ES2310604T3 - Mezclas de analogos de ciclosporinas y su uso como agentes inmunomoduladores. - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende una mezcla isomérica de un análogo de ciclosporina modificado en el resto aminoácido 1 con un sustituyente 1,3-dieno, en la que la mezcla isomérica comprende de 75% a 95% en peso del isómero E y de 25% a 5% en peso del isómero Z, de modo que la suma del porcentaje en peso del isómero (E) y el isómero (Z) es 100 por cien en peso, en la que los isómeros son los isómeros E y Z especificados a continuación: (Ver fórmula)

Description

Mezclas de análogos de ciclosporinas y su uso como agentes inmunomoduladores.

Campo técnico

La invención se dirige a mezclas isoméricas de análogos de ciclosporinas que están relacionados con la ciclosporina A. Se contempla que las mezclas tienen una eficacia potenciada y/o toxicidad reducida frente a los isómeros individuales y frente a las ciclosporinas naturales y otras actualmente conocidas y derivados de ciclosporina.

Referencias

Las siguientes referencias están relacionadas con esta memoria o se hace referencia en la presente invención por el número de patente o de solicitud o entre paréntesis por el autor y el año en las partes pertinentes de esta memoria descriptiva:

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48. Publicación de patente internacional nº WO 86/02080.

49. Publicación de patente internacional nº WO 99/18120.

Antecedentes de la técnica

Los derivados de ciclosporina componen una clase de polipéptidos cíclicos constituidos por once aminoácidos, y que son producidos como metabolitos secundarios por la especie de hongo Tolypocladium inflatum Gams. Se ha observado que inhiben de forma reversible linfocitos inmunocompetentes, en particular linfocitos T, en la fase G_{0} o G_{1} del ciclo celular. También se ha observado que los derivados de ciclosporina inhiben de forma reversible la producción y liberación de linfoquinas (Granelli-Piperno y col., 1986). Aunque se conocen una serie de derivados de ciclosporina, la ciclosporina A es la más ampliamente usada. Los efectos de supresión de la ciclosporina A están relacionados con la inhibición de los sucesos de activación mediados por células T. Esta supresión se lleva a cabo por la unión de la ciclosporina A a la proteína intracelular ubicua ciclofilina. Este complejo a su vez inhibe la actividad de serina-treonina fosfatasa dependiente de calcio y calmodulina de la enzima calcineurina. La inhibición de la calcineurina evita la activación de factores de transcripción tales como NFAT_{p/c} y NF-\kappaB, que son necesarios para la inducción de los genes de citoquinas (IL-2, IFN-\gamma, IL-4 y GM-CSF) durante la activación de células T. La ciclosporina también inhibe la producción de linfoquinas por las células T auxiliares in vitro, y detiene el desarrollo de las células CD8 y CD4 maduras en el timo (Granelli-Piperno y col., 1986). Otras propiedades in vitro de la ciclosporina incluyen la inhibición de los linfocitos T que producen IL-2 y linfocitos T citotóxicos, inhibición de la IL-2 liberada por células T activadas, inhibición de linfocitos T en reposo en respuesta a aloantígeno y linfoquina exógena, inhibición de la producción de IL-1, e inhibición de la activación mitógena de linfocitos T que producen IL-2 (Granelli-Piperno y col., 1986).

La ciclosporina es un potente agente inmunosupresor que se ha demostrado que suprime la inmunidad humoral y las reacciones inmunitarias mediadas por células tales como el rechazo de aloinjerto, hipersensibilidad retrasada, encefalomielitis alérgica experimental, artritis inducida por adyuvante de Freund y enfermedad de injerto contra huésped. Se usa para la profilaxis del rechazo de órgano después del transplante de órgano; para el tratamiento de la artritis reumatoide; para el tratamiento de la psoriasis; y para el tratamiento de otras enfermedades autoinmunes, incluyendo la diabetes de tipo I, enfermedad de Crohn, lupus y similares.

Desde el descubrimiento original de la ciclosporina, se han aislado e identificado una amplia variedad de ciclosporinas naturales y se han preparado muchas otras ciclosporinas no naturales mediante síntesis total o semisíntesis o por aplicación de técnicas de cultivo modificadas. La clase constituida por las ciclosporinas es importante en la actualidad e incluye, por ejemplo, las ciclosporinas de A a Z naturales [véase, Traber y col. (1977); Traber y col. (1982); Kobel y col. (1982); y von Wartburg y col. (1986)], así como diferentes derivados de ciclosporinas no naturales y ciclosporinas artificiales o sintéticas incluyendo las dihidro- e iso-ciclosporinas; ciclosporinas derivatizadas (p. ej., en las que el átomo 3'-O del resto -MeBmt- está acilado o se introduce un sustituyente adicional en el átomo de carbono \alpha del resto sarcosilo en la posición 3); ciclosporinas en las que el resto -MeBmt- está presente en forma isómera (p. ej., en las que la configuración de las posiciones 6' y 7' del resto -MeBmt- es cis en lugar de trans); y ciclosporinas en las que se incorporan aminoácidos variantes en posiciones específicas en la secuencia peptídica, usando, p. ej., el procedimiento sintético total para la producción de ciclosporinas desarrollado por R. Wenger, véase p. ej. Traber y col. (1977), Traber y col. (1982) y Kobel y col. (1982); patentes de EE.UU. nº 4.108.985, 4.210.581, 4.220.641, 4.288.431, 4.554.351 y 4.396.542; publicaciones de patentes europeas nº 0034567 y 0056782; publicación de patente internacional nº WO 86/02080; Wenger (1983); Wenger (1985); y Wenger (1986). Describen los análogos de ciclosporina A que contienen aminoácidos modificados en la posición 1 Rich y col. (1986). Se describen los análogos de ciclosporina A inmunosupresores, antiinflamatorios y antiparasitarios en las patentes de EE.UU. nº 4.384.996; 4.771.122; 5.284.826; y 5.525.590, todas asignadas a Sandoz. Se describen análogos de ciclosporina adicionales en el documento WO 99/18120, asignado a Isotechnika. Los términos Ciclosporina y ciclosporina son intercambiables y se refieren a la ciclosporina.

Hay numerosos efectos adversos asociados con la terapia con ciclosporina A, que incluyen nefrotoxicidad, hepatotoxicidad, cataratogénesis, hirsutismo, parestesia e hiperplasia gingival, por nombrar algunos (Sketris y col., 1995). De estos, la nefrotoxicidad es uno de los más graves efectos adversos relacionados con la dosis que resultan de la administración de ciclosporina A. Los fármacos de ciclosporina A de liberación inmediata (p. ej., Neoral® y Sandimmune®) pueden causar nefrotoxicidades y otros efectos secundarios tóxicos debido a su rápida liberación y la absorción de altas concentraciones del fármaco en la sangre. Se ha postulado que las concentraciones máximas del fármaco están asociadas con los efectos secundarios (Bennett, 1998). El mecanismo exacto por el que la ciclosporina A produce daño renal no se conoce; sin embargo, se ha propuesto que un aumento de los niveles de sustancias vasoconstrictoras en el riñón conduce a la vasoconstricción de las arteriolas glomerulares aferentes. Esto puede dar como resultado isquemia renal, una disminución de la velocidad de filtración glomerular, y a largo plazo, fibrosis intersticial. Cuando se reduce la dosis o se sustituye por otro agente inmunosupresor, la función renal mejora (Valantine y Schroeder, 1995).

Por consiguiente, se necesitan agentes inmunosupresores que sean eficaces y tengan una toxicidad reducida.

Los análogos de ciclosporina que contienen aminoácidos modificados en la posición 1 se describen en el documento WO 99/18120, concedida al concesionario de la presente solicitud.

En una nomenclatura alternativa, el isómero cis también se puede describir como un isómero (Z) y el isómero trans también se podría llamar también un isómero (E).

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Por consiguiente, son necesarios en la técnica procedimientos de preparación de análogos de ciclosporina, incluyendo los isómeros de ISA_{TX}247. Se necesitan rutas sintéticas que produzcan composiciones enriquecidas en los isómeros individuales, así como mezclas isoméricas que tengan una relación conveniente de los dos isómeros. También son necesarios procedimientos de preparación de derivados de ISA_{TX}247.

Descripción de la invención

La ciclosporina y sus análogos son miembros de una clase de polipéptidos cíclicos que tienen una potente actividad inmunosupresora. A pesar de las ventajas que ofrecen estos fármacos con respecto a las actividades inmunosupresoras, antiinflamatorias y antiparasitarias, hay numerosos efectos adversos asociados con la terapia con ciclosporina A que incluyen nefrotoxicidad y hepatoxicidad. Por consiguiente, son necesarios nuevos agentes inmunosupresores que retengan la actividad farmacológica como el compuesto natural ciclosporina A, pero sin uno o más de los efectos secundarios tóxicos asociados.

Las realizaciones de la presente invención proporcionan determinadas mezclas de isómeros cis y trans de análogos de la ciclosporina A, que son farmacéuticamente útiles. Un análogo preferido se denomina ISA_{TX}247. Las mezclas de isómeros de ISA_{TX}247 presentan una combinación de mayor potencia y menor toxicidad frente a las ciclosporinas naturales y actualmente conocidas.

La presente invención se basa en parte en el descubrimiento de que determinadas mezclas isoméricas de análogos de ciclosporina proporcionan efectos inmunosupresores superiores sin uno o más de los efectos adversos asociados con la ciclosporina A. En particular, los autores de la invención han encontrado inesperadamente que las mezclas isoméricas (es decir, mezclas de isómeros tanto cis como trans) de los análogos de ciclosporina modificada en el resto aminoácido 1 con un sustituyente tipo 1,3-dieno como se especifica en la reivindicación 1, en la que la mezcla isomérica comprende de 75% a 95% en peso del isómero E y de 25% a 5% en peso del isómero Z, de modo que la suma de los porcentajes en peso del isómero E y el isómero Z es 100 por cien en peso, proporcionan una eficacia y seguridad superiores. Se describen ejemplos de dichos análogos en el documento WO 99/18120, e incluyen compuestos deuterados y no deuterados. Además, se ha demostrado que estas mezclas de isómeros presentan una combinación de mayor potencia y menor toxicidad frente a las ciclosporinas naturales y actualmente conocidas y derivados de ciclosporina.

Un análogo particularmente preferido (denominado en el presente documento "ISA_{TX}247") es estructuralmente similar a la ciclosporina A, excepto por el grupo funcional modificado en la periferia de la molécula, en el resto aminoácido 1. La estructura de esta particular mezcla isomérica del análogo comparado con la ciclosporina A es:

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Las mezclas isoméricas se pueden usar, entre otras cosas, para la inmunosupresión y el cuidado de diferentes trastornos, enfermedades y afecciones inmunológicas, incluyendo la prevención, control, alivio y tratamiento de los mismos.

Los isómeros de ISA_{TX}247 (y sus derivados) se pueden sintetizar por rutas estereoselectivas que pueden variar en su grado de selectividad. Las rutas estereoselectivas producen composiciones que están enriquecidas en cualquiera de los isómeros (E) y (Z), y estas composiciones se pueden combinar de modo que la mezcla resultante tenga la relación deseada de los dos isómeros. Alternativamente, las condiciones de las reacciones de una ruta estereoselectiva se pueden diseñar para producir la relación deseada directamente en una mezcla preparada. El porcentaje de un isómero u otro en una mezcla se puede verificar usando espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN) u otras técnicas conocidas en la materia.

Cada una de las rutas se desarrolla normalmente con la aplicación de un grupo protector a un grupo funcional alcohol sensible. En una realización, el alcohol se protege como un acetato; en otras realizaciones los grupos protectores son ésteres de benzoato o éteres de sililo. Aunque los grupos protectores acetato son comunes en la técnica, es importante destacar que en muchas de las realizaciones de ejemplo descritas en el presente documento, se pueden evitar algunas de las reacciones secundarias indeseadas que implican un grupo protector acetato, mediante el uso de grupos protectores tales como ésteres de benzoato o éteres de sililo.

El compuesto protegido puede entonces servir como un precursor para una variedad de rutas sintéticas estereoselectivas, incluyendo algunas que usan reactivos que contienen fósforo como participantes en una reacción de Wittig, y elementos inorgánicos como miembros de reactivos organometálicos. Este último tipo puede desarrollarse por estados de transición de anillos de seis miembros en los que el impedimento estérico dicta el resultado de la configuración. Están disponibles muchos reactivos organometálicos, incluyendo los que llevan elementos inorgánicos tales como boro, silicio, titanio, litio y azufre. Los isómeros individuales se pueden preparar a partir de uno o múltiples precursores.

La relación de isómeros (E) a (Z) en cualquier mezcla, sea producida estereoselectiva o no estereoselectivamente, puede variar: la mezcla puede comprender desde 75 a 95 por ciento del isómero (E) hasta 25 a 5 por ciento del isómero (Z). En otras realizaciones, la mezcla puede contener de 75 a 85 por ciento en peso del isómero (E) y de 15 a 25 por ciento del isómero (Z); en otra realización, la mezcla contiene de 85 a 90 por ciento en peso del isómero (E) y de 10 a 15 por ciento en peso del isómero (Z). Estos porcentajes en peso se basan en el peso total de la composición, y se entenderá que la suma de los porcentajes en peso del isómero (E) y el isómero (Z) es 100 por cien en peso. En otras palabras, una mezcla puede contener 75 por ciento en peso del isómero (E) y 25 por ciento en peso del isómero (Z).

Una composición preferida (denominada en el presente documento "ISA_{TX}247") comprende una mezcla isomérica de los isómeros E y Z.

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La mezcla de isómeros comprende de 75% a 95% del isómero E y de 25% a 5% del isómero Z. La mezcla de isómeros puede ser mezclas de ISA_{TX}247 que comprenden: de 75% a 85% del isómero E y de 15% a 25% del isómero Z; de 85% a 90% del isómero E y de 10% a 15% del isómero Z; de 90% a 95% del isómero Z y de 10% a 5% del isómero E. (Los porcentajes están en una base en peso).

En otro aspecto, la invención se dirige a composiciones farmacéuticas que comprenden una mezcla isomérica del análogo de ciclosporina como se ha descrito antes y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La mezcla isomérica del análogo preferiblemente es una mezcla de ISA_{TX}247.

Las composiciones farmacéuticas son eficaces para producir inmunosupresión cuando se administran a un animal que lo necesite y comprenden una cantidad eficaz de una mezcla de isómeros del análogo de ciclosporina como se ha descrito antes. En una realización preferida, la mezcla es una mezcla de ISA_{TX}247. Dicha inmunosupresión se puede usar para tratar o aliviar el rechazo de transplante, una enfermedad o afección autoinmune, o una enfermedad o afección inflamatoria.

Las composiciones farmacéuticas también son eficaces para reducir la toxicidad de un análogo de ciclosporina inmunosupresor y comprenden una mezcla isomérica del análogo descrito antes, para usar como agente inmunosupresor. En una realización preferida, la mezcla es una mezcla de ISA_{TX}247.

Las composiciones farmacéuticas también son eficaces para aumentar la eficacia de un análogo de ciclosporina inmunosupresor, y comprenden una mezcla de isómeros del análogo descrito antes para usar como agente inmunosupresor. En una realización preferida, la mezcla es una mezcla de ISA_{TX}247.

Breve descripción de los dibujos

la fig. 1A muestra la estructura de la ciclosporina A, que ilustra los 11 restos aminoácidos que comprende el anillo peptídico cíclico de la molécula, así como la estructura de la cadena lateral del resto aminoácido 1;

la fig. 1B es otra ilustración de la estructura de la ciclosporina A con énfasis particular en la definición del término "CsA" como se usa en la presente descripción;

la fig. 2A muestra la estructura del isómero E (o isómero trans) del análogo de ciclosporina A llamado ISA_{TX}247;

la fig. 2B muestra la estructura del isómero Z (o isómero cis) del análogo de ciclosporina A ISA_{TX}247;

la fig. 3 muestra una visión general de las rutas sintéticas de ejemplo que se pueden usar para preparar los análogos de ciclosporina de las composiciones de la presente invención, en la que las rutas estereoselectivas están agrupadas según las condiciones reactivas;

la fig. 4 ilustra una ruta sintética que produce una mezcla de isómeros (E) y (Z) de ISA_{TX}247 a partir de un precursor de bromo;

la fig. 5 ilustra otra ruta sintética que produce una mezcla de isómeros (E) y (Z) de ISA_{TX}247 a partir de un precursor aldehído;

la fig. 6 ilustra un esquema de reacción estereoselectiva de ejemplo que se puede usar para preparar composiciones enriquecidas en cualquiera de los isómeros (E) y (Z) de ISA_{TX}247, en el que cualquiera de los isómeros se puede preparar a partir del mismo precursor alcohol;

la fig. 7 ilustra un esquema de reacción alternativo para la síntesis estereoselectiva de una composición enriquecida en el isómero (Z) de ISA_{TX}247;

la fig. 8 ilustra un esquema de reacción alternativo para la síntesis estereoselectiva de una composición enriquecida en el isómero (E) de ISA_{TX}247;

las figs. 9A-C ilustran rutas sintéticas de ejemplo para producir una mezcla de los isómeros (E) y (Z) de ISA_{TX}247, habiéndose diseñado las condiciones de cada reacción para producir una relación de ejemplo particular de los dos isómeros;

la fig. 10 ilustra rutas sintéticas estereoselectivas de ejemplo para producir una mezcla de isómeros (E) y (Z) de ISA_{TX}247, en las que primero se preparan las composiciones enriquecidas en uno de los isómeros, y después se mezclan como corresponde en proporciones predeterminadas para lograr la relación deseada;

la fig. 11 no es de acuerdo con la invención y se muestra solo con propósitos de referencia; proporciona los resultados de un ensayo que muestra que la inhibición de la actividad de fosfatasa de la calcineurina por ISA_{TX}247 (45-50% de isómero E y 50-55% de isómero Z, no de acuerdo con la presente invención) era hasta 3 veces más potente (determinado por la CI_{50}) comparado con la ciclosporina A;

la fig. 12 presente la estructura y composición de isómeros de algunas mezclas de isómeros de análogos deuterados y no deuterados;

la fig. 13 proporciona los resultados de un ensayo que muestra que la inhibición de la actividad de fosfatasa de la calcineurina por diferentes mezclas de isómeros de análogos deuterados y no deuterados era al menos igual de potente (determinado por la CI_{50}) comparado con la ciclosporina A.

Modo(s) de llevar a cabo la invención Síntesis

La ciclosporina y sus análogos son miembros de una clase de polipéptidos cíclicos que tiene una potente actividad inmunosupresora. A pesar de las ventajas que ofrecen estos fármacos con respecto a sus actividades inmunosupresora, antiinflamatoria y antiparasitaria, hay numerosos efectos adversos asociados con la terapia con ciclosporina A que incluyen nefrotoxicidad y hepatotoxicidad. Por consiguiente, son necesarios nuevos agentes inmunosupresores que sean farmacológicamente tan activos como el compuesto de ciclosporina A natural, pero sin los efectos secundarios asociados.

Los autores de la solicitud han descrito previamente un análogo de ciclosporina A denominado "ISA_{TX}247". Este análogo es estructuralmente similar a la ciclosporina A, excepto por la modificación en el resto aminoácido 1. Los autores de la invención descubrieron que determinadas mezclas de isómeros cis y trans de ISA_{TX}247 presentaban una combinación de mayor potencia y menor toxicidad, frente a las ciclosporinas naturales y actualmente conocidas.

Los isómeros de ISA_{TX}247 (y derivados de los mismos) se pueden sintetizar por rutas estereoselectivas que pueden variar en el grado de estereoselectividad. Las rutas estereoselectivas producen composiciones que están enriquecidas en cualquiera de los isómeros (E) y (Z), y estas composiciones se pueden combinar de forma que la mezcla resultante tenga una relación deseada de los dos isómeros. Alternativamente, las condiciones de reacción de una ruta estereoselectiva se pueden diseñar para producir la relación deseada directamente en una mezcla preparada.

El nombre químico de un análogo de ciclosporina inmunosupresor de las composiciones de la presente invención, llamado ISA_{TX}247, se describe químicamente por el nombre ciclo{(E,Z)-(2S,3R,4R)-3-hidroxi-4-metil-2-(metilami-
no)-6,8-nonadienoil}-L-2-aminobutiril-N-metil-glicil-N-metil-L-Leucil-L-valil-N-metil-L-leucil-L-alanil-D-alanil-N-metil-L-leucil-N-metil-L-leucil-N-metil-L-valil}. Su fórmula empírica es C_{63}H_{111}N_{11}O_{12}, y tiene un peso molecular de aproximadamente 1214,85. El término "ISA_{TX}247" es un nombre comercial que se le da a este compuesto farmacológicamente activo.

La estructura de ISA_{TX}247 se ha verificado principalmente por espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN). Los espectros tanto de ^{1}H como de ^{13}C se asignaron usando una serie de experimentos de RMN en una y dos dimensiones, y por comparación con las asignaciones de RMN conocidas para la ciclosporina A. La asignación absoluta de los isómeros (E) y (Z) de ISA_{TX}247 se confirmó por experimentos de efecto Overhausser nuclear (NOE). Se proporcionó otra prueba de apoyo, mediante análisis de espectro de masas, que confirmó el peso molecular, y por espectro de infrarrojo, que se encontró similar al de la ciclosporina A. Este último resultado se esperaba dada la similitud entre los dos compuestos.

La estructura de la ciclosporina A se ilustra en la Fig. 1A. La estructura incluye la identificación de los 11 restos aminoácidos que comprende el anillo de péptido cíclico de la molécula. Estos 11 restos aminoácidos están marcados con números crecientes en el sentido de las agujas del reloj, empezando por el aminoácido mostrado en el centro superior del anillo (e identificado con la marca de referencia "aminoácido 1"). El primer aminoácido está encerrado en un recuadro de trazos para mayor claridad. La cadena lateral del resto aminoácido 1 se ha dibujado químicamente, ya que es en esta posición general en la que tienen lugar las reacciones sintéticas descritas en el presente documento. De forma convencional, el carbono adyacente al grupo carbonilo de un aminoácido se marca como el carbono \alpha, usándose las legras progresivas del alfabeto griego para marcar los carbonos adyacentes en una dirección hacia abajo de la cadena, alejándose del anillo peptídico. En el caso de la ciclosporina A, como se muestra en la fig. 1A, el carbono \beta de la cadena lateral está unido a un grupo hidroxilo, y hay un doble enlace con orientación trans entre los carbonos \varepsilon y \zeta de la cadena lateral.

En la fig. 1B se dibuja otro esquema de la estructura de la ciclosporina A, en la que se ha encerrado en un recuadro de trazos una parte diferente de la molécula. Esta figura define la nomenclatura que se va a usar en la presente descripción, en la que el término "CsA" se refiere a la parte de la ciclosporina A que está encerrada en el recuadro. La presente nomenclatura proporciona un medio abreviado para presentar la región donde se producen las reacciones sintéticas descritas en el presente documento (es decir, la cadena lateral del resto aminoácido 1, que se ha dibujado fuera del recuadro de trazos en la fig. 1B), sin tener que volver a dibujar el resto de la molécula cada vez que se describe una reacción. Será evidente para los expertos en la técnica que el enlace entre los carbonos \alpha y \beta de la cadena lateral es de longitud normal y que se ha exagerado sólo en este dibujo para ayudar en la definición del término "CsA".

Como se ha expuesto antes, un análogo de ciclosporina A particularmente preferido se llama ISA_{TX}247, y sus dos estereoisómeros E (o trans) y Z (o cis) se muestran en las figs. 2A y 2B, respectivamente. La naturaleza cis o trans de estos estereoisómeros se refiere a la configuración del doble enlace entre los carbonos \varepsilon y \zeta de la cadena lateral; es decir, el doble enlace más cercano al anillo peptídico, en oposición al doble enlace en el extremo terminal de la cadena.

Hay que decir algo sobre la nomenclatura estereoquímica. En la presente descripción los términos cis y (Z) se usarán de forma intercambiable, y los términos trans y (E) se usarán de forma intercambiable. El uso de los términos "eritro" y "treo" se mantendrá al mínimo debido a la clara confusión en la bibliografía en relación con su significado. Véase, R.W. Hoffmann y H.-J Zei en "Stereoselective synthesis of Alcohols. 8. Diastereoselective Synthesis of p-Methylhomoallyl Alcohols via Crotylboronates", J. Org. Chem., Vol. 46, pp. 1309-1314 (1981); A. Streitwieser y C. H. Heathcock, Introduction to Organic Chemistry, 2nd ed. (Macmillan, New York, 1981), pp. 845-846; y M.B. Smith y J. March, March's Advanced Organic Chemistry (Wiley, New York, 2001), pp. 144-147. En los pocos casos en los que en el presente documento se usa la terminología treo/eritro, se usa el convenio de Streitwieser y Heathcock, en el que los isómeros "eritro" se refieren a las configuraciones (R,S) y (S,R), y los isómeros "treo" se refieren a las configuraciones (R,R) y (S,S).

Un comentario final sobre la nomenclatura se refiere al doble enlace carbono-carbono terminal mostrado en las figs. 2A y 2B. En un esquema de numeración alternativo, los carbonos en la cadena lateral del resto aminoácido 1 se pueden numerar empezando por el átomo de carbono terminal (\theta) e ir hacia el anillo peptídico. En este sistema puede pensarse en los isómeros de ISA_{TX}247 como 1,3-dienos según la nomenclatura convencional en química orgánica, en la que cada doble enlace se identifica por su carbono numerado más bajo.

Se discutirán a continuación las rutas sintéticas ilustradas en las figs. 3-8. Se pueden preparar directamente mezclas de isómeros, cuando las condiciones de reacción de una ruta sintética particular se diseñan para lograr la relación de isómeros deseada en la mezcla. Alternativamente, se pueden preparar composiciones que están enriquecidas en uno de los dos isómeros geométricos de un análogo de ciclosporina A, y combinar las composiciones en una relación redefinida para lograr la mezcla deseada.

En la fig. 3 se da una visión general de las posibles rutas sintéticas, en las que se pone particular énfasis en la agrupación de las rutas de reacción de acuerdo con la química y estereoselectividad. En relación con la fig. 3, se muestran en general rutas sintéticas que usan reacciones de Wittig en el lado derecho del diagrama, indicadas por el número de referencia 31, mientras que las rutas 32 y 33 que usan reactivos organometálicos que se cree que forman estados de transición de seis miembros se muestran en el centro y el lado izquierdo del diagrama. Cualquiera de las rutas sintéticas puede dar una mezcla de los isómeros, o puede producir composiciones enriquecidas en uno de los dos isómeros.

Se puede llegar a la mezcla de isómeros deseada mediante una variedad de formas. La flexibilidad y versatilidad de las estrategias sintéticas descritas en el presente documento se puede reflejar en parte por las simetrías y asimetrías de la fig. 3A. Una reacción que es común a todas las rutas es la protección de un grupo funcional en la ciclosporina A 34; en esta realización de ejemplo, esta reacción es la conversión de la ciclosporina A 34 en la acetil-ciclosporina A 35. Una asimetría en la fig. 3 es el uso del aldehído de la acetil-ciclosporina A 51 como un precursor para todas las rutas de reactivos organometálicos de titanio y litio, pero solo algunas de las rutas de reacción de Wittig que contienen fósforo.

En general, las rutas sintéticas de la fig. 3 cuyas condiciones de reacción se pueden ajustar para producir una mezcla que tiene la relación de isómeros deseada, usan reactivos que contienen fósforo como participantes en una reacción de Wittig. Otras rutas estereoselectivas usan también elementos inorgánicos, normalmente como miembros de los reactivos organometálicos, que se desarrollan a través de estas de transición de anillos de seis miembros en los que el impedimento estérico dicta el resultado de la configuración. Son útiles diferentes reactivos organometálicos, incluyendo los que tienen elementos inorgánicos tales como boro, silicio, titanio, litio y azufre.

Se pueden preparar composiciones enriquecidas en uno o el otro de una pareja de isómeros a partir de un solo precursor; alternativamente, las dos composiciones se pueden preparar a partir de precursores diferentes. En una de las rutas estereoselectivas de la fig. 3 (ruta 32), un solo precursor conduce a los dos isómeros de ISA_{TX}247, dependiendo de las condiciones de reacción que se elijan. En otra de las rutas estereoselectivas (ruta 33), son necesarios dos precursores diferentes para producir cada una de las composiciones enriquecidas.

Se discutirán a continuación en detalle las reacciones de la fig. 3. Una reacción que es común a cada una de las rutas es la protección del alcohol en la posición \beta de la cadena lateral del resto aminoácido 1. Dicho esquema de protección aborda un problema que se encuentra normalmente en la síntesis orgánica, en la que se modifica accidentalmente un primer grupo funcional por una reacción dirigida a un segundo grupo funcional (similar y/o idéntico) situado en cualquier parte en la molécula. Para llevar a cabo el esquema, el primer grupo funcional se hace reaccionar con un grupo protector, la reacción deseada se lleva a cabo en el segundo grupo funcional, y después el grupo protector se elimina del primer grupo funcional.

Los grupos protectores son bien conocidos en la síntesis orgánica, y han sido descritos por J.R. Hanson en el capítulo 2, "The Protection of Alcohols", de la publicación Protecting Groups in Organic Synthesis (Sheffield Academic Press, Sheffield, England, 1999), pp. 24-25. Hanson enseña como se protegen los grupos hidroxilo convirtiéndolos en ésteres o éteres. Los ésteres de acetato son quizás el tipo de química usado con más frecuencia para los grupos protectores de hidroxilo. Hay una amplia variedad de condiciones que se pueden usar para introducir el grupo acetato. Estos reactivos y disolventes incluyen anhídrido acético y piridina; anhídrido acético, piridina y dimetilaminopiridina (DMAP); anhídrido acético y acetato sódico; anhídrido acético y ácido p-toluenosulfónico, cloruro de acetilo, piridina y DMAP; y cetena. La DMAP es un catalizador de acilación útil debido a la formación de una sal de N-acilpiridinio muy reactiva a partir del anhídrido.

El \beta-alcohol de la ciclosporina A 34 se puede proteger como un acetato haciendo reaccionar 34 con cloruro de acetilo, acetato de etilo o combinaciones de los mismos, formando el compuesto acetil-ciclosporina A 35. Alternativamente, el \beta-alcohol puede dar una adición nucleófila al anhídrido acético, formando la acetil-ciclosporina A 35 y ácido acético. Estas reacciones se pueden llevar a cabo en presencia de dimetilaminopiridina (DMAP) en las que un exceso de anhídrido acético actúa como el disolvente. En estos casos, se puede usar el prefijo "acetilo" en la nomenclatura a lo largo de la ruta sintética, o hasta eliminar el grupo acetilo. Por ejemplo, el último producto intermedio en una ruta que tiene un grupo acetilo en el carbono \beta se llama "acetil-(E)-1,3-dieno".

Aunque la preparación de la acetil-ciclosporina A está bien establecida en la bibliografía, los expertos en la técnica apreciarán que se pueden usar otros grupos protectores distintos de los ésteres de acetato para proteger el \beta-alcohol del resto aminoácido 1 de la ciclosporina A 34. Estos grupos protectores pueden incluir ésteres de benzoato, ésteres de benzoato sustituidos, éteres y éteres de sililo. En determinadas condiciones de reacción, el grupo protector acetato tiene tendencia a dar reacciones secundarias indeseables tales como eliminación e hidrólisis. Puesto que los ésteres de benzoato, éteres y éteres de sililo a menudo son más resistentes a dichas reacciones secundarias en las mismas condiciones de reacción, con frecuencia es ventajoso usar dichos grupos protectores en lugar del acetato. La ciclosporina y derivados de ciclosporina que se han protegido mediante un grupo acetilo o cualquier otro grupo protector se denominan "ciclosporina A protegida". Igualmente, el último producto intermedio en la ruta de ejemplo a la que se ha hecho referencia antes se llamaría "(E)-1,3-dieno protegido" en lugar de "acetil-(E)-1,3-dieno". La naturaleza del grupo protector elegido puede tener influencia en el curso deseado de las etapas posteriores en las secuencias de reacción.

En relación con la fig. 3, la acetil-ciclosporina A 35 en esta ruta de ejemplo tiene un \beta-alcohol protegido, y este compuesto sirve como precursor para la síntesis de los isómeros de ISA_{TX}247 en varias de las rutas sintéticas. Se discutirán primero las rutas de reacciones de Wittig.

Síntesis de mezclas de isómeros (E) y (Z) de ISA_{TX}247 por reacción de Wittig

Las rutas de reacciones de Wittig ilustradas en el presente documento se identifican por el número de referencia 31 en la fig. 3. El procedimiento 1 se desarrolla por el producto intermedio de bromo acetil-\eta-bromociclosporina 41, mientras que el procedimiento 2 usa el aldehído de la acetil-ciclosporina A 51 como punto de partida. Los procedimientos de ejemplo descritos a continuación usan una reacción de Wittig para introducir un grupo funcional alqueno con una mezcla de configuraciones estereoquímicas.

La reacción de Wittig usada en las realizaciones de ejemplo descritas en el presente documento para sintetizar mezclas de isómeros (E) y (Z) de ISA_{TX}247 se pueden llevar a cabo opcionalmente en presencia de un haluro de litio. Se sabe que la presencia de haluros de litio en las reacciones de Wittig tiene un efecto en la relación de los isómeros geométricos producidos, y por lo tanto, la adición de dicho compuesto puede ayudar a producir una mezcla deseada de los isómeros (E) y (Z) de ISA_{TX}247.

Procedimiento 1

Se puede preparar una mezcla de isómeros (E) y (Z) de ISA_{TX}247 como se muestra en la fig. 4. El uso en la representación de una línea ondulada en la fig. 4 (véanse en especial los compuestos 43 y 44) se pretende que indique que la secuencia de reacciones de ejemplo produce una mezcla de isómeros (E) y (Z). La relación en porcentaje de los isómeros (E) y (Z) producidos puede estar en el intervalo de 75 a 95 por ciento del isómero (E) hasta 25 a 5 por ciento del isómero (Z). Sin embargo, la mezcla puede contener de 75 a 85 por ciento en peso del isómero (E) y 25 a 15 por ciento del isómero (Z). En otras realizaciones, la mezcla contiene 85 a 90 por ciento en peso del isómero (E) y 10 a 15 por ciento del isómero (Z); aproximadamente 90 a 95 por ciento en peso del isómero (E) y 10 a 5 por ciento en peso del isómero (Z). Estos porcentajes en peso se basan en el peso total de la composición, y se entenderá que la suma del porcentaje en peso del isómero (E) y el isómero (Z) es 100 por cien en peso. En otras palabras, una mezcla puede contener 75 por ciento en peso del isómero (E) y 25 por ciento en peso del isómero (Z).

En relación con la fig. 4, el carbono \eta terminal de la cadena lateral del resto aminoácido 1 de la acetil-ciclosporina A se broma en la siguiente etapa de la reacción mediante calentamiento a reflujo de la acetil-ciclosporina A 35 con N-bromosuccinimida y azo-bis-isobutironitrilo en un disolvente tal como tetracloruro de carbono, produciendo la acetil-\eta-bromociclosporina A 41 intermedia. La N-bromosuccinimida es un reactivo que se usa a menudo para sustituir hidrógeno alílicos por bromo, y se cree que se produce por un mecanismo de radicales libres. La preparación del producto intermedio 41 ha sido descrita esencialmente por M. K. Eberle y F. Nuninger en "Synthesis of the Main Metabolite (OL-17) of Cyclosporin A", J. Org. Chem., Vol. 57, pp. 2689-2691) (1992).

El nuevo bromuro de trifenilfosfonio de la acetil-ciclosporina A 42 intermedio se puede preparar a partir de la acetil-\eta-bromociclosporina A 41 por calentamiento de este último compuesto con trifenilfosfina en un disolvente tal como tolueno.

El nuevo producto intermedio 42, y otros similares a este, se considera que son productos intermedios clave en la síntesis de una pluralidad de análogos de ciclosporina A que contienen un sistema de dieno conjugado en el resto aminoácido 1. Por ejemplo, además de la trifenilfosfina, compuestos como triarilfosfinas, trialquilfosfinas, arilalquilfosfinas y triarilarsinas se pueden hacer reaccionar con la acetil-\eta-bromociclosporina A 41 para preparar otros compuestos activados similares a 42.

En relación otra vez a la fig. 4, se puede preparar una mezcla de isómeros (E) y (Z) del acetil-1,3-dieno 43 por agitación del bromuro de trifenilfosfonio de la acetil-ciclosporina A 42 con un exceso de formaldehído en tolueno a temperatura ambiente. Después de la adición del formaldehído, se añade gota a gota una base tal como hidróxido sódico, y la mezcla de dienos isómeros se extrae con acetato de etilo.

Muchos libros de texto de química orgánica describen la reacción de Wittig. Una descripción en particular, la proporciona J. McMurry, Organic Chemistry, 5ª Ed. (Brooks/Cole, Pacific Grove, 2000), pp. 780-783. Una reacción de Wittig se puede usar para convertir una cetona o un aldehído en un alqueno. En dicho procedimiento, un iluro de fósforo, también llamado fosforano, se puede hacer reaccionar con el aldehído o cetona para dar un producto intermedio dipolar llamado una betaína. Normalmente la betaína intermedia no se aísla; si no que se descompone espontáneamente a través de un anillo de cuatro miembros para dar un alqueno y óxido de trifenilfosfina. El resultado neto es una sustitución del átomo de oxígeno carbonílico por el grupo R_{2}C= unido originalmente al fósforo.

Los expertos en la técnica apreciarán que los reactivos de la reacción de ejemplo de Wittig citada antes se puedan sustituir una variedad de reactivos. Por ejemplo, el formaldehído se puede sustituir por numerosos compuestos alquilo, arilo, aldehído y cetona para preparar un gran número de derivados de ciclosporina. Los autores de la invención han llevado a cabo la síntesis anterior con formaldehído, y en lugar de formaldehído, con compuestos tales como acetaldehído, formaldehído deuterado, acetaldehído deuterado, 2-clorobenzaldehído, benzaldehído y butiraldehído. Dichas reacciones de Wittig se pueden llevar a cabo con compuestos distintos de los derivados de trifenilfosfonio, tales como triarilfosfinas, trialquilfosfinas, arilalquilfosfinas y triarilarsinas. En lugar de usar hidróxido de sodio, se pueden usar otras bases diferentes tales como carbonato de sodio, butil-litio, hexil-litio, amiduro sódico, bases de litio impedidas tales como diisopropilamiduro de litio, y alcóxidos de metal alcalino. Además de variar estos reactivos, la reacción se puede llevar a cabo en diferentes disolventes orgánicos o mezclas de disolventes orgánicos y agua, en presencia de diferentes sales, en particular haluros de litio, y a diferentes temperaturas. Todos los factores listados antes los puede seleccionar razonablemente un experto en la materia para tener el efecto deseado en la estereosquímica del doble enlace formado, es decir, el efecto deseado en la relación de isómeros cis a trans.

En una etapa final de esta síntesis, se elimina el grupo protector del carbono \beta usando el siguiente procedimiento. La mezcla de acetil-(E)-1,3-dieno y acetil-(Z)-1,3-dieno 43 se disuelve en metanol y entonces se añade agua. Se añade una base tal como carbonato potásico, y la mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente. Se pueden usar bases distintas del carbonato potásico, incluyendo hidróxido sódico, carbonato sódico, alcóxido sódico y alcóxido potásico. Después se usa acetato de etilo para extraer la mezcla de productos finales de isómeros (E) y (Z) de ISA_{TX}247.

Procedimiento 2

En una ruta de reacción alternativa, para sintetizar una mezcla de isómeros (E) y (Z) de ISA_{TX}247 mediante una estrategia por reacción de Wittig, se puede usar una ruta sintética de cuatro etapas como sigue: 1) protección del alcohol \beta, como en el procedimiento 1, 2) oxidación de la acetil-ciclosporina A producida en la primera etapa para producir un aldehído; 3) una reacción de Wittig; y 4) desacetilación del producto de la reacción de Wittig, o de forma equivalente, hidrólisis del éster acetato para recuperar el alcohol. Esta secuencia de reacciones se ilustra en la fig. 5.

La ruta sintética empieza de una forma similar a la ruta de la reacción de Wittig de la fig. 4 en cuanto que la primera etapa protege el alcohol \beta con un grupo éster acetato. Sin embargo, las dos rutas difieren a partir de aquí, en que la siguiente etapa del procedimiento 2 convierte la acetil-ciclosporina A 35 en un aldehído, el aldehído de la acetil-ciclosporina A 51. Esta reacción usa un agente oxidante suficientemente fuerte para escindir un enlace C=C para producir dos fragmentos. La escisión del alqueno se conoce en la técnica. El ozono es quizás el reactivo de escisión de dobles enlaces más comúnmente usado, pero otros reactivos oxidantes tales como el permanganato potásico (KMnO_{4}) o el tetraóxido de osmio pueden producir también la escisión del doble enlace.

El uso de agentes oxidantes basados en rutenio ha sido discutido por H.J. Carlsen y col. en "A Greatly Improved Procedure for Ruthenium Tetroxide Catalyzed Oxidations of Organic Compounds", J. Org. Chem., Vol. 46, No. 19, pp 3736-3738 (1981). Carlsen y col. enseñan que, históricamente, el consumo del rutenio metálico proporcionaba un incentivo para el desarrollo de procedimientos catalíticos, el más popular de los cuales usaba peryodato o hipoclorito como oxidantes estequiométricos. Estos investigadores encontraron una falta de actividad catalítica durante el curso de la reacción con el uso convencional de rutenio, postulando que se debía a la presencia de ácidos carboxílicos. Se encontró que la adición de nitrilos a la mezcla de reacción, en especial de acetonitrilo potenciaba significativamente la velocidad y extensión de la escisión oxidativa de alquenos en un sistema de CCl_{4}/H_{2}O/IO_{4}^{-}.

De acuerdo con una realización de la presente invención, el aldehído de la acetil-ciclosporina A 51 se puede producir a partir de la acetil-ciclosporina A 35 disolviéndola en una mezcla de acetonitrilo y agua, y después añadiendo primero peryodato sódico y después hidrato de cloruro de rutenio. El aldehído 51 se puede extraer con acetato de etilo. Debe indicarse que la síntesis del aldehído 51 por esta estrategia de escisión oxidativa es importante para muchas de las rutas estereoselectivas que se discutirán a continuación, y por consiguiente se volverá a referir al lector a esta sección.

La tercera etapa del procedimiento 2 implica convertir el aldehído 51 en una mezcla de dienos (E) y (Z) por una reacción de Wittig, de una forma similar a la del procedimiento 1. Como en el procedimiento 1, se añade un iluro de fósforo al aldehído para dar una betaína (que no se aísla), con el resultado neto de que el átomo de oxígeno carbonílico del aldehído es sustituido por el grupo R_{2}C= originalmente unido al fósforo. Otra vez, dichas reacciones de Wittig se pueden llevar a cabo con compuestos que contienen fósforo distintos de los derivados de trifenilfosfonio, tales como triarilfosfinas, trialquilfosfinas, arilalquilfosfinas y triarilarsinas, a diferentes temperaturas, y usando una variedad de soluciones básicas y disolventes, o se puede usar la adición de diferentes sales inorgánicas para influir en la estereoquímica del doble enlace recién formado.

En una realización, el aldehído de la acetil-ciclosporina A 51 se disuelve en tolueno, al que se le añade una base tal como hidróxido sódico en agua. Después se añade el bromuro de aliltrifenilfosfonio 52 y la reacción se agita durante algún tiempo. El tratamiento de la mezcla del producto de los acetil-(E) y (Z)-dienos 53 implica la extracción con hexano y/o acetato de etilo, en el que el término "tratamiento" se pretende que signifique el procedimiento para extraer y/o aislar los productos de reacción de una mezcla de reactivos, productos, disolvente, etc.

En una etapa final del procedimiento 2, similar a la etapa final del procedimiento 1, se elimina el grupo éster acetato que protege el alcohol de la posición del carbono \beta, con carbonato potásico, dando una mezcla de isómeros (E) y (Z) de ISA_{TX}247. Otras bases distintas del carbonato potásico que se pueden usar para eliminar el grupo protector incluyen hidróxido sódico, carbonato sódico, alcóxido sódico y alcóxido potásico.

Síntesis de composiciones enriquecidas en cualquiera de los isómeros (E) y (Z) de ISA_{TX}247 por rutas con organometálicos

Las rutas sintéticas estereoselectivas pueden usar reactivos inorgánicos que contienen elementos tales como silicio, boro, titanio, azufre, fósforo y/o litio. Estas rutas pueden desarrollarse a través de un estado de transición de seis miembros en el que uno de los miembros del anillo es el elemento inorgánico del reactivo organometálico. En algunas realizaciones, los efectos de impedimento estérico relacionados con el estado de transición pueden influir en el resultado estereoquímico de la reacción.

En la presente descripción se discutirán dos esquemas estereoselectivos de ejemplo. En el primer esquema estereoselectivo (procedimiento 3, también mostrado como ruta 32 en la fig. 3), un compuesto que contiene silicio experimenta una reacción de eliminación para producir el isómero (E) o (Z), dependiendo de si la reacción de eliminación se lleva a cabo en condiciones ácidas o básicas. Este es un ejemplo de una olefinación de Peterson. En el segundo esquema estereoselectivo (procedimiento 4, también mostrado como ruta 33 en la fig. 3), cada uno de los isómeros es producido a partir de un precursor diferente. El isómero (Z) se produce a partir de productos intermedios que contienen titanio y fósforo, mientras que el isómero (E) se produce por productos intermedios que contienen litio.

Procedimiento 3

Este procedimiento se desarrolla a través del aldehído de la acetil-ciclosporina A 51.

Han discutido un esquema de reacción similar D.J.S. Tsai y D.S. Matteson en "A Stereocontrolled Synthesis of (Z) and (E) Terminal Dienes from Pinacol (E)-1-Trimethylsilyl-1-Propene-3-Boronate", Tetrahedron Letters, Vol. 22, No. 29, pp. 2751-2752 (1981). El procedimiento se ilustra en la fig. 6. En general, la síntesis implica preparar un reactivo de éster de trimetilsililalilboronato 62, y después tratar el aldehído de la acetil-ciclosporina A 51 con 62 para formar el \beta-trimetilsilil-alcohol 64. Se cree que este alcohol se forma a través de un estado de transición que contiene boro 63. Puesto que los ésteres de boronato reaccionan lentamente en reacciones de boración alílica, los expertos en la técnica apreciarán que el uso de un reactivo de borano que reaccione más rápido tal como el E-\gamma-trimetilsilil-dietilborano o 9-(E-\gamma-trimetilsililalil)-9-BBN, tiene ventajas. Después el \beta-trimetilsil-alcohol 64 puede experimentar una olefinación de Peterson para preparar un alqueno, en este caso el dieno 65 o el dieno 67.

La formación del alqueno sigue uno de dos caminos distintos, dependiendo de si la reacción de eliminación (la olefinación) se lleva a cabo en condiciones ácidas o básicas. En condiciones ácidas tiene lugar una eliminación anti que forma el isómero (E), mientras que en condiciones básicas tiene lugar una eliminación cis para formar el isómero (Z). Los expertos en la técnica apreciarán que usando esta ruta sintética se puede preparar cualquiera de los isómeros a partir del mismo precursor. El producto de cada reacción de eliminación comprende una composición enriquecida en uno de los dos isómeros. En una realización, enriquecido significa que la composición contiene más o igual a aproximadamente 75 por ciento en peso de un isómero. En otras realizaciones, la composición enriquecida puede comprender 80, 85 y 90 por ciento en peso de uno de los isómeros. Las composiciones enriquecidas en un isómero después
se pueden combinar en una relación predeterminada para llegar a la mezcla deseada como se ilustra en la fig. 10.

Se discutirán a continuación con detalle las reacciones de la fig. 6, empezando por la preparación del reactivo que contiene boro 62. Han llevado a cabo una investigación general del uso de reactivos de silicio en la síntesis de reacciones que forman enlaces carbono-carbono E. Ehlinger y P. Magnus en "Silicon in Synthesis. 10. The (Trimethylsilyl)allyl Anion: A \beta-Acyl Anion Equivalent for the Conversion of Aldehydes and Ketones into \gamma-Lactones", J. Am. Chem. Soc., Vol. 102, No. 15, pp. 5004-5011 (1980). En particular, estos investigadores enseñan la reacción entre el anión de (trimetilsilil)alilo y un aldehído. El anión se puede preparar por desprotonación del aliltrimetilsilano con sec-butil-litio en tetrahidrofurano a -76ºC, que contiene 1 equivalente de tetrametiletilendiamina (TMEDA).

J.F. Biellmann y J.-B. Ducep en "Allylic and Benzylic Carbanions Substituted by Heteroatoms", Organic Reactions, Vol. 27 (Wiley, New York, 1982), p. 9 han discutido la desprotonación del aliltrimetilsilano (esta etapa no se muestra en la fig. 6) Un protón en alfa al heteroátomo en sistemas alílicos sustituidos se puede eliminar con un agente más básico. Están disponibles una gran variedad de dichos agentes, siendo quizás el más común el n-butil-litio. El n-butil-litio se usa en una cantidad estequiométrica con el compuesto que se va a metalar en solución con tetrahidrofurano (THF). Normalmente, la temperatura se mantiene por debajo de 0ºC (a menudo por debajo de -76ºC) a la que el n-butil-litio tiene una reactividad baja debido a su naturaleza polimérica. La adición de un agente quelante tal como N,N,N',N'-tetrametiletilendiamina (TMEDA) hace que el polímero se disocie. Sin embargo, la reacción también se puede hacer a temperatura ambiente, incluso en ausencia de TMEDA.

Los alilsilanos se desprotonan fácilmente porque el anión que se genera está estabilizado, no sólo por la conjugación con el doble enlace adyacente, si no también por el grupo sililo vecino. El anión puede reaccionar con electrófilos por su carbono \alpha o su carbono \gamma. Los resultados regioquímicos y estereoquímicos de estas reacciones dependen de varios factores, y uno de los más importantes es la identidad del contraión. Véase la discusión de alilsilanos de S. E. Thomas en Organic Synthesis: The Roles of Boron and Silicon (Oxford University Press, New York, 1991), pp. 84-87.

En este esquema de reacción, el alilsilano desprotonado experimenta después una captura electrófila por el trimetilborato para producir un producto intermedio, el cual cuando reacciona con pinacol, da el compuesto trans-(trimetilsilil)boronato 62. El boronato 62 también se puede llamar un "alilborano" (éster alilboronato). Alternativamente, si se usa 9-metoxi-9-dialquilborano en la captura electrófila, dará lugar a un complejo de boronato que se puede demetoxilar usando un reactivo de trifluoruro de boro (tal como BF_{3}.Et_{2}O) para generar el correspondiente 9-(\gamma-trans-trimetilsililalil)-9-dialquilborano.

S.E. Thomas en la referencia anterior, en las páginas 34-35, ha discutido la adición de un aldehído a un alilborano. La adición de un aldehído a un alilborano, en la que este último está sustituido de forma no simétrica en el extremo distal del doble enlace carbono-carbono ("distal" significa más alejado del átomo de boro) produce un alcohol homoalílico que contiene dos centros quirales adyacentes. Los (E)-alilboranos dan lugar al diastereoisómero treo, mientras que los (Z)-alilboranos dan lugar al diastereoisómero eritro. Una reacción de ejemplo de un (E)-alilborano 62 con el aldehído de la ciclosporina A 51 se muestra en la fig. 6, en la que el producto intermedio de boro 63 se forma después de agitar los reaccionantes en una solución de THF durante un periodo de varios días.

El número de referencia 69 en el producto intermedio de boro 63 (fig. 6) se entiende que indica que son posibles cualquiera de una serie de estructuras en la posición del boro. Por ejemplo, si el reactivo boronato 62 es un éster trialquilsililalilboronato, entonces la estructura 69 comprendería un anillo de 5 miembros que incluye dos átomos de oxígeno. Las sustituciones en los reactivos boronato o borano usados en 62 estarán presentes en la estructura 63.

Se ha postulado que la estereoselectividad que se logra en reacciones que implican alilboranos con aldehídos puede deberse al estado de transición de anillo de seis miembros de tipo silla ilustrado para el producto intermedio de boro 63, y representado en la fig. 6. Sólo los dos átomos carbonílicos del aldehído (el carbono y el oxígeno que están unidos por doble enlace) se convierten en miembros del anillo de transición de seis miembros; el resto del aldehído se extiende fuera del anillo. Se ha postulado que la parte de CsA del aldehído que se extiende hacia fuera del anillo de seis miembros existe en una posición ecuatorial más que axial con respecto al anillo, porque esta última configuración daría lugar a impedimentos estéricos desfavorables entre el sustituyente y un átomo de oxígeno del alilborano 62. Los expertos en la técnica también apreciarán que la posición del grupo SiMe_{3} del anión de (trimetilsilil)alilo se muestra ocupando una posición ecuatorial en la fig. 6 porque este ejemplo partía del diastereoisómero (E) del alilborano. Alternativamente, el grupo SiMe_{3} se podría haber dibujado en una posición axial si el alilborano de partida hubiera sido el diastereoisómero (Z).

Alternativamente, se contempla la preparación del eritro-silil-alcohol, para el cual la eliminación con ácido daría lugar al isómero cis y la eliminación con base daría lugar al isómero trans, de una forma opuesta a las reacciones de eliminación discutidas antes. Será evidente para los expertos en la técnica que se obtendrían los mismos productos al final de la síntesis.

El tratamiento del producto del estado de transición 63 con trietanolamina da el \beta-trimetilsilil-alcohol 64. Por otra parte, el producto de alilboración del (trimetilsililalil)dialquil-borano da el silil-alcohol 64 tras oxidación usando NaOH/H_{2}O_{2} o tratamiento acuoso. El alcohol 64 representado en la fig. 6 es el diastereoisómero treo, puesto que el alilborano 63 del estado de transición tenía la configuración (E), aunque los expertos en la técnica apreciarán que también se podría haber preparado el otro diastereoisómero si se hubiera partido del reactivo Z-alilborano. La diastereoselectividad en los centros quirales recién creados no está determinada en esta etapa, debido a la eliminación de estos centros quirales en una etapa posterior de la síntesis. Los autores de la invención han confirmado la estructura del \beta-trimetilsilil-alcohol 64 mostrada en la fig. 6 usando técnicas espectrales.

En un procedimiento de síntesis de alquenos conocida como olefinación de Peterson, la eliminación del grupo trialquilsililo y el grupo hidroxi del \beta-trimetilsilil-alcohol 64 conduce a un alqueno, en este caso a un dieno, debido al doble enlace que ya está presente entre los dos átomos de carbono terminales de la cadena. Se presenta una discusión de la conversión de los \beta-hidroxisilanos en alquenos en la referencia anterior de S.E. Thomas páginas 68-69. Presentan una discusión adicional de esta reacción P.F. Hurdlik y D. Peterson en "Stereospecific Olefin-Forming Elimination Reactions of P-Hydroxysilanes", J. Am. Chem. Soc., Vol. 97, No. 6, pp. 1464-1468 (1975).

En relación con la fig. 6. la reacción de eliminación que convierte el alcohol 64 en un dieno puede seguir uno de dos rutas mecanísticas diferentes, dependiendo de si la reacción se lleva a cabo en condiciones ácidas o básicas. Una ruta conduce al dieno 65, mientras que la otra ruta conduce al dieno 67. En condiciones ácidas se produce la eliminación anti, mientras que en condiciones básicas se produce la eliminación sin. En otras palabras, las reacciones de eliminación de \beta-hidroxisilanos son estereoespecíficas, y las reacciones promovidas por ácido o base tienen desarrollos estereoquímicos opuestos. Los ácidos típicos para la reacción promovida por ácido pueden incluir ácido acético, ácido sulfúrico y diferentes ácidos de Lewis; las bases típicas incluyen hidruro sódico e hidruro potásico o terc-butóxido potásico. Puede ocurrir que las reacciones de eliminación usando hidruro sódico en THF sean lentas a temperatura ambiente, mientras que las reacciones de eliminación que usan hidruro potásico tengan lugar más rápidamente.

La estereoespecificidad ocurre en esta etapa de la ruta de reacciones porque la eliminación en condiciones ácidas requiere que los grupos trimetilsililo e hidroxilo estén un una relación antiperiplanar. En contraste, la eliminación en condiciones básicas requiere que los grupos trimetilsililo e hidroxi adopten una relación sinperiplanar. Esta última condición facilita la formación de un enlace silicio-oxígeno fuerte y un anillo de cuatro miembros intermedio, que se rompe de una forma análoga a la etapa final de una reacción de Wittig. Los expertos en la técnica apreciarán que un enlace silicio-oxígeno fuerte sustituye un enlace silicio-carbono más débil, lo cual domina sobre la sustitución de un enlace carbono-oxígeno fuerte por un enlace carbono-carbono \pi más débil.

Así pues, los productos de la eliminación estereoespecífica de un \beta-hidroxi-alquilsilano son el compuesto acetil-(E)-1,3-dieno 67 y el compuesto acetil-(Z)-1,3-dieno 65. Como en los procedimientos anteriores, ahora se puede eliminar el grupo protector de cada uno de estos dienos por tratamiento con K_{2}CO_{3} en metanol y agua. Esto elimina el grupo acetato unido al carbono \beta del resto aminoácido 1, devolviendo el grupo funcional en ese carbono a un alcohol. Otras bases distintas del carbonato potásico que se pueden usar para eliminar el grupo protector incluyen hidróxido sódico, carbonato sódico, alcóxido sódico y alcóxido potásico.

En esta etapa de la preparación la síntesis se ha completado sustancialmente. Las composiciones enriquecidas en uno o el otro de los isómeros se pueden mezclar para lograr la relación deseada de isómeros en la mezcla. Por "enriquecida" se entiende un producto que comprende al menos aproximadamente 75 por ciento en peso de ese isómero; en otras palabras, el producto puede contener hasta 25 por ciento en peso del isómero "no deseado". La mezcla se diseña para alcanzar el resultado farmacológico deseado.

Procedimiento 4

Esta ruta también se desarrolla por el aldehído de la acetil-ciclosporina A 51.

En las figs. 7-8 se ilustra un esquema alternativo para producir isómeros estereoselectivos. Esta ruta sintética difiere de las discutidas previamente en que 1) la ruta sintética para producir el isómero (E) de ISA_{TX}247 se desarrolla por productos intermedios diferentes de los del isómero (Z), y 2) estas rutas sintéticas usan reactivos y/o productos intermedios que contienen titanio y litio.

Se sabe que los reactivos de titanio son particularmente útiles en la síntesis orgánica porque son regio y estereoselectivos en sus reacciones con aldehídos y cetonas. La naturaleza general del titanio en la química estereoselectiva ha sido discutida por M.T. Reetz en Organotitanium Reagents in Organic Synthesis (Springer-Verlag, Berlin, 1986), pp. VII, 148-149, y 164-165. Aquí se expone que la naturaleza del ligando de titanio puede variar de modo que se puede manipular la identidad electrónica y estérica del reactivo, y se puede predecir el resultado estereoquímico de muchas reacciones de formación de enlaces C-C. De acuerdo con esta química, la unión de dos centros proquirales de moléculas aquirales crea dos centros de quiralidad. Una norma general que gobierna el resultado estereoselectivo es que el enolato con configuración Z o los compuestos metálicos de crotilo forman con preferencia aductos sin, mientras que los reactivos con configuración E favorecen los diastereoisómeros anti. La tendencia se puede explicar otra vez suponiendo un estado de transición cíclico de seis miembros que tiene una geometría de silla.

Ha discutido un ejemplo específico de este tipo de síntesis estereoselectiva Y. Ikeda y col. en "Stereoselective Synthesis of (Z)- and (E)-1,3-Alkadienes from Aldehydes Using Organotitanium and Lithium Reagents", Tetahedron, Vol. 43, No. 4, pp. 723-730 (1987). Este antecedente describe que se puede usar la alildifenilfosfina para producir un reactivo de [3-(difenilfosfino)alil]titanio, que a su vez se puede condensar con un aldehído seguido de formación de la sal de fosfonio para dar un (Z)-1,3-alcadieno de una forma altamente regio y estereoselectiva. En contraste, un óxido de alildifenilfosfina litiado puede condensar con un aldehído para dar un (E)-1,3-alcadieno directamente, otra vez con la estereoselectividad deseada.

En relación con la fig. 7, la síntesis del isómero (Z) de ISA_{TX}247 se desarrolla (como en los esquemas previos) generando el aldehído de la acetil-ciclosporina A 51 a partir de la ciclosporina A 34. El reactivo de [3-(difenilfosfino)alil]titanio 72 se prepara por desprotonación de la alildifenilfosfina 71 con una base fuerte tal como t-BuLi, y después haciendo reaccionar el producto con tetraisopropóxido de titanio. Se propone teóricamente un estado de transición 73 que conduce al eritro-\alpha-aducto 74, el cual después se convierte en la sal de \beta-óxido-fosfonio 75 por tratamiento de 74 con yodometano (MeI). Se postula que la existencia del estado de transición 73 es al menos en parte responsable de la estereoselectividad de esta ruta sintética.

De acuerdo con los procedimientos de ejemplo indicados en la presente descripción, el sitio del metal del reactivo organometálico puede ser la entidad que controla la regioselectividad (Ikeda, pág. 725). Esto significa que el aldehído 51 en la fig. 7 reacciona con el compuesto difenilfosfino 72 en su posición \alpha para dar el correspondiente \alpha-aducto 74, puesto que el carbono \gamma del grupo difenilfosfino está coordinado al metal, que en este caso es titanio. La selectividad Z observada del producto dieno se explica considerando el estado de transición de seis miembros 73. Puesto que se postula que tanto la voluminosa cadena lateral de ciclosporina A del aldehído 35 como el grupo difenilfosfino ocupan posiciones ecuatoriales en el estado de transición, se forma selectivamente el eritro-\alpha-aducto 74, dando lugar al (Z)-1,3-dieno 76.

A diferencia de la ruta de reacciones representada en la fig. 7, en la que el isómero Z de ISA_{TX}247 se produce por un estado de transición con titanio, el isómero (E) no es produce fácilmente por este procedimiento. De hecho, se ha descrito que los intentos de sintetizar el isómero (E) por este procedimiento en general dan como resultado rendimientos bajos. En su lugar, como se muestra en la fig. 8, el derivado de litio 82 se puede hacer reaccionar con el aldehído 51 para producir el estado de transición que contiene litio 83, que forma el 1,3-dieno con relaciones E/Z en un intervalo mayor que aproximadamente 75:25. Como en la fig. 7, la alta estereoselectividad del producto de reacción se debe posiblemente al estado de transición 83, en el que se postula que el grupo vinilo del reactivo de litio 82 y la cadena lateral de ciclosporina A del aldehído 51 ocupan posiciones ecuatoriales, produciendo de esta forma el (E)-1,3-dieno 84 de una forma estereoselectiva. Como se ha discutido previamente, algunas reacciones secundarias indeseables que implican el grupo protector acetato se pueden evitar en todas las síntesis estereoselectivas usando grupos protectores tales como ésteres benzoato o éteres de sililo.

Preparación de mezclas

Como se ha expuesto previamente, se ha encontrado que determinadas mezclas de isómeros cis y trans de ISA_{TX}247 presentan una combinación de mayor potencia y/o menor toxicidad frente a las ciclosporinas naturales y las actualmente conocidas.

Como se ha indicado antes, los isómeros de ISA_{TX}247 (y sus derivados) se pueden sintetizar por rutas estereoselectivas que pueden variar en su grado de estereoselectividad. Las rutas estereoselectivas pueden producir un primer material o composición enriquecido en el isómero (E) y un segundo material o composición enriquecido en el isómero (Z), y después estos materiales se pueden combinar de modo que la mezcla resultante tenga la relación deseada de los dos isómeros. Alternativamente, se contempla que el primer material se puede preparar separando un producto de reacción para aislar y enriquecer en el isómero (E), y se puede preparar el segundo material separando un producto de reacción para aislar y enriquecer en el isómero (Z). Todavía de otra forma, las condiciones de reacción de una ruta estereoselectiva se pueden diseñar para producir la relación deseada directamente en una mezcla
preparada.

Estos principios se ilustran en las figs. 9A-C y 10. En las figs. 9A-C, se muestran tres reacciones sintéticas hipotéticas que producen relaciones de isómero (A) a (Z) de aproximadamente 65 a 35 por ciento en peso, 50 a 50 por ciento en peso, y 35 a 65 por ciento en peso, respectivamente. Por supuesto, estas relaciones son de ejemplo y sólo tienen propósitos ilustrativos, y se podría haber elegido cualquier grupo de números hipotético. Será evidente para los expertos en la técnica que las condiciones de reacción usadas para producir la relación en la fig. 9A pueden ser diferentes de las de las figs. 9B y 9C, con el fin de lograr una relación de isómeros diferente en la mezcla de productos. Las condiciones de cada reacción se han diseñado para producir una relación particular de los dos isómeros para ese caso.

A diferencia de algunas rutas sintéticas, en las que se produce una mezcla de isómeros, los isómeros se pueden preparar primero individualmente y después mezclar en proporciones predeterminadas para lograr la relación deseada. Este concepto se ilustra en la fig. 10, en la que el producto de una ruta estereoselectiva está enriquecido en uno de los isómeros de modo que el producto comprende más de aproximadamente 75 por ciento en peso del isómero (E), y el producto de la otra ruta estereoselectiva está enriquecido en el otro isómero de modo que este producto comprende más de aproximadamente 75 por ciento en peso del isómero (Z). Estos números también son ejemplos, y la pureza del isómero que resulta de una ruta estereoselectiva puede ser mayor o igual que aproximadamente 75 por ciento en peso en una realización. En otras realizaciones, el isómero deseado comprende más de o igual a aproximadamente 80, 85, 90 y 95 por ciento en peso, respectivamente.

Después de sintetizar los isómeros individualmente, se pueden mezclar para lograr la relación deseada, como se ilustra en la fig. 10. Con propósitos de ilustración, se escogen las mismas relaciones hipotéticas en la fig. 10 que las usadas en las figs. 9A-C. En relación con la fig. 10, los isómeros (E) y (Z) se mezclan para dar tres mezclas diferentes que comprenden relaciones del isómero (E) al (Z) de aproximadamente 65 a 35 por ciento en peso, 50 a 50 por ciento en peso, y 35 a 65 por ciento en peso, respectivamente.

Alternativamente, se puede separar una mezcla de isómeros (E) y (Z) de ISA_{TX}247 de modo que la mezcla esté enriquecida en uno de los isómeros frente al otro. Por ejemplo, se puede usar una reacción de Diels-Alder para convertir el isómero cis en un compuesto anular cerrado haciéndolo reaccionar con un alqueno. Si el alqueno está unido a un sustrato que se puede aislar (p. ej., se puede filtrar), el isómero cis se puede separar sustancialmente de la mezcla, dejando una composición enriquecida en el isómero trans. El isómero cis se puede reconstituir a partir del compuesto anular cerrado por aplicación de calor, produciendo una composición enriquecida en el isómero cis. De esta forma, se pueden separar los isómeros cis y trans.

En la práctica, la relación de isómeros (E) a (Z) en cualquier mezcla, independientemente del grado de estereoselectividad del procedimiento por la que se haya producido, puede estar en un amplio intervalo de valores. La mezcla puede comprender desde 70 a 95 por ciento del isómero (E) hasta 25 a 5 por ciento del isómero (Z). Preferiblemente, la mezcla puede contener desde 75 a 85 por ciento en peso del isómero (E) y 25 a 15 por ciento del isómero (Z); o 85 a 90 por ciento en peso del isómero (E) y 10 a 15 por ciento en peso del isómero (Z); o 90 a 95 por ciento en peso del isómero (E) y 10 a 5 por ciento en peso del isómero (Z). Estos porcentajes en peso se basan en el peso total de la composición, y se entenderá que la suma de los porcentajes en peso del isómero (E) y el isómero (Z) es 100 por cien en peso. En otras palabras, una mezcla puede contener 75 por ciento en peso del isómero (E) y 25 por ciento en peso del isómero (Z).

El porcentaje de uno u otro isómero en una mezcla se puede verificar usando resonancia magnética nuclear (RMN), u otras técnicas bien conocidas en la técnica.

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Composiciones farmacéuticas

Esta invención tiene interés en el tratamiento de pacientes que necesitan inmunosupresión, e implica la administración de composiciones farmacéuticas que comprenden la mezcla de la invención como constituyente activo. Las indicaciones para las que esta combinación tiene interés incluyen en particular afecciones autoinmunes e inflamatorias y afecciones asociadas con o causadas por rechazo de transplante, p. ej., tratamiento (incluyendo mejora, reducción, eliminación o cura de la etiología o síntomas) o prevención (incluyendo restricción sustancial o completa, profilaxis o evitación) de lo siguiente:

a) Rechazo agudo de transplante de órgano o tejido, p. ej., tratamiento de receptores de, p. ej., transplantes de corazón, pulmón, corazón-pulmón combinado, hígado, riñón, pancreático, piel, intestino o córnea, en especial prevención y/o tratamiento de rechazo mediado por células T, así como enfermedad de injerto contra huésped, tal como después de transplante de médula ósea.

b) Rechazo crónico de un órgano transplantado, en particular, prevención de enfermedad de vaso injertado, p. ej., caracterizado por la estenosis de las arterias del injerto como resultado de un engrosamiento de la íntima debido a la proliferación de células musculares lisas y efectos asociados.

c) Rechazo de xenoinjerto, incluyendo rechazo agudo, hiperagudo o crónico de un órgano, que ocurre cuando el donante del órgano es de una especie diferente al receptor, más en especial rechazo mediado por células B o rechazo mediado por anticuerpo.

d) Enfermedad autoinmune y afecciones inflamatorias, en particular afecciones inflamatorias con una etiología que incluye un componente inmunológico o autoinmune tal como artritis (por ejemplo artritis reumatoide, artritis crónica progrediente y artritis deformante) y otras enfermedades reumáticas. Las enfermedades autoinmunes específicas para las que se puede usar la combinación sinérgica de la invención incluyen trastornos hematológicos autoinmunes (incluyendo, por ejemplo, anemia hemolítica, anemia aplásica, anemia pura de glóbulos rojos y trombocitopenia idiopática), lupus eritematoso sistémico, policondritis, escleroderma, granulomatosis de Wegner, dermatomiositis, hepatitis activa crónica, miastenia grave, psoriasis, síndrome de Steven-Johnson, esprúe idiopático, enfermedad inflamatoria del intestino (autoinmune) (incluyendo, p.ej., colitis ulcerativa y enfermedad de Crohn), oftalmopatía endocrina, enfermedad de Graves, sarcoidosis, esclerosis múltiple, cirrosis biliar primaria, diabetes juvenil (diabetes mellitus de tipo I), uveítis (anterior y posterior), queratoconjuntivitis seca y queratoconjuntivitis vernal, fibrosis pulmonar intersticial, artritis psoriática, glomerulonefritis (con o sin síndrome nefrótico, p. ej., incluyendo síndrome nefrótico idiopático o nefropatía por cambio mínimo) y dermatomiositis juvenil. Las afecciones autoinmunes e inflamatorias de la piel también se considera que son susceptibles de tratamiento y prevención usando la combinación sinérgica de la invención, p. ej., psoriasis, dermatitis de contacto, dermatitis atópica, alopecia aerata, eritema multiforme, dermatitis herpetiforme, escleroderma, vitíligo, angeítis por hipersensibilidad, urticaria, pénfigo bulloso, lupus eritematoso, pénfigo, epidermolisis bullosa adquirida, y otras afecciones inflamatorias o alérgicas de la piel, tales como afecciones inflamatorias de los pulmones y vías aéreas incluyendo asma, alergias y pneumoconiosis.

Las mezclas isoméricas del análogo de esta invención se pueden administrar solas o con un vehículo farmacéutico a un animal de sangre caliente que lo necesite. El vehículo farmacéutico puede ser sólido o líquido. La mezcla de la invención se pude administrar por vía oral, tópica, parenteral, por pulverizadores para inhalación o vía rectal en formulaciones de unidades de dosificación que contienen vehículos, adyuvantes y excipientes farmacéuticamente aceptables, no tóxicos, convencionales. El término parenteral, tal como se usa en el presente documento, incluye inyecciones subcutáneas, inyección intravenosa, intramuscular, intraesternal o técnicas de infusión.

Las composiciones farmacéuticas que contienen la mezcla de la invención pueden estar preferiblemente en una forma adecuada para uso oral, por ejemplo, como comprimidos, trociscos, pastillas, suspensiones acuosas o de aceite, polvos o gránulos dispersables, emulsiones, cápsulas duras o blandas, o jarabes o elixires. Las composiciones dirigidas al uso oral se pueden preparar de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica para la fabricación de composiciones farmacéuticas y dichas composiciones pueden contener uno o más agentes seleccionados del grupo que consiste en agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes colorantes y agentes conservantes con el fin de proporcionar una preparación sabrosa y farmacéuticamente elegante. Los comprimidos que contienen el principio activo mezclado con vehículos farmacéuticamente aceptables no tóxicos también se pueden fabricar por procedimientos conocidos. Los vehículos usados pueden ser, por ejemplo, (1) diluyentes inertes tales como carbonato cálcico, lactosa, fosfato cálcico o fosfato sódico; (2) agentes de granulación y disgregantes tales como almidón de maíz o ácido algínico; (3) agentes aglutinantes tales como almidón, gelatina o goma arábiga, y (4) agentes lubricantes tales como estearato magnésico, ácido esteárico o talco. Los comprimidos pueden no estar recubiertos o pueden recubrirse por técnicas conocidas para retrasar la disgregación y absorción en el tracto gastrointestinal y proporcionar así una acción sostenida a lo largo de un periodo más largo. Por ejemplo, se puede usar un material de retardo tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo. También se pueden recubrir por las técnicas descritas en las patentes de EE.UU. nº 4.256.108; 4.160.452 y 4.265.874, para formar comprimidos terapéuticos osmóticos para la liberación controlada.

En algunos casos, las formulaciones para uso oral pueden ser en forma de cápsulas de gelatina dura en las que el principio activo se mezcla con un diluyente sólido inerte, por ejemplo, carbonato cálcico, fosfato cálcico o caolín. También se pueden usar en forma de cápsulas de gelatina blanda en las que el principio activo se mezcla con agua o un medio de aceite, por ejemplo, aceite de cacahuete, parafina líquida o aceite de oliva.

Las suspensiones acuosas normalmente contienen los materiales activos mezclados con vehículos adecuados para la fabricación de suspensiones acuosas. Dichos vehículos pueden incluir: (a) agentes de suspensión tales como carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato sódico, polivinilpirrolidona, goma de tragacanto y goma arábiga; o (2) agentes de dispersión o humectantes que pueden ser un fosfátido natural tal como lecitina, un producto de condensación de un óxido de alquileno con un ácido graso, por ejemplo, estearato polioxietilenado, un producto de condensación de óxido de etileno con un alcohol alifático de cadena larga, por ejemplo, heptadecaetilenoxicetanol, un producto de condensación de óxido de etileno con un éster parcial derivado de un ácido graso y un hexitol tal como monooleato de sorbitol polioxietilenado, o un producto de condensación de óxido de etileno con un éster parcial derivado de un ácido graso y un anhídrido de hexitol, por ejemplo monooleato de sorbitán polioxietilenado.

Las suspensiones acuosas también pueden contener uno o más conservantes, por ejemplo, p-hidroxibenzoato de etilo o n-propilo; uno o más agentes colorantes; uno o más agentes aromatizantes; y uno o más agentes edulcorantes tales como sacarosa, aspartamo o sacarina.

Se pueden formular suspensiones en aceite suspendiendo el principio activo en un aceite vegetal, por ejemplo, aceite de araquis, aceite de oliva, aceite de sésamo o aceite de cacahuete, un aceite de pescado que contenga ácido graso omega-3, o en un aceite mineral tal como parafina líquida. Las suspensiones en aceite pueden contener un agente espesante, por ejemplo cera de abeja, parafina dura o alcohol cetílico. Se pueden añadir agentes edulcorantes y agentes aromatizantes para proporcionar una preparación oral sabrosa. Estas composiciones pueden conservarse por la adición de un antioxidante tal como ácido ascórbico.

Los polvos dispersantes y gránulos son adecuados para preparar una suspensión acuosa. Proporcionan el principio activo en una mezcla con un agente dispersante o humectante, un agente de suspensión y uno o más conservantes. Los agentes dispersantes o humectantes adecuados y los agentes de suspensión se ejemplifican por los ya mencionados antes. También pueden estar presentes vehículos adicionales, por ejemplo, los agentes edulcorantes, aromatizantes y colorantes descritos antes.

Las composiciones farmacéuticas que contienen la mezcla de la invención también pueden estar en forma de emulsiones de aceite en agua. La fase de aceite puede ser un aceite vegetal tal como aceite de oliva o aceite de araquis, o un aceite mineral tal como parafina líquida o una mezcla de los mismos. Los agentes emulsionantes adecuados pueden ser (1) gomas naturales tales como goma arábiga y goma de tragacanto, (2) fosfátidos naturales tales como soja y lecitina, (3) ésteres o ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, por ejemplo, monooleato de sorbitán, (4) productos de condensación de dichos ésteres parciales con óxido de etileno, por ejemplo, monooleato de sorbitán polioxietilenado. Las emulsiones también pueden contener agentes edulcorantes y aromatizantes.

Los jarabes y elixires se pueden formular con agentes edulcorantes, por ejemplo, glicerol, propilenglicol, sorbitol, aspartamo o sacarosa. Dichas formulaciones también pueden contener un emoliente, un conservante y agentes aromatizantes y colorantes.

Las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de una suspensión acuosa u oleaginosa inyectable estéril. Esta suspensión se puede formular de acuerdo con procedimientos conocidos usando agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión adecuados que se han mencionados antes. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente aceptable por vía parenteral y no tóxico, por ejemplo, como una solución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que se pueden usar están el agua, solución de Ringer y solución isotónica de cloruro sódico. Además, se usa convencionalmente aceites fijos estériles como un disolvente o medio de suspensión. Para este propósito, se puede usar cualquier aceite fijo blando incluyendo mono o diglicéridos sintéticos. Además, son útiles ácidos grasos tales como el ácido oleico para preparar los productos inyectables.

La mezcla de la invención también se puede administrar en forma de supositorios para la administración rectal del fármaco. Estas composiciones se pueden preparar mezclando el fármaco con un vehículo no irritante adecuado que es sólido a temperaturas ordinarias pero líquido a la temperatura rectal y por lo tanto fundirá en el recto para liberar el fármaco. Dichos materiales son manteca de cacao y polietilenglicoles.

Para uso tópico, se usan cremas, pomadas, gelatinas, soluciones o suspensiones, etc. que contienen las ciclosporinas descritas.

En una realización particularmente preferida, se usa una solución líquida que contiene un tensioactivo, etanol, un disolvente lipófilo y/o uno anfifílico como ingredientes no activos. Específicamente, se usa una fórmula de emulsión múltiple oral que contiene la mezcla de análogos isómeros y los siguientes ingredientes no medicinales: succinato de d-alfa-tocoferil polietilenglicol 1000 (vitamina E-TPGS), aceite de triglicérido de cadena media (MCT), Tween 40 y etanol. Preferiblemente también se puede usar una cápsula de gelatina blanda (que comprende gelatina, glicerina, agua y sorbitol) que contiene la mezcla de isómeros del análogo y los mismos ingredientes no medicinales que la solución oral.

Son útiles niveles de dosificación del orden de aproximadamente 0,05 mg a aproximadamente 50 mg por kilogramo de peso corporal y por día, en el tratamiento de las afecciones indicadas antes. El nivel de dosis y el plan de administración pueden variar dependiendo de la mezcla de isómeros particular usada, la afección que se va a tratar, y factores adicionales tales como la edad y la afección del sujeto. Las dosis preferidas son de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 10 mg/kg/día y de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 mg/kg/día. En una realización preferida, se administra por vía oral dos veces al día de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 mg/kg/día. En una realización particularmente preferida, se administra por vía oral dos veces al día de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 3 mg/kg/día.

La cantidad de principio activo que se puede combinar con los materiales vehículo para producir una sola forma de dosificación variará dependiendo del huésped tratado y el modo de administración particular. Por ejemplo, una formulación dirigida a la administración oral a seres humanos puede contener de 2,5 mg a 2,5 g de agente activo mezclado con una cantidad adecuada y conveniente del material vehículo que puede variar de aproximadamente 5 a aproximadamente 95 por ciento de la composición total. Las formas de dosificación unitaria en general contendrán de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 500 mg de principio activo. En una realización preferida, se usan cápsulas individuales que contienen aproximadamente 50 mg de mezcla de isómeros para la administración oral. En otra realización preferida, se usan soluciones orales que contienen aproximadamente 500 mg/ml de mezcla de isómeros, para la administración oral.

Sin embargo, hay que entender, que el nivel de dosis específico para cualquier paciente particular dependerá de una variedad de factores incluyendo la actividad del compuesto específico usado, la edad, peso corporal, salud general, sexo, dieta, tiempo de administración, ruta de administración, velocidad de excreción, combinación de fármacos y naturaleza y gravedad de la enfermedad o afección particular sometido a terapia.

Metodología

El uso de derivados de ciclosporina, una clase de polipéptidos cíclicos producidos por el hongo Tolypocladium inflatum Gams, está aumentando en la terapia de inmunosupresión debido a sus efectos preferentes sobre las reacciones mediadas por células T. Se ha observado que los derivados de ciclosporina inhiben de forma reversible los linfocitos inmunocompetentes, en particular los linfocitos T, y también inhiben la producción y liberación de linfoquinas. Esta acción es mediada principalmente por la inhibición inducida por la ciclosporina A de la calcineurina, una enzima fosfatasa encontrada en el citoplasma de células (Schreiber y Crabtree, 1992). Un indicador de la eficacia de la cicolosporina A o un derivado de ciclosporina A es su capacidad para inhibir la actividad de fosfatasa de la calcineurina. El ensayo de inhibición de la calcineurina mide la actividad del fármaco en su sitio de acción, y por lo tanto es la evaluación in vitro más precisa y directa de la potencia de los análogos de ciclosporina A (Fruman y col., 1992).

ISA_{TX}247 es un análogo de ciclosporina A que es similar a la ciclosporina A, excepto por la modificación nueva de un grupo funcional en el resto aminoácido 1 de la molécula. Los autores de la invención ahora han encontrado que ISA_{TX}247 presenta una potencia hasta 3 veces mayor que la de la ciclosporina A en el ensayo de inhibición de calcineurina in vitro.

Los estudios farmacodinámicos (in vivo e in vitro) han mostrado que ISA_{TX}247 tiene más potencia que otros compuestos de ciclosporina existentes. Para ayudar a entender la presente invención, se ha demostrado la eficacia de mezclas de isómeros de ISA_{TX}247 que tienen 50-55% del isómero Z y 45-50% del isómero E, que no están de acuerdo con la presente invención, como un agente inmunosupresor (frente a la ciclosporina A), en un ensayo de actividad de la calcineurina in vitro, en un modelo de transplante de corazón en ratas, un modelo de alotransplante de células del islote en ratones, un modelo de artritis inducida por colágeno en el ratón y/o un modelo de artritis inducida por antígeno en el conejo. Los datos muestras que estas mezclas de isómeros son equivalentes o más potentes que la ciclosporina A, y por lo tanto útiles para el tratamiento de trastornos inmunorreguladores.

Hay numerosos efectos adversos asociados con la terapia con ciclosporina A, que incluyen nefrotoxicidad, hepatotoxicidad, cataratogénesis, hirsutismo, parestesia e hiperplasia gingival, por nombrar algunos (Sketris y col., 1995). De estos, la nefrotoxicidad es uno de los más graves efectos adversos relacionados con la dosis que resultan de la administración de ciclosporina A. El mecanismo exacto por el que la ciclosporina A produce daño renal no se conoce. Sin embargo, se ha propuesto que un aumento de los niveles de sustancias vasoconstrictoras en el riñón conduce a la vasoconstricción local de las arteriolas glomerulares aferentes. Esto puede dar como resultado isquemia renal, una disminución de la velocidad de filtración glomerular, y a largo plazo, fibrosis intersticial.

Se ha evaluado la seguridad no clínica de ISA_{TX}247 en una serie de especies animales. Los estudios de toxicidad oral de dosis repetidas en ratas, perros y primates mostraron que ISA_{TX}247 era tolerado bien y producía efectos que eran consecuentes con la inmunosupresión. El único efecto toxicológico observado en todas las especies fue diarrea/heces sueltas.

ISA_{TX}247 no presenta actividad mutágena como se demuestra en ensayos de mutación inversa bacteriana in vitro y aberración cromosómica, y en un ensayo de micronúcleo de rata in vivo. Hasta la fecha no se han completado estudios de carcinogenicidad. Se han completado estudios de toxicidad reproductiva con ISA_{TX}247 en ratas y conejos preñados. No había malformaciones o alteraciones relacionadas con el tratamiento. Con dosis que daban como resultado toxicidad materna, se observó embriotoxicidad.

Ejemplos Ejemplo 1 Acetilación de la ciclosporina A

Se añadió anhídrido acético (140 ml) a ciclosporina A (50,0 g, 41,6 mmol) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente en atmósfera de N_{2} hasta que se hubo disuelto toda la ciclosporina A. Se añadió dimetilaminopiridina (7,62 g, 62,4 mmol) y la reacción se agitó a temperatura ambiente en atmósfera de N_{2} durante 3 horas o hasta completarse la reacción. La mezcla de reacción se enfrió a 5ºC y después se filtró. Los sólidos recogidos se lavaron con hexano para eliminar el anhídrido acético adicional. El sólido pastoso resultante se transfirió lentamente a una solución acuosa de bicarbonato sódico al 5% (1,5 litros) vigorosamente agitada. La suspensión resultante se agitó hasta obtener una suspensión fina y haber cesado la evolución de CO_{2}. Los sólidos se recogieron por filtración y se lavaron con agua hasta que el filtrado tenía pH neutro. El producto sólido se secó en un horno a vacío durante una noche (55ºC) para dar 44,0 g (85%) del producto deseado en forma de un sólido incoloro.

Ejemplo 2 Oxidación del producto del ejemplo 1

Se añadieron acetonitrilo (320 ml) y agua (80 ml) a la acetil-ciclosporina A (42,97 g, 34,54 mmol) y la mezcla se agitó hasta que se hubo disuelto todo el material. Se añadió peryodato sódico (14,77 g, 69,08 mmol), seguido de la adición de hidrato de cloruro de rutenio (0,358 g, 1,73 mmol) y después la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas en una atmósfera de N_{2}. Se añadió agua (300 ml) y la mezcla se transfirió a un embudo de separación. La mezcla se extrajo dos veces con acetato de etilo (300 ml y después 250 ml). Los extractos de acetato de etilo negros oscuros se combinaron y se lavaron con 250 ml de agua seguido de 250 ml de salmuera. La solución orgánica después se secó con MgSO_{4} y se evaporó el disolvente para dar un sólido negro verdoso. El producto bruto se cromatografió en gel de sílice usando acetona al 40%/hexano al 60% como eluyente para dar el producto (29,1 g, 68%) en forma de un sólido incoloro.

Ejemplo 3 Preparación de acetil-ISA_{TX}247 i) Generación del iluro in situ

Se añadió el aldehído de la acetil-ciclosporina A (31,84 g, 25,84 mmol) a 340 ml de tolueno y la mezcla se agitó hasta que se hubo disuelto completamente el material. A la solución resultante se añadieron 340 ml de solución acuosa de hidróxido sódico 1 N. La mezcla resultante se agitó vigorosamente y después se añadió bromuro de aliltrifenilfosfonio (58,22 g, 151,90 mmol). La reacción se agitó durante 24 horas a temperatura ambiente y después se añadió bromuro de aliltrifenilfosfonio adicional (16,64 g, 43,42 mmol) y se continuó agitando durante 24 horas más. La mezcla se transfirió a un embudo de separación y se separó la fase de tolueno. La fase acuosa se extrajo con 200 ml adicionales de tolueno. Los dos extractos de tolueno se combinaron y se lavaron secuencialmente con 200 ml de agua desionizada y 200 ml de solución acuosa saturada de cloruro sódico. La solución se secó con MgSO_{4}, se filtró y el tolueno se evaporó para dar un gel muy viscoso. Este material se trató con 142 ml de acetato de etilo y se agitó hasta que se había formado una suspensión fina. Se añadió lentamente hexano (570 ml) con agitación rápida. La agitación se continuó durante 30 minutos y después la suspensión resultante se filtró y los sólidos recogidos se lavaron con 160 ml de hexano/acetato de etilo 5:1. Los filtrados combinados se concentraron en un rotavapor hasta un semisólido viscoso. Este material se trató con 75 ml de acetato de etilo y se agitó hasta que se obtuvo una suspensión fina. Se añadió lentamente hexano (225 ml) con agitación rápida. Se continuó agitando durante 30 minutos y después la suspensión resultante se filtró y los sólidos recogidos se lavaron con 100 ml de hexano/acetato de etilo 5:1. El filtrado se concentró en un rotavapor para dar un sólido amarillo pálido. El producto bruto se cromatografió en gel de sílice usando acetona al 40%/hexano al 60% como eluyente para dar el producto (14,09 g) en forma de un sólido incoloro.

ii) Generación del iluro preformado y reacción en presencia de LiBr

A una suspensión agitada de bromuro de aliltrifenilfosfonio (7,67 g, 20 mmol) en THF (20 ml) enfriada a 0ºC, se añadió una solución de KOBu^{t} en tetrahidrofurano (20 ml, 20 mmol, solución 1 M). La agitación se continuó a esta temperatura durante 30 minutos y se añadió una solución de LiBr en THF (10 ml, 10 mmol, solución 1 M). La mezcla de reacción después se agitó durante 30 minutos y se añadió mediante una cánula una solución de acetil-CsA-aldehído (4,93 g, 4 mmol) en THF (10 ml). Después de agitar durante 15 minutos a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se inactivó con solución saturada de NH_{4}Cl (25 ml). El tratamiento y la cromatografía como antes proporcionaron el ISA_{TX}247 acetilado en forma de un sólido incoloro (3,5 g).

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Ejemplo 4 Preparación de ISA_{TX}247

Se disolvió el acetil-ISA_{TX}247 (14,6 g, 11,6 mmol) en 340 ml de metanol y después se añadieron 135 ml de agua desionizada. Se añadió carbonato potásico (13,36 g, 96,66 mmol) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 24 a 48 horas hasta que se había completado la reacción. Se evaporó la mayor parte del metanol y después se añadieron 250 ml de acetato de etilo con agitación. Se añadió lentamente una solución de ácido cítrico acuoso al 10% (120 ml) y después se separó la fase de acetato de etilo. La fase acuosa se extrajo con una porción adicional de 200 ml de acetato de etilo. Los extractos de acetato de etilo combinados se lavaron secuencialmente con 150 ml de agua desionizada, 100 ml de solución acuosa de ácido cítrico al 10% y 150 ml de solución acuosa saturada de cloruro sódico, y después se secaron con MgSO_{4}. El acetato de etilo se evaporó para dar un sólido amarillo pálido. El producto se cromatografió en gel de sílice usando acetona al 40%/hexano al 60% como eluyente para dar el ISA_{TX}247 (10,51 g, 75%) en forma de un sólido incoloro. ISA_{TX}247 contiene 45-50% de isómero E y 50-55% de isómero Z.

Los productos de los ejemplos 1-4 se caracterizaron por espectrometría de masas y/o espectroscopía de resonancia magnética nuclear.

Ejemplo 5 Preparación de acetil-\eta-bromociclosporina A

Se disolvieron la acetil-ciclosporina A (41,48 g, 33,3 mol) preparada como en el ejemplo 1, N-bromosuccinimida (10,39 g, 58,4 mmol) y azo-bis-isobutironitrilo (1,09 g, 6,67 mmol) en 250 ml de tetracloruro de carbono y la mezcla resultante se calentó a reflujo durante 2,5 horas. La mezcla se enfrió y se evaporó el disolvente. El residuo se trató con 350 ml de éter dietílico y se filtró para separar el material insoluble. El filtrado se lavó secuencialmente con 150 ml de agua y 150 ml de salmuera, después se secó con sulfato magnésico y se evaporó el disolvente. El material bruto se cromatografió en gel de sílice con acetona/hexano (2:3) para dar 28,57 g (65%) de acetil-\gamma-bromociclosporina A en forma de un sólido amarillo.

Ejemplo 6 Preparación del bromuro de trifenilfosfonio de la acetil-ciclosporina A

Se disolvieron la acetil-\gamma-bromociclosporina A (28,55 g, 21,6 mmol) y trifenilfosfina (7,55 g, 28,8 mmol) en 210 ml de tolueno y la solución resultante se calentó a 100ºC durante 21 horas. La solución se enfrió y se evaporó el tolueno. El semisólido aceitoso se trató con 250 ml de hexano/éter (1:4), se mezcló bien, y se decantó el disolvente. Este procedimiento se repitió 3 veces más con 150 ml de éter. Después, el residuo se disolvió en 50 ml de acetato de etilo y se hizo precipitar con 220 ml de hexano. Después, el sólido resultante se recogió por filtración para dar 22,5 g (66%) del bromuro de trifenilfosfina de la acetil-ciclosporina A en forma de un sólido de color tostado.

Ejemplo 7 Reacción de Wittig

El bromuro de trifenilfosfina de la acetil-ciclosporina A (100 mg, 0,06 mmol), un exceso de formaldehído al 37% (0,25 ml) y tolueno (2 ml) se agitaron rápidamente a temperatura ambiente. Se añadió gota a gota hidróxido sódico acuoso como solución 1 N (2 ml) y se continuó agitando durante 3,5 horas. La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo (20 ml) y agua (10 ml). Se separó la fase de acetato de etilo, se lavó secuencialmente con agua (10 ml) y salmuera (10 ml), se secó con sulfato magnésico y se evaporó el disolvente. El material bruto se cromatografió en gel de sílice con acetona/hexano (2:3) para dar 70 mg (88%) de una mezcla de isómeros (E) y (Z) del acetil-ISA_{TX}247 en forma de un sólido incoloro.

Ejemplo 8 Desacetilación del producto de la reacción de Wittig

La mezcla de isómeros del ejemplo 7 (70 mg, 0,056 mmol) se disolvió en metanol (5 ml) y después se añadió agua (1 ml). Se añadió carbonato potásico (75 mg) y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 19 horas. Se evaporó la mayor parte del metanol y se añadieron 15 ml de acetato de etilo al residuo seguido de 10 ml de solución acuosa de ácido cítrico al 10%. Se separó la fase de acetato de etilo y la fase acuosa se extrajo con 10 ml adicionales de acetato de etilo. Los extractos de acetato de etilo combinados se lavaron secuencialmente con 10 ml de agua, 10 ml de solución acuosa de ácido cítrico al 10% y 10 ml de salmuera, antes de secar sobre sulfato magnésico y evaporar el disolvente. El material bruto se cromatografió en gel de sílice con acetona/hexano (2:3) para dar 37 mg (54%) de ISA_{TX}247 en forma de un sólido incoloro que contenía aproximadamente 85% del isómero E y aproximadamente 15% del isómero Z.

Los productos en los ejemplos 5-8 se caracterizaron por espectrometría de masas y/o espectrometría de resonancia magnética nuclear.

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Ejemplo 9 Preparación de los isómeros geométricos de ISA_{TX}247

Los isómeros cis y trans de ISA_{TX}247 se pueden sintetizar independientemente usando el siguiente esquema de reacciones. La secuencia implica la metalación conocida de aliltrimetilsilano, la captura electrófila por un trimetilborato, seguido de la hidrólisis y después transesterificación para generar el éster trans-(trimetilsilil)alilboronato intermedio. La boración alílica del aldehído de la ciclosporina proporcionó un producto de boro intermedio, que se convirtió en el \beta-trimetilsilil-alcohol intermedio, por secuestro. La diastereoselectividad en la creación de los nuevos centros quirales no está determinada en esta etapa debido a la eliminación de estos centros en una etapa posterior. Debe indicarse que la estereoquímica relativa de los dos centros en el \beta-trimetilsilil-alcohol es anti de acuerdo con lo que se esperaba y se debe al doble enlace trans en el precursor trans-(trimetilsilil)-boronato.

La eliminación promovida por base (Hudrlick y col., 1975) del \beta-trimetilsilil-alcohol proporcionó una composición enriquecida en el acetil-(Z)-1,3-dieno, mientras que la eliminación promovida por ácido dio una composición enriquecida en el acetil-(E)-1,3-dieno. La desprotección conduce a los respectivos dieno-alcoholes, los isómeros (Z) y (E) de ISA_{TX}247, respectivamente.

Un procedimiento alternativo a los dienos usa los alilfosforanos. La metalación de la alildifenilfosfina y después transmetalación con Ti(OPr^{i})_{4} da el producto intermedio de titanio. La titanación alílica seguida de eliminación estereoespecífica generaría una composición enriquecida en el dieno (Z).

Por otra parte, cuando el óxido de alildifenilfosfina se somete a una secuencia similar (fig. 8), se genera el isómero (E) predominantemente (75%).

i) Boración alílica del acetil-CsA-CHO

El (E)-1-trimetilsilil-1-propeno-3-boronato se preparó de acuerdo con procedimientos previamente descritos (Ikeda y col., 1987). A una solución agitada del (E)-1-trimetilsilil-1-propeno-3-boronato (0,2 g, 0,832 mmol) en THF (3 ml) en atmósfera de nitrógeno se añadió el aldehído de acetil-ciclosporina A (1,026 g, 0,832 mmol). La mezcla de reacción se siguió por cromatografía líquida de alto rendimiento (columna C-8, fase inversa) y se agitó durante un periodo total de 7 días. Después se añadió trietanolamina (0,196 g, 1,3 mmol) y se continuó agitando durante un periodo adicional de 4 días. El \beta-trimetilsilil-alcohol se obtuvo por purificación en una columna de gel de sílice EM(ES) m/z 1368,9 (M+Na^{+}).

A una suspensión de KH (3,5 mg, 26,4 \mumol, dispersión en aceite mineral al 30% lavada con hexanos anhidros) en THF anhidro (1 ml) se añadió el \beta-trimetilsilil-alcohol (10 mg, 7,4 \mumol) y se agitó a temperatura ambiente durante 10 min. La mezcla de reacción se diluyó con éter dietílico (10 ml) y después se lavó con solución saturada de NaHCO_{3} (2 x 5 ml). El secado (Na_{2}SO_{4}) y eliminación del disolvente proporcionaron el (Z)-acetil-1,3-dieno enriquecido. EM(ES) m/z 1294,8 (M+K^{+}).

ii) Titanación alílica del acetil-CsA-CHO

A una solución agitada y enfriada (-78ºC) de alildifenilfosfina (0,54 g, 2,4 mmol) en THF anhidro (8 ml) se añadió t-BuLi (1,42 ml, 2,4 mmol, solución 1,7 M en pentano). La solución de color rojo ladrillo se agitó durante 15 min a esta temperatura y después a 0ºC durante 30 min. Después se enfrió otra vez a -78ºC y se añadió Ti(OPr^{i})_{4} (0,71 ml, 2,4 mmol). La solución de color marrón se agitó a esta temperatura durante 15 min y después se añadió mediante una cánula una solución de acetil-CsA-CHO (2,5 g, 2 mmol) en THF (10 ml). La solución de color amarillo pálido se agitó durante un periodo adicional de 30 minutos y después se calentó a temperatura ambiente durante una noche. A la mezcla de reacción se añadió MeI (0,15 ml, 2,4 mmol) a 0ºC. Se continuó agitando durante 1 h a esta temperatura y después a temperatura ambiente durante 2 h. La mezcla de reacción se vertió en HCl al 1% enfriado con hielo (100 ml). La capa acuosa se extrajo con EtOAc (3 x 50 ml). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con agua (2 x 25 ml) y salmuera (25 ml). La separación del disolvente dio un sólido amarillo que se cromatografió en una columna de gel de sílice. La elución con mezcla de acetona-hexano 1:3 proporcionó el acetil-ISA_{TX}247 enriquecido en el isómero (Z). La desprotección como en el ejemplo 4 dio el ISA_{TX}247 enriquecido en el isómero (Z) (relación Z/E, 75:25).

Ejemplo 10 Preparación de una mezcla de isómeros de ISA_{TX}247 enriquecida en el isómero (E)

A una solución de óxido de alildifenilfosfina (1 mmol) y hexametilfosforamida (2 mmol) en tetrahidrofurano (5 ml) a -78ºC se añadió n-butil-litio (1 mmol, en hexanos). La mezcla se agitó a -78ºC durante 30 minutos. Se añadió una solución del aldehído de la acetil-ciclosporina A (0,8 mmol) en tetrahidrofurano (7 ml) y la mezcla de reacción se dejó calentar gradualmente a temperatura ambiente y después se agitó durante 18 horas. La mezcla se vertió en ácido clorhídrico 1 N enfriado con hielo (50 ml) y después se extrajo en acetato de etilo. El extracto orgánico se lavó con agua, se secó con sulfato magnésico y se evaporó el disolvente. El residuo se cromatografió sobre gel de sílice usando acetona al 25%/hexanos al 75% como eluyente para dar una mezcla de isómeros (E) y (Z) de acetil-ISA_{TX}247. La eliminación del grupo protector acetato como se ha descrito en el Ejemplo 4 dio una mezcla de isómeros de ISA_{TX}247 enriquecida en el (E). La espectroscopía de RMN de protón indicaba que la mezcla estaba compuesta de 75% del isómero (E) y 25% del (Z) de ISA_{TX}247. Esta reacción también se llevó a cabo de acuerdo con la modificación de Sclosser (R. Liu, M. Sclosser, Synlett, 1996, 1195). A una solución agitada y enfriada (-78ºC) de óxido de alildifenilfosfina (1,21 g, 5 mmol) en THF (20 ml) se añadió n-BuLi (2 ml, 5 mmol, solución 2,5 M en hexanos). La solución de color rojo se agitó durante 40 minutos a -78ºC. Después se añadió mediante una cánula una solución de acetil-CsA-CHO (1,25 g, 1,02 mmol) en THF (12 ml) durante 15 minutos. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. El tratamiento y la cromatografía como antes dieron el acetil-ISA_{TX}247 (relación Z:E 40:60, por análisis de RMN ^{1}H).

Ejemplo 11 Preparación de ciclosporina A protegida con benzoilo

Se disolvieron la ciclosporina A (6,01 g, 5 mmol) y 4-dimetilaminopiridina (305 mg, 2,5 mmol) en piridina (5 ml). Se añadió anhídrido benzoico (3,4 g, 15 mmol) y la mezcla se agitó durante 19 horas a 50ºC. Se añadieron anhídrido benzoico adicional (1,7 g, 7,5 mmol) y DMAP (305 mg, 2,5 mmol) y se continuó la agitación a 50ºC durante otras 24 horas. Se añadió anhídrido benzoico (0,85 g, 3,8 mmol) y la reacción se agitó durante 23 horas adicionales. Después la mezcla de reacción se vertió lentamente en agua con agitación. El benzoato de ciclosporina A precipitado se filtró y se lavó con agua. La torta de filtración recogida se disolvió en un volumen mínimo de metanol y se añadió a una solución de ácido cítrico al 10% y se agitó durante 1 hora. El producto precipitado se recogió por filtración y se lavó con agua hasta que el pH del filtrado alcanzó el del agua. El benzoato de ciclosporina A sólido se secó a 50ºC a vacío para dar un aceite incoloro.

Ejemplo 12 Preparación de la ciclosporina A protegida con éter de trietilsililo

Se disolvió ciclosporina A (3,606 g, 3 mmol) en piridina seca (8 ml) y después se añadió DMAP (122 mg, 1 mmol). La mezcla de reacción se enfrió a 0ºC y después se añadió gota a gota trifluorometanosulfonato de trietilsililo (3,6 mmol). La mezcla se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó durante una noche. La mezcla de reacción después se vertió lentamente en agua con agitación. El éter de trietilsililo precipitado se filtró y se lavó con agua. La torta de filtración recogida se disolvió en un volumen mínimo de metanol y se añadió a una solución de ácido cítrico al 5% y se agitó durante 30 minutos. El producto precipitado se recogió por filtración y se lavó con agua hasta que el pH del filtrado alcanzó el del agua. El éter de trietilsililo sólido se secó a 50ºC a vacío para dar un sólido incoloro. También se introdujeron los grupos protectores triisopropilsililo y terc-butildimetilsililo siguiendo un procedimiento análogo.

Ejemplo 13 Actividad inmunosupresora usando el ensayo de inhibición de la calcineurina

Un indicador de la eficacia de la ciclosporina A o un derivado de ciclosporina A es su capacidad para inhibir la actividad de fosfatasa de la calcineurina. El ensayo de inhibición de la calcineurina mide la actividad del fármaco en su sitio de acción, y por lo tanto es la evaluación in vitro más precisa y directa de la potencia de los análogos de ciclosporina A (Fruman y col., 1992).

Para ayudar a entender la presente invención, se ha evaluado la actividad inmunosupresora de ISA_{TX}247 (45-50% de isómero E y 50-55% de isómero Z, no está de acuerdo con la presente invención) frente a la ciclosporina A, usando el ensayo de inhibición de la calcineurina (CN). Los resultados de este ensayo muestran que la inhibición de la actividad de fosfatasa de la calcineurina por ISA_{TX}247 (45-50% de isómero Z y 50-55% de isómero E) era hasta 3 veces más potente (determinado por la CI_{50}) comparado con la ciclosporina A (Figura 11).

Se ha evaluado la actividad inmunosupresora de diferentes mezclas de isómeros de análogos deuterados y no deuterados frente a la ciclosporina A, usando el ensayo de inhibición de la calcineurina (CN). La estructura y composición de isómeros de estos análogos se presenta en la figura 12. En la figura 12, la designación "I4" corresponde a la estructura de ISA_{TX}247. I4-M2 indica ISA_{TX}247 producido por el procedimiento descrito en los Ejemplos 5-8 (denominado procedimiento 2 en esta figura). I4-D4 indica ISA_{TX}247 deuterado producido por el procedimiento descrito en los Ejemplos 1-4. I4-D2 indica ISA_{TX}247 deuterado producido por el procedimiento descrito en los Ejemplos 5-8. Otras mezclas de isómeros son como se muestran en la figura.

Los resultados de este ensayo muestran que la inhibición de la actividad de fosfatasa de la calcineurina por estas mezclas de isómeros de análogos era al menos tan potente (determinado por CI_{50}) como la ciclosporina A (figura 13). CsA indica ciclosporina A; Isociclo4 indica ISA_{TX}247 producido por el procedimiento descrito en los Ejemplos 1-4. Isociclo 5 corresponde a I5-M1 de la figura 12. Isociclo4-d4 corresponde a I4-D4 de la figura 12. Isociclo5-d5 corresponde a I5-D5 de la Figura 12. Isociclo4-d2 corresponde a I4-D2 de la Figura 12. Isociclo4-M2 corresponde a I4-M2 de la Figura 12. Isociclo5-m2 corresponde a I5-M5 de la Figure 12.

Ejemplo 14 Actividad inmunosupresora usando el modelo de transplante de corazón en ratas

Para ayudar a entender la presente invención, se ha evaluado la eficacia de ISA_{TX}247 (45-50% de isómero E y 50-55% de isómero Z, no está de acuerdo con la presente invención) en la prevención del rechazo de corazones transplantados entre diferentes cepas de ratas y se ha comparado con la de la ciclosporina A. El modelo de transplante de corazón de rata ha sido el usado con más frecuencia para evaluar la potencia in vivo de nuevos fármacos inmunosupresores, puesto que es difícil lograr la supervivencia prolongada del injerto en este modelo debido al rechazo inmunitario.

El procedimiento implicaba el transplante heterotópico (en la aorta abdominal y vena cava inferior) del corazón de ratas Wistar Furth a ratas Lewis. Se administraron inyecciones intraperitoneales de la ciclosporina A o una mezcla de isómeros del análogo al receptor del transplante, empezando 3 días antes del transplante y continuando durante 30 días después del transplante. Si se observaba disfunción del injerto durante los 30 días después del periodo de transplante, se sacrificaba el animal. Si el animal sobrevivía más de 30 días después del transplante, el ensayo y los artículos de control se interrumpían y se dejaba al animal continuar hasta la disfunción del injerto o hasta 100 días después del transplante.

Las tasas de supervivencia media para cada grupo de animales receptores se resumen en la tabla 1. Estos resultados muestran que ISA_{TX}247 (45-50% de isómero E y 50-55% de isómero Z) con una dosis óptima de 1,75 mg/kg/día aumentaba el tiempo de supervivencia aproximadamente 3 veces frente a la ciclosporina A. Una serie de animales que recibieron ISA_{TX}247 todavía tenían injertos que funcionaban a los 100 días después del transplante (70 días después de interrupción de la dosificación). Estos datos demuestran la actividad inmunosupresora de esta mezcla de isómeros del análogo en la prevención del rechazo.

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TABLA 1 Efecto de ISA_{TX}247 y ciclosporina A dados por administración intraperitoneal, en los tiempos medios de supervivencia de corazones de rata transplantados [media de dos estudios separados, n = 13]

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También se evaluó la eficacia de diferentes mezclas de isómeros de análogos deuterados y no deuterados (estructuras dadas en la Figura 12) en la prevención del rechazo de corazones transplantados entre diferentes cepas de ratas y se comparó con la de la ciclosporina A. Las dosis eran de 1,75 mg/kg/día durante 30 días. Los resultados se resumen en la Tabla 2. Estos resultados muestras que las mezclas de isómeros con 1,75 mg/kg/día aumentaban el tiempo de supervivencia al menos tanto como la ciclosporina A y demuestran la actividad inmunosupresora de estas mezclas de isómeros de análogos en la prevención del rechazo de injerto.

TABLA 2 Efecto de diferentes mezclas de isómeros de análogos y de ciclosporina A dadas por administración intraperitoneal con 1,75 mg/kg/día, en los tiempos de supervivencia medios de corazones de rata transplantados

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Ejemplo 15 Actividad inmunosupresora en el alotransplante de células del islote

Para ayudar a entender la presente invención, se ha evaluado la capacidad de ISA_{TX}247 (45-50% de isómero E y 50-55% de isómero Z, no está de acuerdo con la presente invención) frente a la ciclosporina A, para prolongar la supervivencia de células del islote transplantada en un modelo de ratón, en un estudio que implicaba el transplante de 500 islotes de un ratón CBA/J a la cápsula renal de receptores ratón Balb/c diabéticos.

Después del transplante, se administraron ISA_{TX}247 o ciclosporina A por inyección intraperitoneal (i.p.) con un nivel de dosis de 0 (vehículo), 1,75, 10, 20 ó 25 mg/kg/día durante un total de 30 días. Se controló diariamente la glucosa en la sangre hasta el momento del fallo del injerto, definido como un nivel de glucosa mayor que 17 mmol/l en dos días consecutivos.

Los resultados indican que ISA_{TX}247 aumentaba el periodo de supervivencia del injerto en 40% con una dosis de 20 mg/kg/día (Tabla 3). También se observó que ISA_{TX}247 era menos tóxico que la ciclosporina A con el nivel de dosis mayor. Esto era especialmente evidente con el nivel de dosis de 25 mg/kg/día.

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TABLA 3 La supervivencia de aloinjertos de islotes de ratón en receptores ratones diabéticos con ISA_{TX}247 o ciclosporina A por inyección intraperitoneal con un nivel de dosis de 1,75, 10, 20 ó 25 mg/kg/día

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Ejemplo 16 Actividad de inmunosupresión en la artritis

A lo largo de las últimas tres décadas se han examinado ampliamente tres modelos animales de la artritis reumatoide humana y se han usado mucho en los cribados preclínicos y en el desarrollo de nuevos agentes antirreumáticos. Estos incluyen los modelos de artritis inducida por adyuvante, inducida por colágeno e inducida por antígeno. Para ayudar a entender la presente invención, se diseñaron los siguientes estudios para evaluar la eficacia antiinflamatoria de ISA_{TX}247 (45-50% de isómero E y 50-55% de isómero Z, no de acuerdo con la presente invención) tanto en el modelo de artritis inducida por colágeno en el ratón como en el modelo de artritis inducida por antígeno en el conejo. La histopatología e inmunopatología observadas en estos dos modelos se parecen a los de la enfermedad humana. En ambos modelos se examinó la eficacia de ISA_{TX}247 para evitar el inicio de la artritis (protocolo de prevención) y para tratar la artritis (protocolo de tratamiento). Estos estudios apoyan la acción inmunosupresora de esta mezcla de isómeros del análogo.

A. Artritis inducida por colágeno

Ratones macho DBA/1 LacJ, mantenidos en condiciones sin anticuerpos de virus, se inmunizaron por vía subcutánea a las 8 a 10 semanas de edad con 100 microgramos de colágeno de tipo II de pollo, emulsionado en adyuvante complejo de Freund. Se administraron diariamente ISA_{TX}247, ciclosporina A o vehículo (Chremophor EL/etanol 72:28, volumen/volumen) por inyección intraperitoneal (i.p.) de diluciones de 1 a 5 veces el fármaco madre (0,25, 0,5 ó 1 mg/ml) en solución salina para dar concentraciones de 0 (vehículo); 125, 250 o 500 \mug/ratón para ISA_{tx}247; y 250 ó 500 \mug/ratón para la ciclosporina A. A los animales asignados al protocolo de prevención (12/grupo) se les administraron dosis empezando el día de la inmunización con colágeno (día 0) hasta el sacrificio el día 40. A los animales asignados al protocolo de tratamiento (12/grupo) se les administraron dosis empezando el día del inicio de la enfermedad (\sim día 28) hasta el sacrificio el día 38.

Los parámetros evaluados incluían mortalidad, creatinina en el suero, histología y evaluaciones de consecuencias, tales como puntuación clínica (visual), hinchamiento de la pata trasera, puntuación histológica, puntuación de erosión e inmunohistoquímica.

La puntuación de erosión se hizo de una forma ciega examinando en las secciones sagitales de la articulación interfalángica proximal (PIP) del dedo medio la presencia o ausencia de erosiones (definidas como defectos delimitados en el cartílago o hueso llenos de tejido inflamatorio). Este procedimiento permite comparaciones de la misma articulación. Los estudios previos han demostrado erosiones en >90% de los animales artríticos no tratados en esta articulación.

Los resultados indican que las puntuaciones de erosión negativa en el grupo de tratamiento con dosis alta de ISA_{TX}247 (500 \mug/ratón) eran significativamente más altas que las puntuaciones de erosión negativa en el grupo de tratamiento con vehículo (p<0,05). Tanto el grupo de tratamiento con dosis media de ISA_{TX}247 (250 \mug/ratón) como el de dosis alta de ciclosporina A (500 \mug/ratón) tenían puntuaciones de erosión negativa más altas comparado con el grupo de tratamiento con vehículo (p<0,1). Además, los grupos de tratamiento con dosis baja de ISA_{TX}247 (125 \mug/ratón) y de control con dosis media de ciclosporina A (250 \mug/ratón) tienen puntuaciones de erosión negativa más altas, aunque estadísticamente no significativas, cuando se comparan con el grupo de control con vehículo.

El único tratamiento que prevenía significativamente el desarrollo de erosiones en la articulación era el de ISA_{TX}247 con 500 \mug/ratón. Esta reducción significativa en la proporción de las articulaciones PIP que muestran cambios en la erosión en los ratones tratados con ISA_{TX}247 con respecto a los ratones del grupo de control con vehículo, demuestra que ISA_{TX}247 tiene propiedades modificadoras de la enfermedad.

B. Artritis inducida por antígeno

Se inmunizaron conejos blancos de Nueva Zelanda, mantenidos en condiciones sin patógenos específicos) con 10 mg de ovoalbúmina en solución salina emulsionada con adyuvante completo de Freund que se administró por vía intramuscular o subcutánea en varios sitios en la nuca. Catorce días después, todos los animales empezaron recibiendo 2 inyecciones intraarticulares diarias de 5 mg de ovoalbúmina y 65 ng de factor de crecimiento transformante recombinante humano 2 en solución salina.

Se administraron diariamente ISA_{TX}247, ciclosporina A o vehículo (Chremophor EL/etanol 72:28, volumen/volu-
men) por inyección subcutánea de diluciones de 1 a 4 veces del fármaco madre (en vehículo) en solución salina para dar concentraciones de 0(vehículo); 2,5, 5,0 ó 10 mg/kg/día para ISA_{tx}247; y 5,0, 10 ó 15 mg/kg/día para la ciclosporina A. A los animales asignados al protocolo de prevención (8/grupo) se les administraron dosis empezando el día de la inmunización con ovoalbúmina (día 0) hasta el sacrificio el día 42. A los animales asignados al protocolo de tratamiento (8/grupo) se les administraron dosis empezando el día del inicio de la enfermedad (\sim día 28) hasta el sacrificio el día 42.

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Los parámetros evaluados incluían mortalidad, peso corporal, creatinina en el suero, histología y evaluaciones de consecuencias tales como hinchamiento de la articulación de la rodilla, recuentos del líquido sinovial, autopsia general e histología.

Se observó una disminución significativa de las puntuaciones histopatológicas sinoviales en los animales de ISA_{TX}247 (P 0,05) y ciclosporina A (P 0,05) después de 28 días de terapia (protocolo de prevención) comparado con los animales de control con vehículo. Esto estaba acompañado de reducciones significativas en los recuentos del líquido sinovial (ISA_{TX}247, P 0,05; ciclosporina A, P 0,05). También era evidente la mejora significativa de las puntuaciones histopatológicas sinoviales de los animales con artritis establecida, después de 14 días de tratamiento con ISA_{TX}247 (P 0,05) y ciclosporina A (P 0,05) comparado con los controles con vehículo (protocolo de tratamiento). Era evidente una reducción significativa de la puntuación de artritis macroscópica en ISA_{TX}247 (P=0,01), pero no en los animales tratados con ciclosporina A. El tratamiento fue tolerado bien sin toxicidad significativa tras los análisis de creatinina en el suero o histología postmortem.

Los datos muestran que ISA_{TX}247 es equivalente o potencialmente más potente que la ciclosporina A en el tratamiento y la prevención de la artritis reumatoide en un modelo de artritis inducida por antígeno en el conejo.

Ejemplo 17 Propiedades farmacocinéticas y toxicocinéticas

Para ayudar a entender la presente invención, se ensayaron los parámetros farmacocinéticos y toxicocinéticos de ISA_{TX}247 (45-50% de isómero E y 50-55% de isómero Z, no está de acuerdo con la presente invención) y de ciclosporina A en un modelo de conejo. El conejo también se ha usado como un modelo para estudiar la nefrotoxicidad de la ciclosporina A, pero con mucha menos frecuencia que en la rata. Los estudios han encontrado que la ciclosporina A administrada al conejo produce cambios estructurales y funcionales con una dosis no solo menor que la descrita previamente en otros modelos animales, si no también con al menos el nivel superior del índice terapéutico en seres humanos (Thliveris y col., 1991, 1994). Además, el descubrimiento de fibrosis intersticial y arteriolopatía, además de los cambios citológicos en los túbulos, sugiere que el conejo es un modelo más adecuado para estudiar la nefrotoxicidad, puesto que estas entidades estructurales son marcas de nefrotoxicidad observada en seres humanos. Se administró ISA_{TX}247 por vía intravenosa (i.v.) durante los primeros 7 días y por vía subcutánea (s.c.) durante 23 días adicionales de acuerdo con el siguiente plan.

TABLA 4 Plan de administración de la dosis para la investigación de las propiedades farmacocinéticas y toxicocinéticas de ISA_{TX}247 en el conejo

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Se usaron conejos sin patógenos (SPF) para asegurar que cualquier cambio renal observado se debía al efecto de ISA_{TX}247 y no se debía a patógenos. Los días 1 y 7 se recogieron muestras de sangre antes de la administración de fármaco y a las 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 18 y 24 horas después de la dosis, para generar un perfil farmacocinético. Otros parámetros evaluados incluían observaciones clínicas, peso corporal, consumo de alimento, hematología, química clínica, patología general, y examen histopatológico de tejidos/órganos seleccionados.

Se analizaron muestras de sangre por cromatografía líquida de alto rendimiento acoplada con espectrometría de masas (CL-EM). La siguiente tabla 5 resume los parámetros farmacocinéticos medios en conejos que recibían 10 mg/kg de ciclosporina A o ISA_{TX}247.

TABLA 5 Parámetros farmacocinéticos de ciclosporina A y ISA_{TX}247 administrados por vía intravenosa en conejos macho que recibían 10 mg/kg/día. Resultados expresados como media \pm ET

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No había diferencias estadísticamente significativas entre los parámetros farmacocinéticos de la ciclosporina A y ISA_{TX}247 en conejos macho que recibían 10 mg/kg/día. Los parámetros farmacocinéticos de ISA_{TX}247 en conejos hembra que recibían la misma dosis, no eran significativamente diferentes de los observados en los conejos macho, con excepción de la concentración máxima el día 7.

No se observaron cambios significativos en los parámetros hematológicos de conejos que recibían un control de vehículo, ciclosporina A o ISA_{TX}247. Se observó una diferencia en los niveles de creatinina en los diferentes grupos a lo largo del estudio, como se muestra en la siguiente tabla 6. Estas diferencias indicaban que la ciclosporina A tenía un efecto negativo significativamente mayor en los riñones que el control con vehículo o ISA_{TX}247. Hay que indicar que incluso con una dosis 50% mayor, 15 mg/kg/día, comparado con la ciclosporina A 10 mg/kg/día, ISA_{TX}247 no dio como resultado ningún aumento significativo en los niveles de creatinina en el suero.

TABLA 6 Porcentaje de cambio en los niveles de creatinina en el suero frente a los valores iniciales en conejos macho que recibían vehículo, ciclosporina A o ISA_{TX}247 durante 30 días

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El examen de los órganos en todos los conejos que recibían el control con vehículo, ciclosporina A 10 mg/kg, ISA_{TX}247 5 mg/kg o ISA_{TX}247 10 mg/kg, no puso de manifiesto anomalías significativas. Esto era especialmente cierto para los riñones, en los que no se observaron pruebas de fibrosis intersticial, observada normalmente en los animales tratados con ciclosporina A (Thliveris y col., 1991, 1994). En los conejos macho que recibían ISA_{TX}247 15 mg/kg, se observó una disminución de la espermatogénesis. No se observaron cambios en los 3 conejos hembra que completaron el estudio con una dosis de ISA_{TX}247 15 mg/kg.

Ejemplo 18 Efectos inmunosupresores de ISA_{TX}247

Se incubó sangre entera de monos cynomologus (n=4) con ISA_{TX}247 o ciclosporina y se estimuló con diferentes mitógenos en medio de cultivo. Se evaluó la proliferación de linfocitos por incorporación de timidina marcada con tritio y por análisis por citometría de flujo de la expresión del antígeno nuclear de células proliferativas (PCNA) en células en fase SG_{2}M. También se usó la citometría de flujo para evaluar la producción de citoquinas intracelulares por células T y la expresión de antígenos de activación de linfocitos T. La CE_{50} (concentración de fármaco necesaria para alcanzar 50% del efecto máximo) se calculó posteriormente usando el software WinNonlin^{TM}. Los resultados mostraban que la proliferación de linfocitos, producción de citoquinas y la expresión de antígenos de superficie de células T eran más fuertemente inhibidos por ISA_{TX}247 que por la ciclosporina, como se muestra por la CE_{50} (expresada en ng/ml) presentada en la siguiente Tabla 7.

TABLA 7

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Por lo tanto, los autores de la invención han encontrado que usando un ensayo de sangre entera ex vivo, ISA_{TX}247 suprime diversas funciones inmunitarias de forma 2,3-6 veces más potente que la ciclosporina.

Ejemplo 19 Reacción de Wittig usando bromuro de tributilalilfosfonio

Se disolvió terc-butóxido potásico (0,31 g, 2,8 mmol) en 20 ml de tetrahidrofurano. A aproximadamente -40ºC se añadió lentamente bromuro de tributilalilfosfonio (0,99 g, 3,1 mmol) disuelto en 3 ml de tetrahidrofurano. La mezcla amarilla resultante se agitó durante aproximadamente 10 minutos a aproximadamente -40ºC antes de añadir muy lentamente una solución de aldehído de la acetil-ciclosporina A (1,5 g, 1,2 mmol) en 6 ml de tetrahidrofurano. Después de agitar la mezcla de reacción amarillo-naranja durante 1,5 horas, la reacción se había completado. Para la inactivación, la mezcla de reacción se transfirió a solución acuosa de ácido fosfórico (1,2 g, 1,0 mmol). La solución acuosa resultante se extrajo con 100 ml de tolueno seguido de 50 ml de tolueno. Las capas orgánicas combinadas se lavaron con agua y se concentraron a presión reducida a sequedad. El producto, ISA_{TX}247 acetilado, se obtuvo en forma de un sólido ligeramente amarillo con aproximadamente 90% de rendimiento. La relación de isómeros era aproximadamente 87% de isómero E y aproximadamente 13% de isómero Z (determinado por espectroscopía de RMN ^{1}H).

Ejemplo 20 Reacción de Wittig usando bromuro de tributilalilfosfonio y una base de litio

Se disolvió bromuro de tributilalilfosfonio (1,38 g, 4,3 mmol) en una mezcla de 20 ml de tolueno y 3 ml de tetrahidrofurano. A aproximadamente -78ºC se añadió lentamente butil-litio (1,6 M en hexano, 2,43 ml, 3,9 mmol). La mezcla amarilla resultante se agitó durante aproximadamente 10 minutos a aproximadamente -78ºC antes de añadir lentamente una solución del aldehído de la acetil-ciclosporina A (1,5 g, 1,2 mmol) en 6 ml de tolueno. Después de agitar la mezcla de reacción amarillo-naranja durante 3,5 horas, la reacción se inactivó por transferencia de la mezcla de reacción a una mezcla de 50 ml de tolueno y ácido fosfórico acuoso (0,25 g, 2,2 mmol). La mezcla bifásica resultante se dejó calentar a temperatura ambiente antes de separar las dos capas. La capa de tolueno se lavó con 20 ml de agua y se concentró a presión reducida. El producto, ISA_{TX}247 acetilado, se obtuvo en forma de un sólido ligeramente amarillo con aproximadamente 80% de rendimiento. La relación de isómeros era aproximadamente 70% de isómero E y aproximadamente 30% de isómero Z (determinado por espectroscopía de RMN ^{1}H).

Ejemplo 21 Reacción de Wittig usando bromuro de tributilalilfosfonio y una base de litio

Se trabajó con SAP018 como se ha descrito antes pero sólo a aproximadamente -40ºC. Se repitieron las condiciones experimentales del ejemplo 20, esta vez usando una temperatura de reacción de aproximadamente -40ºC. En estas condiciones la relación de isómeros del producto aislado, ISA_{TX}247 acetilado, era aproximadamente 74% en peso del isómero E y aproximadamente 26% en peso del isómero Z, determinado por espectroscopía de RMN ^{1}H.

Ejemplo 22 Reacción de Wittig usando bromuro de tributilalilfosfonio

Una solución de aldehído de la acetil-ciclosporina A (1,5 g, 1,2 mmol) y bromuro de tributilalilfosfonio (0,99 g, 3,1 mmol) en 15 ml de tetrahidrofurano se enfrió a aproximadamente -80ºC. Se añadió lentamente terc-butóxido potásico (0,19 g, 1,7 mmol) disuelto en 9 ml de tetrahidrofurano. La mezcla amarilla resultante se agitó durante una hora a aproximadamente -80ºC para completar la reacción antes de añadir lentamente una solución de 6 ml de tetrahidrofurano. Después de agitar la mezcla de reacción amarillo-naranja durante 1,5 horas, la reacción se había completado. Para inactivar la mezcla de reacción se añadió una solución acuosa de ácido fosfórico (0,15 g, 1,3 mmol). La mezcla resultante se concentró y el residuo se disolvió en 5 ml de metanol. Después, la mezcla se añadió lentamente a 5 ml de agua. El precipitado resultante se filtró, se lavó con 4 ml de metanol/agua (1/1), y se secó a vacío. El producto, ISA_{TX}247 acetilado, se obtuvo en forma de un sólido incoloro con aproximadamente 90% de rendimiento. La relación de isómeros era aproximadamente 91% en peso de isómero E y 9% en peso de isómero Z (determinado por espectroscopía de RMN ^{1}H).

Ejemplo 23 Ozonolisis de la acetil-CsA

Una solución de acetil-ciclosporina A (15 g, 12,1 mmol) en 200 ml de metanol se ozonizó a -78ºC usando un generador de ozono Sander a aproximadamente 1,1 bar con un flujo de corriente de 300 litros de O_{2}/h hasta que la reacción se había completado (aproximadamente 5 minutos). La solución se trató con argón gaseoso y se inactivó con sulfuro de dimetilo disuelto en metanol. Para completar la reacción la mezcla se agitó durante una noche a temperatura ambiente. Después de concentrar hasta aproximadamente 50 ml, la solución se añadió lentamente a 500 ml de agua. El precipitado resultante se filtró, se lavó con 60 ml de agua y se secó a vacío. El producto, el aldehído de CsA acetilado, se obtuvo en forma de un sólido incoloro con aproximadamente 95% de rendimiento y una pureza de aproximadamente 98% (determinado por HPLC).

Ejemplo 24 Preparación de ciclosporina A protegida con trimetilsililo

La ciclosporina A (40 g, 1 equivalente) se disolvió en diclorometano (100 ml) a 30ºC. Se añadió N,N-bis(trimetilsilil)urea (1,1 equivalentes). Después de 5 minutos agitando a 30ºC, se añadió ácido p-toluenosulfónico (0,02 equivalentes). La mezcla de reacción se calentó a reflujo hasta completarse la reacción, medido por cromatografía de capa fina (TLC), cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) o espectrometría de masas (EM), y después se enfrió a temperatura ambiente. Se añadió solución acuosa semisaturada de bicarbonato sódico (100 ml). Se separó la fase acuosa y se volvió a extraer con diclorometano. Las fases orgánicas combinadas se secaron con Na_{2}SO_{4} anhidro y se filtraron. El disolvente se separó a presión reducida dando la ciclosporina A protegida con trimetilsililo bruta.

Ejemplo 25 Preparación del aldehído de la ciclosporina A protegida con trimetilsililo

La ciclosporina A protegida con trimetilsililo (5 g, 1 equivalentes) se disolvió en diclorometano (50 ml). Después, la solución se enfrió a una temperatura de aproximadamente -78ºC, después de lo cual se burbujeó ozono a través de la solución hasta que apareció un color azul. Después, se burbujeó argón a través de la solución hasta que se obtuvo una solución incolora, con el fin de eliminar el exceso de ozono que se vuelve incoloro; esta etapa se llevó a cabo para eliminar el exceso de ozono. Se añadió trietilamina (5 equivalentes) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 17 horas. El aldehído de la ciclosporina A protegida con trimetilsililo se obtuvo después de tratamiento acuoso.

Ejemplo 26 Preparación de una mezcla 3:1 de isómeros del doble enlace E y Z del dieno de la ciclosporina A protegida con trimetilsililo por reacciones de Wittig

A una mezcla de terc-butóxido potásico (3 equivalentes) y bromuro de aliltrifenilfosfonio (2 equivalentes) en tolueno (10 ml) previamente agitada durante 60 minutos, se añadió el aldehído de la ciclosporina A protegida con trimetilsililo (1 g, 1 equivalente). El tratamiento de la mezcla de reacción después de 1 hora de reacción a temperatura ambiente, proporcionó una mezcla 3:1 (por RMN) de los isómeros del doble enlace E y Z del dieno de la ciclosporina A protegida con trimetilsililo.

Ejemplo 27 Preparación de una mezcla 1:1 de isómeros del doble enlace E y Z del dieno de la ciclosporina A protegida con trimetilsililo por reacciones de Wittig

El aldehído de la ciclosporina A protegida con trimetilsililo (2,5 g) se disolvió en 25 ml de tolueno y se trató con solución acuosa de hidróxido sódico 1 N (10 equivalentes). La mezcla de reacción se agitó vigorosamente y se añadió bromuro de aliltrifenilfosfonio (7,5 equivalentes, en porciones). El tratamiento de la mezcla de reacción después de varias horas de reacción a temperatura ambiente proporcionó una mezcla aproximadamente 1:1 (por RMN) de los isómeros del doble enlace E y Z del dieno de la ciclosporina A protegida con trimetilsililo.

Ejemplo 28 Preparación de una mezcla de isómeros 1:2 del doble enlace E y Z del dieno de la ciclosporina A protegida con trimetilsililo por reacciones de Wittig

El aldehído de la ciclosporina A protegida con trimetilsililo (1 g) se disolvió en 5 ml de tolueno junto con carbonato potásico (1,5 equivalentes) y bromuro de aliltrifenilfosfonio (1,5 equivalentes). El tratamiento de la mezcla de reacción después de 4 horas de reacción a reflujo con agitación vigorosa proporcionó una mezcla aproximadamente 1:2 (por RMN) de los isómeros del doble enlace E y Z del dieno de la ciclosporina A protegida con trimetilsililo.

Ejemplo 29 Preparación de una mezcla de isómeros 1:3 del doble enlace E y Z del dieno de la ciclosporina A protegida con trimetilsililo por reacciones de Wittig

Se disolvió bromuro de aliltributilfosfonio (3 equivalentes, preparado a partir de bromuro de alilo y tributilfosfina) en THF (3,5 ml). Se añadió tolueno (7,5 ml) seguido de terc-butóxido potásico (4 equivalentes). Después de 1 hora a temperatura ambiente, la solución se enfrió a aproximadamente -30ºC. Se añadió gota a gota una solución del aldehído de la ciclosporina A protegida con trimetilsililo (1 g, 1 equivalente) en tolueno (5 ml). Después de 45 minutos a aproximadamente -30ºC, se hizo el tratamiento de la mezcla de reacción, proporcionando una mezcla aproximadamente 1:3 (por RMN) de los isómeros del doble enlace E y Z del dieno de la ciclosporina A protegida con trimetilsililo.

Los dos ejemplos siguientes, Ejemplos 30 y 31, están dirigidos a las metalaciones alílicas.

Ejemplo 30 Preparación del \beta-trimetilsilil-alcohol de la ciclosporina A protegida con acetilo

A una solución de aliltrimetilsilano (10,1 equivalentes) en THF (15 ml) se añadió butil-litio (1,6 M en hexanos, 10 equivalentes) a temperatura ambiente. Después de 30 minutos de reacción, la solución se enfrió a -75ºC, y se trató con dietil-B-metoxiborano (10,1 equivalentes). Después de 1 hora, se añadió complejo de trifluoruro de boro-éter dietílico (10,1 equivalentes) para generar el reactivo B-(\gamma-trimetilsilil-alil)dietilborano. Después de 1 hora, se añadió gota a gota una solución del aldehído de la ciclosporina A protegida con acetilo (5 g, 1 equivalente) en THF (15 ml). Después de 20 minutos, la mezcla de reacción se calentó a -10ºC y se añadió una solución acuosa saturada de NH_{4}Cl. Después de agitar una hora a temperatura ambiente, se añadió agua (45 ml) y la mezcla de reacción se extrajo 3 veces con 25 ml de acetato de etilo. Las fases orgánicas se lavaron secuencialmente con agua (25 ml) y una solución acuosa saturada de NH_{4}Cl (25 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron con Na_{2}SO_{4}, se filtraron, y se concentraron a presión reducida. El producto bruto se cromatografió (gel de sílice, diclorometano/metanol o acetato de etilo/heptano) para dar el \beta-trimetilsilil-alcohol de la ciclosporina A protegida con acetilo.

Ejemplo 31 Preparación del \beta-trimetilsilil-alcohol de la ciclosporina A protegida con trimetisililo

A una solución de aliltrimetilsilano (10,1 equivalentes) en THF (15 ml) se añadió butil-litio (1,6 M en hexanos, 10 equivalentes) a temperatura ambiente. Después de dejar que la reacción procediera durante aproximadamente 30 minutos, la solución se enfrió a -65ºC, y se trató con dietil-B-metoxiborano (10,1 equivalentes). Después de 1 hora, se añadió complejo de trifluoruro de boro-éter dietílico (10,1 equivalentes) para generar el reactivo B-(\gamma-trimetilsilil-alil)dietilborano. Después de 1 hora, se añadió gota a gota una solución del aldehído de la ciclosporina A protegida con trimetisililo (5 g, 1 equivalente) en THF (15 ml). Después de 15 minutos, la mezcla de reacción se calentó a 10ºC y se añadió una solución acuosa saturada de NH_{4}Cl. Después de agitar durante una hora a temperatura ambiente, se añadió agua (12,5 ml) y solución saturada de NaHCO_{3} (25 ml). La mezcla de reacción se extrajo 2 veces con 25 ml de metil-t-butil-éter. Las fases orgánicas se lavaron dos veces secuencialmente con agua (2 x 25 ml) y una solución acuosa saturada de NaCl (25 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron con Na_{2}SO_{4}, se filtraron, y se concentraron a presión reducida. El producto bruto se cromatografió (gel de sílice, heptano/acetato de etilo) para dar el \beta-trimetilsilil-alcohol de la ciclosporina A protegida con trimetilsililo.

Los tres ejemplos siguientes, Ejemplos 32, 33 y 34 están dirigidos a reacciones de eliminación de Peterson.

Ejemplo 32 Preparación del dieno E de la ciclosporina A protegida con acetilo

El \beta-trimetilsilil-alcohol de la ciclosporina A protegida con acetilo (100 mg, 1 equivalente) se disolvió en THF (1 ml). Se añadió H_{2}SO_{4} concentrado (10 \mul) y la mezcla de reacción se agitó toda la noche a temperatura ambiente. Se añadió agua (10 ml) y la mezcla de reacción se extrajo con diclorometano (10 ml). La fase acuosa se extrajo con diclorometano (10 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron con Na_{2}SO_{4}, se filtraron y se concentraron a presión reducida para dar el dieno de ciclosporina A protegido con acetilo (ISA_{TX}247 protegido con acetilo). El producto bruto se hizo cristalizar en metil-t-butil-éter/THF y después se recristalizó en metil-t-butil-éter/DCM para dar el dieno de la ciclosporina A protegido con acetilo (ISA_{TX}247 protegido con acetilo) en forma de una mezcla 99-97%:1-3% de los isómeros de doble enlace E y Z (por RMN a 400 MHz, 2% de error de medición).

La hidrólisis del dieno E de la ciclosporina A protegida con acetilo se llevó a cabo de la siguiente forma: El dieno de la acetil-ciclosporina A (4 g, 1 equivalente) se disolvió en metanol (80 ml) y agua (32 ml). Se añadió carbonato potásico (3,65 g, 8,3 equivalentes). Después de agitar durante 15 horas a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se calentó hasta 40ºC durante 4 horas. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida y el residuo se recogió en acetato de etilo (70 ml). Se añadió lentamente solución acuosa de ácido cítrico al 15% (30 ml) seguido de agua (10 ml). La capa acuosa se separó y se volvió a extraer con acetato de etilo (56 ml). Las fases orgánicas se lavaron con agua (30 ml), solución de ácido cítrico al 15% (40 ml) y solución saturada de NaCl (30 ml). Las capas orgánicas se combinaron, se secaron con Na_{2}SO_{4} y se concentraron a presión reducida para dar el dieno de la ciclosporina A (ISA_{TX}247).

Ejemplo 33 Preparación del dieno Z de la ciclosporina A protegida con trimetisililo y su conversión en el dieno Z de la ciclosporina A (ISA_{TX}247)

El \beta-trimetilsilil-alcohol de la ciclosporina A protegida con trimetilsililo (2 g, 1 equivalente) se disolvió en THF (20 ml). La solución se enfrió a 0-2ºC y se añadió t-butóxido potásico (4 equivalentes). Después de 1,5 horas de reacción, se añadieron acetato de etilo (20 ml) y agua (40 ml). La capa acuosa se separó y se volvió a extraer con acetato de etilo (20 ml). Las fases orgánicas se lavaron con solución acuosa saturada de NaCl (20 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron con Na_{2}SO_{4}, se filtraron y se concentraron a presión reducida para dar una mezcla del dieno Z de la ciclosporina A protegida con trimetisililo (ISA_{TX}247 protegido con trimetilsililo) y el dieno Z de la ciclosporina A (el isómero Z de ISA_{TX}247). La desililación se completó disolviendo la mezcla de producto bruto en metanol (10% en peso en la solución) y añadiendo una solución acuosa de ácido clorhídrico 1 M (1 equivalente). Después de 15 minutos a temperatura ambiente, se añadieron agua y acetato de etilo. La capa acuosa se separó y se volvió a extraer con acetato de etilo. Las fases orgánicas se lavaron con una solución acuosa saturada de NaCl. Las fases orgánicas combinadas se secaron con Na_{2}SO_{4}, se filtraron y se concentraron a presión reducida, proporcionando el dieno de la ciclosporina A (ISA_{TX}247) como una mezcla 94:6 de isómeros E y Z del doble enlace (por RMN).

Ejemplo 34 Preparación del dieno E de la ciclosporina A (ISA_{TX}247)

El \beta-trimetilsilil-alcohol de la ciclosporina A protegida con trimetilsililo (500 mg, 1 equivalente) se disolvió en diclorometano. Esta solución se enfrió en un intervalo de aproximadamente 0-2ºC y se trató con complejo de trifluoruro de boro-éter dietílico (5 equivalentes). Después de 1 hora, se añadieron agua (20 ml) y diclorometano (20 ml). La capa orgánica se separó y se lavó con agua (20 ml), se secó con Na_{2}SO_{4}, se filtró y se concentró a presión reducida para proporcionar directamente el dieno de la ciclosporina A (ISA_{TX}247) en forma de una mezcla 91:9 en peso de los isómeros E y Z del doble enlace (por RMN).

Ejemplo 35 Desprotección del dieno de la ciclosporina A protegida con trimetilsililo

El dieno de la ciclosporina A protegida con trimetilsililo se disolvió en metanol (al 10% en peso en la solución). Esta solución se trató con solución acuosa de ácido clorhídrico 1 M (1 equivalente). Después de 15 minutos a temperatura ambiente, se añadieron agua y acetato de etilo. La capa acuosa se separó y se volvió a extraer con acetato de etilo. Las fases orgánicas se lavaron con una solución acuosa saturada de NaCl. Las fases orgánicas combinadas se secaron con Na_{2}SO_{4}, se filtraron y se concentraron a presión reducida, proporcionando el dieno de la ciclosporina A (ISA_{TX}247).

Ejemplo 36 Epoxidación de la acetil-ciclosporina A

La acetil-ciclosporina A (2,0 g, 1,61 mmol) se disolvió en acetonitrilo (30 ml). Se añadió 1,3-diacetoxi-acetona (0,14 g, 0,8 mmol), seguido de solución acuosa de la sal disódica del ácido etilendiaminotetraacético 0,0004 M (20 ml) y bicarbonato sódico (0,405 g, 4,82 mmol). A la mezcla agitada se añadió oxona (KHSO_{5} al 43,8%) (2,23 g, 6,43 mmol) en porciones a lo largo de 2 horas. El pH se mantuvo a 8,2 por adición constante de NaOH 1 N (cantidad total 6,4 ml) usando un medidor de pH. La temperatura se mantuvo a 22-25ºC por enfriamiento ocasional usando un baño de agua fría. Después de 2,5 horas, la mezcla de reacción se inactivó con unas gotas de una solución de bisulfito sódico. Se añadió agua (100 ml) y la mezcla se extrajo dos veces con terc-butil-metil-éter (100 ml, después 75 ml). Los extractos orgánicos se lavaron con solución acuosa diluida de cloruro sódico (100 ml), se combinaron, se secaron con Na_{2}SO_{4}, y se concentraron para proporcionar el epóxido de la acetil-ciclosporina A bruto (1,92 g, 95%; HPLC: 99,4% de área) en forma de una espuma sólida blanca.

Ejemplo 37 Preparación del aldehído de la acetil-ciclosporina A

El epóxido de la acetil-ciclosporina A bruto (1,92 g, 1,52 mmol) se disolvió en acetonitrilo (25 ml). Se añadió agua (20 ml), seguido de peryodato sódico (489 mg, 2,28 mmol) y ácido sulfúrico 0,5 M (3,05 ml, 1,52 mmol). La mezcla de reacción se agitó a 40ºC durante 18 horas, después se inactivó el exceso de peryodato sódico por adición de solución acuosa de bisulfito sódico. Se añadió solución acuosa diluida de cloruro sódico (100 ml) y la mezcla se extrajo dos veces con terc-butil-metil-éter (100 ml cada vez). Los extractos orgánicos se lavaron con solución acuosa diluida de cloruro sódico (100 ml), se combinaron, se secaron con Na_{2}SO_{4}, y se concentraron para proporcionar el aldehído de la acetil-ciclosporina A bruto (1,74 g, 92%: HPLC: 95,7% de área) en forma de una espuma blanca. El producto bruto se cromatografió en gel de sílice usando acetona al 40%/hexano al 60% como eluyente para dar el producto (1,41 g, 71% basado en la acetil-ciclosporina A; HPLC: 100% de área) en forma de una espuma blanca.

Ejemplo 38 Preparación del aldehído de la acetil-ciclosporina A usando un procedimiento realizado en un solo matraz

La acetil-ciclosporina A (2,0 g, 1,61 mmol) se disolvió en acetonitrilo (30 ml). Se añadió 1,3-diacetoxi-acetona (0,084 g, 0,48 mmol), seguido de solución acuosa de la sal disódica del ácido etilendiaminotetraacético 0,0004 M (20 ml) y bicarbonato sódico (0,405 g, 4,82 mmol). A la mezcla agitada se añadió oxona (KHSO_{5} al 43,8%) (1,67 g, 4,82 mmol) en porciones a lo largo de 2 horas. El pH se mantuvo a 8,2 por adición constante de NaOH 1 N (cantidad total 3,4 ml) usando un medidor de pH. La temperatura se mantuvo a 20-25ºC. Después de 3,5 horas, se añadió ácido sulfúrico 0,5 M (5 ml, 2,5 mmol) a la mezcla de reacción, seguido de unas gotas de ácido sulfúrico concentrado, hasta alcanzar pH 1,3. Después, se añadió peryodato sódico (516 mg, 2,41 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas y a 40ºC durante 22 horas. Se añadió agua (100 ml) y la mezcla se extrajo dos veces con terc-butil-metil-éter (100 ml, después 75 ml). Los extractos orgánicos se lavaron con solución acuosa diluida de cloruro sódico (100 ml), se combinaron, se secaron con Na_{2}SO_{4}, y se concentraron para proporcionar el aldehído de la acetil-ciclosporina A bruto (1,9 g, 96%; HPLC: 83,4% de área) en forma de una espuma blanca. El producto bruto se cromatografió en gel de sílice usando acetona al 40%/hexano al 60% como eluyente para dar el producto (1,35 g, 68% basado en la acetil-ciclosporina A; HPLC: 100% de área) en forma de una espuma blanca.

Ejemplo 39 (ISO): Reacción de Wittig del aldehído de la acetil-ciclosporina A con 3-dimetilaminopropil-trifenilfosforilideno

El aldehído de la ciclosporina A acetilado 1 se hizo reaccionar con la sal libre del iluro 2 que se generó por la reacción del bromuro de 3-dimetilaminopropil-trifenilfosfonio con hexametildisilazida potásica (Corey, E.J. y Desai, M.C. Tetrahedron Letters, 1985, 26, 5747). La N-oxidación selectiva del compuesto cis 3 se logró usando ácido m-cloroperbenzoico a 0ºC. La eliminación de Cope del N-óxido a temperatura elevada a vacío proporcionó el isómero Z acetilado. La desprotección como se ha descrito antes, proporcionó el isómero Z de ISA_{TX}247. El espectro de RMN de ^{1}H (500 MHz) de este compuesto confirmó la geometría Z al presentar un doblete de tripletes a \delta 6,58 con valores de J de 16,99 y 10,5 Hz, característicos del isómero Z en una mezcla Z/E de ISA_{TX}247. La pureza isomérica es \geq99% puesto que el doblete de un triplete característico del isómero E en la mezcla a \delta 6,28 (J=17,5, 10,0 Hz) no era detectable.

A una suspensión agitada del bromuro de 3-dimetilaminopropiltrifosfonio (2,5 g, 5,83 mmol) en tolueno anhidro (20 ml) se añadió hexametildisilazida potásica (11,6 ml, 5,8 mmol, solución 0,5 M en tolueno) mediante una jeringuilla. Después de agitar durante 1 h a temperatura ambiente, la solución de color rojo se centrifugó y el líquido sobrenadante se transfirió a un matraz de reacción mediante cánula. Al sólido se añadió tolueno anhidro (10 ml), se agitó y centrifugó. El líquido sobrenadante se transfirió al matraz de reacción y al iluro de color rojo combinado se añadió OAc-CsA-CHO (1,44 g, 1,17 mmol). La agitación se continuó durante un periodo adicional de 2 h a temperatura ambiente y después el color se volvió amarillo claro. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc (50 ml) y se lavó posteriormente con solución saturada de NaHCO_{3} (50 ml) y salmuera (50 ml). El secado y eliminación del disolvente proporcionaron un sólido amarillo pálido. La cromatografía en una columna de gel de sílice y elución con mezcla de acetona-hexanos (gradiente: 10 a 75% de acetona y 90 a 25% de hexanos) eliminó todas las impurezas relacionadas con el fósforo. La posterior elución con acetona proporcionó el producto deseado en forma de un sólido incoloro (1,28 g, 84% de rendimiento). RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}): 2,23 (s, 6H), 2,03 (s, 3H). RMN ^{13}C (300 MHz, CDCl_{3}): 129,33, 126,95; EM m/z: 1301 (M^{+}), 1324 (M+Na^{+}).

Conversión a N-óxido

A una solución agitada y enfriada (0ºC) del compuesto de dimetilamino obtenido en la reacción de Wittig (0,44 g, 0,34 mmol) en CHCl_{3} (3 ml) se añadió una solución de m-CPBA (0,07 g, 0,405 mmol) en CHCl_{3} (2 ml). Después de agitar durante 30 min, se añadió sulfuro de dimetilo (0,5 ml) seguido de CH_{2}Cl_{2} (50 ml). El tratamiento por lavado con solución de NaHCO_{3} (25 ml) y agua (25 ml), secado y separación del disolvente proporcionaron un sólido (0,43 g). RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}): 3,19 (s, 3H), 3,18 (s, 3H), 2,03 (s, 3H). RMN ^{13}C (300 MHz, CDCl_{3}): 131,89, 124,13; EM m/z: 1340 (M+Na^{+}).

Eliminación de Cope del N-óxido. Preparación del isómero (Z) del acetil-ISA_{TX}247

El N-óxido (350 mg) se agitó solo y se calentó a 100ºC a vacío durante 2 h. Después, este se pasó por una columna de gel de sílice. La elución con mezcla de acetona-hexanos (gradiente, 5 a 25% de acetona y 95 a 75% de hexanos) proporcionó un sólido incoloro (314 mg). RMN ^{1}H (500 MHz, CDCl_{3}): 6,49 (dt, J=16,99, 10,5 Hz, 1H); RMN ^{13}C (400 MHz, CDCl_{3}): 132,20, 131,09, 129,70, 116,85; EM m/z: 1279 (M+Na^{+}).

Isómero (Z) de ISA_{TX}247

A una solución del (Z)-acetil-ISA_{TX}247 (50 mg) en MeOH (4 ml) se añadió agua (1,5 ml) y K_{2}CO_{3} (60 mg) y se agitó durante 48 h a temperatura ambiente. Los disolventes se separaron por destilación de la mezcla de reacción y se extrajo con EtOAc (20 ml). La capa orgánica se lavó con agua (10 ml) y salmuera (10 ml). El secado y separación del disolvente proporcionaron un sólido incoloro. RMN ^{1}H (500 MHz, CDCl_{3}): 6,58 (dt, J=16,99, 10,5 Hz, 1H); EM m/z: 1236,8 (M+Na^{+}). El compuesto resultante era el isómero Z del ISA_{TX}247. Por RMN no se observó isómero E que se pudiera medir.

Claims (53)

1. Una composición que comprende una mezcla isomérica de un análogo de ciclosporina modificado en el resto aminoácido 1 con un sustituyente 1,3-dieno, en la que la mezcla isomérica comprende de 75% a 95% en peso del isómero E y de 25% a 5% en peso del isómero Z, de modo que la suma del porcentaje en peso del isómero (E) y el isómero (Z) es 100 por cien en peso, en la que los isómeros son los isómeros E y Z especificados a continuación:

10

2. La composición de la reivindicación 1, en la que la mezcla isomérica comprende de 75% a 85% del isómero E y de 15% a 25% del isómero Z.

3. La composición de la reivindicación 1, en la que la mezcla isomérica comprende de 85% a 90% del isómero E y de 10% a 15% del isómero Z

4. La composición de la reivindicación 1, en la que la mezcla isomérica comprende de 90% a 95% del isómero E y de 10% a 5% del isómero Z.

5. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, como una composición terapéutica.

6. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, como una composición farmacéutica que comprende una mezcla isomérica del análogo de ciclosporina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

7. La composición farmacéutica de la reivindicación 6, que comprende una solución líquida que contiene un tensioactivo, etanol, un disolvente lipófilo y/o uno anfifílico.

8. La composición farmacéutica de la reivindicación 7, que comprende succinato de d-alfa-tocoferil polietilenglicol 1000 (vitamina E TPGS), aceite de triglicérido de cadena media (MCT), Tween 40 y etanol.

9. La composición farmacéutica de la reivindicación 6, que comprende una cápsula de gelatina que contiene la mezcla isomérica de análogo, una solución líquida que contiene un tensioactivo, etanol, un disolvente lipófilo y/o anfifílico.

10. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 9, que está en forma de dosificación unitaria.

11. La composición farmacéutica de la reivindicación 10, que contiene de 5 mg a 500 mg del principio activo.

12. La composición farmacéutica de la reivindicación 9, que contiene 50 mg de mezcla isomérica.

13. La composición farmacéutica de la reivindicación 7 u 8, en la que la solución contiene 50 mg/ml de mezcla de isomérica.

14. La composición farmacéutica de la reivindicación 6, que está adaptada para la administración oral.

15. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14, en la que la mezcla isomérica del análogo de ciclosporina está presente en una cantidad que es terapéuticamente eficaz para producir inmunosupresión cuando se administra a un animal.

16. La composición farmacéutica de la reivindicación 15, en la que dicho animal es un humano.

17. La composición farmacéutica de la reivindicación 15, en la que la cantidad de la mezcla isomérica del análogo de ciclosporina que se va a administrar es de 0,05 mg a 50 mg por kilogramo de peso corporal y día.

18. La composición farmacéutica de la reivindicación 17, en la que la cantidad de la mezcla isomérica del análogo de ciclosporina que se va a administrar es de 0,1 mg a 10 mg por kilogramo de peso corporal y día.

19. La composición farmacéutica de la reivindicación 18, en la que la cantidad de la mezcla isomérica del análogo de ciclosporina que se va a administrar es de 0,5 mg a 10 mg/kg/día.

20. La composición farmacéutica de la reivindicación 19, en la que la cantidad de una mezcla isomérica del análogo de ciclosporina que se va a administrar es de 2 a 6 mg/kg/día y en la que la composición farmacéutica se formula para ser administrada por oralmente dos veces al día.

21. La composición farmacéutica de la reivindicación 20, en la que la cantidad de una mezcla isomérica del análogo de ciclosporina que se va a administrar es de 0,5 a 3 mg/kg/día y en la que la composición farmacéutica se formula para ser administrada oralmente dos veces al día.

22. La composición farmacéutica de las reivindicaciones 15 a 21, en la que dicha inmunosupresión es para tratar o aliviar el rechazo agudo de transplante de órgano o tejido.

23. La composición farmacéutica de la reivindicación 22, en la que dicho rechazo de transplante se selecciona del grupo que consiste en rechazo de transplante de corazón, pulmón, corazón-pulmón combinado, hígado, riñón, pancreático, piel, intestino y córnea.

24. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 15 a 21, en la que dicha inmunosupresión es para tratar o aliviar el rechazo mediado por células T.

25. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 15 a 21, en la que dicha inmunosupresión es para tratar o aliviar la enfermedad de injerto contra huésped.

26. La composición farmacéutica de la reivindicación 25, en la que dicha enfermedad sigue a un transplante de médula ósea.

27. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 15 a 21, en la que dicha inmunosupresión es para tratar o aliviar el rechazo crónico de un órgano transplantado.

28. La composición farmacéutica de la reivindicación 27, en la que dicho rechazo crónico es la enfermedad del vaso injertado.

29. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 15 a 21, en la que dicha inmunosupresión es para tratar o aliviar el rechazo de xenoinjerto.

30. La composición farmacéutica de la reivindicación 29, en la que dicho rechazo de xenoinjerto se selecciona del grupo que consiste en rechazo agudo, hiperagudo y crónico de un órgano que ocurre cuando el donante de órgano es de una especie diferente al receptor.

31. La composición farmacéutica de la reivindicación 30, en la que dicho rechazo de xenoinjerto es rechazo mediado por células B o rechazo mediado por anticuerpos.

32. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 15 a 21, en la que dicha inmunosupresión es para tratar o aliviar una enfermedad o afección autoinmune o una enfermedad o afección inflamatoria.

33. La composición farmacéutica de la reivindicación 32, en la que dicha enfermedad o afección se selecciona del grupo que consiste en artritis, artritis reumatoide, artritis crónica progrediente, artritis deformante y otras enfermedades reumáticas.

34. La composición farmacéutica de la reivindicación 33, en la que dicha enfermedad o afección se selecciona del grupo que consiste en trastornos hematológicos, anemia hemolítica, anemia aplásica, anemia pura de glóbulos rojos, trombocitopenia idiopática, lupus eritematoso sistémico, policondritis, escleroderma, granulomatosis de Wegner, dermatomiositis, hepatitis activa crónica, miastenia grave, psoriasis, síndrome de Steven-Johnson, esprúe idiopático, enfermedad inflamatoria del intestino (autoinmune), colitis ulcerativa, enfermedad de Crohn, oftalmopatía endocrina, enfermedad de Graves, sarcoidosis, esclerosis múltiple, cirrosis biliar primaria, diabetes juvenil (diabetes mellitus de tipo I), uveítis (anterior y posterior), queratoconjuntivitis seca, queratoconjuntivitis vernal, fibrosis pulmonar intersticial, artritis psoriática, glomerulonefritis, síndrome nefrótico idiopático, nefropatía por cambio mínimo y dermatomiositis juvenil.

35. La composición farmacéutica de la reivindicación 33, en la que dicha enfermedad o afección se selecciona del grupo que consiste en psoriasis, dermatitis de contacto, dermatitis atópica, alopecia aerata, eritema multiforme, dermatitis herpetiforme, escleroderma, vitíligo, angeítis por hipersensibilidad, urticaria, pénfigo bulloso, lupus eritematoso, pénfigo, epidermolisis bullosa adquirida, otras afecciones inflamatorias o alérgicas de la piel, afecciones inflamatorias de los pulmones y vías aéreas, asma, alergias y pneumoconiosis.

36. Uso en la fabricación de un medicamento para inmunosupresión de una mezcla isomérica de un análogo de ciclosporina modificado en el resto aminoácido 1 con un sustituyente 1,3-dieno, en el que la mezcla de isómeros comprende de 75% a 95% en peso de isómero E y de 25% a 5% en peso de isómero Z, de modo que la suma del porcentaje en peso del isómero (E) y el isómero (Z) es 100 por cien en peso, en el que los isómeros son los isómeros E y Z especificados a continuación:

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37. Uso de acuerdo con la reivindicación 36, en el que la mezcla isomérica comprende de 75% a 85% del isómero E y de 15% a 25% del isómero Z.

38. Uso de acuerdo con la reivindicación 36, en el que la mezcla isomérica comprende de 85% a 90% del isómero E y de 10% a 15% del isómero Z.

39. Uso de acuerdo con la reivindicación 36, en el que la mezcla isomérica comprende de 90% a 95% del isómero E y de 10% a 5% del isómero Z.

40. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 36 a 39, en el que la inmunosupresión es para tratar o aliviar el rechazo agudo del transplante de órgano o tejido.

41. Uso de acuerdo con la reivindicación 40, en el que dicho rechazo del transplante se selecciona del grupo que consiste en rechazo de transplante de corazón, pulmón, corazón-pulmón combinado, hígado, riñón, pancreático, piel, intestino y córnea.

42. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 36 a 39, en el que dicha inmunosupresión es para tratar o aliviar el rechazo mediado por células T.

43. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 36 a 39, en el que dicha inmunosupresión es para tratar o aliviar la enfermedad de injerto contra huésped.

44. Uso de acuerdo con la reivindicación 43, en el que dicha enfermedad de injerto contra huésped sigue a un transplante de médula ósea.

45. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 36 a 39, en el que dicha inmunosupresión es para tratar o aliviar el rechazo crónico de un órgano transplantado.

46. Uso de acuerdo con la reivindicación 45, en el que dicho rechazo crónico es la enfermedad del vaso injertado.

47. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 36 a 39, en el que dicha inmunosupresión es para tratar o aliviar el rechazo de xenoinjerto.

48. Uso de acuerdo con la reivindicación 47, en el que el rechazo de xenoinjerto se selecciona del grupo que consiste en rechazo agudo, hiperagudo y crónico de un órgano que ocurre cuando el donante de órgano es de una especie diferente al receptor.

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49. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 36 a 39, en el que dicho rechazo de xenoinjerto es rechazo mediado por células B o rechazo mediado por anticuerpos.

50. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 36 a 39, en el que la inmunosupresión es para tratar o aliviar una enfermedad o afección autoinmune o una enfermedad o afección inflamatoria.

51. Uso de acuerdo con la reivindicación 50, en el que dicha enfermedad o afección se selecciona del grupo que consiste en artritis, artritis reumatoide, artritis crónica progrediente, artritis deformante y otras enfermedades reumáticas.

52. Uso de acuerdo con la reivindicación 50, en el que dicha enfermedad o afección se selecciona del grupo que consiste en trastornos hematológicos, anemia hemolítica, anemia aplásica, anemia pura de glóbulos rojos, trombocitopenia idiopática, lupus eritematoso sistémico, policondritis, escleroderma, granulomatosis de Wegner, dermatomiositis, hepatitis activa crónica, miastenia grave, psoriasis, síndrome de Steven-Johnson, esprúe idiopático, enfermedad inflamatoria del intestino (autoinmune), colitis ulcerativa, enfermedad de Crohn, oftalmopatía endocrina, enfermedad de Graves, sarcoidosis, esclerosis múltiple, cirrosis biliar primaria, diabetes juvenil (diabetes mellitus de tipo I), uveítis (anterior y posterior), queratoconjuntivitis seca, queratoconjuntivitis vernal, fibrosis pulmonar intersticial, artritis psoriática, glomerulonefritis, síndrome nefrótico idiopático, nefropatía por cambio mínimo y dermatomiositis juvenil.

53. Uso de acuerdo con la reivindicación 50, en el que dicha enfermedad o afección se selecciona del grupo que consiste en psoriasis, dermatitis de contacto, dermatitis atópica, alopecia aerata, eritema multiforme, dermatitis herpetiforme, escleroderma, vitíligo, angeítis por hipersensibilidad, urticaria, pénfigo bulloso, lupus eritematoso, pénfigo, epidermolisis bullosa adquirida, otras afecciones inflamatorias o alérgicas de la piel, afecciones inflamatorias de los pulmones y vías aéreas, asma, alergias y pneumoconiosis.