ES2310941T3 - Utilizaciones y composiciones para la quimioterapia selectiva destinada al cancer. - Google Patents

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Abstract

Utilización en la preparación de una composición de quimioterapia para el cáncer de una composición que comprende: (a) ascorbato mineral soluble en plasma; y (b) uno o más metabolitos de la vitamina C seleccionados de entre el grupo constituido por: (i) ácidos aldónicos, y las aldono-lactonas, aldono-láctidos y sus sales metálicas no tóxicas, y (ii) ácido deshidroascórbico, triosa, eritrosa, 4-hidroxi-5-metil-3(2H)-furanona, ácido 3-hidroxikójico y 5-hidroximaltol.

Description

Utilizaciones y composiciones para la quimioterapia selectiva destinada al cáncer.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a procedimientos quimioterapéuticos citotóxicos para el tumor.
En otro aspecto la invención se refiere a unas composiciones quimioterapéuticas citotóxicas para el tumor.
Más particularmente, la invención se refiere a unos procedimientos quimioterapéuticos citotóxicos para el tumor y unas composiciones para el tratamiento de cánceres en humanos.
Antecedentes de la invención
Los agentes quimioterapéuticos citotóxicos para tumores inducen preferentemente la muerte (apoptosis) de las células malignas. Debido a las similitudes entres las células normales y las malignas, ambas nacen del mismo huésped, una dosis quimioterapéutica que induce la apoptosis de las células tumorales puede también ser tóxica para las células normales. Para provocar una remisión, el agente citotóxico para el tumor puede a menudo potenciar los efectos secundarios aceptables. Idealmente, el agente citotóxico para tumores puede ser "selectivo", es decir, debe existir una gran brecha entre las dosis más bajas requeridas para inducir la muerte de las células tumorales, para obtener la eficacia como agente terapéutico citotóxico para el tumor, y la dosis más elevada que es tóxica para las células normales del paciente.
Los efectos secundarios adversos de la quimioterapia pueden incluir la pérdida de cabello, náusea y vómitos, toxicidad cardíaca y cánceres secundarios. Una de las manifestaciones tóxicas más comunes de los efectos adversos de muchos agentes citotóxicos es la supresión de médula espinal, que puede conducir a la supresión inmunológica y las disfunciones hematopoyéticas. Debido a que las complicaciones por infección son una de las causas principales de muerte en los pacientes con cáncer, resultaría muy deseable proporcionar unas composiciones quimioterapéuticas citotóxicas para tumores no tóxicas y unos procedimientos sin efectos secundarios inmunosupresores.
Los compuestos que presentan una actividad vitamina C, por ejemplo, el ácido ascórbico y los derivados del ascorbato, no son inmunosupresores pero son unos agentes quimioterapéuticos citotóxicos intravenosos eficaces frente a una gran variedad de cánceres. Riordan et al., Medical Hypotheses, 1995, 44, 207-213. Sin embargo, no existe un mecanismo de almacenamiento de la vitamina C en los tejidos humanos y se metaboliza toda y/o se secreta. Además, debido a las complicaciones gastrointestinales, resulta difícil establecer y mantener unos niveles séricos elevados de vitamina C por administración oral de ácido ascórbico. De este modo, generalmente se considera necesario administrar el ácido ascórbico por vía intravenosa para establecer y mantener unos niveles plasmáticos suficientemente elevados para conseguir la citotoxicidad. Por consiguiente, resultaría extremadamente ventajoso proporcionar unas composiciones quimioterapéuticas que contienen unas formas de vitamina C diferentes del ácido ascórbico que se pueden administrar oralmente a unas dosis suficientemente elevadas para establecer y mantener un nivel citotóxico para el tumor de vitamina C sérica.
Sin embargo, dado que incluso la vitamina C puede ser tóxica para las células humanas normales si la concentración en plasma es suficientemente elevada, también resultaría altamente deseable proporcionar unas composiciones quimioterapéuticas de vitamina C selectivas del tumor en unas formas de dosificación orales o intravenosas, que consigan la apoptosis de las células tumorales a unas concentraciones plasmáticas más bajas de las requeridas para que el ácido ascórbico induzca la apoptosis de las células tumorales. Debido a que la concentración de vitamina C citotóxica para el tumor administrada a partir de dichas formas de dosificación puede ser inferior, resultaría más factible establecer y mantener una concentración plasmática quimioterapéuticamente eficaz a un nivel que sería inferior al nivel plasmático de apoptosis de la vitamina C para las células normales.
Técnica anterior
Tal como reseña Cameron et al., (Cancer Res., 39: 663-81 (1979)) algunos ensayos clínicos mostraron unos aumentos significativos en los tiempos de supervivencia de pacientes con cáncer que reciben vitamina C.
Elvin et al. (Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 17(7):759-65 (1981)) describió que los aductos de ácido ascórbico con aldehídos como metilgloxal y acetilacroleína inhiben el crecimiento de ascitis de Ehrlich en carcinomas en los ratones.
El documento EP-A-0086544 propone utilizaciones de cetales y acetales del ácido ascórbico como agentes que inhiben la angiogénesis. (La angiogénesis se refiere al procedimiento de desarrollo de nuevos vasos sanguíneos, la proliferación de nuevos vasos sanguíneos está involucrada en el crecimiento tumoral).
El documento EP-A-0148094 y la patente US nº 5.032.610 propone que el ácido 5,6-O-benciliden-L-ascórbico y sus sales y sus mezclas con el ácido L-ascórbico y sus sales administrados oralmente o intravenosamente muestran unas propiedades anticancerosas.
La administración concomitante de 3-amino-1,2,4-triazol potencia la citotoxicidad del ácido ascórbico en los ascitis de Ehrlich de las células tumorales y la adición de vitamina K3 (bisulfito sódico de menadiona) parece que incrementa la citotoxicidad preferencial por el tumor del ácido ascórbico. Benande et al., Oncology, 23: 33-43 (1969).
Asimismo, investigadores anteriores han demostrado que las concentraciones catalíticas de Cu^{2+} incrementan la toxicidad preferente del ácido ascórbico frente a varias líneas celulares malignas de melanoma, que incluye cuatro líneas derivadas de humanos. Bram et., Nature 284: 629-631 (1980).
Se ha descrito que varias células progenitoras leucémicas, pre-leucémicas y de mieloma derivadas de pacientes humanos son sensibles a unas concentraciones de ácido ascórbico que se pueden alcanzar in vivo, sin ninguna toxicidad para las células hematopoyéticas normales. Park et al, Cancer Res., 4: 1062-65 (1980), Am. J. Clin. Nutr. 54:1241S-46S (1991).
El documento WO 99 39580 describe unas composiciones de vitamina C que comprenden por lo menos un ascorbato mineral disuelto en por lo menos un solvente poliol orgánico líquido farmacéuticamente aceptable.
Descripción de las figuras
La Fig. 1 es una gráfica de barras que ilustra la apoptosis de varios tipos de células tumorales mediante la composición "ascorbato mineral más metabolito" empleada en la realización de la invención preferida, como se ilustra mediante el Ensayo 1.
La Fig. 2 es una gráfica de barras similar que ilustra la selectividad de la apoptosis de varios tipos de células tumorales frente a las células normales mediante la composición "ascorbato mineral más metabolito" empleada en la realización de la invención, como se ilustra mediante el Ensayo 1.
Breve descripción de la invención
La presente invención se refiere a la utilización de una composición como se define en la reivindicación 1 en la preparación de una composición destinada a la quimioterapia del cáncer.
Formas de realización preferidas de la invención
Los componentes de la composición quimioterapéutica descrita anteriormente se mezclan simplemente en las proporciones adecuadas. Las proporciones exactas no son altamente críticas. Las proporciones operativas y óptimas se pueden determinar y variar dentro de unos límites que se pueden determinar sin experimentación excesiva para los expertos en la materia, por ejemplo, utilizando ensayos in vitro como los descritos a continuación. Alternativamente, según la forma de realización preferida actualmente de la invención, las composiciones de ascorbato mineral-metabolito adecuadas, que contienen estos componentes en las proporciones adecuadas, están disponibles comercialmente bajo las marcas comerciales registras ESTER-C® de Inter-Cal Corporation, Prescott, Arizona, USA. Dichas composiciones se describen con más detalle en las patentes US nº 4.822.816; nº 4.968.716 y nº 5.070.085.
La concentración de vitamina C plasmática citotoxicamente eficaz proporcionada por los procedimientos quimioterapéuticos y las composiciones de la invención variará según el tipo específico de células tumorales y se puede determinar mediante unos ensayos in vitro como los descritos a continuación, los ensayos con animales y los ensayos en humanos in vivo, según los procedimientos conocidos en la técnica.
Las composiciones quimioterapéuticas de la invención se formulan para la administración intravenosa por inclusión de los componentes de ascorbato mineral y metabolito de la vitamina C en un vehículo intravenoso farmacéuticamente aceptable, es decir, una solución estéril, no tóxica de los componentes en un vehículo, formulado para proporcionar una osmolaridad adecuada, pH, etc.. según los procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la solución Lactato de Ringer es un vehículo intravenoso adecuado.
La concentración de vitamina C en el vehículo intravenoso puede variar dentro de unos límites amplios para ajustarse a los requerimientos del tratamiento. Por ejemplo, cuando resulta deseable establecer una concentración plasmática equivalente de ácido ascórbico en el intervalo de 150-200 mg/dl en una dosificación adecuada durante un periodo de 8 horas. Una infusión de 1.000 cc proporciona 100-150 mg de ascorbato a partir de la sal mineral. Puede ser necesario repetir dichas infusiones varias veces hasta alcanzar y mantener la concentración plasmática deseada, dependiendo de la capacidad del sistema del paciente para la destrucción, eliminación o excreción del as-
corbato.
También puede ser posible utilizar unas formas de dosificación orales que contienen unas composiciones de ascorbato mineral/metabolito de la vitamina C para establecer una concentración plasmática inicial de dichas composiciones que son eficaces para inducir la apoptosis en algunas formas de tumores. Según la presente información, en las dosificaciones orales en el intervalo de aproximadamente 12-15 gramos de ascorbato por día, se puede alcanzar un nivel plasmático (equivalente de AA) de aproximadamente 5 mg/dl, que es suficiente para inducir la apoptosis selectiva de las células de melanoma y de hepatoma.
Además, una vez se ha obtenido una concentración plasmática que induce la apoptosis selectiva del tumor mediante una administración intravenosa, esta concentración se puede mantener mediante la administración de unas formas de dosificación orales o mediante la combinación de una administración oral e intravenosa.
Ejemplos
Varias líneas celulares tumorales y las correspondientes líneas celulares no malignas normales se han ensayado para la apoptosis por Ester-C® (Ascorbato cálcico más metabolito) frente a otras cuatro composiciones de prueba, ascorbato cálcico (CA) sólo, treonato cálcico (CT) sólo y ascorbato cálcico más treonato cálcico (CA + CT) y agua estéril (sH_{2}O).
Ejemplo 1 Procedimientos de prueba
Las líneas celulares son:
Malme-3M
Melanoma, humano (ATCC nº HTB-64)
Malme-3
Fibroblastos de piel humanos normales(ATCC nº HTB-102)
SK-Hep-1
Adenocarcinoma hepático, humano (ATCC nº HTB-52)
WRL
células hepáticas humanas normales (ATCC nº CL-98)
SK-N-MC
Neuroblastoma, humano (ATCC nº HTB-10)
T-84
Carcinoma colon, humano (ATCC nº CCL-248).
\vskip1.000000\baselineskip
Las células se hacen crecer en los medios de cultivo siguientes:
1
Todos los cultivos se mantuvieron a 37ºC en una atmósfera humidificada al 5% de CO_{2}/95% aire. Los medios y reactivos de cultivo se adquirieron en Life Techonologies (Gibco/BRL, Long Island, NY). El FBS se adquirió en Hyclone Labs (logan, UT).
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Los materiales para los ensayos se adquirieron en Inter-Cal Corporation (Prescott, AZ), como sigue:
Ensayo 1: Ester-C® Ascorbato mineral (ver a continuación)
Ensayo 2: Ascorbato cálcico (USP grade), 82,15% equivalentes de ácido ascórbico (AA)
Ensayo 3: Treanoato cálcico, 87,08% equivalentes de ácido L-treónico (AT)
Ensayo 4: Ascorbato cálcico (USP) + Calcio U.S.P, 81,21% AA, 1% equivalente TA
Ensayo 5: Ácido ascórbico
El material del Ensayo 1 contiene lo siguiente mediante análisis de laboratorio.
2
El ácido ascórbico (cultivo tisular) se obtiene de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Las composiciones de control constan de un medio de cultivo, solución Ringer y agua estéril, según sea adecuado.
Todas las soluciones de trabajo se preparan a partir de un stock patrón inmediatamente antes de utilizarlas. Una solución stock patrón a 60 mM de AA se prepara a partir de un medio de cultivo sin suero y se almacena a una temperatura de -15ºC. Las soluciones de trabajo se preparan a partir de unas soluciones stock a una concentración 10X mediante dilución en el medio de cultivo. Un stock a 30 mM (1 mg/%) de treonato cálcico se prepara en solución Ringer (Fay y Verlangieri, Life Sciences, 49: 1377 (1991)) o en agua estéril tibia. Las soluciones de trabajo se preparan como stock a una concentración 1X (en solución Ringer) o como stock 10X (en sH_{2}O), dependiendo de la naturaleza del tratamiento, es decir, corto plazo frente a continuo (ver a continuación).
Para la evolución del material del ensayo 1, se prepara una solución patrón stock al 1-1,3% del material de prueba en agua estéril tibia. Las soluciones stock de trabajo (concentración 10X) se preparan en agua estéril inmediatamente antes de su utilización. Para la evaluación comparativa, las soluciones stock de las soluciones de los ensayos 2 y ensayo 4 se preparan en agua estéril, normalizada para contener unos equivalentes de AA idénticos a los del stock del Ensayo 1. Estos stock se almacenan a temperatura ambiente para su utilización en las evaluaciones.
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Ejemplo 2 Tratamiento de los cultivos celulares con ácido ascórbico y/o treonato cálcico
Se siembran y se cultivan 0,25 -1,0 x 10^{5} células de líneas celulares hepáticas derivadas de un tumor o normales en unos pocillos individuales en una placa de cultivo de 24 pocillos en presencia de una concentración creciente de suplemento recién preparado que consiste en ácido ascórbico (AA) o ascorbato cálcico (AC). Los cultivos se realimentan periódicamente mediante la adición de los suplementos respectivos con o sin cambio de medio según sea necesario. Los controles consisten en células que reciben medio de cultivo sin un suplemento añadido.
Para el tratamiento con el treonato cálcico (TC), se deja que las células se enganchen en un cultivo toda la noche. Al día siguiente, se inicia el tratamiento con treonato cálcico utilizando uno de los dos protocolos.
En un protocolo (exposición corta), las monocapas se lavan y se exponen directamente a 1 ml/pocillo de treonato 7,5-30 mM (preparado en solución Ringer) durante unos periodos cortos a una temperatura de 37ºC como se ha descrito por Fay y Verlangieri (referenciado anteriormente). Los controles se exponen a 1 ml/pocillo de solución Ringer sola durante unos intervalos similares. Tras la exposición, la solución se elimina y se sustituye por medio de cultivo.
En otro protocolo (exposición continua), una décima parte del volumen de treonato a una concentración 10X (preparada en agua estéril) se añade al medio de cultivo y se sigue con la incubación a una temperatura de 37ºC. Se repite el mismo tratamiento mediante adiciones periódicas de solución de trabajo recién preparada.
Ejemplo 3 Tratamiento de las células de cultivo con ácido ascórbico más treonato cálcico
Las células se tratan con treonato cálcico (TC), como en el ejemplo 2, durante sesenta minutos a una temperatura de 37ºC tras la adición de ácido ascórbico (AA) en solución Ringer y una incubación continua durante treinta minutos. Al final del periodo de tratamiento, la solución se elimina y se sustituye por 1 ml/pocillo del medio de creci-
miento.
Ejemplo 4 Tratamiento de los cultivos celulares con ensayo 1 (Ester-C® ascorbato cálcico más metabolitos) y Ensayo 4 (ascorbato cálcico más treonato cálcico
Las monocapas subconfluentes de los cultivos celulares, sembradas en unas placas de 24 pocillos, se suplementan con una décima parte en volumen de las soluciones de trabajo stock para obtener una concentración final de la solución ensayo 1 en el intervalo entre 0,006 a 0,06% (que corresponde a unos equivalentes de ácido ascórbico de 0,28 mM - 2,8 mM). Los grupos paralelos de pocillos se tratan de forma similar con unas soluciones stock de AC + TC y AC solo, que contienen los mismos equivalentes de AA que la solución ensayo 1. Los cultivos control se tratan con un volumen equivalente de agua estéril. El tratamiento periódico con dichas composiciones se repite a un intervalo de 1-2 días mediante la adición directa de las soluciones recién preparadas (sin cambio del medio de cultivo).
Ejemplo 5 Ensayo de supervivencia celular y muerte celular (apoptosis)
La supervivencia de las células tras el tratamiento se evalúa a unos intervalos predeterminados realizando unos recuentos de células viables utilizando un hematocitómetro de Neubauer. Las células viables se marcan como capaces que excluyen el azul de tripán como se ha descrito anteriormente (Harakeh y Jariwalla, Am. J. Clin. Nutr. 54: 1231S-1235S (1991)). Los resultados se utilizan para determinar los cultivos celulares viables (nº de células/ml) frente a la concentración de las soluciones de ensayo para evaluar el efecto sobre la supervivencia de las células.
La inducción a la apoptosis tras el tratamiento de varios tipos de células tumorales con las composiciones de ensayo y los controles descritos en el Ejemplo 1 se evalúa utilizando el inmunoensayo ligado a enzimas ("ELISA") desarrollado por Boehringer Mannheim (Indianápolis, IN). Dicho ensayo sirve para cribar específicamente y detectar los complejos de ADN asociados a histonas (fragmentos nucleosomales) que aparecen en el citoplasma de las células tratadas en relación con los controles no tratados. La presencia y el nivel de fragmentos nucleosomales en los lisados citoplasmáticos tras diferentes tratamientos se determina utilizando el procedimiento especificado en el estuche ELISA para la detección de la muerte celular, suministrado por Boehringer Mannheim.
Brevemente, el ensayo ELISA se lleva a cabo como sigue. A unos intervalos diferentes tras el tratamiento con las composiciones de ensayo, se aspira el medio y las membranas de las células se lisan por incubación con 200-500 \muL de solución de lisis durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los lisados de células se recogen en unos tubos Eppendorf y se centrifugan a 2.500 rpm durante 10 minutos para separar la fracción nuclear. Una alícuota de sobrenadante que contiene una fracción citoplasmática se utiliza para cuantificar los fragmentos nucleosomales mediante la detección fotométrica a 410 nm en un lector de microplacas. Los resultados se procesan como sigue: se determina la absorbancia media a una longitud de onda de 410 nm frente a la concentración de un compuesto ensayo para comparar las dosis que inducen una apoptosis relativa determinada para cada tratamiento y se compara. La dosis mínima que induce una apoptosis se define como la que se requiere para producir una duplicación en la apoptosis (por ejemplo el nivel de nucleoproteína) por encima del nivel del control no tratado. La apoptosis máxima se defina como la variación máxima en la apoptosis por encima del control.
TABLA 1 Resumen de los datos
3
En la Tabla 1, anteriormente, la "Dosis apoptótica mínima" es la concentración de la composición necesaria para producir una duplicación en la apoptosis por encima del nivel del control. El "número de tratamientos" es el número total de tratamientos con la composición. El "incremento máximo en la apoptosis" es la variación máxima en la apoptosis por encima del control y la "dosis máxima" es la concentración de la composición que induce la "variación máxima de la apoptosis" comparada con el control.
Conclusiones
Los resultados de los ensayos descritos anteriormente conducen a las conclusiones siguientes:
Las composiciones de ascorbato mineral/metabolito de la vitamina C ilustradas en la composición del ensayo 1 inducen una muerte celular selectiva (apoptosis) de varios tipos de células tumorales de un modo dosis dependiente.
Las composiciones de ascorbato mineral/metabolito de la vitamina C (como se ilustra en la composición del ensayo 1) consiguen una apoptosis, es decir, una duplicación mínica en la tasa de muerte celular, a unas concentraciones más bajas (equivalente de AA) de las que son necesarias para conseguir dicha disminución ya sea con el ascorbato mineral solo (como se ilustra en la composición de ensayo 2) o con el ácido ascórbico sólo.
El nivel máximo de apoptosis que se puede conseguir con las composiciones de ascorbato mineral/metabolito de vitamina C (como se ilustra en la composición del ensayo 1) frente a unos tipos de células específico, es superior al que se puede conseguir con el ascorbato mineral o con el ácido ascórbico sólo.
La concentración de equivalentes de AA en las composiciones de ascorbato mineral/metabolito de vitamina C (como se ilustra en la composición del ensayo 1) necesaria para inducir la apoptosis en las células tumorales es inferior a la que se necesita para las células normales, y la magnitud de la muerte celular en las células normales es considerablemente inferior que en las células tumorales.
El tratamiento de los cultivos celulares con ácido ascórbico (AA) y/o treonato cálcico (TC) (como se ilustra en el Ejemplo 2) produjo una muerte celular (apoptosis) selectiva dosis dependiente en las células de hepatoma y melanona comparada con las células normales equivalentes respectivas.
El pretratamiento de las células de hepatoma con TC seguido de la aplicación de AA indujo un nivel de apoptosis celular superior a la dosis correspondiente de AA o TC solo.

Claims (8)

1. Utilización en la preparación de una composición de quimioterapia para el cáncer de una composición que comprende:
(a)
ascorbato mineral soluble en plasma; y
(b)
uno o más metabolitos de la vitamina C seleccionados de entre el grupo constituido por:
(i)
ácidos aldónicos, y las aldono-lactonas, aldono-láctidos y sus sales metálicas no tóxicas, y
(ii)
ácido deshidroascórbico, triosa, eritrosa, 4-hidroxi-5-metil-3(2H)-furanona, ácido 3-hidroxikójico y 5-hidroximaltol.
2. Utilización según la reivindicación 1, en la que la composición incluye aproximadamente 78,4% equivalentes AA de ascorbato cálcico, 0,9% equivalente TA de treonato cálcico, 10,4% de equivalente AA de otros metabolitos AA y el equilibrio en el agua de cristalización.
3. Utilización según la reivindicación 1 ó 2, que incluye un vehículo intravenoso farmacológicamente aceptable.
4. Utilización según la reivindicación 1, 2 ó 3, en la que la composición está destinada a utilizarse a una dosis de 12 a 15 g de ascorbato por día.
5. Compuesto para su utilización en la quimioterapia del cáncer que comprende:
(a)
ascorbato mineral soluble en plasma; y
(b)
uno o más metabolitos de la vitamina C seleccionados de entre el grupo constituido por:
(i)
ácidos aldónicos, y las aldono-lactonas, aldono-láctidos y sus sales metálicas no tóxicas, y
(ii)
ácido deshidroascórbico, triosa, eritrosa, 4-hidroxi-5-metil-3(2H)-furanona, ácido 3-hidroxikójico y 5-hidroximaltol.
6. Compuesto según la reivindicación 5, que incluye aproximadamente 78,4% equivalente AA de ascorbato cálcico, 0,9% equivalente TA de treonato cálcico, 10,4% de equivalente AA de otros metabolitos AA y el equilibrio en el agua de cristalización.
7. Compuesto según la reivindicación 5 ó 6, que incluye un vehículo intravenoso farmacológicamente aceptable.
8. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 5 a 7 para su utilización a una dosis de 12 a 15 g de ascorbato por día.
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