ES2311288T3 - Metodo para cultivo de celulas animales. - Google Patents
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Abstract
METODOS PARA MEJORAR LA PRODUCTIVIDAD EN LA PRODUCCION DE SUSTANCIAS UTILES, A PARTIR DE CELULAS ANIMALES. UN METODO DE CULTIVO DE CELULAS ANIMALES, PARA PRODUCIR UNA SUSTANCIA DESEADA, QUE COMPRENDE LAS FASES (1) CULTIVAR CELULAS ANIMALES A UNA TEMPERATURA A LA QUE DICHAS CELULAS PUEDAN CRECER; Y (2) CULTIVAR DICHAS CELULAS ANIMALES A UNA TEMPERATURA INFERIOR.
Description
Método para cultivo de células animales.
La presente invención se refiere a un método
para producir proteínas o péptidos mediante el cultivo de células
recombinantes.
Mediante cultivo de microorganismos o de células
animales se producen numerosas sustancias útiles.
Aunque la producción de sustancias útiles usando
microorganismos tales como E. coli es ventajosa en cuanto a
la cantidad producida por medio o a la productividad por célula, ese
tipo de método no se puede aplicar en los casos en los que la
proteína diana tiene un peso molecular alto y posee una estructura
estérica demasiado compleja para ser replegada, o en los casos de
sustancias cuya actividad fisiológica se exhibe solamente después
de la modificación de, por ejemplo, las cadenas azucaradas.
Para producir esas proteínas se usan típicamente
células animales. Ejemplos de células animales conocidas incluyen
CHO-K1 (células de ovario de hámster chino: ATCC
CCL-61), la línea derivada de
CHO-K1, deficiente en el gen de la
dihidrofolato-reductasa (DHFR), hibridomas
construidos fusionando una célula parental (mieloma, etc.) con una
célula normal (linfocito, etc.) productora de una sustancia útil,
C127I (células de tumor mamario de ratón: ATCC
CRL-1616),
BHK-21(C-13) (células renales
de hámster joven: ATCC CCL-10) y células Vero
(células renales de mono verde africano: ATCC
CCL-81).
Sin embargo, las deficiencias de las células
animales cuando se las compara con los microorganismos incluyen una
velocidad de crecimiento lenta, medios caros y una baja producción
por medio y una baja productividad por célula. El uso de
recipientes para cultivo a gran escala, las condiciones de cultivo
esenciales (temperatura de incubación, concentración de oxígeno
disuelto, pH, etc.), los medios (medios libres de suero, medios
libres de proteínas, etc.), los aditivos para los medios (ácido
butírico, dimetilsulfóxido (DMSO), hidrocortisona, etc.) y el
aumento de densidad de las células en cultivo se están estudiando
como maneras de afrontar estas deficiencias.
Cuando se cultivan células animales, la
temperatura de incubación casi siempre es 37ºC. Sin embargo, debido
a que la temperatura de incubación se considera que tiene efecto
sobre el crecimiento celular así como sobre el metabolismo de
diversas sustancias, la temperatura óptima es un elemento
indispensable de la producción de sustancias por medio de cultivos
celulares.
El efecto de la temperatura de incubación se
estudió por primera vez en la década de los 70 en la producción de
interferón. Además, existen también varios informes de estudios
sobre hibridomas productores de anticuerpos monoclonales que
comienzan en la década de los 80.
Con respecto a la producción de interferón,
tratando fibroblastos normales, células de linfoma de Burkitt
(células Namalwa), células renales de conejo (RK13), otras células
similares a linfoblastos y otras células semejantes, con diversos
compuestos químicos tales como poli I (ácido poliinosínico), poli C
(ácido policitidílico), cicloheximida, actinomicina D y ácido
butírico, o con virus tales como el virus Sendai, es posible crear
un sistema que induce la producción de interferón. Se ha informado
de que en este sistema, la cantidad de interferón se puede
incrementar bajando la temperatura de incubación (Proc. Nat.
Acad. Sci. USA, Vol. 70, núm. 12, Parte II, págs.
3909-3913, 1973; Japan J. Microbiol., Vol.
18(3), 217-222, 1974; Antimicrob. Agents
Chemother., Vol. 18, núm. 1, págs. 130-136,
1980; Proceedings of the Society for Experimental Biology and
Medicine, 170, 155-159, 1982; J. Interferon
Res. 11, Supl. 1, S211, 1991; y el documento
JP-A-7/31495).
Sin embargo, debido a que los métodos indicados
en estas publicaciones requieren procedimientos complejos para
inducir la producción, una producción de gran volumen a escala
industrial es difícil de realizar. Además, éste no es un método de
cultivo que pueda ser aplicado de manera universal a las células
animales.
Con respecto a los hibridomas productores de
anticuerpos monoclonales, se ha informado de que en el caso de
bajar la temperatura de incubación, aunque se mantiene una elevada
viabilidad durante un tiempo prolongado y el consumo de glucosa se
reduce, la productividad de anticuerpos monoclonales desciende
(Biotechnology and Bioengineering, Vol. 37, págs.
292-295, 1991). Se ha informado también de que
aunque el número de células en la fase G1 del ciclo celular
aumenta, la productividad de anticuerpos por célula no cambia,
teniendo lugar el crecimiento celular máximo y la producción máxima
de anticuerpos durante el cultivo a 37ºC (Biotechnology and
Bioengineering, Vol. 40, págs. 427-431, 1992),
sugiriendo así diferentes interpretaciones dependiendo de la línea
celular utilizada.
La producción de anticuerpos en hibridomas se
piensa que está influida por las propiedades de la línea celular
parental, tal como un mieloma, así como por los linfocitos
productores de anticuerpos que se fusionan con ella. Se piensa por
lo tanto que los resultados difieren dependiendo de la línea celular
utilizada.
Por otra parte, en células CHO, que se usan
comúnmente como células hospedadoras para la recombinación génica,
aunque existen informes de que la temperatura óptima para el
crecimiento de las células es de 37ºC (Journal of
Biotechnology, 15, 101-111, 1990), la
temperatura óptima para la producción de sustancias se desconoce
totalmente.
Además, con respecto al efecto de la temperatura
de incubación sobre las células en las que tiene lugar la
recombinación génica, aun cuando existe un informe de que una cepa
mutante sensible a la temperatura, derivada de células CHO
(temperatura óptima para el crecimiento celular: 34ºC, para la
producción de sustancias: 39ºC), se había construido y aplicado a
la producción de sustancias (Biotechnology and
Bioengineering, Vol. 42, págs. 1029-1036,
1993), debido a que se usó una cepa sensible a la temperatura, no se
pueden hacer suposiciones referentes al efecto de la temperatura de
incubación sobre células normales en las que tiene lugar la
recombinación génica.
Por lo tanto, actualmente existe muy poca
información disponible en lo que se refiere al efecto de la
temperatura de incubación sobre las células en las que tiene lugar
la recombinación génica. Además, los informes previamente
ilustrados incluían estudios sobre los efectos de la temperatura de
incubación desde el punto de vista del crecimiento de las células o
de la productividad de las sustancias. Sin embargo, cuando se
considera la producción de sustancias mediante cultivos celulares,
ya que es también necesario considerar el proceso de purificación
posterior así como el cultivo en sí, los estudios se deberían
centrar en aspectos más amplios que incluyen el consumo de
componentes del medio, las proteínas contaminantes y aspectos
similares, además del crecimiento de las células y de la
productividad de la sustancia. Así pues, con respecto a las células
animales en general, se puede decir que los hallazgos concernientes
a la temperatura de incubación son insuficientes en el momento
actual.
Cuando se comparan los costes de producción de
sustancias entre los métodos convencionales de cultivo de células
animales y los métodos de cultivo de microorganismos, los costes
correspondientes a las células animales siguen estando a un nivel
alto. Así, se está tratando continuamente se está tratando de hacer
esfuerzos para conseguir costes reducidos.
Sería conveniente proporcionar un método de
cultivo para producir una eficiencia mayor (costes reducidos) en la
producción de sustancias mediante cultivo de células animales.
La presente invención proporciona un método
para cultivar células animales recombinantes, en el que dichas
células animales recombinantes exhiben una productividad celular más
alta de la proteína recombinante a la temperatura más baja descrita
más adelante, a través de aumentar el contenido del mRNA que
codifica la proteína, pero no son mutantes sensibles a la
temperatura, que comprende las etapas de:
(1) cultivar las células animales recombinantes
a una temperatura a la que las células animales pueden crecer; y
luego
(2) cultivar las células recombinantes a una
temperatura más baja, en el que dicha temperatura es de 30ºC a
35ºC; y
en el que dichas células animales
recombinantes son células
3\mu-1s.
Los autores de la invención proponen un medio de
producción más efectiva del producto diana en células animales
cuando las células animales se cultivan según un procedimiento de
cultivo caracterizado por disminuir la temperatura de cultivo
durante el procedimiento desde una primera temperatura de cultivo
que favorece el crecimiento de las células hasta una segunda
temperatura de cultivo que favorece la productividad del producto
diana, p. ej., la productividad por célula, por unidad de volumen
de cultivo, por cantidad de nutriente de las células, la proporción
de producto frente a la proporción de contaminantes del cultivo, o
cualquier combinación de ellas.
La primera temperatura puede ser sustancialmente
una temperatura óptima para el crecimiento celular, es decir, para
que la densidad celular aumente. Puede estar por ejemplo dentro del
límite de los 0,5ºC de la temperatura óptima del crecimiento de las
células con respecto a las demás condiciones de cultivo
determinadas.
La segunda temperatura puede ser menos apropiada
para el crecimiento celular que la primera, p. ej., puede
corresponder un menor aumento, a ningún aumento o a un descenso en
la densidad celular a lo largo del tiempo. La segunda temperatura
puede estar asociada (al menos en la fase de cultivo en la que se
usa) con una mayor productividad del producto diana por célula, o
por unidad de volumen de cultivo, o por cantidad unitaria de
nutriente. Será sustancialmente inferior, p. ej., al menos 1ºC, 2ºC
o 3ºC inferior que la primera temperatura. La segunda temperatura
puede ser vigilada y mantenida durante un período prolongado de
cultivo y producción; no debe ser confundida con una fase de
enfriamiento no controlado hasta la temperatura ambiente.
Las temperaturas "primera" y "segunda"
no necesitan ser constantes de una manera exacta, aunque esto muchas
veces es conveniente. Pueden variar, p. ej., por otras razones, a
condición de que permanezcan en general dentro de los intervalos de
la primera y de la segunda temperaturas que permiten que se
produzcan los diferentes efectos técnicos aquí mencionados. Además,
el cambio de la primera temperatura a la segunda temperatura puede
ser una gradación de temperaturas controlada.
El procedimiento puede ser contemplado como el
uso de una etapa de crecimiento celular o de aumento de la densidad
celular, seguida de una etapa de producción a una temperatura de
cultivo más baja.
El momento exacto de la transición de la primera
temperatura a la segunda temperatura se puede controlar de manera
que se consiga la mejora deseada en la eficacia de la productividad.
En particular, puede ser mientras el cultivo que se realiza a la
primera temperatura está todavía en la fase logarítmica de
crecimiento, o antes del crecimiento en estado estacionario;
sustancialmente, antes de que se alcance la densidad celular máxima
correspondiente a la primera temperatura.
El procedimiento implica debidamente la etapa de
aislar o separar del cultivo el producto deseado y esto se puede
llevar a cabo de manera periódica, de manera continua o al final de
un procedimiento discontinuo.
Los usos de la técnica de disminución de la
temperatura se pueden seleccionar entre:
- aumentar la proporción de células viables
durante la fase de producción;
- disminuir la proporción de residuos celulares
y/o de otros contaminantes en el cultivo;
- disminuir el consumo de nutrientes celulares
durante la fase de producción;
- aumentar la productividad global del
procedimiento de cultivo para una cantidad determinada de materiales
de partida.
A continuación vienen explicaciones adicionales
que hacen referencia a los dibujos que se adjuntan.
La Fig. 1 muestra curvas de crecimiento de
células 3\mu-1S a diferentes temperaturas de
cultivo. Los círculos negros y blancos de las gráficas indican la
densidad de células totales y la densidad de células viables
respectivamente.
La Fig. 2 es una gráfica que muestra los cambios
con el transcurso del tiempo en la producción (cantidad acumulada)
de enzima amidante (AE) por parte de las células
3\mu-1S a diferentes temperaturas de cultivo.
La Fig. 3 es una gráfica que muestra los cambios
con el transcurso del tiempo en la productividad celular de AE a
diferentes temperaturas de cultivo. La productividad se calculó a
partir de los resultados mostrados en las Figs. 1 y 2.
La Fig. 4 muestra el resultado de una
hibridación por transferencia Southern. Se detectó el DNA de AE en
células 3\mu-1S a los tiempos de cultivo
indicados y a diferentes temperaturas de incubación.
La Fig. 5 muestra los resultados de una
hibridación por transferencia Northern. Se detectó el mRNA de AE
contenido en células 3\mu-1S, a los tiempos de
cultivo indicados y a diferentes temperaturas de incubación, junto
con el mRNA de la \beta-actina, usado como
estándar interno.
La Fig. 6 muestra el contenido relativo de mRNA
de AE en células 3\mu-1S a los tiempos de
inoculación indicados y a diferentes temperaturas de incubación.
El contenido relativo de mRNA de AE se calculó como el cociente del
valor de PSL (del inglés, " Photo-Stimulated
Luminescence") (luminiscencia fotoestimulada) de la
banda de mRNA de AE con respecto al valor de PSL de la banda del
mRNA de la \beta-actina obtenida en la Fig. 5.
La Fig. 7 es una gráfica que muestra el efecto
de la temperatura de cultivo sobre la velocidad de consumo de
glucosa por 10^{5} células 3\mu-1S.
La Fig. 8 es una gráfica que muestra los cambios
con el transcurso del tiempo en la velocidad de lisis celular a
diferentes temperaturas de cultivo. La velocidad se calculó a partir
de las actividades de la lactato-deshidrogenasa
(LDH) en el sobrenadante de los cultivos y en el cultivo completo
(suspensión celular).
La Fig. 9 es un patrón de electroforesis sobre
SDS-PAGE del sobrenadante de los cultivos
(equivalente a 45 unidades de AE) de células
3\mu-1S cultivadas a diferentes temperaturas.
La Fig. 10 muestra el resultado de un análisis
de transferencia Western del sobrenadante de los cultivos
(equivalente a 45 unidades de AE) de células
3\mu-1S cultivadas a diferentes temperaturas.
La Fig. 11 indica los efectos de un cambio de
temperatura de 37ºC a 32ºC durante un cultivo discontinuo de
células 3\mu-1S. (A) muestra los cambios con el
transcurso del tiempo en la densidad celular, (B) muestra los
cambios con el transcurso del tiempo en la concentración de glucosa
en el medio, y (C) muestra los cambios con el transcurso del tiempo
en la producción de AE (cantidad acumulada). Además, los círculos
blancos y negros en el dibujo indican los resultados obtenidos a
37ºC, los triángulos blancos y negros indican los obtenidos a 32ºC,
y los cuadrados blancos y negros indican los resultados de los
cultivos cuando se usa un cambio de temperatura. En la Fig.
11(A), los círculos blancos, los triángulos blancos y los
cuadrados blancos indican la densidad de células viables, mientras
que los círculos negros, los triángulos negros y los cuadrados
negros indican la densidad de células totales.
La Fig. 12 es una gráfica que muestra los
cambios con el transcurso del tiempo en la productividad celular de
AE, calculada a partir de los resultados mostrados en las Figs.
11(A) y (C).
La Fig. 13 es un diagrama del sistema de cultivo
usado en el cultivo continuo descrito en el Ejemplo 3.
La Fig. 14 muestra los efectos de un cambio de
temperatura desde 37ºC hasta 34ºC durante un cultivo continuo de
células 3\mu-1S. (A) muestra los cambios con el
transcurso del tiempo en la densidad celular, (B) muestra los
cambios con el transcurso del tiempo en la producción de AE por
recipiente de cultivo y por día, y (C) muestra los cambios con el
transcurso del tiempo en la productividad celular de AE.
La Fig. 15 muestra gráficas que indican los
cambios en la densidad celular cuando la temperatura se cambió a
diferentes tiempos durante un cultivo discontinuo de células
3\mu-1S. Los círculos negros y blancos de las
gráficas indican respectivamente la densidad de células totales y la
densidad de células viables, mientras que las flechas indican los
tiempos a los que la temperatura se cambió.
La Fig. 16 es una gráfica que muestra los
cambios con el transcurso del tiempo de la concentración de glucosa
en el medio durante el cultivo indicado en la Fig. 15.
La Fig. 17 muestra la producción de AE (cantidad
acumulada) en el cultivo indicado en la Fig. 15. (A) es una gráfica
que indica los cambios con el transcurso del tiempo en la producción
de AE, estando representado el tiempo de cultivo en el eje
horizontal. (B) es una gráfica que muestra el efecto del momento del
cambio de temperatura sobre la producción de AE a diferentes
tiempos de cultivo, estando representado el momento del cambio de
temperatura en el eje horizontal.
Durante la producción de una sustancia deseada
en un cultivo celular, ya que el objetivo es aislar la sustancia
deseada producida, con el fin de conseguir una productividad alta de
la sustancia, además de mejorar la productividad de las células en
la sustancia, es también necesario disminuir una cantidad de
sustancias contaminantes tales como proteínas y sustancias
similares derivadas de productos metabólicos secundarios y de
contenidos celulares presentes en el cultivo. Los autores de la
presente invención llevaron a cabo estudios en profundidad desde
diversos aspectos, sobre la temperatura de cultivo considerada como
una de las condiciones básicas de cultivo, y como resultado de ello
establecieron métodos de cultivo de células animales que pueden
hacer posible una producción eficiente de proteínas.
Los autores de la presente invención llevaron a
cabo estudios sobre el efecto de la temperatura de cultivo sobre
células 3\mu-1S, que son células CHO en suspensión
que producen una enzima amidante (AE) (Animal Cell Technology:
Basic and Applied Aspects, Vol. 5, 493-499
(1993)), desde los aspectos del crecimiento celular, de la
viabilidad celular, de la productividad de la sustancia (AE), del
consumo del medio y de la pureza de la sustancia diana (AE) en el
sobrenadante del cultivo.
Como resultado, cuando los cultivos se
realizaban a una temperatura inferior a 37ºC, aunque el crecimiento
de las células se inhibía, se encontró que se mantenía una elevada
viabilidad celular, aumentaba la productividad celular de la AE,
disminuía el consumo de nutrientes, en su mayor parte aminoácidos,
glucosa) en el medio, se suprimía la liberación de impurezas por
las células, tales como productos metabólicos secundarios y
contenidos celulares, y no había esencialmente ningún cambio en la
AE producida.
Estos fenómenos muestran que es posible
conseguir un incremento significativo en la productividad de la
sustancia deseada en el cultivo de células animales disminuyendo la
temperatura de cultivo a condición de que se obtenga un número de
células adecuado.
En la producción de una sustancia mediante
cultivo a temperaturas bajas, se propone que en un cultivo
discontinuo, las células se cultiven a una temperatura óptima para
su crecimiento (36ºC - 38ºC), disminuyendo a continuación la
temperatura de cultivo; y que en un cultivo continuo, las células se
cultiven a una temperatura óptima para el crecimiento celular hasta
que se alcance una densidad celular alta, disminuyendo a
continuación la temperatura de cultivo. Los autores de la presente
invención confirmaron que la productividad de una sustancia se
aumenta espectacularmente usando una temperatura de cultivo inferior
a 37ºC en un cultivo discontinuo y en un cultivo continuo de alta
densidad, conduciendo así al establecimiento de las presentes
propuestas.
El término "proteína" se puede aquí referir
a una proteína o a un péptido. La proteína producida según la
presente invención es AE. Existe también la posibilidad de producir
proteínas útiles, actualmente desconocidas, mediante aplicación en
el futuro de las presentes técnicas.
Las células animales que se pueden usar en los
presentes métodos incluyen células animales transformadas con un
gen que codifica una proteína deseada (células en las que tiene
lugar la recombinación génica), y son preferibles cualquiera de las
células en las que se observa una producción suficiente de la
sustancia diana al disminuir la temperatura de cultivo. Los autores
de la presente invención han encontrado que las células en las que
tiene lugar la recombinación génica y los hibridomas, en particular,
se pueden obtener de manera efectiva realizando escrutinios basados
en dicha propiedad, en la fase de establecimiento de la línea
celular. Además, también se pueden usar células en suspensión o
células adhesivas.
El cultivo celular se puede llevar a cabo en
cualquier recipiente o aparato de cultivo, p. ej., de la manera que
se usa convencionalmente en un cultivo de células animales. Aunque
se pueden usar placas de Petri, Matraces T y matraces giratorios
usados a escala de laboratorio, aparatos de cultivo equipados un
separador de células que usa filtros, fuerza gravitatoria, fuerza
centrífuga, etc., usados en cultivos de alta densidad de células en
suspensión, aparatos de cultivo que usan soportes con capacidad de
albergar tales como microsoportes o fibras huecas que se usan
principalmente en cultivos de alta densidad de células adhesivas, o
biorreactores para producción industrial y recipientes y aparatos
similares, los recipientes o aparatos no están limitados a estos
ejemplos.
Cualquiera de los medios ordinarios usados en el
cultivo de células animales se puede usar como medio basal. Aunque
se puede usar o un medio que contenga suero o un medio que no
contenga suero, se prefieren los medios libres de suero, que
contengan insulina, transferrina, etc., en lugar de suero. Los más
preferibles son los medios libres de proteínas.
Con respecto a la temperatura de cultivo, aunque
es posible cultivar a una temperatura baja desde el comienzo del
cultivo, es preferible cultivar primero a una temperatura que
permita el crecimiento (temperatura de cultivo primaria) y a
continuación, después de obtener un número suficiente de células,
cultivar a una temperatura baja (temperatura de cultivo
secundaria). La temperatura de cultivo primaria aquí referida es
preferiblemente la temperatura óptima para el crecimiento, y si las
células derivan de animales homeotérmicos, una temperatura de 36ºC
- 37ºC es la común, aunque una temperatura de 37ºC es la más común.
Aunque la temperatura de cultivo secundaria es inferior a la
temperatura de cultivo primaria e inferior a 37ºC, es
preferiblemente de 30ºC - 35ºC y es muy preferiblemente de 30ºC -
32ºC.
Además, el momento de la bajada de temperatura
(momento del cambio de temperatura) es preferiblemente el momento
en el que la productividad de la sustancia puede ser incrementada
adecuadamente. En un cultivo discontinuo, es posible determinar el
momento óptimo para el cambio de temperatura realizando el
experimento indicado en el Ejemplo de Referencia 2, dependiente de
la línea celular usada. El momento del cambio de temperatura en un
cultivo continuo es preferiblemente el momento en el que la densidad
de las células llega a ser suficientemente alta. Sin embargo,
debido a que la densidad celular que se puede alcanzar en un cultivo
continuo varía según las propiedades de la línea celular utilizada
(suspendabilidad, adhesión, etc.), de las diferentes condiciones de
cultivo (medio, pH, DO, velocidad de agitación, forma del recipiente
de cultivo, velocidad de circulación, velocidad de perfusión etc.),
y de condiciones similares, no puede estar limitada dentro de un
intervalo estrecho y es típicamente de 10^{6} a 10^{8}
células/ml.
células/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes Ejemplos proporcionan una
explicación detallada de la presente invención. Sin embargo, la
presente invención no se limita a estas realizaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de Referencia
1
Las cepas K12 de E. coli usadas en este
Ejemplo de Referencia 1, que han sido transformadas con los
plásmidos pKDPXA457 y pKDPXA799 Bgl II, se denominan
respectivamente E. coli SBM 300 y E. coli SBM 301, y
fueron depositadas en el Institute of Bioscience and Human
Technology, Agency of Industrial Science and Technology,
como FERM BP-2235 y FERM
BP-2236.
Los plásmidos pKDPXA457 y pKDPXA799 Bgl II se
introdujeron respectivamente en células CHO derivadas de células de
ovario de hámster chino deficientes en el gen de la
dihidrofolato-reductasa (dhfr) (abreviadas como
células CHO dhfr^{-}, denominadas células CHO dhfr^{-} SBM 306,
y depositadas en el Institute of Bioscience and Human
Technology, Agency of Industrial Science and Technology
como FERM BP-2441) (Hanaka, S. y col., Mol.
Cell. Biol. 7, 2578-2587, 1987), mediante
coprecipitación con fosfato cálcico.
Concretamente, las células CHO dhfr^{-}, que
se habían subcultivado en medio Alfa-medio mínimo
esencial (MEM), que contenía ácidos nucleicos (medio
\alpha^{+}-MEM, Gibco) complementado con suero
bovino fetal al 10% (FBS, Flow Lab.), penicilina G como
antibiótico (50 U/ml) y una concentración de estreptomicina de 50
\mug/ml, se inocularon primero a una densidad de 1,6 x 10^{6}
células/30 ml/T80, por cada matraz T de 80 cm^{2} (T80, Nunc), 12
horas antes de la transfección génica, después de lo cual el medio
se reemplazó con 30 ml de medio \alpha^{+}-MEM
de nueva aportación (que contenía FBS al 10% y antibiótico) 4 horas
antes de la transfección génica.
Por otra parte, los plásmidos pKDPXA457 y
pKDPXA799 Bgl II se disolvieron respectivamente en 240 \mul de
agua purificada y esterilizada por cada 10 \mug de plásmido,
seguido de la adición de una cantidad igual de Tampón A (CaCl_{2}
0,5 M, HEPES 0,1 M) y mezcla. Después de dejar reposar 10 minutos a
temperatura ambiente, se añadieron 480 \mul de Tampón B (NaCl
0,28 M, HEPES 0,05 M, NaH_{2}PO_{4} 0,75 mM, Na_{2}HPO_{4}
0,75 mM) a esta disolución mezclada. Al dejar reposar de 20 a 30
minutos a temperatura ambiente después de agitar durante algunos
segundos con un mezclador Vortex, se formaron precipitados en
fosfato cálcico que contenían los plásmidos. A continuación, 960
\mul de los precipitados en fosfato cálcico que contenían los
plásmidos así obtenidos, se añadieron a células CHO dhfr^{-} (1 x
10^{6} células/30 ml/T80) preparadas según el método
anteriormente mencionado y se dejaron reposar durante 4
horas.
horas.
A continuación, después de lavar las células una
vez con 10 ml de medio \alpha^{+}-MEM de nueva
aportación que no contenía FBS, se añadieron 5 ml de una mezcla 4:1
de medio \alpha^{+}-MEM que contenía 10% FBS al
10% y glicerol, en cada matraz T80, y después de esperar exactamente
1 minuto, la mezcla se extrajo mediante aspiración. Se añadieron de
nuevo 30 ml de medio \alpha^{+}-MEM que contenía
FBS al 10%, y seguidamente se cultivó a 37ºC en presencia de
CO_{2} al 5%. A continuación, después de cultivar las células
durante 4 días, las células se desprendieron del matraz con una
disolución de tripsina al 0,25% (Chiba Kessei). Las células se
inocularon de nuevo a una densidad de 1,6 x 10^{6} células/30
ml/T80, en un medio que no contenía ácidos nucleicos
(\alpha^{-}-MEM) en el que se había añadido
suero bovino fetal dializado (FBS^{d}, Haezleton) al 10%.
A continuación, después de cultivar las células
durante 10 días, se realizó el siguiente experimento con las
células que contenían los plásmidos diana y que habían sobrevivido
en el medio (las células que contienen pKDPXA457 se denominan
células CHO/pKDPXA457-\alpha, mientras que las que
contienen pKDPXA799 Bgl II se denominan CHO/pKDPXA799 Bgl
II-\alpha).
Con el fin de realizar una amplificación génica
en las células CHO/pKDPXA457-\alpha y en las
células CHO/pKDPXA
799 Bgl II-\alpha (pKDPXA457 o pKDPXA799 Bgl II) así obtenidas, las células anteriormente mencionadas se cultivaron en medios que contenían concentraciones progresivamente crecientes de metotrexato (MTX, Sigma) 30 nM, 100 nM, 300 nM y 1000 nM para obtener células con diferentes niveles de resistencia a MTX.
799 Bgl II-\alpha (pKDPXA457 o pKDPXA799 Bgl II) así obtenidas, las células anteriormente mencionadas se cultivaron en medios que contenían concentraciones progresivamente crecientes de metotrexato (MTX, Sigma) 30 nM, 100 nM, 300 nM y 1000 nM para obtener células con diferentes niveles de resistencia a MTX.
A continuación, las células que adquirieron
resistencia a MTX 1000 nM así obtenidas (estas células se denominan
CHO/pKDPXA457-1 y CHO/pKDPXA799 Bgl
II-1 respectivamente) se inocularon respectivamente
a una densidad de 6 x 10^{6} células/30 ml/T80, y se cultivaron a
37ºC durante 4 días en presencia de CO_{2} al 5%. A continuación,
una porción de cultivo se extrajo de ambos cultivos, y se realizó un
ensayo de la actividad de la enzima
\alpha-amidante de extremos
C-terminales usando el sustrato sintético
Ac-[^{125}I]-Tyr-Phe-Gly
(véase el Ejemplo 1 descrito más adelante, en relación con la
definición del método y de las unidades de medida del ensayo de la
actividad de la enzima \alpha-amidante de
extremos C-terminales). Como resultado de ello, se
encontró que 1 unidad/ml y 310 unidades/ml de actividad enzimática
estaban contenidas en el cultivo de CHO/pKDPXA457-1
y de CHO/pKDPXA799 Bgl II-1
respectivamente.
respectivamente.
Según los resultados anteriormente mencionados,
debido a que se encontró que las células transfectadas con
pKDPXA799 Bgl II exhibían una actividad enzimática mayor que las
células transfectadas con pKDPXA457, se llevó a cabo la clonación
mediante el método de las diluciones críticas de las células
CHO/pKDPXA799 Bgl II resistentes a MTX 100 nM, anteriormente
mencionadas, con el fin de establecer una línea celular productora
de niveles altos de enzima \alpha-amidante de
extremos C-terminales. Concretamente, las células
CHO/pKDPXA799 Bgl II resistentes MTX 100 nM se inocularon en una
placa de 96 pocillos de fondo plano (Corning) de manera que
contuviera como promedio 3 unidades, 1,5 unidades, 0,75 unidades o
0,375 unidades/pocillo. Estas células se cultivaron luego durante 1
semana en un volumen de 100 \mul/pocillo de medio
\alpha^{-}-MEM que contenía FBS al 10%.
Una semana después, se añadieron 100 \mul de
medio \alpha^{-}-MEM a 30 pocillos en los que
las células habían crecido formando una colonia única, según se
determinó mediante observación al microscopio, después de lo cual
las células se cultivaron durante una semana adicional. Dos semanas
después de que las células fueran inoculadas, la actividad
enzimática del sobrenadante del cultivo se ensayó en estas 30
células. Como resultado de ello, se encontró que las células
denominadas CHO/9C exhibían la actividad enzimática más alta (910
unidades/ml) de entre estas células. A continuación, estas células
CHO/9C que habían presentado la actividad enzimática más alta, se
cultivaron de nuevo en concentraciones crecientes de MTX, 0,1
\muM, 0,3 \muM, 1 \muM, 3 \muM, 10 \muM y 30 \muM para
obtener células resistentes a diferentes niveles de MTX. Después de
realizar los cultivos respectivos de las células resistentes a MTX
así obtenidas, durante 4 días, en las condiciones de 1,6 x 10^{6}
células/30 ml/T80, usando medio \alpha^{-}-MEM
que contenía FBS al 10% FBS, se realizó el ensayo de la actividad
enzimática del sobrenadante de los cultivos. Como resultado de ello,
se encontró que la línea 9C resistente a MTX 3 \muM presentaba la
actividad enzimática más alta (2860
unidades/ml).
unidades/ml).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de referencia
2
Las células 3\mu-1S se
pudieron obtener conforme al siguiente método.
En primer lugar, se llevó a cabo una clonación
en la línea 9C resistente a MTX 3 \muM, descrita en el Ejemplo de
referencia 1, usando el método descrito en el Ejemplo de Referencia
1. Concretamente, células de la línea 9C resistente a MTX 3 \muM
se inocularon en placas de 96 pocillos (Corning) y se cultivaron
durante 1 semana en un volumen de 100 \mul/pocillo de Medio
Alfa-Medio Mínimo Esencial (MEM) que no contenía
ácido nucleico (medio \alpha^{-}-MEM, Gibco),
complementado con suero bovino fetal dializado (FBS^{d}) al
10%.
Por otra parte, se añadió además un volumen de
100 \mul/pocillo de medio \alpha^{-}-MEM,
seguido de un cultivo adicional durante 1 semana. Las células
resultantes productoras de niveles altos de enzima
\alpha-amidante se denominaron células
3\mu-1S. A continuación, las células
3\mu-1S se suspendieron mediante cultivo en
agitación (volumen del cultivo: 60 ml/matraz) en medio
F-12CMG2T (Ajinomoto) que contenía FBS^{d} al 10%
y MTX 1,0 \muM, usando un matraz Erlenmeyer volumétrico
siliconizado de 300 ml. Por otra parte, la concentración de suero
en el medio se disminuyó gradualmente hasta obtener células
3\mu-1S que finalmente se aclimataron a un medio
libre de suero que fue el medio F-12CMG2T que
contenía insulina y transferrina en una concentración de 5
\mug/ml de cada una de ellas, y MTX
1,0 \muM.
1,0 \muM.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de referencia
3
El momento óptimo para el cambio de temperatura
en un cultivo discontinuo de células células
3\mu-1S se puede determinar por medio de este
experimento. Además, el momento óptimo para el cambio de temperatura
durante un cultivo discontinuo también se puede determinar en el
caso de otras líneas celulares llevando a cabo un experimento
similar a este experimento.
El precultivo y una inoculación en un matraz de
agitación de 1 litro (6) se llevaron a cabo usando métodos
similares a los del Ejemplo 1 que se describirá más adelante,
después de lo cual se inició el cultivo (el volumen de cultivo de
cada uno de los recipientes de cultivo se estableció en 650 ml). Las
temperaturas de los cultivos se establecieron en 36ºC para la
temperatura de cultivo primaria y en 32ºC para la temperatura de
cultivo secundaria, y el cambio de temperatura se realizó a las 0
horas, 24 horas, 48 horas, 62 horas, 72 horas y 98 horas después de
la inoculación. La razón para establecer la temperatura de cultivo
primaria a 36ºC es que la temperatura de crecimiento óptima de las
células 3\mu-1S en el Ejemplo 1 que se describirá
más adelante fue de 36ºC. El pH se controló a 7,2 en todos los
recipientes de cultivo. La velocidad de agitación del matraz de
agitación se ajustó a 100 rpm. El oxígeno se suministró mediante
gaseado continuo con aire, a 100 ml/min, a través de una membrana
de Teflón. En estas condiciones de cultivo, se confirmó que el DO se
mantenía por encima de una saturación de aire del 60%. Se
recogieron muestras cada 24 horas y en ellas se realizó un recuento
de células, un ensayo de la actividad de AE y la medida de glucosa.
Los resultados se muestran en las Figs. de 15 a 17.
Las Figs. 15 de la (A) a la (F) indican los
cambios en la densidad celular del cultivo en el momento de cada
uno de los cambios de temperatura. Las flechas de los dibujos
indican los tiempos de cada uno de los cambios de temperatura, los
puntos negros indican la densidad de las células totales y los
puntos blancos indican la densidad de las células viables. En el
caso en el que la temperatura se cambió durante la fase de
crecimiento logarítmica (de las 24 horas a las 72 horas de
cultivo), el crecimiento celular se detuvo dentro de las 24 horas
después del cambio, después de lo cual la densidad celular descendió
gradualmente (Figs. 15 (B)-(E)). En el caso en el que la
temperatura se cambió durante la fase estacionaria (a las 98 horas
de cultivo), el descenso de la viabilidad en la segunda mitad del
cultivo fue notable, observándose una cantidad extremadamente
grande de residuos celulares (fragmentos de células muertas) en el
líquido del cultivo (Fig. 15 (F)). Además, el consumo de glucosa
descendió después del cambio de temperatura de la misma manera que
lo hacía el crecimiento celular (Fig. 16).
El efecto del momento del cambio de temperatura
sobre la producción de AE se muestra en las Figs. 17 (A) y (B). En
(A), el tiempo de cultivo se representa gráficamente en el eje
horizontal, y en (B), el momento del cambio de temperatura se
representa gráficamente en el eje horizontal. La cantidad de AE
producida aumentó en el caso en el que la temperatura se cambió
durante la fase de crecimiento logarítmica, y aumentó al nivel más
alto como resultado del cambio de temperatura realizado de las 62
horas a las 72 horas después de la inoculación, alcanzando un nivel
de 4300 unidades/ml después de 9 días de cultivo (215 horas). Por
otra parte, en el caso de un cambio de temperatura durante la fase
estacionaria (a las 98 horas de cultivo), la producción de AE cayó
hasta un nivel bajo (2200 unidades/ml). En este caso, aunque la
cantidad de AE producida en este experimento es baja en conjunto en
comparación con los resultados del Ejemplo 1, esta diferencia es
debida a una diferencia en el aumento del número de generaciones de
las células 3\mu-1S.
El aumento en la producción de AE, producido por
un cambio de temperatura en un cultivo discontinuo se piensa que
está íntimamente relacionado con el crecimiento celular que tiene
lugar a la temperatura de cultivo primaria (36ºC) (que garantiza un
número adecuado de células) y con el consumo de componentes del
medio o con la acumulación de metabolitos dañinos que acompañan a
ese crecimiento. Por lo tanto, según los resultados obtenidos en
este experimento, el momento óptimo para el cambio de temperatura
es el momento en el que la cantidad de producción de AE ha
aumentado de manera suficiente y el consumo de componentes del medio
o la acumulación de metabolitos dañinos está a un nivel lo más bajo
posible. Concretamente, se considera que el momento optimo es 62
horas después del inicio del cultivo.
Sin embargo, en caso de aumentar la escala del
experimento para la producción de volúmenes grandes, ya que es
posible que la velocidad de crecimiento celular puede ser diferente
de la del caso del cultivo a escala de sólo 1 litro, el momento del
cambio de temperatura no se puede determinar simplemente a partir
del tiempo de cultivo obtenido cuando el experimento se lleva a
cabo a escala de 1 litro. Desde el punto de vista del consumo de
componentes del medio o de la acumulación de metabolitos dañinos, se
considera preferible usar el crecimiento celular como indicador del
momento del cambio de temperatura en el caso del cultivo
discontinuo. Así, en este experimento, debido a que la densidad
celular después de 62 horas de cultivo fue de 5 x 10^{5}
células/ml, y a que la densidad celular conseguida a 36ºC fue de 8,5
x 10^{5} células/ml, el momento óptimo del cambio de temperatura
en un cultivo discontinuo de células 3\mu-1S se
estima que es el momento en el que se alcanza el 59% de la densidad
celular que se puede obtener a la temperatura de incubación primaria
(36ºC).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Células 3\mu-1S subcultivadas
en matraces Erlenmeyer volumétricos, se inocularon en un matraz de
agitación de 3 litros a una densidad de 2 x 10^{5} células/ml y
en un volumen de cultivo de 1500 ml, seguido de cultivo durante 3
días a 37ºC. El medio aquí usado fue un medio libre de suero en el
que se añadieron insulina y transferrina a concentraciones de 5
\mug/ml de cada una de ellas en medio F-12CMG2T
(Ajinomoto) (para ser denominado simplemente como medio). Después
de completado el precultivo, las células 3\mu-1S
se recuperaron mediante separación centrífuga (1000 rpm, 5 minutos)
y se suspendieron en medio de nueva aportación.
Esta suspensión celular se inoculó a una
densidad celular de 2 x 10^{5} células/ml y en un volumen de
cultivo de 750 ml en seis matraces de agitación de 1 litro que
permitían el control de la temperatura, del oxígeno disuelto (DO) y
del pH, tras lo cual el cultivo se inició. En esta ocasión, las
temperaturas de cultivo se controlaron a 30ºC, 32ºC, 33,5ºC, 35ºC,
36ºC y 37ºC para cada uno de los recipientes de cultivo. El DO se
mantuvo a una saturación de aire superior al 60% mediante gaseado
continuo con aire a 100 ml/min según se ha descrito en lo que
antecede. El pH se controló a 7,2 en todos los recipientes de
cultivo. Además, la velocidad de agitación de los matraces de
agitación se ajustó a 100 rpm. Las células se cultivaron durante 5
días.
Se recogieron muestras de cultivo cada 24 horas
para determinar la densidad de las células totales y de las células
viables, y la concentración de glucosa en el medio. La densidad de
las células totales y de las células viables se determinó
diariamente mediante el método de exclusión con el colorante azul
tripán en un hemocitómetro, después de tratamiento con tripsina. La
concentración de glucosa en el sobrenadante de los cultivos se midió
también diariamente con el Analizador de glucosa
ST-1 (Oriental electric). Todas las muestras,
incluyendo la suspensión celular, las células y el sobrenadante, se
almacenaron a -20ºC hasta que se requirió su uso.
El ensayo de la actividad de AE se realizó
usando un sustrato sintético,
Ac-[^{125}I]-Tyr-Phe-Gly
(véanse, Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol. 137, págs.
984-991, 1986 y la publicación de Patente japonesa
no examinada núm. 1-104168). La actividad
enzimática de 1 unidad se define como la cantidad de actividad que
amida el 50% de 1 pmol de sustrato en 1 hora a 37ºC en condiciones
de reacción estándar. El análisis de aminoácidos se realizó usando
el Analizador de aminoácidos modelo L-8500
(Hitachi). Además, se recogieron muestras del cultivo (suspensión
celular) y del sobrenadante del cultivo para medir la proporción de
lisis celular, muestras de sobrenadante de cultivo para
SDS-PAGE y transferencia Western, y muestras de
células para análisis de transferencias Southern y Northern, en los
días 3 y 5 de cultivo, y se almacenaron congeladas a -20ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
El efecto de la temperatura de cultivo sobre el
crecimiento celular se muestra en la Fig. 1. Los puntos negros de
la gráfica indican la densidad de las células totales y los puntos
blancos indican la densidad de las células viables. El crecimiento
celular más favorable fue a 36ºC y fue inhibido acompañando a un
descenso de la temperatura de incubación por debajo de 36ºC. Por
debajo de 32ºC, el crecimiento celular se suprimió por completo. Por
otra parte, la viabilidad celular tendió a decrecer a medida que la
temperatura de cultivo aumentaba.
\vskip1.000000\baselineskip
La producción de AE se muestra en la Fig. 2. La
producción de AE exhibió un máximo a 35ºC, alcanzando un nivel de
2000 unidades/ml después de 5 días de cultivo. A temperaturas
superiores e inferiores a 35ºC, la producción de AE disminuyó a
medida que la temperatura de cultivo aumentaba o disminuía.
La productividad de AE por célula se calculó a
partir de las Figs. 1 y 2. Los resultados se muestran en la Fig. 3.
A 30ºC y 32ºC, la productividad aumentó a medida que el cultivo
progresaba, manifestándose la productividad más alta a 32ºC. Por
otra parte, a temperaturas de cultivo de 33,5ºC y superiores, el
aumento en la productividad descendió a medida que el cultivo
progresaba, tendiendo finalmente la productividad a descender. Esta
tendencia se hace más marcada a medida que la temperatura de
cultivo se aumentaba.
\vskip1.000000\baselineskip
Los cambios cualitativos y cuantitativos en el
DNA y mRNA de AE, producidos por la temperatura de cultivo, se
estudiaron mediante transferencia Southern y transferencia Northern
respectivamente.
\newpage
Análisis de transferencia Southern: Se aisló el
DNA genómico procedente de las células cultivadas a diferentes
temperaturas, usando un kit para aislamiento de DNA (Bio 101). La
muestra de DNA se digirió con una enzima de restricción (EcoRI),
realizándose después una electroforesis en gel de agarosa, a 1
\mug/pista. Después de la electroforesis, el DNA presente en el
gel se desnaturalizó con álcali y se transfirió a una membrana de
nilón (Hybond-N+, Amersham) en condiciones de
vacío.
Después de la reticulación con radiación UV, se
realizó una pre-hibridación durante 2 horas a 42ºC
[Disolución de pre-hibridación: SSC 5X (SSC 20X;
NaCl 3 M, citrato trisódico 0,3 M), Disolución de Denhardt 5X
(Disolución de Denhardt 100X; BSA (albúmina de suero bovino) al 2%
(p/v), Ficoll^{TM} al 2% (p/v), PVP (polivinilpirrolidona) al 2%
(p/v)), SDS al 0,5% (p/v), formamida al 50% (v/v), DNA de esperma de
arenque (fragmentado y desnaturalizado con calor) en concentración
de 100 \mug/ml]. El plásmido que porta AE, pKD799BglII (Animal
Cell Technology: Basic & Applied Aspects, Vol. 5,
493-499 (1993) y publicación de Patente japonesa no
examinada núm. 2-190193) se digirió con EcoRI para
obtener un fragmento del DNA de AE.
Usando este fragmento como molde, una sonda
específica para AE, marcada con ^{32}P, sintetizada usando
sistemas Megaprime^{TM} de marcaje de DNA, se añadió a la
disolución de pre-hibridación hasta alcanzar una
concentración de 1 x 10^{6} cpm/ml para obtener la disolución de
hibridación. La disolución de pre-hibridación usada
en la pre-hibridación fue sustituida por la
disolución de hibridación, después de lo cual la hibridación se
realizó durante la noche (16 horas) a 42ºC. Después de realizar
lavados de la membrana en condiciones de rigurosidad, las
transferencias se analizaron mediante placa de captación de imágenes
digitales (IP) (del inglés, "Imaging
Plate")-autorradiografía usando un analizador
Bio-imaging BAS2000II (Fuji Photo
Film).
Análisis de transferencia Northern: Se aisló RNA
total procedente de las células cultivadas a diferentes
temperaturas, usando el reactivo TRIzol^{TM} (Gibco BRL). Se
realizó una electroforesis en gel de agarosa sobre la muestra de
RNA, en presencia de formaldehído, a 20 \mug/pista. Después de la
electroforesis, el RNA presente en el gel se transfirió a una
membrana de nilón en condiciones de vacío. Después de la
reticulación con radiación UV, se realizó una
pre-hibridación durante 2 horas a 42ºC. La sonda
específica para AE, marcada con ^{32}P, anteriormente mencionada,
se añadió a la disolución de pre-hibridación hasta
alcanzar una concentración de 5 x 10^{5} cpm/ml, para obtener la
disolución de hibridación.
La disolución de pre-hibridación
usada para la pre-hibridación fue sustituida por la
disolución de hibridación y la hibridación se realizó durante la
noche (16 horas) a 42ºC. Después de realizar lavados de la membrana
en condiciones de rigurosidad, las transferencias se analizaron
mediante placa de captación de imágenes digitales
(IP)-autorradiografía usando un analizador
Bio-imaging analyzer BAS2000II (Fuji Photo
Film). Posteriormente, la sonda específica para AE hibridada se
retiró hirviendo la membrana con una disolución de SDS al 0,5% (p/v)
durante 30 minutos, con el fin de hacer una nueva hibridación a una
sonda específica para \beta-actina, marcada con
^{32}P. Esta sonda se sintetizó usando como molde cDNA de la
\beta-actina humana (Clontech), usando sistemas
Megaprime^{TM} de marcaje de DNA. La hibridación y el análisis se
realizaron de la misma manera.
Los resultados de la hibridación por
transferencia Southern se muestran en la Fig. 4. El DNA de AE
manifestó el mismo tamaño molecular en todas las muestras (2351 pb)
y no se observó que la temperatura de cultivo causara cambios
cualitativos. Además, se observó que la cantidad de mRNA de AE
manifestaba un marcado aumento a medida que la temperatura del
cultivo descendía (Fig. 5). En esta ocasión, además de la banda
principal de mRNA de AE, se observó otra banda de
rRNA-18S en las inmediaciones. El origen de esta
banda, sin embargo, sigue siendo desconocido. No obstante, debido a
que la banda principal del mRNA de AE exhibe el mismo tamaño
molecular, se puede decir que el mRNA de AE de la banda principal
no ha experimentado cambios cualitativos. Además, debido a que no
se observaron cambios cualitativos en el mRNA de la
\beta-actina causados por la temperatura de
incubación, se confirmó que el mRNA de la
\beta-actina se podía usar como control interno de
este análisis.
Con el fin de determinar de manera más precisa
los cambios cuantitativos en el mRNA de AE, la señal de cada una de
las bandas principales se cuantificó en forma del valor de la
luminiscencia fotoestimulada (PSL) (del inglés,
" Photo-Stimulated Luminescence") y
cada uno de los contenidos relativos de mRNA de AE se obtuvo como
el cociente del valor de PSL de la banda principal del mRNA de AE
entre el de la banda principal del mRNA de la
\beta-actina. Este resultado se muestra en la Fig.
6.
El contenido relativo de mRNA de AE incrementó a
medida que la temperatura de cultivo descendía, alcanzándose
niveles a 30ºC y a 32ºC que fueron de 1,8 a 2,4 veces mayores que el
contenido a 37ºC. Así, el aumento en el contenido de mRNA de AE se
considera que es un factor importante de los aumentos de la
productividad de AE resultantes de los descensos en la temperatura
de cultivo. Sin embargo, debido a que la productividad de AE por
célula alcanzó niveles a 30ºC y a 32ºC que fueron de 4,3 a 5,3 veces
mayores que el nivel alcanzado a 37ºC en el día 5 de cultivo (Fig.
3), se piensa que la temperatura de cultivo ejerce un efecto tanto
en el proceso de traducción del mRNA de AE como en el proceso de
secreción de AE.
\vskip1.000000\baselineskip
Se estudió el consumo de glucosa y aminoácidos
considerados como indicadores del consumo del medio. La velocidad
de consumo de glucosa y la velocidad de consumo de aminoácidos se
calcularon en forma del valor medio correspondiente a 5 días de
cultivo, a partir de la concentración de glucosa o de las
concentraciones de diferentes aminoácidos en el sobrenadante del
cultivo, y de la densidad de las células viables (Fig. 1). Los
resultados se muestran respectivamente en la Fig. 7 y en la Tabla
1.
La velocidad de consumo de glucosa descendió con
el descenso de la temperatura de cultivo, desde 80 \mug/10^{5}
células/día a 37ºC, hasta 24 \mug/10^{5} células/día a 30ºC
(Fig. 7). Además, aunque la velocidad de consumo de aminoácidos
aumentó en el caso de Asp y Ala a medida que la temperatura de
incubación disminuía (aunque la velocidad de producción disminuyó
en el caso de Ala), no hubo cambios en las velocidades de consumo de
Glu, Gly, Met, Ile y Leu, aunque la de los demás aminoácidos
disminuyó (Tabla 1). Sobre la base de estos resultados, quedaba
claro que el consumo de la mayoría de los componentes del medio
disminuía a medida que la temperatura de cultivo descendía. Esto
significa que una temperatura de cultivo baja permite que tenga
lugar la producción de sustancias al tiempo que requiere solamente
una pequeña cantidad de componentes nutrientes, indicando así que
este tipo de cultivo puede contribuir a la reducción de costes
debidos al medio.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ensayó la actividad de la
lactato-deshidrogenasa (LDH) en el líquido de
cultivo y en el sobrenadante de cultivo en los días 3 y 5 de
cultivo, y la proporción de células lisadas se calculó como la
proporción de la segunda actividad mencionada con respecto a la
primera (%). Los resultados se muestran en la Fig. 8.
Durante 72 horas de cultivo no hubo diferencias
significativas en la proporción de las células lisadas que
acompañasen a los cambios en la temperatura de cultivo (de 11% a
14%). Sin embargo, después de 120 horas de cultivo, la proporción
de células lisadas aumentó a medida que la temperatura de cultivo
aumentaba (a 30ºC: 15%, a 37ºC: 32%). Este hallazgo indica que el
descenso de la temperatura de cultivo no sólo mantiene a las
células en buen estado, posibilitando así que el cultivo se
prolongue durante mucho tiempo, sino que también inhibe la
contaminación del medio producida por proteínas contaminantes que se
originan en las células que contienen proteasas.
\vskip1.000000\baselineskip
El efecto de la temperatura de cultivo sobre la
pureza de la proteína AE durante el cultivo se estudió mediante
SDS-PAGE. Partes alícuotas de cada uno de los
sobrenadantes en el día 5 de cultivo, que corresponden a 45
unidades de actividad de AE, se aplicaron a un gel de poliacrilamida
al 10% que contenía SDS (SDS-PAGE mini,
Tefco). La electroforesis se llevó a cabo con una corriente
constante de 25 mA y el gel se tiñó con CBB. Además, se usaron
Estándares de proteínas de amplio intervalo, para
SDS-PAGE (Tefco), como marcadores de peso molecular.
El resultado se muestra en la Fig. 9.
Las muestras de cada una de las pistas,
comenzando por orden desde la fila 1, consistieron en el
sobrenadante del cultivo a 30ºC, 32ºC, 33,5ºC, 35ºC, 36ºC y 37ºC.
Además, las flechas del lado izquierdo de la figura indican las
posiciones de los marcadores de peso molecular, mientras que las
flechas del lado derecho (81 y 75 kDa) indican la AE. Además, las
dos bandas situadas justo debajo de AE son las bandas que
representan a la transferrina que se añadió al medio. Las proteínas
contaminantes contenidas en el sobrenadante del cultivo,
disminuyeron notablemente a medida que la temperatura del cultivo
descendía. Este hallazgo indica que el cultivo a temperaturas bajas
es también ventajoso en el procedimiento de purificación de AE. La
disminución de las proteínas contaminantes resultante de cultivar a
temperatura baja se considera que es el resultado de lentificar el
recambio metabólico que acompaña a la reducción de consumo del
medio (Fig. 7, Tabla 1) y a la disminución de la proporción de las
células lisadas (Fig. 8).
A continuación, el efecto de la temperatura de
cultivo sobre la proteína AE durante el cultivo se estudió mediante
transferencia Western. Partes alícuotas de cada uno de los
sobrenadantes en el día 5 de cultivo, que corresponden a 45
unidades de actividad de AE, se aplicaron a un gel de poliacrilamida
al 10% que contenía SDS (SDS-PAGE mini, Tefco). La
electroforesis se llevó a cabo a una corriente constante de 25 mA.
Después de la electroforesis, la proteína presente en el gel se
electrotransfirió a una membrana de PVDF (poli(fluoruro de
vinilideno)) (Millipore). La transferencia se llevó a cabo durante
30 minutos con una corriente constante de 3 mA/cm^{2}. Después de
que la transferencia se hubo completado, la membrana de PVDF se
bloqueó con gelatina al 3% y se trató con un anticuerpo policlonal
(fracción de IgG) anti-AE, biotinizado, procedente
de conejo.
Después de lavar con Tween 20 al 0,1%-PBS, la
membrana se trató con un conjugado de
avidina-peroxidasa de rábano rusticano (peroxidasa
de rábano rusticano avidina D, Vector). Después de lavar de nuevo
con Tween 20 al 0,1%-PBS, las bandas inmunorreactivas se
visualizaron usando un conjunto de inmunotinción con POD (Wako
Pure Chemical Industries). Además, se usaron Estándares
preteñidos SeeBlue^{TM} (Novex) como marcadores de peso
molecular. El resultado se muestra en la Fig. 10.
Lo mismo que en la Fig. 9, las muestras de cada
una de las pistas, comenzando en orden por la fila 1, consistieron
en sobrenadante de cultivo a 30ºC, 32ºC, 33,5ºC, 35ºC, 36ºC y 37ºC.
Además, las flechas del lado izquierdo de la figura indican las
posiciones de los marcadores de peso molecular, mientras que las
flechas del lado derecho (81 kDa y 75 kDa) indican la AE. Las
diferencias en el peso molecular de la proteína AE podrían ser
debidas a diferencias en la modificación de la cadena azucarada. Ya
que el peso molecular de la proteína AE fue constante en todas las
pistas y ya que no hubo cambios en la proporción de las intensidades
de las dos bandas (de 81 kDa y 75 kDa), se demostró que la proteína
AE no había experimentado cambios cualitativos (peso molecular y
modificación de la cadena azucarada) debido a la temperatura de
cultivo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
En caso de realizar el cultivo por debajo de
37ºC según el Ejemplo 1, aunque el crecimiento de las células se
inhibe, se demostró que se mantiene una viabilidad celular alta, la
productividad celular de AE aumenta, el consumo de componentes del
medio (glucosa, la mayor parte de los aminoácidos) desciende y las
impurezas debidas a proteínas presentes en el medio de cultivo
disminuyen. Estos fenómenos indican que bajando la temperatura de
cultivo después de haber obtenido un número suficiente de células,
es posible conseguir un aumento significativo en la eficiencia de
la producción de la sustancia deseada mediante cultivo de células
animales. Este experimento se llevó a cabo para estudiar la
aplicación de este cultivo a temperatura baja a un cultivo
discontinuo.
Las células 3\mu-1S,
subcultivadas en matraces Erlenmeyer de 300 ml, se precultivaron
durante 3 días a 37ºC después de ser inoculadas en un matraz de
agitación de 3 litros, a una densidad celular de 2 x 10^{5}
células/ml y en un volumen de cultivo de 1500 ml. El medio libre de
suero anteriormente mencionado se usó para el medio de cultivo. Una
vez completado el precultivo, las células 3\mu-1S
se recogieron mediante centrifugación (1000 rpm, 5 minutos) y se
suspendieron en medio de nueva aportación.
Esta suspensión celular se inoculó luego en tres
matraces de agitación de 1 litro que permitían el control de la
temperatura, del oxígeno disuelto (DO) y del pH, hasta alcanzar una
densidad celular de 2 x 10^{5} células/ml y en un volumen de
cultivo de 650 ml, tras lo cual el cultivo se inició. Los
recipientes de cultivo 1 y 2 se cultivaron a 37ºC y 32ºC
respectivamente durante todo el período de cultivo. El recipiente de
cultivo 3 se incubó primero a 37ºC, después de lo cual la
temperatura se cambió de 37ºC a 32ºC después de 48 horas de cultivo
y se mantuvo a esa temperatura la duración del período de cultivo.
El DO se mantuvo a una saturación de aire superior al 60% mediante
gaseado continuo con aire a 100 ml/min según se ha descrito en lo
que antecede. El pH se controló a 7,2 en todos los recipientes de
cultivo. Además, la velocidad de agitación de los matraces de
agitación se ajustó a 100 rpm. Los resultados se muestran en la Fig.
11.
Los puntos blancos y los puntos negros de las
gráficas indican los resultados a una temperatura de cultivo de
37ºC, los triángulos blancos y negros indican los resultados a 32ºC
y los cuadrados blancos y negros indican los resultados del cultivo
cuando se usa un cambio de temperatura. Además, los círculos
blancos, los triángulos blancos y los cuadrados blancos de la Fig.
11(A) indican la densidad de las células viables, mientras
que los círculos negros, los triángulos negros y los cuadrados
negros indican la densidad de las células totales.
Durante el cultivo a 37ºC, las células
manifestaron un crecimiento logarítmico al tiempo que mantuvieron
una viabilidad celular alta (del 92% y superior) a lo largo de 4
días de cultivo. Aunque el recuento de células alcanzó
aproximadamente 1 x 10^{6} células/ml, el crecimiento celular se
detuvo entonces, exhibiendo un descenso notable de la viabilidad
(31% en el día 9 de cultivo). Además, durante el cultivo a 32ºC,
aunque la densidad celular tendió a disminuir ligeramente, la
viabilidad se mantuvo en el 85% o más a lo largo de todo el período
de incubación.
Por otra parte, durante el cultivo en el que la
temperatura se cambió, un crecimiento celular casi igual al
producido a 37ºC, se exhibió durante 24 horas después del cambio de
temperatura, alcanzándose una densidad celular de 6,5 x 10^{5}
células/ml. El crecimiento celular se detiene de 24 a 48 horas
después del cambio de temperatura. Aunque posteriormente se observó
una disminución de la densidad celular, la viabilidad se mantuvo en
el 80% o superior. Sobre la base de los anteriores hallazgos, quedó
demostrado que la viabilidad celular se mantiene a un nivel alto y
que el cultivo se puede llevar a cabo durante un tiempo prolongado
usando una temperatura de cultivo más baja (32ºC).
La Fig. 11(B) muestra la concentración de
glucosa que permanece en el medio. A partir de esta gráfica se puede
entender que como resultado del cambio de temperatura de 37ºC a
32ºC, el consumo de glucosa disminuye de la misma manera que cuando
el cultivo se realiza a 32ºC. Además, aunque el consumo de glucosa
disminuye a partir de las 96 horas de cultivo, aún cuando el
cultivo se realiza a 37ºC, esta disminución se considera que es el
resultado de un descenso en la actividad de las propias células
debido a un notable descenso en la densidad de las células viables.
Por lo tanto, esto se considera que es esencialmente diferente de la
disminución en el consumo de glucosa provocado por la bajada de la
temperatura de cultivo.
La Fig. 11(C) muestra la producción de
AE. En el caso de un cultivo realizado a 37ºC, la producción de AE
fue solamente de 1800 unidades/ml. En cambio, en el caso en el que
se usa un cambio de temperatura, la producción de AE alcanzó 5000
unidades/ml en el día 9 de cultivo y siguió manifestando una
tendencia a aumentar. En el caso de un cultivo realizado a 32ºC, la
producción de AE alcanzó 2900 unidades/ml después de 9 días de
cultivo. Además, como se muestra en la Fig. 12, en contraste con el
descenso de productividad celular a partir del día 3 de cultivo a
37ºC, cayendo hasta casi 0 unidades/10^{5} células/día en el día 5
y después, en el caso de realizar el cultivo a 32ºC, la
productividad tiende a aumentar a medida que el cultivo progresa
(valor máximo: 280 unidades/10^{5} células/día).
La productividad celular en el caso de un cambio
de temperatura exhibió valores más bajo en comparación con el
cultivo a 32ºC. Sin embargo, la productividad celular aumentó
durante el período desde las 48 hasta las 96 horas después del
cambio. Aunque alcanzó 180 unidades/10^{5} células/día y a
continuación disminuyó ligeramente después de eso, continuó estando
a nivel alto (125 unidades/10^{5} células/día).
Estos hallazgos indicaron que el cambio a una
temperatura más baja es efectivo en la producción de AE mediante
cultivo discontinuo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
La eficacia del cultivo a temperatura baja en un
cultivo discontinuo se confirmó en el Ejemplo 2. A continuación se
llevó a cabo este experimento para estudiar la aplicación de
cultivar a temperatura baja a un cultivo continuo.
El sistema de cultivo mostrado en la Fig. 13 se
construyó con el fin de realizar un cultivo continuo. Se usó un
separador centrífugo continuo para preparar un concentrado de
células (suspensión) usado para realizar la perfusión y para
separar el sobrenadante del cultivo.
Células 3\mu-1S, subcultivadas
en matraces Erlenmeyer de 300 ml, se inocularon en un matraz de
agitación de 1 litro incluido en el sistema de cultivo
anteriormente mencionado, hasta constituir una densidad celular de
2 x 10^{5} células/ml y en un volumen de cultivo de 800 ml,
iniciándose seguidamente el precultivo. La perfusión se inició
cuando la densidad celular alcanzó 1 x 10^{6} células/ml. La
velocidad de perfusión se incrementó luego correspondiendo al
crecimiento celular y el precultivo se llevó a cabo hasta que la
densidad celular alcanzó 6 x 10^{6} células/ml. Además, la
temperatura de cultivo se controló a 37ºC, el DO se controló a una
saturación de aire del 60% y el pH se controló a 7,2. Además de
esto, la velocidad de agitación del matraz de agitación se ajustó a
100 rpm. Seguidamente el cultivo se dividió en dos porciones para
estudiar los efectos de cultivar a temperatura baja (densidad
celular inoculada: 3 x 10^{6} células/ml). Usando dos conjuntos
del sistema de cultivo anteriormente mencionado, el cultivo se
inició en las mismas condiciones que el precultivo. Usando una
velocidad de perfusión de 4,5 volumen de cultivo/día, la temperatura
de cultivo de uno de los recipientes de cultivo se cambió de 37ºC a
34ºC cuando la densidad celular alcanzó de nuevo 6 x 10^{6}
células/ml, para investigar el efecto de cultivar a temperatura
baja. Además, con la excepción de la temperatura de cultivo, las
mismas condiciones de cultivo se usaron para ambas temperaturas de
incubación. Los resultados se muestran en la Fig. 14.
La Fig. 14(A) muestra los cambios en la
densidad celular. Ambos recipientes de cultivo manifestaron un
crecimiento celular igual hasta que la densidad celular alcanzó 6 x
10^{6} células/ml. Después de que la temperatura se cambió de
37ºC a 34ºC, la densidad celular se hizo estable a una densidad de 6
a 8 x 10^{6} células/ml en las condiciones de este experimento.
Además, la viabilidad celular se mantuvo en el 90% y superior en
ambos cultivos. Además de esto, el consumo de glucosa durante el
cultivo a 34ºC disminuyó en comparación con el consumo de glucosa a
37ºC.
Como se muestra en las Figs. 14(B) y (C),
la aplicación de cultivar a temperatura baja a un cultivo de alta
densidad fue efectiva, dando como resultado aumentos tanto en la
producción de AE por recipiente como en la productividad celular de
AE. En comparación con el cultivo a 37ºC, la producción de AE por
recipiente aumentó aproximadamente 1,6 veces, alcanzando 4 x
10^{6} unidades/día (Fig. 14(B), equivalentes a 27 veces la
cantidad producida en el caso del cultivo discontinuo a 37ºC usando
el mismo volumen de cultivo), mientras que la productividad celular
de AE aumentó aproximadamente 2,5 veces, alcanzando 100
unidades/10^{5} células/día (Fig. 14(C)). Además, debido a
que no hubo disminución en la productividad celular de AE observada,
que acompaña al aumento de la densidad celular (véase la
Realización 1), se espera que la producción de AE se pueda aumentar
aún más a medida que aumente la densidad celular.
Sobre la base de los anteriores resultados,
quedó demostrado que cultivar a temperaturas más bajas es asimismo
efectivo también en el caso de un cultivo continuo.
La presente invención hace que sea
extremadamente fácil aumentar la eficiencia global (costes
reducidos) del cultivo de células animales. Concretamente, bajar la
temperatura de cultivo no solamente aumenta de manera efectiva la
productividad de una sustancia, sino que también reduce el consumo
de medio y disminuye las impurezas tales como proteínas derivadas
de productos metabólicos secundarios y de contenidos celulares,
etcétera. Así, junto con ser capaz de llevar a cabo una reducción
significativa de los costes de cultivo, permite además que los
costes sean reducidos también en el procedimiento de purificación.
De manera adicional, realizar el cultivo a temperaturas bajas es
también ventajoso en relación con la conservación de energía. Por lo
tanto, las presentes propuestas deberían contribuir enormemente a
la producción de sustancias mediante cultivo de células animales a
todas las escalas de producción.
Claims (7)
1. Un método para cultivar células animales
recombinantes, en el que dichas células animales recombinantes
exhiben una productividad celular más alta de la proteína
recombinante a la temperatura más baja descrita más adelante, a
través de aumentar el contenido del mRNA que codifica la proteína,
pero no son mutantes sensibles a la temperatura, que comprende las
etapas de:
(1) cultivar las células animales recombinantes
a una temperatura a la que las células animales pueden crecer; y
luego
(2) cultivar las células recombinantes a una
temperatura más baja, en el que dicha temperatura es de 30ºC a
35ºC; y
en el que dichas células animales
recombinantes son células
3\mu-1s.
2. Un método según la reivindicación 1, en el
que dicha temperatura de cultivo más baja es de 30ºC a 32ºC.
3. Un método según la reivindicación 1 ó 2, en
el que dicha temperatura a la que las células animales pueden
crecer está entre aproximadamente 36ºC y 38ºC.
4. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la temperatura más baja es
al menos 3ºC inferior a dicha temperatura a la que las células
animales pueden crecer.
5. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la transición desde cultivar
a dicha temperatura a la que las células animales pueden crecer,
hasta cultivar a la temperatura más baja, se hace durante una fase
de crecimiento logarítmica de las células, antes del crecimiento de
las células en estado estacionario, o antes de que se alcance la
densidad celular máxima correspondiente a la primera
temperatura.
6. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el cultivo es un cultivo
discontinuo y el momento del cambio de temperatura está entre las 24
y las 72 horas después de la inoculación del cultivo.
7. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el cultivo es un cultivo
continuo y el momento del cambio de temperatura es un momento en el
que la densidad celular está en el intervalo de 10^{6} a 10^{8}
células/ml.
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