózgu (89-94) ponieważ nie wiąże _S on bezpośrednio do elementu restrykcyjnego MHC (IA^S) w odpowiedniej konformacji. Innymi słowy 89-101 nie będzie działał jako apitop dla komórek T rozpoznających 89-94.

Dla sprawdzenia tej możliwości przeprowadzono doświadczenia nad tolerancją z udziałem peptydów 89-101 i 87-96 (Fig. 15 A i B). Peptyd 87-96 zawiera epitop (89-94) najbardziej skuteczny w indukcji EAE.

Metody

Mysz otrzymała 200 μg peptydu w PBS lub tylko PBS dootrzewnowo w dniach -8, -6, i -4 przed podaniem 100 μg peptydu w pełnym adiuwancie Freunda w dniu 0. Po 10 dniach pobrane komórki 5 -5 węzła Iimfatycznego (6 x 10⁵ na studzienkę) hodowano w pożywce X-Vivo 15 uzupełnionej 5 10^-5 M

2-merkaptoetanolem i 2 M L-glutaminą z antygenem lub bez antygenu przez 72 godziny. Hodowlom ₃ podawano impulsowi H-tymidyny 0,5 μφ przez ostatnie 16 godzin i wbudowanie zmierzono przy pomocy cieczowego licznika scyntylacyjnego. Wyniki wyrażono jako wartości średnie zliczeń na minutę uzyskane dla trzech hodowli.

PL 213 585 B1

Wyniki

Pobudzenie za pomocą 87-96 indukowało silną odpowiedź pamięci immunologicznej na ten sam peptyd i słabszą na 89-101 (odpowiednio Fig. 15 A i B □ i o). Jest to zgodne z potrzebą obróbki antygenu dla wytworzenia 89-94 z 89-101. Użycie 87-96 jako tolerogenu przed pobudzeniem za pomocą 87-96 hamowało odpowiedź zależną od pamięci immunologicznej na zarówno 87-96 i 89-101 (Fig. 15A i ·). Zgadza się to z komórkami T reaktywnymi względem 89-94, które gdy raz staną się niewrażliwe in vivo tracą zdolność do reakcji in vitro na 89-94, choć są one wygenerowywane z 89-96 lub 89-101. Zasadniczo jednak zastosowanie 89-101 jako tolerogenu przed pobudzeniem za pomocą 87-96 nie hamuje odpowiedzi przypominających (ang. recall responses) zarówno na 87-96 ani na 89-101 (Fig. 15B A i ·). Dane te pokazują, że podanie peptydu 89-101 w postaci tolerogennej nie wywołuje tolerancji na naturalnie obrabiany epitop związany z zapaleniem mózgu oparty na sekwencji 89-94; peptyd 89-101 nie zachowuje się jak apitop dla epitopu 89-94.

Obserwacje te można wytłumaczyć lokalizacją peptydu 89-101 w miejscu MHC do wiązania peptydu. Jeśli peptyd preferencyjnie wiąże się tak, że obszar 92-98 jest w kieszeni wiążącej ten peptyd to będzie on rozpoznawany przez komórki T specyficzne dla MBP 92-98. To może tłumaczyć dlaczego, gdy myszy są uczulone peptydem MBP 89-101, wszystkie wytworzone klony komórki T rozpoznają epitop MBP 92-98. Również gdy 89-101 jest użyty dla wywołania tolerancji komórek T będzie on głównie powodował tolerancje komórek rozpoznających epitop MBP 92-98. Jeśli MBP 92-98 jest epitopem kryptycznym to nie jest on generowany przez naturalną obróbkę całego antygenu i komórki T rozpoznające ten epitop nie będą najprawdopodobniej występowały in vivo. Nawet jeśli komórki T specyficzne dla MBP 92-98 nie występują in vivo, to nie będą one związane z chorobę. Dlatego też 89-101 nie może zapobiegać EAE wywołanemu całym MBP.

P r z y k ł a d 3. Leczenie peptydem w mysim modelu MS.

Obecnie pokazano, że pojedyncza dawka peptydowego antygenu podana układowo zarówno dootrzewnowo (Liu i Wright (1995) Int. Immunol. 8:1255-1263) lub donosowo (Metzler i Wright (1993) 5:1159-1165) będzie skutecznie chroniła myszy przed doświadczalnym autoimmunlogicznym zapaleniem mózgu i rdzenia przedłużonego (EAE) przez czas do trzech miesięcy (Metzler i Wright (1999) Immunology 97:257-263). Przynajmniej 5 dawek peptydu jest wymagane dla indukcji tolerancji u transgenicznej myszy Tg4 (Burkhart i wsp. (1995) Immunity 3:407-415). Współczesne prace pokazują, ze droga donosowa (IN) jest bezpieczniejsza niż dootrzewnowa (IP) u myszy Tg4 nawet w przypadku gdy oba sposoby są równie skuteczne u myszy nie transgenicznych.

Peptyd 83-99 MBP jest testowany na transgenicznej myszy Fug/D6 z ekspresją zarówno odpowiedniej cząsteczki HLA-DR2 MHC klasy II i TCR z klonu ludzkiej komórki T specyficznego dla tego peptydu. Myszy są leczone peptydem zarówno po podaniu standardowej dawki użytej dla leczenia transgenicznej myszy Tg4 (protokół Tg4) lub zgodnie z protokołem odczulania zwiększając dawkę peptydu, która była użyta w leczeniu pacjentów dotkniętych alergią (protokół odczulania).

Protokół Tg4: grupy myszy są leczone przez donosowe podanie peptydu 83-99 (4 mg/ml w buforowanej fosforanem soli fizjologicznej (PBS)) lub samym PBS w końcowej objętości 25 pi. Myszy traktowano każdego 1 i 5 dnia tygodnia przez 5 tygodni podając łącznie 10 dawek. Na początku tygodnia każdej z 6 myszy wstrzyknięto peptyd 83-99 w pełnym adiuwancie Freunda (CFA) i otrzymały one również zastrzyk IP z toksyny krztuśca (200 ng) dnia 1 i 3. Postęp EAE śledzono przez przynajmniej 30 dni.

Protokół odczulania: grupy myszy traktowano przez donosowe podanie zwiększającej się dawki peptydu 83-99 lub samego PBS w objętości 25 pl. Zwiększanie dawki rozpoczęto od 0,1 pg i zwiększano przez 1, 3, 6, 12, 50, a następnie trzykrotnie 100 pg. Myszy traktowano każdego 1 i 5 dnia tygodnia przez 5 tygodni podając łącznie 10 dawek. Na początku tygodnia każdej z 6 myszy wstrzyknięto peptyd 83-99 w pełnym adiuwancie Freunda (CFA) i otrzymały one również dootrzewnowo (i.p.) zastrzyk toksyny krztuśca (200 ng) w dniach 1 i 3. Postęp EAE śledzono przez przynajmniej 30 dni.

P r z y k ł a d 4 - Donosowe podawanie pacjentom z MS koktajlu apitopu.

Przygotowuje się szczepionkę zawierającą peptydy MBP 30-44, 83-99, 110-124 i 130-144 (np. niektóre z tych epitopów MBP, które zidentyfikowano jako apitopy. Szczepionkę podano trzydziestu pięciu pacjentom w Fazie la/Ib postępowania. Postępowanie jest jednym postępowaniem krzyżowym, w którym pacjenci pozostają nie leczeni przez 3 miesiące po podaniu pojedynczej dawki peptydu (Ia). Pacjenci są następnie obserwowani przez 3 miesiące po podaniu pojedynczej dawki szczepionki dla oceny bezpieczeństwa. Leczenie następnie obejmuje dwukrotne podawanie w ciągu tygodnia przez podanie donosowe. U każdego pacjenta: analizowana jest raz w miesiącu aktywność kliniczna metodą

PL 213 585 B1 obrazowania rezonansu magnetycznego; aktywność immunologiczna jest śledzona przy pomocy oznaczenia kinetyki odpowiedzi dla proliferacji, i wytwarzanie cytokiny jest śledzone przez oparty o komórkę test ELISA.

Postępowanie początkowo angażuje leczenie pięciu pacjentów dotkniętych przewlekłą postępującą chorobą (CP). Pacjenci ci są wybrani na podstawie niskiej aktywności MRI i są najpierw leczeni najwyższą dawką peptydu. Leczenie rozpoczyna się od pacjentów z grupy CP ponieważ w ich wypadku najprawdopodobniej ujawnią się wszystkie możliwe szkodliwe efekty co zwiększa aktywność MRI. Leczenie pacjentów z postacią zaostrzająco-zwalniającą choroby rozpoczyna się, gdy stanie się jasne, że zarówno leczenie jedną jak i wieloma dawkami jest bezpieczne w grupie CP. Większa grupa 30 pacjentów z postacią zaostrzająco-zwalniającą została wybrana na podstawie tego, że byli oni dotknięci zwiększonymi lezjami MRI podczas obserwacji prowadzonych przez 3 miesiące. Zostali oni podzieleni na trzy grupy tak, aby mogli być leczeni wysokimi, średnimi lub niskimi dawkami peptydu.

Punkt czasowy (miesiące)	Pacjenci z chroniczną, postępującą (CP) chorobą	Pacjenci z postać choroby zaostrzająco-zwalniającą (Rr)
0	Początkowe comiesięczne obserwacje
3	Rozpoczęcie fazy Ia (pojedyncza dawka peptydu) z MRI w 1-2 tygodniach po leczeniu i comiesięczna obserwacja
6	Początek fazy Ib (2 razy w tygodniu dawka peptydu) i kontynuowanie comiesięcznej obserwacji	Rozpoczęcie comiesięcznego śledzenia i rekrutacja pacjent ze zwiększonymi lezjami
Punkt czasowy (miesiące)	Pacjenci z chroniczną, postępującą (CP) chorobą	Pacjenci z postacią choroby zaostrzająco-zwalniającą (RR)
9		Początek fazy Ib (dwa razy w tygodniu dawka peptydu) kontynuowanie comiesięcznej obserwacji
12	Koniec leczenia i kontynuacja comiesięcznej obserwacji przez daIsze 6 miesięcy
15		Koniec leczenia kontynuacja comiesięcznej obserwacji przez dalsze 6 miesięcy

Skróty: APC = komórki prezentujące antygen; MHC = główny kompleks zgodności tkankowej; TCR = receptor komórki T; EAE = doświadczalne autoimmmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia; APITOPE = epitop niezależny od obróbki antygenu; APIPS = system prezentacji niezależny od obróbki antygenu; aa = aminokwas; MS = stwardnienie rozsiane; MBP = zasadowe białko mieliny; PLP = białko proteolipidu; TCL = linia komórki T; TCC = klon komórki T; PBMC = jednojądrowe komórki krwi obwodowej; PPD = oczyszczona pochodna białka Mycobacterium tuberculosis; PHA = fitohemaglutynina.

Claims (8)

1. Peptyd tolerogenny zdolny do wiązania się z cząsteczką MHC klasy I lub II bez dalszej obróbki antygenu, który jest peptydem zasadowego białka mieliny (MBP): 30-44 do zastosowania w leczeniu i/lub zapobieganiu stwardnienia rozsianego.

2. Kompozycja farmaceutyczna do zastosowania w leczeniu lub zapobieganiu stwardnienia rozsianego, znamienna tym, że zawiera peptyd jak zdefiniowano w zastrz. 1.

3. Kompozycja według zastrz. 2, znamienna tym, że zawiera mnogość tolerogennych peptydów MBP.

4. Kompozycja według zastrz. 3, znamienna tym, że zawiera od 2 do 15 tolerogennych peptydów MBP.

5. Kompozycja według zastrz. 4, znamienna tym, że zawiera 4 toleranne peptydy MBP.

PL 213 585 B1

6. Kompozycja według zastrz. 2 do 5, w postaci zestawu, znamienna tym, że pewien lub każdy z peptydów są dostarczane osobno do podawania jednoczesnego, oddzielnego lub kolejnego.

7. Peptyd lub kompozycja farmaceutyczna jak zdefiniowano w zastrz. 1 do 6 do podawania donosowego.

8. Zastosowanie peptydu zdefiniowanego w zastrz. 1 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia i/lub do zapobiegania stwardnienia rozsianego.