JP2000279182A - フラボン合成酵素をコードする遺伝子 - Google Patents

フラボン合成酵素をコードする遺伝子

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 フラバノンからフラボンを直接合成すること
ができる新規な酵素の提供。 【解決手段】 例えばキンギョソウやトレニアから得ら
れる、フラバノンを直接にフラボンに転換することがで
きる酵素をコードするDNA 及びその使用に関し、このDN
A 及びそれによりコードされる酵素のアミノ酸配列は、
例えば配列番号：１及び２並びに３及び４により示され
る。この遺伝子を植物に導入することにより、例えばそ
の植物の花の色を変えることができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は植物において、花
色、紫外線からの保護、微生物との共生などに影響をお
よぼすフラボンの生合成を、遺伝子工学の技術を用い
て、制御、利用することに関するものである。より詳し
くはフラバノンからフラボンを合成する活性を有するタ
ンパク質をコードする遺伝子およびその利用に関するも
のである。
【０００２】
【従来の技術】精神的豊かさが求められる今日、多様な
花色の花々は人々の心に潤いを与えるものの１つであ
る。また、人口増加に伴ない必要な食料増産のための１
つの手段として、微生物との共生促進による植物の成長
促進や、窒素固定を行なう根粒菌の増加、その結果とし
て生じる土壌窒素含量増加による植物生産性の向上が考
えられる。より環境にやさしい農業を実現するために
は、無農薬、減農薬が好まれ、上記のような生物学的手
段による土壌の改良や、植物自身の抗菌性の向上が必要
とされる。またオゾン層破壊から植物を保護する手段と
して紫外線に対する防御機能の高い植物が期待されてい
る。
【０００３】フラボノイドは、C6-C3-C6の炭素骨格を持
った一群の化合物の総称で、植物細胞に広く分布してい
る。フラボノイドの機能としては、昆虫などのポリネー
ターを呼んだり、紫外線から植物体を保護したり、土壌
微生物との相互作用にかかわったりすることが知られて
いる（BioEssays, 16 (1994) Koes et al., p.123 ；Tr
ends in Plant Science, 1 (1997) Shirley, B.W., p.3
77 ）。
【０００４】フラボノイドのうちフラボンは、特にマメ
科においては、根粒菌との共生の初期過程にかかわるな
ど、微生物との相互作用を行なう上で重要である（Plan
t Cell, 7 (1995) Dixon and Paiva, p.1085； Annu. R
ev. Phytopathol., 33 (1995) Spaink, p.345 ）。ま
た、花弁におけるフラボンは、昆虫に認識される役割
や、アントシアニンと複合体を形成するコピグメントと
して、働いている（現代化学、（1998年5 月）本田と斉
藤、p.25； Prog. Chem. Org. Natl. Prod., 52 (1987)
Goto,T., p.114 ）。フラボンは、アントシアニンと複
合体を形成すると、アントシアニンの吸収極大値を長波
長側にシフトさせる、すなわち青くすることが知られて
いる。
【０００５】フラボノイドの生合成経路についてはよく
研究されており（Plant Cell, 7 (1995) Holton and Co
rnish, p.1071 ）、例えばアントシアニジン３‐グルコ
シドやフラボノールの生合成にかかわる酵素の遺伝子は
すべて単離されている。しかしながら、フラボンの生合
成にかかわる遺伝子はいまだに単離されていない。フラ
ボンを合成する酵素には、2 ‐オキソグルタール酸に依
存するジオキシゲナーゼファミリーに属する酵素（フラ
ボン合成酵素I)とチトクロームP450ファミリーに属する
モノオキシゲナーゼ酵素（フラボン合成酵素II) がある
ことが知られている。これらの酵素は構造においてもホ
モロジーがなく、全く別の酵素である。
【０００６】パセリにおいては、2-オキソグルタール酸
に依存性のジオキシゲナーゼが、フラバノンの一種であ
るナリンゲニンからフラボンの一種であるアピゲニンを
生成する反応を触媒すると報告されている（Z.Naturfor
sch., 36c (1981) Britsch et al., p.742； Arch. Bio
chem. Biophys., 282 (1990) Britsch, p.152)。もう一
種のフラボン合成酵素IIは、キンギョソウ（Z.Naturfor
sch., 36c (1981) Stotz and Forkmann, p.737）及びダ
イズ（Z.Naturforsch., 42c (1987) Kochs andGrisebac
h, p.343 ； Planta, 171 (1987) Kochs et al., p.519
）での存在が知られている。また、近年ガーベラで遺
伝子座と花弁のフラボン合成酵素II活性に相関があるこ
とが報告されている（Phytochemistry, 49 (1998) Mart
ens andForkmann, p.1953）。しかし、これらのフラボ
ン合成酵素I あるいはIIの遺伝子が単離されたり、フラ
ボン合成酵素IIが純粋に精製された例はない。
【０００７】マメ科カンゾウ（Glycyrrhiza echinata）
の培養細胞をエリシター処理した際に誘導されるリコジ
オン合成活性を持つチトクロームP450タンパク質の性質
が調べられている。このタンパク質によって5-デオキシ
フラバノンであるリクイリチゲニンの２位が水酸化さ
れ、続いて非酵素的なヘミアセタール開環が起こり、リ
コジオンを生成すると考えられた（Plant Physiol., 10
5 (1994) Otani et al.,p.1427 ）。リコジオン合成酵
素をクローニングするために、エリシター処理したカン
ゾウ培養細胞からcDNAライブラリーが作製され、チトク
ロームP450をコードする遺伝子断片が８種クローニング
されている（Plant Science, 126 (1997)Akashi et a
l., p.39 ）。
【０００８】このうち当時機能が未知であったチトクロ
ームP450をコードする２種類の完全長cDNAが取得され
た。すなわち、CYPGe-3 （チトクロームP450番号CYP81E
1 ）及びCYPGe-5 （チトクロームP450番号CYP93B1 、以
下CYP93B1 と表記）である（Plant Physiol., 115 (199
7) Akashi et al., p.1288）。さらに、昆虫の培養細胞
を用いる系でCYP93B1 cDNAを発現させることにより、こ
の遺伝子に由来する蛋白質はフラバノンの１種であるリ
クイリチゲニンからリコジオンを、また同じくフラバノ
ンの１種ナリンゲニンから２−ヒドロキシナリンゲニン
を合成する反応を触媒することが示された。
【０００９】2-ヒドロキシナリンゲニンは10% 塩酸（室
温、2 時間）の酸処理で、フラボンの一種であるアピゲ
ニンに転換された。また、エリオジクチオールは、CYP9
3B1を発現している酵母のミクロソームと反応させ、そ
の後酸処理を行うことによってフラボンの一種であるル
テオリンに変換された。したがってこのチトクロームP4
50遺伝子はフラバノン‐2 ‐水酸化酵素活性の機能をコ
ードしていることが明らかになった（FEBS Lett., 431
(1998) Akashi et al., p.287 ）。この場合、ナリンゲ
ニンからアピゲニンを生産するためにはCYP93B1 に加え
て、さらに別の未知の酵素が必要であり、計２種の酵素
が必要と考えられた。
【００１０】しかしながら、酸処理を行うことなく、フ
ラバノン（たとえば、ナリンゲニン）から直接フラボン
（たとえば、アピゲニン）を合成する活性を有する酵素
の遺伝子は、いまだに得られていない。よって、植物体
において多様な作用を有するフラボンであるにもかかわ
らず、植物体内においてその生合成を制御し、花色をは
じめとするフラボンがかかわる生体機能を改変する技術
はこれまで報告されていなかった。フラバノンからフラ
ボンへの合成を一種の酵素で行なうことができるような
酵素を見出しその遺伝子を取得し、たとえばその遺伝子
を植物に導入することは、フラバノンからフラボンへの
合成に関わる２種の酵素の遺伝子を植物に導入するより
は、実際的であり、産業上有用である。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】本発明では、フラボン
合成酵素遺伝子、好ましくはフラボン合成酵素II遺伝
子、より好ましくはフラバノンから直接フラボンを合成
する活性を有するフラボン合成酵素の遺伝子を得ること
を課題とした。得られるフラボン合成酵素の遺伝子を植
物に導入し、過剰発現させることで、花色を変化させる
ことが可能である。
【００１２】また、従来フラボンを多量に含有する花の
花弁において、フラボン合成酵素遺伝子の発現をアンチ
センス法やコサプレッション法で抑制することで花色を
変化させることも期待できる。さらに、フラボンのもつ
抗菌作用や土壌微生物との相互作用への影響に着目し、
適当な器官においてフラボン合成酵素の遺伝子を発現さ
せることによって、植物の抗菌性の上昇や根圏微生物と
の共生促進によるマメ科植物の窒素固定能の向上、紫外
線や光に対する防御効果などが期待される。
【００１３】
【課題を解決するための手段】従って本発明は、フラバ
ノンから直接フラボンを合成することができるタンパク
質をコードする遺伝子を提供する。この遺伝子は、具体
的には、フラバノンからフラボンを単独の酵素による反
応で合成することができるフラボン合成酵素II（以下、
フラボン合成酵素IIと称する）をコードする遺伝子であ
る。
【００１４】より具体的には、本発明は、配列番号：
２，４又は８のいずれかに記載のアミノ酸配列を有し、
フラバノンからフラボンを合成する活性を有するP450タ
ンパク質をコードする遺伝子、あるいはそれらのアミノ
酸配列に対して１個又は複数個のアミノ酸の付加、欠失
及び／または他のアミノ酸による置換によって修飾され
ているアミノ酸配列を有し、フラバノンからフラボンを
合成する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を
提供する。本発明はまた、配列番号：２，４又は８のい
ずれかに記載のアミノ酸配列に対して55% 以上の相同性
を示すアミノ酸配列を有し、フラバノンからフラボンを
合成する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を
提供する。
【００１５】本発明はさらに、配列番号：１，３又は７
のいずれかに記載の塩基配列の一部または全部に対し
て、５ x SSC、50℃の条件下でハイブリダイズして得ら
れる、フラバノンからフラボンを合成する活性を有する
タンパク質をコードする遺伝子を提供する。本発明はさ
らに、前記いずれかの遺伝子を含んでなるベクター、特
に発現ベクターを提供する。
【００１６】本発明はまた、上記のベクターにより形質
転換された宿主を提供する。本発明はさらに、上記いず
れかの遺伝子によってコードされるタンパク質を提供す
る。本発明はさらに、上記の宿主を培養し、又は生育さ
せ、そして当該宿主からフラボンを合成する活性を有す
るタンパク質を採取することを特徴とする当該タンパク
質の製造方法を提供する。
【００１７】本発明はまた、前記いずれかの遺伝子が導
入された植物もしくはこれと同じ性質を有する該植物の
子孫またはそれらの組織、例えば切り花を提供する。本
発明はまた、前記の遺伝子を用いてフラボノイド成分と
量を変更する方法；前記の遺伝子を用いてフラボン量を
変化させる方法；前記の遺伝子を用いて花の色を変える
方法；前記の遺伝子を用いて花の色を青くする方法；前
記の遺伝子を用いて花の色を赤くする方法；前記の遺伝
子を用いて植物の光感受性を改変する方法；並びに前記
の遺伝子を用いて植物と微生物の相互作用を制御する方
法を提供する。
【００１８】
【発明の実施の形態】カンゾウのCYP93B1 遺伝子にコー
ドされるフラバノン- ２- 水酸化酵素が、フラバノンを
基質として2-ヒドロキシフラバノンを生成し、この生成
物を酸処理することによってフラボンが生じる。本発明
者らは、本発明で課題とするフラボン合成酵素IIをコー
ドする遺伝子を得るには、このカンゾウ由来のcDNA、CY
P93B1を用い、例えばフラボンを多量に含む花のcDNAラ
イブラリーをスクリーニングすれば、フラバノンを基質
として直接フラボンを合成する活性を有するタンパク質
をコードするcDNAを得ることができると考えた。
【００１９】本発明においては、フラボンを多量に含む
キンギョソウのcDNAライブラリーをカンゾウ由来のcDN
A、CYP93B1 をプローブとしてスクリーニングし、新た
なチトクロームP450をコードするcDNAを得た（実施例１
参照）。次に、こうして得られたキンギョソウのcDNA，
ANFNS2と先のカンゾウのCYP93B1 cDNAを混合プローブと
して用い、トレニア花弁cDNAライブラリーから新たなチ
トクロームP450をコードするcDNA, TFNS5 を得た（実施
例２参照）。
【００２０】このトレニア由来のcDNAを酵母で発現し、
フラバノンの一種であるナリンゲニンを基質として反応
させたところ、2-ヒドロキシナリンゲニンではなく、フ
ラボンであるアピゲニンが酸処理なしに生産された（実
施例３参照）。つまり、この酵素は、酸処理なしにフラ
バノンからフラボンを直接生産でき、この遺伝子は今ま
でクローニングされたことのないフラボン合成酵素IIで
あることが証明された。また、実施例１のキンギョソウ
由来のANFNS2がコードするアミノ酸配列は、TFNS5 のコ
ードするフラボン合成酵素IIと77％の高い相同性を示
し、フラボン合成酵素IIの酵素活性を示した（実施例
４）。さらにシソ由来のcDNAがコードするアミノ酸配列
もTFNS5 およびANFNS2とそれぞれ76％，75％の高い相同
性を示すことから（実施例８）、このcDNAがコードする
タンパク質もTFNS5 やANFNS2がコードするフラボン合成
酵素と同様の酵素活性をもつことが類推される。
【００２１】本発明の遺伝子としては、例えば配列表：
２，４又は８のいずれかに記載するアミノ酸配列をコー
ドするものが挙げられる。しかしながら、複数個のアミ
ノ酸の付加、欠失および／または他のアミノ酸との置換
によって修飾されたアミノ酸配列を有するタンパク質
も、もとのタンパク質と同様の酵素活性を維持すること
が知られている。従って本発明は、フラバノンから直接
フラボンを生成する活性を維持しているタンパク質であ
る限り、配列番号：２，４又は８のいずれかに記載のア
ミノ酸配列に対して１個または複数個のアミノ酸配列の
付加、欠失および／または他のアミノ酸との置換によっ
て修飾されたアミノ酸配列を有するタンパク質および当
該タンパク質をコードする遺伝子も本発明に属する。
【００２２】本発明はまた、配列番号：１，３又は７の
いずれかに記載の塩基配列もしくはそこに記載のアミノ
酸配列をコードする塩基配列、またはそれらの塩基配列
の一部分に対して、例えば5xSSC 、50℃の条件下でハイ
ブリダイズし、かつフラバノンからフラボンを生成する
活性を有するタンパク質をコードする遺伝子に関するも
のである。なお、適切なハイブリダイゼーション温度は
塩基配列やその塩基配列の長さによって異なり、例えば
アミノ酸６個をコードする18塩基からなるDNAフラグメ
ントをプローブとした場合には50℃以下の温度が好まし
い。
【００２３】このようなハイブリダイゼーションによっ
て選択される遺伝子としては、天然由来のもの、例えば
植物由来のもの、例えば、キンギョソウやトレニア、シ
ソ由来の遺伝子が挙げられるが、他の植物、例えばリン
ドウやバーベナ、キク、アイリスなどの遺伝子であって
もよい。また、ハイブリダイゼーションによって選択さ
れる遺伝子はcDNAであってもよく、ゲノムDNA であって
もよい。本発明はさらに配列番号：２，４又は８のいず
れかに記載のアミノ酸配列に対して55％以上、好ましく
は70％以上、例えば80％以上、場合によっては90％以上
の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつフラバノン
からフラボンを合成する活性を示すタンパク質をコード
する遺伝子に関するものである。
【００２４】生来の塩基配列を有する遺伝子は実施例に
具体的に示すように、例えばcDNAライブラリーのスクリ
ーニングによって得られる。また、修飾されたアミノ酸
配列を有する酵素をコードするDNA は生来の塩基配列を
有するDNA を基礎として、常用の部位特定変異誘発やPC
R 法を用いて合成することができる。例えば修飾を導入
したいDNA 断片を生来のcDNAまたはゲノムDNA の制限酵
素処理によって得、これを鋳型にして、所望の変異を導
入したプライマーを用いて部位特異的変異誘発またはPC
R 法を実施し、所望の修飾を導入したDNA 断片を得る。
その後、この変異を導入したDNA 断片を目的とする酵素
の他の部分をコードするDNA 断片と連結すればよい。
【００２５】あるいはまた、短縮されたアミノ酸配列か
らなる酵素をコードするDNA を得るには、例えば目的と
するアミノ酸配列より長いアミノ酸配列、例えば全長ア
ミノ酸配列をコードするDNA を所望の制限酵素により切
断し、その結果得られたDNA断片が目的とするアミノ酸
配列の全体をコードしていない場合は、不足部分の配列
からなるDNA 断片を合成し、連結すればよい。
【００２６】得られた遺伝子を大腸菌および酵母での遺
伝子発現系を用いて発現させ、酵素活性を測定すること
により、得られた遺伝子がフラボン合成酵素をコードす
ることを確認することができる。さらに、当該遺伝子を
発現させることにより、遺伝子産物であるフラボン合成
酵素タンパク質を得ることができる。あるいはまた、配
列番号：２，４又は８のいずれかに記載のアミノ酸配列
の全部あるいは一部に対する抗体を用いても、フラボン
合成酵素のタンパク質を得ることができ、抗体を用いて
他の生物のフラボン合成酵素遺伝子をクローン化するこ
ともできる。
【００２７】従って本発明はまた、前述の遺伝子を含む
組換えベクター、特に発現ベクター、及び当該ベクター
によって形質転換された宿主に関するものである。宿主
としては、原核生物または真核生物を用いることができ
る。原核生物としては細菌、例えばエシェリヒア（Esch
erichia ）属に属する細菌、例えば大腸菌（Escherichi
a coli）、バシルス（Bacillus）属微生物、例えばバシ
ルス. スブシルス（Bacillus subtilis ）など常用の宿
主を用いることができる。
【００２８】真核性宿主としては、下等真核生物、例え
ば真核性微生物、例えば真菌である酵母または糸状菌が
使用できる。酵母としては例えばサッカロミセス（Sacc
haromyces ）属微生物、例えばサッカロミセス. セレビ
シエ(Saccharomyces cerevisiae)等が挙げられ、また糸
状菌としてはアスペルギルス（Aspergillus ）属微生
物、例えばアスペルギルス. オリゼ（Aspergillus oryz
ae）、アスペルギルス.ニガー（Aspergillus niger
）、ペニシリウム（Penicillium ）属微生物が挙げら
れる。さらに動物細胞または植物細胞が使用でき、動物
細胞としては、マウス、ハムスター、サル、ヒト等の細
胞系が使用される。さらに昆虫細胞、例えばカイコ細
胞、またはカイコの成虫それ自体も宿主として使用され
る。
【００２９】本発明の発現ベクターはそれらを導入すべ
き宿主の種類に依存して発現制御領域、例えばプロモー
ターおよびターミネーター、複製起点等を含有する。細
菌用発現ベクターのプロモーターとしては、常用のプロ
モーター、例えばtrc プロモーター、tac プロモータ
ー、lac プロモーター等が使用され、酵母用プロモータ
ーとしては、例えばグリセルアルデヒド３リン酸デヒド
ロゲナーゼプロモーター、PH05プロモーター等が使用さ
れ、糸状菌用プロモーターとしては例えばアミラーゼ、
trpC等が使用される。また動物細胞宿主用プロモーター
としてはウイルス性プロモーター、例えばSV40アーリー
プロモーター、SV40レートプロモーター等が使用され
る。
【００３０】発現ベクターの作製は制限酵素、リガーゼ
等を用いて常用に従って行うことができる。また、発現
ベクターによる宿主の形質転換も常法に従って行うこと
ができる。前記の発現ベクターによって形質転換された
宿主を培養、栽培または飼育し、培養物等から常法に従
って、例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過
クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等
により目的とするタンパク質を回収、精製することがで
きる。
【００３１】本明細書においてはキンギョソウ、トレニ
ア及びシソ由来の、フラバノンから直接フラボンを合成
することができるフラボン合成酵素IIについて述べてい
るが、チトクロームP450遺伝子はスーパーファミリーを
形成しており（DNA and CellBiology, 12 (1993) Nelso
n et al., p.1）、同じファミリー内のチトクロームP45
0はアミノ酸配列で40% 以上の相同性を有し、あるいは
サブファミリー内のチトクロームP450はアミノ酸配列で
55% 以上の相同性を有し、遺伝子は互いにハイブリダイ
ズすることが知られている（Pharmacogenetics, 6 (199
6) Nelson et al., p1）。
【００３２】たとえば、チトクロームP450の一種でやは
りフラボノイド合成経路に属するフラボノイド3'，5'水
酸化酵素遺伝子は、最初にペチュニアから単離されたが
（Nature, 366 (1993) Holton et al., p.276 ）、ペチ
ュニアのフラボノイド3'，5'水酸化酵素遺伝子をプロー
ブに用いて、リンドウ（Plant Cell Physiol., 37 (199
6) Tanaka et al., p.711 ）、トルコギキョウ、ベルフ
ラワー（WO93/18155 (1993) Kikuchi et al.）、ラベン
ダー、トレニア、バーベナ（植物の化学調節、33 (199
8) 田中ら、p.55）のフラボノイド3'，5'水酸化酵素遺
伝子が容易に単離されている。
【００３３】よって、本発明に係るキンギョソウ、トレ
ニアあるいはシソ由来の、フラバノンから直接フラボン
を合成することができるフラボン合成酵素II遺伝子の一
部または全部をプローブとして用いることによって、別
種の植物から、フラバノンから直接フラボンを合成する
ことができるフラボン合成酵素IIの遺伝子を得ることが
できる。また、本明細書において示したキンギョソウ、
トレニアまたはシソ由来の、フラバノンから直接フラボ
ンを合成することができるフラボン合成酵素IIを精製
し、常法に従って当該酵素に対する抗体を得ることによ
り、その抗体と反応する別のフラボン合成酵素IIのタン
パク質を得、当該タンパク質をコードする遺伝子を得る
ことができる。
【００３４】従って、本発明はキンギョソウ、トレニア
あるいはシソ由来の、フラバノンから直接フラボンを合
成することができるフラボン合成酵素IIの遺伝子のみに
限定されるものではなく、広く他の植物由来の、フラバ
ノンから直接フラボンを合成することができるフラボン
合成酵素IIに関するものである。このようなフラボン合
成酵素II遺伝子の起源としては、ここで述べたキンギョ
ソウ、トレニア及びシソ以外にも、リンドウ、バーベ
ナ、キク、アイリス、シソ、ツユクサ、ヤグルマギク、
サルビア、ネモフィラなどがあるが、本発明の範囲はこ
れらの植物に限定されるものではない。
【００３５】さらに本発明は、フラバノンから直接フラ
ボンを合成することができるフラボン合成酵素IIの遺伝
子を導入することにより、色合いが調節された植物もし
くはその子孫又はこれらの組織に関するものであり、そ
の形態は切り花であってもよい。本発明でクローニング
したフラボン合成酵素IIあるいはその遺伝子を用いる
と、フラボンを全く、あるいはわずかしか生産していな
い植物種、あるいは品種においてフラボンを生産するこ
とができる。花弁において本フラボン合成酵素II遺伝子
を発現させることによって、花弁においてフラボンの量
を増やすことができ、その結果、たとえば花の色を青い
方向に改変できる。
【００３６】また、花弁においてフラボンの合成を抑制
すれば、花の色をたとえば赤い方向に改変することがで
きる。ただし、フラボンが花色におよぼす効果は多彩で
あり花の色の変化はここに述べたものに限定されるもの
ではない。現在の技術水準をもってすれば、植物に遺伝
子を導入し、その遺伝子を構成的あるいは組織特異的に
発現させることは可能であるし、またアンチセンス法や
コサプレッション法によって目的の遺伝子の発現を抑制
することも可能である。
【００３７】形質転換可能な植物の例としては、バラ、
キク、カーネーション、キンギョソウ、シクラメン、ラ
ン、トルコギキョウ、フリージア、ガーベラ、グラジオ
ラス、カスミソウ、カランコエ、ユリ、ペラルゴニウ
ム、ゼラニウム、ペチュニア、トレニア、チューリッ
プ、イネ、オオムギ、コムギ、ナタネ、ポテト、トマ
ト、ポプラ、バナナ、ユーカリ、サツマイモ、タイズ、
アルファルファ、ルーピン、トウモロコシなどがあげら
れるがこれらに限定されるものではない。
【００３８】また、フラボンは前述のようにさまざまな
生理活性を有するので、植物に新しい生理活性や経済的
価値を付与することができる。例えば根において本遺伝
子を発現させフラボンを生産すれば、植物にとって有益
な微生物の増殖を促すことができ、植物の生育を促進す
ることができる。また、ヒトや動物、昆虫に対し生理活
性を示すフラボン類を合成させることもできる。
【００３９】
【実施例】以下実施例に従って、発明の詳細を述べる。
分子生物学的手法はとくに断らない限り、Molecular Cl
oning （Sambrook et al., 1989 ）に依った。実施例１ ．キンギョソウフラボン合成酵素II遺伝子のク
ローニング キンギョソウ、エローバタフライ（販売名：株式会社サ
カタのタネ）の若いつぼみ約５ｇからRNA を抽出し、オ
リゴテックスによりポリA+RNA を得た。このポリA+RNA
を鋳型とし、ラムダZAPII cDNAライブラリー合成キット
（Stratagene社) を用いて、Stratagene社の推奨する方
法（Stratagene社 Instruction Manual,Revision ＃065
001）によりcDNAライブラリーを作製した。このcDNAラ
イブラリーをCYP93B1 のcDNA全長をプローブとしてスク
リーニングした。スクリーニングならびに陽性クローン
の検出は、DIG-DNA 標識検出キット（ベーリンガー社）
を用いて、同社が推奨する方法を基本とし、下記のよう
な低ストリンジェントな条件で行った。
【００４０】すなわち、ハイブリダイゼーションバッフ
ァー（5 x SSC, 30%ホルムアミド、50 mM リン酸ナトリ
ウムバッファー（pH 7.0）、1% SDS、2%ブロッキング試
薬（ベーリンガー社）、0.1%ラウロイルサルコシン、80
μg/mlサケ精子DNA ）を用い、42℃で2 時間プレハイブ
リダイゼーションを行った後、DIG 標識したプローブを
加え、さらに一晩保持した。メンブレンは1% SDSを含む
5 x SSC洗浄液中、65℃で1.5 時間洗浄した。1 個の陽
性クローンが得られ、ANFNS1と命名した。ANFNS1の5'末
端の塩基配列を決定したところANFNS1はカンゾウCYP93B
1 のコードするフラバノン‐2 ‐水酸化酵素と高い相同
性を有する配列をコードしており、フラバノン‐2 ‐水
酸化酵素と類似の機能をもつP450をコードするものと推
測された。
【００４１】しかし、CYP93B1 にコードされるフラバノ
ン‐2 ‐水酸化酵素のアミノ酸配列との比較の結果、AN
FNS1の cDNA は開始メチオニンから約65アミノ酸残基に
相当する部分を欠く、不完全長のcDNAであると考えられ
た。そこで、ANFNS1の cDNAをプローブとして再度キン
ギョソウのcDNAライブラリーをスクリーニングしたとこ
ろ、全長のアミノ酸配列を含むと考えられるcDNA (ANFN
S2) を得た。ここで得られたANFNS2にコードされるタン
パク質はカンゾウのCYP93B1 にコードされるフラバノン
‐2 ‐水酸化酵素とアミノ酸レベルで53％のホモロジー
を示した。ANFNS2の塩基配列を配列番号：１に示し、そ
してそれから推察されるアミノ酸配列を配列番号２に示
す。
【００４２】実施例２．トレニアフラボン合成酵素II遺
伝子のクローニング トレニア品種（品種名称：サンレニブ、種苗法による品
種登録出願番号：7433号、サントリー株式会社）のつぼ
み約2gからRNA を抽出し、オリゴテックスによりポリA+
RNA を得た。このポリA+RNA を鋳型とし、ラムダZAPII
cDNAライブラリー合成キット（Stratagene社) を用い
て、実施例１で述べたようにStratagene社の推奨する方
法によりcDNAライブラリーを作製した。このcDNAライブ
ラリーを前述のCYP93B1 cDNAならびに ANFNS1 cDNAの混
液をプローブとしてスクリーニングした。スクリーニン
グならびに陽性クローンの検出は、実施例1 で述べた緩
い条件で行なった。
【００４３】１種類の陽性クローンが得られ、TFNS5 と
命名した。TFNS5 cDNAの全塩基配列を決定したところ、
TFNS5 cDNAにコードされるタンパク質は、カンゾウCYP9
3B1にコードされるフラバノン‐2 ‐水酸化酵素とアミ
ノ酸レベルで52% の相同性を示した。また、このTFNS5
cDNAは、実施例１で得られたキンギョソウ由来のcDNA、
ANFNS ２にコードされるタンパク質とは77％の高い相同
性があった。決定した塩基配列を配列番号：３に示し、
そしてそれから推察されるアミノ酸配列を配列番号：４
に示す。
【００４４】実施例３．トレニアフラボン合成酵素II遺
伝子の酵母における発現 実施例２で得られたトレニアのcDNAであるTFNS5 にコー
ドされるタンパク質の酵素活性を検出するために、以下
の実験を行なった。この遺伝子の翻訳領域の外側の一部
を改変して制限酵素部位を導入したセンスプライマー
（5'-AAATAGGATCCAAGCatgGACACAGTCTTAA-3' ；下線、Ba
mHI 部位；小文字、開始コドン）（配列番号：５）及び
アンチセンスプライマー(5'-CCCTTCTAGAtcaAGCACCCGATA
TTGTGGCCGGG-3'；下線、XbaI部位；小文字、終始コド
ン）（配列番号：６）、並びにKOD ポリメラーゼ（東洋
紡）を用いてPCR を行った。PCR 条件は98℃ 1分、（98
℃ 15秒、55℃ 10 秒、74℃ 30 秒）を20サイクル、74
℃ 10 分である。
【００４５】得られたPCR 産物はpBluescriptII SK‐
（Stratagene社）のEcoRV 部位に導入後、制限酵素BamH
I とXbaIにより消化し、酵母発現ベクターpYES2 （Invi
trogen社) のBamHI-XbaIに導入した。得られたプラスミ
ドを酵母BJ2168（日本ジーン社）へ導入した。明石らの
文献に述べられた方法（FEBS Lett., 431 (1998) Akash
i et al., p.287 ）で酵素活性を測定した。すなわち、
得られた形質転換酵母を20 ml の選択培地（6.7 mg/ml
yeast nitrogen base without amino acids (Difco
社) 、20mg/ml グルコース、30μg/mlロイシン、20μg/
mlトリプトファン、5 mg/ml カザミノ酸）で、30℃ 24
時間培養した。
【００４６】酵母細胞を遠心して回収後、その回収酵母
を発現培地（10 mg/ml酵母エキス、10 mg/mlペプトン、
2 μg/mlヘミン、20 mg/mlガラクトース）で30℃、48時
間培養した。この酵母を集菌後、水に懸濁し、再び集菌
することにより洗浄した。ガラスビーズを用いて10分間
破砕し、8,000xg 、10分間遠心した。この上清をさらに
15,000xgで10分間遠心することにより粗酵素画分を得
た。
【００４７】15μg (R,S) −ナリンゲニン（30μl の2-
メトキシエタノールに溶解）、1 mlの粗酵素液及び1 mM
の NADPHを混合し（総反応液量1.05ml）、30℃にて 2時
間反応させた。30μl の酢酸を加えて反応を停止した
後、1 mlの酢酸エチルを加え、混合した。遠心分離後、
酢酸エチル層をエバポレーターで乾燥させた。これを10
0 μl のメタノールに溶解し、HPLCにて分析した。分析
は明石らの文献に依った。酸処理は、エバポレーターで
乾燥させた標品を150 μl の10％の塩酸を含むエタノー
ルに溶解し30分間攪拌した。これを1.3 mlの水で希釈
し、さらに800 μlの酢酸エチルを加えて混合し、遠心
後、酢酸エチル層を回収した。これを乾燥した後、200
μl のメタノールに溶解し、HPLCにて分析した。
【００４８】カンゾウのCYP93B1 を発現している酵母で
はナリンゲニンから２−ヒドロキシナリンゲニンが生
じ、アピゲニンは生産されていなかった（図１、Ａ）。
この反応液を酸処理することによって２−ヒドロキシナ
リンゲニンからアピゲニンがはじめて生じた（図１、
Ｂ）。これに対して、トレニアTFNS5 を発現している酵
母では、反応液の酸処理なしに、ナリンゲニンからアピ
ゲニンが生産された（図１、Ｃ）。このことからTFNS5
はフラボン合成酵素IIをコードしていることが明らかと
なった。
【００４９】実施例４．キンギョソウフラボン合成酵素
II遺伝子の酵母における発現 ANFNS2 cDNA をBamHI とSphIで消化して得られる約1400
bpのDNA 断片と、SphIとBamHI で消化して得られる約35
0bp のDNA 断片と、BamHI とXhoIで消化したpYES2 とを
ライゲーションして得られたプラスミドを、実施例３に
記載と同様な方法で酵母へ導入した。得られた組換え酵
母を用いて、実施例３に記載と同様の方法でフラボン合
成活性を測定した。キンギョソウ由来のANFNS2を発現し
ている酵母では、酸処理無しに、アピゲニンが生産さ
れ、ANFNS2はフラボン合成酵素IIをコードしていること
が明らかとなった。
【００５０】実施例５．植物での発現ベクターの構築 実施例２で得られたトレニアのcDNA、TFNS5 を植物体へ
導入するため、植物発現ベクターを構築した。まず、pB
E2113 −GUS (Plant Cell Physiol., 37 (1996) Mitsuh
ara et al., p.49) をSacIで消化後、ブランティングキ
ット（タカラ）を用いて、平滑末端にした後、XhoIリン
カー（東洋紡）を挿入した。得られたプラスミドをHind
III とEcoRI で消化し、約3kb のDNA 断片を回収した。
このDNA断片をバイナリーベクター pBINPLUS のHindIII
/EcoRI サイトに連結し、pBE2113'とした。なお、今回
用いたベクターpBINPLUSは、アグロバクテリウムを介し
た植物への遺伝子導入の際に広く用いられているバイナ
リーベクターBin19 （Nucl. Acids. Res., 12 (1984) B
evan, p.8711）を、Engelen らの報告（TransgenicRese
arch, 4 (1995) van Engelen et al., p.288 ）のよう
に改変して得られたものである。
【００５１】TFNS5 cDNAをBamHI/XhoI切断によってSK−
ベクターから切り出し、得られた約1.7kb フラグメント
を前述のバイナリーベクターpBE2113'のBamHI/XhoIサイ
トに連結した。このようにして得られたコンストラク
ト、pSPB441 は、エンハンサー配列を2 回繰り返した35
S カリフラワーモザイクウイルスプロモーターの制御下
(Plant Cell Physiol., 37 (1996) Mitsuhara et al.,
p.49) 、TFNS5 cDNAをセンス方向に発現させるものであ
る。
【００５２】実施例６．トレニアの花色変化 トレニア品種（品種名称：サンレニブ、種苗法による品
種登録出願番号：7433号、サントリー株式会社）を間ら
の方法（Breeding Science, 45 (1995) Aida et al.,
p.71 ）に従い、上の実施例５で構築したpSPB441 で形
質転換した。得られた形質転換体の95％以上で、花の色
が元株の濃い紫色から薄い紫色に変化していた。４枚の
花弁のうち、左右の花弁の色を測定した。元株の花弁の
色はイギリス王立園芸協会カラーチャート（The Royal
Horticultural Society Color Chart ）ナンバー８９A
であったが、形質転換体の花弁の代表的な色は、82C 、
87D、87C 、88D 、91A などであった。この結果、TFNS5
を植物体へ導入することにより、花色を改変できるこ
とが示された。
【００５３】これら形質転換体の個体では、フラボンの
量が宿主の５分の１から１０分の１に、アントシアニン
の量が宿主の約３分の１程度に減少していた。また、宿
主では検出されなかったフラボン生合成の前駆体である
フラバノン（ナリンゲニン、エリオジクチオールおよび
ペンタヒドロキシフラバノン）が検出された。
【００５４】実施例７．ペチュニアでのフラボン合成酵
素の発現 ペチュニア（品種名称：レボリューション・バイオレッ
トミニ、種苗法による品種登録出願番号：9217号、サン
トリー株式会社）にNapoliら（Plant Cell, 2,（1990）
Napoli et al., p.279）らの方法により、pSPB441 を導
入した。得られた形質転換体のうち２株で、花色の変化
が認められ、花色が薄くなった。元株の花色は、イギリ
ス王立園芸協会カラーチャートナンバー88Ａであった
が、これらの形質転換株では87Ａであった。また、元株
ではフラボンが検出されなかったが、これら形質転換体
の株ではフラボンの一種であるルテオリンが検出され
た。
【００５５】実施例８．シソフラボン合成酵素II遺伝子
のクローニング 赤ジソ（Perilla frutescens）の葉からGong等の方法
（Plant Mol. Biol.,35, （1997）Gong et al., p.91
5）で作製したλgt10（Stratagene社）をベクターにし
たcDNAライブラリーを実施例１に記載したような方法で
スクリーニングした。得られたファージクローン＃３を
Gong等の方法（Plant Mol. Biol., 35, （1997）Gong e
t al., p.915）にしたがって培養、DNA 調製、サブクロ
ーニングを行ない、塩基配列を決定、配列番号：７に示
した。この塩基配列がコードすると推定されるアミノ酸
配列を配列番号：８に示した。このアミノ酸配列は、TF
NS5,ANFNS2 に対して、それぞれ76％、75％の相同性を
示した。また、CYP93B1 に対しては52％の相同性を示し
た。
【００５６】実施例９．シソフラボン合成酵素II遺伝子
の酵母での発現 実施例８で得たファージクローン＃３を鋳型にし、ラム
ダアームプライマー（Stratagene社）を用い、実施例３
に述べたような方法によりPCR を行なった。増幅された
DNA 断片をpBluescript KS−のEcoRV サイトにサブクロ
ーニングした。pBluescript KS−上のSalIサイト側にシ
ソフラボン合成酵素IIcDNAの開始コドンがあるクローン
を選択し、これをpFS3と称した。pFS3の挿入cDNAの塩基
配列を決定し、PCR によるエラーがないことを確認し
た。
【００５７】pFS3をSalIとXbaIで消化して得られる約1.
8kb のDNA 断片とXhoIとXbaIで消化したpYES2 （実施例
３）をライゲーションして得られたプラスミドをpYFS3
とし、これを実施例３に述べたような方法で酵母BJ2168
に導入した。この組換え酵母を用いて、フラボン合成酵
素活性を実施例３に述べたような方法で測定したとこ
ろ、ナリンゲニンからアピゲニンの生成が認められ、シ
ソファージクローン＃３のcDNAがフラボン合成酵素II活
性をコードしていることが示された。
【００５８】
【発明の効果】本発明のcDNAを適当な植物発現ベクター
に接続し、植物に導入し、フラボン合成酵素を発現させ
たり、発現を抑制することにより、花色を改変出来るよ
うになった。さらに、花弁だけではなく植物体全体また
は適当な器官において本フラボン合成酵素遺伝子を発現
させることによって、植物の抗菌性の上昇や根圏微生物
との共生促進によるマメ科植物の窒素固定能、植物の紫
外線や光に対する防御効果の向上などが可能となる。
【００５９】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> SUNTORY LIMITED <120> Gene coding for flavone synthesizing enzyme <130> 993009 <160> 6 <210> 1 <211> 1724 <212> DNA <213> Antirrhinum majus <220> <223> Nucleotide sequence coding for a protein having an activity to dir ectly convert flavanone to flavone <400> 1 gctttacaca cacacacaca cacacacaca caaacaaaa atg tct aca ctt gtc 54 Met Ser Thr Leu Val 1 5 tac agc aca ctc ttc atc ctc tca acc ctc ctc ctc acc ctc cta acc 102 Tyr Ser Thr Leu Phe Ile Leu Ser Thr Leu Leu Leu Thr Leu Leu Thr 10 15 20 cgc acc cgc cgc aag acc cgc ccg ccc ggc cca tta gcc ctc ccc tta 150 Arg Thr Arg Arg Lys Thr Arg Pro Pro Gly Pro Leu Ala Leu Pro Leu 25 30 35 ata ggc cac tta cac ctc ctc ggc cca aag ctc cac cac acc ttc cac 198 Ile Gly His Leu His Leu Leu Gly Pro Lys Leu His His Thr Phe His 40 45 50 caa ttc tcc caa cgc tac ggc ccg ctc atc cag ctc tac ctc ggc tcc 246 Gln Phe Ser Gln Arg Tyr Gly Pro Leu Ile Gln Leu Tyr Leu Gly Ser 55 60 65 gtc cca tgc gtc gtc gct tcc acg ccc gaa ctc gcc cgc gaa ttc ctc 294 Val Pro Cys Val Val Ala Ser Thr Pro Glu Leu Ala Arg Glu Phe Leu 70 75 80 85 aag acg cac gaa ctc gac ttc tcg tcc cgc aag cac tcc acc gcc atc 342 Lys Thr His Glu Leu Asp Phe Ser Ser Arg Lys His Ser Thr Ala Ile 90 95 100 gac atc gtc acg tac gac tcc tcg ttc gcc ttc gcg ccg tac ggg ccg 390 Asp Ile Val Thr Tyr Asp Ser Ser Phe Ala Phe Ala Pro Tyr Gly Pro 105 110 115 tac tgg aaa ttc atc aag aaa tta tgt act tac gag cta ctg ggt gcc 438 Tyr Trp Lys Phe Ile Lys Lys Leu Cys Thr Tyr Glu Leu Leu Gly Ala 120 125 130 cgg aac ttg agc cat ttc cag ccc att aga gct ttg gag gtc aac agt 486 Arg Asn Leu Ser His Phe Gln Pro Ile Arg Ala Leu Glu Val Asn Ser 135 140 145 ttc ttg aga att ttg tac gag aaa aca gag cag aaa cag agt gtt aat 534 Phe Leu Arg Ile Leu Tyr Glu Lys Thr Glu Gln Lys Gln Ser Val Asn 150 155 160 165 gtg act gag gag ctt gtg aag ctg acg agt aat gtg atc agt aac atg 582 Val Thr Glu Glu Leu Val Lys Leu Thr Ser Asn Val Ile Ser Asn Met 170 175 180 atg ttg ggg atc agg tgt tcg ggg acg gaa ggg gag gcg gag gtg gcg 630 Met Leu Gly Ile Arg Cys Ser Gly Thr Glu Gly Glu Ala Glu Val Ala 185 190 195 agg acg gtg ata agg gag gtg acg cag ata ttt ggg gag ttt gat gtg 678 Arg Thr Val Ile Arg Glu Val Thr Gln Ile Phe Gly Glu Phe Asp Val 200 205 210 tcg gag att gtt tgg ttt tgt aag aat ttg gat ctg cag ggg att agg 726 Ser Glu Ile Val Trp Phe Cys Lys Asn Leu Asp Leu Gln Gly Ile Arg 215 220 225 aag agg tcg gag gat att agg agg agg tat gat gct ttg ttg gag aag 774 Lys Arg Ser Glu Asp Ile Arg Arg Arg Tyr Asp Ala Leu Leu Glu Lys 230 235 240 245 att att agt gat agg gag agg ttg agg ttg agg ggg ggt ggt ggt gga 822 Ile Ile Ser Asp Arg Glu Arg Leu Arg Leu Arg Gly Gly Gly Gly Gly 250 255 260 ggg ggt gga gag gtg aag gat ttt ttg gat atg ttg ttg gat gtg atg 870 Gly Gly Gly Glu Val Lys Asp Phe Leu Asp Met Leu Leu Asp Val Met 265 270 275 gag agt gag aaa tcg gag gtg gag ttt acg agg gag cat ctc aaa gct 918 Glu Ser Glu Lys Ser Glu Val Glu Phe Thr Arg Glu His Leu Lys Ala 280 285 290 ttg att ctg gat ttc ttc act gcc ggt aca gac aca aca gca atc aca 966 Leu Ile Leu Asp Phe Phe Thr Ala Gly Thr Asp Thr Thr Ala Ile Thr 295 300 305 aca gaa tgg gca ata gca gaa ctc att agc aat cca aat gta ctc aaa 1014 Thr Glu Trp Ala Ile Ala Glu Leu Ile Ser Asn Pro Asn Val Leu Lys 310 315 320 325 aaa gct caa gaa gag atg gac aaa gtc ata gga tca caa agg ttg ttg 1062 Lys Ala Gln Glu Glu Met Asp Lys Val Ile Gly Ser Gln Arg Leu Leu 330 335 340 caa gaa tcc gac gcc cct aac ttg cct tac ctc aac gcg atc ata aaa 1110 Gln Glu Ser Asp Ala Pro Asn Leu Pro Tyr Leu Asn Ala Ile Ile Lys 345 350 355 gaa acg ttc cgt ctc cac cct cca atc ccc atg ctc act aga aaa tca 1158 Glu Thr Phe Arg Leu His Pro Pro Ile Pro Met Leu Thr Arg Lys Ser 360 365 370 att tct gac gtt gtg gtc aac ggg tac acg atc cct gcc aaa acg cta 1206 Ile Ser Asp Val Val Val Asn Gly Tyr Thr Ile Pro Ala Lys Thr Leu 375 380 385 ttg ttt gtc aac ctt tgg tcc atg gga agg aat cct aac tac tgg gaa 1254 Leu Phe Val Asn Leu Trp Ser Met Gly Arg Asn Pro Asn Tyr Trp Glu 390 395 400 405 aat ccg atg gag ttc cga ccc gag agg ttt ctc gag aaa ggg acc ggg 1302 Asn Pro Met Glu Phe Arg Pro Glu Arg Phe Leu Glu Lys Gly Thr Gly 410 415 420 tcg ata gac gtt aaa ggg cag cat ttc gag ttg ctg ccg ttt ggc acg 1350 Ser Ile Asp Val Lys Gly Gln His Phe Glu Leu Leu Pro Phe Gly Thr 425 430 435 ggc agg cgg ggc tgc ccg ggg atg ttg tta ggc atg cag gag ttg ttt 1398 Gly Arg Arg Gly Cys Pro Gly Met Leu Leu Gly Met Gln Glu Leu Phe 440 445 450 agt att atc ggg gct atg gtg cag tgc ttc gat tgg aaa ctg ccc gat 1446 Ser Ile Ile Gly Ala Met Val Gln Cys Phe Asp Trp Lys Leu Pro Asp 455 460 465 ggt gtg aag tcg gtc gac atg acc gag cgg ccc ggg ttg acg gct cca 1494 Gly Val Lys Ser Val Asp Met Thr Glu Arg Pro Gly Leu Thr Ala Pro 470 475 480 485 cgt gcc aat gat ttg gtg tgc caa ttg gtg cca cgg att gac ccg gtc 1542 Arg Ala Asn Asp Leu Val Cys Gln Leu Val Pro Arg Ile Asp Pro Val 490 495 500 gtt gtc tcc gga ccg tgaaccttaa ggtagtatcg ataatctgtt taatt 1592 Val Val Ser Gly Pro 505 aaattgttat ttgttgtgag gatttgattt ttgttatgta tgattatgcg tggattaaga 1652 taagcctgca aggacaaatt ccctttcttt gattgatgtc aatgagtttg tgtcaaaaaa 1712 aaaaaaaaaa aa 1724
【００６０】 <210> 2 <211> 506 <212> PRT <213> Antirrhinum majus <220> <223> Amino acid sequence of a protein having an activity to directly co nvert flavanone to flavone <400> 2 Met Ser Thr Leu Val Tyr Ser Thr Leu Phe Ile Leu Ser Thr Leu Leu 1 5 10 15 Leu Thr Leu Leu Thr Arg Thr Arg Arg Lys Thr Arg Pro Pro Gly Pro 20 25 30 Leu Ala Leu Pro Leu Ile Gly His Leu His Leu Leu Gly Pro Lys Leu 35 40 45 His His Thr Phe His Gln Phe Ser Gln Arg Tyr Gly Pro Leu Ile Gln 50 55 60 Leu Tyr Leu Gly Ser Val Pro Cys Val Val Ala Ser Thr Pro Glu Leu 65 70 75 80 Ala Arg Glu Phe Leu Lys Thr His Glu Leu Asp Phe Ser Ser Arg Lys 85 90 95 His Ser Thr Ala Ile Asp Ile Val Thr Tyr Asp Ser Ser Phe Ala Phe 100 105 110 Ala Pro Tyr Gly Pro Tyr Trp Lys Phe Ile Lys Lys Leu Cys Thr Tyr 115 120 125 Glu Leu Leu Gly Ala Arg Asn Leu Ser His Phe Gln Pro Ile Arg Ala 130 135 140 Leu Glu Val Asn Ser Phe Leu Arg Ile Leu Tyr Glu Lys Thr Glu Gln 145 150 155 160 Lys Gln Ser Val Asn Val Thr Glu Glu Leu Val Lys Leu Thr Ser Asn 165 170 175 Val Ile Ser Asn Met Met Leu Gly Ile Arg Cys Ser Gly Thr Glu Gly 180 185 190 Glu Ala Glu Val Ala Arg Thr Val Ile Arg Glu Val Thr Gln Ile Phe 195 200 205 Gly Glu Phe Asp Val Ser Glu Ile Val Trp Phe Cys Lys Asn Leu Asp 210 215 220 Leu Gln Gly Ile Arg Lys Arg Ser Glu Asp Ile Arg Arg Arg Tyr Asp 225 230 235 240 Ala Leu Leu Glu Lys Ile Ile Ser Asp Arg Glu Arg Leu Arg Leu Arg 245 250 255 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Val Lys Asp Phe Leu Asp Met 260 265 270 Leu Leu Asp Val Met Glu Ser Glu Lys Ser Glu Val Glu Phe Thr Arg 275 280 285 Glu His Leu Lys Ala Leu Ile Leu Asp Phe Phe Thr Ala Gly Thr Asp 290 295 300 Thr Thr Ala Ile Thr Thr Glu Trp Ala Ile Ala Glu Leu Ile Ser Asn 305 310 315 320 Pro Asn Val Leu Lys Lys Ala Gln Glu Glu Met Asp Lys Val Ile Gly 325 330 335 Ser Gln Arg Leu Leu Gln Glu Ser Asp Ala Pro Asn Leu Pro Tyr Leu 340 345 350 Asn Ala Ile Ile Lys Glu Thr Phe Arg Leu His Pro Pro Ile Pro Met 355 360 365 Leu Thr Arg Lys Ser Ile Ser Asp Val Val Val Asn Gly Tyr Thr Ile 370 375 380 Pro Ala Lys Thr Leu Leu Phe Val Asn Leu Trp Ser Met Gly Arg Asn 385 390 395 400 Pro Asn Tyr Trp Glu Asn Pro Met Glu Phe Arg Pro Glu Arg Phe Leu 405 410 415 Glu Lys Gly Thr Gly Ser Ile Asp Val Lys Gly Gln His Phe Glu Leu 420 425 430 Leu Pro Phe Gly Thr Gly Arg Arg Gly Cys Pro Gly Met Leu Leu Gly 435 440 445 Met Gln Glu Leu Phe Ser Ile Ile Gly Ala Met Val Gln Cys Phe Asp 450 455 460 Trp Lys Leu Pro Asp Gly Val Lys Ser Val Asp Met Thr Glu Arg Pro 465 470 475 480 Gly Leu Thr Ala Pro Arg Ala Asn Asp Leu Val Cys Gln Leu Val Pro 485 490 495 Arg Ile Asp Pro Val Val Val Ser Gly Pro 500 505
【００６１】 <210> 3 <211> 1730 <212> DNA <213> Torenia hybrida <220> <223> Nucleotide sequence coding for a protein having an activity to dir ectly convert flavanone to flavone <400> 3 atcgaaaccg ctatatcatt acatttacaa cagcgctaaa aaaatatata taaagc 56 atg gac aca gtc tta atc aca ctc tac acc gcc ctg ttc gtc atc acc 104 Met Asp Thr Val Leu Ile Thr Leu Tyr Thr Ala Leu Phe Val Ile Thr 1 5 10 15 acc acc ttc ctc ctc ctc ctc cgc cga agg gga cca ccg tct ccg ccc 152 Thr Thr Phe Leu Leu Leu Leu Arg Arg Arg Gly Pro Pro Ser Pro Pro 20 25 30 ggt cct ctc tcc cta ccc ata att ggc cac ctc cac ctc ctc ggc cca 200 Gly Pro Leu Ser Leu Pro Ile Ile Gly His Leu His Leu Leu Gly Pro 35 40 45 aga ctc cac cac acg ttc cat gaa ttc tca ctc aaa tac ggc cca ttg 248 Arg Leu His His Thr Phe His Glu Phe Ser Leu Lys Tyr Gly Pro Leu 50 55 60 atc cag ctc aag ctc ggc tcg atc ccg tgc gtc gtg gcc tcg acg ccc 296 Ile Gln Leu Lys Leu Gly Ser Ile Pro Cys Val Val Ala Ser Thr Pro 65 70 75 80 gag ctc gcg aga gag ttt ctt aag acg aac gag ctc gcg ttc tcc tct 344 Glu Leu Ala Arg Glu Phe Leu Lys Thr Asn Glu Leu Ala Phe Ser Ser 85 90 95 cgc aag cac tct acg gcc ata gac atc gtc acc tac gac tcg tcc ttt 392 Arg Lys His Ser Thr Ala Ile Asp Ile Val Thr Tyr Asp Ser Ser Phe 100 105 110 gct ttc tct ccg tac gga ccc tac tgg aag tac atc aag aaa ctg tgt 440 Ala Phe Ser Pro Tyr Gly Pro Tyr Trp Lys Tyr Ile Lys Lys Leu Cys 115 120 125 acc tac gag ctg ctc gga gcg agg aac ctc gga cac ttt cag ccc att 488 Thr Tyr Glu Leu Leu Gly Ala Arg Asn Leu Gly His Phe Gln Pro Ile 130 135 140 agg aat ctc gag gtc agg tcc ttt ctg cag ctt ctg atg cac aag agc 536 Arg Asn Leu Glu Val Arg Ser Phe Leu Gln Leu Leu Met His Lys Ser 145 150 155 160 ttt aag ggc gag agt gtg aat gtg aca gac gag ctg gtg agg ctg acg 584 Phe Lys Gly Glu Ser Val Asn Val Thr Asp Glu Leu Val Arg Leu Thr 165 170 175 agc aat gtg ata tcc cac atg atg ctg agc ata agg tgc tcg gaa gat 632 Ser Asn Val Ile Ser His Met Met Leu Ser Ile Arg Cys Ser Glu Asp 180 185 190 gaa ggc gat gct gag gcg gcg aga aca gtg ata cgc gag gtg acg cag 680 Glu Gly Asp Ala Glu Ala Ala Arg Thr Val Ile Arg Glu Val Thr Gln 195 200 205 ata ttt ggg gaa ttc gat gtt acg gac ata ata tgg ttt tgc aag aaa 728 Ile Phe Gly Glu Phe Asp Val Thr Asp Ile Ile Trp Phe Cys Lys Lys 210 215 220 ttc gat ctg cag ggg ata aag aag agg tca gag gat att cag agg agg 776 Phe Asp Leu Gln Gly Ile Lys Lys Arg Ser Glu Asp Ile Gln Arg Arg 225 230 235 240 tat gat gct ttg ctc gag aag att att agt gat aga gag aga tcg agg 824 Tyr Asp Ala Leu Leu Glu Lys Ile Ile Ser Asp Arg Glu Arg Ser Arg 245 250 255 agg caa aat cgt gat aag cat ggt ggc ggt aac aat gag gag gcc aag 872 Arg Gln Asn Arg Asp Lys His Gly Gly Gly Asn Asn Glu Glu Ala Lys 260 265 270 gat ttt ctt gat atg ttg ctt gat gtg atg gag agt ggg gac acg gag 920 Asp Phe Leu Asp Met Leu Leu Asp Val Met Glu Ser Gly Asp Thr Glu 275 280 285 gtc aaa ttc act aga gag cat ctc aag gct ttg att ctg gat ttc ttc 968 Val Lys Phe Thr Arg Glu His Leu Lys Ala Leu Ile Leu Asp Phe Phe 290 295 300 acg gcc ggt acg gac aca aca gcc ata gcc acc gag tgg gcc atc gcc 1016 Thr Ala Gly Thr Asp Thr Thr Ala Ile Ala Thr Glu Trp Ala Ile Ala 305 310 315 320 gag ctc atc aac aac ccg aac gtc ttg aag aag gcc caa gaa gaa ata 1064 Glu Leu Ile Asn Asn Pro Asn Val Leu Lys Lys Ala Gln Glu Glu Ile 325 330 335 tcc cgg atc atc gga acc aag cgg atc gta caa gaa tcc gac gcc cca 1112 Ser Arg Ile Ile Gly Thr Lys Arg Ile Val Gln Glu Ser Asp Ala Pro 340 345 350 gac cta ccc tac ctc cag gcc atc atc aag gag acg ttc cgg ctc cac 1160 Asp Leu Pro Tyr Leu Gln Ala Ile Ile Lys Glu Thr Phe Arg Leu His 355 360 365 cca ccg atc ccg atg ctc tcg cgt aag tcc acc tcc gat tgc acg gtc 1208 Pro Pro Ile Pro Met Leu Ser Arg Lys Ser Thr Ser Asp Cys Thr Val 370 375 380 aac ggc tac aaa atc caa gcc aag agc ctc ttg ttc gtg aac ata tgg 1256 Asn Gly Tyr Lys Ile Gln Ala Lys Ser Leu Leu Phe Val Asn Ile Trp 385 390 395 400 tcc atc ggt cga aac cct aat tac tgg gaa agc cct atg gag ttc agg 1304 Ser Ile Gly Arg Asn Pro Asn Tyr Trp Glu Ser Pro Met Glu Phe Arg 405 410 415 ccc gag cgg ttc ttg gag aag gga cgc gag tcc atc gac gtc aag ggc 1352 Pro Glu Arg Phe Leu Glu Lys Gly Arg Glu Ser Ile Asp Val Lys Gly 420 425 430 cag cac ttt gag ctc ttg cct ttt ggg acg ggc cgc agg ggc tgt ccc 1400 Gln His Phe Glu Leu Leu Pro Phe Gly Thr Gly Arg Arg Gly Cys Pro 435 440 445 ggt atg ttg ctg gct ata caa gag gtg gtc agc atc att ggg acc atg 1448 Gly Met Leu Leu Ala Ile Gln Glu Val Val Ser Ile Ile Gly Thr Met 450 455 460 gtt cag tgc ttc gac tgg aaa ttg gca gat ggt tcg ggc aat aat gtg 1496 Val Gln Cys Phe Asp Trp Lys Leu Ala Asp Gly Ser Gly Asn Asn Val 465 470 475 480 gac atg acc gaa cgg tct gga ttg acc gct ccg aga gcg ttc gat ctg 1544 Asp Met Thr Glu Arg Ser Gly Leu Thr Ala Pro Arg Ala Phe Asp Leu 485 490 495 gtt tgc cgg ttg tat cca cgg gtt gac ccg gcc aca ata tcg ggt gct 1592 Val Cys Arg Leu Tyr Pro Arg Val Asp Pro Ala Thr Ile Ser Gly Ala 500 505 510 512 tgatgtagta gggtgaggcg cgtgttggtg ttttatcttt cggttttgtt ctgttagtat 1652 *** tattatggtc tgtgttgaag cctcaaggat tttaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1712 aaaaaaaaaa aaaaaaaa 1730
【００６２】 <210> 4 <211> 512 <212> PRT <213> Torenia hybrida <220> <223> Amino acid sequence of a protein having an activity to directly co nvert flavanone to flavone <400> 4 Met Asp Thr Val Leu Ile Thr Leu Tyr Thr Ala Leu Phe Val Ile Thr 1 5 10 15 Thr Thr Phe Leu Leu Leu Leu Arg Arg Arg Gly Pro Pro Ser Pro Pro 20 25 30 Gly Pro Leu Ser Leu Pro Ile Ile Gly His Leu His Leu Leu Gly Pro 35 40 45 Arg Leu His His Thr Phe His Glu Phe Ser Leu Lys Tyr Gly Pro Leu 50 55 60 Ile Gln Leu Lys Leu Gly Ser Ile Pro Cys Val Val Ala Ser Thr Pro 65 70 75 80 Glu Leu Ala Arg Glu Phe Leu Lys Thr Asn Glu Leu Ala Phe Ser Ser 85 90 95 Arg Lys His Ser Thr Ala Ile Asp Ile Val Thr Tyr Asp Ser Ser Phe 100 105 110 Ala Phe Ser Pro Tyr Gly Pro Tyr Trp Lys Tyr Ile Lys Lys Leu Cys 115 120 125 Thr Tyr Glu Leu Leu Gly Ala Arg Asn Leu Gly His Phe Gln Pro Ile 130 135 140 Arg Asn Leu Glu Val Arg Ser Phe Leu Gln Leu Leu Met His Lys Ser 145 150 155 160 Phe Lys Gly Glu Ser Val Asn Val Thr Asp Glu Leu Val Arg Leu Thr 165 170 175 Ser Asn Val Ile Ser His Met Met Leu Ser Ile Arg Cys Ser Glu Asp 180 185 190 Glu Gly Asp Ala Glu Ala Ala Arg Thr Val Ile Arg Glu Val Thr Gln 195 200 205 Ile Phe Gly Glu Phe Asp Val Thr Asp Ile Ile Trp Phe Cys Lys Lys 210 215 220 Phe Asp Leu Gln Gly Ile Lys Lys Arg Ser Glu Asp Ile Gln Arg Arg 225 230 235 240 Tyr Asp Ala Leu Leu Glu Lys Ile Ile Ser Asp Arg Glu Arg Ser Arg 245 250 255 Arg Gln Asn Arg Asp Lys His Gly Gly Gly Asn Asn Glu Glu Ala Lys 260 265 270 Asp Phe Leu Asp Met Leu Leu Asp Val Met Glu Ser Gly Asp Thr Glu 275 280 285 Val Lys Phe Thr Arg Glu His Leu Lys Ala Leu Ile Leu Asp Phe Phe 290 295 300 Thr Ala Gly Thr Asp Thr Thr Ala Ile Ala Thr Glu Trp Ala Ile Ala 305 310 315 320 Glu Leu Ile Asn Asn Pro Asn Val Leu Lys Lys Ala Gln Glu Glu Ile 325 330 335 Ser Arg Ile Ile Gly Thr Lys Arg Ile Val Gln Glu Ser Asp Ala Pro 340 345 350 Asp Leu Pro Tyr Leu Gln Ala Ile Ile Lys Glu Thr Phe Arg Leu His 355 360 365 Pro Pro Ile Pro Met Leu Ser Arg Lys Ser Thr Ser Asp Cys Thr Val 370 375 380 Asn Gly Tyr Lys Ile Gln Ala Lys Ser Leu Leu Phe Val Asn Ile Trp 385 390 395 400 Ser Ile Gly Arg Asn Pro Asn Tyr Trp Glu Ser Pro Met Glu Phe Arg 405 410 415 Pro Glu Arg Phe Leu Glu Lys Gly Arg Glu Ser Ile Asp Val Lys Gly 420 425 430 Gln His Phe Glu Leu Leu Pro Phe Gly Thr Gly Arg Arg Gly Cys Pro 435 440 445 Gly Met Leu Leu Ala Ile Gln Glu Val Val Ser Ile Ile Gly Thr Met 450 455 460 Val Gln Cys Phe Asp Trp Lys Leu Ala Asp Gly Ser Gly Asn Asn Val 465 470 475 480 Asp Met Thr Glu Arg Ser Gly Leu Thr Ala Pro Arg Ala Phe Asp Leu 485 490 495 Val Cys Arg Leu Tyr Pro Arg Val Asp Pro Ala Thr Ile Ser Gly Ala 500 505 510
【００６３】 <210> 5 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 aaataggatc caagcatgga cacagtctta a 31
【００６４】 <210> 6 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 cccttctaga tcaagcaccc gatattgtgg ccggg 35
【００６５】 <210> 7 <211> 1770 <212> DNA <213> Perilla frutescens <220> <223> Nucleotide sequence coding for a protein having an activity to dir ectly convert flavanone to flavone <400> 7 tgtcgacgga gcaagtggaa atg gca ctg tac gcc gcc ctc ttc ctc ctg tcc 53 Met Ala Leu Tyr Ala Ala Leu Phe Leu Leu Ser 1 5 10 gcc gcc gtg gtc cgc tcc gtt ctg gat cga aaa cgc ggg cgg ccg ccc 101 Ala Ala Val Val Arg Ser Val Leu Asp Arg Lys Arg Gly Arg Pro Pro 15 20 25 tac cct ccc ggg ccg ttc cct ctt ccc atc atc ggc cac tta cac ctc 149 Tyr Pro Pro Gly Pro Phe Pro Leu Pro Ile Ile Gly His Leu His Leu 30 35 40 ctc ggg ccg aga ctc cac caa acc ttc cac gat ctg tcc caa cgg tac 197 Leu Gly Pro Arg Leu His Gln Thr Phe His Asp Leu Ser Gln Arg Tyr 45 50 55 ggg ccc tta atg cag ctc cgc ctc ggg tcc atc cgc tgc gtc att gct 245 Gly Pro Leu Met Gln Leu Arg Leu Gly Ser Ile Arg Cys Val Ile Ala 60 65 70 75 gcc tcg ccg gag ctc gcc aag gaa tgc ctc aag aca cac gag ctc gtc 293 Ala Ser Pro Glu Leu Ala Lys Glu Cys Leu Lys Thr His Glu Leu Val 80 85 90 ttc tcc tcc cgc aaa cac tcc acc gcc att gat atc gtc acc tac gat 341 Phe Ser Ser Arg Lys His Ser Thr Ala Ile Asp Ile Val Thr Tyr Asp 95 100 105 tca tcc ttc gct ttc tct ccc tac ggg cct tac tgg aaa ttc atc aag 389 Ser Ser Phe Ala Phe Ser Pro Tyr Gly Pro Tyr Trp Lys Phe Ile Lys 110 115 120 aaa tta tgc acc tac gag ctg ctc ggg gcc cga aat ctc gcc cac ttt 437 Lys Leu Cys Thr Tyr Glu Leu Leu Gly Ala Arg Asn Leu Ala His Phe 125 130 135 cag ccc atc agg act ctc gaa gtc aag tct ttc ctc caa att ctt atg 485 Gln Pro Ile Arg Thr Leu Glu Val Lys Ser Phe Leu Gln Ile Leu Met 140 145 150 155 cgc aag ggt gaa tcg ggg gag agc ttc aac gtg act gag gag ctc gtg 533 Arg Lys Gly Glu Ser Gly Glu Ser Phe Asn Val Thr Glu Glu Leu Val 160 165 170 aag ctg acg agc aac gtc ata tcg cat atg atg ctg agc ata cgg tgt 581 Lys Leu Thr Ser Asn Val Ile Ser His Met Met Leu Ser Ile Arg Cys 175 180 185 tca gag acg gag tcg gag gcg gag gcg gcg agg acg gtg att cgg gag 629 Ser Glu Thr Glu Ser Glu Ala Glu Ala Ala Arg Thr Val Ile Arg Glu 190 195 200 gtc acg cag ata ttt ggg gag ttc gac gtc tcc gac atc ata tgg ctt 677 Val Thr Gln Ile Phe Gly Glu Phe Asp Val Ser Asp Ile Ile Trp Leu 205 210 215 tgt aag aac ttc gat ttc caa ggt ata agg aag cgg tcc gag gat atc 725 Cys Lys Asn Phe Asp Phe Gln Gly Ile Arg Lys Arg Ser Glu Asp Ile 220 225 230 235 cag agg aga tat gat gct ctg ctg gag aag atc atc acc gac aga gag 773 Gln Arg Arg Tyr Asp Ala Leu Leu Glu Lys Ile Ile Thr Asp Arg Glu 240 245 250 aag cag agg cgg acc cac ggc ggc ggt ggc ggc ggc ggg gaa gcc aag 821 Lys Gln Arg Arg Thr His Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Ala Lys 255 260 265 gat ttt ctt gac atg ttc ctc gac ata atg gag agc ggg aaa gcc gaa 869 Asp Phe Leu Asp Met Phe Leu Asp Ile Met Glu Ser Gly Lys Ala Glu 270 275 280 gtt aaa ttc acg agg gag cat ctc aaa gct ttg att ctg gat ttc ttc 917 Val Lys Phe Thr Arg Glu His Leu Lys Ala Leu Ile Leu Asp Phe Phe 285 290 295 acc gcc ggc acc gac acg acg gcg atc gtg tgt gaa tgg gcg ata gca 965 Thr Ala Gly Thr Asp Thr Thr Ala Ile Val Cys Glu Trp Ala Ile Ala 300 305 310 315 gaa gtg atc aac aat cca aat gtg ttg aag aaa gct caa gaa gag att 1013 Glu Val Ile Asn Asn Pro Asn Val Leu Lys Lys Ala Gln Glu Glu Ile 320 325 330 gcc aac atc gtc gga ttc gac aga att ctg caa gaa tcc gac gcc cca 1061 Ala Asn Ile Val Gly Phe Asp Arg Ile Leu Gln Glu Ser Asp Ala Pro 335 340 345 aat ctg ccc tac ctt caa gcc ctc atc aaa gaa aca ttc cgg ctc cac 1109 Asn Leu Pro Tyr Leu Gln Ala Leu Ile Lys Glu Thr Phe Arg Leu His 350 355 360 cct cca atc cca atg ctg gcg agg aaa tcg atc tcc gac tgc gtc atc 1157 Pro Pro Ile Pro Met Leu Ala Arg Lys Ser Ile Ser Asp Cys Val Ile 365 370 375 gac ggc tac atg att ccg gcc aac acg ctg ctc ttc gtc aac ctc tgg 1205 Asp Gly Tyr Met Ile Pro Ala Asn Thr Leu Leu Phe Val Asn Leu Trp 380 385 390 395 tcc atg ggg cgg aac cct aaa atc tgg gac tac ccg acg gcg ttc cag 1253 Ser Met Gly Arg Asn Pro Lys Ile Trp Asp Tyr Pro Thr Ala Phe Gln 400 405 410 ccg gag agg ttt ctg gag aag gaa aag gcc gcc atc gat gtt aaa ggg 1301 Pro Glu Arg Phe Leu Glu Lys Glu Lys Ala Ala Ile Asp Val Lys Gly 415 420 425 cag cat ttt gag ctg cta ccg ttc gga acg ggc agg aga ggc tgc cca 1349 Gln His Phe Glu Leu Leu Pro Phe Gly Thr Gly Arg Arg Gly Cys Pro 430 435 440 ggg atg ctt tta gcc att cag gag gtg gtc atc ata att ggg acg atg 1397 Gly Met Leu Leu Ala Ile Gln Glu Val Val Ile Ile Ile Gly Thr Met 445 450 455 att caa tgc ttc gat tgg aag ctg ccc gac ggc tcc ggc cat gtt gat 1445 Ile Gln Cys Phe Asp Trp Lys Leu Pro Asp Gly Ser Gly His Val Asp 460 465 470 475 atg gca gaa cgg cca ggg ctc acg gca ccg cga gag acc gat ttg ttt 1493 Met Ala Glu Arg Pro Gly Leu Thr Ala Pro Arg Glu Thr Asp Leu Phe 480 485 490 tgc cgt gtg gtg ccg cga gtt gat ccg ttg gtt gtt tcc acc cag 1538 Cys Arg Val Val Pro Arg Val Asp Pro Leu Val Val Ser Thr Gln 495 500 505 tgatcacccc ctttaaattt attaatgata tatttttatt ttgagaaaaa ataaaaatgc 1598 taattgtttt gtttcatgat gtaattgtta attagtttct attgtgcgct gtcgcgtgtc 1658 gcgtggctta agataagatt gtatcattgg tacctaggat gtattttcat tttcaataaa 1718 ttattttgtg ctgtgtatat taaaaaaaaa aaagaaaaaa aaaaaaaaaa aa 1770
【００６６】 <210> 8 <211> <212> PRT <213> Perilla frutescens <220> <223> Amino acid sequence of a protein having an activity to directly co nvert flavanone to flavone <400> 8 Met Ala Leu Tyr Ala Ala Leu Phe Leu Leu Ser Ala Ala Val Val Arg 1 5 10 15 Ser Val Leu Asp Arg Lys Arg Gly Arg Pro Pro Tyr Pro Pro Gly Pro 20 25 30 Phe Pro Leu Pro Ile Ile Gly His Leu His Leu Leu Gly Pro Arg Leu 35 40 45 His Gln Thr Phe His Asp Leu Ser Gln Arg Tyr Gly Pro Leu Met Gln 50 55 60 Leu Arg Leu Gly Ser Ile Arg Cys Val Ile Ala Ala Ser Pro Glu Leu 65 70 75 80 Ala Lys Glu Cys Leu Lys Thr His Glu Leu Val Phe Ser Ser Arg Lys 85 90 95 His Ser Thr Ala Ile Asp Ile Val Thr Tyr Asp Ser Ser Phe Ala Phe 100 105 110 Ser Pro Tyr Gly Pro Tyr Trp Lys Phe Ile Lys Lys Leu Cys Thr Tyr 115 120 125 Glu Leu Leu Gly Ala Arg Asn Leu Ala His Phe Gln Pro Ile Arg Thr 130 135 140 Leu Glu Val Lys Ser Phe Leu Gln Ile Leu Met Arg Lys Gly Glu Ser 145 150 155 160 Gly Glu Ser Phe Asn Val Thr Glu Glu Leu Val Lys Leu Thr Ser Asn 165 170 175 Val Ile Ser His Met Met Leu Ser Ile Arg Cys Ser Glu Thr Glu Ser 180 185 190 Glu Ala Glu Ala Ala Arg Thr Val Ile Arg Glu Val Thr Gln Ile Phe 195 200 205 Gly Glu Phe Asp Val Ser Asp Ile Ile Trp Leu Cys Lys Asn Phe Asp 210 215 220 Phe Gln Gly Ile Arg Lys Arg Ser Glu Asp Ile Gln Arg Arg Tyr Asp 225 230 235 240 Ala Leu Leu Glu Lys Ile Ile Thr Asp Arg Glu Lys Gln Arg Arg Thr 245 250 255 His Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Ala Lys Asp Phe Leu Asp Met 260 265 270 Phe Leu Asp Ile Met Glu Ser Gly Lys Ala Glu Val Lys Phe Thr Arg 275 280 285 Glu His Leu Lys Ala Leu Ile Leu Asp Phe Phe Thr Ala Gly Thr Asp 290 295 300 Thr Thr Ala Ile Val Cys Glu Trp Ala Ile Ala Glu Val Ile Asn Asn 305 310 315 320 Pro Asn Val Leu Lys Lys Ala Gln Glu Glu Ile Ala Asn Ile Val Gly 325 330 335 Phe Asp Arg Ile Leu Gln Glu Ser Asp Ala Pro Asn Leu Pro Tyr Leu 340 345 350 Gln Ala Leu Ile Lys Glu Thr Phe Arg Leu His Pro Pro Ile Pro Met 355 360 365 Leu Ala Arg Lys Ser Ile Ser Asp Cys Val Ile Asp Gly Tyr Met Ile 370 375 380 Pro Ala Asn Thr Leu Leu Phe Val Asn Leu Trp Ser Met Gly Arg Asn 385 390 395 400 Pro Lys Ile Trp Asp Tyr Pro Thr Ala Phe Gln Pro Glu Arg Phe Leu 405 410 415 Glu Lys Glu Lys Ala Ala Ile Asp Val Lys Gly Gln His Phe Glu Leu 420 425 430 Leu Pro Phe Gly Thr Gly Arg Arg Gly Cys Pro Gly Met Leu Leu Ala 435 440 445 Ile Gln Glu Val Val Ile Ile Ile Gly Thr Met Ile Gln Cys Phe Asp 450 455 460 Trp Lys Leu Pro Asp Gly Ser Gly His Val Asp Met Ala Glu Arg Pro 465 470 475 480 Gly Leu Thr Ala Pro Arg Glu Thr Asp Leu Phe Cys Arg Val Val Pro 485 490 495 Arg Val Asp Pro Leu Val Val Ser Thr Gln 500 505
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はCYP93B1 及びTFNS5 にコードされるタン
パク質によって、ナリンゲニンを基質として生じる生成
物のＨＰＬＣ分析の結果を示すグラフである。 Ａ及びＢ：CYP93B1 を発現している酵母の粗酵素画分を
添加したもの Ｃ及びＤ：TFNS5 を発現している酵母の粗酵素画分を添
加したもの Ａ及びＣ：酵素画分添加による直接の生成物 Ｂ：Ａの反応後、酸処理を行った場合の生成物 Ｄ：Ｃの反応後、酸処理を行った場合の生成物
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 久住 高章 大阪府三島郡島本町若山台１−１−１ サ ントリー株式会社研究センター内 (72)発明者 綾部 眞一 神奈川県大和市下鶴間2570−１ ダイアパ レス鶴間218号 (72)発明者 明石 智義 東京都大田区北千束１−66−12 メゾン大 岡山101 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AD08 AD12 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD07 CD09 4B024 AA08 BA10 CA04 DA01 DA12 EA04 GA11 HA01 4B050 CC03 DD13 LL10 4B065 AA72X AA88X AA88Y AB01 BA02 CA29 CA53

Claims (18)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 フラバノンからフラボンを合成する活性
    を有するタンパク質をコードする遺伝子。
  2. 【請求項２】 前記遺伝子がフラボン合成酵素IIをコー
    ドする遺伝子である請求項１記載の遺伝子。
  3. 【請求項３】 配列番号：２，４又は８のいずれかに記
    載のアミノ酸配列を有し、フラバノンからフラボンを合
    成する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、あ
    るいはそれらのアミノ酸配列に対して１個又は複数個の
    アミノ酸の付加、欠失及び／または他のアミノ酸による
    置換によって修飾されているアミノ酸配列を有し、且つ
    フラバノンからフラボンを合成する活性を有するタンパ
    ク質をコードする請求項１又は２に記載の遺伝子。
  4. 【請求項４】 配列番号：２，４又は８のいずれかに記
    載のアミノ酸配列に対して55% 以上の相同性を示すアミ
    ノ酸配列を有し、フラバノンからフラボンを合成する活
    性を有するタンパク質をコードする請求項１から３のい
    ずれか１項に記載の遺伝子。
  5. 【請求項５】 配列番号：１，３又は７のいずれかに記
    載の塩基配列の一部または全部に対して、5 x SSC 、50
    ℃の条件下でハイブリダイズする、フラバノンからフラ
    ボンを合成する活性を有するタンパク質をコードする請
    求項１から４のいずれか１項に記載の遺伝子。
  6. 【請求項６】 請求項１〜５のいずれか１項に記載の遺
    伝子を含んでなるベクター。
  7. 【請求項７】 請求項６に記載のベクターにより形質転
    換された宿主。
  8. 【請求項８】 請求項１〜５のいずれか１項に記載の遺
    伝子によってコードされるタンパク質。
  9. 【請求項９】 請求項７に記載の宿主を培養し、又は生
    育させ、そして当該宿主からフラボンを合成する活性を
    有するタンパク質を採取することを特徴とする当該タン
    パク質の製造方法。
  10. 【請求項１０】 請求項１〜５のいずれか１項に記載の
    遺伝子が導入された植物もしくはこれと同じ性質を有す
    る該植物の子孫またはそれらの組織。
  11. 【請求項１１】 請求項１０に記載の植物又はこれと同
    じ性質を有するその子孫の切り花。
  12. 【請求項１２】 請求項１〜５に記載の遺伝子を用いて
    フラボノイド成分及び／又はその量を変更する方法。
  13. 【請求項１３】 請求項１〜５のいずれか１項に記載の
    遺伝子を用いてフラボン量を変化させる方法。
  14. 【請求項１４】 請求項１〜５のいずれか１項に記載の
    遺伝子を用いて花の色を変える方法。
  15. 【請求項１５】 請求項１〜５のいずれか１項に記載の
    遺伝子を用いて花の色を青くする方法。
  16. 【請求項１６】 請求項１〜５のいずれか１項に記載の
    遺伝子を用いて花の色を赤くする方法。
  17. 【請求項１７】 請求項１〜５のいずれか１項に記載の
    遺伝子を用いて植物の光感受性を改変する方法。
  18. 【請求項１８】 請求項１〜５のいずれか１項に記載の
    遺伝子を用いて植物と微生物の相互作用を制御する方
    法。
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