ES2311254T3

ES2311254T3 - Genes que codifican flavona-sintasas.

Info

Publication number: ES2311254T3
Application number: ES06015653T
Authority: ES
Inventors: Masako Mizutani; Yoshikazu Tanaka; Takaaki Kusumi; Shin-Ichi Ayabe; Tomoyoshi Akashi
Original assignee: International Flower Developments Pty Ltd
Current assignee: International Flower Developments Pty Ltd
Priority date: 1999-01-29
Filing date: 2000-01-28
Publication date: 2009-02-01
Anticipated expiration: 2020-01-28
Also published as: AU2322400A; DE60036159D1; EP1067189A4; EP1726653B1; US20060277621A1; KR100753351B1; IL138716A0; ATE430803T1; NZ507149A; DE60040497D1; CA2324505C; JP4368005B2; US7507566B2; CN1355848A; JP2000279182A; EP1067189B1; EP1067189A1; EP1728867B1; EP1726653A2; TWI260345B

Abstract

Un gen que codifica una proteína con actividad de síntesis de flavonas a partir de la flavanonas, en el que la proteína: (1) tiene la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ. ID. No. 2; o (2) tiene una identidad de al menos el 70% con la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ. ID. No.

Description

Genes que codifican flavona-sintasas.

Campo técnico

La presente invención se refiere al control y a la utilización de la biosíntesis de flavonas, que tienen efectos sobre el color de las flores, la protección de los rayos ultravioletas, la simbiosis con microorganismos, etc. en plantas, mediante una técnica de ingeniería genética. Más específicamente, se refiere a genes que codifican proteínas con actividad para sintetizar flavonas a partir de flavanonas, y a su utilización.

Antecedentes de la técnica

La abundancia de los diferentes colores en las flores es uno de los aspectos agradables de la vida que enriquece las mentes y los corazones humanos. Se espera que aumente la producción de alimentos para satisfacer el futuro aumento demográfico por medio de la aceleración del crecimiento de plantas por la simbiosis con microorganismos, o aumentando el número de bacterias de leguminosas que fijan nitrógeno, mejorándose así la productividad de las plantas como consecuencia del aumento del contenido de nitrógeno en el suelo. La eliminación o la reducción del uso de sustancias químicas agrícolas es también deseable para lograr una agricultura más ecológica, y esto requiere la mejora del suelo por los medios biológicos anteriormente mencionados, así como una resistencia más alta de las plantas contra la infección microbiana. Otro objetivo deseado es obtener plantas con altas funciones protectoras contra los rayos ultravioletas como medio para proteger las plantas de la destrucción de la capa de ozono.

"Flavonoide" es un término general para un grupo de compuestos con la estructura carbonada C6-C3-C6, y que están extensamente distribuidos en todas las partes de las células de las plantas. Se sabe que los flavonoides tienen funciones tales como la atracción de insectos y otros polinizadores, la protección de la planta de los rayos ultravioletas, y la participación en la interacción con los microorganismos del suelo (BioEssays, 16 (1994), Koes et al., pág. 123; Trends in Plant Science, 1 (1997), Shirley, B.W., pág. 377).

De los flavonoides, las flavonas juegan un papel importante en la interacción de las plantas con los microorganismos, especialmente en las legumbres, en las que participan en las etapas iniciales de la simbiosis con las bacterias de las leguminosas (Plant Cell, 7 (1995), Dixon y Paiva, pág. 1085; Annu. Rev. Phytopathol., 33 (1995), Spaink, pág. 345). Las flavonas en los pétalos desempeñan un papel en el reconocimiento por los insectos y actúan como copigmentos que forman complejos con las antocianinas. (Gendai Kagaku, (mayo de 1998), Honda y Saito, pág. 25; Prog. Chem. Org. Natl. Prod., 52 (1987), Goto, T., pág. 114). Se sabe que cuando la flavona forma un complejo con la antocianina, el máximo de la absorción de la antocianina se desplaza hacia longitudes de onda más altas, es decir, hacia el azul.

Las rutas de la biosíntesis para los flavonoides han sido ampliamente estudiadas (Plant Cell, 7 (1995), Holton y Cornish, pág. 1071), y los genes para todas las enzimas implicadas en la biosíntesis de antocianidina 3-glucósido y flavonol, por ejemplo, han sido aislados. Sin embargo, los genes implicados en la biosíntesis de las flavonas aún no han sido aislados. Las enzimas que sintetizan flavonas incluyen las que pertenecen a la familia de la dioxigenasa que depende del ácido 2-oxoglutárico (flavona sintasa I) y las enzimas monoxigenasas que pertenecen a la familia del citocromo P450 (flavona sintasa II). Estos grupos de enzimas son enzimas completamente diferentes sin ninguna homología estructural.

Se ha informado que en el perejil, la dioxigenasa dependiente del ácido 2-oxoglutárico cataliza una reacción que produce apigenina, una flavona, a partir de la naringenina, una flavanona (Z. Naturforsch., 36c (1981), Britsch et al., pág. 742; Arch. Biochem. Biophys., 282 (1990), Britsch, pág. 152). Se conocen otros tipos, la flavona sintasa II, que existen en el dragón (Z. Naturforsch., 36c (1981), Stotz y Forkmann, pág. 737) y la soja (Z. Naturforsch., 42c (1987), Koch y Grisebach, pág. 343; Planta, 171 (1987), Koch et al., pág. 519). Se ha publicado recientemente una correlación entre un locus génico y la actividad de la flavona sintasa II en los pétalos de la gerbera (Phytochemistry, 49 (1998), Martens y Forkmann, pág. 1953). Sin embargo, no hay ninguna publicación en la que los genes para estas flavona sintasa I y II fueran aislados o en la que la flavona sintasa II fuera altamente purificada.

Fueron investigadas las propiedades de una proteína citocromo P450, que tenía actividad de síntesis de licodiona que fue inducida cuando células cultivadas de regaliz (Glycyrrhiza echinata) fueron tratadas con un elicitor. La proteína, según se piensa, cataliza la hidroxilación de la posición 2 de liquiritigenina que es una 5-desoxiflavanona, seguido de la apertura del anillo hemiacetal no enzimático para producir licodiona (Plant Physiol., 105 (1994), Otani et al., pág. 1427). Para la clonación de licodiona sintasa, fue preparada una genoteca de cADN a partir de células cultivadas de Glycyrrhiza tratadas con elicitor, y fueron clonados 8 fragmentos génicos que codificaban la citocromo P450 (Plant Science, 126 (1997), Akashi et al., pág. 39).

A partir de estos fragmentos fueron obtenidas dos secuencias de cADN diferentes de cadena entera, cada una codificando una citocromo P450, que habían sido desconocidas hasta aquel tiempo. Específicamente, eran CYPGe-3 (la citocromo P450 Nº CYP81E1) y CYPGE-5 (la citocromo P450 Nº CYP93B1, en lo sucesivo en este documento indicada como la CYP93B1) (Plant Physiol., 115 (1997), Akashi et al., pág. 1288). Mediante la expresión posterior del cADN de CYP93B1 en un sistema que usaba células de insecto cultivadas, se mostró que la proteína derivada del gen catalizaba la reacción que sintetizaba la licodiona a partir de liquiritigenina, una flavanona, y 2-hidroxinaringenina a partir de naringenina, también una flavanona.

La 2-hidroxinaringenina fue convertida a apigenina, una flavona, por tratamiento ácido con ácido clorhídrico del 10% (temperatura ambiente, 2 horas). También, el eriodictiol fue convertida a luteolina, una flavona, por la reacción de eriodictiol con microsomas de levadura que expresaba CYP93B1 seguido de tratamiento ácido. Por lo tanto, fue demostrado que el gen de citocromo P450 codifica la función de la actividad de la flavanona 2-hidroxilasa (FEBS Lett., 431 (1998), Akashi et al., pág. 287). En esta invención, la producción de apigenina a partir de la naringenina requirió CYP93B1 así como otra enzima desconocida, de modo que fue concluido que un total de dos enzimas eran necesarias.

Sin embargo, ningún gen ha sido identificado aún para enzimas con actividad de síntesis de flavonas (tal como la apigenina) directamente a partir de flavanonas (tal como la naringenina) sin tratamiento ácido. Así, a pesar del hecho de que las flavonas tienen numerosas funciones en plantas, ninguna técnica ha sido publicada aún que controle su biosíntesis en plantas, y que mejore las biofunciones en las que las flavonas están implicadas, tal como el color de la flor. El descubrimiento de una enzima que por sí misma pueda lograr la síntesis de flavonas a partir de flavanonas y la adquisición de su gen, y la introducción de tal gen en plantas, sería más práctico e industrialmente aplicable que la introducción en una planta de genes para dos enzimas implicadas en la síntesis de flavonas a partir de flavanonas.

Descripción de la invención

Un objetivo de la presente invención es proporcionar genes para flavona sintasas con actividad de síntesis de flavonas directamente a partir de flavanonas. Los genes de flavona sintasa obtenidos pueden ser introducidos en plantas y ser sobreexpresados para cambiar los colores de la flor.

Además, en los pétalos de las flores que contienen de forma natural grandes cantidades de flavonas, se espera que el control de la expresión de los genes de la flavona sintasa por un método antisentido o un método de cosupresión también pueda cambiar los colores de la flor. También, la expresión de los genes de flavona sintasa en los órganos apropiados, a la luz de la actividad antibacteriana de las flavonas y su interacción con los microorganismos del suelo, causará un aumento de las propiedades antibacterianas de las plantas y mejorará la capacidad de fijar nitrógeno de las legumbres debido a la simbiosis promovida con los microorganismos de la rizosfera, así como un efecto protector contra los rayos ultravioletas y la luz.

La presente invención, por lo tanto, proporciona un gen según se define en las reivindicaciones que codifica una proteína que puedan sintetizar flavonas directamente a partir de flavanonas. El gen es, específicamente, un gen que codifican la flavona sintasa II que pueden sintetizar flavonas a partir de flavanonas por una reacción monoenzimática (denominada en este documento en adelante "flavona sintasa II").

Más específicamente, la presente invención proporciona un gen que codifica una proteína P450 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ. ID. No. 2 del Listado de Secuencias y que posee actividad para sintetizar flavonas a partir de flavanonas.

La invención además proporciona un gen según se define en las reivindicaciones que codifica proteínas que tienen secuencias de aminoácidos con una identidad de al menos el 70% respecto a la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ. ID. No. 2 del Listado de Secuencias y que posee actividad para sintetizar flavonas a partir de flavanonas.

La invención además proporciona un gen según se define en las reivindicaciones que codifica proteínas que poseen la actividad de sintetizar flavonas a partir de flavononas.

La invención proporciona incluso además un vector según se define en las reivindicaciones, particularmente un vector de expresión, que contiene cualquiera de los genes anteriormente mencionados.

La invención proporciona incluso además un huésped según se define en las reivindicaciones transformado con el vector anteriormente mencionado.

La invención proporciona incluso además una proteína según se define en las reivindicaciones codificada por cualquiera de los genes anteriormente mencionados.

La invención proporciona incluso además un procedimiento según se define en las reivindicaciones para producir la proteína anteriormente mencionada que se caracteriza por cultivar o hacer crecer el huésped anteriormente mencionado y recuperar la proteína con actividad para sintetizar la flavona a partir del huésped.

La invención proporciona incluso además una planta según se define en las reivindicaciones en la que han sido introducidos cualquiera de los genes anteriormente mencionados, o progenies de la planta o su tejido, tales como flores cortadas, que exhiben las mismas propiedades.

La invención proporciona incluso además un método según se define en las reivindicaciones para cambiar las cantidades y las composiciones del flavonoide usando los genes anteriormente mencionados; un método según se define en las reivindicaciones para cambiar las cantidades de flavonas usando los genes anteriormente mencionados; un método según se define en las reivindicaciones para cambiar los colores de las flores usando los genes anteriormente mencionados; un método según se define en las reivindicaciones para volver más azul el color de las flores usando los genes anteriormente mencionados; un método según se define en las reivindicaciones para volver más rojo el color de las flores usando los genes anteriormente mencionados; un método según se define en las reivindicaciones para modificar la fotosensibilidad de las plantas usando los genes anteriormente mencionados; y un método según se define en las reivindicaciones para controlar la interacción entre las plantas y los microbios usando los genes anteriormente mencionados.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un cromatograma que muestra los resultados del análisis HPLC de los productos obtenidos a partir de un sustrato, la naringenina, usando las proteínas codificadas por CYP93B1 y TFNS5.

A y B: Obtenido añadiendo una fracción de enzimas a granel de levadura que expresa CYP93B 1.

C y D: Obtenido añadiendo una fracción de enzimas a granel de levadura que expresa TFNS5.

A y C: Productos directos obtenidos por la adición de la fracción de enzimas.

B: Productos obtenidos por tratamiento ácido después de reacción de A.

D: Productos obtenidos por tratamiento ácido después de reacción de C.

Realizaciones para llevar a cabo la invención

La flavanona 2-hidroxilasa codificada por el gen de CYP93B 1 de Glycyrrhiza produce 2-hidroxiflavanonas a partir de flavanonas como los sustratos, y los productos se convierten en flavonas por tratamiento ácido. Los presentes inventores vieron que seria posible obtener un gen que codificara una flavona sintasa II, que era un objeto de la invención, usando el cADN derivado de Glycyrrhiza, CYP93B 1 para seleccionar de una genoteca de cADN de, por ejemplo, una flor que contiene una gran cantidad de flavonas, para así obtener el cADN que codificara proteínas con actividad de síntesis de flavonas directamente a partir de flavanonas como sustratos.

De acuerdo con la invención, una genoteca de cADN de dragón que contiene una gran cantidad de flavonas se rastrea usando el cADN derivado de Glycyrrhiza, CYP93B1 como una sonda, para obtener el cADN que codifica una nueva citocromo P450 (véase el Ejemplo 1). El cADN de dragón, ANFNS2, obtenido de esta manera y el cADN de CYP93B1 de Glycyrrhiza entonces fue usado como una sonda mezclada para obtener TFNS5, un cADN que codifica una nueva citocromo P450, a partir de una genoteca cADN de pétalos de flor de torenia (véase el Ejemplo 2).

El cADN derivado de torenia fue expresado en levadura y se hizo reaccionar con naringenina, una flavanona, como un sustrato que no causó la producción de 2-hidroxinaringenina, sino más bien de la flavona apigenina, sin tratamiento ácido (véase el Ejemplo 3). En otras palabras, esta enzima produjo directamente flavonas a partir de flavanonas sin tratamiento ácido, y se confirmó que su gen era una flavona sintasa II que nunca había sido clonada. La secuencia de aminoácidos codificada por el ANFNS2 derivado de dragón del Ejemplo 1 exhibió una alta identidad del 77% con la flavona sintasa II codificada por TFNS5, y exhibió actividad enzimática de flavona sintasa II (Ejemplo 4). Además, como una secuencia de aminoácidos codificada por cADN derivado de perilla también exhibió una alta identidad del 76% y 75% con TFNS5 y ANFNS2, respectivamente (Ejemplo 8), se especula que la proteína codificada por este cADN también posee la misma actividad enzimática que las flavona sintasas codificadas por TFNS5 y ANFNS2.

El gen de la presente invención pueden ser, por ejemplo, uno que codifica la secuencia de aminoácidos incluida en SEQ. ID. No. 2 del Listado de Secuencias. Sin embargo, se sabe que las proteínas cuyas secuencias de aminoácidos son modificadas por adiciones o deleciones de múltiples aminoácidos y/o sustituciones con aminoácidos diferentes pueden mantener la misma actividad enzimática que la proteína original.

La presente invención también se refiere a un gen que tiene las secuencias de nucleótidos de SEQ ID Nº. 1 y las secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias aminoácidos de citadas en la presente memoria.

La invención también se refiere a genes que codifican proteínas que tienen secuencias de aminoácidos con identidad de preferiblemente al menos el 70%, como el 80% o mayor y hasta el 90% o mayor, con la secuencia de aminoácidos incluida en SEQ ID Nº 2 del Listado de Secuencias, y que posee una actividad de síntesis de flavonas a partir de flavanonas.

Un gen con la secuencia de nucleótidos natural puede ser obtenido rastreando una genoteca de cADN, por ejemplo, como se demuestra detalladamente en los ejemplos. El ADN que codifica las enzimas con secuencias de aminoácidos modificadas puede ser sintetizado usando mutagénesis dirigida común o un método PCR, usando el ADN con una secuencia de nucleótidos natural como material de partida. Por ejemplo, un fragmento de ADN en el que una modificación deba ser introducida puede ser obtenido por tratamientos con enzimas de restricción del cADN natural o del ADN genómico y luego puede usarse como plantilla para la mutagénesis dirigida o la PCR utilizando un cebador que tenga la mutación deseada introducida en el mismo, para obtener un fragmento de ADN que tenga la modificación deseada introducida en el mismo. Los fragmentos de ADN introducidos por mutación entonces pueden ser unidos a un fragmento de ADN que codifica otra parte de una enzima objetivo.

De forma alternativa, para obtener el ADN que codifica una enzima que consiste en una secuencia de aminoácidos acortada, por ejemplo, el ADN que codifica una secuencia de aminoácidos que es más larga que la secuencia de aminoácidos objetivo, tal como la secuencia de aminoácidos de longitud completa, puede ser cortado con las endonucleasas de restricción deseadas, y si el fragmento de ADN obtenido así no codifica la secuencia de aminoácidos objetivo entera, puede ser unido con el ADN sintetizado que comprende el resto de la secuencia.

Los genes así obtenidos pueden ser expresados en un sistema de expresión usando E. coli o una levadura y su actividad enzimática puede ser medida para confirmar que el gen obtenido codifica a la flavona sintasa. Expresando el gen, es también posible obtener la proteína flavona sintasa como producto génico. De forma alternativa, es también posible obtener una proteína flavona sintasa incluso usando anticuerpos para una secuencia de aminoácidos parcial o completa incluida en SEQ. ID. No. 2, y tales anticuerpos pueden ser usados para la donación de un gen de flavona sintasa en otro organismo.

Por consiguiente, la invención también se refiere a vectores recombinantes, y especialmente a vectores de expresión, que contiene el gen anteriormente mencionados, y a huéspedes transformados por estos vectores. Los huéspedes usados pueden ser organismos procariotas o eucariotas. Los ejemplos de organismos procariotas que pueden ser usados comúnmente como huéspedes incluyen a las bacterias que pertenece al género Escherichia, tales como Escherichia coli, y los microorganismos que pertenecen al género Bacillus, tales como Bacillus subtilis.

Los ejemplos de huéspedes eucariotas que pueden ser usados incluyen organismos eucariotas inferiores, por ejemplo, microorganismos eucariotas, por ejemplo, Eumycota tales como levadura y hongos filamentosos. Como levaduras pueden mencionarse los microorganismos que pertenecen al género Saccharomyces, tal como Saccharomyces cerevisiae, y como hongos filamentosos pueden mencionarse microorganismos que pertenecen al género Aspergillus, tales como Aspergillus oryzae y Aspergillus niger y microorganismos que pertenecen al género Penicillium. También pueden ser usadas células de animal y células de planta, siendo las células de animal líneas celulares de ratones, hámsteres, monos o seres humanos. Las células de insecto, tales como células de gusano de seda, o los propios gusanos de seda adultos, también pueden ser usados.

Los vectores de expresión de la invención incluirán regiones reguladoras de la expresión tales como un promotor y un terminador, un origen de replicación, etc., dependiendo del tipo de huéspedes en los que deban ser introducidos. Los ejemplos de promotores para los vectores de expresión bacterianos que pueden ser usados incluyen a promotores convencionales tales como el promotor trc, el promotor tac, el promotor lac, etc., los ejemplos de los promotores de levadura que pueden ser usados incluyen al promotor de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, el promotor PH05, etc., y los ejemplos de los promotores de hongos filamentosos que pueden ser usados incluyen al promotor de amilasa, trpC, etc. Los ejemplos de promotores huésped de células de animal que pueden ser usados incluyen a promotores virales tales como el el promotor temprano SV40, tardío SV40, etc.

El vector de expresión puede prepararse de acuerdo con un método convencional usando endonucleasas de restricción, ligasas y otras similares. La transformación de un huésped con un vector de expresión también puede ser llevada a cabo de acuerdo con métodos convencionales.

Los huéspedes transformados por el vector de expresión pueden ser cultivados pueden hacerse crecer y la proteína objetivo puede ser recuperada y purificada a partir del producto cultivado, etc., de acuerdo con métodos convencionales tales como filtración, separación centrífuga, trituración de células, cromatografía de filtración de gel, cromatografía de intercambio iónico y otros similares.

La presente memoria descriptiva en todas partes habla de flavona sintasas II derivadas de dragón, torenia y perilla que son capaces de sintetizar flavonas directamente a partir de flavanonas, y también se sabe que los genes de citocromo P450 constituyen una superfamilia (DNA and Cell Biology, 12 (1993), Nelson et al., pág. 1) y que las proteínas de citocromo P450 dentro de la misma familia tienen un 40% o mayor identidad en sus secuencias de aminoácidos mientras que las proteínas citocromo P450 dentro de una subfamilia tiene 55% o una mayor identidad en sus secuencias de aminoácidos, y que sus genes se hibridan entre sí (Pharmacogenetics, 6 (1996), Nelson et al., pág. 1).

Por ejemplo, un gen para la flavonoide 3',5'-hidroxilasa, que era un tipo de citocromo P450 y que participaba en la ruta de síntesis de los flavonoides, fue aislado primero a partir de petunias (Nature, 366 (1993), Holton et al., pág. 276), y el gen de flavonoide 3',5'-hidroxilasa de petunia fue usado como una sonda para aislar fácilmente un gen de flavonoide 3',5'-hidroxilasa de genciana (Plant Cell Physiol., 37 (1996), Tanaka et al., pág. 711), genciana de pradera, campanilla (documento WO93/18155 (1993), Kikuchi et al.), lavanda, torenia y verbena (Shokubutsu no Kagaku Chosetsu, 33 (1998), Tanaka et al., pág. 55).

Así, una parte o todo de cualquiera de los genes de flavona sintasa II de la invención derivada de dragón, que es capaz de sintetizar flavonas directamente a partir de flavanonas, pueden ser usados como sonda, para obtener los genes de la flavona sintasa II capaces de sintetizar flavonas directamente a partir de flavanonas, a partir de diferentes especies de plantas. Además, purificando las enzimas de la flavona sintasa II derivadas de dragón, torenia o perilla descritas en esta memoria descriptiva que pueden sintetizar flavonas directamente a partir de flavanonas, y obteniendo los anticuerpos contra las enzimas por métodos convencionales, es posible obtener diferentes proteínas flavona sintasa II que reaccionen con los anticuerpos y obtener los genes que codifican para aquellas proteínas.

Las fuentes para genes de flavona sintasa II pueden ser, además de dragón, torenia y perilla descritas en este documento, también genciana, verbena, crisantemo, lirio, commelina, centaurea, salvia, nemófila y similares.

La invención se refiere incluso además a plantas cuyos colores sean modificados introduciendo un gen o genes para flavona sintasas II que pueda o puedan sintetizar flavonas directamente a partir de flavanonas, y a las progenies de las plantas o sus tejidos, que también puedan estar en forma de flores cortadas. Usando las flavona sintasas II o sus genes que han sido clonados de acuerdo con la invención, es posible producir flavonas en especies de plantas o variedades que de otra manera producirían pocas o absolutamente ninguna flavona. Expresando el gen o los genes de la flavona sintasa II en pétalos de flor, es posible aumentar la cantidad de flavonas en los pétalos de flor, permitiendo así que los colores de las flores sean modificados hacia el azul, por ejemplo.

A la inversa, reprimiendo la síntesis de flavonas en los pétalos de flor, es posible modificar los colores de las flores hacia el rojo, por ejemplo. Sin embargo, las flavonas tienen una miríada de efectos sobre los colores de las flores, y los cambios de colores de las flores por lo tanto no están limitados con los mencionados en este documento. Con el nivel actual de tecnología, es posible introducir un gen en una planta y expresar el gen en una manera constitutiva o específica de tejido, mientras que es también posible reprimir la expresión del gen objetivo por un método antisentido o un método de cosupresión.

Como ejemplos de plantas transformables pueden ser mencionados rosa, crisantemo, clavel, dragón, ciclamen, orquídea, violeta de pradera, freesia, gerbera, gladiolo, paniculata, kalanchoe, lirio, pelargonium, geranio, petunia, torenia, tulipán, arroz, cebada, trigo, semilla de colza, patata, tomate, álamo, plátano, eucalipto, batata, soja, alfalfa, lupino, grano, etc., pero no hay ninguna limitación a estos.

Como las flavonas tienen varias actividades fisiológicas como se explica anteriormente, pueden impartir una nueva actividad fisiológica o valor económico a las plantas. Por ejemplo, expresando el gen para producir flavonas en las raíces, es posible promover el crecimiento de microorganismos que son beneficiosos para las plantas, y así promover el crecimiento de las plantas. Es también posible sintetizar flavonas que exhiben actividad fisiológica en seres humanos, animales o insectos.

Ejemplos

La invención ahora será explicada con más detalle mediante los Ejemplos siguientes. A no ser que sea especificado de otra manera, los métodos biológicos moleculares fueron llevados a cabo de acuerdo con "Molecular Cloning" (de Sambrook et al., 1989).

Ejemplo 1 Clonación del gen de flavona sintasa II de dragón

Fue extraído ARN de aproximadamente 5 g de brotes jóvenes de un dragón "Yellow Butterfly" (nombre comercial de Sakatano-Tane, KK.), y fue obtenido el ARN de polyA+ por un Oligotex. Este ARN de polyA+ fue usado como una plantilla para preparar una genoteca de cADN usando un Kit de Síntesis de Genoteca de cADN Lambda ZAPII (Stratagene) por el método recomendado por Stratagene (Manual de instrucciones de Stratagene, Revisión Nº 065001). La genoteca de cADN fue rastreada usando el cADN de CYP93B1 de longitud completa como sonda. El rastreo y la detección de clones positivos fueron llevados a cabo usando un kit de marcación DIG-ADN y detección (Boehringer) basado en el método recomendado por la misma empresa, en condiciones pocos rigurosas.

Específicamente, un tampón de hibridación (5 x SSC, 30% de formamida, tampón fosfato de sodio 50 mM (pH 7,0), 1% de SDS, 2% de reactivo bloqueante (Boehringer), 0,1% de lauroilsarcosina, 80 \mug/ml de ADN de esperma de salmón) fue usado para la prehibridación a 42ºC durante 2 horas, después de lo cual la sonda DIG-marcada fue añadida y la mezcla fue guardada por la noche. La membrana fue aclarada en una solución de aclarado 5 x SSC que contenía 1% de SDS a 65ºC durante 1,5 horas. Un clon positivo fue obtenido, y fue denominado ANFNS1. En la determinación de la secuencia de nucleótidos en el extremo 5' de ANFNS1 se esperaba que ANFNS1 codificara una secuencia con una alta identidad con la flavanona 2-hidroxilasa codificada por el CYP93B1 de regaliz, y fue asumido que codificaba una P450 con una función similar a la de la flavanona 2-hidroxilasa.

Sin embargo, una comparación con la secuencia de aminoácidos de flavanona 2-hidroxilasa codificada por
CYP93B1 sugirió que el cADN de ANFNS1 no era un cADN de cadena entera, careciendo de la parte correspondiente a aproximadamente 65 restos de aminoácidos de la metionina de iniciación. El cADN de ANFNS1 por lo tanto fue usado como una sonda para rastrear de nuevo la genoteca del cADN de dragón, para obtener el cADN (ANFNS2) que, según se creía, incluía la secuencia de aminoácidos de cadena entera. La proteína codificada por ANFNS2 obtenida en este documento exhibió una identidad del 53% respecto al nivel de aminoácidos con la flavanona 2-hidroxilasa codificada por regaliz CYP93B1. La secuencia de nucleótidos de ANFNS2 es la SEQ. ID. No. 1, y la secuencia de aminoácidos deducida a partir de ahí es la SEQ. ID. No. 2.

Ejemplo 2 Clonación del gen de flavona sintasa II de torenia

Fue extraído ARN a partir de aproximadamente 2 g de brotes de una variedad de torenia (nombre de la variedad Sunrenive, Nº de Solicitud del Registro de Variedades: 7433 de acuerdo con el Derecho de Semillas y Plantones, de Suntory Ltd.) y fue obtenido el ARN de polyA+ con un Oligotex. El ARN de polyA+ fue usado como plantilla para preparar una genoteca de cADN usando un Kit de Síntesis de Genoteca de cADN Lambda ZAPII (Stratagene) por el método recomendado por Stratagene como se menciona en el Ejemplo 1. La genoteca de cADN fue rastreada usando una mezcla del cADN de CYP93B1 anteriormente mencionado y el cADN de ANFNS1 como sondas. El rastreo y la detección de clones positivos fueron llevados a cabo en condiciones poco rigurosas como se describe en el Ejemplo 1.

Un clon positivo fue obtenido, y fue denominado TFNS5. Para determinar la secuencia de nucleótidos completa del cADN de TFNS5, fue encontrado que la proteína codificada por el cADN de TFNS5 exhibía una identidad del 52% respecto al nivel de aminoácidos con la flavanona-2-hidroxilasa codificada por regaliz CYP93B1. Este cADN de TFNS5 también tenía una alta identidad del 77% con la proteína codificada por ANFNS2, el cADN derivado de dragón obtenido en el Ejemplo 1. La secuencia de nucleótidos determinada es la SEQ. ID. No. 3, y la secuencia de aminoácidos deducida a partir de ahí es la SEQ. ID. No. 4.

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Ejemplo 3 Expresión del gen de flavona sintasa II de torenia en levadura

El siguiente experimento fue llevado a cabo para detectar la actividad enzimática de la proteína codificada por TFNS5, el cADN de torenia obtenido en el Ejemplo 2. Las partes del exterior de la región traducida del gen fueron modificadas para introducir los sitios de la enzima de restricción para preparar un cebador sentido (5'-AAATAGGATCCA
AGCatgGACACAGTCTTAA-3 ; subrayado = el sitio BamHI; letras minúsculas: codon de iniciación) (SEQ. ID. No. 5) y un cebador antisentido (5'-CCCTTCTAGAtcaAGCACCCGATATTGTGGCCGGG-3'; subrayado = el sitio XbaI; letras minúsculas: codon de terminación) (SEQ. ID. No. 6) fueron usados con la polimerasa KOD (Toyobo) para la reacción PCR. Las condiciones de la PCR fueron 98ºC durante un minuto, 20 ciclos (de 98ºC durante 15 segundos, 55ºC durante 10 segundos, 74ºC durante 30 segundos), seguido de 74ºC durante 10 minutos.

Después de la introducción del resultado del producto de la PCR en el sitio EcoRV de pBluescriptII SK(-) (Stratagene), fue digerido con las enzimas de restricción BamHI y XbaI e introducido en los sitios de BamHI-XbaI del vector de expresión de levadura pYES2 (Invitrogen). El plásmido resultante entonces fue introducido en la levadura BJ2168 (Nihon Gene). La actividad enzimática fue medida por el método descrito por Akashi et al. (FEBS Lett., 431 (1998), Akashi et al., pág. 287). Las células de levadura transformadas fueron cultivadas en 20 ml de medio selectivo (6,7 mg/ml de base de nitrógeno de levadura sin amino-ácido (Difco), 20 mg/ml de glucosa, 30 \mug/ml de leucina, 20 \mug/ml de triptófano y 5 mg/ml de ácido casamino), a 30ºC durante 24 horas.

Después de la recolección de las células de levadura con centrifugación, las células de levadura cosechadas fueron cultivadas a 30ºC durante 48 horas en un medio de expresión (10 mg/ml de extracto de levadura, 10 mg/ml de peptona, 2 \mug/ml de hemina, 20 mg/ml de galactosa). Después de la recuperación de las células de levadura, fueron lavadas suspendiéndolas en agua y recogiéndolas. Fueron usadas perlas de vidrio durante 10 minutos de interrupción, después de lo cual las células fueron centrifugadas a 8000 g x durante 10 minutos. El sobrenadante además fue centrifugado a 15.000 x g durante 10 minutos para obtener una fracción de enzimas a granel.

Una mezcla de 15 \mug de (R,S)-naringenina (disuelta en 30 \mul de 2-metoxietanol), 1 ml de solución de enzima a granel y NADPH 1 mM (volumen de mezcla de reacción total: 1,05 ml) se hizo reaccionar a 30ºC durante 2 horas. Después de la finalización de la reacción por la adición de 30 \mul de ácido acético, fue añadido 1 ml de acetato de etilo y fue mezclado con esto. Después de la centrifugación, la capa de acetato de etilo fue secada con un evaporador. El residuo fue disuelto en 100 \mul de metanol y fue analizado por HPLC. El análisis fue llevado a cabo de acuerdo con el método descrito por Akashi et al. El tratamiento ácido implicó la disolución de la muestra secada por el evaporador en 150 \mul de etanol que contenía 10% de ácido clorhídrico, y fue agitado durante 30 minutos. Esto fue diluido con 1,3 ml de agua, fueron añadidos después 800 \mul de acetato de etilo y fue mezclado con esto, y después de la centrifugación, la capa de acetato de etilo fue recuperada. Esto entonces fue secado, fue disuelto en 200 \mul de metanol y fue analizado por HPLC.

La levadura que expresa CYP93B1 de regaliz produjo 2-hidroxinaringenina a partir de naringenina, pero no proporcionó ninguna apigenina (Figura 1, A). Sólo bajo el tratamiento ácido de la mezcla de reacción, la apigenina fue proporcionada a partir de 2-hidroxinaringenina (Figura 1, B). Por el contrario, la levadura que expresa TFNS5 de torenia proporcionó apigenina a partir de naringenina sin tratamiento ácido de la mezcla de reacción (Figura 1, C). Esto demostró que TFNS5 codifica una flavona sintasa II.

Ejemplo 4 Expresión del gen de flavona sintasa II de dragón en levadura

Un fragmento de ADN de aproximadamente 1400 bp obtenido digiriendo cADN de ANFNS2 con BamHI y SphI, un fragmento de ADN de aproximadamente 350 bp obtenido digiriendo el mismo con SphI y BamHI, y pYES2 digerido con BamHI y XhoI fue ligado para obtener un plásmido, que entonces fue introducido en la levadura por el mismo método que el descrito en el Ejemplo 3. Las células de levadura recombinantes resultantes fueron usadas para medir la actividad de síntesis de flavona por el mismo método que en el Ejemplo 3. La levadura que expresa el ANFNS2 derivado de dragón produjo la apigenina sin tratamiento ácido, demostrando así que ANFNS2 codifica una flavona sintasa II.

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Ejemplo 5 Construcción del vector de expresión en plantas

Un vector de expresión de planta fue construido para introducir TFNS5, el cADN de torenia obtenido en el Ejemplo 2, en plantas. Después de la digestión de pBE2113-Gus (Plant Cell Physiol., 37 (1996), Mitsuhara et al., pág. 49) con SacI, un kit de redondeo (Takara) fue usado para redondear los extremos, después de lo cual fue insertado un enlazador XhoI (Toyobo). El plásmido resultante entonces fue digerido con HindIII y EcoRI, y fue recuperado un fragmento de ADN de aproximadamente 3 kilobytes. El fragmento de ADN fue unido al sitio de HindIII/EcoRI del vector binario pBINPLUS para preparar pBE2113'. El vector pBINPLUS usado en este documento fue obtenido modificando el vector binario Bin19 (Nucl. Acids Res., 12 (1984), Bevan, pág. 8711), que se usa extensamente para la introducción génica en plantas usando células de Agrobacterium, de la manera publicada por van Engelen et al. (Transgenic Research, 4 (1995), van Engelen et al., pág. 288).

El cADN de TFNS5 fue cortado del vector SK(-) por la división con BamHI/XhoI, y un fragmento de aproximadamente 1,7 kilobytes así obtenido fue ligado a los sitios de BamHI/XhoI del vector binario anteriormente mencionado pBE2113'. La construcción así obtenida, pSPB441, expresa el cADN de TFNS5 en la dirección sentido en el control del promotor de virus del mosaico de la coliflor de 35S que tiene una doble repetición de la secuencia del potenciador (Plant cell Physiol., 37 (1996), Mitsuhara et al., pág. 49).

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Ejemplo 6 Alteración del color de la flor de torenia

Una variedad de torenia (nombre de la variedad Sunrenive, Nº de Solicitud de Registro de Variedades: 7433 de acuerdo con el Derecho de Semillas y Plantones, de Suntory Ltd.) fue transformada con el pSPB441 construido en el Ejemplo 5 anterior, de acuerdo con el método de Aida et al. (Breeding Science, 45 (1995), Aida et al., pág. 71). Más del 95% de los transformantes obtenidos mostraron la alteración del color de flor del púrpura oscuro de la cepa parenteral a un púrpura claro. Los colores de los pétalos de la flor izquierdo y derecho de cuatro pétalos de la flor fueron medidos. Aunque el color de los pétalos de la flor de la cepa parenteral era el Número 89A de acuerdo con la Carta de Colores de la Real Sociedad Hortícola, los colores de los pétalos de la flor típicos de los transformantes fueron 82C, 87, 87C, 88, 91A, etc. Estos resultados indicaron que la introducción de TFNS5 en las plantas puede cambiar los colores de la flor.

En los individuos transformados, la cantidad de flavonas estaba en los rangos de 1/5 a 1/10 respecto al del huésped, mientras que se redujo la cantidad de antocianinas a aproximadamente 1/3 respecto a la del huésped. También se detectaron las flavanonas (naringenina, eriodictiol y pentahidroxiflavanona) que son las precursoras de la biosíntesis de flavona que no fueron detectados en el huésped.

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Ejemplo 7 Expresión de flavona sintasa en petunias

El plásmido pSPB441 fue introducido en una variedad de petunia (nombre de la variedad: Revolution Violet Mini, Nº de Solicitud de Registro de Variedades: 9217, de acuerdo con el Derecho de Semillas y Plantones, de Suntory Ltd.) de acuerdo con el método de Napoli et al. (Plant Cell, 2, (1990), Napoli et al., pág. 279). Los cambios de colores de la flor ocurrieron en dos de los transformantes resultantes, en los que los colores de la flor eran más claros que los de la cepa parenteral. El color de la flor de la cepa parenteral era del Número 88A de acuerdo con la Carta de Colores de la Real Sociedad Hortícola, mientras que era el 87A en los transformantes. También, aunque ninguna flavona fue detectada en la cepa parenteral, una flavona, la luteolina, fue detectada en las cepas transformadas.

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Ejemplo 8 Clonación del gen de flavona sintasa II de perilla

El método descrito en el Ejemplo 1 fue usado para rastrear una genoteca de cADN preparada a partir de hojas de perilla roja (Perilla frutescens) de acuerdo con el método de Gong et al. (Plant Mol. Biol., 35, (1997), Gong et al., pág. 915) utilizando \lambdagt10 (Stratagene) como vector. El cultivo, la preparación de ADN y la subclonación de los clones del bacteriófago resultante Nº. 3 fueron llevados a cabo de acuerdo con el método de Gong et al. (Plant Mol. Biol., 35, (1997), Gong et al., pág. 915), y la secuencia de nucleótidos fue determinada y catalogada como SEQ. ID. No. 7. La secuencia de aminoácidos deducida codificada por esta secuencia de nucleótidos fue SEQ.ID. No 8. Esta secuencia de aminoácidos mostró una identidad del 76% y 75% con TFNS5 y ANFNS2, respectivamente. Ésta también mostró una identidad del 52% con CYP93B1.

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Ejemplo 9 Expresión del gen de flavona sintasa II de perilla en levadura

El clon del bacteriófago Nº 3 obtenido en el Ejemplo 8 fue usado como una plantilla para PCR por el método descrito en el Ejemplo 3, usando el cebador Lambda Arm (Stratagene). El fragmento de ADN amplificado fue subclonado en el sitio de EcoRV de pBluescript KS(-). Un clon con el codon de iniciación del cADN de flavona sintasa II de perilla en el lado del sitio de SalI de pBluescript KS(-) fue seleccionado, y fue denominado pFS3. La secuencia de nucleótidos del inserto de cADN de pFS3 fue determinada, y fue llevada a cabo la PCR para confirmar la ausencia de errores.

Un fragmento de ADN de aproximadamente 1,8 kilobytes obtenido digiriendo pFS3 con SalI y XbaI fue ligado con pYES2 digerido con XhoI y XbaI (Ejemplo 3) para obtener un plásmido que fue denominado pYFS3, y esto fue introducido en BJ2168 de levadura por el método descrito en el Ejemplo 3. Cuando la actividad de flavona sintasa de esta levadura recombinante fue medida por el método descrito en el Ejemplo 3, se confirmó la producción de apigenina a partir de naringenina, indicando que el cADN del clon del bacteriófago de perilla Nº 3 codificaba una proteína con actividad de flavona sintasa II.

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Aplicabilidad industrial

Es posible cambiar los colores de las flores uniendo el cADN de la invención a un vector de expresión de planta apropiado e introduciéndolo en plantas que expresan o inhiben la expresión de flavona sintasas. Además, expresando los genes de flavona sintasa no sólo en pétalos sino también en plantas enteras o en sus órganos apropiados, es posible aumentar la resistencia frente a microorganismos de plantas o mejorar la capacidad fijadora del nitrógeno de legumbres promoviendo la asociación con los microorganismos de la rizosfera, así como mejorar los efectos protectores de las plantas contra los rayos ultravioletas y la luz.

<110> SUNTORY LIMITED

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<120> Gen que codifica para enzimas sintetizadoras de flavonas

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<130> 993009

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<160> 8

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<210> 1

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<211> 1724

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<212> ADN

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<213> Antirrhinum majus

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<220>

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<223> Secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que tiene actividad para convertir directamente flavanona en flavona

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<400> 1

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1

2

3

4

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<210> 2

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<211> 506

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<212> PRT

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<213> Antirrhinum majus

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<220>

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<223> Secuencia de aminoácidos de una proteína que tiene actividad para convertir directamente flavanona en flavona

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<400> 2

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5

6

7

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<210> 3

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<211> 1730

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<212> ADN

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<213> Torenia hybrida

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<220>

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<400> 3

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8

9

10

11

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<210> 4

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<211> 512

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<212> PRT

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<213> Torenia hybrida

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<220>

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<400> 4

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12

13

14

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<210> 5

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<211> 31

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador

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<400> 5

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15

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<210> 6

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<211> 35

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador

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<400> 6

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16

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<210> 7

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<211> 1770

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<212> ADN

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<213> Perilla frutescens

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<220>

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<400> 7

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17

18

19

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<210> 8

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<211>

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<212> PRT

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<213> Perilla frutescens

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<220>

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<400> 8

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20

21

Claims

1. Un gen que codifica una proteína con actividad de síntesis de flavonas a partir de la flavanonas, en el que la proteína:

(1): tiene la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ. ID. No. 2; o

(2): tiene una identidad de al menos el 70% con la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ. ID. No. 2.

2. Un gen de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el nivel de identidad es de al menos el 80%

3. Un gen de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el nivel de identidad es de al menos el 90%.

4. Un gen de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene una secuencia nucleotídica indicada en SEQ ID No:1.

5. Un vector que comprende un gen de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Un huésped transformado que comprende un vector de acuerdo con la reivindicación 5.

7. Una proteína codificada por un gen de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Un método para producir una proteína con actividad de síntesis de flavona, que se caracteriza por cultivar o hacer crecer un huésped de acuerdo con la reivindicación 6 y recuperar dicha proteína de dicho huésped.

9. Una planta transgénica que comprende un gen artificialmente introducido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o la progenie de dicha planta o su tejido, cuya progenie comprende dicho gen de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

10. Una flor cortada de la planta transgénica o su progenie de acuerdo con la reivindicación 9, que comprende dicho gen de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

11. Un método para cambiar las cantidades y/o las composiciones de flavonoides usando un gen de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

12. Un método para cambiar la cantidad de una flavona usando un gen de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

13. Un método para cambiar el color de una flor usando un gen de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

14. Un método para volver más azul el color de una flor usando un gen de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

15. Un método para volver más rojo el color de una flor usando un gen de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

16. Un método para cambiar la fotosensibilidad de una planta usando un gen de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

17. Un método para controlar la interacción entre una planta y microorganismos usando un gen de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.