ES2311540T3

ES2311540T3 - Acido nucleico y proteina correspondiente llamada 85p1b3 util en el tratamiento y deteccion del cancer.

Info

Publication number: ES2311540T3
Application number: ES01968204T
Authority: ES
Inventors: Arthur B. Raitano; Mary Faris; Rene S. Hubert; Daniel Afar; Wangmao Ge; Pia Challita-Eid; Aya Jakobovits
Original assignee: Agensys Inc
Current assignee: Agensys Inc
Priority date: 2000-08-28
Filing date: 2001-08-28
Publication date: 2009-02-16
Anticipated expiration: 2021-08-28
Also published as: EP1313850A2; DK1313850T3; US20030170626A1; US20070036762A1; WO2002018578A2; US7501502B2; AU2001288466B9; AU8846601A; EP2022797A3; DE60135232D1; CA2705366A1; CY1109029T1; AU2007202977B2; US7217799B2; ATE403716T1; US8173381B2; WO2002018578A3; CA2420990C; CA2420990A1; US20090203016A1

Abstract

Un método in vitro para detectar los niveles de expresión de un producto génico en una muestra de ensayo y una muestra normal, comprendiendo el método: determinar los niveles de expresión del producto génico en la muestra de ensayo y la muestra normal; y comparar los niveles de expresión del producto génico detectado en la muestra de ensayo y la muestra normal; en el que el producto génico es seleccionado a partir del grupo que consiste en un mARN correspondiente a la Figura 2 o una proteína que es al menos 90% idéntica a la Figura 2 y por la cual la presencia de niveles elevados de producto génico en la muestra de ensayo en relación con la muestra normal indica la presencia de un cáncer en un tejido seleccionado del grupo que consiste en próstata, vejiga, riñón, colon, pulmón, ovario, mama, estómago, útero y cerviz.

Description

Ácido nucleico y proteína correspondiente llamada 85P1B3 útil en el tratamiento y detección del cáncer.

Campo de la invención

La invención descrita en este documento se refiere a un nuevo gen y a la proteína que codifica, llamada 85P1B3, y a métodos diagnósticos y terapéuticos y composiciones útiles en el tratamiento médico de varios cánceres que expresan 85P1B3.

Antecedentes de la invención

El cáncer es la segunda causa principal de muerte en los seres humanos junto con la enfermedad coronaria. Por todo el mundo, millones de personas mueren cada año de cáncer. Sólo en los Estados Unidos, según dice la Sociedad Americana del Cáncer, el cáncer causa la muerte de más de medio millón de personas cada año, siendo diagnosticados más de 1,2 millones de nuevos casos cada año. Aunque las muertes por problemas cardíacos han estado disminuyendo considerablemente, las que son resultado del cáncer generalmente suben. En la primera parte del próximo siglo, se prevé que el cáncer será la causa principal de muerte.

Por todo el mundo, son varios cánceres los que destacan como principalmente mortales. En particular, los carcinomas de pulmón, próstata, mama, colon, páncreas y ovario representan las causas principales de muerte por cáncer. Estos y prácticamente todos los otros carcinomas comparten una propiedad mortal común. Con muy pocas excepciones, la enfermedad metastásica de una carcinoma es mortal. Además, hasta para aquellos pacientes con cáncer que sobreviven al principio a sus cánceres primarios, la experiencia común ha mostrado que sus vidas son drásticamente alteradas. Muchos pacientes con cáncer experimentan una gran ansiedad producida por la conciencia del potencial fracaso del tratamiento o de la recurrencia. Muchos pacientes con cáncer experimentan debilitaciones físicas después del tratamiento. Además, muchos pacientes con cáncer experimentan una recurrencia.

Por todo el mundo, el cáncer de próstata es el cuarto cáncer más frecuente en hombres. En Norteamérica y Europa del Norte, es con mucho el cáncer más común en hombres y es el segundo que acaba en un resultado de muerte por cáncer en hombres. Sólo en los Estados Unidos, más de 30.000 hombres mueren cada año por esta enfermedad- sólo segunda después del cáncer de pulmón. A pesar de la magnitud de estas figuras, no hay todavía ningún tratamiento eficaz contra el cáncer de próstata metastásico. La prostatectomía quirúrgica, radioterapia, terapia de ablación hormonal, castración quirúrgica y la quimioterapia siguen siendo las principales modalidades de tratamiento. Lamentablemente, estos tratamientos son ineficaces para muchos y a menudo están asociados a consecuencias indeseables.

Respecto al enfoque diagnóstico, la carencia de un marcador del tumor de próstata que pueda detectar con exactitud tumores localizados en una etapa inicial comporta una limitación significativa en el diagnóstico y el tratamiento médico de esta enfermedad. Aunque el análisis del antígeno prostático específico (PSA, por sus siglas en inglés "Prostate Specific Antigen") en suero ha sido una herramienta muy útil, sin embargo, su especificidad y su utilidad general está extensamente considerada como deficiente en varios aspectos importantes.

El progreso en la identificación de marcadores específicos adicionales para el cáncer de próstata ha mejorado por la generación de xenoinjertos de cáncer de próstata que pueden recapitular las diferentes etapas de la enfermedad en ratones. Los xenoinjertos LAPC (por sus siglas en inglés "Los Angeles Prostate Cancer", en español "Cáncer de Próstata de Los Angeles") son xenoinjertos de cáncer de próstata que han sobrevivido la transferencia en ratones inmuno-deficientes combinados severos (SCID, por sus siglas en inglés "Severe Combined Immune Deficient") y que han exhibido la capacidad de imitar la transición de la dependencia de andrógenos a la independencia de andrógenos (Klein et al., 1997, Nat. Med. 3: 402). Los marcadores del cáncer de próstata más recientemente identificados incluyen PCTA-1 (Su et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7252), el antígeno de membrana específico de próstata (PSM, "Prostate-Specific Membrane") (Pinto et al., Clin Cancer Res, 2 de septiembre de 1996 (9):1445-51), STEAP (Hubert, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 7 de diciembre de 1999; 96(25): 14523-8) y el antígeno de células madres de próstata (PSCA, "Prostate Stem Cell Antigen") (Reiter et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 1735).

Aunque los marcadores antes mencionados, tales como PSA, PSM, PCTA y PSCA, han facilitado los esfuerzos para diagnosticar y tratar el cáncer de próstata, queda una necesidad de identificación de otros marcadores y dianas terapéuticas para cánceres de próstata y asociados para mejorar posteriormente el diagnóstico y la terapia.

El carcinoma de células renales (RCC, "Renal Cell Carcinoma") comporta aproximadamente un 3 por ciento de malignidades en adultos. Una vez que los adenomas alcanzan un diámetro de 2 a 3 cm, existe potencial maligno. En adultos, los dos principales tumores renales malignos son el adenocarcinoma de células renales y el carcinoma de células de transición de pelvis renal o del uréter. La incidencia del adenocarcinoma de células renales se estima en más de 29.000 casos en los Estados Unidos, y más de 11.600 pacientes muertos por esta enfermedad en 1998. El carcinoma de células de transición es menos frecuente, con una incidencia de aproximadamente 500 casos por año en los Estados Unidos.

La cirugía ha sido la principal terapia para el adenocarcinoma de células renales durante muchas décadas. Hasta hace poco, la enfermedad metastásica ha sido refractaria a cualquier terapia sistémica. Con los desarrollos recientes en terapias sistémicas, particularmente inmunoterapias, se puede tratar agresivamente el carcinoma de células renales metastásico en los pacientes apropiados con posibilidad de tener respuestas duraderas. Sin embargo, hacen falta terapias eficaces para estos pacientes.

De todos los nuevos casos de cáncer en los Estados Unidos, el cáncer de vejiga representa aproximadamente el 5 por ciento en hombres (el neoplasma en quinto lugar más común) y el 3 por ciento en mujeres (el octavo neoplasma más común). La incidencia aumenta despacio, simultáneamente con una creciente población más anciana. En 1998, había aproximadamente 54.500 casos, incluyendo 39.500 en hombres y 15.000 en mujeres. La incidencia por edades en los Estados Unidos es del 32 por 100.000 para hombres y 8 por 100.000 en mujeres. La relación histórica masculina/femenina de 3:1 puede disminuirse en relación con modelos fumadores en mujeres. Hubo aproximadamente 11.000 muertes por cáncer de vejiga en 1998 (7.800 en hombres y 3.900 en mujeres). La incidencia del cáncer de vejiga y la mortalidad aumentan fuertemente con la edad y será un problema creciente según la población se vuelva más anciana.

La mayor parte de los cánceres de vejiga reaparecen en la vejiga. El cáncer de vejiga es tratado con una combinación de resección transuretral de la vejiga (TUR, "Transurethral Resection of the Bladder") y quimioterapia intravesical o inmunoterapia. La naturaleza multifocal y recurrente del cáncer de vejiga destaca las limitaciones de la TUR. La mayoría de los cánceres invasivos músculares no tienen cura solo por TUR. La cistectomía radical y la diversión urinaria son los medios más eficaces para eliminar el cáncer, pero provocan un impacto innegable sobre la función urinaria y sexual. Sigue quedando una necesidad significativa de modalidades de tratamiento que sean beneficiosas para pacientes con cáncer de vejiga.

Aproximadamente 130.200 casos de cáncer colorectal aparecieron en 2000 en los Estados Unidos, incluyendo 93.800 casos de cáncer de colon y 36.400 de cáncer rectal. Los cánceres colorectales son los terceros cánceres más comunes en hombres y mujeres. Las tasas de incidencia disminuyeron considerablemente durante 1992-1996 (-2,1% por año). La investigación sugiere que esta disminución haya sido debida a un mayor rastreo y eliminación del pólipo, la progresión de la prevención de pólipos frente a cánceres invasivos. Hubo aproximadamente 56.300 muertes (47.700 de cáncer de colon, 8.600 de cáncer rectal) en 2000, lo que comporta aproximadamente el 11% de todas las muertes por cáncer en estadounidenses.

Actualmente, la cirugía es la forma más común de terapia para el cáncer colorectal, y para los cánceres que no se han extendido, es curativa con frecuencia. Se da quimioterapia, o quimioterapia más radiación, antes o después de la cirugía a la mayor parte de pacientes cuyo cáncer ha perforado profundamente la pared del intestino o se ha extendido a los nodos de linfa. Ocasionalmente es necesaria una colostomía permanente (la creación de una abertura abdominal para la eliminación de los desechos del cuerpo) para el cáncer de colon y raras veces se requiere para el cáncer rectal. Sigue quedando una necesidad de un diagnóstico eficaz y de modalidades de tratamiento para el cáncer colorectal.

Hubo aproximadamente 164.100 de nuevos casos de cáncer de pulmón y de bronquios en 2000, lo que comporta un 14% de todos los diagnósticos de cáncer estadounidenses. La tasa de incidencia del cáncer de pulmón y de bronquios disminuye considerablemente en hombres, desde un alto 86,5 por 100.000 en 1984 a 70,0 en 1996. En 1990, la tasa de aumento entre mujeres comenzó a reducirse. En 1996, la tasa de incidencia en mujeres era de 42,3 por 100.000.

El cáncer de pulmón y de bronquios causó aproximadamente 156.900 muertes en 2000, lo que comporta un 28% de todas las muertes por cáncer. Durante 1992-1996, la mortalidad por el cáncer de pulmón disminuyó considerablemente entre hombres (-1,7% por año) mientras que las tasas para mujeres todavía aumentaban considerablemente (0,9% por año). Desde 1987, han muerto más mujeres cada año por cáncer de pulmón que por cáncer de mama, que, en más de 40 años, era la principal causa de muerte por cáncer en mujeres. La disminución de la incidencia del cáncer de pulmón y de los índices de mortalidad lo más probablemente es que sea el resultado de las menores tasas de tabaquismo de los últimos 30 años; sin embargo, la disminución de modelos de fumadores entre mujeres se queda atrás del de los hombres. Es destacable que aunque la disminución del uso del tabaco en adultos se ha reducido, el uso de tabaco en la juventud aumente de nuevo.

Las opciones de tratamiento para el cáncer de pulmón y de bronquios son determinadas por el tipo y la etapa del cáncer e incluyen cirugía, radioterapia y quimioterapia. Para muchos cánceres localizados, la cirugía es por lo general el tratamiento de elección. Como se ha descubierto que la enfermedad por lo general se extiende con el tiempo, la radioterapia y la quimioterapia son a menudo necesarias en combinación con la cirugía. La quimioterapia sola o combinada con radiación es el tratamiento de elección para el cáncer de pulmón de células pequeñas; en este régimen, un porcentaje grande de pacientes experimenta una remisión, que en algunos casos es duradera. Queda, sin embargo, una necesidad todavía de un tratamiento eficaz y logros diagnósticos para los cánceres de pulmón y de
bronquios.

Se prevé que aparezcan aproximadamente 182.800 nuevos casos invasivos de cáncer de mama entre mujeres en los Estados Unidos durante el 2000. Además, se prevé que se diagnosticarán aproximadamente 1.400 nuevos casos de cáncer de mama en hombres en 2000. Después del aumento de aproximadamente el 4% por año en los años 80, las tasas de incidencia del cáncer de mama en mujeres se han ajustado en los años 90 a aproximadamente 110,6 casos por 100.000.

Sólo en EE.UU. hubo aproximadamente 41.200 muertes (40.800 mujeres, 400 hombres) en 2000 debido al cáncer de mama. El cáncer de mama alcanza el segundo puesto entre las muertes por cáncer en mujeres. De acuerdo con los datos más recientes, los índices de mortalidad disminuyeron considerablemente durante 1992-1996 con disminuciones más grandes en las mujeres más jóvenes, tanto blancas como negras. Estas disminuciones son probablemente el resultado de una detección más precoz y de mejores tratamientos.

Teniendo en cuenta las circunstancias médicas y las preferencias del paciente, el tratamiento del cáncer de mama puede implicar una lumpectomía (la eliminación local del tumor) y la eliminación de los nodos de linfa bajo el brazo; mastectomía (eliminación quirúrgica del pecho) y eliminación de los nodos de linfa bajo el brazo; radioterapia; quimioterapia; o terapia hormonal. A menudo, son usados dos o más métodos en combinación. Numerosos estudios han mostrado que, durante la etapa inicial de la enfermedad, las tasas de supervivencia a largo plazo después de la lumpectomía más la radioterapia son similares a las tasas de supervivencia después de la mastectomía radical modificada. Los avances significativos en las técnicas de reconstrucción proporcionan varias opciones para la reconstrucción de la mama después de la mastectomía. Recientemente, tal reconstrucción ha sido llevada a cabo al mismo tiempo que la mastectomía.

La supresión local del carcinoma ductal in situ (DCIS, "Ductal Carcinoma in situ") con cantidades adecuadas de tejido de mama normal circundante puede prevenir la recurrencia local del DCIS. La radiación en la mama y/o el tamoxifeno pueden reducir la posibilidad de que aparezca el DCIS en el tejido de mama restante. Esto es importante porque el DCIS, de ser dejado sin tratar, puede desarrollarse como un cáncer de mama invasivo. Sin embargo, hay serios efectos secundarios o secuelas con estos tratamientos. Por lo tanto, queda una necesidad de tratamientos eficaces del cáncer de mama.

Hubo aproximadamente 23.100 nuevos casos de cáncer ovárico en los Estados Unidos en 2000. Esto comporta el 4% de todos los cánceres entre mujeres y constituye el segundo entre los cánceres ginecológicos. Durante 1992-1996, las tasas de incidencia del cáncer ovárico disminuyeron considerablemente. Como consecuencia del cáncer ovárico, hubo aproximadamente 14.000 muertes en 2000. El cáncer ovárico causa más muertes que cualquier otro cáncer del sistema reproductivo femenino.

La cirugía, radioterapia y quimioterapia son las opciones de tratamiento para el cáncer ovárico. La cirugía, por lo general, incluye la eliminación de uno o ambos ovarios, las trompas de Falopio (salpingo-ooforectomía) y el útero (histerectomía). En algunos tumores muy precoces, sólo será eliminado el ovario implicado, especialmente en las jóvenes que deseen tener niños. En la enfermedad avanzada, se realiza una tentativa para eliminar toda la enfermedad intraabdominal para potenciar el efecto de la quimioterapia. Sigue quedando una necesidad importante de opciones de tratamiento eficaces para el cáncer ovárico.

Hubo aproximadamente 28.300 nuevos casos de cáncer pancreático en los Estados Unidos en 2000. En los últimos 20 años, las tasas del cáncer pancreático han disminuido en hombres. Las tasas entre mujeres han permanecido aproximadamente constantes, pero pueden comenzar a disminuir. El cáncer pancreático causó aproximadamente 28.200 muertes en 2000 en los Estados Unidos. En los últimos 20 años, ha habido una leve disminución pero significativa en los índices de mortalidad entre los hombres (aproximadamente -0,9% por año) mientras que las tasas han aumentado ligeramente entre mujeres.

La cirugía, radioterapia y quimioterapia son opciones de tratamiento para el cáncer pancreático. Estas opciones de tratamiento pueden ampliar la supervivencia y/o aliviar los síntomas en muchos pacientes, pero probablemente no producen una cura para la mayoría. Queda una necesidad significativa de opciones terapéuticas y diagnósticas adicionales para el cáncer pancreático.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a un gen nuevo, denominado 85P1B3, que se sobreexpresa en los múltiples cánceres nombrados en la Tabla I. El análisis de la expresión por inmunotransferencia Northern de la expresión del gen 85P1B3 en tejidos normales muestra un modelo de expresión restringido en tejidos adultos. Se proporcionan las secuencias de nucleótidos (Figura 2) y de aminoácidos (Figura 2 y Figura 3) de 85P1B3. El perfil asociado al tejido de 85P1B3 en tejidos normales adultos, combinado con la sobreexpresión observada en tumores de próstata y otros, muestra que 85P1B3 se sobreexpresa aberrantemente en al menos algunos cánceres, y por eso sirve como una diana diagnóstica y/o terapéutica útil para los cánceres de tejidos, tales como los mencionados en la Tabla I.

De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un método in vitro para detectar los niveles de expresión de un producto génico en una muestra de ensayo y una muestra normal, comprendiendo el método:

determinar los niveles de expresión del producto génico en la muestra de ensayo y la muestra normal; y

comparar los niveles de expresión del producto génico detectado en la muestra de ensayo y la muestra normal; en el que el producto génico es seleccionado a partir del grupo que consiste en un mRNA correspondiente a la Figura 2 o una proteína que sea al menos 90% idéntica a la Figura 2 y por la cual la presencia de niveles elevados del producto génico en la muestra de ensayo en relación con la muestra normal indica la presencia de un cáncer en un tejido seleccionado a partir del grupo que consiste en próstata, vejiga, riñón, colon, pulmón, ovario, pecho, estómago, útero y
cerviz.

De acuerdo con un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona el uso de un anticuerpo o su fragmento que se une específicamente a una proteína que es al menos 90% idéntica a la Figura 2 para la preparación de un medicamento que inhibe el crecimiento de células cancerígenas que expresan la Figura 2.

De acuerdo con un tercer aspecto de la presente invención, se proporciona el uso de una composición inmunogénica para la fabricación de un medicamento para generar una respuesta inmune de mamífero dirigida a una proteína que tiene al menos una identidad de secuencia del 90% respecto a la Figura 2 para el tratamiento del cáncer.

De acuerdo con un cuarto aspecto de la presente invención, se proporciona un ensayo in vitro para detectar la presencia de una proteína que tiene una identidad de al menos el 90% respecto a la Figura 2 o un polinucleótido que tiene una identidad de al menos el 90% respecto a la Figura 2 en una muestra de ensayo que comprende las etapas de:

poner en contacto la muestra de ensayo con una sustancia que se une específicamente a la proteína o al polinucleótido, en el que la sustancia comprende un anticuerpo que se une específicamente a la proteína o en el que la sustancia comprende una sonda de polinucleótido que se hibrida específicamente al polinucleótido, y

determinar que hay un complejo de la sustancia y proteína o la sustancia y el nucleótido, por el cual la presencia de niveles elevados del producto génico en la muestra de ensayo en relación con la muestra normal indica la presencia de un cáncer en un tejido seleccionado a partir del grupo que consiste en próstata, vejiga, riñón, colon, pulmón, ovario, pecho, estómago, útero y cerviz.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Secuencia SSH de 85P1B3. La secuencia SSH de 85P1B3 contiene 259 bp.

Figura 2. El cDNA y la secuencia de aminoácidos de 85P1B3. La metionina del inicio está subrayada. El marco de lectura abierto se extiende desde el ácido nucleico 13 al 702 incluyendo el codón de terminación.

Figura 3. Secuencia de aminoácidos de 85P1B3. La proteína 85P1B3 tiene 229 aminoácidos.

Figura 4. El alineamiento de secuencia de 85P1B3 con el número de entrada del GenBank AAC39561.1 (AF025441), proteína que interacciona con Opa OIP5.

Figura 5. Perfil de hidrofilicidad del aminoácido de 85P1B3 determinado por el análisis de secuencia por algoritmo informático usando el método de Hopp y Woods (Hopp T. P., Woods K. R., 1981. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 78:3824-3828) con acceso en el sitio web de Protscale (www.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl) desde el servidor de biología molecular ExPasy.

Figura 6. El perfil de hidropaticidad de aminoácido de 85P1B3 determinado por el análisis de secuencia por algoritmo informático usando el método de Kyte y Doolittle (Kyte J., Doolittle R. F., 1982. J. Mol. Biol. 157: 105-132) con acceso en el sitio web de ProtScale (www.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl) a través del servidor de biología molecular ExPasy.

Figura 7. Porcentaje del perfil de residuos de aminoácidos accesibles de 85P1B3 determinado por el análisis de secuencia por algoritmo informático usando el método de Janin (Janin J., 1979 Nature 277: 491-492) con acceso en el sitio web del ProtScale (www.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl) a través del servidor de biología molecular ExPasy.

Figura 8. El perfil de aminoácido de flexibilidad promedio de 85P1B3 determinado por el análisis de secuencia por algoritmo informático usando el método de Bhaskaran y Ponnuswamy (Bhaskaran R., y Ponnuswamy P. K., 1988. Int. J. Pept. Protein Res. 32: 242-255) con acceso en el sitio web del ProtScale (www.expasy.ch/cgibin/protscale.pl) a través del servidor de biología molecular ExPasy.

Figura 9. El perfil de aminoácido de giro \beta de 85P1B3 determinado por análisis de secuencia por algoritmo informático usando el método de Deleage y Roux (Deleage, G., Roux B. 1987 Protein Engineering 1: 289294) con acceso en el sitio web del ProtScale (www.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl) a través del servidor de biología molecular ExPasy.

Figura 10. Análisis RT-PCR de la expresión de 85P1B3. La primera cadena de cDNA fue preparada a partir del grupo vital 1 (VP1: hígado, pulmón y riñón), grupo vital 2 (VP2, páncreas, bazo y estómago), grupo de xenoinjerto de próstata (LAPC-4AD, LAPC-4AI, LAPC-9AD, LAPC-9AI), grupo de cáncer de próstata, grupo de cáncer de vejiga, grupo de cáncer de riñón, grupo de cáncer de colon, grupo de cáncer de pulmón, grupo de cáncer de ovario, grupo de cáncer de mama y grupo de metástasis de cáncer. La normalización fue realizada por PCR usando cebadores frente a actina y GAPDH. La PCR semi-cuantitativa, usando cebadores frente a 85P1B3, fue realizada en 26 y 30 ciclos de amplificación.

Figura 11. Expresión de 85P1B3 en tejidos humanos normales. Dos inmunotransferencias Northern de tejido múltiple (Clontech) con 2 \mug de mARN/línea, fueron sondadas con la secuencia SSH de 85P1B3. Los estándares de tamaño en kilobases (kb) son indicados en el lado. Los resultados muestran la expresión exclusiva de un transcrito de 85P1B3 de aproximadamente 1,4 kb en testículo, pero no en ningún otro tejido normal.

Figura 12. Expresión de 85P1B3 en líneas celulares de cáncer humanas. Fue extraído el ARN de un panel de líneas celulares de cáncer humanas. Fueron sondadas inmunotransferencias Northern con 10 \mug de ARN/línea total con la secuencia SSH de 85P1B3. Los estándares de tamaño en kilobases (kb) son indicados en el lado.

Figura 13. Expresión de 85P1B3 en muestras de cáncer de pacientes humanos y líneas celulares de cáncer. La expresión de 85P1B3 fue analizada en un panel de cánceres humanos (T) y sus tejidos normales emparejados respectivos (N) en transferencias en mancha de ARN. La expresión de 85P1B3 fue detectada en los cánceres de pecho, próstata, útero, cerviz, estómago y pulmón. También fue encontrado que 85P1B3 era altamente expresada en todas las líneas celulares de cáncer humanas analizadas.

Figura 14. Expresión de 85P1B3 en muestras de pacientes con cáncer de colon. Fue extraído ARN a partir de líneas celulares de cáncer de colon (CL), colon normal (N), tumores de colon (T) y sus tejidos adyacentes normales (Nat) derivados a partir de pacientes con cáncer de colon. Fueron sondadas inmunotransferencias con 10 \mug de ARN total/línea con la secuencia SSH de 85P1B3. Los estándares de tamaño en kilobases (kb) son indicados en el lado. Los resultados muestran la expresión de 85P1B3 en 2 muestras de tumor de colon, pero no en el tejido adyacente normal correspondiente. La expresión también es vista en todas las 4 líneas celulares de cáncer de colon (Colo 205, LoVo, T84, Caco-2). P1-Etapa III, T2N1MX; P2-Etapa III, T3N1MX.

Figura 15. Expresión de 85P1B3 en muestras de pacientes con cáncer de vejiga. Fue extraído el ARN a partir de líneas celulares de cáncer de vejiga (CL), vejiga normal (N), tumores de vejiga (T) y su tejido adyacente normal (Nat) derivado de pacientes con cáncer de vejiga. Fue sondada la inmunotransferencia Northern con 10 \mug de ARN total/línea con la secuencia SSH de 85P1B3. Los estándares de tamaño en kilobases (kb) son indicados en el lado. Los resultados muestran la expresión de 85P1B3 en 3 de 5 muestras de tumor de vejiga. La expresión también es vista en las tres líneas celulares de cáncer de vejiga, UM-UC-3, J82 y SCABER.

Figura 16. Expresión de 85P1B3 en muestras de paciente con cáncer de pulmón. El ARN fue extraído a partir de líneas celulares de cáncer de pulmón (CL), pulmón normal (N), tumores pulmonares (T) y su tejido adyacente normal (NAT) derivado de pacientes con cáncer de pulmón. Fue sondada la inmunotransferencia Northern con 10 \mug de ARN total/línea con la secuencia SSH de 85P1B3. Los estándares de tamaño en kilobases (kb) son indicados en el lado. Los resultados muestran la expresión de 85P1B3 en tres muestras de tumor de pulmón. La expresión también es vista en todas las líneas celulares de cáncer de pulmón.

Figura 17. Expresión de 85P1B3 en xenoinjertos de cáncer de próstata después de la castración. Les fue inyectado a ratones machos células de tumor LAPC-9AD. Cuando el tumor alcanzó un tamaño palpable (0,3-0,5 cm de diámetro), los ratones fueron castrados y los tumores fueron recuperados en puntos de tiempo diferentes después de la castración. El ARN fue aislado de los tejidos del xenoinjerto. Fueron sondadas inmunotransferencias Northern con 10 \mug de ARN total/línea con el fragmento SSH de 85P1B3. Los estándares de tamaño en kilobases (kb) son indicados en el lado. Los resultados muestran que la expresión de 85P1B3 es mantenida después de la castración. También se presenta un cuadro de tinción con bromuro de etidio del gel de ARN. La hibridación de la misma inmunotransferencia Northern con el gen dependiente de andrógeno TMPRSS2 confirma la calidad de la privación de andrógenos después de la castración.

Figura 18. Expresión de 85P1B3 en células PC3 después de la administración génica mediada por retrovirales. Fueron traducidas células PC3 con el vector retroviral pSR\alpha que codifica el gen de 85P1B3. Después de la selección con neomicina, las células fueron expandidas y el ARN fue extraído. Fue sondada la inmunotransferencia Northern con 10 \mug de ARN total/línea con la secuencia SSH de 85P1B3. Los estándares de tamaño en kilobases (kb) son indicados en el lado. Los resultados muestran la expresión del transcrito de 85P1B3 expulsado del LTR retroviral, que emigra más despacio que el transcrito endógeno de 85P1B3 de 1,4 kb. LAPC-9AI muestra sólo la expresión de la 85P1B3 endógena, pero no el transcrito de pSR\alpha.

Figura 19. Diagrama esquemático de la alineación de 85P1B3 con su variante de empalme. La región de homología entre 85P1B3 y su variante de empalme 1 está marcada con un cuadro de ventana. Las regiones específicas para 85P1B3 están marcadas en cuadros blancos, y las específicos para la variante de empalme 1 como cuadros negros. La secuencia de SSH de 85P1B3 también se indica por un cuadro blanco.

Figura 20. Análisis Western de la expresión de 85P1B3 con un anticuerpo policlonal anti-85P1B3. Panel A. Detección de GST-85P1B3 con suero de conejo anti-GST-85P1B3. 200 ng de GST-85P1B3 (aminoácidos 1-229) y 200 ng de GST solo fueron separados en SDS-PAGE y fueron transferidos a nitrocelulosa. La mancha entonces fue incubada con diluciones indicadas de suero anti-85P1B3. Fueron detectadas bandas inmuno-reactivas por incubación con HRP-anticuerpo secundario de IgG anticonejo y fueron visualizadas por una mayor quimioluminiscencia y por la exposición a la película de auto-radiografía. Se muestra con flechas la detección de la proteína GST-85P1B3 y la detección mínima de GST solo. Panel B. Fueron transfectadas células 293T transitoriamente con el vector pCDNA 3.1 vacío o con pCDNA 3.1 que presentaba el cDNA de 85P1B3. Los lisados de las células fueron separados en SDS-PAGE y sometidos a análisis Western como se realiza para los datos en el Panel A, con 2 \mug/ml de anticuerpo policlonal anti-85P1B3 purificado. Panel C. El análisis Western fue llevado a cabo como para los datos en el Panel B, pero usando un anticuerpo policlonal anti-His (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Las flechas indican las bandas inmuno-reactivas correspondientes a la proteína 85P1B3 His-marcada.

Figura 21. Estructura secundaria y predicción de transmembrana para 85P1B3. Panel A. La estructura secundaria de la proteína 85P1B3 fue predicha usando el método de red neuronal jerárquico HNN (Guermeur, 1997, http://pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_nn.html), con acceso en el servidor de biología molecular ExPasy (http://www.expasy.ch/tools/). Este método indica la presencia y la posición de hélices alfa (h), cadenas extendidas (e), y zonas espiriladas aleatorias (c) a partir de la secuencia de proteína primaria. También se da el tanto por ciento de proteína en una estructura secundaria dada. Panel B. La representación esquemática de la probabilidad de existencia de regiones transmembrana de 85P1B3 basado en el algoritmo TMpred de Hofmann y Stoffel que utiliza TMBASE (K. Hofmann, W. Stoffel. TMBASE-Una base de datos de segmentos de proteína que atraviesan la membrana, Biol. Chem. Hoppe-Seyler 374: 166, 1993). Una longitud estirada de los aminoácidos de aproximadamente 17-33 aminoácidos con un valor mayor que 0 son potenciales hélices transmembrana. Este programa indica la presencia de una hélice en 85P1B3. Panel C. Representación esquemática de la probabilidad de la existencia de regiones transmembrana y la orientación extracelular e intracelular de 85P1B3 basado en el algoritmo de Sonnhammer, von Heijne, y Krogh (Erik, L. L., et al., Un modelo de Markov ocultado para predecir las hélices transmembrana en secuencias de proteína. En Proc. of Sixth Int. Conf. on Intelligent Systems for Molecular Biology, pp. 175-182 Editor J. Glasgow, et al., Menlo Park, CA: Prensa AAAI, 1998). Este programa indica que 85P1B3 es una proteína intracelular sin dominios transmembrana. Estos resultados de predicción de transmembrana también son resumidos en la Tabla XXV.

Descripción detallada de la invención Esquema de las secciones

I.): Definiciones

II.): Polinucleótidos de 85P1B3

II. A.): Usos de los polinucleótidos de 85P1B3

II. A. 1.): Monitorización de anormalidades genéticas

II. A. 2.): Realizaciones antisentido

II. A. 3.): Cebadores y pares de cebador

II. A. 4.): Aislamiento de moléculas de ácidos nucleicos que codifican 85P1B3

II. A. 5.): Moléculas de ácidos nucleicos recombinantes y sistemas huésped-vector

III.): Proteínas relacionadas con 85P1B3

III. A.): Realizaciones de la proteína que presenta el motivo

III. B.): Expresión de proteínas relacionadas con 85P1B3

III. C.): Modificaciones de proteínas relacionadas con 85P1B3

III. D.): Usos de proteínas relacionadas con 85P1B3

IV.): Anticuerpos de 85P1B3

V.): Respuestas inmunes celulares de 85P1B3

VI.): Animales transgénicos de 85P1B3

VII.): Métodos para la detección de 85P1B3

VIII.): Métodos para monitorizar el estado de genes relacionados con 85P1B3 y sus productos

IX.): Identificación de moléculas que interaccionan con 85P1B3

X.): Métodos terapéuticos y composiciones

X. A.): Vacunas anticáncer

X. B.): 85P1B3 como diana para terapia basada en anticuerpos

X. C.): 85P1B3 como diana para respuestas inmunes celulares

X. C.1.: Vacunas del minigen

X. C. 2.: Combinaciones de péptidos que estimulan a CTL con péptidos que estimulan a linfocitos T auxiliadores

X. C. 3.: Combinaciones de péptidos que estimulan a CTL con agentes cebadores de linfocitos T

X. C. 4.: Composiciones de vacuna que comprenden DC pulsada con péptidos que estimulan a CTL y/o HTL

X. D.): Inmunoterapia adoptiva

X. E.): Administración de vacunas para fines terapéuticos o profilácticos

XI.): Realizaciones diagnósticas y pronósticas de 85P1B3.

XII.): Inhibición de la función de la proteína 85P1B3

XII. A.): Inhibición de 85P1B3 con anticuerpos intracelulares

XII. B.): Inhibición de 85P1B3 con proteínas recombinantes

XII. C.): Inhibición de la transcripción o traducción de 85P1B3

XII. D.): Consideraciones generales para estrategias terapéuticas

XIII.): Kits

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I.) Definiciones

A no ser que se definan de otra manera, todos los términos de la técnica, notaciones y otros términos científicos o terminología usada en este documento son requeridos para mostrar los significados comúnmente entendidos por los expertos en la técnica a la cual esta invención pertenece. En algunos casos, en este documento son definidos términos con significados comúnmente entendidos para una mayor claridad y/o como referencia, y la inclusión de tales definiciones en este documento no debe ser necesariamente interpretada para representar una diferencia sustancial sobre lo que generalmente se sobrentiende en la técnica. Muchas de las técnicas y procedimientos descritos o referidos en este documento son bien entendidos y comúnmente empleados usando la metodología convencional por los expertos en la técnica, tales como, por ejemplo, las metodologías de clonación molecular extensamente utilizadas descritas en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. Cuando sea apropiado, los procedimientos que implican el uso de kits disponibles en el comercio y reactivos son llevados a cabo generalmente conforme a los protocolos definidos del fabricante y/o los parámetros, a no ser que se especifique de otra manera.

Las expresiones "cáncer de próstata avanzado", "cáncer de próstata avanzado localmente", "enfermedad avanzada" y "enfermedad avanzada localmente" significan cánceres de próstata que se han extendido por la cápsula de la próstata, y se proponen para incluir la enfermedad en etapa C según el sistema de la Asociación Urológica Americana (AUA), la enfermedad en el estado C1-C2 según el sistema Whitmore-Jewett, y la enfermedad en el estado T3-T4 y N+ según el sistema TNM (tumor, nodo, metástasis). En general, no se recomienda la cirugía para pacientes con enfermedad avanzada localmente, y estos pacientes tienen resultados sustancialmente menos favorables comparado con pacientes que tienen cáncer de próstata clínicamente localizado (confinado al órgano). La enfermedad avanzada localmente se identifica clínicamente mediante pruebas palpables de induración más allá del borde lateral de la próstata, o por asimetría o induración anterior a la base de la próstata. El cáncer de próstata avanzado localmente en este momento se diagnostica patológicamente después de la prostatectomía radical si el tumor invade o penetra la cápsula prostática, se extiende en el margen quirúrgico, o invade las vesículas seminales.

"El cambio del modelo de glicosilación natural" es requerido para los fines de este documento significando la supresión de uno o varios restos carbohidratos encontrados en la secuencia natural de 85P1B3 (eliminando el sitio de glicosilación subyacente o suprimiendo la glicosilación por medios químicos y/o enzimáticos), y/o añadiendo uno o varios sitios de glicosilación que no están presentes en la secuencia natural de 85P1B3. Además, la frase incluye cambios cualitativos en la glicosilación de las proteínas naturales, implicando un cambio de la naturaleza y las proporciones de los diversos restos carbohidratos presentes.

El término "análogo" se refiere a una molécula que es estructuralmente similar o comparte atributos similares o correspondientes con otra molécula (por ejemplo, una proteína relacionada con 85P1B3). Por ejemplo, un análogo de la
proteína 85P1B3 puede ser unida específicamente por un anticuerpo o célula T que se una específicamente a 85P1B3.

El término "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio. Por lo tanto, un "anticuerpo" puede darse naturalmente o artificialmente tales como los anticuerpos monoclonales producidos por tecnología de hibridoma convencional. Los anticuerpos anti-85P1B3 comprenden los anticuerpos monoclonales y policlonales así como los fragmentos que contienen el dominio que se une al antígeno y/o una o varias regiones determinantes de la complementariedad de estos anticuerpos.

Un "fragmento de anticuerpo" se define como al menos una parte de la región variable de la molécula de inmunoglobulina que se une a su diana, es decir, la región que se une al antígeno. En una realización esto cubre específicamente los anticuerpos sencillos anti-85P1B3 y sus clones (incluyendo agonistas, antagonistas y anticuerpos neutralizantes) y composiciones de anticuerpo anti-85P1B3 con especificidad poliepitópica.

La expresión "secuencias optimizadas del codón" se refiere a las secuencias de nucleótidos que han sido optimizadas para una especie de huésped particular sustituyendo cualquier codón que tenga una frecuencia de uso de menos de aproximadamente el 20%. Las secuencias de nucleótidos que han sido optimizadas para la expresión en una especie de huésped dada por la eliminación de secuencias de poliadenilación falsas, eliminación de señales de empalme de exón/intrón, eliminación de repeticiones tipo transposón y/u optimización del contenido de GC además de la optimización del codón se refieren en este documento a "secuencias de expresión realzadas".

La expresión "agente citotóxico" se refiere a una sustancia que inhibe o previene la función de las células y/o causa la destrucción de las células. La expresión es requerida para incluir isótopos radiactivos, agentes quimioterapéuticos y toxinas tales como toxinas de pequeñas moléculas o toxinas enzimáticamente activas bacterianas, micóticas, de origen planta o animal, incluyendo sus fragmentos y/o variantes. Los ejemplos de agentes citotóxicos incluyen, pero no están limitados a maitansinoides, itrio, bismuto, ricino, cadena A de ricino, doxorubicina, daunorubicina, taxol, bromuro de etidio, mitomicina, etoposido, tenoposido, vincristina, vinblastina, colquicina, dihidroxi antracin diona, actinomicina, toxina de difteria, Pseudomonas exotoxina (PE) A, PE40, abrina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, gelonina, mitogelina, retstrictocina, fenomicina, enomicina, curicina, crotina, caliqueamicina, inhibidor de sapaonaria officinalis y glucocorticoide y otros agentes quimioterapéuticos, así como radioisótopos tales como At^{211}, I^{131}, I^{125}, Y^{90}, Re^{186}, Re^{188}, Sm^{153}, Bi^{212}, P^{32} y los isótopos radiactivos de Lu. Los anticuerpos también pueden ser conjugados a una enzima capaz de activar un profármaco anticáncer para convertir el profármaco a su forma activa.

El término "homólogo" se refiere a una molécula que exhibe homología frente a otra molécula, por ejemplo, que tiene secuencias de residuos químicos que son iguales o similares en las posiciones correspondientes.

El "antígeno leucocitario humano" o "HLA" (acrónimo inglés de "Human leukocyte antigen") es una proteína humana de clase I o clase II del complejo principal de histocompatibilidad (MHC; por sus siglas en inglés "Major Histocompatibility Complex") (véase, por ejemplo, Stites, et al., IMMUNOLOGY, 8ª ed., Editorial Lange, Los Altos, CA (1994).

Los términos "hibridar", "hibridación", "hibrida" y similares, usados en el contexto de los polinucleótidos, se proponen para referirse a condiciones de hibridación convencionales, preferiblemente tales como la hibridación en formamida al 50%/6XSSC/SDS al 0,1%/100 \mug/ml de ssDNA, en las que las temperaturas para la hibridación son superiores a 37ºC y las temperaturas para lavar en 0,1XSSC/SDS al 0,1% son superiores a 55ºC.

Las expresiones "aislado" o "biológicamente puro" se refieren al material que está sustancialmente o esencialmente libre de los componentes que normalmente acompañan al material que se encuentra en su estado natural. Así, los péptidos aislados conforme a la invención no contienen preferiblemente los materiales normalmente asociados a los péptidos en su ambiente in situ. Por ejemplo, un polinucleótido, según se dice, está "aislado" cuando está sustancialmente separado de los polinucleótidos contaminantes que corresponden o que son complementarios a otros genes que el gen de 85P1B3 o que codifican otros polipéptidos distintos al producto génico de 85P1B3 o sus fragmentos. Un experto en la técnica puede emplear fácilmente procedimientos de aislamiento de ácidos nucleicos para obtener un polinucleótido de 85P1B3 aislado. Una proteína, según se dice, está "aislada", por ejemplo, cuando se emplean métodos físicos, mecánicos o químicos para eliminar la proteína 85P1B3 de los constituyentes celulares que normalmente están asociados a la proteína. Un experto en la técnica puede emplear fácilmente métodos de purificación estándar para obtener una proteína 85P1B3 aislada. De forma alternativa, una proteína aislada puede ser preparada por medios químicos.

El término "mamífero" se refiere a cualquier organismo clasificado como un mamífero, incluyendo ratones, ratas, conejos, perros, gatos, vacas, caballos y seres humanos. En una realización de la invención, el mamífero es un ratón. En otra realización de la invención, el mamífero es un ser humano.

Las expresiones "cáncer de próstata metastásico" y "enfermedad metastásica" significan cánceres de próstata que se han extendido a los nodos de linfa regionales o a sitios distantes, y se proponen para incluir la enfermedad en etapa D según el sistema AUA y la etapa TxNxM+ según el sistema TNM. Como es el caso con el cáncer de próstata avanzado localmente, la cirugía no está indicada generalmente para pacientes con enfermedad metastásica, y la terapia hormonal (ablación androgénica) es una modalidad de tratamiento preferida. Los pacientes con cáncer de próstata metastásico desarrollan eventualmente un estado de refracción androgénica de 12 a 18 meses antes de la iniciación del tratamiento. Aproximadamente la mitad de estos pacientes de refracción androgénica mueren antes de los 6 meses después del desarrollo de aquel estado. El sitio más común para la metástasis del cáncer de próstata es el hueso. La metástasis ósea del cáncer de próstata es a menudo osteoblástica más bien que osteolítica (es decir, causando la formación de hueso neto). La metástasis ósea se encuentra con más frecuencia en la espina, seguida por fémur, pelvis, caja torácica, cráneo y húmero. Otros sitios comunes para la metástasis incluyen nodos de linfa, pulmón, hígado y cerebro. El cáncer de próstata metastásico se diagnostica típicamente por linfadenectomía pélvica laparoscópica o abierta, exploraciones con radionucleidos de cuerpo entero, radiografía esquelética y/o biopsia de lesión ósea.

La expresión "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos que comprenden la población son idénticos excepto las posibles mutaciones que aparecen naturalmente que están presentes en cantidades menores.

Un "motivo", como en el motivo biológico de una proteína relacionada con 85P1B3, se refiere a cualquier modelo de aminoácidos que forman parte de la secuencia primaria de una proteína, que está asociado a una función particular (por ejemplo, la interacción proteína-proteína, interacción proteína-ADN, etc.) o modificación (por ejemplo, que está fosforilada, glicosilada o amidada), o localización (por ejemplo, secuencia secretora, secuencia de localización nuclear, etc.) o una secuencia que está correlacionada con ser inmunogénica, humoralmente o celularmente. Un motivo puede ser contiguo o capaz de alinearse a ciertas posiciones que generalmente están correlacionadas con una cierta función o propiedad. En el contexto de los motivos de HLA, "motivo" se refiere al modelo de residuos en un péptido de longitud definida, por lo general un péptido de aproximadamente 8 a aproximadamente 13 aminoácidos para un motivo de HLA clase I y de aproximadamente 6 a aproximadamente 25 aminoácidos para un motivo de HLA clase II, que es reconocido por una molécula HLA particular. Los motivos peptídicos para la unión de HLA son típicamente diferentes para cada proteína codificada por cada alelo de HLA humano y se diferencian en el modelo de los residuos de anclaje primario y secundario.

Un "excipiente farmacéutico" comprende un material ta como adyuvante, un vehículo, agentes de ajuste del pH y tampón, agentes de ajuste de la tonicidad, agentes humectantes, conservantes y otros similares.

"Farmacéuticamente aceptable" se refiere a una composición no tóxica, inerte, y/o que es fisiológicamente compatible con seres humanos u otros mamíferos.

El término "polinucleótido" significa una forma polimérica de nucleótidos de al menos 10 bases o pares de bases de longitud, ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada de uno u otro tipo de nucleótido, y se propone para incluir formas de ADN y/o ARN de cadena sencilla y doble. En la técnica, este término a menudo se usa de manera intercambiable con "oligonucleótido". Un polinucleótido puede comprender una secuencia de nucleótidos descrita en este documento en el que timidina (T) (como se muestra, por ejemplo, en la SEQ ID NO: 702) también puede ser uracilo (U); esta definición pertenece a las diferencias entre las estructuras químicas del ADN y ARN, en particular la observación de que una de las cuatro bases principales en el ARN es el uracilo (U) en vez de la timidina (T).

El término "polipéptido" significa un polímero de al menos aproximadamente 4, 5, 6, 7 ó 8 aminoácidos. En todas partes de la memoria descriptiva, se usan las designaciones de tres letras estándar o letras solas para aminoácidos. En la técnica, este término a menudo se usa de manera intercambiable con "péptido" o "proteína".

Un "residuo de anclaje primario" de HLA es un aminoácido en una posición específica a lo largo de una secuencia peptídica que se entiende que proporciona un punto de contacto entre el péptido inmunogénico y la molécula de HLA.

De uno a tres, por lo general dos, residuos de anclaje primario dentro de un péptido de longitud definida generalmente definen un "motivo" para un péptido inmunogénico. Estos residuos se entiende que entran en un contacto cercano con el hueco de unión del péptido de una molécula HLA, con sus cadenas laterales enterradas en bolsas específicas del hueco de unión. En una realización, por ejemplo, los residuos de anclaje primario para una molécula HLA clase I se localizan en la posición 2 (desde la posición del amino terminal) y en la posición del carboxilo terminal de un epítopo de péptido del residuo 8, 9, 10, 11 ó 12 conforme a la invención. En otra realización, por ejemplo, los residuos de anclaje primario de un péptido que se unirá a una molécula HLA clase II están espaciados el uno en relación con el otro, más que a los extremos de un péptido, donde el péptido tiene generalmente al menos 9 aminoácidos de longitud. Las posiciones de anclaje primario para cada motivo y supermotivo son expuestas en adelante en la Tabla IV. Por ejemplo, pueden ser creados péptidos análogos cambiando la presencia o la ausencia de residuos particulares en las posiciones de anclaje primario y/o secundario mostradas en la Tabla IV. Tales análogos son usados para modular la afinidad de unión y/o la cobertura de un péptido que comprende un motivo de HLA particular o supermotivo.

Una molécula de ADN o ARN "recombinante" es una molécula de ADN o ARN que ha sido sometida a manipulación molecular in vitro.

La "severidad" de las reacciones de hibridación es fácilmente determinable por cualquier experto ordinario en la técnica, y generalmente es un cálculo empírico dependiente de la longitud de la sonda, temperatura de lavado y concentración salina. En general, sondas más largas requieren temperaturas más altas para una hibridación apropiada, mientras que las sondas más cortas necesitan temperaturas inferiores. La hibridación generalmente depende de la capacidad de las secuencias de ácido nucleico desnaturalizadas de hibridarse de nuevo cuando están presentes cadenas complementarias en un ambiente por debajo de su temperatura de fusión. Cuanto más alto sea el grado de homología deseada entre la sonda y la secuencia hibridizable, más alta será la temperatura relativa que puede ser usada. Por consiguiente, se sigue que temperaturas más altas relativas tenderán a hacer las condiciones de reacción más rigurosas, mientras que temperaturas inferiores menos rigurosas. Para detalles adicionales y una explicación de la severidad de las reacciones de hibridación, véase Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", Wiley Interscience Publishers, (1995).

"Condiciones rigurosas" o "altas condiciones de rigurosidad", como se define en este documento, son identificadas por, pero no limitadas a, aquellas que: (1) emplean una baja fuerza iónica y altas temperaturas para el lavado, por ejemplo cloruro de sodio 0,015 M/citrato de sodio 0,0015 M /dodecil-sulfato de sodio al 0,1% a 50ºC; (2) emplean durante la hibridación a un agente de desnaturalización, tal como formamida, por ejemplo, formamida al 50% (v/v) con albúmina de suero bovino al 0,1%/Ficoll al 0,1%/polivinilpirrolidona al 0,1%/tampón fosfato de sodio 50 mM a pH 6,5 con cloruro de sodio 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42ºC; o (3) emplean formamida al 50%, 5 x SSC (NaCI 0,75 M, citrato de sodio 0,075 M), fosfato de sodio 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sodio al 0,1%, solución de Denhardt 5 x, ADN de esperma de salmón sonicado (50 \mug/ml), SDS al 0,1% y sulfato de dextrano al 10% a 42ºC, con lavados a 42ºC en 0,2 x SSC (cloruro de sodio/citrato de sodio) y formamida al 50% a 55ºC, seguido de un lavado de alta rigurosidad que consiste en 0,1 x SSC conteniendo EDTA a 55ºC. Las "condiciones moderadamente rigurosas" son descritas por, pero no limitadas a, las de Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen el uso de una solución lavadora y condiciones de hibridación (por ejemplo, temperatura, fuerza iónica y % de SDS) menos rigurosas que las descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente rigurosas es la incubación de una noche a 37ºC en una solución que comprende: formamida al 20%, 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato de trisodio 15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), solución de Denhardt 5 x, sulfato de dextrano al 10% y 20 mg/mL de ADN de esperma de salmón recortado desnaturalizado, seguido por el lavado de los filtros en 1 x SSC a aproximadamente 37-50ºC. El experto en la técnica reconocerá cómo ajustar la temperatura, fuerza iónica, etc. cuando sea necesario para ajustar factores tales como la longitud de la sonda y otros similares.

Un "supermotivo" de HLA es una especificidad de unión del péptido compartida por moléculas HLA codificadas por dos o más alelos de HLA.

Como se usa en este documento "tratar" o "terapéutico", y los términos gramaticalmente relacionados, se refieren a cualquier mejora de cualquier consecuencia de enfermedad, tal como una supervivencia prolongada, menos morbilidad, y/o una disminución de los efectos secundarios que son los subproductos de una modalidad terapéutica alternativa; no se requiere la erradicación completa de la enfermedad.

Un "animal transgénico" (por ejemplo, un ratón o una rata) es un animal que tiene células que contienen un transgen, cuyo transgen fue introducido en el animal o un antepasado del animal en un estado prenatal, por ejemplo, en una etapa embrionaria. Un "transgen" es un ADN que está integrado en el genoma de una célula a partir de la cual un animal transgénico se desarrolla.

Como se usa en este documento, un HLA o respuesta celular inmune "vacuna" es una composición que contiene o codifica uno o varios péptidos de la invención. Hay numerosas realizaciones de tales vacunas, tales como un cóctel de uno o varios péptidos individuales; uno o varios péptidos de la invención comprendidos por un péptido poliepitópico; o los ácidos nucleicos que codifican tales péptidos individuales o polipéptidos, por ejemplo, un minigen que codifica un péptido poliepitópico. La expresión "uno o varios péptidos" puede incluir cualquier número entero total de 1-150 o más, por ejemplo, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145 ó 150 o más péptidos de la invención. Los péptidos o polipéptidos pueden ser modificados opcionalmente, tal como por lipidación, adición de dianas u otras secuencias. Los péptidos de HLA clase I de la invención pueden ser mezclados, o unidos, a los péptidos de HLA clase II, para facilitar la activación tanto de los linfocitos T citotóxicos como de los linfocitos T auxiliares. Las vacunas de HLA también pueden comprender células que presentan el antígeno pulsado por péptido, por ejemplo, células dendríticas.

El término "variante" se refiere a una molécula que exhibe una variación de un tipo descrito o norma, tal como una proteína que tiene uno o varios residuos de aminoácidos diferentes en la posición(ones) correspondiente(s) de una proteína específicamente descrita (por ejemplo, la proteína 85P1B3 mostrada en la Figura 2 o la Figura 3). Un análogo es un ejemplo de una proteína variante.

Las proteínas relacionadas con 85P1B3 de la invención incluyen las específicamente identificadas en este documento, así como variantes alélicas, variantes de sustitución conservadoras, análogos y homólogos que pueden ser aislados/generados y caracterizados sin una experimentación excesiva siguiendo los métodos perfilados en este documento o que están fácilmente disponibles en la técnica. Las proteínas de fusión que combinan partes de proteínas 85P1B3 diferentes o sus fragmentos, así como las proteínas de fusión de una proteína 85P1B3 y un polipéptido heterólogo también son incluidos. Tales proteínas 85P1B3 en conjunto son denominadas proteínas relacionadas con 85P1B3, proteínas de la invención, o 85P1B3. La expresión "proteínas relacionadas con 85P1B3" se refiere a un fragmento de polipéptido o una secuencia de la proteína 85P1B3 de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, o más de 25 aminoácidos; o, al menos 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 85, 90, 95, 100 o más de 100 aminoácidos.

II.) Polinucleótidos de 85P1B3

Un aspecto de la invención proporciona polinucleótidos correspondientes o complementarios a todo o parte de un gen de 85P1B3, mARN, y/o una secuencia de codificación, preferiblemente en forma aislada, incluyendo los polinucleótidos que codifican una proteína relacionada con 85P1B3 y sus fragmentos, ADN, ARN, híbrido de ADN/ARN, y moléculas relacionadas, polinucleótidos u oligonucleótidos complementarios a un gen de 85P1B3 o secuencia de mARN o una parte de éste, y polinucleótidos u oligonucleótidos que se hibridan a un gen de 85P1B3, mARN, o a un polinucleótido que codifica 85P1B3 (en conjunto, "polinucleótidos de 85P1B3"). En todos los casos cuando se refiera a esta sección, T también puede ser U en la Figura 2.

Las realizaciones de un polinucleótido de 85P1B3 incluyen: un polinucleótido de 85P1B3 que tiene la secuencia mostrada en la Figura 2, la secuencia de nucleótido de 85P1B3 como se muestra en la Figura 2, en la que T es U; al menos 10 nucleótidos contiguos de un polinucleótido que tiene una secuencia como se muestra en la Figura 2; o, al menos 10 nucleótidos contiguos de un polinucleótido que tiene la secuencia como se muestra en la Figura 2 donde T es U. Por ejemplo, las realizaciones de nucleótidos de 85P1B3 comprenden, sin restricción:

(a): un polinucleótido que comprende o que consiste en la secuencia como se muestra en la Figura 2, en la que T también puede ser U;

(b): un polinucleótido que comprende o que consiste en la secuencia como se muestra en la Figura 2, desde el residuo de nucleótido número 13 al residuo de nucleótido número 699, en la que T también puede ser U;

(c): un polinucleótido que codifica al menos un péptido expuesto en adelante en las Tablas V-XVIII;

(d): un polinucleótido que codifica una región peptídica de al menos 5 aminoácidos de la Figura 3 en cualquier incremento de número entero hasta 229 que incluye una posición de aminoácido que tiene un valor mayor que 0,5 en el perfil de hidrofilicidad de la Figura 5;

(e): un polinucleótido que codifica una región peptídica de al menos 5 aminoácidos de la Figura 3 en cualquier incremento de número entero hasta 229 que incluye una posición de aminoácido que tiene un valor de menos de 0,5 en el perfil de hidropaticidad de la Figura 6;

(f): un polinucleótido que codifica una región peptídica de al menos 5 aminoácidos de la Figura 3 en cualquier incremento de número entero hasta 229 que incluye una posición de aminoácido que tiene un valor mayor que 0,5 en el perfil del tanto por ciento de residuos accesibles de la Figura 7;

(g): un polinucleótido que codifica una región peptídica de al menos 5 aminoácidos de la Figura 3 en cualquier incremento de número entero hasta 229 que incluye una posición de aminoácido que tiene un valor mayor que 0,5 en el perfil de flexibilidad promedio en la Figura 8;

(h): un polinucleótido que codifica una región peptídica de al menos 5 aminoácidos de la Figura 3 en cualquier incremento de número entero hasta 229 que incluye una posición de aminoácido que tiene un valor mayor que 0,5 en el perfil de giro beta de la Figura 9;

(i): un polinucleótido que es totalmente complementario a un polinucleótido de cualquiera de (a) - (h);

(j): un polinucleótido que se hibrida selectivamente en condiciones rigurosas a un polinucleótido de (a) - (i); y

(k): un polinucleótido de cualquiera de (a) - (j) o péptido de (l) (véase justo más abajo) junto con un excipiente farmacéutico y/o en una forma de dosis unitaria humana.

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En cuanto al elemento (k) inmediatamente anterior, los ejemplos de las realizaciones de los polipéptidos de 85P1B3 comprenden, sin restricción:

(l): un péptido que es codificado por cualquiera de (a) - (h).

Como se usa en este documento, un intervalo se entiende que describe específicamente todas sus posiciones unitarias enteras.

Las realizaciones típicas de la invención descrita en este documento incluyen los polinucleótidos de 85P1B3 que codifican las partes específicas de la secuencia de mARN de 85P1B3 (y los que son complementarios a tales secuencias) tales como los que codifican la proteína y sus fragmentos, por ejemplo de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225 ó 229 aminoácidos contiguos.

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Por ejemplo, las realizaciones representativas de la invención descrita en este documento incluyen: polinucleótidos y sus péptidos codificados por sí mismos que codifican aproximadamente del aminoácido 1 a aproximadamente el aminoácido 10 de la proteína 85P1B3 mostrada en la Figura 2 o la Figura 3, polinucleótidos que codifican aproximadamente del aminoácido 10 a aproximadamente el aminoácido 20 de la proteína 85P1B3 mostrada en la Figura 2, o Figura 3, polinucleótidos que codifican aproximadamente del aminoácido 20 a aproximadamente el aminoácido 30 de la proteína 85P1B3 mostrada en la Figura 2 o la Figura 3, polinucleótidos que codifican aproximadamente del aminoácido 30 a aproximadamente el aminoácido 40 de la proteína 85P1B3 mostrada en la Figura 2 o Figura 3, polinucleótidos que codifican de aproximadamente el aminoácido 40 a aproximadamente el aminoácido 50 de la proteína 85P1B3 mostrada en la Figura 2 o Figura 3, polinucleótidos que codifican de aproximadamente el aminoácido 50 a aproximadamente el aminoácido 60 de la proteína 85P1B3 mostrada en la Figura 2 o Figura 3, polinucleótidos que codifican de aproximadamente el aminoácido 60 a aproximadamente el aminoácido 70 de la proteína 85P1B3 mostrada en la Figura 2 o Figura 3, polinucleótidos que codifican de aproximadamente el aminoácido 70 a aproximadamente el aminoácido 80 de la proteína 85P1B3 mostrada en la Figura 2 o Figura 3, polinucleótidos que codifican de aproximadamente el aminoácido 80 a aproximadamente el aminoácido 90 de la proteína 85P1B3 mostrada en la Figura 2 o Figura 3, polinucleótidos que codifican de aproximadamente el aminoácido 90 a aproximadamente el aminoácido 100 de la proteína 85P1B3 mostrada en la Figura 2 o Figura 3, en incrementos de aproximadamente 10 aminoácidos, finalizando en el aminoácido del carboxilo terminal expuesto en adelante en la Figura 2 o Figura 3. De acuerdo con esto, los polinucleótidos que codifican las partes de la secuencia de aminoácidos (de aproximadamente 10 aminoácidos), de los aminoácidos 100 al aminoácido del carboxilo terminal de la proteína 85P1B3 son realizaciones de la invención. En el que se sobrentiende que cada posición de aminoácido particular describe aquella posición más o menos cinco residuos de aminoácidos.

Los polinucleótidos que codifican partes relativamente largas de la proteína 85P1B3 están también en la amplitud de la invención. Por ejemplo, los polinucleótidos que codifican de aproximadamente el aminoácido 1 (ó 20 ó 30 ó 40, etc.) a aproximadamente el aminoácido 20, (ó 30 ó 40 ó 50, etc.) de la proteína 85P1B3 mostrada en la Figura 2 o Figura 3 pueden ser generados por una variedad de técnicas conocidas en la técnica. Estos fragmentos de polinucleótido pueden incluir cualquier parte de la secuencia de 85P1B3 como se muestra en la Figura 2 o la Figura 3.

Las realizaciones ilustrativas adicionales de la invención descrita en este documento incluyen fragmentos del polinucleótido de 85P1B3 que codifican uno o varios de los motivos biológicos contenidos dentro de la secuencia de la proteína 85P1B3, incluyendo una o varias de las subsecuencias que presentan el motivo de la proteína 85P1B3 expuesta en adelante en las Tablas V-XVIII. En otra realización, los fragmentos de polinucleótido típicos de la invención codifican una o varias de las regiones de 85P1B3 que exhiben homología frente a una molécula conocida. En otra realización de la invención, los fragmentos de polinucleótido típicos pueden codificar uno o varios de los sitios de N-Glicosilación de 85P1B3, sitios de fosforilación de proteína quinasa cAMP- y cGMP-dependientes, sitios de fosforilación de caseína quinasa II o el sitio de N-miristoilación y sitios de amidación.

II. A.) Usos de los polinucleótidos de 85P1B3 II. A. 1.) Monitorización de anormalidades genéticas

Los polinucleótidos de los párrafos precedentes tienen un número de diferentes usos específicos. El gen de 85P1B3 humano se relaciona con la posición cromosómica expuesta en adelante en el Ejemplo 3. Por ejemplo, porque el gen de 85P1B3 se relaciona con este cromosoma, los polinucleótidos que codifican las diferentes regiones de la proteína 85P1B3 se usan para caracterizar las anormalidades citogenéticas de este lugar cromosómico, tales como las anormalidades que se han identificado que están asociadas a varios cánceres. En ciertos genes, una variedad de anormalidades cromosómicas incluyendo reajustes han sido identificadas como frecuentes anormalidades citogenéticas en un número de cánceres diferentes (véase, por ejemplo, Krajinovic et al., Mutat. Res. 382 (3-4): 81-83 (1998); Johansson et al., Blood 86 (10): 3905-3914 (1995) y Finger et al., P. N. A. S. 85 (23): 9158-9162 (1988)). Así, los polinucleótidos que codifican regiones específicas de la proteína 85P1B3 proporcionan nuevas herramientas que pueden ser usadas para delinear, con mayor precisión que antes era posible, anormalidades citogenéticas en la región cromosómica que codifica 85P1B3 lo que puede contribuir al fenotipo maligno. En este contexto, estos polinucleótidos satisfacen una necesidad en la técnica para ampliar la sensibilidad del rastreo cromosómico para identificar anormalidades cromosómicas más sutiles y menos comunes (véase, por ejemplo, Evans et al., Am. J. Obstet. Gynecol 171 (4): 1055-1057 (1994)).

Además, como fue mostrado que 85P1B3 era altamente expresada en cánceres de próstata y otros, los polinucleótidos de 85P1B3 son usados en métodos que evalúan el estado de productos génicos de 85P1B3 en tejidos normales frente a cancerosos. Típicamente, los polinucleótidos que codifican las regiones específicas de la proteína 85P1B3 son usados para evaluar la presencia de perturbaciones (tales como deleciones, inserciones, mutaciones de punto, o alteraciones que causan una pérdida de un antígeno, etc.) en regiones específicas del gen de 85P1B3, tales como tales regiones que contienen uno o varios motivos. Los ensayos ejemplares incluyen tanto ensayos RT-PCR como análisis del polimorfismo de conformación de cadena sencilla (SSCP) (véase, por ejemplo, Marrogi et al., J. Cutan. Pathol. 26 (8): 369-378 (1999), ambos de los cuales utilizan polinucleótidos que codifican las regiones específicas de una proteína para examinar estas regiones dentro de la proteína.

II. A. 2.) Realizaciones antisentido

Otras realizaciones relacionadas con ácidos nucleicos específicamente contempladas de la invención descrita en este documento son ADN genómico, los cDNA, ribozimas, y moléculas antisentido, así como moléculas de ácidos nucleicos basadas en una estructura alternativa, o incluyendo bases alternativas, tanto derivadas de fuentes naturales como sintetizadas, e incluyen moléculas capaces de inhibir el ARN o la expresión de la proteína 85P1B3. Por ejemplo, las moléculas antisentido pueden ser ARN u otras moléculas, incluyendo el ácidos nucleicos peptídicos (PNA) o moléculas no basadas en ácidos nucleicos tales como los derivados de fosforotioato, que se unen específicamente al ADN o ARN de una manera dependiente del par de bases. Un experto en la técnica puede obtener fácilmente estas clases de moléculas de ácidos nucleicos usando los polinucleótidos de 85P1B3 y las secuencias de polinucleótido descritas en este documento.

La tecnología antisentido implica la administración de oligonucleotidos exógenos que se unen a un polinucleótido diana localizado dentro de las células. El término "antisentido" se refiere al hecho de que tales oligonucleotidos son complementarios a sus dianas intracelulares, por ejemplo, 85P1B3. Véase, por ejemplo, Jack Cohen, "Oligodeoxynucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression", Ed. CRC, 1989; y Synthesis 1: 1-5 (1988). Los oligonucleotidos antisentido de 85P1B3 de la presente invención incluyen derivados tales como S-oligonucleotidos (derivados de fosforotioato o S-oligos, véase, Jack Cohen, supra), que exhiben una mayor acción inhibitoria del crecimiento de células cancerígenas. Los S-oligos (nucleósido de fosforotioatos) son análogos isoelectrónicos de un oligonucleotido (O-oligo) en los que un átomo de oxígeno no puente del grupo fosfato es sustituido por un átomo de azufre. Los S-oligos de la presente invención pueden ser preparados por el tratamiento de los correspondientes O-oligos con 3H-1,2-benzoditiol-3-ona-1,1-dióxido, que es un reactivo de transferencia de azufre. Véase Iyer, R. P. et al., J. Org. Chem. 55: 4693-4698 (1990); y Iyer, R. P. et al., J. Am. Chem. Soc. 112: 1253-1254 (1990). Oligonucleotidos antisentido de 85P1B3 adicionales de la presente invención incluyen los oligonucleotidos antisentido de morfolino conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Partridge et al., 1996, Antisense & Nucleic Acid Drug Development 6: 169-175).

Los oligonucleotidos antisentido de 85P1B3 de la presente invención pueden ser típicamente ARN o ADN que es complementario a y que se hibrida establemente con los primeros 100 codones 5' o últimos 100 codones 3' de la secuencia genómica de 85P1B3 o el correspondiente mARN. No se requiere complementariedad absoluta, aunque sean preferidos altos grados de complementariedad. El uso de un oligonucleotido complementario a esta región permite la hibridación selectiva al mARN de 85P1B3 y no al mARN que especifican otras subunidades reguladoras de proteína quinasa. En una realización, los oligonucleotidos antisentido de 85P1B3 de la presente invención son fragmentos de 15 a 30-meros de la molécula de ADN antisentido que tiene una secuencia que se hibrida al mARN de 85P1B3. Opcionalmente, el oligonucleotido antisentido de 85P1B3 es un oligonucleotido de 30-meros que es complementario a una región en los primeros 10 codones 5' o últimos 10 codones 3' de 85P1B3. De forma alternativa, las moléculas antisentido son modificadas para emplear ribozimas en la inhibición de la expresión de 85P1B3, véase, por ejemplo, L. A. Couture & D. T. Stinchcomb; Trends Genet 12: 510-515 (1996).

II. A. 3.) Cebadores y pares de cebador

Otras realizaciones específicas de estos nucleótidos de la invención incluyen cebadores y pares de cebador, que permiten la amplificación específica de polinucleótidos de la invención o de cualquiera de sus partes específicas, y sondas que se hibridan selectivamente o específicamente a las moléculas de ácidos nucleicos de la invención o a cualquiera de sus partes. Se pueden marcar sondas con un marcador detectable, tales como, por ejemplo, un radioisótopo, compuesto fluorescente, compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, quelante metálico o enzima. Tales sondas y cebadores son usados para detectar la presencia de un polinucleótido de 85P1B3 en una muestra y como medio para detectar una célula que expresa una proteína 85P1B3.

Los ejemplos de tales sondas incluyen polipéptidos que comprenden todo o parte de la secuencia de cDNA de 85P1B3 humana mostrada en la Figura 2. Los ejemplos de pares de cebador capaces de amplificar específicamente los mARN de 85P1B3 también son descritos en los Ejemplos. Como se sobrentiende por cualquier experto en la técnica, muchos cebadores diferentes y sondas pueden ser preparadas basado en las secuencias proporcionadas en este documento y son usadas eficazmente para amplificar y/o detectar un mARN de 85P1B3.

Los polinucleótidos de 85P1B3 de la invención son útiles para una variedad de fines, incluyendo, pero no limitados a su uso como sondas y cebadores para la amplificación y/o la detección del(de los) gen(es) de 85P1B3, mARN(s), o sus fragmentos; como reactivos para el diagnóstico y/o el pronóstico del cáncer de próstata y otros cánceres; como secuencias codificantes capaces de dirigir la expresión de polipéptidos de 85P1B3; como herramientas para modular o inhibir la expresión del(de los) gen(es) de 85P1B3 y/o la traducción del(de los) transcriptor(es) de 85P1B3; y como agentes terapéuticos.

La presente invención incluye el uso de cualquier sonda como se describe en este documento para identificar y aislar una 85P1B3 o secuencia de ácido nucleico relacionada con 85P1B3 a partir de una fuente natural, tal como seres humanos u otros mamíferos, así como la secuencia de ácido nucleico aislada per se, que comprendería todo o la mayor parte de las secuencias encontradas en la sonda usada.

II. A. 4.) Aislamiento de moléculas de ácido nucleico que codifican 85P1B3

Las secuencias de cDNA de 85P1B3 descritas en este documento permiten el aislamiento de otros polinucleótidos que codifican los producto(s) génico(s) de 85P1B3, así como el aislamiento de polinucleótidos que codifican homólogos del producto génico de 85P1B3, de forma alternativa isoformas empalmadas, variantes alélicas, y formas mutantes del producto génico de 85P1B3 así como polinucleótidos que codifican los análogos de proteínas relacionadas con 85P1B3. Se conocen varios métodos de clonación molecular que pueden ser empleados para aislar los cDNA de cadena completa que codifican un gen de 85P1B3 (véase, por ejemplo, Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Press, Nueva York, 1989; Current Protocols in Molecular Biology. Ausubel et al.; Ed., Wiley and Sons, 1995). Por ejemplo, pueden ser empleadas convenientemente metodologías de clonación del fago lambda, usando sistemas de clonación disponibles en el comercio (por ejemplo, Lambda ZAP Express, Stratagene). Los clones de fago que contienen los cDNA del gen de 85P1B3 pueden ser identificados sondando con un cDNA de 85P1B3 marcado o sus fragmentos. Por ejemplo, en una realización, el cDNA de 85P1B3 (Figura 2) o una parte de éste puede ser sintetizado y usado como una sonda para recuperar la superposición y los cDNA de cadena entera correspondientes a un gen de 85P1B3. El gen de 85P1B3 por sí mismo puede ser aislado rastreando genotecas de ADN genómico, genotecas de cromosomas artificiales bacterianos (BAC), genotecas de cromosomas artificiales de levadura (YAC), y similares, con sondas de ADN de 85P1B3 o cebadores.

II. A. 5.) Moléculas de ácido nucleico recombinantes y sistemas huésped-vector

La invención también proporciona moléculas de ADN recombinante o ARN que contienen un polinucleótido de 85P1B3, un fragmento, análogo o su homólogo, incluyendo, pero no limitado a fagos, plásmidos, fagómidos, cósmidos, YAC, BAC, así como varios vectores virales y no virales conocidos en la técnica, y células transformadas o transfectadas con tales moléculas de ADN recombinante o ARN. Los métodos para generar tales moléculas son conocidos (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra).

La invención proporciona además un sistema huésped-vector que comprende una molécula de ADN recombinante que contiene un polinucleótido de 85P1B3, fragmento, análogo o su homólogo dentro de una célula huésped procariota o eucariota adecuada. Los ejemplos de células huésped eucariotas adecuadas incluyen una célula de levadura, una célula de planta, o una célula de animal, tal como una célula de mamífero o una célula de insecto (por ejemplo, una célula de baculovirus-infectable tal como una célula Sf9 o HighFive). Los ejemplos de células de mamífero adecuadas incluyen varias líneas celulares de cáncer de próstata tales como DU145 y TsuPr1, otras líneas celulares de cáncer de próstata transfectables o transducibles, células primarias (PrEC), así como un número de células de mamífero rutinariamente usadas para la expresión de proteínas recombinantes (por ejemplo, células COS, CHO, 293, 293T). Más particularmente, un polinucleótido que comprende la secuencia de codificación de 85P1B3 o un fragmento, análogo o su homólogo pueden ser usados para generar proteínas 85P1B3 o sus fragmentos usando cualquier número de sistemas huésped-vector rutinariamente usados y extensamente conocidos en la técnica.

Un amplio rango de sistemas huésped-vector adecuados para la expresión de proteínas 85P1B3 o sus fragmentos está disponible, véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra; Current Protocols in Molecular Biology, 1995, supra). Vectores preferidos para la expresión en mamíferos incluyen, pero no están limitados, a pcDNA 3.1 myc-His-tag (Invitrogen) y el vector retroviral pSRatkneo (Muller et al., 1991, MCB 11: 1785). Utilizando estos vectores de expresión, 85P1B3 puede ser expresada en varias líneas celulares de cáncer de próstata y no próstata, incluyendo por ejemplo 293, 293T, rat-1, NIH 3T3 y TsuPrl. Los sistemas huésped-vector de la invención son útiles para la producción de una proteína 85P1B3 o sus fragmentos. Tales sistemas huésped-vector pueden ser empleados para estudiar las propiedades funcionales de 85P1B3 y mutaciones de 85P1B3 o análogos.

La proteína 85P1B3 humana recombinante o análogo u homólogo o sus fragmentos pueden ser producidos por células de mamífero transfectadas con un constructo que codifica un nucleótido relacionado con 85P1B3. Por ejemplo, pueden ser transfectadas células 293T con un plásmido de expresión que codifica 85P1B3 o su fragmento, análogo o homólogo, 85P1B3 o la proteína relacionada se expresa en células 293T, y la proteína 85P1B3 recombinante se aísla usando métodos de purificación estándar (por ejemplo, purificación por afinidad usando anticuerpos anti-85P1B3). En otra realización, se subclona una secuencia que codifica 85P1B3 en el vector retroviral pSR\alphaMSVtkneo y se usa para infectar varias líneas celulares de mamífero, tales como NIH 3T3, TsuPrl, 293 y rat-1 para establecer líneas celulares que expresan 85P1B3. También pueden ser empleados varios otros sistemas de expresión conocidos en la técnica. Los constructos de expresión que codifican un péptido líder unido en marco a la secuencia que codifica 85P1B3 pueden ser usados para la generación de una forma secretada de la proteína 85P1B3 recombinante.

Como se discute en este documento, la redundancia en el código genético permite la variación en las secuencias génicas de 85P1B3. En particular, se conoce en la técnica que especies de huéspedes específicos tienen a menudo preferencias de codón específicas, y así se puede adaptar la secuencia descrita como preferida para el huésped deseado. Por ejemplo, las secuencias del codón análogas preferidas tienen típicamente codones raros (es decir, codones que tienen una frecuencia de uso de menos de aproximadamente el 20% en las secuencias conocidas del huésped deseado) sustituidos por codones de frecuencia más alta. Las preferencias del codón para una especie específica son calculadas, por ejemplo, utilizando tablas de uso de codón disponibles en INTERNET tales como en el URL www.dna.affrc.go.jp/\simnakamura/codon.html.

Se sabe que otras modificaciones de secuencia realzan la expresión de la proteína en el huésped celular. Éstas incluyen la eliminación de secuencias que codifican señales de poliadenilación falsas, señales de sitio de empalme exón/intrón, repeticiones del tipo transposón, y/o otras tales secuencias bien caracterizadas que son deletéreas a la expresión génica. El contenido de GC de la secuencia es ajustado al promedio de niveles para un huésped celular dado, como se calcula por referencia a los genes conocidos expresados en la célula huésped. Cuando sea posible, la secuencia es modificada para evitar estructuras de mARN secundarias de horquilla predichas. Otras modificaciones útiles incluyen la adición de una secuencia consenso de iniciación de translación en el principio del marco de lectura abierto, como se describe en Kozak, Mol. Cell Biol., 9: 5073-5080 (1989). Los expertos en la técnica saben que la regla general de que los ribosomas eucariotas inician la traducción exclusivamente en el codón AUG 5' proximal es abrogada sólo en raras condiciones (véase, por ejemplo, Kozak PNAS 92 (7): 2662-2666, (1995) y Kozak NAR 15 (20): 8125-8148 (1987)).

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III.) Proteínas relacionadas con 85P1B3

Otro aspecto de la presente invención proporciona proteínas relacionadas con 85P1B3. Las realizaciones específicas de las proteínas 85P1B3 comprenden un polipéptido que tiene todo o parte de la secuencia de aminoácidos de 85P1B3 humana como se muestra en la Figura 2 o la Figura 3. De forma alternativa, las realizaciones de las proteínas 85P1B3 comprenden polipéptidos variante, homólogo o análogos que tienen alteraciones en la secuencia de aminoácidos de 85P1B3 mostrada en la Figura 2 o la Figura 3.

En general, las variantes alélicas naturales de 85P1B3 humana comparten un alto grado de identidad estructural y de homología (por ejemplo, el 90% o más de homología). Típicamente, las variantes alélicas de la proteína 85P1B3 contienen sustituciones de aminoácidos conservadoras dentro de las secuencias de 85P1B3 descritas en este documento o contienen una sustitución de un aminoácido de una posición correspondiente en un homólogo de 85P1B3. Una clase de variantes alélicas de 85P1B3 son las proteínas que comparten un alto grado de homología con al menos una pequeña región de una secuencia de aminoácidos de 85P1B3 particular, pero que además contienen una salida radical de la secuencia, tal como una sustitución no conservadora, truncamiento, inserción o marco de desplazamiento. En las comparaciones de secuencias de proteína, los términos semejanza, identidad y homología cada uno tienen un significado distinto como se aprecia en el campo de la genética. Además, ortología y paralogía pueden ser conceptos importantes que describen la relación de los miembros de una familia de proteínas dada en un organismo frente a los miembros de la misma familia en otros organismos.

Las abreviaturas de los aminoácidos son proporcionadas en la Tabla II. Pueden hacerse con frecuencia sustituciones de aminoácidos conservadoras en una proteína sin cambiar la conformación o la función de la proteína. Las proteínas de la invención pueden comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 sustituciones conservadoras. Tales cambios incluyen la sustitución de cualquiera de isoleucina (I), valina (V) y leucina (L) por cualquier otro de estos aminoácidos hidrófobos; ácido aspártico (D) por ácido glutámico (E) y viceversa; glutamina (Q) por asparagina (N) y viceversa; y serina (S) por treonina (T) y viceversa. También pueden ser consideradas otras sustituciones conservadoras, dependiendo del ambiente del aminoácido particular y su papel en la estructura tridimensional de la proteína. Por ejemplo, la glicina (G) y la alanina (A) con frecuencia pueden ser permutables, como pueden serlo la alanina (A) y la valina (V). La metionina (M), que es relativamente hidrófoba, con frecuencia puede ser intercambiada con la leucina y la isoleucina, y a veces con la valina. Lisina (K) y arginina (R) son con frecuencia permutables en posiciones en las cuales la propiedad significativa del residuo de aminoácido es su carga y los diferentes pK de estos dos residuos de aminoácido no son significativos. De todos modos, pueden ser considerados otros cambios "conservadores" en ambientes particulares (véase, por ejemplo, la Tabla III en este documento; paginas 13-15 "Biochemistry" 2ª ed. Lubert Stryer ed. (Universidad de Stanford); Henikoff et al., PNAS, 1992 Vol 89 10915-10919; Lei et al., J Biol Chem, 19 de mayo de 1995; 270 (20): 11882-6).

Las realizaciones de la invención descritas en este documento incluyen una amplia variedad de variantes aceptadas en la técnica o análogos de proteínas 85P1B3 tales como polipéptidos que tienen inserciones de aminoácidos, deleciones y sustituciones. Las variantes de 85P1B3 pueden ser hechas usando métodos conocidos en la técnica tales como mutagénesis dirigida, barrido de alaninas, y mutagénesis por PCR. La mutagénesis dirigida (Carter et al., Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)), mutagénesis por inserción de un casete (Wells et al., Gene, 34: 315 (1985)), mutagénesis de selección por restricción (Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)) u otras técnicas conocidas pueden ser realizadas sobre el ADN clonado para producir el ADN de la variante de 85P1B3.

El análisis por barrido de aminoácidos también puede ser empleado para identificar uno o varios aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua que está implicada en una actividad biológica específica tal como una interacción proteína-proteína. Entre los aminoácidos de barrido preferidos están los aminoácidos neutros relativamente pequeños. Tales aminoácidos incluyen alanina, glicina, serina y cisteína. La alanina es típicamente un aminoácido de barrido preferido entre este grupo porque elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y con menor probabilidad cambia la conformación de la cadena principal de la variante. La alanina también es típicamente preferida porque es el aminoácido más común. Además, con frecuencia se encuentra tanto en posiciones enterradas como expuestas (Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N. Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)). Si la sustitución de alanina no proporciona las cantidades adecuadas de la variante, puede ser usado un aminoácido isostérico.

Como se define en este documento, las variantes de 85P1B3, análogos o homólogos, tienen el atributo distintivo de que tienen al menos un epítopo que "reacciona específicamente" con una proteína 85P1B3 que tiene la secuencia de aminoácidos de la Figura 2. Como se usa en esta oración, "reacciona específicamente" significa que un anticuerpo o célula T que se une específicamente a una variante de 85P1B3 también se une específicamente a la proteína 85P1B3 que tiene la secuencia de aminoácidos de la Figura 2. Un polipéptido deja de ser una variante de la proteína mostrada en la Figura 2 cuando ya no contiene ningún epítopo capaz de ser reconocido por un anticuerpo o célula T que se une específicamente a la proteína 85P1B3. Los expertos en la técnica saben que los anticuerpos que reconocen las proteínas que se unen a epítopos de tamaño variable, y una agrupación del orden de aproximadamente cuatro o cinco aminoácidos, contiguos o no, es considerada como un número típico de aminoácidos en un epítopo mínimo. Véase, por ejemplo, Nair et al., J. Immunol 2000, 165 (12): 6949-6955; Hebbes et al., Mol Immunol (1989) 26 (9): 865-73; Schwartz et al., J Immunol (1985) 135 (4): 2598-608.

Otra clase de variantes de proteína relacionadas con 85P1B3 comparte el 70%, 75%, 80%, 85% o 90% o más de semejanza con la secuencia de aminoácidos de la Figura 2 o sus fragmentos. Otra clase específica de variantes de la proteína 85P1B3 o análogos comprende uno o varios del motivos biológicos de 85P1B3 descritos en este documento o conocidos en la técnica en este momento. Así, según la presente invención, son abarcados análogos de fragmentos de 85P1B3 (ácido nucleico o aminoácido) que tienen cambiadas propiedades funcionales (por ejemplo, inmunogénicas) en relación con el fragmento de partida. Debe ser apreciado que los motivos ahora o que se volverán parte de la técnica deben ser aplicados a las secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos de la Figura 2 o la Figura 3.

Como se discute en este documento, las realizaciones de la invención reivindicada incluyen polipéptidos que contienen menos que la secuencia de aminoácidos completa de la proteína 85P1B3 mostrada en la Figura 2 o la Figura 3. Por ejemplo, las realizaciones representativas de la invención comprenden péptidos/proteínas que tienen cualesquiera 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más aminoácidos contiguos de la proteína 85P1B3 mostrada en la Figura 2 o la Figura 3.

Además, las realizaciones representativas de la invención descrita en este documento incluyen polipéptidos que consisten en aproximadamente del aminoácido 1 a aproximadamente el aminoácido 10 de la proteína 85P1B3 mostrada en la Figura 2 o la Figura 3, polipéptidos que consisten en aproximadamente del aminoácido 10 a aproximadamente el aminoácido 20 de la proteína 85P1B3 mostrada en la Figura 2 o la Figura 3, polipéptidos que consisten en aproximadamente del aminoácido 20 a aproximadamente el aminoácido 30 de la proteína 85P1B3 mostrada en la Figura 2 o la Figura 3, polipéptidos que consisten en aproximadamente del aminoácido 30 a aproximadamente el aminoácido 40 de la proteína 85P1B3 mostrada en la Figura 2 o la Figura 3, polipéptidos que consisten en aproximadamente del aminoácido 40 a aproximadamente el aminoácido 50 de la proteína 85P1B3 mostrada en la Figura 2 o la Figura 3, polipéptidos que consisten en aproximadamente del aminoácido 50 a aproximadamente el aminoácido 60 de la proteína 85P1B3 mostrada en la Figura 2 o la Figura 3, polipéptidos que consisten en aproximadamente del aminoácido 60 a aproximadamente el aminoácido 70 de la proteína 85P1B3 mostrada en la Figura 2 o la Figura 3, polipéptidos que consisten en aproximadamente del aminoácido 70 a aproximadamente el aminoácido 80 de la proteína 85P1B3 mostrada en la Figura 2 o la Figura 3, polipéptidos que consisten en aproximadamente del aminoácido 80 a aproximadamente el aminoácido 90 de la proteína 85P1B3 mostrada en la Figura 2 o la Figura 3, polipéptidos que consisten en aproximadamente del aminoácido 90 a aproximadamente el aminoácido 100 de la proteína 85P1B3 mostrada en la Figura 2 o la Figura 3, etc. en todas partes de la totalidad de la secuencia de aminoácidos de 85P1B3. Además, los polipéptidos que consisten en aproximadamente del aminoácido 1 (ó 20 ó 30 ó 40, etc.) a aproximadamente el aminoácido 20, (ó 130 ó 140 ó 150, etc.) de la proteína 85P1B3 mostrada en la Figura 2 o la Figura 3 son las realizaciones de la invención. Debe ser apreciado que las posiciones de partida y parada en este párrafo se refieren a la posición especificada así como a aquella posición más o menos 5 residuos.

Las proteínas relacionadas con 85P1B3 son generadas usando la tecnología de síntesis de péptidos estándar o usando métodos de división química conocidos en la técnica. De forma alternativa, pueden ser usados métodos recombinantes para generar las moléculas de ácidos nucleicos que codifican una proteína relacionada con 85P1B3. En una realización, las moléculas de ácidos nucleicos proporcionan medios par generar los fragmentos definidos de la proteína 85P1B3 (o sus variantes, homólogos o análogos).

III. A.) Realizaciones de la proteína que presenta el motivo

Otras realizaciones ilustrativas de la invención descrita en este documento incluyen polipéptidos de 85P1B3 que comprenden los residuos de aminoácidos de uno o varios de los motivos biológicos contenidos dentro de la secuencia del polipéptido de 85P1B3 expuesta en adelante en la Figura 2 o la Figura 3. Se conocen varios motivos en la técnica, y una proteína puede ser evaluada por la presencia de tales motivos en un número de sitios de Internet públicamente disponibles (véanse, por ejemplo, las direcciones URL: pfam.wustl.edu/; searchlauncher.bcm.tmc.edu/seq-search/
struc-predict.html; psort.ims.u-tokyo.ac.jp/; www.cbs.dtu.dk/; www.ebi.ac.uk/interpro/scan.html; www.expasy.ch/
tools/scnpsitl.html; Epimatrix® y Epimer®, Universidad Brown, www.brown.edu/Research/TB-HIV_Lab/epimatrix/
epimatrix.html; y BIMAS, bimas.dcrt.nih.gov/.).

Las subsecuencias que presentan el motivo de la proteína 85P1B3 son expuestas en adelante e identificadas en la Tabla XIX.

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La tabla XX establece más adelante varios motivos que se presentan con frecuencia basado en las búsquedas del pfam (véase la dirección URL pfam.wustl.edu/). Las columnas de la Tabla XX describen (1) la abreviatura del nombre del motivo, (2) el porcentaje de identidad encontrado entre el miembro diferente de la familia del motivo, (3) la descripción o nombre del motivo y (4) la función más común; la información de la posición está incluida si el motivo es relevante para la posición.

Los polipéptidos que comprenden uno o varios de los motivos de 85P1B3 discutidos anteriormente son útiles en la elucidación de las características específicas de un fenotipo maligno en vista de la observación de que los motivos de 85P1B3 discutidos anteriormente están asociados a la desregulación del crecimiento y porque 85P1B3 se sobreexpresa en ciertos cánceres (véase, por ejemplo, Tabla I). La caseína quinasa II, cAMP y proteína quinasa dependiente de camp, y la proteína quinasa C, por ejemplo, son enzimas conocidas que están asociadas al desarrollo del fenotipo maligno (véase, por ejemplo, Chen et al., Lab Invest., 78 (2): 165-174 (1998); Gaiddon et al., Endocrinology 136 (10): 4331-4338 (1995); Hall et al., Nucleic Acids Research 24 (6): 1119-1126 (1996); Peterziel et al., Oncogene 18 (46): 6322-6329 (1999) y O'Brian, Oncol. Rep. 5 (2): 305-309 (1998)). Además, tanto la glicosilación como la miristoilación son modificaciones de la proteína también asociadas al cáncer y a la progresión del cáncer (véase, por ejemplo, Dennis et al., Biochem. Biophys. Acta 1473 (1): 21-34 (1999); Raju et al., Exp. Cell Res. 235 (1): 145-154 (1997)). La amidación es otra modificación de la proteína también asociada al cáncer y a la progresión del cáncer (véase, por ejemplo, Treston et al., J. Natl. Cancer Inst. Monogr. (13): 169-175 (1992)).

En otra realización, las proteínas de la invención comprenden uno o varios de los epítopos inmuno-reactivos identificados conforme a los métodos aceptados por la técnica, tales como los péptidos expuestos en adelante en las Tablas V-XVIII. Los epítopos de CTL pueden ser determinados usando algoritmos específicos para identificar los péptidos dentro de una proteína 85P1B3 que sea capaces de unirse óptimamente a los alelos de HLA especificados (por ejemplo, Tabla IV; Epimatrix® y Eimer®, Universidad Brown, URL www.brown.edu/Research/TB-HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html; y BIMAS, URL bimas.dcrt.nih.gov/.) Además, los procesos para identificar los péptidos que tienen una afinidad de unión suficiente con las moléculas de HLA y que están correlacionados con ser epítopos inmunogénicos, son conocidos en la técnica, y son llevados a cabo sin una experimentación excesiva. Además, los procesos para identificar los péptidos que son epítopos inmunogénicos, son conocidos en la técnica, y se llevan a cabo sin una experimentación excesiva in vitro o in vivo.

También son conocidos en la técnica principios para crear análogos de tales epítopos para modular la inmunogenicidad. Por ejemplo, se comienza con un epítopo que presenta un motivo CTL o HTL (véase, por ejemplo, los motivos/supermotivos HLA Clase I y HLA Clase II de la Tabla IV). El epítopo se hace análogo sustituyendo un aminoácido en una de las posiciones especificadas, y sustituyéndolo con otro aminoácido específico para aquella posición. Por ejemplo, se puede sustituir un residuo deletéreo a favor de cualquier otro residuo, tal como un residuo preferido como se define en la Tabla IV; sustituir un residuo menos preferido por un residuo preferido como se define en la Tabla IV; o sustituir un residuo originalmente natural preferido por otro residuo preferido como se define en la Tabla IV. Las sustituciones pueden ocurrir en posiciones de anclaje primario o en otras posiciones en un péptido; véase, por ejemplo, la Tabla IV.

Una variedad de referencias reflejan la técnica en cuanto a la identificación y la generación de epítopos en una proteína de interés así como en sus análogos. Véase, por ejemplo, el documento WO 9733602 de Chesnut et al.; Sette, Immunogenetics 1999 50 (3-4): 201-212; Sette et al., J. Immunol. 2001 166 (2): 1389-1397; Sidney et al., Hum. Immunol. 1997 58 (1): 12-20; Kondo et al., Immunogenetics 1997 45 (4): 249-258; Sidney et al., J. Immunol. 1996 157 (8): 3480-90; y Falk et al., Nature 351:290: 6 (1991); Hunt et al., Science 255: 1261-3 (1992); Parker et al., J. Immunol. 149: 3580-7 (1992); Parker et al., J. Immunol. 152: 163-75 (1994)); Kast et al., 1994 152 (8): 3904-12; Borras-Cuesta et al., Hum. Immunol. 2000 61 (3): 266-278; Alexander et al., J. Immunol. 2000 164 (3): 1625-1633; Alexander et al., PMID: 7895164, UI: 95202582; O'Sullivan et al., J. Immunol. 1991 147 (8): 2663-2669; Alexander et al., Immunity 1994 1 (9): 751-761 y Alexander et al., Immunol. Res. 1998 18 (2): 79-92.

Las realizaciones relacionadas de las invenciones incluyen polipéptidos que comprenden combinaciones de los diferentes motivos expuestos en adelante en la Tabla XIX, y/o, uno o varios de los epítopos de CTL predichos de la Tabla V a la Tabla XVIII, y/o, uno o varios de los motivos de unión a linfocitos T conocidos en la técnica. Las realizaciones preferidas no contienen ninguna inserción, delección o sustitución dentro de los motivos o las secuencias intervinientes de los polipéptidos. Además, pueden ser deseables realizaciones que incluyan un número de residuos de aminoácidos N-terminal y/o C-terminal en cada lado de estos motivos (para, por ejemplo, incluir una mayor parte de la arquitectura del polipéptido en la cual el motivo es localizado). Típicamente el número de residuos de aminoácidos N-terminal y/o C-terminal de cada lado de un motivo está entre aproximadamente 1 a aproximadamente 100 residuos de aminoácidos, preferiblemente de 5 a aproximadamente 50 residuos de aminoácidos.

Las proteínas relacionadas con 85P1B3 son incorporadas en muchas formas, preferiblemente en forma aislada. Una molécula proteica de 85P1B3 purificada estará sustancialmente sin otras proteínas o moléculas que perjudiquen la unión de 85P1B3 al anticuerpo, célula T u otro ligando. La naturaleza y el grado de aislamiento y purificación dependerán del uso pretendido. Las realizaciones de las proteínas relacionadas con 85P1B3 incluyen proteínas purificadas relacionadas con 85P1B3 y proteínas funcionales y solubles relacionadas con 85P1B3. En una realización, una proteína 85P1B3 funcional y soluble o sus fragmentos conservan la capacidad de unirse al anticuerpo, célula T u otro ligando.

La invención también proporciona proteínas 85P1B3 que comprenden fragmentos biológicamente activos de la secuencia de aminoácidos de 85P1B3 mostrada en la Figura 2 o la Figura 3. Tales proteínas exhiben las propiedades de la proteína 85P1B3, tales como la capacidad de obtener una generación de anticuerpos que se unan específicamente a un epítopo asociado a la proteína 85P1B3; que sean unidas por tales anticuerpos; para producir la activación de HTL o CTL; y/o, que sean reconocidas por HTL o CTL.

Los polipéptidos relacionados con 85P1B3 que contienen estructuras particularmente interesantes pueden ser predichos y/o identificados usando varias técnicas analíticas conocidas en la técnica, incluyendo, por ejemplo, los métodos de Chou-Fasman, Garnier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz o el análisis de Jameson-Wolf, o basados en la inmunogenicidad. Los fragmentos que contienen tales estructuras son particularmente útiles en la generación de anticuerpos anti-85P1B3 específicos de la subunidad, o linfocitos T o en la identificación de factores celulares que se unen a 85P1B3.

Los epítopos CTL pueden ser determinados usando algoritmos específicos para identificar péptidos dentro de una proteína 85P1B3 que sean capaces de unirse óptimamente a los alelos de HLA especificados (por ejemplo, usando el sitio SYFPEITHI en el URL de la World Wide Web syfpeithi.bmi-heidelberg.com/; los listados en la Tabla IV (A) - (E); Epimatrix® y Eimer®, Universidad Brown, URL (\underbar{www.brown.edu/Research/TB-HIV\_Lab/epimatrix/epimatrix.html}); BIMAS, URL bimas.dcrt.nih.gov/). Ilustrando esto, fueron predichos los epítopos de péptido de 85P1B3 que se presentan en el contexto de las moléculas de clase I de MHC humanas HLA-A1, A2, A3, A11, A24, B7 y B35 (Tablas V-XVIII). Específicamente, la secuencia de aminoácidos completa de la proteína 85P1B3 fue introducida en el algoritmo de búsqueda de motivos de péptidos de HLA encontrado en el sitio web del "Bioinformatics and Molecular Analysis Section" (BIMAS) nombrado anteriormente. El algoritmo de búsqueda de motivos de péptidos de HLA fue desarrollado por el Doctor Ken Parker basado en la unión de secuencias de péptido específicas en la ancladura de moléculas de HLA Clase I, en particular HLA-A2 (véase, por ejemplo, Falk et al., Nature 351: 290-6 (1991); Hunt et al., Science 255: 1261-3 (1992); Parker et al., J. Immunol. 149: 3580-7 (1992); Parker et al., J. Immunol. 152: 163-75 (1994)). Este algoritmo proporciona la posición y la clasificación de péptidos 8-mero, 9-mero y 10-mero a partir de una secuencia de proteína completa para la unión predicha a HLA-A2 así como numerosas otras moléculas de HLA Clase I. Muchos péptidos de unión de HLA Clase I tienen 8-, 9-, 10 ó 11-meros. Por ejemplo, para HLA-A2 Clase I, los epítopos preferiblemente contienen una leucina (L) o metionina (M) en la posición 2 y una valina (V) o leucina (L) en el extremo C-terminal (véase, por ejemplo, Parker et al., J. Immunol. 149: 3580-7 (1992)). Se muestran los resultados seleccionados de péptidos de unión de 85P1B3 predichos en las Tablas V-XVIII en este documento. En las Tablas V-XVIII, se muestran los 50 primeros candidatos, 9-meros y 10-meros, para cada miembro de familia con su posición, la secuencia de aminoácidos de cada péptido específico, y una valoración de unión estimada. La valoración de la unión corresponde a la mitad del tiempo estimado de disociación de complejos que contienen el péptido a 37ºC a un pH 6,5. Los péptidos con la valoración de unión más alta son predichos que son los más fuertemente unidos a HLA Clase I en la superficie de la célula durante el mayor período de tiempo y así representan las mejores dianas inmunogénicas para el reconocimiento de linfocitos T.

La unión real de péptidos a un alelo de HLA puede ser evaluada por la estabilización de la expresión de HLA en la línea celular T2 defectuosa procesadora de antígeno (véase, por ejemplo, Xue et al., Prostate 30: 73-8 (1997) y Peshwa et al., Prostate 36: 129-38 (1998)). La inmunogenicidad de péptidos específicos puede ser evaluada in vitro por la estimulación de linfocitos T citotóxicos CD8+ (CTL) en presencia de células que presentan el antígeno tales como células dendríticas.

Debe ser apreciado que cada epítopo predicho por el sitio BIMAS, sitios Epimer® y Epimatrix®, o especificado por los motivos de HLA Clase I o clase II disponibles en la técnica o que se vuelven parte de la técnica tales como los expuestos en adelante en la Tabla IV (o determinados usando el sitio URL de la World Wide Web syfpeithi.bmi-heidelberg.com/) deben ser "aplicados" a la proteína 85P1B3. Como se usa en este contexto, "aplicado" significa que la proteína 85P1B3 se evalúa, por ejemplo, visualmente o por métodos de búsqueda basados en modelos informáticos, como se aprecia por los expertos en la técnica relevante. Cada subsecuencia de la 85P1B3 de 8, 9, 10 ó 11 residuos de aminoácidos que presenta un motivo de HLA Clase I, o una subsecuencia de 9 o más residuos de aminoácidos que presenta un motivo de HLA Clase II están en la amplitud de la invención.

III. B.) Expresión de proteínas relacionadas con 85P1B3

En una realización descrita en los ejemplos que siguen, 85P1B3 puede ser convenientemente expresada en células (tales como células 293T) transfectadas con un vector de expresión disponible en el comercio, tal como un vector de expresión dirigido por CMV que codifica 85P1B3 con un 6XHis extremo C-terminal y el marcador MYC (pcDNA3.1/mycHIS, Invitrogen o Tag5, Corporación GenHunter, Nashville TN). El vector Tag5 proporciona una señal de secreción de IgGK que puede ser usada para facilitar la producción de una proteína 85P1B3 secretada en células transfectadas. La 85P1B3 His-marcada secretada en el medio de cultivo puede ser purificada, por ejemplo, usando una columna de níquel usando técnicas estándar.

III. C.) Modificaciones de proteínas relacionadas con 85P1B3

Modificaciones de proteínas relacionadas con 85P1B3 tales como modificaciones covalentes están incluidas en la amplitud de esta invención. Un tipo de modificación covalente incluye hacer reaccionar residuos de aminoácidos reconocibles de un polipéptido de 85P1B3 con un agente de derivatización orgánico que sea capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o los residuos N- o C-terminal de la 85P1B3. Otro tipo de modificación covalente del polipéptido de 85P1B3 incluida en la amplitud de esta invención comprende cambiar el modelo de glicosilación natural de una proteína de la invención. Otro tipo de modificación covalente de 85P1B3 comprende unir el polipéptido de 85P1B3 a una de una variedad de polímeros no proteicos, por ejemplo, polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la manera expuesta en adelante en la patentes de EE.UU. N^{os}. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 o 4.179.337.

Las proteínas relacionadas con 85P1B3 de la presente invención también pueden ser modificadas para formar una molécula quimérica que comprenda 85P1B3 fusionada a otro polipéptido heterólogo o secuencia de aminoácidos. Una tal molécula quimérica puede ser sintetizada químicamente o recombinantemente. Una molécula quimérica puede tener una proteína de la invención fusionada a otro antígeno asociado al tumor o su fragmento. De forma alternativa, una proteína conforme a la invención puede comprender una fusión de fragmentos de la secuencia de 85P1B3 (aminoácido o ácido nucleico) tal que sea creada una molécula que no es, por su longitud, directamente homóloga a las secuencias de aminoácido o ácido nucleico mostradas en la Figura 2 o la Figura 3. Una tal molécula quimérica puede comprender múltiplos de la misma subsecuencia de 85P1B3. Una molécula quimérica puede comprender una fusión de una proteína relacionada con 85P1B3 con un marcador de epítopo de polihistidina, que proporcione un epítopo al cual puede unirse selectivamente níquel inmovilizado, con citoquinas o con factores de crecimiento. El marcador de epítopo se coloca generalmente en el extremo amino- o carboxilo-terminal de la 85P1B3. En una realización alternativa, la molécula quimérica puede comprender una fusión de una proteína relacionada con 85P1B3 con una inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina. Para una forma bivalente de la molécula quimérica (también denominada una "inmunoadhesina"), tal fusión podría ser a la región de Fc de una molécula IgG. Las fusiones de Ig incluyen preferiblemente la sustitución de una forma soluble (dominio transmembrana suprimido o inactivo) de un polipéptido de 85P1B3 en lugar de al menos una región variable dentro de una molécula Ig. En una realización preferida, la fusión de inmunoglobulina incluye las regiones de ancladura, CH_{2} y CH_{3}, o la ancladura, CH_{1}, CH_{2} y CH3 de una molécula IgGI. Para la producción de fusiones de inmunoglobulina véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. Nº. 5.428.130 publicada el 27 de junio de 1995.

III. D.) Usos de proteínas relacionadas con 85P1B3

Las proteínas de la invención tienen un número de diferentes usos específicos. Como 85P1B3 es altamente expresada en la próstata y otros cánceres, las proteínas relacionadas con 85P1B3 son usadas en métodos que evalúan el estado de productos génicos de 85P1B3 en tejidos normales frente a cancerosos, proporcionando así el fenotipo maligno. Típicamente, los polipéptidos de las regiones específicas de la proteína 85P1B3 son usados para evaluar la presencia de perturbaciones (tales como deleciones, inserciones, mutaciones de punto etc.) en aquellas regiones (tales como regiones que contienen uno o varios motivos). Los ensayos ejemplares utilizan anticuerpos o linfocitos T que reconocen proteínas relacionadas con 85P1B3 que comprenden los residuos de aminoácidos de uno o varios de los motivos biológicos contenidos dentro de la secuencia del polipéptido de 85P1B3 para evaluar las características de esta región en tejidos normales frente a cancerosos u obtener una respuesta inmune frente al epítopo. De forma alternativa, las proteínas relacionadas con 85P1B3 que contienen los residuos de aminoácidos de uno o varios de los motivos biológicos en la proteína 85P1B3 son usadas para seleccionar los factores que interaccionan con aquella región de 85P1B3.

Los fragmentos/subsecuencias de la proteína 85P1B3 son particularmente útiles en la generación y la caracterización de anticuerpos específicos de dominio (por ejemplo, anticuerpos que reconocen un epítopo extracelular o intracelular de una proteína 85P1B3), para identificar a agentes o los factores celulares que se unen a 85P1B3 o su dominio estructural particular, y en varios contextos terapéuticos y diagnósticos, incluyendo, pero no limitados a ensayos diagnósticos, vacunas del cáncer y métodos para preparar tales vacunas.

Las proteínas codificadas por los genes de 85P1B3, o por sus análogos, homólogos o fragmentos, tienen una variedad de usos, incluyendo, pero no limitados a la generación de anticuerpos y en métodos para identificar ligandos y otros agentes y constituyentes celulares que se unen a un producto génico de 85P1B3. Los anticuerpos generados contra una proteína 85P1B3 o sus fragmentos son útiles en ensayos diagnósticos y pronósticos, y metodologías de imagimática en el tratamiento médico de cánceres humanos caracterizadas por la expresión de la proteína 85P1B3, tales como los mencionados en la Tabla I. Tales anticuerpos pueden ser expresados intracelularmente y ser usados en métodos para tratar a pacientes con tales cánceres. Los ácidos nucleicos relacionados con 85P1B3 o proteínas también son usados en la generación de respuestas de HTL o CTL.

Varios ensayos inmunológicos útiles para la detección de proteínas 85P1B3 son usados, incluyendo, pero no limitados a los diversos tipos de radioinmunoensayos, ensayo inmunosorbente ligado a enzima (ELISA), ensayo inmunofluorescente ligado a enzima (ELIFA), métodos inmunocitoquímicos y otros similares. Los anticuerpos pueden marcarse y usarse como reactivos de imagimática inmunológicos capaces de detectar las células que expresan 85P1B3 (por ejemplo, en métodos de imagimática radiocintigráficos). Las proteínas 85P1B3 son también particularmente útiles en la generación de vacunas del cáncer, como se describe más adelante en este documento.

IV.) Anticuerpos de 85P1B3

Otro aspecto de la invención proporciona anticuerpos que se unen a proteínas relacionadas con 85P1B3. Los anticuerpos preferidos se unen específicamente a una proteína relacionada con 85P1B3 y no se unen (o se unen débilmente) a péptidos o proteínas que no son proteínas relacionadas con 85P1B3. Por ejemplo, los anticuerpos que se unen a 85P1B3 puede unirse a proteínas relacionadas con 85P1B3, tales como sus homólogos o análogos.

Los anticuerpos de 85P1B3 de la invención son particularmente útiles en ensayos diagnósticos y pronósticos del cáncer de próstata, y metodologías de imagimática. Asimismo, tales anticuerpos son útiles en el tratamiento, diagnóstico, y/o pronóstico de otros cánceres, al grado de que 85P1B3 también se expresa o se sobreexpresa en estos otros cánceres. Además, los anticuerpos intracelularmente expresados (por ejemplo, anticuerpos de cadena sencilla) son terapéuticamente útiles en el tratamiento de cánceres en los cuales está implicada la expresión de 85P1B3, tales como cánceres de próstata avanzados o metastásicos.

La invención también proporciona varios ensayos inmunológicos útiles para la detección y la cuantificación de 85P1B3 y proteínas relacionadas con 85P1B3 mutantes. Tales ensayos pueden comprender uno o varios anticuerpos de 85P1B3 capaces de reconocer y unirse a una proteína relacionada con 85P1B3, cuando sea apropiado. Estos ensayos son realizados según varios formatos de ensayo inmunológicos conocidos en la técnica, incluyendo, pero no limitados a varios tipos de radioinmunoensayos, ensayo inmunosorbente ligado a enzima (ELISA), ensayo inmunofluorescente ligado a enzima (ELIFA) y otros similares.

Los ensayos sin anticuerpos inmunológicos de la invención también comprenden ensayos de inmunogenicidad de linfocitos T (inhibitorios o estimuladores) así como ensayos de unión del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC).

Además, también se proporcionan métodos de imagimática inmunológicos capaces de detectar el cáncer de próstata y otros cánceres que expresan 85P1B3 según la invención, incluyendo, pero no limitados a métodos de imagimática radiocintigráficos usando anticuerpos de 85P1B3 marcados. Tales ensayos son clínicamente útiles en la detección, control y pronóstico de cánceres que expresan 85P1B3, tales como el cáncer de próstata.

Los anticuerpos de 85P1B3 también son usados en métodos para purificar una proteína relacionada con 85P1B3 y para aislar a los homólogos de 85P1B3 y moléculas relacionadas. Por ejemplo, un método para purificar una proteína relacionada con 85P1B3 comprende incubar un anticuerpo de 85P1B3, que ha sido acoplado a una matriz sólida, con un lisado u otra solución que contiene una proteína relacionada con 85P1B3 en condiciones que permiten al anticuerpo de 85P1B3 unirse a la proteína relacionada con 85P1B3; lavar la matriz sólida para eliminar las impurezas; y eluir la proteína relacionada con 85P1B3 del anticuerpo acoplado. Otros usos de los anticuerpos de 85P1B3 de la invención incluyen anticuerpos anti-idiotípicos generadores que imitan a la proteína 85P1B3.

Varios métodos para la preparación de anticuerpos son conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos inmunizando un huésped mamífero adecuado usando una proteína relacionada con 85P1B3, péptido o fragmento, en una forma aislada o inmunoconjugada ("Antibodies: A Laboratory Manual", CSH Press, Eds., Harlow y Lane(1988); Harlow, "Antibodies", Cold Spring Harbor Press, Nueva York (1989)). Además, también pueden ser usadas proteínas de fusión de 85P1B3, tales como una proteína de fusión 85P1B3 GST. En una realización particular, es producida una proteína de fusión GST que comprende todo o la mayor parte de la secuencia de aminoácidos de la Figura 2 o la Figura 3, luego usarla como un inmunógeno para generar los anticuerpos apropiados. En otra realización, se sintetiza una proteína relacionada con 85P1B3 y se usa como inmunógeno.

Además, se usan técnicas de inmunización de ADN desnudo conocidas en la técnica (con o sin la proteína relacionada con 85P1B3 purificada o células que expresan 85P1B3) para generar una respuesta inmune frente al inmunógeno codificado (para una revisión, véase Donnelly et al., 1997, Ann. Rev. Immunol. 15: 617-648).

La secuencia de aminoácidos de 85P1B3 como se muestra en la Figura 2 o la Figura 3 puede ser analizada para seleccionar las regiones específicas de la proteína 85P1B3 para generar anticuerpos. Por ejemplo, los análisis de hidrofobicidad y hidrofilicidad de la secuencia de aminoácidos de 85P1B3 son usados para identificar regiones hidrófilas en la estructura de 85P1B3. Las regiones de la proteína 85P1B3 que muestran la estructura inmunogénica, así como otras regiones y dominios, pueden ser identificadas fácilmente usando varios otros métodos conocidos en la técnica, tales como los análisis de Chou-Fasman, Garnier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz o Jameson-Wolf. Así, cada región identificada según cualquiera de estos programas o métodos está en la amplitud de la presente invención. Los métodos para la generación de anticuerpos de 85P1B3 son ilustrados además mediante los ejemplos proporcionados en este documento. Los métodos para preparar una proteína o polipéptido para su uso como inmunógeno son conocidos en la técnica. También son conocidos en la técnica métodos para preparar conjugados inmunogénicos de una proteína con un vehículo, tal como BSA, KLH u otra proteína vehículo. En algunas circunstancias, en la conjugación directa se usan, por ejemplo, reactivos de carbodimida; en otros casos son eficaces reactivos de unión tales como los suministrados por la compañía Pierce Chemical, Rockford, IL. La administración de un inmunógeno de 85P1B3 se lleva a cabo a menudo mediante la inyección en un período de tiempo adecuado y con el uso de un adyuvante adecuado, como se sobrentiende en la técnica. Durante el programa de inmunización, los títulos de anticuerpos pueden ser tomados para determinar la suficiencia de la formación de anticuerpos.

Pueden ser producidos anticuerpos monoclonales de 85P1B3 mediante varios medios conocidos en la técnica. Por ejemplo, las líneas celulares inmortalizadas que secretan un anticuerpo monoclonal deseado se preparan usando la tecnología de hibridoma estándar de Kohler y Milstein o modificaciones que inmortalizan células B que producen el anticuerpo, como es generalmente conocido. Las líneas celulares inmortalizadas que secretan los anticuerpos deseados son rastreadas por inmunoensayo en el cual el antígeno es una proteína relacionada con 85P1B3. Cuando se identifica el apropiado cultivo celular inmortalizado, las células pueden ser ampliadas y pueden ser producidos los anticuerpos a partir de los cultivos in vitro o a partir del fluido ascítico.

Los anticuerpos o los fragmentos de la invención también pueden ser producidos, por medios recombinantes. Las regiones que se unen específicamente a las regiones deseadas de la proteína 85P1B3 también pueden ser producidas en el contexto de los anticuerpos quiméricos o injertados de la región determinante de complementariedad (CDR) de múltiples especies de origen. También pueden ser producidos anticuerpos de 85P1B3 humanizados o humanos, y son preferidos para su uso en contextos terapéuticos. Se conocen métodos para humanizar anticuerpos murinos y otros no humanos, sustituyendo una o varias de las CDR de anticuerpos no humanos por las correspondientes secuencias del anticuerpo humano (véase, por ejemplo, Jones et al., 1986, Nature 321: 522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332: 323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239: 1534-1536). Véase también, Carter et al., 1993, Proc. Natl. Acad, Sci. USA 89: 4285 y Sims et al., 1993, J. Immunol. 151: 2296.

Los métodos para producir anticuerpos monoclonales totalmente humanos incluyen métodos de expresión en fago y transgénicos (para una revisión, véase Vaughan et al., 1998, Nature Biotechnology 16: 535-539). Pueden ser generados anticuerpos monoclonales de 85P1B3 totalmente humanos usando tecnologías de clonación que emplean genotecas combinatorias del gen de Ig humano grandes (es decir, expresión en fago) (Griffiths y Hoogenboom, "Building an in vitro immune system: human antibodies from phage display libraries". En: Protein Engineering of Antibody Molecules for Prophylactic and Therapeutic Applications in Man, Clark, M. (editor), Nottingham Academic, pp. 45-64 (1993); Burton y Barbas, Human Antibodies from combinatorial libraries. Id., pp. 65-82). También pueden ser producidos anticuerpos monoclonales de 85P1B3 totalmente humanos usando ratones transgénicos genéticamente modificados que contienen los loci del gen de inmunoglobulina humano como se describe en la solicitud de patente PCT W098/24893, Kucherlapati y Jakobovits et al., publicada el 3 de diciembre de 1997 (véase también, Jakobovits, 1998, Exp. Opin. Invest. Drugs 7 (4): 607-614; patentes de EE.UU. 6.162.963 publicada el 19 de diciembre del 2000; 6.150.584 publicada el 12 de noviembre de 2000; y 6.114.598 publicada el 5 de septiembre del 2000). Este método evita la manipulación in vitro requerida con la tecnología de expresión en fago y produce de manera eficiente auténticos anticuerpos humanos de alta afinidad.

La reactividad de los anticuerpos de 85P1B3 con una proteína relacionada con 85P1B3 puede ser establecida por un número de medios conocidos, incluyendo análisis de inmunotransferencia Western, inmunoprecipitación, ELISA y FACS usando, cuando sea apropiado, proteínas relacionadas con 85P1B3, células que expresan 85P1B3 o sus extractos. Un anticuerpo de 85P1B3 o sus fragmentos puede marcarse con un marcador detectable o ser conjugado a una segunda molécula. Los marcadores detectables adecuados incluyen, pero no están limitados a, un radioisótopo, un compuesto fluorescente, un compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, un quelante metálico o una enzima. Además, los anticuerpos bi-específicos específicos para dos o más epítopos de 85P1B3 son generados usando métodos generalmente conocidos en la técnica. También pueden ser generados anticuerpos homodiméricos mediante técnicas de reticulación conocidas en la técnica (por ejemplo, Wolf et al., Cancer Res. 53: 2560-2565).

V.) Respuestas inmunes celulares de 85P1B3

Se ha descrito el mecanismo por el cual los linfocitos T reconocen a los antígenos. Las composiciones de vacuna eficaces basadas en epítopo de péptido de la invención inducen respuestas inmunes terapéuticas o profilácticas en segmentos muy amplios de la población mundial. Para comprender el valor y la eficacia de las composiciones de la invención que inducen respuestas inmunes celulares, se proporciona una breve revisión de la tecnología relacionada con la inmunología.

Un complejo de una molécula HLA y un antígeno peptídico actúa como el ligando reconocido por los linfocitos T HLA-restringidos (Buus, S. et al., Cell 47: 1071, 1986; Babbitt, B. P. et al., Nature 317: 359, 1985; Townsend, A. y Bodmer, H., Annu. Rev. Immunol. 7: 601,1989; Germain, R. N., Annu. Rev. Immunol. 11: 403,1993). A través del estudio de análogos de antígeno sustituidos de aminoácidos simple y la secuenciación de péptidos naturalmente procesados endógenamente unidos, se han identificado residuos críticos que corresponden a motivos requeridos para la unión específica a moléculas de antígeno de HLA y son expuestos en adelante en la Tabla IV (véase también, por ejemplo, Southwood, et al., J. Immunol. 160: 3363, 1998; Rammensee, et al., Immunogenetics 41: 178, 1995; Rammensee et al., SYFPEITHI, acceso vía el sitio URL de la World Wide Web syfpeithi.bmi-heidelberg.com/; Sette, A. y Sidney, J. Curr. Opin. Immunol. 10: 478, 1998; Engelhard, V.H., Curr. Opin. lmmunol. 6: 13,1994; Sette, A. y Grey, H. M., Curr. Opin. Immunol. 4: 79, 1992; Sinigaglia, F. y Hammer, J. Curr. Biol. 6: 52,1994; Ruppert et al., Cell 74: 929-937, 1993; Kondo et al., J. Immunol. 155: 4307-4312, 1995; Sidney et al., J. Immlunol. 157: 3480-3490, 1996; Sidney et al., Human Immunol. 45: 79-93, 1996; Sette, A. y Sidney, J. Immunogenetics, noviembre de 1999; 50 (3-4): 201-12, Revisión).

Además, los análisis cristalográficos de rayos X de complejos HLA-péptido han revelado bolsas dentro de fisura/ancladura de unión del péptido de moléculas HLA que acomodan, en un modo específico de alelo, residuos llevados por ligandos de péptido; estos residuos a su vez determinan la capacidad de unión de HLA de los péptidos en los cuales están presentes. (Véase, por ejemplo, Madden, D. R. Annu. Rev. Immunol. 13: 587,1995; Smith, et al., Immunity 4: 203,1996; Fremont et al., Immunity 8: 305,1998; Stern et al., Structure 2: 245,1994; Jones, E. Y. Curr. Opin. Immunol. 9: 75, 1997; Brown, J. H. et al., Nature 364: 33, 1993; Guo, H. C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8053, 1993; Guo, H.C. et al., Nature 360: 364, 1992; Silver, M. L. et al., Nature 360: 367, 1992; Matsumura, M. et al., Science 257: 927, 1992; Madden et al., Cell 70: 1035, 1992; Fremont, D. H. et al., Science 257: 919, 1992; Saper, M. A., Bjorkman, P. J. y Wiley, D. C., J. Mol. Biol. 219: 277, 1991.)

En consecuencia, la definición de motivos de unión de HLA específicos de alelo clase I y clase II, o supermotivos clase I y clase II permite la identificación de regiones dentro de una proteína que están correlacionadas con la unión
al(a los) antígeno(s) de HLA particular(es).

Así, por un procedimiento de identificación del motivo de HLA, se han identificado candidatos para vacunas basadas en epítopo; tales candidatos pueden ser evaluados además mediante ensayos de unión de HLA-péptido para determinar la afinidad de unión y/o el período de tiempo de asociación del epítopo y su molécula HLA correspondiente. Otro trabajo confirmativo puede ser realizado para seleccionar, entre estos candidatos de vacuna, los epítopos con características preferidas en términos de cobertura y/o inmunogenicidad.

Varias estrategias pueden ser utilizadas para evaluar la inmunogenicidad celular, incluyendo:

1) La evaluación de cultivos de linfocitos T primarios de individuos normales (véase, por ejemplo, Wentworth, P. A. et al., Mol. Immunol. 32: 603, 1995; Celis, E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2105, 1994; Tsai, V. et al., J. Immunol. 158: 1796, 1997; Kawashima, I et al., Human Immunol. 59: 1,1998). Este procedimiento implica la estimulación de linfocitos de sangre periférica (PBL) de sujetos normales con un péptido de ensayo en presencia de células que presentan antígeno in vitro en un período de varias semanas. Los linfocitos T específicos para el péptido se vuelven activos durante este tiempo y son detectados usando, por ejemplo, un ensayo de liberación de linfoquina o ^{51}Cr que implica células diana sensibilizadas del péptido.

2) La inmunización de ratones transgénicos de HLA (véase, por ejemplo, Wentworth, P. A. et al., J. Immunol. 26: 97, 1996; Wentworth, P. A. et al., Int. Immunol. 8: 651, 1996; Alexander, J. et al., J. Immunol. 159: 4753, 1997). Por ejemplo, en tales métodos son administrados a ratones transgénicos de HLA péptidos en adyuvante de Freund incompleto subcutáneamente. Varias semanas después de la inmunización, los esplenocitos son eliminados y cultivados in vitro en presencia del péptido de ensayo durante aproximadamente una semana. Los linfocitos T específicos del péptido son detectados usando, por ejemplo, un ensayo de liberación de ^{51}Cr que implica células diana sensibilizadas del péptido y células diana que expresan el antígeno endógenamente generado.

3) La manifestación de respuestas de linfocitos T recuerdo a partir de individuos inmunes que han sido vacunados eficazmente y/o a partir de pacientes crónicamente enfermos (véase, por ejemplo, Rehermann, B. et al., J. Exp. Med. 181: 1047, 1995; Doolan, D. L. et al., Immunity 7: 97, 1997; Bertoni, R. et al., J. Clin. Invest. 100: 503, 1997; Threlkeld, S. C. et al., J. lmmunol. 159: 1648, 1997; Diepolder, H. M. et al., J. Virol. 71: 6011, 1997). En consecuencia, las respuestas de recuerdo son detectadas por el cultivo de PBL a partir de sujetos que han sido expuestos al antígeno debido a la enfermedad y que así han generado una respuesta inmune "natural", o a partir de pacientes que fueron vacunados contra el antígeno. PBL de sujetos son cultivados in vitro durante 1-2 semanas en presencia del péptido de ensayo más células que presentan antígeno (APC) para permitir la activación de linfocitos T de "recuerdo", comparado con los linfocitos T "limpios". Al final del período de cultivo, la actividad de los linfocitos T es detectada usando ensayos que incluyen la liberación de ^{51}Cr que implica dianas sensibilizadas del péptido, la proliferación de linfocitos T o la liberación de linfoquina.

VI.) Animales transgénicos de 85P1B3

Los ácidos nucleicos que codifican una proteína relacionada con 85P1B3 también pueden ser usados para generar animales transgénicos o animales "genéticamente modificados" que, a su vez, son útiles en el desarrollo y el rastreo de reactivos terapéuticamente útiles. Conforme a las técnicas establecidas, puede ser usado el cDNA que codifica 85P1B3 para clonar el ADN genómico que codifica 85P1B3. Las secuencias genómicas clonadas entonces pueden ser usadas para generar animales transgénicos que contienen células que expresan el ADN que codifica 85P1B3. Los métodos para generar animales transgénicos, particularmente animales tales como ratones o ratas, se han vuelto convencionales en la técnica y son descritos, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. N^{os}. 4.736.866 publicada el 12 de abril de 1988, y 4.870.009 publicada el 26 de septiembre de 1989. Típicamente, serían reconocidas células particulares para la incorporación del transgen de 85P1B3 con potenciadores específicos de tejido.

Pueden ser usados animales transgénicos que incluyan una copia de un transgen que codifica 85P1B3 para examinar el efecto de la mayor expresión del ADN que codifica 85P1B3. Tales animales pueden ser usados como animales probadores de reactivos pensados para conferir la protección de, por ejemplo, condiciones patológicas asociadas a su sobreexpresión. Conforme a este aspecto de la invención, se trata a un animal con un reactivo y una incidencia reducida de una condición patológica, comparado con animales no tratados portadores del transgen, indicaría una potencial intervención terapéutica para la condición patológica.

De forma alternativa, pueden ser usados homólogos no humanos de 85P1B3 para construir un animal "genéticamente modificado" de 85P1B3 que tiene un gen defectuoso o alterado que codifica 85P1B3 como consecuencia de la recombinación homóloga entre el gen endógeno que codifica 85P1B3 y el ADN genómico alterado que codifica 85P1B3 introducido en una célula embrionaria del animal. Por ejemplo, el cDNA que codifica 85P1B3 puede ser usado para clonar el ADN genómico que codifica 85P1B3 conforme a técnicas establecidas. Una parte del ADN genómico que codifica 85P1B3 puede ser suprimida o sustituida con otro gen, tal como un gen que codifica un marcador seleccionable que puede ser usado para monitorizar la integración. Típicamente, varios kilobases del ADN flanqueante inalterado (ambos en los extremos 5' y 3') son incluidos en el vector (véase, por ejemplo, Thomas y Capecchi, Cell, 51: 503 (1987) para una descripción de vectores de recombinación homólogos). El vector es introducido en una línea celular madre embrionaria (por ejemplo, por electroporación) y son seleccionadas células en las cuales el ADN introducido ha sido recombinado homólogamente con el ADN endógeno (véase, por ejemplo, Li et al., Cell, 69: 915 (1992)). Las células seleccionadas entonces son inyectadas en un blastocito de un animal (por ejemplo, un ratón o una rata) para formar quimeras de agregación (véase, por ejemplo, Bradley, en "Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach", E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152). Un embrión quimérico puede ser implantado entonces en una animal de cría hembra pseudoembarazada adecuado, y el embrión es llevado a término para crear un animal "genéticamente modificado". La progenie que presenta el ADN homólogamente recombinado en sus células germen puede ser identificada por técnicas estándar y puede ser usada para criar animales en los cuales todas las células del animal contienen el ADN homólogamente recombinado. Los animales genéticamente modificados pueden ser caracterizados, por ejemplo, por su capacidad de defenderse contra ciertas condiciones patológicas o por su desarrollo de condiciones patológicas debido a la ausencia del polipéptido de 85P1B3.

VII.) Métodos para la detección de 85P1B3

Otro aspecto de la presente invención se refiere a métodos para detectar polinucleótidos de 85P1B3 y proteínas relacionadas con 85P1B3, así como métodos para identificar una célula que expresa 85P1B3. El perfil de expresión de 85P1B3 lo hace un marcador diagnóstico para la enfermedad en metástasis. En consecuencia, el estado de los productos génicos de 85P1B3 proporciona información útil para predecir una variedad de factores incluyendo la sensibilidad a la enfermedad en etapa avanzada, la velocidad de progresión y/o la agresividad del tumor. Como se discute detalladamente en este documento, el estado de los productos génicos de 85P1B3 en muestras de pacientes puede ser analizado según una variedad de protocolos que son conocidos en la técnica, incluyendo el análisis inmunohistoquímico, la variedad de técnicas de inmunotransferencia Northern incluyendo la hibridación in situ, análisis RT-PCR (por ejemplo, en muestras microdisecadas de captura láser), el análisis de inmunotransferencia Western y el análisis de series de tejidos.

Más particularmente, la invención proporciona ensayos para la detección de polinucleótidos de 85P1B3 en una muestra biológica, tal como suero, hueso, próstata, y otros tejidos, orina, semen, preparaciones celulares y otros similares. Los polinucleótidos de 85P1B3 detectables incluyen, por ejemplo, un gen de 85P1B3 o sus fragmentos, mARN de 85P1B3, mARN de 85P1B3 de variantes de empalme alternativas, y moléculas de ADN recombinante o ARN que contienen un polinucleótido de 85P1B3. Un número de métodos para amplificar y/o detectar la presencia de los polinucleótidos de 85P1B3 son conocidos en la técnica y pueden ser empleados en la práctica de este aspecto de la invención.

En una realización, un método para detectar un mARN de 85P1B3 en una muestra biológica comprende producir cDNA a partir de la muestra por transcripción inversa usando al menos un cebador; amplificar el cDNA así producido usando polinucleótidos de 85P1B3 como cebadores sentido y antisentido para amplificar los cDNA de 85P1B3 en estos; y detactar la presencia del cDNA de 85P1B3 amplificado. Opcionalmente, puede ser determinada la secuencia del cDNA de 85P1B3 amplificado.

En otra realización, un método para detectar un gen de 85P1B3 en una muestra biológica comprende primero aislar el ADN genómico de la muestra; amplificar el ADN genómico aislado usando polinucleótidos de 85P1B3 como cebadores sentido y antisentido; y detectar la presencia del gen de 85P1B3 amplificado. Cualquier número de combinaciones de sonda sentido y antisentido apropiado puede ser diseñado a partir de la secuencia de nucleótidos proporcionada para 85P1B3 (Figura 2) y ser usada para este fin.

La invención también proporciona ensayos para detectar la presencia de una proteína 85P1B3 en un tejido u otra muestra biológica tal como suero, semen, hueso, próstata, orina, preparaciones celulares y otras similares. Los métodos para detectar una proteína relacionada con 85P1B3 son también conocidos e incluyen, por ejemplo, inmunoprecipitación, análisis inmunohistoquímico, análisis de inmunotransferencia Western, ensayos de unión molecular, ELISA, ELIFA y otros similares. Por ejemplo, un método para detectar la presencia de una proteína relacionada con 85P1B3 en una muestra biológica comprende primero poner en contacto la muestra con un anticuerpo de 85P1B3, uno de sus fragmentos reactivos con 85P1B3, o una proteína recombinante que contiene una región de unión al antígeno de un anticuerpo de 85P1B3; y luego detectar la unión de la proteína relacionada con 85P1B3 en la muestra.

Los métodos para identificar una célula que expresa 85P1B3 están también dentro de la amplitud de la invención. En una realización, un ensayo para identificar una célula que expresa un gen de 85P1B3 comprende detectar la presencia de mARN de 85P1B3 en la célula. Los métodos para la detección de los mARN particulares en células son conocidos e incluyen, por ejemplo, ensayos de hibridación que usan sondas de ADN complementario (tal como la hibridación in situ usando ribosondas de 85P1B3 marcado, inmunotransferencia Northern y técnicas relacionadas) y varios ensayos de amplificación de ácidos nucleicos (tales como RT-PCR usando cebadores complementarios específicos para 85P1B3, y otros métodos de detección del tipo de amplificación, tales como, por ejemplo, ADN ramificado, SISBA, TMA y similares). De forma alternativa, un ensayo para identificar una célula que expresa un gen de 85P1B3 comprende detectar la presencia de una proteína relacionada con 85P1B3 en la célula o secretada por la célula. Varios métodos para la detección de proteínas son conocidos en la técnica y son empleados para la detección de proteínas relacionadas con 85P1B3 y células que expresan las proteínas relacionadas con 85P1B3.

El análisis de expresión de 85P1B3 es también útil como herramienta para identificar y evaluar a los agentes que modulan la expresión génica de 85P1B3. Por ejemplo, la expresión de 85P1B3 está considerablemente sobrerregulada en el cáncer de próstata, y se expresa en los cánceres de los tejidos mencionados en la Tabla I. La identificación de una molécula o un agente biológico que inhibe la expresión de 85P1B3 o la sobreexpresión en células cancerígenas tiene valor terapéutico. Por ejemplo, tal agente puede ser identificado usando un rastreo que cuantifique la expresión de 85P1B3 por RT-PCR, la hibridación de ácidos nucleicos o la unión de anticuerpos.

VIII.) Métodos para monitorizar el estado de genes relacionados con 85P1B3 y sus productos

Se sabe que la oncogénesis es un proceso de múltiples etapas en el que el crecimiento celular se vuelve cada vez más desregulado y las células evolucionan desde un estado fisiológico normal a estados precancerosos y luego cancerosos (véase, por ejemplo, Alers et al., Lab Invest. 77 (5): 437-438 (1997) e Isaacs et al., Cancer Surv. 23: 19-32 (1995)). En este contexto, el examen de una muestra biológica para buscar pruebas del crecimiento de células desregulado (tal como la expresión aberrante de 85P1B3 en cánceres) permite la detección precoz de tal fisiología aberrante, antes de que un estado patológico tal como el cáncer haya evolucionado a una etapa en la que las opciones terapéuticas sean más limitadas y/o el pronóstico sea peor. En tales exámenes, puede ser comparado el estado de 85P1B3 en una muestra biológica de interés, por ejemplo, con el estado de 85P1B3 en una muestra normal correspondiente (por ejemplo, una muestra de aquel individuo o de forma alternativa otro individuo que no esté afectado por una patología). Una alteración en el estado de 85P1B3 en la muestra biológica (comparado con la muestra normal) proporciona pruebas de un crecimiento celular desregulado. Además de usar una muestra biológica que no esté afectada por una patología como una muestra normal, también se puede usar un valor normativo predeterminado tal como un nivel normal de expresión de mARN predeterminado (véase, por ejemplo, Grever et al., J. Comp. Neurol. 9 de diciembre de 1996; 376 (2): 306-14 y la patente de EE.UU. Nº. 5.837.501) para comparar el estado de 85P1B3 en una muestra.

El término "estado" en este contexto se usa de acuerdo con su significando aceptado de la técnica y se refiere a la condición o al estado del gen y sus productos. Típicamente, los expertos en la técnica usan un número de parámetros para evaluar la condición o el estado de un gen y sus productos. Estos incluyen, pero no están limitados a la posición de los productos génicos expresados (incluyendo la posición de las células que expresan 85P1B3) así como el nivel, y la actividad biológica de los productos génicos expresados (tales como el mARN de 85P1B3, polinucleótidos y polipéptidos). Típicamente, una alteración en el estado de 85P1B3 comprende un cambio de la posición de 85P1B3 y/o células que expresan 85P1B3 y/o un aumento del mARN de 85P1B3 y/o la expresión de la proteína.

El estado de 85P1B3 en una muestra puede ser analizado por un número de medios conocidos en la técnica, incluyendo sin restricción, análisis inmunohistoquímico, hibridación in situ, análisis RT-PCR en las muestras microdisecadas de captura láser, análisis de inmunotransferencia Western y el análisis de series de tejidos. Los protocolos típicos para evaluar el estado del gen de 85P1B3 y los productos génicos se encuentran, por ejemplo, en Ausubel ed., 1995, "Current Protocols In Molecular Biology", Unidades 2 (Inmunotransferencia Northern), 4 (Inmunotransferencia Southern), 15 (Inmunotransferencia) y 18 (Análisis PCR). Así, el estado de 85P1B3 en una muestra biológica es evaluado por varios métodos utilizados por los expertos en la técnica incluyendo, pero no limitado al análisis genómico Southern (para examinar, por ejemplo, las perturbaciones en el gen de 85P1B3), el análisis Northern y/o el análisis PCR del mARN de 85P1B3 (para examinar, por ejemplo las alteraciones en las secuencias del polinucleótido o niveles de expresión de mARN de 85P1B3), y el análisis Western y/o inmunohistoquímico (para examinar, por ejemplo alteraciones en secuencias del polipéptido, alteraciones en la localización del polipéptido dentro de una muestra, alteraciones en niveles de expresión de proteínas 85P1B3 y/o asociaciones de proteínas 85P1B3 con parejas de unión del polipéptido). Los polinucleótidos de 85P1B3 detectables incluyen, por ejemplo, un gen de 85P1B3 o sus fragmentos, mARN de 85P1B3, variantes de empalme alternativas, mARN de 85P1B3, y el ADN recombinante o moléculas de ARN que contienen un polinucleótido de 85P1B3.

El perfil de expresión de 85P1B3 lo hace un marcador diagnóstico para la enfermedad local y/o en metástasis, y proporciona información sobre el crecimiento o el potencial oncogénico de una muestra biológica. En particular, el estado de 85P1B3 proporciona la información útil para predecir la sensibilidad frente a las etapas de la enfermedad particulares, la progresión, y/o la agresividad del tumor. La invención proporciona métodos y ensayos para determinar el estado de 85P1B3 y diagnosticar cánceres que expresan 85P1B3, tales como los cánceres de los tejidos mencionados en la Tabla I. Por ejemplo, debido a que el mARN de 85P1B3 es altamente expresado en la próstata y otros cánceres en relación con el tejido de próstata normal, los ensayos que evalúan los niveles de transcriptos de mARN de 85P1B3 o proteínas en una muestra biológica pueden ser usados para diagnosticar una enfermedad asociada con la desregulación de 85P1B3, y pueden proporcionar información pronóstica útil en la definición de las opciones terapéuticas
apropiadas.

El estado de expresión de 85P1B3 proporciona información que incluye la presencia, la etapa y la posición de células displásicas, precancerosas y cancerosas, prediciendo la sensibilidad en las diversas etapas de la enfermedad, y/o para calibrar la agresividad del tumor. Además, el perfil de expresión lo hace útil como reactivo de imagimática para la enfermedad en metástasis. Por consiguiente, un aspecto de la invención se refiere a los diversos métodos pronósticos moleculares y diagnósticos para examinar el estado de 85P1B3 en muestras biológicas tales como las de individuos que sufren, o se sospecha que sufren, una patología caracterizada por el crecimiento celular desregulado, tal como el cáncer.

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Como se describe anteriormente, el estado de 85P1B3 en una muestra biológica puede ser examinado según un número de procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el estado de 85P1B3 en una muestra biológica tomada de una posición específica en el cuerpo puede ser examinada evaluando la muestra según la presencia o la ausencia de células que expresan 85P1B3 (por ejemplo, aquellas que expresan los mARN de 85P1B3 o proteínas). Este examen puede proporcionar pruebas de un crecimiento celular desregulado, por ejemplo, cuando la células que expresan 85P1B3 se encuentran en una muestra biológica que normalmente no contiene tales células (tal como un nodo de linfa), porque tales alteraciones en el estado de 85P1B3 en una muestra biológica están asociadas a menudo con el crecimiento celular desregulado. Específicamente, un indicador del crecimiento celular desregulado es la metástasis de las células cancerígenas de un órgano de origen (tal como la próstata) a una zona diferente del cuerpo (tal como un nodo de linfa). En este contexto, las pruebas del crecimiento celular desregulado son importantes, por ejemplo, porque la metástasis del nodo de linfa oculta puede ser detectada en una proporción sustancial de pacientes con cáncer de próstata, y tal metástasis está asociada con predicciones conocidas de progresión de la enfermedad (véase, por ejemplo, Murphy et al., Prostate 42 (4): 315-317 (2000); Su et al., Semin. Surg. Oncol. 18 (1): 17-28 (2000) y Freeman et al., J Urol, agosto de 1995, 154 (2 Punto 1): 474-8).

En un aspecto, la invención proporciona métodos para monitorizar productos génicos de 85P1B3 determinando el estado de los productos génicos de 85P1B3 expresados por células de un individuo que se sospecha que tiene una enfermedad asociada con el crecimiento de células desregulado (tal como hiperplasia o cáncer) y luego comparar el estado así determinado con el estado de los productos génicos de 85P1B3 en una muestra normal correspondiente. La presencia de productos génicos de 85P1B3 aberrantes en la muestra de ensayo en relación con la muestra normal proporciona una indicación de la presencia de un crecimiento de células desregulado dentro de las células del individuo.

En otro aspecto, la invención proporciona ensayos útiles en la determinación de la presencia del cáncer en un individuo, que comprende detectar un aumento significativo de mARN de 85P1B3 o la expresión de la proteína en una muestra celular de ensayo o de tejido en relación con los niveles de expresión en la célula normal correspondiente o tejido. La presencia del mARN de 85P1B3, por ejemplo, puede ser evaluada en muestras de tejido incluyendo, pero no limitadas a las mencionados en la Tabla I. La presencia de una expresión de 85P1B3 significativa en cualquiera de estos tejidos es útil para indicar la aparición, la presencia y/o la severidad de un cáncer, ya que los tejidos normales correspondientes no expresan el mARN de 85P1B3 o lo expresan a niveles inferiores.

En una realización relacionada, el estado de 85P1B3 se determina con el nivel de proteína en vez de con el nivel del ácido nucleico. Por ejemplo, tal método comprende determinar el nivel de la proteína 85P1B3 expresada por células en una muestra de tejido de ensayo y comparar el nivel así determinado con el nivel de 85P1B3 expresado en una muestra normal correspondiente. En una realización, se evalúa la presencia de la proteína 85P1B3, por ejemplo, usando métodos inmunohistoquímicos. Los anticuerpos de 85P1B3 o parejas de unión capaces de detectar la expresión de la proteína 85P1B3 se usan en una variedad de formatos de ensayos conocidos en la técnica para este fin.

En una realización más, se puede evaluar el estado de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de 85P1B3 en una muestra biológica para identificar perturbaciones en la estructura de estas moléculas. Estas perturbaciones pueden incluir inserciones, deleciones, sustituciones y otras similares. Tales evaluaciones son útiles porque las perturbaciones en las secuencias de nucleótidos y aminoácidos son observadas en un gran número de proteínas asociadas con un fenotipo de crecimiento desregulado (véase, por ejemplo, Marrogi et al., 1999, J. Cutan. Pathol. 26 (8): 369-378). Por ejemplo, una mutación en la secuencia de 85P1B3 puede ser indicativa de la presencia o la promoción de un tumor. Tales ensayos, por lo tanto, tienen valor diagnóstico y predictivo, donde una mutación en 85P1B3 indica una pérdida potencial de la función o aumento del crecimiento del tumor.

Una amplia variedad de ensayos para observar perturbaciones en secuencias de nucleótidos y aminoácidos es conocida en la técnica. Por ejemplo, el tamaño y la estructura de las secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos de los productos génicos de 85P1B3 son observados por los protocolos de Northern, Southern, Western, PCR y de secuenciación de ADN discutidos en este documento. Además, otros métodos para observar perturbaciones en las secuencias de nucleótidos y aminoácidos tal como el análisis de polimorfismo de conformación de cadena sencilla son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. N^{os}. 5.382.510 publicada el 7 de septiembre de 1999, y 5.952.170 publicada el 17 de enero de 1995).

Además, se puede examinar el estado de metilación del gen de 85P1B3 en una muestra biológica. La desmetilación aberrante y/o hipermetilación de islas de CpG en las regiones reguladoras del gen 5' ocurren con frecuencia en células inmortalizadas y transformadas, y pueden causar una expresión alterada de varios genes. Por ejemplo, la hipermetilación del promotor de la glutationa S-transferasa clase pi (una proteína expresada en próstata normal pero no expresada en > 90% de los carcinomas de próstata) parece silenciar permanentemente la transcripción de este gen y es la alteración genómica detectada con más frecuencia en los carcinomas de próstata (De Marzo et al., Am. J. Pathol. 155 (6): 1985-1992 (1999)). Además, esta alteración está presente en al menos el 70% de los casos de neoplasia intraepitelial prostática de alto grado (PIN) (Brooks et al., Cancer Epidemiol. Biomarkers Prey., 1998, 7: 531-536). En otro ejemplo, la expresión del gen específico del tumor LAGE-I (que no se expresa en la próstata normal, pero que se expresa en el 25-50% de los cánceres de próstata) se induce por la desoxiazacitidina en células linfoblastoides, sugiriendo que la expresión tumoral es debida a la desmetilación (Lethe et al., Int. J. Cancer 76 (6): 903-908 (1998)). Una variedad de ensayos para examinar el estado de metilación de un gen es conocida en la técnica. Por ejemplo, se puede utilizar, en los intentos de hibridación Southern, las enzimas de restricción sensibles a la metilación que no pueden dividir las secuencias que contienen los sitios CpG metilados para evaluar el estado de metilación de las islas CpG. Además, MSP (PCR específica de metilación) puede perfilar rápidamente el estado de metilación de todos los sitios de CpG presentes en una isla CpG de un gen dado. Este procedimiento implica la modificación inicial del ADN por bisulfito de sodio (que convertirá todas las citosinas no metiladas en uracilos) seguido de la amplificación usando cebadores específicos para ADN metilado frente a no metilado. Los protocolos que implican la interferencia de la metilación también pueden ser encontrados por ejemplo en "Current Protocols In Molecular Biology", Unidad 12, eds. Frederick M. Ausubel et al., 1995.

La amplificación génica es un método adicional para evaluar el estado de 85P1B3. La amplificación génica es medida en una muestra directamente, por ejemplo, por inmunotransferencia Southern convencional o inmunotransferencia Northern para cuantificar la transcripción de mARN (Thomas, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205), inmunotransferencia de punto (análisis de ADN), o hibridación in situ, usando una sonda marcada de manera apropiada, basado en las secuencias proporcionadas en este documento. De forma alternativa, se emplean anticuerpos que reconocen dobles hélices específicas, incluyendo dobles hélices de ADN, doble hélices de ARN, y doble hélices de híbridos de ADN-ARN o doble hélices de ADN-proteína. Los anticuerpos, a su vez, se marcan y el ensayo se lleva a cabo donde la doble hélice se une a una superficie, de modo que, en la formación de la doble hélice sobre la superficie, puede ser detectada la presencia del anticuerpo unido a la doble hélice.

El tejido de la biopsia o la sangre periférica pueden ser analizados convenientemente según la presencia de células cancerígenas usando, por ejemplo, inmunotransferencia Northern, análisis de punto o RT-PCR para detectar la expresión de 85P1B3. La presencia del mARN de 85P1B3 amplifiable por RT-PCR proporciona una indicación de la presencia de cáncer. Los ensayos RT-PCR son conocidos en la técnica. Los ensayos de detección por RT-PCR para células tumorales en sangre periférica están siendo evaluados actualmente para su uso en el diagnóstico y el tratamiento médico de un número de tumores sólidos humanos. En el campo del cáncer de próstata, estos incluyen ensayos de RT-PCR para la detección de células que expresan PSA y PSM (Verkaik et al., 1997, Urol. Res. 25: 373-384; Ghossein et al., 1995, J. Clin. Oncol. 13: 1195-2000; Heston et al., 1995, Clin. Chem. 41:1687-1688).

Un aspecto más de la invención es una evaluación de la sensibilidad que un individuo tiene para desarrollar el cáncer. En una realización, un método para predecir la sensibilidad frente al cáncer comprende detectar el mARN de 85P1B3 o la proteína 85P1B3 en una muestra de tejido, indicando su presencia la sensibilidad frente al cáncer, en la que el grado de expresión del mARN de 85P1B3 se correlaciona frente al grado de sensibilidad. En una realización específica, se examina la presencia de 85P1B3 en próstata u otro tejido, proporcionando la presencia de 85P1B3 en la muestra una indicación de la sensibilidad frente al cáncer de próstata (o la aparición o la existencia de un tumor de próstata). Asimismo, se puede evaluar la integridad de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de 85P1B3 en una muestra biológica, para identificar perturbaciones en la estructura de estas moléculas tales como inserciones, deleciones, sustituciones y otras similares. La presencia de una o varias perturbaciones en productos génicos de 85P1B3 en la muestra es una indicación de la sensibilidad frente al cáncer(o la aparición o la existencia de un tumor).

La invención también comprende métodos para calibrar la agresividad del tumor. En una realización, un método para calibrar la agresividad de un tumor comprende determinar el nivel de mARN de 85P1B3 o la proteína 85P1B3 expresada por células tumorales, comparando el nivel así determinado frente al nivel de mARN de 85P1B3 o la proteína 85P1B3 expresada en un tejido normal correspondiente tomado a partir del mismo individuo o una muestra de referencia de tejido normal, en el que el grado de expresión de mARN de 85P1B3 o la proteína 85P1B3 en la muestra tumoral en relación con la muestra normal indica el grado de agresividad. En una realización específica, la agresividad de un tumor es evaluada determinando el grado al cual se expresa 85P1B3 en las células tumorales, indicando los niveles de expresión más altos que los tumores son más agresivos. Otra realización es la evaluación de la integridad de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de 85P1B3 en una muestra biológica, para identificar perturbaciones en la estructura de estas moléculas tales como inserciones, deleciones, sustituciones y otros similares. La presencia de una o varias perturbaciones indica tumores más agresivos.

Otra realización de la invención se refiere a métodos para observar la progresión de una malignidad en un individuo con el tiempo. En una realización, los métodos para observar la progresión de una malignidad en un individuo con el tiempo comprenden determinar el nivel de mARN de 85P1B3 o la proteína 85P1B3 expresada por células en una muestra del tumor, comparando el nivel así determinado con el nivel de mARN de 85P1B3 o la proteína 85P1B3 expresada en una muestra de tejido equivalente tomada del mismo individuo en un tiempo diferente, en el que el grado de mARN de 85P1B3 o la expresión de la proteína 85P1B3 en la muestra de tumor con el tiempo proporciona información sobre la progresión del cáncer. En una realización específica, la progresión de un cáncer es evaluada determinando la expresión de 85P1B3 en las células tumorales con el tiempo, en el que el aumento de expresión con el tiempo indica una progresión del cáncer. También, se puede evaluar la integridad de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de 85P1B3 en una muestra biológica para identificar perturbaciones en la estructura de estas moléculas tales como inserciones, deleciones, sustituciones y similares, en el que la presencia de una o varias perturbaciones indica una progresión del cáncer.

Los enfoques diagnósticos anteriores pueden ser combinados con cualquiera de una amplia variedad de protocolos pronósticos y diagnósticos conocidos en la técnica. Por ejemplo, otra realización de la invención se refiere a métodos para observar una coincidencia entre la expresión del gen de 85P1B3 y los productos génicos de 85P1B3 (o perturbaciones en el gen de 85P1B3 y los productos génicos de 85P1B3) y un factor que está asociado con la malignidad, como un medio para diagnosticar y pronosticar el estado de una muestra de tejido. Una amplia variedad de factores asociados a la malignidad pueden ser utilizados, tal como la expresión de genes asociados a la malignidad (por ejemplo, la expresión de PSA, PSCA y PSM para el cáncer de próstata, etc.) así como gruesas observaciones citológicas (véase, por ejemplo, Bocking et al., 1984, Anal. Quant. Cytol. 6 (2):74-88; Epstein, 1995, Hum. Pathol. 26 (2):223-9; Thorson et al., 1998, Mod. Pathol. 11 (6): 543-51; Baisdenetal., 1999, Am. J. Surg. Pathol. 23 (8):918-24). Los métodos para observar una coincidencia entre la expresión del gen de 85P1B3 y los productos génicos de 85P1B3 (o perturbaciones en el gen de 85P1B3 y los productos génicos de 85P1B3) y otro factor que esté asociado con la malignidad son útiles, por ejemplo, porque la presencia de un grupo de factores específicos que coinciden con la enfermedad proporciona la información crucial para diagnosticar y pronosticar el estado de una muestra de tejido.

En una realización, los métodos para observar una coincidencia entre la expresión del gen de 85P1B3 y los productos génicos de 85P1B3 (o perturbaciones en el gen de 85P1B3 y los productos génicos de 85P1B3) y otro factor asociado a la malignidad implican detectar la sobreexpresión de mARN de 85P1B3 o la proteína en una muestra de tejido, detectar la sobreexpresión del mARN de PSA o de la proteína en una muestra de tejido (o la expresión de PSCA o PSM) y observar una coincidencia del mARN de 85P1B3 o la proteína y el mARN de PSA o la sobreexpresión de la proteína (o la expresión de PSCA o PSM). En una realización específica, se examina la expresión de 85P1B3 y del mARN de PSA en tejido de próstata, de modo que la coincidencia de la sobreexpresión del mARN de 85P1B3 y PSA en la muestra indica la existencia del cáncer de próstata, la sensibilidad frente al cáncer de próstata o la aparición o el estado de un tumor de próstata.

Métodos para detectar y cuantificar la expresión de mARN de 85P1B3 o la proteína son descritos en este documento, y las tecnologías de cuantificación y detección del ácido nucleico estándar y la proteína son conocidos en la técnica. Los métodos estándar para la detección y la cuantificación del mARN de 85P1B3 incluyenla hibridación in situ usando ribosondas de 85P1B3 marcados, inmunotransferencia Northern y técnicas relacionadas usando sondas de polinucleótido de 85P1B3, análisis de RT-PCR usando cebadores específicos para 85P1B3, y otros métodos de detección de amplificación tipo, tales como, por ejemplo, ADN ramificado, SISBA, TMA y otros similares. En una realización específica, se usa RT-PCR semicuantitativa para detectar y cuantificar la expresión del mARN de 85P1B3. Cualquier número de cebadores capaces de amplificar 85P1B3 puede ser usado para este fin, incluyendo pero no limitados a los diversos grupos de cebadores específicamente descritos en este documento. En una realización específica, pueden ser usados anticuerpos policlonales o monoclonales específicamente reactivos con la proteína 85P1B3 tipo silvestre en un ensayo inmunohistoquímico de tejido obtenido de biopsia.

IX.) Identificación de moléculas que interaccionan con 85P1B3

La proteína 85P1B3 y las secuencias de ácido nucleico descritas en este documento permiten a cualquier experto en la técnica identificar proteínas, pequeñas moléculas y otros agentes que interaccionan con 85P1B3, así como rutas activadas por 85P1B3 vía cualquiera de una variedad de protocolos aceptados en la técnica. Por ejemplo, se puede utilizar uno de los sistemas denominados trampa de interacción (también denominado "ensayo de dos híbridos"). En tales sistemas, las moléculas interaccionan y reconstituyen un factor de transcripción que dirige la expresión de un gen indicador, mediante el cual se analiza la expresión del gen indicador. Otros sistemas identifican interacciones proteína-proteína in vivo por la reconstitución de un activador transcripcional eucariota, véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. N^{os}. 5.955.280 publicada el 21 de septiembre de 1999, 5.925.523 publicada el 20 de julio de 1999, 5.846.722 publicada el 8 de diciembre de 1998 y 6.004.746 publicada el 21 de diciembre de 1999. Los algoritmos están también disponibles en la técnica para predicciones basadas en genoma de la función de la proteína (véase, por ejemplo, Marcotte, et al., Nature 402: 4 noviembre de 1999, 83-86).

De forma alternativa, se pueden rastrear genotecas de péptidos para identificar a las moléculas que interaccionan con las secuencias de la proteína 85P1B3. En tales métodos, los péptidos que se unen a 85P1B3 son identificados rastreando las genotecas que codifican una colección aleatoria o controlada de aminoácidos. Los péptidos codificados por las genotecas son expresados como proteínas de fusión de proteínas de recubrimiento de bacteriófago, las partículas de bacteriófago entonces son rastreadas contra la proteína 85P1B3.

En consecuencia, son así identificados péptidos que tienen una amplia variedad de usos, tales como reactivos terapéuticos, pronósticos o diagnósticos, sin ninguna información anterior sobre la estructura del ligando esperado o la molécula receptora. Las genotecas de péptido típicas y los métodos de rastreo que pueden ser usados para identificar a las moléculas que interaccionan con las secuencias de la proteína 85P1B3 son descritos, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. N^{os}. 5.723.286 publicada el 3 de marzo de 1998 y 5.733,731 publicada el 31 de marzo de 1998.

De forma alternativa, son usadas líneas celulares que expresan 85P1B3 para identificar interacciones proteína-proteína mediadas por 85P1B3. Tales interacciones pueden ser examinadas usando técnicas de inmunoprecipitación (véase, por ejemplo, Hamilton BJ, et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999, 261:646-51). La proteína 85P1B3 puede ser inmunoprecipitada a partir de líneas celulares que expresan 85P1B3 usando anticuerpos anti-85P1B3. De forma alternativa, pueden ser usados anticuerpos contra His-marcador en una línea celular genéticamente manipulada para expresar las fusiones de 85P1B3 y un His-marcador (vectores mencionados anteriormente). El complejo inmunoprecipitado puede ser examinado por la asociación de la proteína según procedimientos tales como inmunotransferencia Western, marcación de ^{35}S-metionina de proteínas, microsecuenciación de proteínas, tinción con plata, electroforesis de gel bidimensional.

Las pequeñas moléculas y ligandos que interaccionan con 85P1B3 pueden ser identificados por las realizaciones relacionadas de tales ensayos de rastreo. Por ejemplo, pueden ser identificadas pequeñas moléculas que interfieran con la función de la proteína, incluyendo moléculas que interfieren con la capacidad de 85P1B3 de mediar la fosforilación y desfosforilación, interacción con moléculas de ADN o ARN como una indicación de la regulación de los ciclos celulares, señalización de segundos mensajeros o tumorigénesis. Asimismo, las pequeñas moléculas que modulan el canal iónico relacionado con 85P1B3, la bomba de proteínas, o funciones de comunicación celular son identificadas y usadas para tratar a pacientes que tienen un cáncer que expresa 85P1B3 (véase, por ejemplo, Hille; B., "Ionic Channels of Excitable Membranes" 2ª Ed., Sinauer Assoc, Sunderland, MA, 1992). Además, los ligandos que regulan la función de 85P1B3 pueden ser identificados según su capacidad de unirse a 85P1B3 y activar a un construto reportero. Se discuten, por ejemplo, métodos típicos en la patente de EE.UU. Nº. 5.928.868, publicada el 27 de julio de 1999, e incluye métodos para formar ligandos híbridos en los cuales al menos un ligando es una molécula pequeña. En una realización ilustrativa, las células genéticamente manipuladas para expresar una proteína de fusión de 85P1B3 y una proteína de unión de ADN son usadas para co-expresar una proteína de fusión de un ligando híbrido/molécula pequeña y una proteína activadora transcripcional de la genoteca de cDNA. Las células además contienen un gen indicador, cuya expresión está condicionada por la proximidad de las primeras y segundas proteínas de fusión entre sí, un acontecimiento que ocurre sólo si el ligando híbrido se une a sitios diana en ambas proteínas híbridas. Aquellas células que expresan el gen indicador son seleccionadas y la molécula pequeña desconocida o el ligando desconocido es identificado. Este método proporciona un medio para identificar los moduladores que activan o inhiben
85P1B3.

Una realización de esta invención comprende un método de rastreo para una molécula que interacciona con una secuencia de aminoácidos de 85P1B3 mostrada en la Figura 2 o la Figura 3, comprendiendo las etapas de poner en contacto una población de moléculas con la secuencia de aminoácidos de 85P1B3, permitiendo a la población de moléculas y a la secuencia de aminoácidos de 85P1B3 interaccionar en condiciones que faciliten una interacción, determinar la presencia de una molécula que interaccione con la secuencia de aminoácidos de 85P1B3, y luego separar las moléculas que no interaccionen con la secuencia de aminoácidos de 85P1B3 de las moléculas que lo hacen. En una realización específica, el método comprende además purificar, caracterizar e identificar una molécula que interaccione con la secuencia de aminoácidos de 85P1B3. La molécula identificada puede ser usada para modular una función realizada por 85P1B3. En una realización preferida, se pone en contacto la secuencia de aminoácidos de 85P1B3 con una genoteca de péptidos.

X.) Métodos terapéuticos y composiciones

La identificación de 85P1B3 como una proteína que normalmente es expresada en un grupo de tejidos restringido, pero que también es expresada en cánceres de próstata y otros, abre un número de posibilidades terapéuticas para el tratamiento de tales cánceres. Como se contempla en este documento, la 85P1B3 funciona como un factor de transcripción implicado en la activación de genes que promueven tumores o que reprimen genes o que bloquean la tumorigenesis.

En consecuencia, las posibilidades terapéuticos que inhiben la actividad de la proteína 85P1B3 son útiles para pacientes que sufren de un cáncer que expresa 85P1B3. Estas posibilidades terapéuticas se dividen generalmente en dos clases. Una clase comprende varios métodos para inhibir la unión o la asociación de la proteína 85P1B3 a su pareja de unión o con otras proteínas. Otra clase comprende una variedad de métodos para inhibir la transcripción del gen de 85P1B3 o la traducción del mARN de 85P1B3.

X.A.) Vacunas anticáncer

La invención proporciona vacunas del cáncer que comprenden una proteína relacionada con 85P1B3 o el ácido nucleico relacionado con 85P1B3. En vista de la expresión de 85P1B3, las vacunas del cáncer previenen y/o tratan cánceres que expresan 85P1B3 con un mínimo o ningún efecto sobre los tejidos no diana. El uso de un antígeno del tumor en una vacuna que genera respuestas inmunes humorales y/o mediadas por células como terapia anticáncer es conocido en la técnica y ha sido empleado en el cáncer de próstata usando inmunógenos de PSMA humano y PAP de roedor (Hodge et al., 1995, Int. J. Cancer 63:231-237; Fong et al., 1997, J. Immunol. 159: 3113-3117).

Tales métodos pueden ser puestos en práctica fácilmente empleando una proteína relacionada con 85P1B3, o una molécula de ácido nucleico que codifica 85P1B3 y vectores recombinantes capaces de expresar y presentar el inmunógeno de 85P1B3 (que típicamente comprende un número de anticuerpos o epítopos de linfocitos T). Los expertos en la técnica saben que se conoce una amplia variedad de sistemas de vacuna para la administración de epítopos inmuno-reactivos en la técnica (véase, por ejemplo, Heryln et al., Ana Med, 31 de febrero de 1999 (l):66-78; Maruyama et al., Cancer Immunol Immunother, junio de 2000, 49 (3): 123-32) Brevemente, tales métodos para generar una respuesta inmune (por ejemplo, humoral y/o mediada por células) en un mamífero, comprenden las etapas de: exponer el sistema inmunológico del mamífero a un epítopo inmuno-reactivo (por ejemplo, un epítopo presente en la proteína 85P1B3 mostrada en la SEQ ID NO: 703 o su análogo u homólogo) de modo que el mamífero genere una respuesta inmune que es específica para aquel epítopo (por ejemplo, genere anticuerpos que reconocen específicamente a aquel epítopo). En un método preferido, el inmunógeno de 85P1B3 contiene un motivo biológico, véase, por ejemplo, las Tablas V-XVIII, o un péptido de un intervalo de tamaño de 85P1B3 indicado en la Figura 5, Figura 6, Figura 7, Figura 8 y Figura 9.

La proteína 85P1B3 entera, las regiones inmunogénicas o sus epítopos pueden ser combinados y suministrados por varios medios. Tales composiciones de vacuna pueden incluir, por ejemplo, lipopéptidos (por ejemplo, Vitiello, A. et al., J. Clin. Invest. 95:341,1995), composiciones de péptido encapsuladas en microesferasde poli(DL-lactida-co-glicolido) ("PLG") (véase, por ejemplo, Eldridge, et al., Molec. Immunol. 28: 287-294, 1991: Alonso et al., Vaccine 12: 299-306, 1994; Jones et al., Vaccine 13: 675-681, 1995), composiciones de péptido contenidas en complejos de estimulación inmune (ISCOMS) (véase,por ejemplo, Takahashi et al., Nature 344:873-875, 1990; Hu et al., Clin Exp Immunol 113:235-243, 1998), múltiples sistemas de péptido de antígeno (MAPAS)(véase, por ejemplo, Tam, J. P., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 85:5409-5413, 1988; Tarn, J.P., J. Immunol. Methods 196:17-32, 1996), péptidos formulados como péptidos multivalentes; péptidos para uso en sistemas de administración balísticos, péptidos típicamente cristalizados, vectores de administración viral (Perkus, M. E. et al., En: Concepts in vaccine development, Kaufmann, S. H. E., ed., p. 379, 1996; Chakrabarti, S. et al., Nature 320: 535,1986; Hu, S. L. et al., Nature 320: 537, 1986; Kieny, M.-P. et al., AIDS Bio/Technology 4:790,1986; Top, F. H. et al., J. Infect. Dis. 124:148,1971; Chanda, P. K. et al., Virology 175:535,1990), partículas de origen viral o sintético(por ejemplo, Kofler, N. et al., J. Immunol Methods. 192: 25, 1996; Eldridge, J. H. et al., Sem. Hematol 30: 16, 1993; Falo, L. D., junior et al., Nature Med. 7:649, 1995), adyuvantes (Warren, H. S., Vogel, F. R., y Chedid, L. A. Annu. Rev. Immunol. 4:369, 1986; Gupta, R. K. et al., Vaccine 11:293, 1993), liposomas (Reddy, R. et al., J. Immunol. 148:1585, 1992; Rock, K. L., Immunol. Today 17:131, 1996), o, cDNA desnudo o absorbido en partículas (Ulmer, J. B. et al., Science 259:1745, 1993; Robinson, H. L., Hunt, L. A., y Webster, R. G., Vaccine 11:957, 1993; Shiver, J. W. et al., En: Concepts in vaccine development, Kaufmann, S. H. E., ed., p. 423, 1996; Cease, K. B., y Berzofsky, J. A., Arum. Rev. Immunol. 12:923, 1994 y Eldridge, J. H. et al., Sem. Hematol. 30:16, 1993). También pueden ser usadas tecnologías de administración reconocidas por toxina, también conocidas como reconocimiento mediado por receptor, tales como los de Avant Immunotherapeutics, Inc. (Needham, Massachusetts).

En pacientes con cáncer asociado a 85P1B3, las composiciones de vacuna de la invención también pueden ser usadas junto con otros tratamientos usados para el cáncer,por ejemplo, cirugía, quimioterapia, terapias con fármacos, terapias con radiación,etc. incluyendo el uso en combinación con adyuvantes inmunes tales como IL-2, IL-12, GM-CSF, y otros similares.

Vacunas celulares

Pueden ser determinados epítopos de CTL usando algoritmos específicos para identificar péptidos dentro de la proteína 85P1B3 que se unan a los alelos de HLA correspondientes (véase por ejemplo, Tabla IV; Epimer® y Epimatrix®, Universidad Brown (URL www.brown.edu/Research/TB-HlV_Lab/epimatrix/epimatrix.html); y, BIMAS, (URL bimas.dcrt.nih.gov/; SYFPEITHI en el URL syfpeithi.bmi-heidelberg.com/). En una realización preferida, el inmunógeno de 85P1B3 contiene una o varias secuencias de aminoácidos identificadas usando técnicas conocidas en la técnica, tales como las secuencias mostradas en las Tablas V-XVIII o un péptido de 8, 9, 10 ó 11 aminoácidos especificados por un motivo/supermotivo de HLA Clase I (por ejemplo, Tabla IV (A), Tabla IV (D), o Tabla IV (E)) y/o un péptido de al menos 9 aminoácidos que comprende un motivo/supermotivo HLA Clase II (por ejemplo, Tabla IV (B) o Tabla IV (C)). Como se aprecia en la técnica, la ancladura de unión de HLA Clase I está esencialmente terminada cerrada de modo que los péptidos de sólo un intervalo de tamaño particular puedan caber en la ancladura y unirse, generalmente los epítopos de HLA Clase I tienen 8, 9, 10 ó 11 aminoácidos. Por el contrario, la ancladura de unión de HLA Clase II está esencialmente terminada en abierto; por lo tanto un péptido de aproximadamente 9 o más aminoácidos puede unirse por una molécula HLA Clase II. Debido a las diferencias de la ancladura de unión entre los motivos de HLA Clase I y II, HLA Clase I son de una longitud específica, es decir, la posición dos de un motivo de Clase I es el segundo aminoácido en una dirección de amino a carboxilo del péptido. Las posiciones de aminoácido en un motivo de Clase II son relativas sólo entre sí, no respecto al péptido total, es decir, pueden ser unidos aminoácidos adicionales a los extremos amino- y/o carboxilo-terminal de una secuencia que presenta el motivo. Los epítopos de HLA Clase II tienen a menudo 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ó 25 aminoácidos, o más de 25 aminoácidos.

Vacunas basadas en anticuerpos

Se conoce una amplia variedad de métodos para generar una respuesta inmune en un mamífero en la técnica (por ejemplo, como la primera etapa en la generación de hibridomas). Los métodos para generar una respuesta inmune en un mamífero comprenden exponer el sistema inmunológico del mamífero a un epítopo inmunogénico en una proteína (por ejemplo, la proteína 85P1B3) de modo que sea generada una respuesta inmune. Una realización típica consiste en un método para generar una respuesta inmune frente a 85P1B3 en un huésped, poniendo en contacto el huésped con una cantidad suficiente de al menos una célula B de 85P1B3 o el epítopo del linfocito T citotóxico o su análogo; y al menos un intervalo periódico a partir del cual poner en contacto de nuevo el huésped con la célula B de 85P1B3 o el epítopo del linfocito T citotóxico o su análogo. Una realización específica consiste en un método para generar una respuesta inmune contra una proteína relacionada con 85P1B3 o un péptido multiepitópico artificial que comprende: administrar el inmunógeno de 85P1B3 (por ejemplo, la proteína 85P1B3 o su fragmento del péptido, una proteína de fusión 85P1B3 o el análogo, etc.) en una preparación de vacuna a un humano u otro mamífero. Típicamente, tales preparaciones de vacuna contienen además un adyuvante adecuado (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. Nº. 6.146.635) o un epítopo auxiliar universal tal como un péptido PADRE® (Epimmune Inc., San Diego, CA; véase, por ejemplo, Alexander et al., J. Immunol. 2000 164 (3); 164 (3): 1625-1633; Alexander et al., Immunity 1994 1 (9): 751-761 y Alexander et al., Immunol. Res. 1998 18 (2): 79-92). Un método alternativo comprende generar una respuesta inmune en un individuo contra un inmunógeno de 85P1B3: administrar in vivo al músculo o la piel del cuerpo del individuo una molécula de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica un inmunógeno de 85P1B3, la secuencia de ADN operativamente unida a las secuencias reguladoras que controlan la expresión de la secuencia de ADN; en el que la molécula de ADN es tomada por las células, la secuencia de ADN se expresa en las células y una respuesta inmune se genera contra el inmunógeno (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. Nº. 5.962.428). Opcionalmente, también se administra un facilitador de vacuna genético tal como lípidos aniónicos; saponinas; lecitinas; compuestos estrogénicos; alquilos inferiores hidroxilados; dimetil-sulfóxido; y urea.

Vacunas de ácidos nucleicos

Las composiciones de vacuna de la invención incluyen modalidades mediadas por ácidos nucleicos. El ADN o ARN que codifica la(s) proteína(s) de la invención pueden ser administrados a un paciente. Pueden ser empleados métodos de inmunización genética para generar respuestas profilácticas o terapéuticas inmunes humorales y celulares dirigidas contra células cancerígenas que expresan 85P1B3. Los constructos que comprenden el ADN que codifica una proteína/inmunógeno relacionada con 85P1B3 y las secuencias reguladoras apropiadas pueden ser inyectados directamente en el músculo o la piel de un individuo, tal que las células del músculo o de la piel capten el constructo y expresen la proteína 85P1B3/inmunógeno codificado. De forma alternativa, una vacuna comprende una proteína relacionada con 85P1B3. La expresión del inmunógeno de la proteína relacionada con 85P1B3 causa la generación de inmunidad humoral y celular profiláctica o terapéutica contra células que llevan la proteína 85P1B3. Varias técnicas de inmunización genética profiláctica y terapéutica conocidas en la técnica pueden ser usadas (para una revisión, véase la información y referencias publicadas en la dirección de Internet www.genweb.com). La administración basada en ácidos nucleicos es descrita, por ejemplo, en Wolff et. al., Science 247: 1465 (1990) así como las patentes de EE.UU. N^{os}. 5.580.859; 5.589.466; 5.804.566; 5.739.118; 5.736.524; 5.679.647; el documento WO 98/04720. Los ejemplos de tecnologías de administración basadas en el ADN incluyen la administración de "ADN desnudo", administración facilitada (bupivicaina, polímeros, mediado por péptido), complejos lipídicos catiónicos, y la administración mediada por partículas ("pistola génica") o mediada por presión (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. Nº. 5.922.687).

Con fines de inmunización terapéuticos o profilácticos, las proteínas de la invención pueden ser expresadas vía vectores virales o bacterianos. Los diversos sistemas de administración génica virales que pueden ser usados en la práctica de la invención incluyen, pero no están limitados a, vaccinia, viruela aviar, viruela del canario, adenovirus, influenza, poliovirus, virus adeno-asociado, lentivirus y el virus sindbis (véase, por ejemplo, Restifo, 1996, Curr. Opin. Immunol. 8: 658-663; Tsang et al. J. Natl. Cancer Inst. 87: 982-990 (1995)). También pueden ser empleados sistemas de administración no virales que introducen el ADN desnudo que codifica una proteína relacionada con 85P1B3 en el paciente (por ejemplo, intramuscularmente o intradermalmente) para inducir una respuesta antitumoral.

El virus de vaccinia se usa, por ejemplo, como un vector para expresar las secuencias de nucleótidos que codifican los péptidos de la invención. En la introducción en un huésped, el virus vaccinia recombinante expresa el péptido inmunogénico de la proteína, y produce así una respuesta inmune frente al huésped. Los vectores de vaccinia y los métodos útiles en los protocolos de inmunización son descritos, por ejemplo, en la patente de EE.UU. Nº. 4.722.848. Otro vector es el BCG (Bacille Calmette Guerin). Los vectores BCG son descritos en Stover et al., Nature 351: 456-460 (1991). Una amplia variedad de otros vectores útiles para la administración terapéutica o la inmunización de los péptidos de la invención, por ejemplo, vectores de adeno virus y adeno-asociados, vectores retrovirales, vectores de Salmonella typhi, vectores del toxina ántrax desintoxicados, y similares, serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción en este documento.

Así, se usan sistemas de administración génica para suministrar una molécula de ácido nucleico relacionada con 85P1B3. En una realización, se emplea el cDNA de 85P1B3 humano de cadena entera. En otra realización, son empleadas moléculas de ácido nucleico de 85P1B3 que codifican linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos y/o epítopos de anticuerpos.

Vacunas ex vivo

También pueden ser empleadas varias estrategias ex vivo para generar una respuesta inmune. Un enfoque implica el uso de células que presentan antígeno (APC) tales como células dendríticas (DC) que presentan el antígeno de 85P1B3 frente al sistema inmunológico de un paciente. Las células dendríticas expresan moléculas MHC clase I y II, co-estimulador B7 e IL-12, y son así células que presentan antígenos altamente especializadas. En el cáncer de próstata, están siendo usadas células dendríticas autólogas pulsadas con péptidos del antígeno de membrana específico de próstata (PSMA) en una Fase I de ensayo clínico para estimular los sistemas inmunológicos de los pacientes con cáncer de próstata (Tjoa et al., 1996, Prostate 28: 65-69; Murphy et al., 1996, Prostate 29: 371-380). Así, pueden ser usadas células dendríticas que presentan péptidos de 85P1B3 frente a linfocitos T en el contexto de moléculas MHC clase I o II. En una realización, son pulsadas células dendríticas autólogas con péptidos de 85P1B3 capaces de unirse a moléculas MHC clase I y/o clase II. En otra realización, son pulsadas células dendríticas con la proteína 85P1B3 completa. Otra realización más implica manipular genéticamente la sobreexpresión del gen de 85P1B3 en células dendríticas usando varios vectores de implementación conocidos en la técnica, tales como adenovirus (Arthur et al., 1997, Cancer Gene Ther. 4: 17-25), retrovirus (Henderson et al., 1996, Cancer Res. 56: 3763-3770), lentivirus, virus adeno-asociados, transfección de ADN (Ribas et al., 1997, Cancer Res. 57: 2865-2869), o transfección de ARN derivado de tumor (Ashley et al., 1997, J. Exp. Med. 186: 1177-1182). Las células que expresan 85P1B3 también pueden ser manipuladas para expresar moduladores inmunes, tales como GM-CSF, y usarse como agentes de inmunización.

X. B.) 85P1B3 como una diana para la terapia basada en anticuerpos

85P1B3 es una atractiva diana para estrategias terapéuticas basadas en anticuerpos. Se conoce un número de estrategias con anticuerpos en la técnica para reconocer tanto moléculas extracelulares como intracelulares (véase, por ejemplo, eliminación mediada por complemento y ADCC así como el uso de intracuerpos). Como 85P1B3 se expresa por células cancerígenas de varios linajes con relación a las células normales correspondientes, la administración sistémica de composiciones inmuno-reactivas de 85P1B3 se prepara exhibiendo una excelente sensibilidad sin efectos tóxicos, inespecíficos y/o no específicos causados uniendo la composición inmuno-reactiva a órganos no diana y tejidos. Los anticuerpos específicamente reactivos con dominios de 85P1B3 son útiles para tratar cánceres que expresan sistémicamente 85P1B3, conjugados con una toxina o con un agente terapéutico, o como anticuerpos desnudos capaces de inhibir la proliferación o función de las células.

Pueden ser introducidos anticuerpos de 85P1B3 a un paciente tal que el anticuerpo se una a 85P1B3 y module una función, tal como una interacción con una pareja de unión, y por consiguiente medie la destrucción de células tumorales y/o inhiba el crecimiento de las células tumorales. Los mecanismos por los cuales tales anticuerpos ejercen un efecto terapéutico pueden incluir la citolisis mediada por complemento, la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo, la modulación de la función fisiológica de 85P1B3, la inhibición de la unión de ligando o rutas de transducción de señal, la modulación de la diferenciación de células tumorales, la alteración de perfiles del factor de angiogénesis tumoral y/o la apoptosis.

Los expertos en la técnica saben que los anticuerpos pueden ser usados para reconocer y unir moléculas inmunogénicas específicamente tal como una región inmunogénica de la secuencia de 85P1B3 mostrada en la Figura 2 o la Figura 3. Además, los expertos en la técnica saben que es rutinario conjugar anticuerpos a agentes citotóxicos (véase, por ejemplo, Slevers et al. Blood 93:11 3678-3684 (1 de junio,1999)). Cuando se administran agentes citotóxicos y/o terapéuticos directamente a células, tal como por conjugación de éstos a anticuerpos específicos para una molécula expresada por aquella célula (por ejemplo, 85P1B3), el agente citotóxico ejercerá su efecto biológico conocido (es decir, la citotoxicidad) sobre aquellas células.

Se conocen una amplia variedad de composiciones y métodos para usar conjugados anticuerpo-agente citotóxico para matar a células en la técnica. En el contexto de los cánceres, los métodos típicos implican administrar a un animal que tiene un tumor una cantidad biológicamente eficaz de un conjugado que comprende un agente citotóxico seleccionado y/o terapéutico unido a un agente de reconocimiento (por ejemplo, un anticuerpo anti-85P1B3) que se una a un marcador (por ejemplo, 85P1B3) expresado, accesible a la unión o localizado en las superficies de las células. Una realización típica es un método para administrar un agente citotóxico y/o terapéutico a una célula que expresa 85P1B3, que comprende conjugar el agente citotóxico a un anticuerpo que se una inmunoespecíficamente a un epítopo de 85P1B3, y, exponer la célula al conjugado anticuerpo-agente. Otra realización ilustrativa es un método para tratar a un individuo que se sospecha que sufre un cáncer con metástasis, que comprende una etapa de administrar parenteralmente a dicho individuo una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo conjugado a un agente citotóxico y/o terapéutico.

La inmunoterapia del cáncer usando anticuerpos anti-85P1B3 puede hacerse conforme a varias posibilidades que han sido empleadas satisfactoriamente en el tratamiento de otros tipos de cáncer, incluyendo, pero no limitado al cáncer de colon (Arlen et al., 1998, Crit. Rev. Immunol. 18: 133-138), mieloma múltiple (Ozaki et al., 1997, Blood 90: 3179-3186, Tsunenari et al., 1997, Blood 90: 2437-2444), cáncer gástrico (Kasprzyk et al., 1992, Cancer Res. 52: 2771-2776), linfoma de células B (Funakoshi et al., 1996, J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 19: 93-101), leucemia (Zhong et al., 1996, Leuk. Res. 20: 581-589), cáncer colorectal (Moun et al., 1994, Cancer Res. 54: 6160-6166; Velders et al., 1995, Cancer Res. 55: 4398-4403), y cáncer de mama (Shepard et al., 1991, J. Clin. Immunol. 11: 117-127). Algunas posibilidades terapéuticas implican la conjugación de un anticuerpo desnudo a una toxina, tal como la conjugación de Y^{91} o I^{131} a anticuerpos anti-CD20 (por ejemplo, Zevalin®, productos farmacéuticos IDEC Corp. o Bexxar®, productos farmacéuticos Coulter), mientras que otros implican la co-administración de anticuerpos y otros agentes terapéuticos, tales como Herceptin® (trastuzumab) con paclitaxel (Genentech, Inc.). Para tratar el cáncer de próstata, por ejemplo, pueden ser administrados anticuerpos de 85P1B3 junto con radiación, quimioterapia o ablación hormonal.

Aunque la terapia con anticuerpos de 85P1B3 sea útil para todas las etapas del cáncer, la terapia con anticuerpos puede ser particularmente apropiada en cánceres avanzados o metastásicos. El tratamiento con terapia con anticuerpos de la invención se indica para pacientes que han recibido uno o varios ciclos de quimioterapia. De forma alternativa, la terapia con anticuerpos de la invención se combina con un régimen quimioterapéutico o de radiación para pacientes que no han recibido tratamiento quimioterapéutico. Además, la terapia con anticuerpos puede permitir el uso de dosificaciones reducidas de quimioterapia concomitante, particularmente para pacientes que no toleren la toxicidad del agente quimioterapéutico muy bien.

Los pacientes con cáncer pueden ser evaluados según la presencia y el nivel de expresión de 85P1B3, preferiblemente usando evaluaciones inmunohistoquímicas de tejido tumoral, imagimática cuantitativa de 85P1B3, u otras técnicas que indican fidedignamente la presencia y el grado de expresión de 85P1B3. El análisis inmunohistoquímico de biopsias tumorales o muestras quirúrgicas es preferido para este fin. Los métodos para análisis inmunohistoquímico de tejidos tumorales son conocidos en la técnica.

Los anticuerpos monoclonales anti-85P1B3 que tratan cánceres de próstata y otros incluyen los que inician una potente respuesta inmune contra el tumor o los que son directamente citotóxicos. En cuanto a esto, los anticuerpos monoclonales anti-85P1B3 pueden producir lisis de células tumorales por mecanismos de citotoxicidad celular mediados por complemento o dependientes de anticuerpo (ADCC), ambos de los cuales requieren una parte intacta de Fc de la molécula de inmunoglobulina para la interacción con los sitios del receptor de Fc de células efectoras en proteínas complementarias. Además, los anticuerpos monoclonales anti-85P1B3 que ejercen un efecto biológico directo en el crecimiento de tumores son útiles para tratar cánceres que expresan 85P1B3. Los mecanismos por los cuales los anticuerpos monoclonales directamente citotóxicos actúan incluyen: la inhibición del crecimiento celular, la modulación de la diferenciación celular, la modulación de perfiles del factor de angiogenesis tumoral y la inducción de la apoptosis. El(Los) mecanismo(s) por los cuales un anticuerpo monoclonal anti-85P1B3 particular ejerce un efecto antitumoral es(son) evaluado(s) usando cualquier número de ensayos in vitro que evalúan la muerte celular tal como ADCC, ADMMC, lisis de células mediada por complemento, etcétera, etcétera, como es generalmente conocido en la técnica.

En algunos pacientes, el uso de anticuerpos monoclonales murinos u otros no humanos, o anticuerpos monoclonales quiméricos de humano/ratón puede inducir respuestas inmunes de moderadas a fuertes contra el anticuerpo no humano. Esto puede causar la liberación del anticuerpo desde la circulación y una eficacia reducida. En los casos más severos, una tal respuesta inmune puede conducir a la formación extensiva de complejos inmunes que, potencialmente, pueden causar una insuficiencia renal. En consecuencia, los anticuerpos monoclonales preferidos usados en los métodos terapéuticos de la invención son aquellos que son totalmente humanos o humanizados y que se unen específicamente al antígeno 85P1B3 diana con alta afinidad, pero que exhiben baja o ninguna antigenicidad en el paciente.

Los métodos terapéuticos de la invención contemplan la administración de los anticuerpos monoclonales anti-85P1B3 solo así como combinaciones, o cócteles, de diferentes anticuerpos monoclonales. Tales cócteles de anticuerpos monoclonales pueden tener ciertas ventajas puesto que contienen a anticuerpos monoclonales que reconocen epítopos diferentes, explotan diferentes mecanismos efectores o combinan los anticuerpos monoclonales citotóxicos directamente con los anticuerpos monoclonales que se basan en la funcionalidad efectora inmune. Tales anticuerpos monoclonales en combinación pueden exhibir efectos terapéuticos sinérgicos. Además, pueden ser administrados los anticuerpos monoclonales anti-85P1B3 de manera concomitante con otras modalidades terapéuticas, incluyendo, pero no limitadas a varios agentes quimioterapéuticos, bloqueantes de andrógenos, inmuno-moduladores (por ejemplo, IL-2, GM-CSF), cirugía o radiación. Los anticuerpos monoclonales anti-85P1B3 se administran en su forma "desnuda" o no conjugada, o pueden tener un(algunos) agente(s) terapéutico(s) conjugado(s) a ellos.

Las formulaciones de anticuerpos anti-85P1B3 son administradas vía cualquier ruta capaz de administrar los anticuerpos a una célula tumoral. Las rutas de administración incluyen, pero no están limitadas a intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intratumoral, intradérmica y otros similares. El tratamiento implica generalmente la administración repetida de la preparación del anticuerpo anti-85P1B3, vía una ruta de administración aceptable tal como la inyección intravenosa (IV), típicamente en una dosis en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal. En general, las dosis en el intervalo de 10-500 mg de anticuerpo monoclonal por semana son eficaces y bien toleradas.

Basado en la experiencia clínica con el anticuerpo monoclonal de Herceptina en el tratamiento del cáncer de mama metastásico, una dosis IV de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg de peso corporal del paciente, seguido de dosis semanales IV de aproximadamente 2 mg/kg de la preparación del anticuerpo monoclonal anti-85P1B3 representa un régimen de medicación aceptable. Preferiblemente, la dosis de carga inicial es administrada como una infusión de 90 minutos o más larga. La dosis de mantenimiento periódica se administra como una infusión de 30 minutos o más larga, a condición de que la dosis inicial sea bien tolerada. Como se aprecia por los expertos en la técnica, varios factores pueden influir en el régimen de medicación ideal en un caso particular. Tales factores incluyen, por ejemplo, la afinidad de unión y la semivida del anticuerpo o de los anticuerpos monoclonales usados, el grado de la expresión de 85P1B3 en el paciente, el grado de cobertura circulante del antígeno 85P1B3, el nivel de concentración del anticuerpo deseado en estado estacionario, la frecuencia del tratamiento y la influencia de los agentes quimioterapéuticos u otros usados en combinación con el método de tratamiento de la invención, así como el estado de salud del paciente particular.

Opcionalmente, los pacientes deben ser evaluados según los niveles de 85P1B3 en una muestra dada (por ejemplo, los niveles del antígeno 85P1B3 circulante y/o células que expresan 85P1B3) para ayudar a la determinación del régimen de medicación más eficaz, etc. Tales evaluaciones son usadas también para monitorizar los fines en todos los momentos de la terapia, y son útiles para calibrar el éxito terapéutico en combinación con la evaluación de otros parámetros (por ejemplo, citología de orina y/o niveles de ImmunoCyt en la terapia del cáncer de vejiga, o por analogía, los niveles de PSA en suero en la terapia del cáncer de próstata).

También pueden usarse anticuerpos anti-85P1B3 anti-idiotípicos en terapia anticáncer como una vacuna para inducir una respuesta inmune frente a células que expresan una proteína relacionada con 85P1B3. En particular, la generación de anticuerpos anti-idiotípicos es conocida en la técnica; esta metodología puede ser adaptada fácilmente para generar anticuerpos anti-85P1B3 anti-idiotípicos que imitan un epítopo en una proteína relacionada con 85P1B3 (véase, por ejemplo, Wagner et al., 1997, Hybridoma 16: 33-40; Foon et al., 1995, J. Clin. Invest. 96: 334-342; Herlyn et al., 1996, Cancer Immunol. Immunother. 43:65-76). Un tal anticuerpo anti-idiotípico puede ser usado en estrategias de vacunas del cáncer.

X. C.) 85P1B3 como una diana para respuestas inmunes celulares

Las vacunas y los métodos para preparar vacunas que contienen una cantidad inmunogénicamente eficaz de uno o varios péptidos de unión de HLA como se describe en este documento son otras realizaciones de la invención. Además, las vacunas conforme a la invención abarcan composiciones de uno o varios de los péptidos reivindicados. Un péptido puede estar presente en una vacuna individualmente. De forma alternativa, el péptido puede existir como un homopolímero que comprenda múltiples copias del mismo péptido, o como un heteropolímero de varios péptidos. Los polímeros tienen la ventaja de una mayor reacción inmunológica y, cuando se usan diferentes epítopos de péptido para preparar el polímero, la capacidad adicional de inducir anticuerpos y/o CTL que reaccionan con diferentes determinantes antigénicos del organismo patógeno o péptido relacionado con el tumor reconocido para una respuesta inmune. La composición puede ser una región natural de un antígeno o puede ser preparada, por ejemplo, recombinantemente o por síntesis química.

Los vehículos que pueden ser usados con las vacunas de la invención son conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, tiroglobulina, albúminas tales como albúmina de suero humano, vacuna antitetánica, ácidos poliaminos tales como poli L-lisina, ácido poli-L-glutámico, influenza, proteína de núcleo del virus de la hepatitis B, y otros similares. Las vacunas pueden contener un diluyente fisiológicamente tolerable (es decir, aceptable) tal como agua, o solución salina, preferiblemente solución salina de fosfato tamponada. Las vacunas típicamente también incluyen un adyuvante. Los adyuvantes tales como el adyuvante incompleto de Freund, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio o alumbre son ejemplos de materiales conocidos en la técnica. Además, como se describe en este documento, las respuestas de CTL pueden ser cebadas conjugando los péptidos de la invención a lípidos, tales como tripalmitoil-S-glicerilcisteinliseril-serina (P_{3}CSS). Además, se ha encontrado que un adyuvante tales como oligonucleotidos sintéticos que contienen citosina-fosforotiolado-guanina (CpG) aumentan las respuestas de CTL de 10 a 100 veces. (véase, por ejemplo, Davila y Celis. J. Immunol. 165: 539-547 (2000)).

En la inmunización con una composición de péptido conforme a la invención, vía inyección, aerosol, oral, transdérmica, transmucosa, intrapleural, intratecal u otras rutas adecuadas, el sistema inmunológico del huésped responde a la vacuna produciendo grandes cantidades de CTL y/o HTL específicos para el antígeno deseado. Por consiguiente, el huésped se vuelve al menos parcialmente inmune frente al desarrollo posterior de células que expresan o sobreexpresan el antígeno 85P1B3, o deriva al menos alguna ventaja terapéutica cuando el antígeno se asocia al
tumor.

En algunas realizaciones, puede ser deseable combinar los componentes del péptido clase I con los componentes que inducen o facilitan el anticuerpo de neutralización y/o las respuestas de linfocitos T auxiliares dirigidas al antígeno diana. Una realización preferida de tal composición comprende los epítopos clase I y clase II conforme a la invención. Una realización alternativa de tal composición comprende un epítopo clase I y/o clase II conforme a la invención, con un epítopo específico de HTL tal como la molécula PADRE® (Epimmune, San Diego, CA) (descrita, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. N^{os}. 5.736.142).

Una vacuna de la invención también puede incluir células que presentan antígenos (APC), tales como células dendríticas (DC), tal como un vehículo que presenta los péptidos de la invención. Las composiciones de vacuna pueden ser creadas in vitro, después de la movilización de la célula dendrítica y la recuperación, mediante la cual la carga de células dendríticas ocurre in vitro. Por ejemplo, las células dendríticas son transfectadas, por ejemplo, con un minigen conforme a la invención, o son pulsadas con péptidos. Las células dendríticas entonces pueden ser administradas a un paciente para provocar respuestas inmunes in vivo. Las composiciones de vacuna, basadas en ADN o péptido, también pueden ser administradas in vivo en combinación con la movilización de células dendríticas mediante la cual la carga de células dendríticas ocurre in vivo.

Preferiblemente, se utilizan los principios siguientes cuando se selecciona una serie de epítopos para su inclusión en una composición poliepitópica para el uso en una vacuna, o para seleccionar epítopos discretos que se incluyen en una vacuna y/o se codifican por ácidos nucleicos tal como un minigen. Se prefiere que cada uno de los principios siguientes sea equilibrado para hacer la selección. Los múltiples epítopos que se incorporan en una composición de vacuna dada pueden ser, pero no tienen que ser, contiguos en la secuencia en el antígeno natural a partir de la cual son derivados los epítopos.

1.) Se seleccionan epítopos que, bajo su administración, imitan respuestas inmunes que se ha observado que se correlacionan con la distribución del tumor. Para el HLA Clase I esto incluye 3-4 epítopos que vienen de al menos un antígeno asociado al tumor (TAA). Para el HLA Clase II, se emplea un racionamiento similar; de nuevo 3-4 epítopos son seleccionados de al menos un TAA (véase, por ejemplo, Rosenberg et al., Science 278: 1447-1450). Los epítopos de un TAA pueden ser usados en combinación con epítopos de uno o varios TAA adicionales para producir una vacuna que reconoce tumores con modelos de expresión variables de TAA expresados frecuentemente.

2.) Se seleccionan epítopos que tienen el requisito de afinidad de unión establecido para que se correlacione con la inmunogenicidad: para HLA Clase I un IC_{50} de 500 nM o menos, a menudo 200 nM o menos; y para Clase II un IC_{50} de 1000 nM o menos.

3.) Se seleccionan suficientes péptidos portadores de supermotivos, o una serie suficiente de péptidos portadores del motivo específico de alelo, para dar una amplia cobertura. Por ejemplo, es preferible tener una cobertura de al menos el 80%. Un análisis Monte Carlo, una evaluación estadística conocida en la técnica, puede ser empleado para evaluar la anchura, o la redundancia de la cobertura.

4.) Cuando se seleccionan epítopos de antígenos relacionados con el cáncer es útil a menudo seleccionar análogos porque el paciente puede haber desarrollado la tolerancia al epítopo natural.

5.) De una importancia particular son los epítopos llamados "epítopos anidados". Los epítopos anidados ocurren donde al menos dos epítopos se solapan en una secuencia peptídica dada. Una secuencia peptídica anidada puede comprender epítopos de células B, HLA clase I y/o HLA clase II. Cuando se proporcionan epítopos anidados, una diana general es proporcionar el mayor número de epítopos por secuencia. Así, un aspecto es evitar proporcionar un péptido que es mayor que el extremo amino-terminal del epítopo amino-terminal y el extremo carboxilo-terminal del epítopo del carboxilo-terminal en el péptido. Cuando se proporciona una secuencia multiepitópica, tal como una secuencia que comprende epítopos anidados, es generalmente importante para seleccionar la secuencia para asegurar que esto no tiene propiedades patológicas u otras biológicas deletéreas.

6.) Si se crea una proteína poliepitópica, o cuando se crea un minigen, un objetivo es generar el péptido más pequeño que abarca los epítopos de interés. Este principio es similar, si no el mismo que se emplea cuando se selecciona un péptido que comprende epítopos anidados. Sin embargo, con un péptido poliepitópico artificial, la diana de minimización de tamaño se equilibra contra la necesidad de integrar cualquier secuencia de espaciador entre epítopos en la proteína poliepitópica. Los residuos de aminoácidos del espaciador, por ejemplo, pueden ser introducidos para evitar uniones de epítopos (un epítopo reconocido por el sistema inmunológico, no presente en el antígeno diana, y sólo creado por la yuxtaposición artificial de epítopos), o para facilitar la división entre epítopos y así potenciar la presentación de epítopo. Las uniones de epítopos deben ser evitadas generalmente porque el receptor puede generar una respuesta inmune frente a aquel epítopo no natural. De interés particular es un epítopo de unión que es un "epítopo dominante". Un epítopo dominante puede conducir a una tal respuesta entusiasta de modo que las respuestas inmunes frente a otros epítopos son disminuidas o suprimidas.

7.) Cuando las secuencias de variantes múltiples de la misma proteína diana están presentes, también pueden ser seleccionados epítopos de péptido potenciales en base de su conservadurismo. Por ejemplo, un criterio para el conservadurismo puede definir que la secuencia entera de un péptido de unión de clase I HLA o núcleo 9-mer entero de un péptido de unión de clase II se conserva en un porcentaje designado de las secuencias evaluadas para un antígeno de proteína específico.

X. C.1. Vacunas del minigen

Un número de diferentes posibilidades están disponibles que permiten la administración simultánea de múltiples epítopos. Los ácidos nucleicos que codifican los péptidos de la invención son una realización particularmente útil de la invención. Los epítopos para la inclusión en un minigen son seleccionados preferiblemente de acuerdo con las directrices expuestas en adelante en la sección anterior. Un medio preferido de administrar ácidos nucleicos que codifican los péptidos de la invención usa constructos de minigen que codifican un péptido que comprende uno o múltiples epítopos de la invención.

El uso de minigenes de multiepítopo es descrito más abajo y en, Ishioka et al., J. Immunol. 162: 3915-3925, 1999; An, L. y Whitton, J. L., J. Virol. 71: 2292, 1997; Thomson, S. A. et al., J. Immunol. 157: 822, 1996; Whitton, J. L. et al., J. Virol. 67: 348, 1993; Hanke, R. et al., Vaccine 16: 426, 1998. Por ejemplo, un plásmido de ADN de multiepítopo que codifica 85P1B3 derivado de epítopos portadores del motivo y/o el supermotivo, el epítopo de linfocitos T auxiliares universal PADRE® (o múltiples epítopos HTL de 85P1B3), y una secuencia de señal que traslada del retículo endoplásmica puede ser manipulada genéticamente. Una vacuna también puede comprender epítopos que son derivados de otros TAA.

Puede confirmarse la inmunogenicidad de un minigen multiepitópico en ratones transgénicos para evaluar la magnitud de respuestas de inducción de CTL contra los epítopos analizados. Además, la inmunogenicidad de epítopos codificados por ADN in vivo puede ser correlacionada con las respuestas in vitro de líneas de CTL específicas contra células diana transfectadas con el plásmido de ADN. Así, estos experimentos pueden mostrar que el minigen sirve para ambos: 1.) generar una respuesta de CTL y 2.) que las células reconocidas de CTL inducidas que expresan los epítopos codificados.

Por ejemplo, para crear una secuencia de ADN que codifica los epítopos seleccionados (minigen) para la expresión en células humanas, las secuencias de aminoácido de los epítopos pueden ser traducidas a la inversa. Una tabla de uso de codón humana puede ser usada para dirigir la opción del codón para cada aminoácido. Estas secuencias de ADN que codifican el epítopo pueden ser lindadas directamente, de modo que cuando se traducen, se crea una secuencia de polipéptido continua. Para optimizar la expresión y/o la inmunogenicidad, pueden ser incorporados elementos adicionales en el diseño minigénico. Los ejemplos de las secuencias de aminoácidos que pueden ser traducidas a la inversa y ser incluidas en la secuencia del minigen incluyen: epítopos de HLA clase I, epítopos de HLA clase II, epítopos de anticuerpo, una secuencia señal de ubiquitinación, y/o una señal de reconocimiento del retículo endoplásmico. Además, la presentación de HLA de epítopos de CTL y HTL puede ser mejorada por la inclusión de secuencias sintéticas (por ejemplo, polialanina) o flanqueantes naturales adyacentes a los epítopos de CTL o HTL; estos péptidos más grandes que comprenden el(los) epítopo(s) están en la amplitud de la invención.

La secuencia del minigen puede ser convertida al ADN ensamblando oligonucleotidos que codifican las cadenas más y menos del minigen. Los oligonucleotidos que se superponen (30-100 bases de longitud) pueden ser sintetizados, fosforilados, purificados y hibridado en condiciones apropiadas usando técnicas conocidas. Los extremos de los oligonucleotidos pueden ser unidos, por ejemplo, usando la T4 DNA ligasa. Este minigen sintético, que codifica el polipéptido de epítopo, entonces puede ser clonado en un vector de expresión deseado.

Las secuencias reguladoras estándar conocidas para los expertos en la técnica preferiblemente están incluidas en el vector para asegurar la expresión en las células diana. Varios elementos del vector son deseables: un promotor con un sitio de clonación corriente abajo para la inserción del minigen; una señal de poliadenilación para la terminación de la transcripción eficiente; un origen de E. coli de replicación; y un marcador seleccionable de E. coli (por ejemplo, resistencia a la ampicilina o kanamicina). Pueden ser usados numerosos promotores para este fin, por ejemplo, el promotor del citomegalovirus humano (hCMV). Véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. N^{os}. 5.580.859 y 5.589.466 para otras secuencias de promotor adecuadas.

Pueden ser deseadas modificaciones del vector adicionales para optimizar la expresión del minigen y la inmunogenicidad. En algunos casos, se requieren intrones para la expresión génica eficiente, y podrían ser incorporados uno o varios intrones sintéticos o naturales en la región transcrita del minigen. La inclusión de secuencias de estabilización del mARN y secuencias para la replicación en células de mamífero también puede ser considerada para aumentar la expresión del minigen.

Una vez que un vector de expresión es seleccionado, el minigen se clona en la región del polienlazante corriente abajo del promotor. Este plásmido se transforma en la cepa de E. coli apropiada, y el ADN se prepara usando técnicas estándar. Se confirman la orientación y la secuencia de ADN del minigen, así como todos los otros elementos incluidos en el vector, usando el mapeo de restricción y el análisis de secuencias de ADN. Las células bacterianas que albergan el plásmido correcto pueden ser almacenadas como un banco de células maestro y un banco de células de trabajo.

Además, las secuencias inmunoestimuladoras (ISS o CpG) parecen desempeñar un papel en la inmunogenicidad de vacunas de ADN. Estas secuencias pueden ser incluidas en el vector, fuera de la secuencia que codifica el, de ser deseado, para realzar la inmunogenicidad.

En algunas realizaciones, puede ser usado un vector de expresión bi-cistrónico que permita la producción tanto de los epítopos codificados por el minigen como de una segunda proteína (incluida para realzar o disminuir la inmunogenicidad). Los ejemplos de proteínas o polipéptidos que podrían realzar beneficiosamente la respuesta inmune si se coexpresan incluyen citoquinas (por ejemplo, IL-2, IL-12, GM-CSF), moléculas que inducen citoquina (por ejemplo, LeIF), moléculas coestimuladoras, o para respuestas HTL, proteínas de unión de pan-DR (PADRE®, Epimmune, San Diego, CA). Los epítopos auxiliares (HTL) pueden ser unidos a señales de reconocimiento intracelulares y ser expresados separadamente de epítopos de CTL expresados; esto permite la dirección de los epítopos de HTL a un compartimiento celular diferente que él de los epítopos de CTL. De ser requerido, esto podría facilitar una entrada más eficiente de epítopos de HTL en la ruta de HLA clase II, mejorando así la inducción de HTL. En contraste a la inducción de HTL o CTL, específicamente la disminución de la respuesta inmune por co-expresión de moléculas inmunodepresivas (por ejemplo, TGF-P) puede ser beneficiosa en ciertas enfermedades.

Las cantidades terapéuticas del ADN de plásmido pueden ser producidas, por ejemplo, por fermentación en E. coli, seguido por la purificación. Se usan alícuotas del banco de células de trabajo para inocular el medio de crecimiento, y se cultiva hasta la saturación en matraces agitadores o un biorreactor de acuerdo con técnicas conocidas. Puede ser purificado el ADN del plásmido usando tecnologías de bioseparación estándar tales como resinas de intercambio aniónico en fase sólida suministradas por QIAGEN, Inc. (Valencia, California). De ser requerido, puede ser aislado el DNA superenrollado a partir de formas circulares abiertas y lineales usando electroforesis de gel u otros métodos.

El ADN del plásmido purificado puede ser preparado para la inyección usando una variedad de formulaciones. La más simple de éstas es la reconstitución del ADN Iiofilizado en solución salina de tampón fosfato estéril (PBS). Este enfoque, conocido como "ADN desnudo", se usa actualmente para la administración intramuscular (IM) en ensayos clínicos. Para maximizar los efectos inmunoterapéuticos de vacunas de ADN del minigen, puede ser deseable un método alternativo para formular el ADN del plásmido purificado. Una variedad de métodos ha sido descrita, y nuevas técnicas pueden volverse disponibles. También pueden ser usados lípidos catiónicos, glucolípidos y liposomas fusogénicos en la formulación (véase, por ejemplo, como se describe en el documento WO 93/24640; Mannino y Gould-Fogerite, BioTechniques 6 (7): 682 (1988); patente de EE.UU. Nº. 5.279.833; documento WO 91/06309; y Felgner, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 84: 7413 (1987). Además, los péptidos y compuestos referidos en conjunto como compuestos protectores, interactivos, no condensantes (PINC) podrían ser complejados también al ADN del plásmido purificado para influir en variables tales como la estabilidad, la dispersión intramuscular o el tráfico a órganos específicos o tipos de células.

La sensibilización de la célula diana puede ser usada como un ensayo funcional para la expresión y la presentación de HLA clase I de epítopos de CTL codificados por el minigen. Por ejemplo, el ADN del plásmido es introducido en una línea celular de mamífero que es adecuada como una diana para ensayos de liberación de cromo de CTL estándar. El método de transfección usado será dependiente de la formulación final. La electroporación puede ser usada para el ADN "desnudo", mientras que los lípidos catiónicos permiten la transfección in vitro directa. Un plásmido que expresa la proteína fluorescente verde (GFP) puede ser co-transfectado para permitir el enriquecimiento de células transfectadas usando la clase de células activadas por fluorescencia (FACS). Estas células son entonces marcadas con cromo 51 (^{51}Cr) y son usadas como células diana para líneas de CTL específicas de epítopo; la citolisis, detectada por la liberación de ^{51}Cr, indica tanto la producción, como la presentación de HLA, de epítopos de CTL codificados del minigen. La expresión de epítopos de HTL puede ser evaluada de una manera análoga usando ensayos para evaluar la actividad de HTL.

La inmunogenicidad in vivo es un segundo enfoque para las pruebas funcionales de las formulaciones de ADN del minigen. Los ratones transgénicos que expresan las proteínas de HLA apropiadas humanas son inmunizados con el producto de ADN. La dosis y la ruta de administración son dependientes de la formulación (por ejemplo, IM para ADN en PBS, intraperitoneal (i. p.) para el ADN complejado por lípido). Veintiún días después de la inmunización, se recolectan los esplenocitos y se estimula de nuevo durante una semana en presencia de péptidos que codifican cada epítopo que se analiza.

A partir de entonces, para células efectoras de CTL, se llevan a cabo ensayos para la citolisis de células diana ^{51}Cr-marcadas, cargadas de péptido, usando técnicas estándar. La lisis de las células diana que fueron sensibilizadas por HLA cargado de epítopos de péptido, correspondiente a epítopos codificados por minigen, demuestra la función de la vacuna de ADN para la inducción in vivo de CTLS. Se confirma la inmunogenicidad de epítopos de HTL en ratones transgénicos en una manera análoga.

De forma alternativa, los ácidos nucleicos pueden ser administrados usando la administración balística como se describe, por ejemplo, en la patente de EE.UU. Nº. 5.204.253. Usando esta técnica, se administran partículas comprendidas únicamente de ADN. En una realización más alternativa, el ADN puede ser adherido a partículas, tales como partículas de oro.

También pueden ser suministrados minigenes usando otros sistemas de administración bacterianos o virales conocidos en la técnica, por ejemplo, un constructo de expresión que codifica los epítopos de la invención puede ser incorporado en un vector viral tal como una vacuna.

X. C. 2. Combinaciones de péptidos que estimulan a CTL con péptidos que estimulan a linfocitos T auxiliadores

Las composiciones de vacuna que comprenden los péptidos que estimulan a CTL de la invención pueden ser modificadas, por ejemplo, transformados en análogos, para proporcionar los atributos deseados, tal como una mejor semivida en suero, cobertura ampliada o una inmunogenicidad potenciada.

Por ejemplo, la capacidad de un péptido para inducir la actividad de CTL puede ser potenciada uniendo el péptido a una secuencia que contiene al menos un epítopo que es capaz de inducir una respuesta de linfocitos T auxiliares. Aunque un péptido de CTL pueda ser unido directamente a un péptido T auxiliar, a menudo los conjugados epítopo de CTL/epítopo de HTL se unen por una molécula de espaciador. El espaciador típicamente está comprendido por moléculas relativamente pequeñas, neutras, tales como aminoácidos o miméticos de aminoácido, que sustancialmente no están cargados en condiciones fisiológicas. Los espaciadores son seleccionados típicamente a partir de, por ejemplo, Ala, Gly, u otros espaciadores neutros de aminoácidos no polares o aminoácidos polares neutros. Será entendido que el espaciador opcionalmente presente no tiene que estar comprendido de los mismos residuos y así puede ser un hetero- u homo-oligómero. Cuando está presente, el espaciador por lo general tendrá al menos uno o dos residuos, por lo general más de tres a seis residuos y a veces 10 o más residuos. El epítopo del péptido CTL puede ser unido al epítopo del péptido T auxiliar directamente o vía un espaciador en el extremo amino- o carboxi-terminal del péptido de CTL. El extremo amino-terminal del péptido inmunogénico o del péptido T auxiliar puede ser acilado.

En ciertas realizaciones, el péptido T auxiliar es el que se reconoce por linfocitos T auxiliares presentes en una mayoría de una población genéticamente diversa. Esto puede ser logrado seleccionando péptidos que se unen a muchos, la mayoría, o todas las moléculas de HLA clase II. Los ejemplos de tal aminoácido unidos a muchas moléculas de HLA Clase II incluyen secuencias de antígenos tales como la vacuna antitetánica en las posiciones 830-843 (QYIKANSKFIGITE), la proteína circumesporozoide (CS) de Plasmodium falciparum en las posiciones 378-398 (DIEKKIAKMEKASSVFNVVNS), y la proteína de Streptococcus de 18kD en las posiciones 116-131 (GAVDSILGGVATYGAA). Otros ejemplos incluyen péptidos portadores de un supermotivo DR 1-4-7, o cualquiera de los motivos DR3.

De forma alternativa, es posible preparar péptidos sintéticos capaces de estimular linfocitos T auxiliares, en una manera restringida de HLA suelta, usando secuencias de aminoácidos no encontradas en la naturaleza (véase, por ejemplo, la publicación PCT WO 95/07707). Estos compuestos sintéticos llamados epítopos de unión Pan-DR (por ejemplo, PADRE®, Epimmune, Inc., San Diego, CA) se diseñan para unirse más preferiblemente a la mayor parte de moléculas HLA-DR (clase II de HLA humana). Por ejemplo, un péptido de epítopo de unión Pan-DR que tiene la fórmula: aKXVAAWTLKAAa, donde "X" es ciclohexilalanina, fenilalanina o tirosina, y a es D-alanina o L-alanina, ha sido encontrado que se une a la mayor parte de alelos de HLA-DR, y para estimular la respuesta de linfocitos T auxiliares de la mayor parte de individuos, independientemente de su tipo HLA. Una alternativa de un epítopo de unión Pan-DR comprende todos "L" aminoácidos naturales y puede ser proporcionada en forma de ácidos nucleicos que codifican el epítopo.

Los epítopos del péptido HTL también pueden ser modificados para cambiar sus propiedades biológicas. Por ejemplo, pueden ser modificados para incluir D-aminoácidos para aumentar su resistencia frente a las proteasas y así ampliar su semivida en suero, o pueden ser conjugados a otras moléculas tales como lípidos, proteínas, carbohidratos, y similares para aumentar su actividad biológica. Por ejemplo, un péptido T auxiliar puede ser conjugado a una o varias cadenas de ácido palmítico en los extremos carboxilo- o amino-terminal.

X. C. 3. Combinaciones de péptidos que estimulan a CTL con agentes cebadores de linfocitos T

En algunas realizaciones puede ser deseable incluir en las composiciones farmacéuticas de la invención al menos un componente que ceba linfocitos B o linfocitos T. Los lípidos han sido identificados como agentes capaces de cebar CTL in vivo. Por ejemplo, pueden ser unidos residuos de ácido palmítico a los grupos \varepsilon- y \alpha-amino de un residuo de lisina y luego unirse, por ejemplo, vía uno o varios residuos de unión tales como Gly, Gly-Gly-, Ser, Ser-Ser, o similares, a un péptido inmunogénico. El péptido lipidado puede ser administrado entonces directamente en una micela o partícula, incorporado en un liposoma, o emulsionado en un adyuvante, por ejemplo, adyuvante de Freund incompleto. En una realización preferida, una composición inmunogénica particularmente eficaz comprende el ácido palmítico unido a los grupos \varepsilon- y \alpha-amino de Lys, que se une vía el enlace, por ejemplo, Ser-Ser, al extremo amino-terminal del péptido inmunogénico.

Como otro ejemplo de cebadura de lípidos de las respuestas de CTL, pueden ser usadas lipoproteínas de E. coli, tales como la tripalmitoil-S-glicerilcisteinliseril-serina (P_{3}CSS) para cebar el virus de CTL específico cuando se une covalentemente a un péptido apropiado (véase, por ejemplo, Deres, et al., Nature 342: 561,1989). Los péptidos de la invención pueden ser acoplados a P_{3}CSS, por ejemplo, y el lipopéptido administrado a un individuo para cebar específicamente una respuesta inmune al antígeno diana. Además, porque la inducción de neutralizar anticuerpos también puede ser cebada con epítopos conjugados de P_{3}CSS, dos tales composiciones pueden ser combinadas para producir más eficazmente tanto respuestas humorales como mediadas por células.

X. C. 4. Composiciones de vacuna que comprenden DC pulsado con péptidos que estimulan a CTL y/o HTL

Una realización de una composición de vacuna conforme a la invención comprende la administración ex vivo de un cóctel de péptidos portadores de epítopo a PBMC, o el DC aislado a partir de esto, de la sangre del paciente. Puede usarse un producto farmacéutico para facilitar la recuperación de DC, tal como Progenipoietint® (Pharmacia-Monsanto, San Louis, MO) o GM-CSF/IL-4. Después de pulsar DC con péptidos y antes de la reinfusión en pacientes, el DC se lava para eliminar los péptidos desunidos. En esta realización, una vacuna comprende los DC pulsados por péptido que presentan los epítopos de péptido pulsados complejados con moléculas de HLA en sus superficies.

El DC puede ser pulsado ex vivo con un cóctel de péptidos, algunos de los cuales estimulan las respuestas de CTL frente a 85P1B3. Opcionalmente, un péptido de linfocitos T auxiliares (HTL), tal como un péptido de HLA Clase II restringido natural o artificial suelto, puede ser incluido para facilitar la respuesta de CTL. Así, una vacuna conforme a la invención se usa para tratar un cáncer que expresa o sobreexpresa 85P1B3.

X. D. Inmunoterapia adoptiva

Se usan péptidos relacionados con 85P1B3 antigénicos para producir una respuesta de CTL y/o HTL ex vivo, también. Las células de CTL o HTL resultantes, pueden ser usadas para tratar tumores en pacientes que no responden a otras formas convencionales de terapia, o no responderán a un péptido de vacuna terapéutico o ácido nucleico conforme a la invención. Las respuestas de CTL o HTL ex vivo frente a un antígeno particular son inducidas incubando en el cultivo de tejido las células precursoras de CTL o HTL del paciente, o genéticamente compatibles, junto con una fuente de células que presentan antígeno (APC), tales como células dendríticas, y el péptido inmunogénico apropiado. Después de un tiempo de incubación apropiado (típicamente aproximadamente 7-28 días), en el que las células precursoras son activadas y ampliadas en células efectoras, las células son administradas por reinfusión en el paciente, donde destruirán (CTL) o facilitarán la destrucción (HTL) de su célula diana específica (por ejemplo, una célula tumoral). También pueden ser usadas células dendríticas transfectadas como células que presentan antígenos.

X. E. Administración de vacunas para dianas terapéuticas o profilácticas

Las composiciones farmacéuticas y de vacuna de la invención típicamente son usados para tratar y/o prevenir un cáncer que expresa o sobreexpresa 85P1B3. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones de péptidos y/o ácidos nucleicos son administradas a un paciente en una cantidad suficiente para producir una respuesta de CTL y/o HTL de células B eficaz, frente al antígeno y curar o al menos parcialmente detener o reducir los síntomas y/o las complicaciones. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como "dosis terapéuticamente eficaz". Las cantidades eficaces para este uso dependerán, por ejemplo, de la composición particular administrada, la manera de administración, la etapa y severidad de la enfermedad que se trate, el peso y el estado general de salud del paciente y el juicio del médico que prescribe.

Para composiciones farmacéuticas, los péptidos inmunogénicos de la invención, o el ADN que los codifica, generalmente son administradas a un individuo que sufre un tumor que expresa 85P1B3. Los péptidos o el ADN que los codifica pueden ser administrados individualmente o como fusiones de una o varias secuencias de péptido. Los pacientes pueden ser tratados con los péptidos inmunogénicos separadamente o junto con otros tratamientos, tales como cirugía, cuando sea apropiado.

Para el uso terapéutico, la administración generalmente debería comenzar en el primer diagnóstico del cáncer asociado a 85P1B3. Esto es seguido por el refuerzo de la dosis hasta que al menos los síntomas son sustancialmente disminuidos y durante un período a partir de entonces. La realización de la composición de vacuna (es decir, incluyendo, pero no limitado a realizaciones tales como cócteles de péptido, polipéptidos poliepitópicos, minigenes, o CTL específicos de TAA o células dendríticas pulsadas) suministrada al paciente puede variar de acuerdo con la etapa de la enfermedad o el estado de salud del paciente. Por ejemplo, en un paciente con un tumor que expresa 85P1B3, una vacuna que comprende CTL específico de 85P1B3 puede ser más eficaz en la muerte de células tumorales en el paciente con la enfermedad avanzada que las realizaciones alternativas.

Es generalmente importante proporcionar una cantidad del epítopo del péptido suministrado por un modo de administración suficiente para estimular eficazmente una respuesta de linfocitos T citotóxica; también se pueden proporcionar composiciones que estimulan las respuestas de linfocitos T auxiliares conforme a esta realización de la invención.

La dosificación para una inmunización terapéutica inicial generalmente ocurre en un intervalo de dosificación unitaria en el que el valor inferior es aproximadamente 1, 5, 50, 500 ó 1,000 \mug y el valor más alto es aproximadamente 10.000; 20.000; 30.000 ó 50.000 \mug. Los valores de dosificación para un intervalo típicamente humano de aproximadamente 500 \mug a aproximadamente 50.000 \mug por 70 paciente de kilogramos. Las dosificaciones de refuerzo de entre aproximadamente 1,0 \mug a aproximadamente 50.000 \mug de péptido de conformidad con un régimen de refuerzo a lo largo de semanas a meses pueden ser administradas dependiendo de la respuesta del paciente y la condición como se determina midiendo la actividad específica de CTL y HTL obtenidos de la sangre del paciente. La administración debe seguir hasta que al menos los síntomas clínicos o las pruebas de laboratorio indiquen que la neoplasia ha sido eliminada o reducida y durante un período a partir de éste. Las dosificaciones, las rutas de administración y programas de dosis son ajustadas conforme a las metodologías conocidas en la técnica.

En ciertas realizaciones, los péptidos y las composiciones de la presente invención son empleados en estados de enfermedad serios, es decir situaciones con amenaza de vida o que potencialmente amenazan de vida. En tales casos, como consecuencia de las cantidades mínimas de sustancias extrañas y la naturaleza relativa no tóxica de los péptidos en las composiciones preferidas de la invención, es posible y puede ser entendido como deseable por el médico que trata administrar excesos sustanciales de estas composiciones peptídicas en relación con estas cantidades de dosificación indicadas.

Las composiciones de vacuna de la invención también pueden ser usadas puramente como agentes profilácticos. Generalmente, la dosificación para una inmunización profiláctica inicial generalmente se da en un intervalo de dosificación unitaria donde el valor inferior es aproximadamente 1, 5, 50, 500 o 1000 \mug y el valor más alto es aproximadamente 10.000, 20.000, 30.000 o 50.000 \mug. Los valores de dosificación para un ser humano están típicamente en el intervalo de aproximadamente 500 \mug a aproximadamente 50.000 \mug por paciente de 70 kilogramos. Esto es seguido reforzando las dosificaciones de entre aproximadamente 1,0 \mug a aproximadamente 50.000 \mug del péptido administrado en intervalos definidos de aproximadamente cuatro semanas a seis meses después de la administración inicial de la vacuna. La inmunogenicidad de la vacuna puede ser evaluada midiendo la actividad específica de CTL y HTL obtenidos a partir de una muestra de sangre del paciente.

Las composiciones farmacéuticas para el tratamiento terapéutico son requeridas para administración parenteral, tópica, oral, nasal, intratecal o local (por ejemplo, como una crema o ungüento tópico). Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas son administradas parenteralmente, por ejemplo, intravenosamente, subcutáneamente, intradermalmente o intramuscularmente. Así, la invención proporciona composiciones para la administración parenteral que comprenden una solución de los péptidos inmunogénicos disueltos o suspendidos en un vehículo aceptable, preferiblemente un vehículo acuoso.

Una variedad de vehículos acuosos puede ser usada, por ejemplo, agua, agua tamponada, solución salina al 0,8%, glicina al 0,3%, ácido hialurónico y otros similares. Estas composiciones pueden ser esterilizadas por técnicas de esterilización convencionales, conocidas, o pueden ser filtradas para su esterilización. Las soluciones acuosas resultantes pueden ser envasadas para su uso como tal, o pueden ser liofilizada, siendo combinada la preparación liofilizada con una solución estéril antes de la administración.

Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables tales como las requeridas para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes de ajuste del pH y agentes tampón, agentes que ajustan la tonicidad, agentes humectantes, conservantes y similares, por ejemplo, acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, monolaurato de sorbitán, oleato de trietanolamina, etc.

La concentración de los péptidos de la invención en las formulaciones farmacéuticas puede variar ampliamente, es decir, de menos aproximadamente de 0,1%, por lo general o al menos aproximadamente el 2% a tanto como del 20% al 50% en peso o más, y será seleccionada principalmente por los volúmenes del fluido, viscosidades, etc., conforme al modo particular de administración seleccionada.

Una forma de dosis unitaria humana de una composición típicamente es incluida en una composición farmacéutica que comprende una dosis unitaria humana de un vehículo aceptable, en una realización un vehículo acuoso, y es administrada en un volumen/cantidad que el experto en la técnica sabe que se usa para la administración de tales composiciones a seres humanos (véase, por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences", 17ª Edición, A. Gennaro, Redactor, Compañía Mack Publishing, Easton, Pensylvania, 1985). Por ejemplo, una dosis del péptido para la inmunización inicial puede tener de aproximadamente 1 a aproximadamente 50.000 \mug, generalmente 100-5.000 \mug, para un paciente de 70 kg. Por ejemplo, para ácidos nucleicos, puede ser realizada una inmunización inicial usando un vector de expresión en la forma de ácido nucleico desnudo administrado IM (o SC o ID) en las cantidades de 0,5-5 mg en múltiples sitios. El ácido nucleico (de 0,1 a 1000 \mug) también puede ser administrado usando una pistola génica. Después de un período de incubación de 3-4 semanas, es administrada entonces una revacunación. El refuerzo puede ser del virus recombinante de la viruela aviar administrado en una dosis de 5x10^{7} a 5x10^{9} pfu. Para los anticuerpos, un tratamiento generalmente implica la administración repetida de la preparación del anticuerpo anti-85P1B3, vía una ruta de administración aceptable tal como la inyección intravenosa (IV), típicamente en una dosis en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 mg/kg peso corporal. En general, las dosis en el intervalo de 10-500 mg de anticuerpo monoclonal por semana son eficaces y bien toleradas. Además, una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg de peso corporal del paciente IV, seguido de dosis semanales de aproximadamente 2 mg/kg IV de la preparación del anticuerpo monoclonal anti-85P1B3 representa un régimen de medicación aceptable. Como apreciado por aquellos de experto en la técnica, varios factores pueden influir en la dosis ideal en un caso particular. Tales factores incluyen, por ejemplo, la semivida de una composición, la afinidad de unión de un anticuerpo monoclonal, la inmunogenicidad de una sustancia, el grado de la expresión de 85P1B3 en el paciente, el grado de cobertura circulante del antígeno 85P1B3, el nivel de concentración en estado estacionario deseado, la frecuencia del tratamiento y la influencia de agentes quimioterapéuticos u otros usados en combinación con el método de tratamiento de la invención, así como el estado de salud del paciente
particular.

En una realización, las formas de dosis unitaria humanas de los polinucleótidos comprenden un intervalo de dosificación adecuado o una cantidad eficaz que proporcione cualquier efecto terapéutico. Como apreciaría cualquier experto ordinario en la técnica el efecto terapéutico depende de un número de factores, incluyendo la secuencia del polinucleótido, el peso molecular del polinucleótido y la ruta de administración. Las dosificaciones son seleccionadas generalmente por el médico u otro profesional de asistencia médica conforme a una variedad de parámetros conocidos en la técnica, tales como la severidad de los síntomas, la historia del paciente y otros similares. Generalmente, para un polinucleótido de aproximadamente 20 bases, el intervalo de dosificación puede ser seleccionado a partir de, por ejemplo, un límite inferior seleccionado por separado tal como de aproximadamente 0,1, 0,25, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 200, 300, 400 o 500 mg/kg hasta un límite superior seleccionado por separado, mayor que el límite inferior, de aproximadamente 60, 80, 100, 200, 300, 400, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 o 10.000 mg/kg. Por ejemplo, una dosis puede ser aproximadamente cualquiera de las siguientes: de 0,1 a 100 mg/kg, de 0,1 a 50 mg/kg, de 0,1 a 25 mg/kg, de 0,1 a 10 mg/kg, de 1 a 500 mg/kg, de 100 a 400 mg/kg, de 200 a 300 mg/kg, de 1 a 100 mg/kg, de 100 a 200 mg/kg, de 300 a 400 mg/kg, de 400 a 500 mg/kg, de 500 a 1000 mg/kg, de 500 a 5000 mg/kg o de 500 a 10.000 mg/kg. Generalmente, las rutas parenterales de administración pueden requerir dosis más altas de polinucleótido comparado con una aplicación más directa al nucleótido al tejido enfermo, como lo hacen los polinucleótidos de longitud creciente.

En una realización, las formas de dosis unitaria humanas de linfocitos T comprenden un intervalo de dosificación adecuado o una cantidad eficaz que proporcione cualquier efecto terapéutico. Como apreciaría cualquier experto ordinario en la técnica, un efecto terapéutico depende de un número de factores. Las dosificaciones son seleccionadas generalmente por el médico u otro profesional de la asistencia médica conforme a una variedad de parámetros conocidos en la técnica, tales como la severidad de los síntomas, la historia del paciente y otros similares. Una dosis puede ser de aproximadamente 10^{4} células a aproximadamente 10^{6} células, de aproximadamente 10^{6} células a aproximadamente 10^{8} células, de aproximadamente 10^{8} a aproximadamente 10^{11} células, o de aproximadamente 10^{8} a aproximadamente 5x10^{10} células. Una dosis también puede ser de aproximadamente 10^{6} células/m^{2} a aproximadamente 10^{10} células/m^{2}, o de aproximadamente 10^{6} células/m^{2} a aproximadamente 10^{8} células/m^{2}.

La(s) proteínas(s) de la invención, y/o ácidos nucleicos que codifican la(s) proteína(s), también pueden ser administradas vía liposomas, que también pueden servir para: 1) reconocer la(s) proteínas(s) a un tejido particular, tal como tejido linfoide; 2) reconocer selectivamente a células enfermas 3) aumentar la semivida de la composición del péptido. Los liposomas incluyen emulsiones, espumas, micelas, monocapas insolubles, cristales líquidos, dispersiones de fosfolípidos, capas laminares y otros similares. En estas preparaciones, el péptido que se administra se incorpora como parte del liposoma, solo o junto con una molécula que se una a un receptor frecuente entre las células linfoides, tales como los anticuerpos monoclonales que se unen al antígeno CD45, o con otras composiciones terapéuticas o inmunogénicas. Así, pueden ser dirigidos liposomas enteros o edulcorados con un péptido deseado de la invención al sitio de las células linfoides, de modo que los liposomas entonces se suministran a las composiciones del péptido. Los liposomas para uso conforme a la invención son formados a partir de lípidos formadores de vesículas estándar, que generalmente incluyen fosfolípidos neutros y negativamente cargados y un esterol, tal como el colesterol. La selección de los lípidos generalmente se realiza considerando, por ejemplo, el tamaño del liposoma, la labilidad ácida y la estabilidad de los liposomas en la circulación sanguínea. Una variedad de métodos está disponible para preparar liposomas, como se describe, por ejemplo, en Szoka, et al., Ana. Rev. Biophys. Bioeng. 9: 467 (1980), y las patentes de EE.UU. N^{os}. 4.235.871, 4.501.728, 4.837.028, y 5.019.369.

Para reconocer las células del sistema inmunológico, un ligando que se incorpore en el liposoma puede incluir, por ejemplo, anticuerpos o sus fragmentos específicos para los determinantes de superficie de la célula de las células del sistema inmunológico deseadas. Una suspensión de liposomas que contiene un péptido puede ser administrada intravenosamente, localmente, tópicamente, etc. en una dosis variable de acuerdo con, entre otras cosas, el modo de administración, el péptido que se administre y la etapa de la enfermedad que esté siendo tratada.

Para las composiciones sólidas, pueden usarse vehículos sólidos no tóxicos convencionales que incluyen, por ejemplo, calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio y otros similares. Para la administración oral, una composición farmacéuticamente no tóxica aceptable es formada incorporando cualquiera de los excipientes normalmente empleados, como los vehículos antes mencionados, y generalmente el 10-95% del ingrediente activo, es decir uno o varios péptidos de la invención, y más preferiblemente a una concentración de 25%-75%.

Para la administración por aerosol, los péptidos inmunogénicos son suministrados preferiblemente en una forma finamente dividida con un tensioactivo y propulsor. Los porcentajes típicos de péptidos tienen aproximadamente 0,01%-20% en peso, preferiblemente aproximadamente 1% -10%. El tensioactivo, por supuesto, no debe ser tóxico, y preferiblemente debe ser soluble en el propulsor. Son representativos de tales agentes ésteres o ésteres parciales de ácidos grasos que contienen de aproximadamente 6 a 22 átomos de carbono, tales como los ácidos caproico, octanoico, laurico, palmítico, esteárico, linoleico, linolenico, olesterico y oleicos con un alcohol alifático polihídrico o su anhídrido cíclico. Pueden ser empleados ésteres mixtos, tales como glicéridos mixtos o naturales. El tensioactivo puede constituir de aproximadamente 0,1% - 20% en peso de la composición, preferiblemente aproximadamente 0,25-5%. El equilibrio de la composición es generalmente por propulsor. También puede ser incluido un vehículo, cuando sea deseado, tal como, por ejemplo, con lecitina para la administración intranasal.

XI.) Realizaciones diagnósticas y pronósticas de 85P1B3

Como se describe en este documento, los polinucleótidos de 85P1B3, polipéptidos, linfocitos T citotóxicos (CTL) reactivos, linfocitos T auxiliares (HTL) reactivos y anticuerpos antipolipéptidos son usados en ensayos diagnósticos, pronósticos y terapéuticos conocidos que examinan las condiciones asociadas con el crecimiento de células desregulado tal como el cáncer, en particular los cánceres mencionados en la Tabla I (véase, por ejemplo, tanto su modelo específico de expresión en tejidos así como su sobreexpresión en ciertos cánceres como se describe, por ejemplo, en el Ejemplo 4).

85P1B3 puede ser convertido en un análogo frente a un antígeno asociado a la próstata (PSA), el marcador arquetípico que ha sido usado por médicos durante años para identificar y monitorizar la presencia del cáncer de próstata (véase, por ejemplo, Merrill et al., J. Urol. 163 (2): 503-5120 (2000); Polascik et al., J. Urol. Aug; 162 (2): 293-306 (1999) y Fortier et al., J. Nat. Cancer Inst. 91 (19): 1635-1640 (1999)). Una variedad de otros marcadores diagnósticos también es usada en contextos similares incluyendo p53 y K-ras (véase, por ejemplo, Tulchinsky et al., Int J Mol Med, 4 de julio de 1999 (1): 99-102 y Minimoto et al., Cancer Detect Prev 2000; 24 (1): 1-12). Por lo tanto, esta descripción de los polinucleótidos de 85P1B3 y polipéptidos (así como las sondas del polinucleótido de 85P1B3 y anticuerpos anti-85P1B3 usados para identificar la presencia de estas moléculas) y sus propiedades permiten a los expertos en la técnica utilizar estas moléculas en los métodos que son análogos a los usados, por ejemplo, en una variedad de ensayos diagnósticos dirigidos al examen de las condiciones asociadas con el cáncer.

Las realizaciones típicas de los métodos diagnósticos que utilizan los polinucleótidos de 85P1B3, polipéptidos, linfocitos T reactivos y anticuerpos son análogas a métodos de ensayos diagnósticos bien establecidos que emplean, por ejemplo, polinucleótidos PSA, polipéptidos, linfocitos T reactivos y anticuerpos.

Por ejemplo, justo como los polinucleótidos PSA son usados como sondas (por ejemplo, en análisis Northern, véase, por ejemplo, Sharief et al., Biochem. Mol. Biol. Int. 33 (3): 567-74 (1994)) y cebadores (por ejemplo, en análisis PCR, véase, por ejemplo, Okegawa et al., J. Urol. 163 (4): 1189-1190 (2000)) para observar la presencia y/o el nivel de los mARN de PSA en métodos para monitorizar la sobreexpresión de PSA o la metástasis de cánceres de próstata, los polinucleótidos de 85P1B3 descritos en este documento pueden ser utilizados de la misma manera para detectar la sobreexpresión de 85P1B3 o la metástasis de próstata y otros cánceres que expresan este gen. De forma alternativa, justo como los polipéptidos PSA son usados para generar anticuerpos específicos para PSA que entonces pueden ser usado para observar la presencia y/o el nivel de proteínas PSA en métodos para monitorizar la sobreexpresión de la proteína PSA (véase, por ejemplo, Stephan et al., Urology 55 (4): 560-3 (2000)) o la metástasis de células de próstata (véase, por ejemplo, Alanen et al., Pathol. Res. Pract. 192 (3): 233-7 (1996)), los polipéptidos 85P1B3 descritos en este documento pueden ser utilizados para generar anticuerpos para su uso en la detección de la sobreexpresión de 85P1B3 o la metástasis de células de próstata y células de otros cánceres que expresan este gen.

Específicamente, debido a que la metástasis implica el movimiento de células cancerígenas de un órgano de origen (tal como el pulmón o la próstata, etc.) a una zona diferente del cuerpo (tal como un nodo de linfa), los ensayos que examinan una muestra biológica para detectar la presencia de células que expresan los polinucleótidos de 85P1B3 y/o polipéptidos pueden ser usados para proporcionar pruebas de metástasis. Por ejemplo, cuando una muestra biológica del tejido que normalmente no contiene células que expresan 85P1B3 (un nodo de linfa) se encuentra que contiene células que expresan 85P1B3 tal como la expresión de 85P1B3 vista en LAPC4 Y LAPC9, los xenoinjertos aislados del nodo de linfa y la metástasis ósea, respectivamente, son indicativos de metástasis.

De forma alternativa, los polinucleótidos de 85P1B3 y/o polipéptidos pueden ser usados para proporcionar pruebas de cáncer, por ejemplo, cuando las células en una muestra biológica que normalmente no expresa 85P1B3 o expresa 85P1B3 a un nivel diferente se encuentra que expresan 85P1B3 o tienen una mayor expresión de 85P1B3 (véase, por ejemplo, la expresión de 85P1B3 en los cánceres mencionados en la Tabla I y en muestras del paciente etc. mostrado en las Figuras que acompañan). En tales ensayos, los expertos pueden desearse que generen además pruebas suplementarias de metástasis por el análisis de la muestra biológica para detectar la presencia de un segundo marcador restringido de tejido (además de 85P1B3) tal como PSA, PSCA etc. (véase, por ejemplo, Alanen et al., Pathol. Res. Pract. 192 (3): 233-237 (1996)).

Justo como son empleados los fragmentos de polinucleótido de PSA y variantes de polinucleótido por los expertos en la técnica para su uso en los métodos de monitorización de PSA, fragmentos de polinucleótido de 85P1B3 y variantes del polinucleótido son usados de una manera análoga. En particular, los polinucleótidos de PSA típicos usados en los métodos para monitorizar PSA son sondas o cebadores que consisten en los fragmentos de la secuencia de cDNA de PSA. Ilustrando esto, los cebadores usados para amplifica por PCR un polinucleótido de PSA deben incluir menos que toda la secuencia de PSA para funcionar en la reacción en cadena de la polimerasa. En el contexto de tales reacciones PCR, los expertos en la técnica generalmente crean una variedad de fragmentos del polinucleótido diferentes que pueden ser usados como cebadores para amplificar las diferentes partes de un polinucleótido de interés u optimizar las reacciones de amplificación (véase, por ejemplo, Caetano Anolles, G. Biotechniques 25 (3): 472-476, 478-480 (1998); Robertson et al., Methods Mol. Biol. 98:121-154 (1998)). Una ilustración adicional del uso de tales fragmentos es proporcionada en el Ejemplo 4, donde un fragmento del polinucleótido de 85P1B3 se usa como una sonda para mostrar la expresión de los ARN de 85P1B3 en células cancerígenas. Además, las secuencias del polinucleótido de la variante típicamente son usadas como cebadores y sondas para los mARN correspondientes en PCR y análisis Northern (véase, por ejemplo, Sawai et al., Fetal Diagn. Ther., 11 de diciembre-noviembre de 1996 (6): 407-13 y "Current Protocols In Molecular Biology", Volumen 2, Unidad 2, ed. Frederick M. Ausubel., 1995)). Los fragmentos de polinucleótido y variantes son útiles en este contexto cuando son capaces de unirse a una secuencia de polinucleótido diana (por ejemplo, el polinucleótido de 85P1B3 mostrado en la SEQ ID NO: 701) en condiciones de alta severidad.

Además, los polipéptidos de PSA que contienen un epítopo que puede ser reconocido por anticuerpos o linfocitos T que se une específicamente a aquel epítopo son usados en los métodos para monitorizar PSA. Los fragmentos del polipéptido de 85P1B3 y análogos del polipéptido o variantes también pueden ser usados de una manera análoga. Esta práctica de usar fragmentos del polipéptido o variantes del polipéptido para generar anticuerpos (tales como anticuerpos anti-PSA o linfocitos T) es típica en la técnica usándose una amplia variedad de sistemas tales como proteínas de fusión por los médicos (véase, por ejemplo, "Current Protocols In Molecular Biology", Volumen 2, Unidad 16, ed. Frederick M. Ausubel., 1995). En este contexto, cada epítopo(s) funciona para proporcionar una arquitectura con la cual los anticuerpos o linfocitos T son reactivos. Típicamente, los expertos en la técnica crean una variedad de fragmentos de polipéptidos diferentes que pueden ser usados para generar respuestas inmunes específicas para diferentes partes de un polipéptido de interés (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. Nº. 5.840.501 y la patente de EE.UU. Nº. 5.939.533). Por ejemplo, puede ser preferible utilizar un polipéptido que comprenda uno de los motivos biológicos de 85P1B3 discutidos en este documento o una subsecuencia que lleve el motivo que se identifica fácilmente por cualquier experto en la técnica basado en los motivos disponibles en la técnica. Los fragmentos de polipéptido, las variantes o los análogos son típicamente útiles en este contexto siempre que comprendan un epítopo capaz de generar anticuerpos o linfocitos T específicos para una secuencia del polipéptido diana de la Figura 2.

Como se muestra en este documento, los polinucleótidos de 85P1B3 y polipéptidos (así como las sondas del polinucleótido de 85P1B3 y anticuerpos anti-85P1B3 o linfocitos T usados para identificar la presencia de estas moléculas) exhiben propiedades específicas que los hacen útiles en el diagnóstico de cánceres tales como los mencionados en la Tabla I. Los ensayos diagnósticos que miden la presencia de productos génicos de 85P1B3, para evaluar la presencia o el inicio de una condición de enfermedad descrita en este documento, tal como el cáncer de próstata, son usados para identificar a pacientes para aplicar medidas preventivas o monitorizar además, como ha sido hecho tan satisfactoriamente con PSA. Además, estos materiales satisfacen una necesidad en la técnica para moléculas que tienen características similares o complementarias a PSA en situaciones en las que, por ejemplo, un diagnóstico definido de la metástasis de origen prostático no puede ser hecha en base de una prueba para PSA solo (véase, por ejemplo, Alanen et al., Pathol. Res. Pract. 192 (3): 233237 (1996)), y por consiguiente, materiales tales como polinucleótidos de 85P1B3 y polipéptidos (así como las sonda del polinucleótido de 85P1B3 y los anticuerpos anti-85P1B3 usados para identificar la presencia de estas moléculas) deben ser empleados para confirmar la metástasis de origen prostático.

Finalmente, además de su uso en ensayos diagnósticos, los polinucleótidos de 85P1B3 descritos en este documento tienen un número de otras utilidades tales como su uso en la identificación de anormalidades cromosómicas asociadas a la oncogenética en la región cromosómica en la cual el gen de 85P1B3 se mapea (véase el Ejemplo 3 más abajo). Incluso, además de su uso en ensayos diagnósticos, las proteínas relacionadas con 85P1B3 y los polinucleótidos descritos en este documento tienen otras utilidades como su uso en análisis forenses de tejidos de origen desconocido (véase, por ejemplo, Takahama K Forensic Sci Int, 28 de junio de 1996; 80 (1-2): 63-9).

Además, las proteínas relacionadas con 85P1B3 o polinucleótidos de la invención pueden ser usados para tratar una condición patológica caracterizada por la sobreexpresión de 85P1B3. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos de la Figura 2 o la Figura 3, o los fragmentos de ambos, pueden ser usados para generar una respuesta inmune frente al antígeno 85P1B3. Los anticuerpos u otras moléculas que reaccionan con 85P1B3 pueden ser usadas para modular la función de esta molécula, y así proporcionar una ventaja terapéutica.

XII.) Inhibición de la función de la proteína 85P1B3

La invención incluye varios métodos y composiciones para inhibir la unión de 85P1B3 a su pareja de unión o su asociación con otra(s) proteína(s) así como métodos para inhibir la función de 85P1B3.

XII. A.) Inhibición de 85P1B3 con anticuerpos intracelulares

En un enfoque, un vector recombinante que codifica anticuerpos de cadena sencilla que se unen específicamente a 85P1B3 es introducido en células que expresan 85P1B3 vía tecnologías de transferencia génica. En consecuencia, el anticuerpo anti-85P1B3 de cadena sencilla codificado se expresa intracelularmente, se une a la proteína 85P1B3, y así inhibe su función. Se conocen métodos para modificar genéticamente tales anticuerpos de cadena sencilla intracelulares. Tales anticuerpos intracelulares, también conocidos como "intracuerpos", son reconocidos específicamente frente a un compartimiento particular dentro de la célula, proporcionando control donde es centrada la actividad inhibitoria del tratamiento. Esta tecnología ha sido satisfactoriamente aplicada en la técnica (para una revisión, véase Richardson y Marasco, 1995, TIBTECH vol. 13). Se han mostrado intracuerpos para eliminar prácticamente de otra manera la expresión de receptores de superficie de célula abundantes (véase, por ejemplo, Richardson et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 3137-3141; Beerli et al., 1994, J. Biol. Chem. 289: 23931-23936; Deshane et al., 1994, Gene Ther. 1: 332-337).

Los anticuerpos de cadena sencilla comprenden los dominios variables de la cadena ligera y pesada unida por un polipéptido del enlazante flexible, y son expresados como un polipéptido solo. Opcionalmente, los anticuerpos de cadena sencilla son expresados como un fragmento de la región variable de cadena sencilla unido a la región constante de la cadena ligera. Las señales de tráfico intracelular conocidas son genéticamente manipuladas en vectores del polinucleótido recombinante que codifican tales anticuerpos de cadena sencilla para reconocer con precisión el intracuerpo frente al compartimiento intracelular deseado. Por ejemplo, los intracuerpos reconocidos en el retículo endoplásmico (ER) son genéticamente modificados para incorporar un péptido líder y, opcionalmente, una señal de retención de ER del extremo C-terminal, tal como el motivo del aminoácido KDEL. Los intracuerpos que se pretende que ejerzan actividad en el núcleo son genéticamente modificados para incluir una señal de localización nuclear. Los restos lipídicos son unidos a intracuerpos para unir el intracuerpo al lado citosólico de la membrana celular. Los intracuerpos también pueden ser reconocidos para ejercer su función en el citosol. Por ejemplo, los intracuerpos citosólicos son
usados para secuestrar factores dentro del citosol, impidiéndoles así transportarse a su destinación celular natural.

En una realización, son usados intracuerpos para capturar 85P1B3 en el núcleo, previniendo así su actividad dentro del núcleo. Las señales de reconocimiento nucleares son manipuladas genéticamente en tales intracuerpos de 85P1B3 para alcanzar el reconocimiento deseado. Tales intracuerpos de 85P1B3 son diseñados para unirse específicamente a un dominio de 85P1B3 particular. En otra realización, los intracuerpos citosólicos que se unen específicamente a la proteína 85P1B3 son usados para impedir que 85P1B3 entre en el núcleo, impidiéndole así ejercer cualquier actividad biológica dentro del núcleo (por ejemplo, previniendo que 85P1B3 forme complejos de transcripción con otros factores).

Para dirigir específicamente la expresión de tales intracuerpos a células particulares, la transcripción del intracuerpo se coloca bajo el control regulador de un promotor y/o potenciador específico de tumor apropiado. Para reconocer la expresión del intracuerpo específicamente en la próstata, por ejemplo, el promotor PSA y/o el promotor/potenciador pueden ser utilizados (Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. Nº. 5.919,652 publicada el 6 de julio de 1999).

XII. B.) Inhibición de 85P1B3 con proteínas recombinantes

En otro enfoque, las moléculas recombinantes se unen a 85P1B3 y así inhiben la función de 85P1B3. Por ejemplo, estas moléculas recombinantes impiden o inhiben que 85P1B3 tenga entrada/se una a su pareja(s) de unión o que se asocie a otra(s) proteína(s). Tales moléculas recombinantes, por ejemplo, pueden contener parte(s) reactiva(s) de una molécula de anticuerpo específica de 85P1B3. En una realización particular, el dominio de unión de 85P1B3 de una pareja de unión de 85P1B3 es manipulada genéticamente en una proteína de fusión dimérica, por la cual la proteína de fusión comprende dos dominios de unión del ligando de 85P1B3 unido a la parte Fc de una IgG humana, tal como IgG1 humana. Tal parte de IgG puede contener, por ejemplo, los dominios C_{H}2 y C_{H}3 y la región de ancladura, pero no el dominio de C_{H}1. Tales proteínas de fusión diméricas son administradas en una forma soluble a pacientes que sufren de un cáncer asociado con la expresión de 85P1B3, por la cual la proteína de fusión dimérica se une específicamente a 85P1B3 y bloquea la interacción de 85P1B3 con una pareja de unión. Tales proteínas de fusión dimérica son combinadas después en proteínas multiméricas usando tecnologías de unión de anticuerpos conocidas.

XII. C.) Inhibición de la transcripción o la traducción de 85P1B3

La presente invención también comprende varios métodos y composiciones para inhibir la transcripción del gen de 85P1B3. Asimismo, la invención también proporciona métodos y composiciones para inhibir la traducción del mARN de 85P1B3 en la proteína.

En un enfoque, un método para inhibir la transcripción del gen de 85P1B3 comprende poner en contacto el gen de 85P1B3 con un polinucleótido de 85P1B3 antisentido. En otro enfoque, un método para inhibir la traducción del mARN de 85P1B3 comprende poner en contacto el mARN de 85P1B3 con un polinucleótido antisentido. En otro enfoque, un ribozima específico de 85P1B3 se usa para dividir el mensaje de 85P1B3, inhibiendo así la traducción. Tales métodos basados en ribozimas y antisentido también pueden ser dirigidos a las regiones reguladoras del gen de 85P1B3, tales como los elementos potenciadores y/o promotores de 85P1B3. Asimismo, las proteínas capaces de inhibir un factor de transcripción génico de 85P1B3 son usadas para inhibir transcripción del mARN de 85P1B3. Varios polinucleótidos y composiciones útiles en los métodos anteriormente mencionados han sido descritos previamente. El uso de moléculas ribozimas y antisentido para inhibir la transcripción y la traducción es conocido en la técnica.

Otros factores que inhiben la transcripción de 85P1B3 interfiriendo con la activación transcripcional de 85P1B3 son también útiles para tratar cánceres que expresan 85P1B3. Asimismo, los factores que interfieren con el tratamiento de 85P1B3 son útiles para tratar los cánceres que expresan 85P1B3. Los métodos de tratamiento del cáncer que utilizan tales factores están también en la amplitud de la invención.

XII. D.) Consideraciones generales para estrategias terapéuticas

Las tecnologías de transferencia génica y terapia génicas pueden ser usadas para administrar moléculas de polinucleótido terapéuticas a células tumorales que sintetizan 85P1B3 (es decir, antisentido, ribozima, polinucleótidos que codifican intracuerpos y otras moléculas 85P1B3 inhibitorias). Se conoce un número de posibilidades terapéuticas génicas en la técnica. Los vectores recombinantes que codifican los polinucleótidos de 85P1B3 antisentido, ribozimas, factores capaces de interferir con la transcripción de 85P1B3, etcétera, etcétera, pueden ser suministrados a células tumorales diana usando tales posibilidades de terapia génica.

Las posibilidades terapéuticas anteriores pueden ser combinadas con cualquiera de una amplia variedad de regímenes quirúrgicos, quimioterapia o radioterapia. Las posibilidades terapéuticos de la invención pueden permitir el uso de dosificaciones reducidas de quimioterapia (u otras terapias) y/o la administración menos frecuente, una ventaja para todos los pacientes y particularmente para los que no toleran bien la toxicidad del agente quimioterapéutico.

La actividad antitumoral de una composición particular (por ejemplo, antisentido, ribozima, intracuerpo), o una combinación de tales composiciones, puede ser evaluada usando varios sistemasde análisis in vitro e in vivo. Los ensayos in vitro que evalúan la actividad terapéutica incluyen ensayos de crecimiento de células, ensayos de agar suaves y otros ensayos indicativos de la actividad promotora de tumores, ensayos de unión capaces de determinar el grado al cual una composición terapéutica inhibirá la unión de 85P1B3 a una pareja de unión, etc.

In vivo, el efecto de una composición terapéutica de 85P1B3 puede ser evaluado en un modelo animal adecuado.

Por ejemplo, pueden ser usados modelos de cáncer de próstata xenogénicos, en los que son introducidos explantes de cáncer de próstata humano o tejidos de xenoinjerto pasados en animales inmuno-deprimidos, tales como ratones desnudos o SCID (Klein et al., 1997, Nature Medicine 3: 402-408). Por ejemplo, la solicitud de patente PCT W098/16628, Sawyers et al., publicada el 23 de abril de 1998, describe varios modelos de xenoinjerto de cáncer de próstata humano capaz de recapitular el desarrollo de tumores primarios, micrometástasis y la formación de características de metástasis osteoblástica de la enfermedad en etapa tardía. La eficacia puede ser predicha usando ensayos que miden la inhibición de la formación de tumores, la regresión del tumor o la metástasis, y otros similares. Los ensayos in vivo que evalúan la promoción de la apoptosis son útiles en la evaluación de composiciones terapéuticas. En una realización, los xenoinjertos de ratones portadores de tumor tratados con la composición terapéutica pueden ser examinados por la presencia de focos apoptóticos y pueden ser comparados con ratones portadores del xenoinjerto de control no tratado. El grado en el cual los focos apoptóticos son encontrados en los tumores de los ratones tratados proporciona una indicación de la eficacia terapéutica de la composición.

Las composiciones terapéuticas usadas en la práctica de los métodos precedentes pueden ser formuladas en composiciones farmacéuticas que comprenden a un vehículo adecuado para el método de administración deseado. Los vehículos adecuados incluyen cualquier material que, cuando se combina con la composición terapéutica, conserve la función antitumoral de la composición terapéutica y que es generalmente no reactivo con el sistema inmunológico del paciente. Los ejemplos incluyen, pero no están limitados a, cualquiera de un número de vehículos farmacéuticos estándar tales como soluciones salinas tamponadas de fosfato estéril, agua bacteriostática y similares (véase, generalmente, "Remington's Pharmaceutical Sciences", 16 ed., A. Osal., ed., 1980).

Pueden ser solubilizadas y administradas formulaciones terapéuticas vía cualquier ruta capaz de administrar la composición terapéutica al sitio tumoral. Las rutas potencialmente eficaces de administración incluyen, pero no están limitadas a intravenosa, parenteral, intraperitoneal, intramuscular, intratumoral, intradérmica, intraórgano, ortotópico, y otros similares. Una formulación preferida para la inyección intravenosa comprende la composición terapéutica en una solución de agua bacteriostática conservada, agua no conservada estéril y/o diluida en poli(cloruro de vinilo) o bolsas de polietileno que contienen cloruro de sodio estéril para inyección al 0,9%, USP. Las preparaciones proteicas terapéuticas pueden ser liofilizados y almacenados como polvos estériles, preferiblemente bajo el vacío, y luego ser reconstituidas en agua bacteriostática (conteniendo, por ejemplo, un conservante de alcohol bencílico) o en agua estéril antes de la inyección.

Las dosificaciones y protocolos de administración para el tratamiento de cánceres usando los métodos precedentes variarán con el método y el cáncer diana, y generalmente dependerán de un número de otros factores apreciados en la técnica.

XIII.) Kits

Para el uso en las aplicaciones diagnósticas y terapéuticas descritas en este documento, los kits están también en la amplitud de la invención. Tales kits pueden comprender a un vehículo, paquete o recipiente que se compartimenta para recibir uno o varios recipientes tales como viales, tubos y similares, cada uno del(de los) recipiente(s) que comprenden uno de los elementos separados que se usan en el método. Por ejemplo, el(los) recipiente(s) puede(n) comprender una sonda que es o puede(n) ser marcado(s) detectablemente. Tal sonda puede ser un anticuerpo o polinucleótido específico para una proteína relacionada con 85P1B3 o un gen de 85P1B3 o mensaje, respectivamente. Cuando el método utiliza la hibridación de ácidos nucleicos para detectar el ácido nucleico diana, el kit también puede tener recipientes que contienen el(los) nucleótido(s) para la amplificación de la secuencia de ácido nucleico diana y/o un recipiente que comprende un medio reportero, tal como una proteína de unión de biotina, tal como avidina o estreptavidina, unida a una molécula reportera, tal como un marcador enzimático, fluorescente o de radioisótopo. El kit puede incluir todo o parte de la secuencia de aminoácidos de la Figura 2 o la Figura 3 o sus análogos, o las moléculas de ácidos nucleicos que codifican tales secuencias de aminoácidos.

El kit de la invención comprenderá típicamente el recipiente descrito anteriormente y uno o varios otros recipientes que comprenden los materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringuillas e insertos de paquete con instrucciones de uso.

Un marcador puede estar presente en el recipiente para indicar que la composición se usa para una terapia específica o aplicación no terapéutica, y también puede indicar direcciones para el uso in vivo o in vitro, como los descritos ante-
riormente. Las directrices y/u otra información también pueden ser incluidas en un prospecto que se incluye en el kit.

Ejemplos

Varios aspectos de la invención son descritos además e ilustrados mediante los diversos ejemplos que siguen.

Ejemplo 1 Aislamiento generado de SSH de un fragmento de cDNA del gen de 85P1B3

Para aislar genes que están implicados en la progresión del cáncer de próstata dependiente de andrógeno (AD) al cáncer independiente de andrógeno (AI), los inventores llevaron a cabo un experimento con el xenoinjerto de AD de LAPC-4 en ratones de SCID masculinos. Ratones que albergaban xenoinjertos de AD de LAPC-4 fueron castrados cuando los tumores alcanzaron un tamaño de 1 cm de diámetro. Los tumores se reducieron en tamaño y se paró temporalmente produciendo la proteína dependiente de andrógeno PSA. De siete a catorce días después de la castración, fueron detectables de nuevo niveles de PSA en la sangre de los ratones. Eventualmente los tumores desarrollaron un fenotipo AI y comenzaron a crecer de nuevo en los machos castrados. Los tumores fueron recuperados en puntos de tiempo diferentes después de la castración para identificar los genes que son activados o desactivados durante la transición a la independencia de andrógenos.

EL gen 85P1B3 fue derivado de un AD de LAPC-4 (3 días después de la castración) menos la substracción de AD de LAPC-4. La secuencia de ADN de SSH de 319 bp (Figura 1) es un fragmento del gen 5 de la proteína que interacciona de Opa (OIP-5).

Materiales y métodos Xenoinjertos de LAPC y tejidos humanos

Fueron obtenidos xenoinjertos de LAPC del Doctor Charles Sawyers (UCLA) y fueron generados como se describe (Klein et al., 1997, Nature Med. 3: 402-408; Craft et al., 1999, Cancer Res. 59: 5030-5036). Los xenoinjertos de AD y AI de LAPC-4 dependientes e independientes de andrógenos fueron cultivados en ratones SCID machos y fueron pasados como pequeños pedazos de tejido en los machos receptores. Fueron derivados xenoinjertos de AI de LAPC-4 de tumores de AD de LAPC-4, respectivamente. Para generar los xenoinjertos de AI, los ratones machos que presentaban los tumores de AD fueron castrados y mantenidos durante 2-3 meses. Después de que los tumores crecieron de nuevo, los tumores fueron recuperados y pasados a machos castrados o a ratones femeninos SCID.

Líneas celulares

Fueron obtenidas líneas celulares humanas (por ejemplo, HeLa) del ATCC y fueron mantenidas en DMEM con suero de becerro fetal al 5%.

Aislamiento del ARN

El tejido del tumor y las líneas celulares fueron homogeneizadas en reactivo Trizol (Life Technologies, Gibco BRL) usando 10 ml/g de tejido o 10 ml/10^{8} células para aislar el ARN total. Fue purificado el ARN de Poly A a partir del ARN total usando los kits Mini y Midi de mARN Oligotex de Qiagen. Total y mARN fueron cuantificados por análisis espectrofotométrico (O. D. 260/280 nm) y fueron analizados por electroforesis de gel.

Oligonucleotidos

Fueron usados los siguientes oligonucleotidos purificados de HPLC.

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DPNCDN (cebador de síntesis de cDNA)

100

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Adaptador 1:

1

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Adaptador 2:

2

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Cebador PCR 1:

3

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Cebador desnudo (NP) 1:

4

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Cebador desnudo (NP) 2:

5

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Hibridación de supresión privativa

La hibridación sustractiva por supresión (SSH) fue usada para identificar los cDNA correspondiente en genes que pueden ser expresados diferencialmente en el cáncer de próstata. La reacción SSH utilizaba el cDNA de dos xenoinjertos de AD de LAPC-4. Específicamente, para aislar genes que están implicados en la progresión del cáncer de próstata dependiente de andrógeno (AD) al cáncer independiente de andrógeno (AI), fue llevado a cabo un experimento con el xenoinjerto de AD de LAPC-4 en ratones machos SCID. Los ratones que albergaban los xenoinjertos de AD de LAPC-4 fueron castrados cuando los tumores alcanzaron un tamaño de 1 cm de diámetro. Los tumores disminuyeron de tamaño y fue temporalmente parada produciendo la proteína dependiente de andrógeno PSA. De siete a catorce días después de la castración, los niveles de PSA fueron detectables de nuevo en la sangre de los ratones. Eventualmente los tumores desarrollaron un fenotipo Al y comenzaron a crecer de nuevo en los machos castrados. Los tumores fueron recuperados en puntos de tiempo diferentes después de la castración para identificar los genes que son activados o desactivados durante la transición a la independencia de andrógeno.

El gen 85P1B3 fue derivado de un AD de LAPC-4 (3 días después de la castración) menos la substracción de AD de LAPC-4. La secuencia de ADN de SSH (Figura 1) fue identificada.

El cDNA derivado de un tumor de AD de LAPC-4 (cultivado en ratón macho intacto) fue usado como la fuente del cDNA "conductora", mientras que el cDNA del tumor de AD de LAPC-4 (3 días después de la castración) fue usado como la fuente del cDNA "probador". Los cDNA bicatenarios correspondientes a los cDNA probador y conductor fueron sintetizados a partir de 2 \mug de ARN de poli(A)^{+} aislado a partir de tejido de xenoinjerto relevante, como se describe anteriormente, usando el kit de substracción de cDNA PCR-Select de CLONTECH y 1 ng del oligonucleotido DPNCDN como cebador. La síntesis de la primera y segunda cadena fueron llevadas a cabo como se describe en el protocolo del manual de usuario del Kit (Protocolo de CLONTECH Nº. PT1117-1, Nº. de Catálogo K1804-1). El cDNA resultante fue digerido con Dpn II durante 3 horas a 37ºC. El cDNA digerido fue extraído con fenol/cloroformo (1:1) y etanol precipitado.

El cDNA conductor fue generado combinando en un cDNA digerido de Dpn II en relación 1:1 a partir de la fuente de xenoinjerto relevante (véase anterior) con una mezcla de los cDNA digeridos derivados a partir de líneas celulares humanas HeLa, 293, A431, Colo205 e hígado de ratón.

El cDNA probador fue generado diluyendo 1 \mul del cDNA digerido de Dpn II a partir de la fuente del xenoinjerto relevante (véase anterior) (400 ng) en 5 \mul de agua. El cDNA diluido (2 \mul, 160 ng) entonces fue ligado a 2 \mul de Adaptador 1 y Adaptador 2 (10 \muM), en reacciones de ligadura separadas, en un volumen total de 10 \mul a 16ºC de la noche a la mañana, usando 400 \mul de T4 DNA ligasa (CLONTECH). La ligadura fue terminada con 1 \mul de EDTA 0,2 M y fue calentado a 72ºC durante 5 minutos.

La primera hibridación fue realizada añadiendo 1,5 \mul (600 ng) del cDNA conductor a cada uno de dos tubos que contienen 1,5 \mul (20 ng) del cDNA probador ligado del Adaptador 1 y Adaptador 2. En un volumen final de 4 \mul, las muestras fueron cubiertas con aceite mineral, fueron desnaturalizadas en un ciclador termal de MJ Research a 98ºC durante 1,5 minutos, y luego se permite hibridarse durante 8 horas a 68ºC. Las dos hibridaciones fueron mezcladas entonces junto con un 1 \mul adicional de cDNA conductor desnaturalizado recién preparado y se permitió hibridar de la noche a la mañana a 68ºC. La segunda hibridación entonces fue diluida en 200 \mul de Hepes 20 mM, pH 8,3, NaCl 50 mM, EDTA 0,2 mM, fue calentada a 70ºC durante 7 minutos y fue almacenada a -20ºC.

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Amplificación por PCR, clonación y secuenciación de fragmentos génicos generados de SSH

Para amplificar los fragmentos génicos que son el resultado de las reacciones SSH, fueron realizadas dos amplificaciones PCR. En la reacción de la PCR primaria fue añadido 1 \mul de la mezcla de hibridación final diluida a 1 \mul del cebador PCR 1 (10 \muM), 0,5 \mul de la mezcla de dNTP (10 \muM), 2,5 \mul 10 x tampón de reacción (CLONTECH) y 0,5 \mul de 50 x mezcla de polimerasa de cDNA Advantage (CLONTECH) en un volumen final de 25 \mul. La PCR 1 fue llevada a cabo usando las condiciones siguientes: 75ºC durante 5 minutos, 94ºC durante 25 s, entonces 27 ciclos de 94ºC durante 10 s, 66ºC durante 30 s, 72ºC durante 1,5 minutos. Cinco reacciones de PCR primarias separadas fueron realizadas para cada experimento. Los productos fueron reunidos y diluidos 1:10 con agua. Para la reacción de PCR secundaria, fue añadido 1 \mul de la reacción PCR primaria reunida y diluida a la misma mezcla de reacción que la usado para la PCR 1, excepto que fueron usados cebadores NP1 y NP2 (10 \muM) en vez del cebador PCR 1. Fue realizada la PCR 2 usando 10-12 ciclos de 94ºC durante 10 s, 68ºC durante 30 s y 72ºC durante 1,5 minutos. Los productos de la PCR fueron analizados usando electroforesis de gel de agarosa al 2%.

Los productos de la PCR fueron insertados en pCR2.1 usando el kit de clonación de vector T/A (Invitrogen). Fueron sometidos E. coli transformada a selección azul/blanco y de ampicilina. Fueron escogidas las colonias blancas y puestas en serie en placas de 96 pocillos y fueron cultivadas en cultivo líquido de la noche a la mañana. Para identificar los insertos, la amplificación por PCR fue realizada en 1 ml de cultivo bacteriano usando las condiciones de PCR1 y NP1 y NP2 como cebadores. Fueron analizados los productos de la PCR usando electroforesis de gel de agarosa al 2%.

Fueron almacenadas los clones bacterianas en glicerol al 20% en un formato de 96 pocillos. El ADN del plásmido fue preparado, secuenciado y fue sometido a búsquedas según homología de ácidos nucleicos de las bases de datos del GenBank, dBest y NCI-CGAP.

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Análisis de expresión de RT-PCR

Pueden ser generados cDNA de primera cadena a partir de 1 \mug de mARN con cebadura de oligo (dT) 12-18 usando el sistema de preamplificación de Superscript de Gibco-BRL. El protocolo del fabricante fue usado lo que incluía una incubación durante 50 minutos a 42ºC con transcriptasa inversa seguido del tratamiento H de ARNsa a 37ºC durante 20 minutos. Después de completar la reacción, el volumen puede ser aumentado a 200 \mul con agua antes de la normalización. Los cDNA de primera cadena de 16 tejidos diferentes normales humanos pueden ser obtenidos de Clontech.

La normalización de los cDNA de primera cadena a partir de múltiples tejidos fue realizada usando los cebadores 5'atatcgccgcgctcgtcgtcgacaa3' y 5'agccacacgcagctcattgtagaagg3' para amplificar \beta-actina. Fueron amplificados los cDNA de cadena primaria (5 \mul) en un volumen total de 50 \mul que contenía cebadores 0,4 \muM, 0,2 \muM cada dNTP, tampón 1XPCR (Clontech, Tris-HCl 10 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, KCI 50 mM, pH 8,3) y ADN polimerasa de 1X Klentaq (Clontech). Cinco \mul de la reacción PCR pueden ser eliminados a 18, 20 y 22 ciclos y fueron usados para la electroforesis de gel de agarosa. La PCR fue realizada usando un ciclador termal de MJ Research en las condiciones siguientes: la desnaturación inicial puede ser a 94ºC durante 15 s, seguido de 18, 20 y 22 ciclos de 94ºC durante 15 minutos, 65ºC durante 2 minutos, 72ºC durante 5 s. Una extensión final a 72ºC fue llevada a cabo durante 2 minutos. Después de la electroforesis de gel de agarosa, las intensidades de banda de bandas de \beta-actina de 283 b.p. de múltiples tejidos fueron comparadas por inspección visual. Los factores de dilución para los cDNA de primera cadena fueron calculados para causar intensidades de banda de \beta-actina iguales en todos los tejidos después de 22 ciclos de PCR. Se pueden requerir tres rondas de normalización para alcanzar intensidades de banda iguales en todos los tejidos después de 22 ciclos de PCR.

Para determinar niveles de expresión del gen de 85P1B3, fueron analizados 5 \mul del cDNA de primera cadena normalizado por PCR usando 26 y 30 ciclos de amplificación. El análisis de expresión semicuantitativo puede ser logrado comparando los productos de la PCR en números de ciclo que dan intensidades de banda ligera.

Un análisis de expresión de RT-PCR típico se muestra en la Figura 10. El análisis de expresión de la RT-PCR fue realizado en los cDNA de primera cadena generados usando grupos de tejidos a partir de múltiples muestras. Se mostraron que los cDNA se normalizaban usando la PCR de \beta-actina. Una fuerte expresión de 85P1B3 fue observada en el grupo del xenoinjerto, grupo de cáncer de vejiga, grupo de cáncer de riñón, grupo de cáncer de colon, grupo de cáncer de pulmón, grupo de cáncer de mama, grupo de cáncer de ovario y grupo de metástasis de cáncer. Niveles inferiores de expresión fueron observados en VP1, VP2, y el grupo de cáncer de próstata.

Ejemplo 2 Clonación de longitud completa de 85P1B3

Para aislar los genes que están implicados en la progresión del cáncer de próstata dependiente de andrógeno (AD) al cáncer independiente de andrógeno (AI), fue llevado a cabo un experimento con el xenoinjerto de AD de LAPC-4 en ratones machos SCID. Los ratones que albergaban xenoinjertos de AD de LAPC-4 fueron castrados cuando los tumores alcanzaron un tamaño de 1 cm de diámetro. Los tumores disminuyeron de tamaño y pararon temporalmente produciendo la proteína dependiente de andrógeno PSA. De siete a catorce días después de la castración, los niveles PSA eran detectables de nuevo en la sangre de los ratones. Eventualmente los tumores desarrollaron un fenotipo AI y comenzaron a crecer de nuevo en los machos castrados. Los tumores fueron recuperados en puntos de tiempo diferentes después de la castración para identificar los genes que son activados o desactivados durante la transición a la independencia de andrógeno.

El gen 85P1B3 fue derivado de una substracción de AD de LAPC-4 (3 días después de la castración menos el AD de LAPC-4) (ninguna castración). La secuencia de ADN de SSH (Figura 1) fue designada 85P1B3. El clon de cDNA 85P1B3-clon A (Figura 2) fue identificado rastreando una genoteca de testículo humano (Display Target, Pangene) usando la secuencia de ADN SSH de 85P1B3. El cDNA (clon A) de 1.262 bp reveló un ORF que codificaba 229 aminoácidos (Figura 2 y Figura 3). La secuencia de nucleótidos y proteína 85P1B3 corresponden al gen OIP-5 (Figura 4). La proteína 85P1B3 se predice que se que es citoplásmica usando el programa PSORT
(URL psort.nibb.ac.jp:8800/form.html).

Ejemplo 3 Localización cromosómica

La localización cromosómica puede implicar a genes en la patogénesis de la enfermedad. Varios cromosomas que comportan el mapa de accesos está disponible en la técnica, incluyendo la hibridación fluorescente in situ (FISH), paneles del híbrido de radiación (RH) de humano/hámster (Walter et al., 1994; Nature Genetics 7: 22; Research Genetics, Huntsville Al), paneles de híbrido de célula somática de humano-roedor tales como los que están disponibles en el Instituto de Coriell (Camden, Nueva Jersey), y espectadores genómicos que utilizan homologías BLAST para clones genómicos secuenciados y mapeados (NCBI, Bethesda, Maryland).

Mapas de 85P1B3 para el cromosoma 15q14, usando la secuencia de 85P1B3 y la herramienta de BLAST del NCBI: (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/page.cgi?F=HsBlast.html&&ORG=Hs).

La localización cromosómica de 85P1B3 también fue determinada usando el panel del híbrido de radiación de humano/hámster GeneBridge4 (RH) (Walter et al., 1994; Nature Genetics 7: 22) (Research Genetics, Huntsville Al).

Los cebadores PCR siguientes fueron usados:

85P1B3. 1: 5' catgggactctgcatcttaattcc 3'

85P1B3. 2: 5' caggttcaggctttattgctgtct 3'

El vector de mapeo de 85P1B3 resultante para los 93 ADN del panel del híbrido de radiación (1001000101010001
01000000000000110100000012101100001011100100001011100010010101100110110110101), y el programa de
mapeo disponible en la dirección de internet http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/contig/rhmapper.pl, localiza el gen de 85P1B3 al cromosoma 15q13.2-q14.

De nota, el cromosoma 15q13.2-q14 es una región implicada en cánceres (Tomlinson et al., abril de 1999 de Gastroenterology; 116 (4): 789-95).

Ejemplo 4 Análisis de expresión de 85P1B3 en tejidos normales y muestras de pacientes

El análisis de 85P1B3 por RT-PCR es mostrado en la Figura 10. La fuerte expresión de 85P1B3 es observada en el grupo del xenoinjerto, grupo de cáncer de vejiga, grupo de cáncer de riñón, grupo de cáncer de colon, grupo de cáncer de pulmón, grupo de cáncer de mama, grupo de cáncer de ovario y el grupo de metástasis de cáncer. Niveles inferiores de expresión son observados en VP1, VP2 y el grupo de cáncer de próstata.

El análisis de inmunotransferencia Northern extensivo de 85P1B3 en 16 tejidos normales humanos demostró que la expresión de 85P1B3 es evocadora de un gen de testículo de cáncer (Figura 11). Una transcripción de 1,4 kilobytes fue detectada en el testículo, pero no en cualquier otro tejido normal. La expresión de 85P1B3 también fue mostrada en xenoinjertos de cáncer de próstata y en todas las líneas celulares de cáncer analizadas, tales como en los cánceres de próstata (4AD de LAPC, 4AI de LAPC, 9AD de LAPC, 9AI de LAPC, LNCaP, PC-3, DU145, Tsu-Prl y CL de LAPC-4), vejiga (HT1197, SCaBER, UM-UC-3, TCCSUP, J82,5637), línea celular 293T, sarcoma de Ewing (EWS), cerebro (PFSK-1, T98G), hueso (SK-ES-1, HOS, U-2 OS, RD-ES), pulmón (CALU-1, A427, NCI-H82, NCI-H146), riñón (769-P, A498, CAK1, SW839), pecho (CAMA-1, DU4475, MCF-7, mDA-MB-435s), testicular (NTERRA-2, NCCIT, TER1, TERA-2), ovárico (OV-1063, PA-1, SW 626), páncreas (PANC-1, Bx PC-3, HPAC, Capan-1), colon (Caco-2, LoVo, T84, Colo205), y cervical (A431) (Figura 12). Estos resultados indican que 85P1B3 es un gen específico de testículo que se sobreregula en múltiples cánceres.

La expresión de 85P1B3 fue analizada en un panel de tumores de pacientes humanos (T) y sus tejidos normales (N) fueron emparejados respectivos en transferencias de punto de ARN (Figura 13). La expresión de 85P1B3 fue vista en los cánceres de pecho, próstata, útero, ovario, cerviz, estómago el pulmón. La expresión detectada en tejidos adyacentes normales (aislado de tejidos de enfermo) pero no en tejidos normales (aislado de donantes sanos) puede indicar que estos tejidos no son totalmente normales y que 85P1B3 puede ser expresado en tumores en etapa temprana. También fue encontrado que 85P1B3 estaba altamente expresada en todas las líneas celulares de cáncer humano analizadas, HeLa (carcinoma cervical), Daudi (linfoma de Burkitt), K562 (CML), HL-60 (PML), G361 (melanoma), A549 (carcinoma pulmonar), MOLT-4 (leucemia linfoblástica), SW480 (carcinoma colorectal) y Raji (linfoma de Burkitt).

El análisis de inmunotransferencia en muestras de tumor de pacientes individuales mostró la expresión de 85P1B3 en dos tejidos de tumor de colon analizados, y en las líneas celulares de cáncer de colon Colo 205, LoVo, T84 y Caco-2, pero no en el colon normal (Figura 14).

La expresión de 85P1B3 también fue detectada en los tumores de 4 de 5 pacientes con cáncer de vejiga, y en las tres líneas celulares de cáncer de vejiga analizadas, pero no en la vejiga normal (Figura 15).

En muestras de cáncer de pulmón, la expresión de 85P1B3 fue observada en tres muestras de tumor pulmonar, las tres líneas celulares de cáncer de pulmón analizadas, pero no en el pulmón normal (Figura 16).

Para analizar la regulación de andrógenos de la expresión de 85P1B3, fueron inyectadas células tumorales de LAPC-9AD en ratones machos (Figura 17). Cuando los tumores alcanzaron un tamaño palpable (0,3-0,5 cm de diámetro), los ratones fueron castrados y los tumores fueron recuperados en puntos de tiempo diferentes. El ARN fue aislado de los tejidos de xenoinjerto y las transferencias Northern con 10 \mug de ARN total/línea fueron sondadas con el fragmento SSH de 85P1B3. Los resultados mostraron que la expresión de 85P1B3 no está afectada por la privación de andrógenos, y por lo tanto, no está regulada por los andrógenos.

La expresión restringida de 85P1B3 en tejidos normales y la expresión detectada en cáncer de vejiga, cáncer de riñón, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer ovárico y cáncer de mama indica que 85P1B3 es una diana terapéutica y/o profiláctica y un marcador pronóstico y/o diagnóstico para cánceres humanos.

Ejemplo Producción de 85P1B3 recombinante en sistemas procariotas

Para expresar la 85P1B3 recombinante en células procariotas, las secuencias de cDNA de 85P1B3 de longitud completa o parcial pueden ser clonadas en cualquiera de una variedad de los vectores de expresión conocidos en la técnica. Una o varias de las regiones siguientes de 85P1B3 son expresadas en estos contructos, aminoácidos de 1 a 229; o cualquiera 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más aminoácidos contiguos de 85P1B3, variantes, o sus análogos.

A. Constructos de transcripción y traducción in vitro

pCRII: Para generar sondas de ARN de 85P1B3 sentido y antisentido para las investigaciones de ARN in situ, son generados constructos de pCRII (Invitrogen, Carlsbad CA) codificando todo o fragmentos del cDNA de 85P1B3. El vector pCRII tiene los promotores Sp6 y T7 que flanquean el inserto para conducir la transcripción del ARN de 85P1B3 para su uso como sondas en experimentos de hibridación de ARN in situ. Estas sondas son usadas para analizar la expresión de la célula y tejido de 85P1B3 en el nivel de ARN. El ARN de 85P1B3 transcrito que representa el aminoácido de cDNA que codifica la región del gen de 85P1B3 se usa en sistemas de traducción in vitro tales como el TnT® Coupled Reticulolysate Sytem (Promega, Corp., Madison, WI) para sintetizar la proteína 85P1B3.

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B. Constructos bacterianos

Constructos de pGEX: Para generar proteínas 85P1B3 recombinantes en bacterias que son fusionadas a la proteína glutationa S-transferasa (GST), todo o parte del cDNA de la proteína 85P1B3 que codifica la secuencia es fusionado al gen de GST clonando en pGEX-6P-1 o cualquier otro vector de fusión de GST de la familia pGEX (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Estos constructos permiten la expresión controlada de las secuencias de proteína 85P1B3 recombinantes con GST fusionada en el extremo amino-terminal y un epítopo de seis histidinas (6X His) en el extremo carboxilo-terminal. Los marcadores GST y 6X His permiten la purificación de la proteína de fusión recombinante de la bacteria inducida con la matriz de afinidad apropiada y permiten el reconocimiento de la proteína de fusión con anticuerpos anti-GST y anti-His. El marcador 6X His es generado añadiendo 6 codones de histidina al cebador de clonación en el extremo 3', por ejemplo, del marco de lectura abierto (ORF). Un sitio de división proteolítica, tal como el sitio de reconocimiento de PreScision® en pGEX-6P-1, puede ser empleado tal que permita la división del marcador GST a partir de la proteína relacionada con 85P1B3. El gen de resistencia a la ampicilina y el origen pBR322 permiten la selección y el mantenimiento de plásmidos pGEX en E. coli.

En una realización, fue construida una proteína de fusión GST que codifica la secuencia de la proteína 85P1B3 de longitud completa (aminoácidos 1-229) y fue purificada de la bacteria inducida. Esta preparación entonces fue usada como inmunógeno para generar un anticuerpo policlonal anti-85P1B3 de conejo (véase la sección titulada "Generación de anticuerpos policlonales de 85P1B3". Como puede ser visto en la Figura 20A, el pAb reconoce fuertemente al inmunógeno de fusión GST original así como a la proteína 85P1B3 expresada en células 293T (Figura 20B y Figura 20C).

Constructos pMAL: Para generar, en bacterias, proteínas 85P1B3 recombinantes que son fusionadas a la proteína de unión de maltosa (MBP), todo o parte del cDNA de la proteína 85P1B3 que codifica la secuencia es fusionado al gen de MBP clonando en los vectores pMAL-c2X y pMAL-p2X (Biolabs de Nueva Inglaterra, Beverly, MA). Estos constructos permiten la expresión controlada de secuencias de la proteína 85P1B3 recombinante con MBP fusionado en el extremo amino terminal y un marcador de epítopo 6X His en el extremo carboxilo-terminal. Los marcadores MBP y 6X His permiten la purificación de la proteína recombinante de la bacteria inducida con la matriz de afinidad apropiada y permiten el reconocimiento de la proteína de fusión con anticuerpos anti-MBP y anti-His. El marcador de epítopo 6X His es generado añadiendo 6 codones de histidina al cebador de clonación 3'. Un sitio de reconocimiento del Factor Xa permite la división del marcador pMAL a partir de 85P1B3. Los vectores pMAL-c2X y pMAL-p2X son optimizados para que expresen la proteína recombinante en el citoplasma o el periplasma, respectivamente. La expresión del periplasma realza el plegado de las proteínas con puentes disulfuro.

Constructos de pET: Para expresar 85P1B3 en células bacterianas, todo o parte del cDNA de la proteína 85P1B3 que codifica la secuencia es clonado en la familia favorita de vectores (Novagen, Madison, WI). Estos vectores permiten la fuerte expresión controlada de la proteína 85P1B3 recombinante en la bacteria con y sin la fusión a las proteínas que realzan la solubilidad, tales como NusA y tioredoxina (Trx), y marcadores de epítopo, tales como 6X His y S-Tag® que ayudan a la purificación y la detección de la proteína recombinante. Por ejemplo, se hacen constructos utilizando el sistema de fusión 43.1 de pET NusA tal que las regiones de la proteína 85P1B3 se expresan como fusiones del extremo amino-terminal a NusA.

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C. Constructos de levadura

Constructos de pESC: Para expresar 85P1B3 en la especie de levadura Saccharomyces cerevisiae para la generación de proteína recombinante y estudios funcionales, todo o parte del cDNA de la proteína 85P1B3 que codifica la secuencia es clonado en la familia pESC de vectores cada uno de los cuales contiene 1 de 4 marcadores seleccionables, HIS3, TRP1, LEU2 y URA3 (Stratagene, La Jolla, CA). Estos vectores permiten la expresión controlada a partir del mismo plásmido de hasta 2 genes diferentes o secuencias clonadas que contienen los marcadores de epítopo Flag® o Myc en la misma célula de levadura. Este sistema es útil para confirmar las interacciones proteína-proteína de 85P1B3. Además, la expresión en levadura proporciona modificaciones pos-translacionales similares, tales como glicosilaciones y fosforilaciones, que son encontradas cuando se expresan en células eucariotas.

Constructos de pESP: Para expresar 85P1B3 en la especie de levadura Saccharomyces pombe, todo o parte del cDNA de la proteína 85P1B3 que codifica la secuencia es clonado en la familia pESP de vectores. Estos vectores permiten un alto nivel controlado de la expresión de una secuencia de la proteína 85P1B3 que es fusionada en el extremo amino-terminal o en el extremo carboxilo-terminal a GST que ayuda a la purificación de la proteína recombinante. Una marcador de epítopo Flag® permite la detección de la proteína recombinante con el anticuerpo anti-Flag®.

Ejemplo 6 Producción de 85P1B3 recombinante en sistemas eucariotas A. Constructos de mamífero

Para expresar 85P1B3 recombinante en células eucariotas, las secuencias de cDNA de 85P1B3 de longitud completa o parcial pueden ser clonadas en cualquiera de una variedad de vectores de expresión conocidos en la técnica. Una o varias de las regiones siguientes de 85P1B3 son expresadas en estos constructos, aminoácidos de 1 a 229; o cualesquiera 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más aminoácidos contiguos de 85P1B3, sus variantes o análogos.

Los constructos pueden ser transfectados en cualquiera de una amplia variedad de células de mamífero tales como células 293T. Los lisados de células 293T transfectadas pueden ser sondados con suero policlonal anti-85P1B3, descrito en este documento.

Constructos pcDNA4/HisMax: Para expresar 85P1B3 en células de mamífero, el ORF de 85P1B3, o sus partes de 85P1B3, son clonados en pcDNA4/HisMax Versión A (Invitrogen, Carlsbad, CA). La expresión de la proteína es controlada por el promotor de citomegalovirus (CMV) y el potenciador translacional SP16. La proteína recombinante tiene los epítopos Xpress® y seis histidinas (6X His) fusionadas al extremo amino-terminal. El vector pcDNA4/HisMax también contiene la señal de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovino (BGH) y la secuencia de terminación de transcripción para realzar la estabilidad del mARN con el origen de SV40 para la replicación episomal y el rescate del vector simple en líneas celulares que expresan el antígeno T grande. El gen de resistencia a la Zeocina permite la selección de células de mamífero que expresan la proteína y el gen de resistencia a la ampicilina y el origen ColEl permite la selección y el mantenimiento del plásmido en E. coli.

Constructos de PcDNA3.1/MvcHis: Para expresar 85P1B3 en células de mamífero, el ORF de 85P1B3, o sus partes de 85P1B3, con un sitio de iniciación de traducción Kozak consenso son clonados en pcDNA3.1/MycHis Versión A (Invitrogen, Carlsbad, CA). La expresión de la proteína es controlada por el promotor del citomegalovirus (CMV). Las proteínas recombinantes tienen el epítopo myc y epítopo 6X His fusionado al extremo carboxilo-terminal. El vector pcDNA3.1/MycHis también contiene la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovino (BGH) y la secuencia de terminación de transcripción para realzar la estabilidad del mARN, junto con el origen SV40 para la replicación episomal y el rescate del vector simple en líneas celulares que expresan el antígeno T grande. El gen de resistencia a la neomicina puede ser usado, ya que éste permite la selección de células de mamífero que expresan la proteína y el gen de resistencia a la ampicilina y el origen ColEl permite la selección y el mantenimiento del plásmido en E. coli.

Constructos de PcDNA3.1/CT-GFP-TOPO: Para expresar 85P1B3 en células de mamífero y permitir la detección de las proteínas recombinantes usando fluorescencia, el ORF de 85P1B3, o sus partes de 85P1B3, con un sitio de iniciación de traducción de Kozak consenso son clonados en pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO (Invitrogen, CA). La expresión de la proteína es controlada por el promotor del citomegalovirus (CMV). Las proteínas recombinantes tienen la proteína verde fluorescente (GFP) fusionada al extremo carboxilo-terminal lo que facilita una detección in vivo no invasiva y los estudios de biología celular. El vector pcDNA3.1CT-GFP-TOPO también contiene la señal de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovino (BGH) y la secuencia de terminación de transcripción para realzar la estabilidad del mARN con el origen SV40 para la replicación episomal y el rescate de vector simple en líneas celulares que expresan el antígeno T grande. El gen de resistencia a la neomicina permite la selección de células de mamífero que expresan la proteína, y el gen de resistencia a la ampicilina y el origen ColEl permiten la selección y el mantenimiento del plásmido en E. coli. Constructos adicionales con una fusión de GFP del extremo amino-terminal se hacen en pcDNA3.1/NT-GFP-TOPO para atravesar la longitud entera de las proteínas 85P1B3.

PAPtag: El ORF de 85P1B3, o sus partes de 85P1B3, son clonados en PAPtag-5 (GenHunter Corp. Nashville, TN). Esto constructos generan una fusión de fosfatasa alcalina en el extremo carboxilo-terminal de las proteínas 85P1B3 fusionando la secuencia de señal de IgGK al extremo amino-terminal. También son generados constructos en los que es fusionada fosfatasa alcalina con un secuencia señal de IgGK del extremo amino-terminal al extremo amino-terminal de las proteínas 85P1B3. Las proteínas 85P1B3 recombinantes resultantes son optimizadas para la secreción en el medio de células de mamífero transfectadas y pueden ser usadas para identificar proteínas tales como ligandos o receptores que interaccionan con las proteínas 85P1B3. La expresión de la proteína es controlada por el promotor CMV y las proteínas recombinantes también contienen epítopos myc y 6X His fusionados en el extremo carboxilo-terminal lo que facilita la detección y la purificación. El gen de resistencia a la zeocina presente en el vector permite la selección de células de mamífero que expresan la proteína recombinante y el gen de resistencia a la ampicilina permite la selección del plásmido en E. coli.

Ptag5: El ORF de 85P1B3, o sus partes de 85P1B3, fueron clonados en pTag-5. Este vector es similar a pAPtag, pero sin la fusión de fosfatasa alcalina. Este constructo generó la proteína 85P1B3 con un secuencia señal de IgGK del extremo amino-terminal y marcadores de epítopo myc y 6X His en el extremo carboxilo-terminal lo que facilita la purificación de afinidad y la detección. La proteína 85P1B3 recombinante resultante fue optimizada para su secreción en el medio de células de mamífero transfectadas, y fue usada como inmunógeno o ligando para identificar proteínas tales como ligandos o receptores que interaccionan con las proteínas 85P1B3. La expresión de la proteína es controlada por el promotor CMV. El gen de resistencia a la zeocina presente en el vector permite la selección de células de mamífero que expresan la proteína, y el gen de resistencia a la ampicilina permite la selección del plásmido en E. coli.

PsecFc: El ORF de 85P1B3, o sus partes de 85P1B3, también son clonados en psecFc. El vector psecFc fue montado clonando la Fc de inmunoglobulina G1 humana (IgG) (regiones de ancladura, CH2, CH3) en pSecTag2 (Invitrogen, California). Este constructo genera una fusión Fc de IgGI en el extremo carboxilo-terminal de las proteínas 85P1B3, fusionando la secuencia señal de IgGK al extremo N-terminal. También son usadas fusiones de 85P1B3 utilizando la región Fc de IgG1 murina. Las proteínas de 85P1B3 recombinantes resultantes son optimizadas para su secreción en el medio de células de mamífero transfectadas, y pueden ser usadas como inmunógenos o para identificar proteínas como ligandos o receptores que interaccionan con la proteína 85P1B3. La expresión de la proteína es controlada por el promotor CMV. El gen de resistencia a la higromicina presente en el vector permite la selección de las células de mamífero que expresan la proteína recombinante, y el gen de resistencia a la ampicilina permite la selección del plásmido en E. coli.

Constructos de pSR\alpha: Para generar líneas celulares de mamífero que expresan 85P1B3, o sus partes, constitutivamente, el ORF de 85P1B3 fue clonado en constructos de pSR\alpha. Fueron generados retrovirus anfotrópicos y ecotrópicos por la transfección de constructos de pSR\alpha en la línea de envase 293T-10A1 o la cotransfección de pSR\alpha y un plásmido auxiliar (conteniendo secuencias de envase delecionadas) en las 293 células, respectivamente. El retrovirus fue usado para infectar una variedad de líneas celulares de mamífero, causando la integración del gen clonado, 85P1B3, en las líneas celulares del huésped. La expresión de la proteína es dirigida por una repetición del terminal largo (LTR). El gen de resistencia a la neomicina presente en el vector permite la selección de las células de mamífero que expresan la proteína, y el gen de resistencia a la ampicilina y el origen ColEl permiten la selección y el mantenimiento del plásmido en E. coli. La Figura 18 muestra la expresión de 85P1B3 utilizando el vector pSR\alpha retroviral en la línea celular de cáncer de próstata PC3. Los vectores retrovirales, a partir de aquí, pueden ser usados para la infección y la generación de varias líneas celulares utilizando, por ejemplo, células SCaBER, NIH 3T3, TsuPr1, 293 o
rat-1.

Los constructos de PSR\alpha adicionales se hace que se fusione un marcador de epítopo tal como el marcador FLAG® al extremo carboxilo-terminal de secuencias de 85P1B3 para permitir la detección usando anticuerpos anti-FLAG. Por ejemplo, la secuencia de FLAG® 5' gat tac aag gat gac gac gat aag 3' es añadida al cebador de clonación en el extremo 3' del ORF. Los constructos de PSR\alpha adicionales se hacen que produzcan tanto proteínas de fusión de GFP del extremo amino-terminal y carboxilo-terminal y myc/6X His de las proteínas 85P1B3 de cadena entera.

Vectores virales adicionales: Otros constructos se hacen para la administración mediada por virus y la expresión de 85P1B3. El alto título de virus que conduce a un alto nivel de expresión de 85P1B3 es logrado en sistemas de administración virales tales como vectores adenovirales y vectores de amplicón del herpes. Las secuencias codificantes de 85P1B3 o sus fragmentos son amplificados por PCR y subclonados en el vector transportador de AdEasy (Stratagene). La recombinación y el empaquetamiento de virus son realizados de acuerdo con las instrucciones del fabricante para generar vectores adenovirales. De forma alternativa, secuencias codificantes de 85P1B3 o sus fragmentos son clonados en el vector HSV-1 (Imgenex) para generar vectores virales de herpes. Los vectores virales, a partir de aquí, son usados para la infección de varias líneas celulares tales como células SCaBER, NIH 3T3,293 o rat-1.

Sistemas de expresión regulados: Para controlar la expresión de 85P1B3 en células de mamífero, las secuencias codificantes de 85P1B3, o sus partes, son clonadas en sistemas de expresión de mamífero regulados tales como el sistema T-Rex (Invitrogen), el sistema GeneSwitch (Invitrogen) y el sistema Ecdysone fuertemente regulado (Stratagene). Estos sistemas permiten el estudio de los efectos temporales y dependientes de la concentración de 85P1B3 recombinante. Estos vectores, a partir de aquí, son usados para controlar la expresión de 85P1B3 en varias líneas celulares tales como células SCaBER, NIH 3T3, 293 o rat-1.

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B. Sistemas de expresión de baculovirus

Para generar proteínas 85P1B3 recombinantes en un sistema de expresión de baculovirus, el ORF de 85P1B3, o sus partes, es clonado en el vector de transferencia de baculovirus pBlueBac 4.5 (Invitrogen), que proporciona un marcador His en el extremo N-terminal. Específicamente, pBlueBac-85P1B3 es co-transfectado con el plásmido auxiliar pBac-N-Blue (Invitrogen) en células de insecto SF9 (Spodoptera frugiperda) para generar el baculovirus recombinante (véase el manual de instrucciones de Invitrogen para más detalles). El baculovirus entonces es recogido del sobrenadante de las células y es purificado por ensayo de placa.

La proteína 85P1B3 recombinante entonces se genera por la infección de células de insecto HighFive (Invitrogen) con baculovirus purificado. Las proteína 85P1B3 recombinante puede ser detectada usando el anticuerpo anti-85P1B3 o anti-His-tag. La proteína 85P1B3 puede ser purificada y usada en varios ensayos basados en células o como inmunógeno para generar anticuerpos policlonales y monoclonales específicos para 85P1B3.

Ejemplo 7 Perfiles de antigenicidad y estructura secundaria

La Figura 5, Figura 6, Figura 7, Figura 8 y Figura 9 representan gráficamente cinco perfiles de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de 85P1B3, estando disponible cada evaluación por acceso al sitio web de ProtScale (URL www.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl) en el servidor de biología molecular de ExPasy.

Estos perfiles: Figura 5, Hidrofilia, (Hopp T.P., Woods K.R., 1981. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:3824-3828); Figura 6, Hidropaticidad, (Kyte J., Doolittle R.F., 1982. J. Mol. Biol. 157:105-132); Figura 7, Porcentaje de Residuos Accesibles (Janin J., 1979 Nature 277:491-492); Figura 8, Flexibilidad Promedio, (Bhaskaran R., y Ponnuswamy P.K., 1988. Int. J. Pept. Protein Res.. 32:242-255); Figura 9, giro \beta (Deleage, G., Roux B. 1987 Protein Engineering 1:289-294); y opcionalmente otros disponibles en la técnica, tales como el sitio web ProtScale, fueron usados para identificar las regiones antígenas de la proteína 85P1B3. Cada uno de los perfiles de aminoácidos de 85P1B3 anteriores fue generado usando los siguientes parámetros ProtScale para el análisis: 1) un tamaño de ventana de 9; 2) 100% en peso de los bordes de ventana comparado con el centro de ventana; y 3) valores del perfil de aminoácidos normalizados para que estén entre 0 y 1.

La hidrofilia (Figura 5), Hidropaticidad (Figura 6) y Porcentaje de Residuos Accesibles (Figura 7) los perfiles fueron usados determinar los períodos de aminoácidos hidrófilos (es decir, valores mayores que 0,5 sobre la Hidrofilia y el perfil de Porcentaje de Residuos Accesibles, y valores menores de 0,5 en el perfil de Hidropaticidad). Tales regiones probablemente son expuestas al ambiente acuoso, están presentes en la superficie de la proteína, y por eso están disponibles para el reconocimiento inmune, tal como por anticuerpos.

Los perfiles de Flexibilidad Promedio (Figura 8) y giro \beta (Figura 9) determinan los períodos de aminoácidos (es decir, valores mayores que 0,5 en el perfil del giro \beta y el perfil de Flexibilidad Promedio) que no está unido en estructuras secundarias tales como láminas \beta y hélices \alpha. Tales regiones, con mayor probabilidad, son expuestas también sobre la proteína y son así accesibles al reconocimiento inmune, tal como por anticuerpos.

Las secuencias antígenas de la proteína 85P1B3 indicada, por ejemplo, por los perfiles expuestos en adelante en la Figura 5, Figura 6, Figura 7, Figura 8 y/o Figura 9 se usan para preparar inmunógenos, péptidos o ácidos nucleicos que las codifican, para generar anticuerpos terapéuticos y diagnósticos anti-85P1B3. El inmunógeno puede ser cualquiera de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más de 50 aminoácidos contiguos, o los ácidos nucleicos correspondientes que las codifican, de la proteína 85P1B3. En particular, los inmunógenos del péptido de la invención pueden comprender una región peptídica de al menos 5 aminoácidos de la Figura 2 en cualquier incremento de número entero hasta 229 lo que incluye una posición de aminoácidos que tiene un valor mayor que 0,5 en el perfil de Hidrofilia de la Figura 5; una región peptídica de al menos 5 aminoácidos de la Figura 2 en cualquier incremento de número entero hasta 229 que incluye una posición de aminoácido que tiene un valor menor de 0,5 en el perfil de Hidropaticidad de la Figura 6; una región peptídica de al menos 5 aminoácidos de la Figura 2 en cualquier incremento de número entero hasta 229 que incluye una posición de aminoácido que tiene un valor mayor que 0,5 en el perfil del Porcentaje de Residuos Accesibles de la Figura 7; una región peptídica de al menos 5 aminoácidos de la Figura 2 en cualquier incremento de número entero hasta 229 que incluye una posición de aminoácido que tiene un valor mayor que 0,5 en el perfil de Flexibilidad Promedio en la Figura 8; y, una región peptídica de al menos 5 aminoácidos de la Figura 2 en cualquier incremento de número entero hasta 229 que incluye una posición de aminoácido que tiene un valor mayor que 0,5 en el perfil del giro \beta de la Figura 9. Los inmunógenos del péptido de la invención también pueden comprender los ácidos nucleicos que codifican cualquiera de los anteriores.

Todos los inmunógenos de la invención, péptido o ácido nucleico, pueden ser incorporados en la forma de una dosis unitaria humana, o estar comprendidos por una composición que incluya un excipiente farmacéutico compatible con la fisiología humana.

La estructura secundaria de 85P1B3, a saber, la presencia predicha y la posición de las hélices alfa, cadenas extendidas y zonas espiriladas aleatorias, es predicha a partir de la secuencia de aminoácidos primaria usando el método de Red neuronal jerárquico HNN (Guermeur, 1997, \underbar{http://pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa\_automat.pl?page=npsa\_nn.html}), con acceso en el servidor de biología molecular de ExPasy (http://www.expasy.ch/tools/). El análisis indica que 85P1B3 está compuesto del 36,8% de hélice alfa, el 13,97% de cadena ampliada, y el 49,34% del rollo arbitrario (Figura 21A).

El análisis para detectar la presencia potencial de dominios de transmembrana en 85P1B3 fue llevado a cabo usando una variedad de algoritmos de predicción de transmembrana con acceso en el servidor de biología molecular ExPasy (http://www.expasv.ch/tools/). Un dominio de transmembrana potencial compuesto de los aminoácidos 129-149 es predicho según el programa TMpred (Figura 21B). HMMTop predice una región de transmembrana de los aminoácidos 134-158. Los programas SOSUI y TMHMM (Figura 21C) predicen que 85P1B3 es una proteína soluble sin dominios transmembrana. Los resultados de las predicciones de transmembrana son resumidos en la Tabla XXV.

Ejemplo 8 Generación de anticuerpos policlonales de 85P1B3

Pueden ser generados anticuerpos policlonales en un mamífero, por ejemplo, por una o varias inyecciones de un agente de inmunización y, de ser deseado, un adyuvante. Típicamente, el agente de inmunización y/o adyuvante será inyectado en el mamífero por múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales. Además de la inmunización con la proteína 85P1B3 de longitud completa, se emplean algoritmos informático en el diseño de inmunógenos que, basado en el análisis de secuencia de los aminoácidos, contienen características de ser antigénicos y estar disponibles para el reconocimiento por el sistema inmunológico del huésped inmunizado (véase el Ejemplo titulado "Perfiles de antigenicidad"). Tales regiones serían predichas que son hidrófilas, flexibles, en conformaciones de giro \beta, y que están expuestas en la superficie de la proteína (véase, por ejemplo, Figura 5, Figura 6, Figura 7, Figura 8 o Figura 9 para los perfiles de aminoácidos que indican tales regiones de 85P1B3).

Por ejemplo, las proteínas de fusión bacterianas recombinantes de 85P1B3 o los péptidos que codifican las regiones de giro \beta hidrófilas, flexibles, de la secuencia de 85P1B3, tales como los aminoácidos 1-77 y 190-229 se usan como antígenos para generar anticuerpos policlonales en conejos blancos de Nueva Zelanda. Es útil conjugar el agente de inmunización a una proteína conocida que es inmunogénica en el mamífero que se inmuniza. Los ejemplos de tales proteínas inmunogénicas incluyen, pero no están limitados a, hemocianina de lapa californiana (KLH), albúmina de suero, tiroglobulina bovina y el inhibidor de tripsina de soja. En una realización, un péptido que codifica los aminoácidos 190-206 de 85P1B3 se conjuga a KLH y se usa para inmunizar al conejo. De forma alternativa, el agente de inmunización puede incluir todo o parte de la proteína 85P1B3, sus análogos o proteínas de fusión. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de 85P1B3 puede ser fusionada usando técnicas de ADN recombinante a cualquiera de una variedad de parejas de proteína de fusión que son conocidas en la técnica, tales como glutationa-S-transferasa (GST) y las proteínas de fusión marcadas de HIS. Tales proteínas de fusión son purificadas a partir de la bacteria inducida usando la matriz de afinidad apropiada.

En una realización, fue producida y purificada una proteína de fusión GST que codifica la secuencia de la proteína 85P1B3 de longitud completa y fue usada como inmunógeno (véase la sección titulada "Producción de 85P1B3 en sistemas procariotas"). Secuencias más cortas también son fusionadas a GST para dirigir el anticuerpo a las regiones específicas de la proteína tales como los aminoácidos 1-77 para generar anticuerpos específicos del extremo amino-terminal. Otras proteínas de fusión bacterianas recombinante que pueden ser empleadas incluyen la proteína de unión de maltosa, LacZ, tioredoxina, NusA, o una región constante de inmunoglobulina (véase la sección titulada "Producción de 85P1B3 en sistemas procariotas" y "Current Protocols In Molecular Biology", Volumen 2, Unidad 16, ed. Frederick M. Ausubul., 1995; Linsley, P.S., Brady, W., Urnes, M., Grosmaire, L., Damle, N., y Ledbetter, L. (1991) J. Exp. Med. 174,561-566).

Además de las proteínas de fusión derivadas bacterianas, también son usados antígenos de proteína expresados en mamífero. Estos antígenos son expresados a partir de vectores de expresión de mamífero tales como los vectores Tag5 y de fusión Fc (véase la sección titulada "Producción de 85P1B3 recombinante en sistemas eucariotas"), y conserve modificaciones post-translacionales tales como glicosilaciones encontradas en la proteína natural. En una realización, una región antigénica predicha de 85P1B3, los aminoácidos 190-229, es clonada en el vector de secreción de mamífero Tag5. La proteína recombinante es purificada por cromatografía de quelato metálico a partir de sobrenadantes del cultivo de tejido de células 293T que expresan establemente el vector recombinante. La proteína 85P1B3 de Tag5 purificado se usa entonces como inmunógeno.

Durante el protocolo de inmunización, es útil mezclar o emulsionar el antígeno en adyuvantes que realzan la respuesta inmune del animal huésped. Los ejemplos de adyuvantes incluyen, pero no están limitados a, adyuvante de Freund completo (CFA) y adyuvante MPL-TDM (Lípido A de monofosforilo, dicorinomicolato de trehalosa sintético).

En un protocolo típico, los conejos son inicialmente inmunizados subcutáneamente con hasta 200 \mug, típicamente 100-200 \mug, de proteína de fusión o péptido conjugado a KLH mezclado en adyuvante de Freund completo (CFA). A los conejos, entonces, se les inyecta subcutáneamente cada dos semanas con hasta 200 \mug, típicamente 100-200 \mug, del inmunógeno en adyuvante de Freund incompleto (IFA). Las sangrías de ensayo son tomadas aproximadamente 7-10 días después de cada inmunización y son usadas para monitorizar el título del anti-suero por ELISA.

Para analizar la reactividad y la especificidad del suero inmune, tal como el suero de conejo generado a partir de la inmunización con la proteína de fusión de longitud completa GST-85P1B3, el cDNA de 85P1B3 de cadena entera fue clonado en el vector de expresión de pCDNA 3.1 myc-his (Invitrogen, véase el Ejemplo titulado "Producción de 85P1B3 recombinante en sistemas eucariotas"). Después de la transfección de los constructos en células 293T, fueron sondadas los lisados de célula con suero anti-85P1B3 y con anticuerpo anti-His (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA) para determinar la reactividad específica frente a la proteína 85P1B3 desnaturalizada usando la técnica de inmunotransferencia. Como puede ser visto en la Figura 20B, el anti-85P1B3 pAb reconoció específicamente la proteína 85P1B3 expresada en células 293T que es del mismo peso molecular que la detectada por el anticuerpo anti-His (Figura 20C). El reconocimiento de la proteína natural por el antisuero se determina por inmunoprecipitación y análisis citométrico de flujo de células 293T y otras células que expresan 85P1B3 recombinantes. Además, la especificidad del antisuero es analizada por inmunotransferencia, inmunoprecipitación, microscopía fluorescente, y técnicas citométricas de flujo usando células que expresan endógenamente 85P1B3.

Para purificar el antisuero derivado del conejo inmunizado de GST-85P1B3, el suero fue pasado sobre una columna de afinidad compuesta de GST para eliminar los anticuerpos anti-GST reactivos. El suero entonces fue purificado después por cromatografía de afinidad de la proteína G para aislar la fracción IgG. El suero de los conejos inmunizados con otras proteínas de fusión, tales como proteínas de fusión MBP, se purifica por agotamiento de anticuerpos reactivos con MBP, u otra secuencia de pareja de fusión, por la transferencia sobre una columna de afinidad que contiene la pareja de fusión sola o en el contexto de una proteína de fusión no pertinente. Los sueros de la proteína marcada con His y los conejos inmunizados con el péptido así como los sueros agotados de la pareja de fusión se purifican después por la transferencia sobre una columna de afinidad compuesta del inmunógeno de proteína original o acoplado sin péptido a la matriz Affigel (BioRad).

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Ejemplo 9 Generación de anticuerpos monoclonales de 85P1B3

En una realización, los anticuerpos monoclonales terapéuticos de 85P1B3 comprenden aquellos que reaccionan con epítopos de la proteína que interrumpirían o modularían la función biológica de 85P1B3, por ejemplo, aquellos que interrumpirían su interacción con ligandos o proteínas que median o están implicados en su actividad biológica. Los anticuerpos monoclonales terapéuticos también comprenden los que se une específicamente a los epítopos de 85P1B3 expuestos en la superficie de la célula y que así son útiles en el reconocimiento de conjugados anticuerpo monoclonal-toxina. Los inmunógenos para la generación de tales anticuerpos monoclonales incluyen aquellos diseñados para codificar o contener la proteína 85P1B3 entera o las regiones de la proteína 85P1B3 predichas para ser antígenas a partir del análisis informático de la secuencia de aminoácidos (véase, por ejemplo, la Figura 5, Figura 6, Figura 7, Figura 8 o la Figura 9, y el Ejemplo titulado "Perfiles de antigenicidad").

Los inmunógenos incluyen péptidos, proteínas bacterianas recombinantes, y las proteínas Tag 5 expresadas de mamífero y humano y proteínas de fusión FC de IgG murina. Para generar anticuerpos monoclonales frente a 85P1B3, los ratones primero son inmunizados intraperitonealmente (IP) con, típicamente, 10-50 \mug de inmunógeno de proteína mezclada en adyuvante de Freund completo. Los ratones entonces son inmunizados IP posteriormente cada 2-4 semanas con, típicamente, 10-50 \mug de antígeno mezclado en adyuvante de Freund incompleto. De forma alternativa, se usa en las inmunizaciones el adyuvante MPL-TDM. Además, se emplea un protocolo de inmunización basado en ADN en el cual un vector de expresión que codifica la secuencia de 85P1B3 de mamífero es usado para inmunizar ratones por inyección directa del ADN del plásmido. Por ejemplo, se usa el pCDNA 3.1 que codifica el cDNA de 85P1B3 de longitud completa, aminoácidos 1-77, o 190-229 de 85P1B3 (predicho que son antigénicos por el análisis de secuencia, véase, por ejemplo, la Figura 5, Figura 6, Figura 7, Figura 8 o la Figura 9) fusionado en el extremo amino terminal a una secuencia líder de IgK y en el extremo carboxilo-terminal a la secuencia de codificación de la región Fc de IgG murina o humana. Este protocolo es usado solo y en combinación con inmunógenos de la proteína. Sangrías de muestra son tomadas 7-10 días después de la inmunización para monitorizar el título y la especificidad de la respuesta inmune. Una vez que son obtenidas la reactividad apropiada y la especificidad como se determina por ELISA, inmunotransferencia, inmunoprecipitación, microscopía de fluorescencia, y análisis citométrico de flujo, entonces son llevados a cabo la fusión y la generación del hibridoma con procedimientos establecidos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Harlow y Lane, 1988).

En una realización para generar anticuerpos monoclonales de 85P1B3, una proteína de fusión de glutationa-S-transferasa (GST) que codifica la proteína 85P1B3 de longitud completa se expresa y se purifica. Un fragmento de división que codifica los aminoácidos específicos de 85P1B3 entonces se usa como inmunógeno en el que GST es eliminado por proteolisis específica de sitio. Inicialmente, ratones Balb C son inmunizados intraperitonealmente con 25 \mug de la proteína de división 85P1B3 mezclada en adyuvante de Freund completo. Los ratones posteriormente son inmunizados cada dos semanas con 25 \mug de la proteína de división 85P1B3 mezclada en adyuvante de Freund incompleto en un total de tres inmunizaciones. El título del suero de los ratones inmunizados se determina por ELISA usando la proteína de fusión de longitud completa GST y el inmunógeno dividido. La reactividad y la especificidad del suero frente a la proteína 85P1B3 de longitud completa son monitorizados por inmunotransferencia, inmunoprecipitación y citometría de flujo usando células 293T transfectadas con un vector de expresión que codifica el cDNA de 85P1B3. Otras células que expresan 85P1B3 recombinantes (véase, por ejemplo, el Ejemplo titulado "Producción de 85P1B3 en sistemas eucariotas") o también son usadas células que expresan 85P1B3 endógenamente. Los ratones que mostraban la reactividad más fuerte se dejan descansar y se les da una inyección final de la proteína de división 85P1B3 en PBS y luego son sacrificados cuatro días más tarde. Los bazos de los ratones sacrificados son recuperados y fusionados a células de mieloma SPO/2 usando procedimientos estándar (Harlow y Lane, 1988). Los sobrenadantes de los pocillos de crecimiento después de la selección HAT son rastreados por ELISA, inmunotransferencia, inmunoprecipitación, microscopía fluorescente y citometría de flujo para identificar los clones específicos que producen el anticuerpo de 85P1B3.

La afinidad de unión de un anticuerpo monoclonal de 85P1B3 se determina usando tecnologías estándar. Las medidas de afinidad cuantifican la fuerza del anticuerpo frente a la unión del epítopo y son usadas para ayudar a definir qué anticuerpos monoclonales de 85P1B3 son preferidos para su uso diagnóstico o terapéutico, como apreciaría cualquier experto en la técnica. El sistema BIAcore (Uppsala, Suecia) es un método preferido para determinar la afinidad de unión. El sistema BIAcore usa la resonancia de plasmón de superficie (SPR, Welford K. 1991, Opt. Quant. Electo. 23:1; Morton y Myszka, 1998, Methods in Enzymology 295: 268) para monitorizar las interacciones biomoleculares a tiempo real. El análisis por BIAcore genera convenientemente las constantes de velocidad de asociación, las constantes de velocidad de disociación, las constantes de disociación en equilibrio y las constantes de afinidad.

Ejemplo 10 Ensayos de unión de HLA Clase I y Clase II

Los ensayos de unión de HLA clase I y clase II usando moléculas purificadas de HLA son realizados conforme a los protocolos descritos (por ejemplo, las publicaciones PCT WO 94/20127 y WO 94/03205; Sidney et al., Current Protocols in Immunology 18.3.1 (1998); Sidney, et al., J. Immunol. 154:247 (1995); Sette, et al., Mol. Immunol. 31:813 (1994)). Brevemente, las moléculas de MHC purificadas (de 5 a 500 nM) son incubadas con varios inhibidores del péptido no marcados y péptidos de sonda ^{125}I-radiomarcados 1-10 nM, como se ha descrito. Después de la incubación, los complejos de MHC-péptido son separados del péptido libre por filtración de gel y la fracción del péptido unido es determinada. Típicamente, en experimentos preliminares, cada preparación MHC es titulada en presencia de cantidades fijas de péptidos radiomarcados para determinar la concentración de moléculas HLA necesarias para unirse el 10-20% de la radiactividad total. Todos los ensayos de inhibición subsecuentes y de unión directa son realizados usando estas concentraciones de HLA.

En estas condiciones [marcador] < [HLA] e IC_{50} \geq [HLA], los valores de IC_{50} medidos son aproximaciones razonables de los valores de K_{D} verdaderos. Los inhibidores del péptido típicamente son analizados en concentraciones en el intervalo de 120 \mug/ml a 1,2 ng/ml, y son analizados en de dos a cuatro experimentos completamente independientes. Para permitir la comparación de los datos obtenidos en experimentos diferentes, se calcula una figura de unión relativa para cada péptido dividiendo el IC_{50} de un control positivo de la inhibición por el IC_{50} para cada péptido analizado (versiones típicamente no marcadas del péptido de sonda radiomarcado). Para fines de la base de datos, y comparaciones interexperimentos, los valores de unión relativa se compilan. Estos valores pueden ser reconvertidos después en valores de IC_{50} nM dividiendo el IC_{50} nM de los controles positivos para la inhibición por la unión relativa del péptido de interés. Este método de compilación de datos es exacto y constante para comparar los péptidos que han sido analizados durante días diferentes, o con diferente lotes de MHC purificado.

Los ensayos de unión como se perfilan anteriormente pueden ser usados para analizar los péptidos portadores del supermotivo de HLA y/o motivo de HLA.

Ejemplo 11 Identificación de epítopos candidatos portadores del supermotivo de HLA y el motivo CTL

Las composiciones de vacuna HLA de la invención puede incluir múltiples epítopos. Los múltiples epítopos pueden comprender múltiples supermotivos de HLA o motivos para alcanzar la amplia cobertura. Este ejemplo ilustra la identificación y la confirmación de epítopos portadores del supermotivo y el motivo para la inclusión en tal composición de vacuna. El cálculo de la cobertura es realizado usando la estrategia descrita más abajo.

Búsquedas informáticas y algoritmos para la identificación de epítopos portadores de supermotivo y/o motivo

Las búsquedas realizadas para identificar las secuencias del péptido portadoras de motivo en el Ejemplo titulado "Perfiles de antigenicidad" y las Tablas V-XVEI emplean los datos de secuencia de la proteína a partir del producto génico de 85P1B3 expuesto en adelante en las Figuras 2 y 3.

Las búsquedas informáticas de epítopos portadores de los supermotivos o motivos de HLA Clase I o Clase II son realizadas como sigue. Todas las secuencias de proteína 85P1B3 traducidas son analizadas usando un programa de software de búsqueda de cadena de texto para identificar las potenciales secuencias del péptido que contienen los motivos de unión de HLA apropiados; tales programas son fácilmente producidos conforme a la información en la técnica en vista de las descripciones del motivo/supermotivo conocidas. Además, tales cálculos pueden ser hechos mentalmente.

Las secuencias A2-, A3- y DR-supermotivo identificadas son contabilizadas usando algoritmos de polinomios para predecir su capacidad de unirse a moléculas de HLA Clase I o II específicas. Estos algoritmos de polinomios consideran el impacto de diferentes aminoácidos en diferentes posiciones, y están basados esencialmente en la premisa de que la afinidad total (o \DeltaG) las de interacciones de la molécula péptido-HLA pueden ser aproximadas a una función de un polinomio lineal del tipo:

``\DeltaG'' =a_{1i} xa_{2i} xa_{3i} .... xa_{ni}

donde a_{ji} es un coeficiente que representa el efecto de la presencia de un aminoácido dado (j) en una posición dada (i) a lo largo de la secuencia de un péptido de n aminoácidos. La asunción crucial de este método es que los efectos en cada posición son esencialmente independientes entre sí (es decir, la unión independiente de cadenas laterales individuales). Cuando el residuo j está en la posición i en el péptido, es asumido que contribuye a una cantidad constante j_{i} a la energía libre de unión del péptido independientemente de la secuencia del resto del péptido.

El método de derivación de coeficientes de algoritmo específicos ha sido descrito en Gulukota et al., J. Mol. Biol. 267:1258-126,1997; (véase también Sidney et al., Human Immunol. 45:79-93, 1996; y Southwood et al., J. Immunol 160:3363-3373, 1998). Brevemente, para todas las posiciones i, anclaje y no anclaje igualmente, la media geométrica del promedio de unión relativo (ARB) de todos los péptidos que llevan j se calcula en relación con el resto del grupo, y se usa como la estimación de ji. Para los péptidos Clase II, si son posibles múltiples alineaciones, sólo es utilizada la alineación de la valoración más alta, después de un procedimiento iterativo. Para calcular una valoración de algoritmo de un péptido dado en un grupo de ensayo, son multiplicados los valores de ARB correspondientes a la secuencia del péptido. Si este producto excede un umbral escogido, el péptido se predice que se une. Los umbrales apropiados son escogidos como una función del grado de severidad de predicción deseado.

La selección de péptidos específicos del supertipo HLA-A2

Secuencias de la proteína completa de 85P1B3 son rastreadas utilizando el software de identificación de motivos, para identificar las secuencias de 8, 9, 10 y 11 unidades monoméricas que contienen la especificidad de anclaje del principal HLA-supermotivo A2. Típicamente, estas secuencias son cuantificadas después usando el protocolo descrito anteriormente y los péptidos correspondientes a las secuencias de valoración positivas son sintetizados y analizados según su capacidad para unirse a moléculas HLA-A*0201 purificadas in vitro (HLA-A*0201 es considerada una molécula A2-supertipo prototipo).

Estos péptidos entonces son analizados según su capacidad de unirse a moléculas A2-supertipo adicionales
(A*0202, A*0203, A*0206 y A*6802). Los péptidos que se unen a al menos tres de los cinco alelos A2-supertipo analizados son típicamente considerados aglomerantes específicos de A2-supertipo reactivos. Los péptidos preferidos se unen a una afinidad igual o menor de 500 nM a tres o más moléculas supertipo de HLA-A2.

Selección de epítopos portadores del supermotivo de HLA-A3

La secuencia de la proteína 85P1B3 rastreada anteriormente también se examina por la presencia de péptidos con anclas primarias del HLA-A3-supermotivo. Los péptidos correspondientes a las secuencias portadoras del supermotivo de HLA-A3 son sintetizados entonces y analizados por unirse a las moléculas HLA-A*0301 y HLA-A*1101, las moléculas codificadas por los dos alelos de A3-supertipo más frecuentes. Los péptidos que se unen al menos a uno de los dos alelos con afinidades de unión de \leq 500 nM, a menudo \leq 200 nM, entonces son analizados por su reactividad específica de unión a otros alelos comunes de A3-supertipo (por ejemplo, A*3101, A*3301 y A*6801) para identificar los que pueden unirse a al menos tres de las cinco moléculas HLA-A3-supertipo analizadas.

Selección de epítopos portadores del supermotivo de HLA-B7

La proteína 85P1B3 también se analiza por la presencia de péptidos de unidades monoméricas 8, 9, 10 ó 11 con el HLA-B7-supermotivo. Los péptidos correspondientes son sintetizados y analizados para unirse a HLA-B*0702, la molécula codificada por el alelo B7-supertipo más común(es decir, el prototipo B7 del alelo de supertipo). Los péptidos que se unen a B*0702 con IC_{50} de < 500 nM son identificados usando métodos estándar. Estos péptidos entonces son analizados por unirse a otras moléculas de B7-supertipo comunes (por ejemplo, B*3501, B*5101, B*5301 y B*5401). Los péptidos capaces de unirse a tres o más de los cinco alelos de B7-supertipo analizados son así identificados.

Selección de epítopos portadores del motivo A1 y A24

Para aumentar más la cobertura, también pueden ser incorporados los HLA-A1 y -A24 en composiciones de vacuna. Un análisis de la proteína 85P1B3 también puede ser realizado para identificar las secuencias que contienen el motivo de HLA A1 y A24.

Los epítopos de unión de alta afinidad y/o específicos portadores de otro motivo y/o supermotivos son identificados usando la metodología análoga.

Ejemplo 12 Confirmación de inmunogenicidad

Los péptidos portadores del supermotivo A2 del candidato CTL específicos que se identifican como se describe en este documento se seleccionan para confirmarla inmunogenicidad in vitro. La confirmación se realiza usando la metodología siguiente:

Líneas celulares diana para el rastreo celular

La línea celular .221A2.1, producida transfiriendo el gen de HLA-A2.1 en la línea celular de B-linfoblastoide 721.221 humano de mutante nulo HLA-A, -B, -C, se usa como la diana cargado de péptido para medir la actividad de CTL restringido de HLA-A2.1. Esta línea celular se cultiva en el medio RPMI-1640 suplementado con antibióticos, piruvato de sodio, aminoácidos no esenciales y FCS al 10% (v/v) inactivado con calor. Las células que expresan un antígeno de interés, o los transfectantes que comprenden el gen que codifica el antígeno de interés, pueden ser usadas como células diana par confirmar la capacidad de los CTL específicos de péptido de reconocer el antígeno endógeno.

Cultivos de inducción de CTL primarios

Generación de células dendríticas (DC): Los PBMC son descongelados en RPMI con 30 \mug/ml de DNAsa, son lavados dos veces y resuspendidos en medio completo (RPMI-1640 más suero humano de AB al 5%, aminoácidos no esenciales, piruvato de sodio, L-glutamina y penicilina/estreptomicina). Los monocitos son purificados poniendo en placa 10 x 106 PBMC/pocillo en una placa de 6 pocillos. Después de 2 horas a 37ºC, las células no adherentes son eliminadas agitando con cuidado las placas y aspirando los sobrenadantes. Los pocillos son lavados un total de tres veces con 3 ml de RPMI para eliminar la mayor parte de células no adherente y adherentes sueltas. Tres ml de medio completo que contiene 50 ng/ml de GM-CSF y 1.000 U/ml de IL-4 entonces son añadidos a cada pocillo. Se añade TNF\alpha a las DC el día 6 a 75 ng/ml y las células son usadas para cultivos de inducción de CTL el día 7.

Inducción de CTL con DC y péptido: Son aislados linfocitos T CD8+ por selección positiva con perlas inmunomagnéticas de Dynal (Dynabeads® M-450) y el reactivo detacha-bead®. Típicamente, se tratan aproximadamente PBMC 200-250x10^{6} para obtener 24x10^{6} linfocitos T CD8^{+} (bastante para un cultivo de placa de 48 pocillos). Brevemente, los PBMC se descongelan en RPMI con 30 \mug/ml de DNAsa, se lavan una vez con PBS que contiene suero AB humano al 1% y se resuspenden en suero PBS/AB 1% a una concentración de 20x10^{6} células/ml. Las perlas magnéticas se lavan 3 veces con suero PBS/AB, se añaden a las células (140 \mul perlas/20x10^{6} células) y se incuban durante 1 hora a 4ºC con mezcla continua. Las perlas y células son lavadas 4x con suero PBS/AB para eliminar las células no adherentes y se resuspenden en 100x10^{6} células/ml (basado en el número de células originales) en suero PBS/AB que contiene 100 \mul/ml del reactivo detacha-bead®y 30 \mug/ml de DNAsa. La mezcla se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente con una mezcla continua. Las perlas son lavadas de nuevo con PBS/AB/DNAsa para recoger los linfocitos T CD8+. La DC es recogida y centrifugada a 1300 revoluciones por minuto durante 5-7 minutos, se lava una vez con PBS con BSA al 1%, se cuenta y se pulsa con 40 \mug/ml de péptido a una concentración de células de 1-2x10^{6}/ml en presencia de 3 \mug/ml de \beta2-microglobulina durante 4 horas a 20ºC. La DC entonces se irradia (4.200 rads), se lava 1 vez con medio y se cuenta de nuevo.

Creación de cultivos de inducción: 0,25 ml de DC generada por citoquina (en 1x10^{5} células/ml) se co-cultivan con 0,25 ml de linfocitos T CD8+ (a 2x10^{6} células/ml) en cada pocillo de una placa de 48 pocillos en presencia de 10 ng/ml de IL-7. El IL-10 recombinante humano es añadido al día siguiente a una concentración final de 10 ng/ml e IL-2 r-humano es añadido 48 horas más tarde en 10 UI/ml.

Reestimulación de cultivos de inducción con células adherentes pulsadas por péptido: Siete y catorce días después de la inducción primaria, las células son reestimuladas con células adherentes pulsadas por péptido. Los PBMC se descongelan y se lavan dos veces con RPMI y DNAsa. Las células son resuspendidas a 5x10^{6} células/ml y son irradiadas a \sim4200 rad. Los PBMC se ponen en placa a 2x10^{6} en 0,5 ml de medio completo por pocillo y se incuban durante 2 horas a 37ºC. Las placas son lavadas dos veces con RPMI dando un golpe a la placa con cuidado para eliminar las células no adherentes y las células adherentes pulsadas con 10 \mug/ml de péptido en presencia de 3 \mug/ml de \beta_{2}-microglobulina en 0,25 ml de RPMI/5%AB por pocillo durante 2 horas a 37ºC. La solución del péptido de cada pocillo es aspirada y los pocillos son lavados una vez con RPMI. La mayor parte del medio es aspirado de los cultivos de inducción (células CD8+) y se lleva a 0,5 ml con medio recién preparado. Las células entonces son transferidas a los pocillos que contienen las células adherentes pulsadas por péptido. Veinticuatro horas más tarde se añade IL-10 recombinante humano a una concentración final de 10 ng/ml y se añade IL2 recombinante humano al día siguiente y de nuevo 2-3 días más tarde a 50 UI/ml (Tsai et al., Critical Reviews in Immunology 18 (1-2):65-75,1998). Siete días más tarde, los cultivos son analizados por su actividad CTL en un ensayo de liberación de ^{51}Cr. En algunos experimentos, los cultivos son analizados por su reconocimiento específico de péptido enel ELISA de IFN\gamma in situ en el momento de la segunda reestimulación seguido del ensayo de reconocimiento endógeno 7 días más tarde. Después de la extensión, la actividad es medida en ambos ensayos para una comparación paralela.

Medida de la actividad lítica de CTL por la liberación de ^{51}Cr

Siete días después de la segunda reestimulación, se determina la citotoxicidad en un ensayo de liberación estándar (5 h) de ^{51}Cr analizando los pocillos individuales en E:T solo. Las dianas pulsadas por péptido se preparan incubando las células con 10 \mug/ml de péptido de la noche a la mañana a 37ºC.

Las células diana adherentes son eliminadas de los matraces de cultivo con tripsina-EDTA. Las células diana son marcadas con 200 \muCi del cromato de sodio ^{51}Cr (Dupont, Wilmington, DE) durante 1 hora a 37ºC. Las células diana marcadas se resuspenden a 10^{6} por ml y se diluyen 1:10 con células K562 a una concentración de 3,3x10^{6}/ml (una línea celular de eritroblastoma sensible a NK usado para reducir la lisis no específica). Las células diana (100 \mul) y los efectores (100 \mul) son puestas en placa en placas de 96 pocillos de fondo redondo y se incuban durante 5 horas a 37ºC. En aquel tiempo, 100 \mul del sobrenadante son recogidos de cada pocillo y se determina el tanto por ciento de lisis de acuerdo con la fórmula: [(cpm de la muestra de ensayo - cpm de la muestra de liberación de ^{51}Cr espontánea) / (cpm de la muestra de liberación de ^{51}Cr máxima - cpm de la muestra de liberación de ^{51}Cr espontánea)] x 100.

La liberación máxima y espontánea se determina incubando las dianas marcadas con Trition X-100 al 1% y medio solo, respectivamente. Un cultivo positivo es definido como aquel en el cual la lisis específica (muestra - antecedentes) es un 10% o más alto en el caso de pocillos individuales y es un 15% o más en las dos relaciones E:T más altas cuando se analizan cultivos expandidos.

Medida in situ de producción de IFN\gamma humana como un indicador de reconocimiento específico de péptido y endógeno

Placas de immulon 2 son revestidas de anticuerpo monoclonal de IFN\gamma antihumano de ratón (4 \mug/ml NaHCO_{3} 0,1 M, pH 8,2) de la noche a la mañana a 4ºC. Las placas son lavadas con PBS sin Ca^{2+} y Mg^{2+}/Tween 20 al 0,05% y bloqueadas con PBS/FCS al 10% durante dos horas, después lo cual los CTL (100 \mul/pocillo) y dianas (100 \mul/pocillo) se añaden a cada pocillo, dejando vacíos los pocillos para los estándares y blancos (que recibió el medio sólo). Las células diana, tanto dianas pulsadas por péptido o endógenas, son usadas a una concentración de 1x10^{6} células/ml. Las placas son incubadas durante 48 horas a 37ºC con CO_{2} al 5%.

Se añade IFN-\gamma humano recombinante a los pocillos estándar que comienzan en 400 pg o 1200 pg/100 microlitro/pocillo y la placa fue incubada durante dos horas a 37ºC. Las placas se lavan y 100 \mul de anticuerpo monoclonal de IFN-\gamma antihumano de ratón biotinilado (2 microgramos/ml en PBS/FCS al % 3%/Tween 20 al 0,05%) se añaden e incuban durante 2 horas a temperatura ambiente. Después del lavado de nuevo, se añaden 100 microlitros de HRP-estreptavidina (1:4000) y las placas se incuban durante una hora a temperatura ambiente. Las placas entonces se lavan 6x con tampón de lavado, se añaden 100 microlitros/pocillo de solución de desarrollo (TMB 1:1), y a las placas se les dejan desarrollarse durante 5-15 minutos. La reacción se para con 50 microlitros/pocillo de H_{3}PO_{4} 1M y se lee a OD_{450}. Un cultivo es considerado positivo si se miden al menos 50 pg de IFN-\gamma/pocillo del nivel de fondo superior y es dos veces el nivel de fondo de expresión.

Expansión de CTL

Aquellos cultivos que muestran una actividad lítica específica contra dianas pulsadas por péptido y/o dianas de tumor son expandidas durante un período de dos semanas con anti-CD3. Brevemente, se añaden 5x10^{4} de células CD8+ a un matraz T25 que contiene lo siguiente: 1x10^{6} de PBMC irradiadas (4.200 rad) (autólogo o alogeneico) por ml, 2x10^{5} de células transformadas de EBV por ml irradiadas (8.000 rad), y OKT3 (anti-CD3) a 30 ng por ml en RPMI-1640 que contiene suero AB humano al 10% (v/v), aminoácidos no esenciales, piruvato de sodio, 2-mercaptoetanol 25 \muM, L-glutamina y penicilina/estreptomicina. Se añade IL2 recombinante humano 24 horas más tarde a una concentración final de 200 UI/ml y cada tres días a partir de entonces con medio recién preparado a 50 UI/ml. Las células son divididas si la concentración de células excede a 1x10^{6}/ml y los cultivos son analizados entre los días 13 y 15 en relaciones E:T de 30, 10, 3 y 1:1 en el ensayo de liberación de ^{51}Cr o en 1x10^{6}/ml enel ensayo de IFN\gamma in situ usando las mismas dianas que antes de la expansión.

Los cultivos son ampliados en ausencia de anti-CD3+ como sigue. Aquellos cultivos que muestran la actividad lítica específica contra el péptido y dianas endógenas son seleccionados y son añadidas 5x10^{4} de células CD8+ a un matraz T25 que contiene lo siguiente: 1x10^{6} de PBMC autólogo por ml que ha sido pulsado con péptido con 10 \mug/ml de péptido durante dos horas a 37ºC e irradiado (4.200 rad); 2x10^{5} de células EBV-transformadas irradiadas (8.000 rad) por ml de RPMI-1640 que contiene al 10% (v/v) suero AB humano, AA no esenciales, piruvato de sodio, 2-ME 25 mM, L-glutamina y gentamicina.

Inmunogenicidad de péptidos portadores del supermotivo A2

Los péptidos de unión específicos del supermotivo A2 se analizan en el ensayo celular por su capacidad de inducir CTL específico de péptido en individuos normales. En este análisis, un péptido, según se considera típicamente, es un epítopo si éste induce los CTL específicos de péptido en al menos individuos, y preferiblemente, también reconoce el péptido endógenamente expresado.

También se puede confirmar la inmunogenicidad usando los PBMC aislados a partir de pacientes que padecen un tumor que expresa 85P1B3. Brevemente, los PBMC se aíslan de pacientes, se reestimulan con monocitos pulsados por péptido y se analizan por su capacidad de reconocer células pulsadas por péptido diana así como células transfectadas endógenamente que expresan el antígeno.

Evaluación de la inmunogenicidad de A*03/A11

También son evaluados péptidos de unión específicos portadores del supermotivo de HLA-A3 por su inmunogenicidad usando una metodología análoga a la usada para evaluar la inmunogenicidad de los péptidos del supermotivo de HLA-A2.

Evaluación de la inmunogenicidad de B7

El rastreo de inmunogenicidad de los péptidos de unión específicos del supertipo B7 identificados como se exponen en adelante se confirma en este documento de una manera análoga a la confirmación de péptidos portadores de A2 y A3.

También se confirman péptidos portadores des otro supermotivos/motivos,por ejemplo, HLA-A1, HLA-A24 etc. usando una metodología similar.

Ejemplo 13 Puesta en práctica del supermotivo ampliado para mejorar la capacidad de unión de epítopos naturales creando análogos

Los motivos y supermotivos de HLA (que comprenden residuos primarios y/o secundarios) son útiles en la identificación y la preparación de péptidos naturales altamente específicos, como se demuestra en este documento. Además, la definición de motivos y supermotivos de HLA también permite modificar genéticamente epítopos altamente específicos identificando residuos dentro de una secuencia peptídica natural que puede ser hecha análoga para conferir bajo el péptido ciertas características,por ejemplo, mayor reactividad específica dentro del grupo de las moléculas HLA que comprenden un supertipo, y/o una mayor afinidad de unión para algunas o todas aquellas moléculas HLA. Los ejemplos de péptidos susceptibles de ser análogos a exhibir una afinidad de unión modulada son expuestos en adelante en este ejemplo.

Capacidad de hacerse análogos en residuos de anclaje primario

Las estrategias de manipulación genética del péptido se ponen en práctica para aumentar además la reactividad específica de los epítopos. Por ejemplo, las anclas principales de los péptidos portadores del supermotivo de A2 son cambiadas, por ejemplo, para introducir una L, I, V o M preferida en la posición 2, y I o V en el extremo C-terminal.

Para analizar la reactividad específica de los péptidos análogos, cada análogo modificado se analiza inicialmente para unirse al alelo de supertipo A2 del prototipo A*0201, entonces, si la capacidad de unión A*0201 es mantenida, para la reactividad específica del supertipo A2.

De forma alternativa, se confirma que un péptido se une a uno o todos los miembros del supertipo y luego se hacen análogos para modular la afinidad de unión a cualquier (o más) de los miembros del supertipo para añadir la cobertura.

La selección de análogos por su inmunogenicidad en un análisis de rastreo celular es restringida típicamente además por la capacidad del péptido tipo silvestre parenteral (WT) para unirse al menos débilmente,es decir, unirse a un IC_{50} de 5000 nM o menos, a tres de más alelos del supertipo A2. El racionamiento para este requerimiento es que los péptidos de WT deben estar presentes endógenamente en una cantidad suficiente para ser biológicamente relevantes. Se ha demostrado que los péptidos hechos análogos tienen una mayor inmunogenicidad y reactividad específica por linfocitos T específicos para el epítopo parenteral (véase, por ejemplo, Parkhurst et al., J. Immunol. 157:2539, 1996; y Pogue et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:8166, 1995).

En el rastreo celular de estos análogos de péptido, es importante confirmar que los CTL análogos específicos son también capaces de reconocer el péptido tipo silvestre y, cuando sea posible, células diana que expresan endógenamente el epítopo.

Capacidad de hacerse análogos de péptidos portadores del supermotivo de A3 y B7 de HLA

Los análogos de epítopos portadores del supermotivo de HLA-A3 son generados usando estrategias similares a las empleadas en volver análogos a péptidos portadores del supermotivo de HLA-A2. Por ejemplo, la unión de péptidos a 3/5 de las moléculas del supertipo A3 son manipuladas en residuos de anclaje primario para que posean un residuo preferido (V, S, M o A) en la posición 2.

Los péptidos análogos entonces son analizados por su capacidad de unirse a A*03 y A*11 (alelos del supertipo del prototipo A3). Aquellos péptidos que muestran una capacidad de unión \leq 500 nM entonces se confirman como que tienen una reactividad específica del supertipo A3.

De modo similar, los péptidos portadores del motivo A2 y a3, péptidos que unen 3 o más alelos del supertipo B7 pueden ser mejorados, cuando sea posible, para alcanzar una mayor unión específica o una mayor afinidad de unión o semivida de unión. Los péptidos portadores del supermotivo B7, por ejemplo, son genéticamente modificados para poseer un residuo preferido (V, I, L o F) en la posición de anclaje primaria del C-terminal, como se demuestra por Sidney et al. (J. Immunol. 157:3480-3490, 1996).

Hacer análogos en los residuos de anclaje primario de otros epítopos portadores del motivo y/o supermotivo se realizan de una manera parecida.

Los péptidos análogos luego se confirman por su inmunogenicidad, típicamente en un ensayo de rastreo celular. De nuevo, generalmente es importante demostrar que los CTL específicos de análogos son también capaces de reconocer el péptido tipo silvestre y, cuando sea posible, dianas que expresan endógenamente el epítopo.

Capacidad de hacerse análogos en residuos de anclaje secundarios

Además, los supermotivos de HLA son de valor en la bioingeniería de péptidos altamente específicos y/o péptidos que se unen a moléculas HLA con una mayor afinidad identificando los residuos particulares en las posiciones de anclaje secundarias que están asociadas a tales propiedades. Por ejemplo, se analiza la capacidad de unión de un péptido portador del supermotivo B7 con un residuo F en la posición 1. El péptido entonces se hace análogo, por ejemplo, al sustituto L para F en la posición 1. El péptido hecho análogo se evalúa por su mayor afinidad de unión, la semivida de unión y/o la mayor reactividad específica. Tal procedimiento identifica péptidos hechos análogos con propiedades potenciadas.

Los análogos genéticamente modificados con una capacidad de unión suficientemente mejorada o la reactividad específica también pueden ser analizada por su inmunogenicidad en ratones HLA-B7-transgénicos, siguiendo por ejemplo, la inmunización IFA o la inmunización de lipopéptido. Los péptidos hechos análogos además son analizados por su capacidad de estimular una respuesta de recuerdo usando PBMC de pacientes con tumores que expresan 85P1B3.

Otras estrategias que hacen análogos

Otra forma del péptido que se hace análogo, no relacionada con las posiciones de ancla, implica la sustitución de una cisteína con un ácido \alpha-amino butírico. Debido a su naturaleza química, la cisteína tiene la propensión de formar puentes disulfuro y cambiar suficientemente el péptido estructuralmente para reducir la capacidad de unión. La sustitución de un ácido \alpha-amino butírico para la cisteína no sólo alivia este problema, sino que se muestra para mejorar la unión y las capacidades de unión específica en algunos casos (véase, por ejemplo, la revisión de Sette et al., En: "Persistent Viral Infections", Ed. R. Ahmed y I. Chen, John Wiley & Sons, Inglaterra, 1999).

Así, por el uso de sustituciones de aminoácido simples, pueden ser moduladas las propiedades de unión y/o la reactividad específica de ligandos del péptido para moléculas de supertipo de HLA.

Ejemplo 14 Identificación y confirmación de secuencias derivadas de 85P1B3 con motivos de unión de HLA-DR

Epítopos de péptido portadores de un supermotivo o motivo de HLA clase II son identificados y confirmas como se perfilan más abajo usando una metodología similar a la descrita para los péptidos de HLA Clase I.

Selección de epítopos portadores del supermotivo de HLA-DR

Para identificar los epítopos HTL de HLA clase II, derivados de 85P1B3, el antígeno de 85P1B3 se analiza por su presencia de secuencias portadoras de un motivo o supermotivo de HLA-DR. Específicamente, son seleccionadas secuencias de 15 unidades monoméricas comprendiendo un DR-supermotivo, comprendiendo un núcleo de 9 unidades monoméricas, y de tres regiones flanqueantes de los residuos N- y C-terminal (15 aminoácidos totales).

Se han desarrollado protocolos para predecir la unión del péptido a moléculas DR (Southwood et al., J. Immunol 160:3363-3373,1998). Estos protocolos, específicos para moléculas DR individuales, permiten la puntuación, y la clasificación, de regiones de núcleo de 9 unidades monoméricas. Cada protocolo no sólo puntúa secuencias de péptido por su presencia de anclas primarias de DR-supermotivo (es decir, en la posición 1 y la posición 6) dentro de un núcleo de 9 unidades monoméricas, pero además evalúa secuencias por su presencia de anclas secundarias. Usando tablas de selección específicas de alelo (véase, por ejemplo, Southwood et al., ibíd.), ha sido encontrado que estos protocolos seleccionan de manera eficiente secuencias de péptido con una alta probabilidad de unirse a una molécula de DR particular. Además, se ha encontrado que la realización de estos protocolos en tándem, específicamente aquellos para DR1, DR4w4 y DR7, puede seleccionar de manera eficiente a los péptidos específicos DR.

Los péptidos derivados de 85P1B3 identificados anteriormente son analizados por su capacidad de unión para varias moléculas de HLA-DR comunes. Todos los péptidos son analizados inicialmente por unirse a las moléculas DR en el panel primario: DR1, DR4w4 y DR7. Los péptidos que se unen a al menos dos de estas tres moléculas DR entonces son analizados por unirse a moléculas DR2w2 \beta1, DR2w2 \beta2, DR6w19 y DR9 en ensayos secundarios. Finalmente, los péptidos que se unen a al menos dos de las cuatro moléculas DR del panel secundario, y así acumulativamente al menos cuatro de siete moléculas DR diferentes, son seleccionados para unirse a moléculas DR4WL5, DR5w11 y DR8w2 en ensayos terciarios. Los péptidos que se unen a al menos siete de las diez moléculas DR que comprenden ensayos de rastreo primarios, secundarios y terciarios son considerados aglomerantes de DR específicos. Los péptidos derivados de 85P1B3 que se encuentran que se unen a alelos de HLA-DR comunes son de interés particular.

Selección de péptidos del motivo DR3

Como HLA-DR3 es un alelo que es frecuente en poblaciones caucasianas, negras e hispanas, la capacidad de unión de DR3 es un criterio relevante en la selección de epítopos HTL. Así, los péptidos mostrados como candidatos también pueden ser analizados por su capacidad de unión de DR3. Sin embargo, en vista de la especificidad de unión del motivo DR3, los péptidos que se unen sólo a DR3 también pueden ser considerados como candidatos por la inclusión en una formulación de vacuna.

Para identificar de manera eficiente los péptidos que se unen a DR3, son analizados antígenos de 85P1B3 diana para secuencias portadoras de uno de los dos motivos de unión específicos de DR3 mencionados por Geluk et al. (J. Immunol. 152:5742-5748, 1994). Los péptidos correspondientes son sintetizados entonces y son confirmados como que tienen la capacidad de unirse a DR3 con una afinidad de 1 \muM o mejor, es decir, menos de 1 \muM. Se encuentra que los péptidos satisfacen este criterio de unión y califica como aglomerantes de alta afinidad de HLA clase II.

Los epítopos de unión de DR3 identificados de esta manera están incluidos en composiciones de vacuna con epítopos de péptido portadores del supermotivo de DR.

De modo similar al caso de péptidos portadores del motivo de HLA clase I, los péptidos portadores del motivo clase II son hechos análogos para mejorar la afinidad o la reactividad específica. Por ejemplo, el ácido aspártico en la posición 4 de la secuencia del núcleo de 9 unidades monoméricas es un residuo óptimo para la unión de DR3, y la sustitución para aquel residuo a menudo mejora la unión de DR 3.

Ejemplo 15 Inmunogenicidad de epítopos de HTL derivados de 85P1B3

Este ejemplo determina los epítopos inmunogénicos portadores del supermotivo DR y del motivo DR3 entre aquellos identificados usando la metodología expuesta en adelante en este documento.

La inmunogenicidad de epítopos de HTL es confirmada de una manera análoga a la determinación de inmunogenicidad de epítopos de CTL, evaluando la capacidad de estimular respuestas de HTL y/o usando modelos de ratón transgénico apropiados. La inmunogenicidad es determinada rastreando para: 1.) la inducciónprimaria in vitro usando el PBMC normal o 2.) respuestas de recuerdo de los pacientes que tienen tumores que expresan 85P1B3.

Ejemplo 16 Cálculo de frecuencias fenotípicas supertipos de HLA en varios antecedentes étnicos para determinar la anchura de la cobertura

Este ejemplo ilustra la evaluación de la anchura de la cobertura de una composición de vacuna comprendida de múltiples epítopos que comprenden múltiples supermotivos y/o motivos.

Para analizar la cobertura, son determinadas las frecuencias génicas de alelos de HLA. Las frecuencias génicas para cada alelo de HLA son calculadas a partir de las frecuencias de antígeno o alelo utilizando las fórmulas de distribución binomias gf=1-(SQRT(1-af)) (véase, por ejemplo, Sidney et al., Human Immunol. 45:79-93,1996). Para obtener frecuencias fenotípicas generales, se calculan las frecuencias acumulativas génicas, y las frecuencias de antígeno acumulativas derivadas por el uso de la fórmula inversa [af=1-(1-Cgf)^{2}].

Cuando no están disponibles los datos de frecuencia a un nivel de perfil del ADN, se asume la correspondencia con las frecuencias de antígeno serológicamente definidas. Para obtener la cobertura del supertipo potencial total no se asume ningún desequilibrio de enlace, y sólo son incluidos los alelos confirmados de pertenecer a cada uno de los supertipos (estimaciones mínimas). Las estimaciones de la cobertura total potencial alcanzada por combinaciones inter-loci son hechas añadiendo a la cobertura A la proporción de la cobertura de no A que podría esperarse que fuera cubierta por los alelos de B considerados (por ejemplo, total=A+B* (1-A)). Los miembros confirmados del supertipo tipo A3 son A3, A11, A31, A*3301 y A*6801. Aunque el supertipo tipo A3 también pueda incluir A34, A66 y A*7401, estos alelos no fueron incluidos en los cálculos de frecuencia totales. De la misma manera, los miembros confirmados de la familia del supertipo tipo A2 son A*0201, A*0202, A*0203, A*0204, A*0205, A*0206, A*0207, A*6802 y A*6901. Finalmente, los alelos confirmados del supertipo tipo B7 son: B7, B*3501-03, B51, B*5301, B*5401, B*5501-2, B*5601, B*6701 y B*7801 (potencialmente también B*1401, B*3504-06, B*4201 y B*5602).

La cobertura alcanzada combinando los supertipos A2, A3 y B7 es aproximadamente el 86% en cinco grupos étnicos principales. La cobertura puede ser ampliada incluyendo péptidos portadores de los motivos A1 y A24. Por regla general, A1 está presente en el 12% y A24 en el 29% de la población a través de los cinco grupos diferentes étnicos principales (caucasiano, negro norteamericano, chino, japonés e hispano). Juntos, estos alelos son representados con una frecuencia promedio del 39% en estas mismas poblaciones étnicas. La cobertura total a través de las identidades étnicas principales cuando son combinados A1 y A24 con la cobertura de los alelos del supertipo A2, A3 y
B7 es > 95%. Un enfoque análogo puede ser usado para estimar la cobertura alcanzada con las combinaciones de epítopos portadores del motivo clase II.

Los estudios de inmunogenicidad en seres humanos (por ejemplo, Bertoni et al., J. Clin. Invest. 100: 503,1997; Doolan et al., Immunity 7: 97, 1997; y Threlkeld et al., J. lmmunol. 159: 1648, 1997) han mostrado que los péptidos de unión altamente específicos casi siempre son reconocidos como epítopos. El uso de péptidos de unión altamente específicos es un criterio de selección importante en los epítopos candidatos que se identifican por su inclusión en una vacuna que es inmunogénica en una población diversa.

Con un número suficiente de epítopos (como se describe en este documento y a partir de la técnica), una cobertura promedia es predicha que es mayor que el 95% en cada uno de las cinco poblaciones étnicas principales. El análisis de simulación Monte Carlo de la teoría de juegos, que se conoce en la técnica (véase, por ejemplo, Osborne, M. J. y Rubinstein, A. "A course in game theory" Prensa MIT, 1994), puede ser usado para estimar qué porcentaje de los individuos en una población comprendida de los grupos étnicos caucasiano, negro norteamericanos, japonés, chino e hispano reconocería los epítopos de vacuna descritos en este documento. Un porcentaje preferido es el 90%. Un porcentaje más preferido es el 95%.

Ejemplo 17 Reconocimiento de CTL de antígenos endógenamente tratados después de la cebadura

Este ejemplo confirma que el CTL inducido por epítopos de péptido naturales o hechos análogos identificado y seleccionado como se describe en este documento reconoce a antígenos endógenamente sintetizado, es decir, naturales.

Las células efectoras aisladas de los ratones transgénicos que son inmunizadas con epítopos de péptido, por ejemplo, epítopos portadores del supermotivo de HLA-A2, son estimuladas de nuevo in vitro usando células estimuladoras cubiertas por péptido. Seis días más tarde, las células efectoras son analizadas por su citotoxicidad y las líneas celulares que contienen la actividad citotóxica específica de péptido además son estimuladas de nuevo. Seis días adicionales más tarde, estas líneas celulares son analizadas por su actividad citotóxica en células diana de Jurkat-A2.1/Kilobyte marcadas conCr en ausencia o presencia de péptido, y también se analizaron en células diana marcadas con ^{51}Cr portadoras del antígeno endógenamente sintetizado, es decir, células que son transfectadas establemente con vectores de expresión de 85P1B3.

Los resultados demuestran que las líneas de CTL obtenidas de animales cebados con el epítopo de péptido reconocen el antígeno de 85P1B3 endógenamente sintetizado. La elección del modelo de ratón transgénico que se usa para tal análisis depende del(de los) epítopo(s) que está(n) siendo evaluado(s). Además de ratones transgénicos HLA-A*0201/K^{b}, varios otros modelos de ratón transgénico incluyendo ratones con A11 humano, que también pueden ser usados para evaluar epítopos A3, y alelos B7 han sido caracterizados y otros (por ejemplo, ratones transgénicos para HLA-A1 y A24) están siendo desarrollados. También se han desarrollad modelos de ratón HLA-DR1 y HLA-DR3, que pueden ser usados para evaluar los epítopos HTL.

Ejemplo 18 Actividad de epítopos conjugados de CTL-HTL en ratones transgénicos

Este ejemplo ilustra la inducción de CTLS y HTLS en ratones transgénicos, por el uso de composiciones de vacuna de péptido de CTL derivado de 85P1B3 y HTL. La composición de vacuna usada en este documento comprende péptidos que se administran a un paciente con un tumor que expresa 85P1B3. La composición de péptido pueden comprender múltiples epítopos de CTL y/o HTL. Los epítopos son identificados usando la metodología como se describe en este documento. Este ejemplo también ilustra que la inmunogenicidad potenciada puede ser alcanzada por la inclusión de uno o varios epítopos de HTL en una composición de vacuna de CTL; tal composición de péptido puede comprender un epítopo de HTL conjugado a un epítopo de CTL. El epítopo de CTL puede ser uno que se una a múltiples miembros de la familia HLA en una afinidad de 500 nM o menos, o los análogos de aquel epítopo. Los péptidos pueden ser lipidados, de ser deseado.

Procedimientos de inmunización: La inmunización de ratones transgénicos es realizada como se describe (Alexander et al., J. Immunol. 159: 4753-4761, 1997). Por ejemplo, ratones A2/K^{b}, que son transgénicos para el alelo HLA A2.1 humano y son usados para confirmar la inmunogenicidad de epítopos portadores del motivo de HLA-A2 o el supermotivo de HLA-A*0201, y son cebados subcutáneamente (la base de la cola) con 0,1 ml de péptido en adyuvante de Freund incompleto, o si la composición de péptido es un conjugado CTL/HTL lipidado, en DMSO/solución salina, o si la composición de péptido es un polipéptido, en PBS o adyuvante de Freund incompleto. Siete días después de la cebadura, los esplenocitos obtenidos a partir de estos animales son estimulados de nuevo con linfoblastos activados con LPS singénicos irradiados cubierto con el péptido.

Líneas celulares: Células diana para ensayos de citotoxicidad específicos de péptido son células Jurkat transfectadas con el gen HLA-A2.1/Kb quimérico (por ejemplo, Vitiello et al., J. Exp. Med. 173: 1007,1991).

Activación de CTL in vitro: Una semana después de la cebadura, células de bazo (30x10^{6} células/matraz) se co-cultivan a 37ºC con linfoblastos cubiertos de péptido singeneico, irradiadas (3000 rad), (10x10^{6} células/matraz) en 10 ml de medio de cultivo/matraz T25. Después de seis días, las células efectoras son cultivadas y analizadas por su actividad citotóxica.

Ensayo para la actividad citotóxica: Células diana (de 1,0 a 1,5x10^{6}) son incubadas a 37ºC en presencia de 200 \mul de ^{51}Cr. Después de 60 minutos, se lavan las células tres veces y se resuspenden en el medio R10. El péptido se añade cuando se requiere a una concentración de 1 \mug/ml. Para el ensayo, 10^{4} células ^{51}Cr-marcadas diana son añadidas a las concentraciones diferentes de células efectoras (el volumen final de 200 \mul) en placas de 96 pocillos de fondo en U. Después de un período de incubación de seis horas a 37ºC, una alícuota de 0,1 ml de sobrenadante es retirada de cada pocillo y la radiactividad es determinada en un contador gamma automático Micromedic. El tanto por ciento de lisis específica es determinado por la fórmula: tanto por ciento de liberación específica = 100 x (liberación experimental -
liberación espontánea) / (liberación máxima - liberación espontánea). Para facilitar la comparación entre ensayos de CTL separados llevados a cabo en las mismas condiciones, los datos de liberación del % ^{51}Cr son expresados como unidades líticas/10^{6} células. Una unidad lítica es definida aleatoriamente como el número de células efectoras requeridas para alcanzar una lisis del 30% de 10.000 células diana en un ensayo de liberación de seis de ^{51}Cr. Para obtener unidades líticas específicas/10^{6}, las unidades líticas/10^{6} obtenidas en ausencia del péptido son restadas de las unidades líticas/10^{6} obtenidas en presencia del péptido. Por ejemplo, si es obtenido el 30% de liberación de ^{51}Cr en la relación de efector (E):diana (T) de 50:1 (es decir, 5x10^{5} células efectoras para 10.000 dianas) en ausencia del péptido y 5:1 (es decir, 5x10^{4} células efectoras para 10.000 dianas) en presencia del péptido, las unidades específicas líticas serían: [(1/50.000) - (1/500.000)] x 10^{6} = 18 LU.

Los resultados son analizados para evaluar la magnitud de las respuestas de CTL de animales inyectados con la preparación de la vacuna del conjugado de CTL/HTL inmunogénica y son comparados con la magnitud de la respuesta de CTL alcanzada usando, por ejemplo, los epítopos de CTL como se perfila antes en el Ejemplo titulado "Confirmación de inmunogenicidad". Análisis similares a éste pueden ser realizados para confirmar la inmunogenicidad de múltiples epítopos de CTL y/o múltiples epítopos de HTL que contienen los conjugados del péptido. Conforme a estos procedimientos, se encuentra que se induce una respuesta de CTL, y de manera concomitante que se induce una respuesta de HTL bajo la administración de tales composiciones.

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Ejemplo 19 Selección de epítopos de CTL y HTL para la inclusión en una vacuna específica de 85P1B3

Este ejemplo ilustra un procedimiento para seleccionar epítopos de péptido para las composiciones de vacuna de la invención. Los péptidos en la composición pueden estar en forma de una secuencia de ácidos nucleicos, solos o una o varias secuencias (es decir, minigen) que codifica el(los) péptido(s), o pueden ser péptidos solos y/o poliepitópicos.

Los principios siguientes son utilizados seleccionando una pluralidad de epítopos para la inclusión en una composición de vacuna. Cada uno de los principios siguientes es equilibrado para hacer la selección.

Se seleccionan epítopos que, bajo la administración, imiten respuestas inmunes que son correlacionadas con el aclaración de 85P1B3. El número de epítopos usados depende de las observaciones de los pacientes que espontáneamente se segregan 85P1B3. Por ejemplo, si ha sido observado que los pacientes que espontáneamente segregan 85P1B3 generan una respuesta inmune a al menos tres (3) del antígeno de 85P1B3, entonces tres o cuatro (3-4) epítopos deberían ser incluidos para HLA clase I. Un racionamiento similar es usado para determinar los epítopos de HLA clase II.

A menudo son seleccionados epítopos que tienen una afinidad de unión de una IC_{50} de 500 nM o menos para una molécula HLA clase I, o para la clase II, una IC_{50} de 1000 nM o menos; o péptidos de HLA Clase I con altas puntuaciones de unión del sitio web BIMAS, en el URL bimas.dcrt.nih.gov/.

Para alcanzar una amplia cobertura de la vacuna en una diversa población, suficientes supermotivos portadores de péptidos, o una serie suficiente de péptidos portadores de motivo específicos de alelo, son seleccionados para dar una amplia cobertura. En una realización, son seleccionados epítopos que proporcionan una cobertura de al menos el 80%. Un análisis Monte Carlo, una evaluación estadística conocida en la técnica, puede ser empleado para evaluar la anchura, o la redundancia, de la cobertura.

Creando composiciones poliepitópicas, o un minigen que codifica las mismas, es típicamente deseable generar el péptido lo más pequeño posible que abarque los epítopos de interés. Los principios empleados son similares, si no los mismos, como los empleados seleccionando un péptido que comprende epítopos anidados. Por ejemplo, una secuencia de proteína para la composición de vacuna se selecciona porque tiene el número máximo de epítopos contenidos dentro de la secuencia, es decir, tiene una alta concentración de epítopos. Los epítopos pueden ser anidados o solapados (es decir, el marco cambiado el uno en relación con el otro). Por ejemplo, con la superposición de epítopos, dos epítopos de 9 unidades monoméricas y un epítopo de 10 unidades monoméricas pueden estar presentes en un péptido de 10 aminoácidos. Cada epítopo puede ser expuesto y unido por una molécula HLA bajo la administración de tal péptido. Un péptido multiepitópico puede ser generado sintéticamente, recombinantemente, o vía la división de la fuente natural. De forma alternativa, puede hacerse un análogo de esta secuencia natural, por la cual uno o varios de los epítopos comprenden sustituciones que cambian la reactividad específica y/o las propiedades de afinidad de unión del péptido poliepitópico. Tal composición de vacuna se administra para dianas terapéuticas o profilácticas. Esta realización proporciona la posibilidad de que un aspecto aún no descubierto de tratamiento del sistema inmunológico aplicará a la secuencia natural anidada y así facilitará la producción de composiciones de vacuna terapéuticas o profilácticas inmunes que inducen una respuesta. Además tal realización proporciona la posibilidad de epítopos portadores del motivo para una composición de HLA que en este momento es desconocida. Además, esta realización (ausente en la creación de cualquier análogo) dirige la respuesta inmune a múltiples secuencias de péptido que están en realidad presentes en 85P1B3, evitando así la necesidad de evaluar cualquier epítopo de unión.

Finalmente, la realización proporciona una economía de escala produciendo composiciones de vacuna de ácidos nucleicos. Referido a esta realización, pueden ser derivados programas informáticos conforme a principios en la técnica, que se identifican en una secuencia diana, el mayor número de epítopos por longitud de secuencia.

Una composición de vacuna comprendida de los péptidos seleccionados, cuando se administra, es segura, eficaz, y produce una respuesta inmune similar en magnitud a una respuesta inmune que controla o limpia células que llevan o sobreexpresan 85P1B3.

Ejemplo 20 Construcción de plásmidos de ADN de multiepítopo "minigénico"

Este ejemplo habla de la construcción de un plásmido de expresión minigénico. Los plásmidos minigénicos, por supuesto, pueden contener varias configuraciones de epítopos de células B, CTL y/o HTL o análogos de epítopo como se describe en este documento.

Un plásmido de expresión minigénico típicamente incluye múltiples epítopos de péptido de CTL y HTL. En el ejemplo presente, los epítopos de péptido portadores del supermotivo de HLA-A2, -A3, -B7 y los epítopos de péptido portadores del motivo de HLA-A1 y -A24 se usan junto con epítopos portadores del supermotivo de DR y/o los epítopos de DR3. Los epítopos de péptido portadores del motivo o supermotivo de HLA la clase I derivados de 85P1B3, son seleccionados tal que los múltiples supermotivos/motivos son representados para asegurar una amplia cobertura. Asimismo, los epítopos de HLA clase II son seleccionados de 85P1B3 para proporcionar una amplia cobertura, es decir, tanto los epítopos portadores del supermotivo de HLA DR-1-4-7 como los epítopos portadores del motivo de HLA DR-3 son seleccionados para la inclusión en constructos del minigen. Los epítopos de CTL y HTL seleccionados entonces son incorporados en un minigen para su expresión en un vector de expresión.

Tal constructo puede incluir además secuencias que dirigen los epítopos de HTL al retículo endoplásmico. Por ejemplo, la proteína li puede ser fusionada a uno o varios epítopos de HTL como se describe en la técnica, en el que la secuencia de CLIP de la proteína li es eliminada y sustituida con una secuencia de epítopo de HLA clase II de modo que el epítopo de HLA clase II es dirigido al retículo endoplásmico, donde el epítopo se une a una molécula HLA clase II.

Este ejemplo ilustra los métodos que se usan para la construcción de un plásmido de expresión portador del minigen. Otros vectores de expresión que pueden ser usados para composiciones del minigen están disponibles y son conocidos para los expertos en la técnica.

El plásmido de ADN minigénico de este ejemplo contiene una secuencia Kozak consenso y una secuencia señal de cadena de ligera de Ig kappa murina consenso seguida de epítopos de CTL y/o HTL seleccionados conforme a principios descritos en este documento. La secuencia codifica un marco de lectura abierto fusionado al marcador de epítopo del anticuerpo de Myc y His codificado por el vector pcDNA 3.1 Myc-His.

La superposición de oligonucleotidos que, por ejemplo, puede promediar aproximadamente 70 nucleótidos en longitud con 15 superposiciones de nucleótido, se sintetizan y purifican por HPLC. Los oligonucleotidos codifican los epítopos de péptido seleccionados así como los nucleótidos de enlazante apropiados, la secuencia Kozak, y la secuencia señal. El minigen de multiepítopo final se monta ampliando los oligonucleotidos que sobrelapan en tres grupos de reacciones usando la PCR. Una máquina de PCR 9600 de Perkin/Elmer se usa y se realizan un total de 30 ciclos usando las condiciones siguientes: 95ºC durante 15 s, temperatura de hibridación (5º por debajo de la Tm calculada más baja de cada par de cebador) durante 30 s, y 72ºC durante 1 minuto.

Por ejemplo, minigen se prepara como sigue. Para una primera reacción PCR, 5 \mug de cada uno de dos oligonucleotidos son hibridados y ampliados: En un ejemplo que usa ocho oligonucleotidos, es decir, cuatro pares de cebadores, oligonucleotidos 1+2, 3+4, 5+6 y 7+8 son combinados en reacciones de 100 \mul que contienen tampón de polimerasa Pfu (1x = KCL 10 mM, (NH_{4})_{2}SO_{4} 10 mM, Tris-cloruro 20 mM, pH 8,75, MgSO_{4} 2 mM, Triton X-100 al 0,1%, 100 g/ml de BSA), 0,25 mM cada dNTP, y 2,5 U de polimerasa Pfu. Los productos de dímero de cadena entera son purificados por gel, y dos reacciones que contienen el producto de 1+2 y 3+4, y el producto de 5+6 y 7+8 son mezcladas, hibridadas, y ampliadas durante 10 ciclos. La mitad de las dos reacciones entonces se mezcla, y se llevan a cabo 5 ciclos de hibridación y de extensión antes de que sean añadidos los cebadores flanqueante para amplificar el producto de longitud completa. El producto de cadena entera se purifica por gel y se clona en PCR-blunt (Invitrogen) y se seleccionan clones individuales secuenciando.

Ejemplo 21 El constructo de plásmido y el grado al cual induce inmunogenicidad

El grado al cual el constructo del plásmido, por ejemplo, un plásmido construido conforme al Ejemplo anterior, es capaz de inducir inmunogenicidad se confirma in vitro determinando la presentación de epítopo por APC después de la transducción o transfección del APC con un constructo de ácido nucleico que expresa el epítopo. Tal estudio determina la "antigenicidad" y permite el uso de APC humano. El ensayo determina la capacidad del epítopo que se presenta por el APC en un contexto que es reconocido por linfocitos T cuantificando la densidad de complejos de epítopo de HLA clase I en la superficie de la célula. La cuantificación puede ser realizada midiendo directamente la cantidad de péptido eluido del APC (véase, por ejemplo, Sijts et al., J. Immunol. 156: 683-692,1996; Demotz et al., Nature 342: 682-684,1989); o el número de complejos péptido-HLA clase I pueden ser estimados midiendo la cantidad de lisis o liberación de linfoquina inducida por el enfermo o células diana transfectadas, y luego determinando la concentración de péptido necesario para obtener niveles equivalentes de lisis o la liberación de linfoquina (véase, por ejemplo, Kageyama et al., J. Immunol. 154: 567-576, 1995).

De forma alternativa, se confirma la inmunogenicidad por inyecciones in vivo en ratones y la subsecuente evaluación in vitro de la actividad de CTL y HTL, que es analizada usando ensayos de citotoxicidad y proliferación, respectivamente, como se detalla, por ejemplo, en Alexander et al., Immunity 1: 751-761, 1994.

Por ejemplo, para confirmar la capacidad de un constructo de minigen de ADN que contiene al menos un péptido de supermotivo de HLA-A2 para inducir los CTL in vivo, ratones transgénicos HLA-A2.1/K^{b}, por ejemplo, se inmunizan intramuscularmente con 100 \mug de cDNA desnudo. Como un medio para comparar el nivel de los CTL inducidos por inmunización de cDNA, un grupo de control de animales también se inmuniza con una composición de péptido real que comprende múltiples epítopos sintetizados como un polipéptido solo que sería codificado por el minigen.

Los esplenocitos de animales inmunizados son estimulados dos veces con cada una de las composiciones respectivas (epítopos de péptido codificados en el minigen o el péptido poliepitópico), luego se analizan por su actividad citotóxica específica de péptido en un ensayo de liberación de ^{51}Cr. Los resultados indican la magnitud de la respuesta de CTL dirigida contra el epítopo A2-restringido, indicando así la inmunogenicidad in vivo de la vacuna del minigen y la vacuna poliepitópica.

Por lo tanto, se encuentra que el minigen produce respuestas inmunes dirigidas hacia los epítopos de péptido del supermotivo de HLA-A2 como hace la vacuna de péptido poliepitópica. Un análisis similar también se realiza usando otros modelos de ratón transgénicos HLA-A3 y HLA-B7 para evaluar la inducción CTL por los epítopos del motivo o del supermotivo de HLA-A3 y HLA-B7, por lo cual también se encuentra que el minigen produce respuestas inmunes apropiadas dirigidas hacia los epítopos proporcionados.

Para confirmar la capacidad de un minigen que codifica el epítopo clase II para inducir los HTL in vivo, ratones transgénicos DR, o para aquellos epítopos que reaccionan específicamente con la molécula MHC de ratón apropiado, ratones I-A^{b}-restringidos, por ejemplo, son inmunizados intramuscularmente con 100 \mug de ADN de plásmido. Como medio para comparar el nivel de HTL inducido por la inmunización de ADN, también se inmuniza un grupo de animales control con una composición de péptido real emulsionada en adyuvante de Freund completo. Los linfocitos T CD4+, es decir, los HTL, son purificados a partir de esplenocitos de animales inmunizados y estimulados con cada una de las composiciones respectivas (péptidos codificados en el minigen). La respuesta de HTL es medida usando un ensayo de proliferación de incorporación de ^{3}H-timidina, (véase, por ejemplo, Alexander et al. Immunity 1: 751-761, 1994).
Los resultados indican la magnitud de la respuesta HTL, demostrando así la inmunogenicidad in vivo del minigen.

También se pueden confirmar minigenes de ADN, construidos como se describe en el Ejemplo anterior, como una vacuna en combinación con un agente de refuerzo usando un protocolo de refuerzo principal. El agente de refuerzo puede consistir en la proteína recombinante (por ejemplo, Barnett et al., Aids Res. and Human Retroviruses 14, Suplemento 3: S299-S309, 1998) o vaccinia recombinante, por ejemplo, expresando un minigen o ADN que codifica la proteína completa de interés (véase, por ejemplo, Hanke et al., Vaccine 16: 439-445, 1998; Sedegah et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 95: 7648-53,1998; Hanke y McMichael, Immunol. Letters 66: 177-181, 1999; y Robinson et al., Nature Med. 5: 526-34, 1999).

Por ejemplo, la eficacia del minigen de ADN usado en un protocolo de refuerzo principal inicialmente se evalúa en ratones transgénicos. En este ejemplo, ratones transgénicos A2.1/Kb son inmunizados IM con 100 \mug de un minigen de ADN que codifica los péptidos inmunogénicos incluyendo al menos un péptido portador del supermotivo de HLA-A2. Después de un período de incubación (en el intervalo de 3-9 semanas), los ratones son reforzados IP con 10^{7} pfu/ratón de una virus de vacuna recombinante que expresa la misma secuencia codificada por el minigen de ADN. Los ratones control son inmunizados con 100 \mug de ADN o vacuna recombinante sin la secuencia del minigen, o con el ADN que codifica el minigen, pero sin el refuerzo de vacuna. Después de un período de incubación adicional de dos semanas, los esplenocitos de los ratones se analizan inmediatamente por su actividad específica del péptido en un ensayo ELISPOT. Además, son estimulados los esplenocitos in vitro con los epítopos de péptido A2-restringidos codificados en el minigen y la vacuna recombinante, luego se analiza por su actividad específica de péptido en un ELISA de alfa, beta y/o gamma IFN.

Se encuentra que el minigen utilizado en un protocolo de refuerzo principal produce mayores respuestas inmunes hacia los péptidos del supermotivo de HLA-A2 que con el ADN solo. Tal análisis también puede ser realizado usando modelos de ratón transgénico HLA-A11 o HLA-B7 para evaluar la inducción de CTL por los epítopos del motivo o supermotivo de HLA-A3 o HLA-B7. El uso de protocolos de refuerzo principales en seres humanos se describe más abajo en el Ejemplo titulado "Inducción de respuestas de CTL usando un protocolo de refuerzo principal".

Ejemplo 22 Composición de péptido para usos profilácticos

Las composiciones de vacuna de la presente invención pueden ser usadas para prevenir la expresión de 85P1B3 en personas que están en peligro para los tumores que presentan este antígeno. Por ejemplo, una composición de epítopo de péptido poliepitópica (o un ácido nucleico que comprende el mismo) que contiene los múltiples epítopos de CTL y HTL como los seleccionados en los Ejemplos anteriores, que también son seleccionados para reconocer más del 80% de la población, se administra a individuos en peligro para un tumor asociado a 85P1B3.

Por ejemplo, se proporciona una composición a base de péptido como un sencillo polipéptido que abarca múltiples epítopos. La vacuna típicamente se administra en una solución fisiológica que comprende un adyuvante, tal como un adyuvante de Freund incompleto. La dosis del péptido para la inmunización inicial es de aproximadamente 1 a aproximadamente 50.000 \mug, generalmente 100-5.000 \mug, para un paciente de 70 kg. La administración inicial de la vacuna es seguida de dosificaciones de refuerzo en 4 semanas seguido de la evaluación de la magnitud de la respuesta inmune en el paciente, por técnicas que determinan la presencia de poblaciones de CTL específicas de epítopo en una muestra de PBMC. Revacunaciones adicionales son administradas cuando se requieran. La composición es encontrada que es tanto segura como eficaz como una profilaxis contra la enfermedad asociada a 85P1B3.

De forma alternativa, se usa una composición que comprende típicamente agentes de transfección para la administración de una vacuna a base de ácido nucleico conforme a metodologías conocidas en la técnica y descritas en este documento.

Ejemplo 23 Composiciones de vacuna poliepitópicas derivadas de secuencias de 85P1B3 naturales

Se analiza una secuencia de poliproteína de 85P1B3 natural, preferiblemente usando algoritmos informáticos definidos para cada supermotivo o motivo clase I y/o clase II, para identificar regiones "relativamente cortas" de la poliproteína que comprenden múltiples epítopos. Las regiones "relativamente cortas" son preferiblemente menores en longitud que un antígeno entero natural. Esta secuencia relativamente corta que contiene múltiples epítopos distintos o sobrelapantes "anidados" se selecciona; esto puede ser usado para generar constructos del minigen. El constructo se modifica para expresar el péptido, lo que corresponde a la secuencia de proteína natural. El péptido "relativamente corto" tiene generalmente menos de 250 aminoácidos de longitud, a menudo menos de 100 aminoácidos de longitud, preferiblemente menos de 75 aminoácidos de longitud, y más preferiblemente menos de 50 aminoácidos de longitud. La secuencia de proteína de la composición de vacuna se selecciona porque tiene el número máximo de epítopos contenidos dentro de la secuencia, es decir, tiene una alta concentración de epítopos. Como se dice en este documento, los motivos de epítopo pueden ser anidados o solapados (es decir, el marco cambiado el uno en relación con el otro). Por ejemplo, con epítopos sobrelapantes, dos epítopos de 9 unidades monoméricas y un epítopo de 10 unidades monoméricas pueden estar presentes en un péptido de 10 aminoácidos. Tal composición de vacuna se administra para dianas terapéuticas o profilácticos.

La composición de vacuna incluirá, por ejemplo, múltiples epítopos de CTL del antígeno de 85P1B3 y al menos un epítopo de HTL. Esta secuencia poliepitópica natural se administra como un péptido o como una secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido. De forma alternativa, puede hacerse un análogo de esta secuencia natural, por lo cual uno o varios de los epítopos comprenden sustituciones que cambian la reactividad específica y/o las propiedades de afinidad de unión del péptido poliepitópico.

La realización de este ejemplo proporciona la posibilidad que un aspecto aún no descubierto de tratamiento del sistema inmunológico aplicará a la secuencia natural anidada y así facilitar la producción de composiciones de vacuna terapéuticas o profilácticas inmunes que inducen una respuesta. Además tal realización proporciona la posibilidad de epítopos portadores de motivo para un composición de HLA que es desconocida en este momento. Además, esta realización (excluyendo una realización análoga) dirige la respuesta inmune frente a múltiples secuencias de péptido que están en realidad presentes en la 85P1B3 natural, evitando así la necesidad de evaluar cualquier epítopo de unión. Finalmente, la realización proporciona una economía de escala que produce el péptido o composiciones de vacuna de ácidos nucleicos.

Referido a esta realización, están disponibles programas informáticos en la técnica que pueden ser usados para identificar en una secuencia diana, el mayor número de epítopos por longitud de secuencia.

Ejemplo 24 Composiciones de vacuna poliepitópicas de múltiples antígenos

Los epítopos del péptido 85P1B3 de la presente invención son usados junto con epítopos de otros antígenos asociados a tumor diana, para crear una composición de vacuna que es útil para la prevención o el tratamiento de un cáncer que expresa 85P1B3 y otros tales antígenos. Por ejemplo, puede ser proporcionada una composición de vacuna como un polipéptido solo que incorpora múltiples epítopos de 85P1B3 así como antígenos asociados al tumor que a menudo son expresados con un cáncer diana asociado con la expresión de 85P1B3, o puede ser administrado como una composición que comprende un cóctel de uno o varios epítopos discretos. De forma alternativa, la vacuna puede ser administrada como un constructo del minigen o como células dendríticas que han sido cargadas por los epítopos de péptido in vitro.

Ejemplo 25 Uso de péptidos para evaluar una respuesta inmune

Los péptidos de la invención pueden ser usados para analizar una respuesta inmune por la presencia de anticuerpos específicos, CTL o HTL dirigido a 85P1B3. Tal análisis puede ser realizado en una manera descrita por Ogg et al., Science 279: 2103-2106, 1998. En este Ejemplo, los péptidos conforme a la invención son usados como un reactivo para fines diagnósticos o pronósticos, no como un inmunógeno.

En este ejemplo, se usan complejos tetraméricos de antígeno de leucocitos humanos altamente sensibles ("tetrámeros") para un análisis transversal de, por ejemplo, frecuencias de CTL específicas de HLA-A*0201 de 85P1B3 a partir de individuos HLA A*0201-positivos en las etapas diferentes de la enfermedad o después de la inmunización que comprende un péptido de 85P1B3 que contiene un motivo A*0201. Los complejos tetraméricos son sintetizados como se describe (Musey et al., N. Engl. J. Med. 337: 1267, 1997). Brevemente, la cadena pesada de HLA purificada (A*0201 en este ejemplo) y \beta2-microglobulina son sintetizados mediante un sistema de expresión procariota. La cadena pesada es modificada por la deleción de la cola citosólica de transmembrana y la adición del extremo COOH-terminal de una secuencia que contiene un sitio de biotinilación enzimático BirA. La cadena pesada, \beta2-microglobulina, y el péptido son plegados de nuevo por dilución. El producto plegado de nuevo de 45-kD es aislado por cromatografía líquida de la proteína rápida y luego es biotinilado por BirA en presencia de biotina (Sigma, San Louis, Missouri), adenosin 5' trifosfato y magnesio. El conjugado de estreptavidina-ficoeritrina es añadido en una relación molar 1:4, y el producto tetramérico es concentrado a 1 mg/ml. El producto resultante se menciona como tetrámero-ficoeritrina.

Para el análisis de muestras de sangre pacientes, aproximadamente un millón de PBMC son centrifugados en 300 g durante 5 minutos y resuspendidos en 50 \mul de solución salina tamponada de fosfato fría. El análisis tricolor es realizado con tetrámero-ficoeritrina, junto con anti-CD8-Tricolor, y anti-CD38. Los PBMC se incuban con tetrámero y los anticuerpos en hielo durante 30 a 60 minutos y luego se lavan dos veces antes de la fijación de formaldehído. Se aplican barreras para contener > 99,98% de muestras control. Los controles para los tetrámeros incluyen a ambos individuos A*0201-negativo y donantes no enfermos A*0201-positivos. El porcentaje de células teñidas con tetrámero entonces se determina por citometría de flujo. Los resultados indican el número de células en la muestra de PBMC que contienen los CTL restringido por epítopo, indicando así fácilmente el grado de respuesta inmune frente al epítopo de 85P1B3, y así el estado de exposición a 85P1B3, o la exposición a una vacuna que produce una respuesta protectora o terapéutica.

Ejemplo 26 Uso de epítopos de péptido para evaluar respuestas de recuerdo

Los epítopos de péptido de la invención son usados como reactivos para evaluar las respuestas de linfocitos T, tal como las respuestas agudas o de recuerdo, en pacientes. Tal análisis puede ser realizado en pacientes que se han repuesto de la enfermedad asociada a 85P1B3 o que han sido vacunados con una vacuna de 85P1B3.

Por ejemplo, puede ser analizada la respuesta de CTL restringida de clase I de personas que han sido vacunadas. La vacuna puede ser cualquier vacuna de 85P1B3. Los PBMC son recogidos de individuos vacunados y tipo HLA. Los epítopos de péptido apropiados de la invención portadores, óptimamente, de los supermotivos que proporcionan reactividad específica de múltiples miembros de familia de supertipo de HLA, son entonces usados por su análisis de muestras derivados de los individuos que presentan el tipo de HLA.

Los PBMC de individuos vacunados son separados en gradientes de densidad Ficoll-Histopaque (Compañía Química Sigma, San Louis, MO), son lavadas tres veces en HBSS (Laboratorios GIBCO), son resuspendidos en RPMI-1640 (Laboratorios GIBCO) suplementado con L-glutamina (2 mM), penicilina (50 U/ml), estreptomicina (50 \mug/ml) y Hepes (10 mM) que contienen suero AB humano inactivado con calor al 10% (completo RPMI) y son puestos en placas usando formatos de microcultivo. Un péptido sintético que comprende un epítopo de la invención es añadido a 10 \mug/ml a cada pocillo y el epítopo 128-140 de núcleo de HBV es añadido a 1 \mug/ml a cada pocillo como una fuente de linfocitos T adyuvantes durante la primera semana de la estimulación.

En el formato de microcultivo, son estimulados 4 x 10^{5} PBMC con el péptido en 8 cultivos replicados en una placa de 96 pocillos de fondo redondo en 100 \mul/pocillo de RPMI completo. Durante 3 días y 10.100 \mul de RPMI completo y 20 U/ml de concentración final de rIL-2 son añadidos a cada pocillo. El día 7 los cultivos son transferidos a una placa de 96 pocillos de fondo plano y son estimulados de nuevo con el péptido, rIL-2 y células alimentadoras autólogas irradiadas con 10^{5} (3.000 rad). Los cultivos son analizados por su actividad citotóxica el día 14. Una respuesta de CTL positiva que requiere dos o más de los ocho cultivos de replicado muestran una liberación de ^{51}Cr específica de más del 10%, basado en la comparación con sujetos control no enfermos como se describe antes (Rehermann, et al., Nature Med. 2: 1104-1108, 1996; Rehermann et al., J. Clin. Invest. 97: 1655-1665, 1996; y Rehermann et al. J. Clin. Invest. 98: 1432-1440, 1996).

Las líneas celulares diana son autólogas y B-LCL EBV-transformada alogeneicas que son compradas en la sociedad americana de histocompatibilidad e inmunogenética (ASHI, Boston, MA) o son establecidas a partir del grupo de pacientes como se ha descrito (Guilhot, et al. J. Virol. 66: 2670-2678, 1992).

Los ensayos de citotoxicidad son realizados de la manera siguiente. Las células diana consisten en línea celular HLA-emparejada alogeneica o B linfoblastoide EBV-transformada autóloga que se incuban de la noche a la mañana con el epítopo de péptido sintético de la invención a 10 \muM, y se marcan con 100 \muCi de ^{51}Cr (Amersham Corp., Arlington Heights, IL) durante 1 hora después de lo cual son lavadas cuatro veces con HBSS.

La actividad citolítica es determinada en un ensayo de liberación de ^{51}Cr de pocillo dividido de 4 h estándar usando placas de 96 pocillos con fondo en U que contienen 3.000 dianas/pocillo. Los PBMC estimulados son analizados en relaciones efector/diana (E/T) de 20-50:1 el día 14. El tanto por ciento de citotoxicidad se determina a partir de la fórmula: 100 x [(liberación experimental - liberación espontánea) / (liberación máxima - liberación espontánea)]. La liberación máxima se determina por la lisis de dianas mediante detergente (Triton X-100 al 2%; Compañía Química Sigma, San Louis, MO). La liberación espontánea es < 25% de liberación máxima para todos los experimentos.

Los resultados de tal análisis indican el grado al cual las poblaciones de CTL HLA-restringido han sido estimulados por la exposición anterior a 85P1B3 o una vacuna de 85P1B3.

Asimismo, las respuestas de HTL restringido de Clase II también puede ser analizadas. Los PBMC purificados son cultivados en un placa de 96 pocillos de fondo plano a una densidad de 1,5 x 10^{5} células/pocillo y son estimulados con 10 \mug/ml del péptido sintético de la invención, el antígeno 85P1B3 entero o PHA. Las células son puestas rutinariamente en placa en replicados de 4-6 pocillos para cada condición. Después de siete días de cultivo, el medio es retirado y sustituido con medio recién preparado que contiene 10 U/ml de IL-2. Dos días más tarde, se añade a cada pocillo 1 \muCi de ^{3}H-timidina y se sigue la incubación durante 18 horas adicionales. El ADN celular entonces se recolecta en esteras de fibra de vidrio y se analizan según la incorporación de ^{3}H-timidina. La proliferación de linfocitos T específicos de antígeno se calcula como una relación de la incorporación de ^{3}H-timidina en presencia de antígeno dividido por la incorporación de ^{3}H-timidina en ausencia de antígeno.

Ejemplo 27 Inducción de respuesta de CTL específica en seres humanos

Un ensayo clínico en ser humano de una composición inmunogénica que comprende los epítopos de CTL y HTL de la invención se establece como un estudio de escalada de dosis en Fase I IND, y se lleva a cabo como un ensayo aleatorio, dos veces ciego, controlado con placebo. Tal ensayo se diseña, por ejemplo, como sigue:

Un total de aproximadamente 27 individuos se involucran y se dividen en grupos de 3:

Grupo I: a 3 sujetos se les inyecta placebo y a 6 sujetos se les inyecta 5 \mug de composición de péptido;

Grupo II: a 3 sujetos se les inyecta placebo y a 6 sujetos se les inyecta 50 \mug de composición de péptido;

Grupo III: a 3 sujetos se les inyecta placebo y a 6 sujetos se les inyecta 500 \mug de composición de péptido.

Después de 4 semanas después de la primera inyección, todos los sujetos reciben una inoculación de refuerzo en la misma dosificación.

Los puntos finales medidos en este estudio se refieren a la seguridad y tolerabilidad de la composición de péptido así como a su inmunogenicidad. Las respuestas inmunes celulares frente a la composición de péptido son un índice de la actividad intrínseca de esta composición de péptido, y por lo tanto pueden ser vistas como una medida de la eficacia biológica. Lo siguiente resume los datos clínicos y de laboratorio que se refieren a los puntos finales de eficacia y seguridad.

Seguridad: La incidencia de acontecimientos adversos es monitorizada en el grupo de placebo y de tratamiento de fármaco y es evaluada en términos de grado y reversibilidad.

Evaluación de la eficacia de vacuna: Para la evaluación de la eficacia de la vacuna, a los sujetos se les realiza análisis de sangre antes y después de la inyección. Las células mononucleares de sangre periférica son aisladas de la sangre reciente heparinizada por centrifugación por gradiente de densidad de Ficoll-Hypaque, son separadas en alícuotas en medio congelante y son almacenadas congeladas. Las muestras son analizadas según la actividad de CTL y HTL.

Se encuentra que la vacuna es tanto segura como eficaz.

Ejemplo 28 Ensayos en fase II en pacientes que expresan 85P1B3

Se realizan ensayos en fase II para estudiar el efecto de la administración de las composiciones de péptido de CTL-HTL a pacientes que tienen cáncer que expresa 85P1B3. Los objetivos principales del ensayo son para determinar una dosis eficaz y el régimen que induce los CTL en pacientes con cáncer que expresan 85P1B3, para establecer la seguridad de inducir una respuesta de CTL y HTL en estos pacientes, y para ver en qué medida la activación de los CTL mejora el cuadro clínico de estos pacientes, como se manifiesta, por ejemplo, por la reducción y/o la disminución de lesiones. Tal estudio es diseñado, por ejemplo, como sigue:

Los estudios son realizados en múltiples centros. El diseño del ensayo es un protocolo de escalada de dosis de marcador abierto, no controlado, en el que la composición de péptido se administra como una dosis sola seguido de seis semanas más tarde por una revacunación sencilla de la misma dosis. Las dosificaciones son 50.500 y 5.000 microgramos por inyección. Los efectos adversos asociados al fármaco (severidad y reversibilidad) son registrados.

Hay tres agrupaciones de los pacientes. Al primer grupo se les inyecta 50 microgramos de la composición del péptido y al segundo y tercer grupo 500 y 5.000 microgramos de la composición del péptido, respectivamente. Los pacientes dentro de cada grupo tienen una edad de entre 21-65 y representan diversos antecedentes étnicos. Todos ellos tienen un tumor que expresa 85P1B3.

Las manifestaciones clínicas o respuestas de linfocitos T específicos de antígeno son monitorizadas para evaluar los efectos de la administración de las composiciones del péptido. La composición de vacuna se encuentra que es a la vez segura y eficaz en el tratamiento de una enfermedad asociada a 85P1B3.

Ejemplo 29 Inducción de respuestas de CTL usando un protocolo de refuerzo principal

Un protocolo de refuerzo principal similar en su principio subyacente al usado para confirmar la eficacia de una vacuna de ADN en ratones transgénicos, como se describe anteriormente en el Ejemplo titulado "El constructo de plásmido y el grado al cual éste induce la inmunogenicidad" también puede ser usado para la administración de la vacuna a seres humanos. Tal régimen de vacuna puede incluir una administración inicial de, por ejemplo, el ADN desnudo seguido de un refuerzo usando el virus recombinante que codifica la vacuna, o proteína/polipéptido recombinante o una mezcla del péptido administrado en un adyuvante.

Por ejemplo, la inmunización inicial puede ser realizada usando un vector de expresión, tal como el construido en el Ejemplo titulado "Construcción de plásmidos de ADN de multiepítopo del ``minigen''" en forma del ácido nucleico desnudo administrado IM (o SC o ID) en cantidades de 0,5-5 mg en múltiples sitios. El ácido nucleico (de 0,1 a 1000 \mug) también puede ser administrado usando un pistola génica. Después de un período de incubación de 3-4 semanas, entonces se administra una revacunación. El refuerzo puede ser del virus recombinante de la viruela aviar administrado a una dosis de 5-10^{7} a 5x10^{9} pfu. Un virus recombinante alternativo, tal como un MVA, herpes canario, adenovirus, o virus adeno-asociado, también puede ser usado para el refuerzo, o la proteína poliepitópica o puede ser administrada una mezcla de los péptidos. Para la evaluación de la eficacia de la vacuna, se obtienen muestras de sangre de pacientes antes de la inmunización así como a intervalos después de la administración de la vacuna inicial y las revacunaciones de la vacuna. Las células mononucleares de sangre periférica son aisladas de la sangre reciente heparinizada por centrifugación por gradiente de densidad de Ficoll-Hypaque, son divididas en alícuotas en medio congelante y son almacenadas congeladas. Las muestras son analizadas según la actividad de CTL y HTL.

El análisis de los resultados indica que es generada una magnitud de respuesta suficiente para alcanzar una inmunidad terapéutica o protectora contra 85P1B3.

Ejemplo 30 Administración de composiciones de vacuna usando células dendríticas (DC)

Las vacunas que comprenden los epítopos de péptido de la invención pueden ser administradas usando APC, o APC "profesional" tales como DC. En este ejemplo, se administran DC pulsadas por péptido a un paciente para estimular una respuesta de CTL in vivo. En este método, las células dendríticas son aisladas, ampliadas, y pulsadas con una vacuna que comprende el péptido CTL y los epítopos de HTL de la invención. Las células dendríticas son administradas por reinfusión en el paciente para producir las respuestas de CTL y HTL in vivo. El CTL y HTL inducido entonces destruye o facilita la destrucción, respectivamente, de las células diana portadoras de la proteína 85P1B3 de las cuales los epítopos en la vacuna son derivados.

Por ejemplo, un cóctel de péptidos que comprenden el epítopo se administra ex vivo a PBMC, o DC aislado de éstos. Puede ser usado un compuesto farmacéutico para facilitar la recuperación de DC, tal como Progenipoietin® (Monsanto, San Louis, MO) o GM-CSF/IL-4. Después de pulsar las DC con péptidos, y antes de la reinfusión en pacientes, las DC se lavan para eliminar los péptidos desunidos.

Como se aprecia clínicamente, y se determina fácilmente por cualquier experto basado en los resultados clínicos, el número de DC infundidas de nuevo en el paciente pueden variar (véase, por ejemplo, Nature Med. 4:328, 1998; Nature Med. 2: 52, 1996 y Prostate 32: 272,1997). Aunque sean típicamente administradas 2-50 x 10^{6} de DC por paciente, el número más grande de DC, también pueden ser proporcionadas 10^{7} o 10^{8}. Tales poblaciones de células contienen típicamente entre 50-90% de DC.

En algunas realizaciones, se inyectan PBMC cargados de péptido en pacientes sin purificación de las DC. Por ejemplo, el PBMC generado después del tratamiento con un agente tal como Progenipoietin® es inyectado en pacientes sin purificación de DC. El número total de PBMC se administra a menudo en intervalos de 10^{8} a 10^{10}. Generalmente, las dosis de células inyectadas en pacientes están basadas en el porcentaje de DC en la sangre de cada paciente, como se determina, por ejemplo, por análisis de inmunofluorescencia con anticuerpos anti-DC específicos. Así, por ejemplo, si Progenipoietin® moviliza el 2% de DC en la sangre periférica de un paciente dado, y que el paciente debe recibir 5 x 10^{6} DC, entonces al paciente le será inyectado un total de 2,5 x 10^{8} de PBMC cargados de péptido. El tanto por ciento de DC movilizado por un agente tal como Progenipoietin® típicamente, como se estima, está entre el 2-10%, pero puede variar como apreciaría cualquier experto en la técnica.

Activación ex vivo de respuestas de CTL/HTL

De forma alternativa, las respuestas de CTL o HTL ex vivo frente a antígenos de 85P1B3 pueden ser inducidas incubando, en cultivos de tejido, del paciente, o genéticamente compatible, las células precursoras de CTL o HTL junto con una fuente de APC, tal como DC, y péptidos inmunogénicos. Después de un tiempo de incubación apropiado (típicamente de aproximadamente 7-28 días), en el cual las células precursoras son activadas y ampliados en células efectoras, las células son administradas por infusión en el paciente, donde destruirán (CTL) o facilitarán la destrucción (HTL) de sus células diana específicas, es decir, las células tumorales.

Ejemplo 31 Un método alternativo de identificación y confirmación de péptidos portadores de motivo

Otro método de identificación y confirmación de péptidos portadores de motivo es eluirlos de las células que presentan las moléculas MHC definidas. Por ejemplo, las líneas celulares B de EBV transformadas usadas específicas de tejido han sido caracterizadas extensivamente para determinar qué moléculas HLA expresan. En ciertos casos, estas células expresan sólo un tipo solo de molécula HLA. Estas células pueden ser transfectadas con los ácidos nucleicos que expresan el antígeno de interés, por ejemplo 85P1B3. Los péptidos producidos por el procesamiento de antígeno endógeno de péptidos producidos como consecuencia de la transfección entonces se unirán a moléculas HLA dentro de la célula y serán transportados y expresados en la superficie de la célula. Los péptidos entonces son eluidos de las moléculas HLA por la exposición a condiciones suaves ácidas y su secuencia de aminoácidos se determina, por ejemplo, por análisis espectral de masas (por ejemplo, Kubo et al., J. Immunol. 152: 3913, 1994). Como la mayoría de los péptidos que se unen a una molécula HLA portadora de motivo particular, es una modalidad alternativa obtener los péptidos portadores de motivo correlacionados con la molécula particular HLA expresada en la célula.

De forma alternativa, las líneas celulares que no expresan moléculas HLA endógenas pueden ser transfectadas con un constructo de expresión que codifica un alelo solo de HLA. Estas células entonces pueden ser usadas como se describe, es decir, pueden ser transfectados entonces con los ácidos nucleicos que codifican 85P1B3 para aislar los péptidos correspondientes a 85P1B3 que han sido expresados sobre la superficie de la célula. Los péptidos obtenidos a partir de tal análisis llevarán motivo(s) que corresponde a la unión al alelo solo de HLA que se expresa en la célula.

Como se aprecia por cualquiera en la técnica, se puede realizar un análisis similar sobre una célula que lleve más de un alelo de HLA y posteriormente determinar los péptidos específicos para cada alelo de HLA expresado. Además, cualquier experto también reconocería que los otro medios distintos a la transfección, tales como cargar con un antígeno de proteína, pueden ser usados para proporcionar una fuente de antígeno a la célula.

Ejemplo 32 Polinucleótidos complementarios

Las secuencias complementarias a la secuencia que codifica 85P1B3, o cualquiera de sus partes, son usados para detectar, disminuir o inhibir la expresión de 85P1B3 natural. Aunque sea descrito el uso de oligonucleotidos que comprenden de aproximadamente 15 a 30 pares de bases, esencialmente se usa el mismo procedimiento con fragmentos de secuencia más pequeños o más grandes. Los oligonucleotidos apropiados son diseñados usando, por ejemplo, el software OLIGO 4.06 (Biosciences Nacional) y la secuencia de codificación de 85P1B3. Para inhibir la transcripción, un oligonucleotido complementario se diseña a partir de la secuencia 5' más única y se usa para prevenir la unión del promotor a la secuencia de codificación. Para inhibir la traducción, el oligonucleotido complementario se diseña para prevenir la unión ribosomal al transcrito que codifica 85P1B3.

Ejemplo 33 Purificación de 85P1B3 natural o recombinante usando anticuerpos específicos de 85P1B3

La 85P1B3 natural o recombinante se purifica sustancialmente por cromatografía de inmunoafinidad usando anticuerpos específicos para 85P1B3. Una columna de inmunoafinidad es construida acoplando covalentemente el anticuerpo anti-85P1B3 a una resina cromatográfica activada, tal como SEPHAROSE CNBR-activada (Amersham Pharmacia Biotech). Después del acoplamiento, la resina se bloquea y se lava de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

El medio que contiene 85P1B3 se pasa a través de la columna de inmunoafinidad, y la columna se lava en condiciones que permitan la absorbancia preferencial de 85P1B3 (por ejemplo, tampones de alta fuerza iónica en presencia de detergente). La columna es eluida en condiciones que rompan el anticuerpo/unión de 85P1B3 (por ejemplo, tampón de pH 2 a pH 3, o una alta concentración de un caotropo, tal como urea o ión de tiocianato), y GCR.P es recogido.

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Ejemplo 34 Identificación de moléculas que interaccionan con 85P1B3

85P1B3, o sus fragmentos biológicamente activos, se marcan con reactivo de Bolton-Hunter ^{121}I.

(Véase, por ejemplo, Bolton et al. (1973) Biochem. J. 133: 529). Las moléculas candidato antes puestas en grupos en los pocillos de una placa multipocillos son incubadas con 85P1B3 marcada, se lavan, y cualquier pocillo con el complejo de 85P1B3 marcada es analizado. Los datos obtenidos usando diferentes concentraciones de 85P1B3 son usados para calcular los valores para el número, la afinidad y la asociación de 85P1B3 con las moléculas candidato.

En todas partes de esta aplicación, los diversos contenidos de los datos del sitio web, publicaciones, se hace referencia a solicitudes y patentes. (Los websites son referidos por Localizador Uniforme de Recursos, o URL, direcciones en la World Wide Web). Las descripciones de cada uno de estos artículos de información son incorporados por la presente como referencia en este documento en su totalidad.

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Ejemplo 35 Ensayo in vivo para la promoción del crecimiento de tumores de 85P1B3

Se puede confirmar el efecto de la proteína 85P1B3 en el crecimiento de células de tumor in vivo por la sobreexpresión génica en una variedad de células cancerígenas, incluyendo próstata, riñón y vejiga. Por ejemplo, se les puede inyectar SQ a ratones SCID en cada flanco con 1 x 10^{6} células cancerígenas de próstata, riñón o vejiga (tales como células PC3, LNCaP, SCaBER, UM-UC-3, HT1376, RT4, T24, Caki, A-498 y SW839) que contienen el vector vacío de tkNeo o 85P1B3.

Pueden ser usadas al menos dos estrategias: (1) La expresión de 85P1B3 constitutiva conforme a la regulación de un promotor tal como un promotor constitutivo obtenido a partir de genomas de virus tales como el virus de polioma, virus de la viruela aviar (documento de Reino Unido 2.211.504 publicado el 5 de julio de 1989), adenovirus (tal como el Adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y Virus Simian 40 (SV40), o a partir de promotores de mamíferos heterólogos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, a condición de que tales promotores sean compatibles con los sistemas de célula huésped. (2) La expresión regulada en el control de un sistema de vector inducible, tal como ecdisona, tet, etc., puede ser usada a condición de que tales promotores sean compatibles con los sistemas de célula huésped. El volumen del tumor entonces es monitorizado según el aspecto de los tumores palpables y es seguido con el tiempo para validar que las células que expresan 85P1B3 crecen a una velocidad más rápida y que los tumores producidos por las células que expresan 85P1B3 muestran características de agresividad cambiada (por ejemplo, metástasis realzada, vascularización, sensibilidad reducida a fármacos quimioterapéuticos). Además, a los ratones se les puede implantar las mismas células ortotópicamente en próstata, vejiga o riñón para determinar si 85P1B3 tiene un efecto en el crecimiento local en próstata, vejiga o riñón o sobre la capacidad de las células de producir metástasis, específicamente a pulmones o nodos de linfa (Fu, X., et al., Int. J. Cancer, 1991. 49: p. 938-939; Chang, S., et al., Anticancer Res., 1997. 17: p. 3239-3242; Peralta, E. A., et al., J. Urol., 1999. 162: p. 1806-1811).

Además, este ensayo es útil para confirmar el efecto inhibitorio de 85P1B3 de composiciones terapéuticas candidato, tales como, por ejemplo, anticuerpos de 85P1B3 o intracuerpos, y moléculas antisentido de 85P1B3 o ribozimas.

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Ejemplo 36 Inhibición mediada por el anticuerpo monoclonal de 85P1B3 de tumores in vivo

La expresión significativa de 85P1B3 en tejidos de cáncer, junto con su expresión restringida en tejidos normales, hace de 85P1B3 una excelente diana para la terapia con anticuerpos. En los casos en los que el anticuerpo monoclonal diana es una proteína de la superficie de la célula, se ha demostrado que los anticuerpos son eficaces en la inhibición del crecimiento del tumor (Véase, por ejemplo, (Saffran, D., et al., PNAS 10: 1073-1078 o www.pnas.ors/cgi/doi/10.1073/pnas.051624698). En los casos en los que la diana no está sobre la superficie celular, tal como PSA y PAP en el cáncer de próstata, también se ha mostrado que los anticuerpos reconocen e inhiben el crecimiento de células que expresan aquellas proteínas (Saffran, D. C., et al., Cancer and Metastasis Reviews, 1999. 18: p. 437449). Como con cualquier proteína celular con un perfil de expresión restringido, la 85P1B3 es una diana para la inmunoterapia basada en células T.

En consecuencia, la eficacia terapéutica de los anticuerpos monoclonales anti-85P1B3 en modelos de ratón de cáncer de colon humano, riñón, vejiga y próstata es modelada en xenoinjertos de cáncer que expresa 85P1B3 de riñón, vejiga o próstata o líneas celulares de cáncer, como las descritas en el Ejemplo titulado "Ensayo in vivo para la promoción del crecimiento de tumor de 85P1B3", que ha sido modificado para expresar 85P1B3.

La eficacia del anticuerpo sobre el crecimiento del tumor y la formación de la metástasis es confirmada, por ejemplo, en un ratón ortotópico en el modelo de xenoinjerto de cáncer de próstata, colon, vejiga o riñón. Los anticuerpos pueden ser no conjugados, o pueden ser conjugados a una modalidad terapéutica, como se aprecia en la técnica. Se confirma que los anticuerpos monoclonales anti-85P1B3 inhiben la formación de tumores que expresan 85P1B3 de riñón, vejiga y próstata. Los anticuerpos monoclonales anti-85P1B3 también retardan el crecimiento de tumores ortotópicos establecidos y prolongan la supervivencia de los ratones que presentan el tumor. Estos resultados indican la utilidad de los anticuerpos monoclonales anti-85P1B3 en el tratamiento de etapas locales y avanzadas del cáncer. (Véase, por ejemplo, Saffran, D., et al., PNAS 10: 1073-1078 o www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.051624698).

La administración del retraso de los anticuerpos monoclonales anti-85P1B3 estableció el crecimiento del tumor ortotópicos y la metástasis de inhibición a sitios distantes, causando una prolongación significativa en la supervivencia de ratones que padecen un tumor. Estos estudios indican que 85P1B3 es una atractiva diana para la inmunoterapia y demuestran el potencial terapéutico de los anticuerpos monoclonales anti-85P1B3 para el tratamiento local y metastásico del cáncer de riñón, colon, vejiga y próstata.

Este ejemplo demuestra que los anticuerpos monoclonales de 85P1B3 no conjugados inhiben eficazmente el crecimiento de tumores de vejiga humanos cultivados en ratones SCID; de acuerdo con esto una combinación de tales anticuerpos monoclonales eficaces es también eficaz.

Ejemplo 37 Inducción de la respuesta de CTL específica en seres humanos

Un ensayo clínico humano de una composición inmunogénica que comprende epítopos de CTL y HTL de la invención se establece como un estudio de escalada de dosis de Fase I de IND y se lleva a cabo como un ensayo aleatorio, dos veces ciego, controlado por placebo. Tal ensayo se diseña, por ejemplo, como sigue:

Un total de aproximadamente 27 individuos se incluyen y se dividen en 3 grupos:

Los puntos finales medidos en este estudio se refieren a la seguridad y tolerabilidad de la composición de péptido así como a su inmunogenicidad. Las respuestas inmunes celulares frente a la composición de péptido son un índice de la actividad intrínseca de esta composición de péptido, y por lo tanto pueden ser vistas como una medida de eficacia biológica. Lo siguiente resume los datos clínicos y de laboratorio que se refieren a los puntos finales de eficacia y seguridad.

Seguridad: La incidencia de acontecimientos adversos es monitorizada en el grupo de placebo y tratamiento de fármaco y es evaluada en términos de grado y reversibilidad.

Evaluación de la eficacia de la vacuna: Para la evaluación de la eficacia de la vacuna, a los sujetos se les realiza un análisis de sangre antes y después de la inyección. Las células mononucleares de sangre periférica son aisladas de sangre reciente heparinizada por centrifugación por gradiente de densidad de Ficoll-Hypaque, son divididas en alícuotas en medio congelante y son almacenadas congeladas. Las muestras son analizadas según la actividad de CTL y HTL.

La vacuna se encuentra que es tanto segura como eficaz.

Ejemplo 38 Variantes de empalme de 85P1B3

Las variantes de empalme también se llaman transcripciones alternativas. Cuando se transcribe un gen del ADN genómico, el ARN inicial generalmente se empalma para producir el mARN funcional, que tiene sólo exones y que es usado para la traducción en una secuencia de aminoácidos. En consecuencia, un gen dado puede tener el cero frente a muchos productos de mARN empalmadas de forma alternativa. Las transcripciones alternativas cada una tienen un composición de exón único, y pueden tener diferentes partes codificantes y/o no codificantes (extremo 5' o 3'), a partir del transcrito original. Los transcritos alternativos pueden codificar para proteínas similares con la misma función o similar o pueden codificar proteínas con diferentes funciones, y pueden ser expresadas en el mismo tejido al mismo tiempo, o en diferentes tejidos varias veces, las proteínas codificadas por transcripciones alternativas pueden tener localizaciones similares o diferentes celulares o extracelulares, por ejemplo, que se secretan.

Las variantes de empalme son identificados por una variedad de métodos aceptados en la técnica. Por ejemplo, son identificadas variantes de empalme por el uso de datos EST. Primero, todas las EST humanas fueron agrupadas en agrupaciones que muestran identidad directa o indirecta entre sí. Segundo, las EST en la misma agrupación fueron agrupados además en subagrupaciones y fueron montadas en una secuencia consenso. El gen de partida es comparado con la(s) secuencia(s) consenso. Cada secuencia consenso es una potencial variante de empalme para aquel gen (véase, por ejemplo, http://www.doubletwist.com/products/c11_agentsOverview.html). Incluso cuando una variante es identificada que no es un clon de cadena entera, que la parte de la variante es muy útil para la generación de antígeno y para una posterior clonación de la variante de empalme de cadena entera, usando técnicas conocidas en la técnica.

Además, los programas informáticos están disponibles en la técnica que identifica las variantes de empalme basado en secuencias genómicas. Los programas de identificación de la variante genómica incluyen FgenesH (A. Salamov y V. Solovyev, "Ab initio gene finding in Drosophila genomic DNA", Genome Research. Abril de 2000; 10 (4): 51622); Grail (http://compbio.ornl.gov/Grail-bin/EmptyGrailForm) y GenScan (http://genes.mit.edu/GENSCAN.html). Para una discusión general de protocolos de identificación de variante de empalme, véase, por ejemplo, Southan C., "A genomic perspective on human proteases", FEBS Lett., 8 de junio de 2001; 498 (2-3): 2148; de Souza SJ, et al., "Identification of human chromosome 22 transcribed sequences with ORF expressed sequence tags", Proc. Natl Acad Sci USA. 7 de noviembre de 2000; 97 (23): 12690-3.

Para las variantes identificadas por el método basado en EST, la tabla XXI muestra las secuencias de nucleótidos de las variantes de empalme. La Tabla XXII Figura muestra la alineación de la variante de empalme con la secuencia de ácido nucleico de 85P1B3. La Tabla XXIII muestra la alineación sencilla más larga de una secuencia de aminoácidos codificada por una variante de empalme, de los seis marcos de lectura potenciales con 85P1B3. Así, para cada una de las variantes de empalme, el marco de lectura de una variante que codifica la homología del péptido solo contigua más larga entre 85P1B3 y la variante es la orientación del marco de lectura apropiado para la variante. Debido a la posibilidad de secuenciar errores en EST o datos genómicos, también pueden ser codificados por la variante otros péptidos en la orientación del marco de lectura relevante (de 5' a 3' o de 3' a 5'). La tabla XXIV presenta tres de las traducciones de aminoácido cambiadas del marco de la variante de empalme para la orientación del marco de lectura identificado.

Para las variantes identificadas por cualesquiera de los métodos basados en secuencia genómicos, la Tabla XXI muestra las secuencias de nucleótidos de la variante de empalme. La Tabla XXII Figura muestra la alineación de la variante de empalme con la secuencia de ácido nucleico de 85P1B3. La Tabla XXIII muestra la alineamiento de secuencia de aminoácidos de los transcritos predichos con 85P1B3. Los programas informáticos basados en genómicos predicen un transcrito de la secuencia genómica, y no sólo predicen exones, sino que también ajustan el marco de lectura abierto como el primer marco de lectura abierto avanzado. La transcripción predicha no contiene la región no traducida de 5' o 3' (UTR). Esto comienza con ATG y termina con un codón de terminación, TAG, TGA o TAA. En el caso del transcrito es predicho sobre la cadena inversa de la secuencia genómica, la secuencia del transcrito es complementada a la inversa frente a la secuencia genómica de los exones. Así, los programas genómicos proporcionan la secuencia del transcrito correcta, con la orientación de 5' a 3' y +1 como el marco de lectura abierto. Sin embargo, debido a la posibilidad de predicción inexacta de exones o la posibilidad de secuenciar errores en datos genómicos, otros péptidos en el otro marco de lectura abierto avanzado también pueden ser codificados por la variante. La tabla XXIV presenta todas las traducciones de aminoácidos de la variante de empalme en cada uno de los tres marcos de lectura avanzados.

Para confirmar además los parámetros de una variante de empalme, una variedad de técnicas está disponible en la técnica, tal como la validación proteómica, la validación basada en PCR, y la validación 5' RACE, etc. (véase, por ejemplo, Validación proteómica: Brennan SO, Fellows AP, George PM.; "Albumin banks peninsula: a new termination variant characterised by electrospray mass spectrometry". Biochim Biophys Acta. 17 de agosto de 1999; 1433 (1-2): 321-6; Ferranti P, et al., "Differential splicing of pre-messenger RNA produces multiple forms of mature caprine alpha(sl)-casein". Eur J Biochem. 1 de octubre de 1997; 249 (1): 1-7; Validación basada en PCR: Wellmann S, et al., "Specific reverse transcription-PCR quantification of vascular endothelial growth factor (VEGF) splice variants by LightCycler technology". Clin Chem., Abril de 2001; 47 (4): 654-60; Jia HP, et al., "Discovery of new human beta-defensins using a genomics-based approach", Gene. 24 de enero de 2001; 263 (1-2): 211-8; basado en PCR y Validación 5'RACE: Brigle KE, et al., "Organization of the murine reduced folate carrier gene and identification of variant splice forms", Biochim Biophys Acta. 7 de agosto de 1997; 1353 (2): 191-8.

Se sabe en la técnica que las regiones genómicas son sobrereguladas en cánceres. Cuando la región genómica a la cual 85P1B3 constituye el mapa se sobre-regula en un cáncer particular, las variantes de empalme de 85P1B3 se sobre-regulan también. Se describe en este documento que 85P1B3 tiene un perfil de expresión particular. Las variantes de empalme de 85P1B3 que son estructuralmente y/o funcionalmente similares a 85P1B3 comparten este modelo de expresión, sirviendo así como marcadores/antígenos asociados al tumor.

Usando el enfoque del ensamblaje de EST, los inventores identificaron unas variantes de empalme denominadas la variante de empalme 1.

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TABLA XXIA Secuencia de nucleótido de la variante de empalme 1

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6

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TABLA XXIIA Alineación de la secuencia de nucleótido de 85P1B3 con la variante de empalme 1

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Puntuación = 160 bits (83), Valor = 3e-36

Identidades = 83/83 (100%)

Cadena = Más/Más

7

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TABLA XXIIIA Alineación de secuencia de aminoácidos de 85P1B3 y variante de empalme 1

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Valoración = 64,8 bits (135), Valor = 2e-08

Identidades = 28/29 (96%)

Marco = +1 / +3

8

TABLA XXIVA Secuencias del péptido a partir de la traducción de la secuencia de nucleótidos de la variante de empalme 1

9

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Ejemplo 39 Análisis de expresión de variantes de empalme de 85P1B3 en muestras de tejidos normales y de tumor de pacientes

La expresión de 85P1B3 descrito en el Ejemplo 4 fue realizada usando la secuencia SSH de 85P1B3 como una sonda. Esta secuencia de ácido nucleico atraviesa la región 701-1019 del gen de 85P1B3, una región ausente en la variante de empalme 1 de 85P1B3 (Figura 19). Por lo tanto, las transferencias Northern descritas en la Figura 11, Figura 12, Figura 13, Figura 14, Figura 15, Figura 16, Figura 17 y Figura 18 detectaron el transcrito de 85P1B3 pero no la variante de empalme 1.

Una sonda que comprende la región de homología entre 85P1B3 y su variante de empalme 1 es generada (Sonda 1). Esta región atraviesa las posiciones de nucleótido 524-606 de 85P1B3 y 19-101 de la variante de empalma 1. Las transferencias Northern de tejido normal y las transferencias Northern del cáncer del paciente se sondan con la sonda 1. Los resultados tienen dos bandas, y muestran la expresión del transcrito de 1,2 kilobytes de 85P1B3 y el transcrito de su variante de empalme 1.

En otro estudio, se genera una sonda que comprende una región presente en el ORF de la variante de empalme pero no en el ORF de 85P1B3 (Sonda 2). Esta región atraviesa las posiciones de nucleótido 102-496 de la variante de empalme 1. Las transferencias Northern de tejido normal y las transferencias Northern del cáncer del paciente se sondan con la sonda 2. Los resultados tienen bandas individuales, y muestran la expresión de la variante de empalme 1, pero no el transcrito de 85P1B3.

Cuando la variante de empalme 1 de 85P1B3 se expresa en muestras de cáncer de pacientes, y muestra la expresión restringida en tejidos normales, la variante de empalme 1 de 85P1B3 es una diana del cáncer adecuada para el diagnóstico de cáncer y la terapia.

Ejemplo 40 Características de la proteína de la variante de empalme

La proteína de la variante presente se entiende que es parcial, y que comprende así dominios de la proteína completa. Los aminoácidos 7-35 de la proteína 85P1B3 de la variante 1 se alinean con los aminoácidos 172-200 de 85P1B3 con una identidad del 96%, mientras que los aminoácidos restantes corrientes abajo divergen de 85P1B3. Este modelo de alta homología a una sección de la proteína parenteral acoplada a una alta divergencia de las partes restantes de la proteína parenteral forman el signo característico de una variante de empalme.

El análisis de proteína BLAST de la variante 1 muestra que la variante de 85P1B3 es homóloga a OIP5, una proteína humana conocida que está implicada en la adherencia y la invasión de células epiteliales (Brooks GF et al., Mol Microbiol. 1991, 5: 3063; Weel JF et al., J Exp Med. 1991, 173: 1395), con una identidad del 96% en 28 aminoácidos. El análisis por pFam o prosite falló en identificar cualquier motivo. Sin embargo fue observada homología de motivo frente a Glioxalasa I en los aa 114-153 de la proteína de la variante. La Glioxalasa es una enzima detoxificadora que media la glutationa, que protege a las células de los productos finales de glicación avanzados (AGE) (Thornalley PJ. Chem. Biol. Interact. 1998, 111: 137). La Glioxalasa es altamente expresada en células cancerígenas de mama (Rulli A. et al., Breast Cancer Res Treat. 2001, 66: 67).

En cuanto a la localización, la variante de 85P1B3 se localiza en el citoplasma (60,9% de PSORT II citoplásmico) o las mitocondrias (0.519 mitocondrial, PSORT).

Basado en el análisis bioinformático (TMPred, Sosui) la variante de 85P1B3 no aparece contener dominios de transmembrana, pero forma una proteína intracelular soluble. Debido a su homología frente a OIP5 y Glioxalasa I, 85P1B3 está implicada en la adherencia y la invasión de células epiteliales, y tiene un modelo de expresión relacionado con el cáncer.

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Ejemplo 41 Comparación de la homología de 85P1B3 frente a secuencias conocidas

La proteína 85P1B3 de la Figura 3 tiene 229 aminoácidos con un peso molecular calculado de 24,69 kDa, y un pI de 7,02. Se predice que 85P1B3 es una proteína mitocondrial (60,9%) o citoplásmica (21,7).

85P1B3 muestra la mejor homología frente a la proteína 5 que interacciona con Opa humana (gi 2815610, http://
www.ncbi.nlm.nih.gov) compartiendo una identidad del 100% con aquella proteína. Las proteínas asociadas con la opacidad (Opa) fueron identificadas en Neisseria gonorrhoeae como las proteínas de la membrana externa que están implicadas en mediar la adherencia de Neisseria frente a células de mamífero y la invasión de células epiteliales humanas (Brooks GF et al., Mol Microbiol. 1991, 5: 3063; Weel JF et al., J Exp Med. 1991, 173: 1395). Las proteínas OPA se unen a proteínas de membrana, tales como CD66 y la molécula celular relacionada con el antígeno carcinoembriónico (CEACAM), sobre la superficie de células epiteliales humanas y mononucleares, facilitando así la entrada de Neisseria en células del huésped mamífero (Muenzner P et al., J. Biol. Chem. 2001, 276:24331; Chen T et al., J. Exp. Med. 1997, 185: 1557). Para desalinear el papel de Opa en la adhesión e invasión de células humanas, Williams et al. usaron un sistema dos híbridos de levadura para identificar a las proteínas que interaccionan con Opa (Williams JM et al., Mol. Microbiol. 1998, 27:171). Rastreando una genoteca de cDNA para parejas que interaccionan con Opa, ellos identificaron a la proteína 5 que interacciona con Opa o OIP5. OIP5 es una proteína intracelular y citoplásmica con una homología frente al receptor de la hormona tiroides que interacciona con la proteína 6 (TRIP6) (Williams JM y Rest RF. Ann N Y Acad Sci.1996, 797: 288). TRIP6 es una molécula de señalización intracelular que transmite la información al núcleo regulando así la expresión génica (Zhao M et al., Gene Expr. 1999: 207; Wang Y et al., Gene 1999, 234: 403).

Esta información indica que 85P1B3 puede desempeñar un papel en la adherencia y la invasión de células epiteliales en tejidos adyacentes y membranas de internar, y regular la transcripción transmitiendo las señales de la superficie celular al núcleo.

En consecuencia, cuando 85P1B3 funciona como un regulador de adhesión e invasión celular, o como un modulador de transcripción implicado en la activación de genes asociados a la génesis de tumores o en la expresión bloqueante de genes que reprimen la tumorigenesis, 85P1B3 es usado para fines terapéuticos, diagnósticos, pronósticos y/o preventivos.

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Ejemplo 42 Identificación y confirmación de potenciales rutas de transducción de señal

Muchas proteínas de mamífero, según se ha dicho, interaccionan con moléculas de señalización y participan en la regulación de rutas de señalización. (J Neurochem. 2001; 76: 217-223). En particular, OPA, según se ha dicho, se asocia con una fosfatasa y receptores superficiales (Hauck C et al., Infect. Immun. 1999, 67: 5490; Muenzner P et al., J. Biol. Chem. 2001, 276:24331). Usando las técnicas de inmunoprecipitación e inmunotransferencia, se identifican las proteínas que se asocian con 85P1B3 y los acontecimientos de señalización mediados. Varias rutas conocidos que desempeñan un papel en la biología de cáncer pueden ser reguladas por 85P1B3, incluyendo las rutas de fosfolípidos tales como PI3K, AKT, etc., la adhesión y las rutas de migración, incluyendo FAK, Rho, Rac-1, etc., así como cascadas mitógenas/supervivencia tales como ERK, p38, etc. (Cell Growth Differ. 2000, 11: 279; J Biol Chem. 1999, 274: 801; Oncogene. 2000, 19: 3003, J. Cell Biol. 1997, 138: 913.).

Utilizando, por ejemplo, las técnicas de inmunotransferencia se confirma la capacidad de 85P1B3 para regular estas rutas. Las células que expresan o carecen de 85P1B3 son dejadas sin tratar o estimuladas con citoquinas, andrógeno y anticuerpos anti-integrina. Los lisados de células son analizados usando anticuerpos anti-fosfo-específicos (Cell Signaling, Santa Cruz Biotechnology) para detectar la fosforilación y regulación de ERK, p38, AKT, PI3K, PLC y otras moléculas de señalización. Cuando 85P1B3 desempeña un papel en la regulación de rutas de señalización, o individualmente o comunalmente, esto se usa como una diana para fines diagnósticos, pronósticos, preventivos y/o terapéuticos.

Para confirmar que 85P1B3 activa directamente o indirectamente la rutas de transducción de señal conocidas en células, se llevan a cabo ensayos de reportero transcripcionales basados en luciferasa (luc) en células que expresan genes individuales. Estos reporteros transcripcionales contienen sitios de unión consenso para factores de transcripción conocidos que están corriente abajo de rutas de transducción de señal bien caracterizadas. Los reporteros y los ejemplos de estos factores de transcripción asociados, las rutas de transducción de señal y los estímulos de activación son descritos más abajo.

1. NFkB-luc, NFkB/Rel; Ik-quinasa/SAPK; crecimiento/apoptosis/estrés

2. SRE-luc, SRF/TCF/ELK1; MAPK/SAPK; crecimiento/diferenciación

3. AP-1-luc, FOS/JUN; MAPK/SAPK/PKC; crecimiento/apoptosis/estrés

4. ARE-luc, receptor de andrógeno; esteroides/MAPK; crecimiento/diferenciación/apoptosis

5. P53-luc, p53; SAPK; crecimiento/diferenciación/apoptosis

6. CRE-luc, CREB/ATF2; PKA/p38; crecimiento/apoptosis/estrés

Los efectos mediados por gen pueden ser analizados en células que muestran la expresión de mARN. Los plásmidos del reportero de luciferasa pueden ser introducidos por las transfección mediada por lípido (TFX-50, Promega). La actividad de luciferasa, un indicador de la actividad transcripcional relativa, es medida por la incubación de extractos de células con sustrato de luciferina y la luminiscencia de la reacción es monitorizada en un luminómetro.

Las rutas de señalización activadoras por 85P1B3 son mapeadas y usadas para la identificación y la validación de dianas terapéuticas. Cuando 85P1B3 está implicado en la señalización de células, éste se usa como diana con fines diagnósticos, pronósticos, preventivos y/o terapéuticos.

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Ejemplo 43 Participación en la progresión del tumor

El gen de 85P1B3 puede contribuir al crecimiento de células cancerígenas. Se confirma el papel de 85P1B3 en el crecimiento de tumores en una variedad de líneas celulares primarias y transfectadas incluyendo líneas celulares de próstata, colon, vejiga y riñón, así como células NIH 3T3 manipuladas para expresar establemente 85P1B3. Las células parenteral que carecen de 85P1B3 y las células que expresan 85P1B3 se evalúan según el crecimiento celular usando un ensayo de proliferación bien documentado (Fraser SP, Grimes JA, Djamgoz MB. Prostate. 2000; 44: 61, Johnson DE, Ochieng J, Evans SL. Anticancer Drugs. 1996, 7: 288).

Para confirmar el papel de 85P1B3 en el procedimiento de transformación, se investiga su efecto en los ensayos formadores de colonia. Las células NIH3T3 parenterales que carecen de 85P1B3 se comparan con células NHI-3T3 que expresan 85P1B3, usando un ensayo de agar suave en condiciones rigurosas y más permisivas (Song Z. et al. Cancer Res. 2000; 60: 6730).

Para confirmar el papel de 85P1B3 en la invasión y la metástasis de células cancerígenas, se usa un ensayo bien establecido, por ejemplo, un ensayo del Sistema de inserto de Transwell (Becton Dickinson) (Cancer Res. 1999; 59: 6010). Las células de control, incluyendo las líneas celulares de próstata, colon, vejiga y riñón que carecen de 85P1B3 son comparadas con células que expresan 85P1B3. Las células son cargadas por el tinte fluorescente, calceína, y puestas en placa en la parte superior del pocillo del inserto de Transwell cubierto de un análogo de base de membrana. La invasión se determina por la fluorescencia de células en la cámara inferior en relación con la fluorescencia de la población de célula entera.

85P1B3 también puede desempeñar un papel en el ciclo celular y la apoptosis. Las células parenterales y las células que expresan 85P1B3 son comparadas según sus diferencias en la regulación del ciclo celular usando un ensayo BrdU bien establecido (AbdeMalek ZA. J Cell Physiol. 1988, 136: 247). Brevemente, las células son cultivadas bajo condiciones óptimas (suero completo) y limitantes (suero inferior) se marcan con BrdU y se tiñen con anticuerpo anti-BrdU y yoduro de propidio. Las células son analizadas por su entrada en las fases Gl, S y G2M del ciclo celular. De forma alternativa, el efecto del estrés en la apoptosis se evalúa en células parenterales control y células que expresan 85P1B3, incluyendo células normales y de tumor de próstata, colon y pulmonares. Las células manipuladas y parenterales son tratadas con varios agentes quimioterapéuticos, tales como etopósido, flutamida, etc., e inhibidores de síntesis de proteína, tal como la cicloheximida. Las células son teñidas con annexina V-FITC y la muerte celular se mide por análisis FACS. La modulación de muerte celular por 85P1B3 puede jugar un papel crítico en la regulación de la progresión del tumor y la carga tumoral.

Cuando 85P1B3 desempeña un papel en el crecimiento de la célula, la transformación, la invasión o la apoptosis, esto se usa como una diana para fines diagnósticos, pronósticos, preventivos y/o terapéuticos.

Ejemplo 44 Participación en la angiogénesis

La angiogénesis o la nueva formación de vasos sanguíneos capilares es necesaria para el crecimiento del tumor (Hanahan D, Folkman J. Cell. 1996, 86:353; Folkman J. Endocrinology. 1998 139: 441). Varios ensayos han sido desarrollados para medir la angiogénesis in vitro e in vivo, tales como el análisis del cultivo de tejido formación del tubo celular endotelial y la proliferación de células endoteliales. Usando estos ensayos así como la neo-vascularización in vitro, el papel de 85P1B3 en la angiogénesis, confirma la potenciación o la inhibición.

Por ejemplo, son evaluadas células endoteliales manipuladas que expresan 85P1B3 usando ensayos de formación de tubo y proliferación. También se confirma el efecto de 85P1B3 en modelos de animal in vivo. Por ejemplo, las células que expresan o carecen de 85P1B3 son implantadas subcutáneamente en ratones inmunodeprimidos.

La migración de células endoteliales y la angiogenesis son evaluadas 5-15 días más tarde usando técnicas de inmunohistoquímica. Cuando 85P1B3 afecta a la angiogenesis, esto se usa como una diana para fines diagnósticos, pronósticos, preventivos y/o terapéuticos.

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Ejemplo 45 Regulación de la transcripción

La localización citoplásmica de 85P1B3 y su semejanza con TRIP5 apoya el uso conforme a la presente invención de 85P1B3 como un modulador de la regulación transcripcional de genes eucariotas.

La regulación de la expresión génica es confirmada, por ejemplo, estudiando la expresión génica en células que expresan o carecen de 85P1B3. Para este fin, son realizados dos tipos de experimentos.

En el primer grupo de experimentos, ARN de células parenterales y que expresan 85P1B3 es extraído e hibridado en series génicas disponibles en el comercio (Clontech) (Smid-Koopman E et al. Br J. Cancer 2000, 83: 246). El resto de las células así como las células tratadas con FBS o andrógeno son comparadas. Los genes expresados diferencialmente son identificados conforme a procedimientos conocidos en la técnica. Los genes expresados diferencialmente entonces son mapeados frente a rutas biológicas (Chen K et al. Thyroid. 2001, 11: 41.).

En el segundo grupo de experimentos, la activación de la ruta transcripcional específica es evaluada usando a constructos de reportero de luciferasa disponibles en el comercio (Stratagene) incluyendo: NFkB-luc, SRE-luc, ELK1-luc, ARE-luc, p53-luc, y CRE-luc. Estos reporteros transcripcionales contienen los sitios de unión consenso para factores de transcripción conocidos que están corriente abajo de rutas de transducción de señal bien caracterizadas, y representan una buena herramienta para averiguar la activación de la ruta y rastrear moduladores positivos y negativos de la activación de ruta.

Cuando 85P1B3 desempeña un papel en la regulación génica, esto se usa como una diana para fines diagnósticos, pronósticos, preventivos y/o terapéuticos.

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Ejemplo 46 Participación en la adhesión de células

La adhesión de células juega un papel crítico en la colonización de tejido y la metástasis. 85P1B3 puede participar en la organización celular, y como una adhesión de células de consecuencia y motilidad. Esto está apoyado por la presencia de un motivo RGD en la parte N-terminal de 85P1B3 (véase la Tabla XIX). Para confirmar que 85P1B3 regula la adhesión de células, las células control que carecen de 85P1B3 son comparadas con células que expresan 85P1B3, usando técnicas antes descritas (véase, por ejemplo, Haier et al., Br. J. Cancer. 1999, 80: 1867; Lehr y Pienta, J. Natl. Cancer Inst. 1998, 90: 118). Brevemente, en una realización, células marcadas con un indicador fluorescente, tal como calcina, son incubadas en pocillos de cultivo de tejido revestidos de medio solo o de proteínas de matriz. Las células adherentes son detectadas por análisis fluorométrico y la adherencia es calculada en tanto por ciento. En otra realización, las células que carecen o que expresan 85P1B3 son analizadas según su capacidad de mediar la adherencia de célula a célula usando técnicas experimentales similares como se describe anteriormente. Ambos de estos sistemas experimentales son usados para identificar proteínas, anticuerpos y/o pequeñas moléculas que modulan la adherencia de células a la matriz extracelular y la interacción de célula a célula. Ya que la adherencia de las células juega un papel crítico en el crecimiento del tumor, la progresión, y la colonización, cuando 85P1B3 está implicado en estos procesos esto sirve como una modalidad diagnóstica, pronóstica, preventiva y/o terapéutica.

Ejemplo 47 Asociación de proteína-proteína

Se ha mostrado que dos proteínas con homología frente a 85P1B3, a saber OIP5 y TRIP6, interaccionan con otras proteínas, regulando así la transducción de la señal, la transcripción génica, y la adhesión de células. Usando técnicas de inmunoprecipitación así como sistemas de dos híbridos de levadura, son identificadas las proteínas que se asocian con 85P1B3. Los inmunoprecipitados de células que expresan 85P1B3 y células que carecen de 85P1B3 son comparadas según las asociaciones proteína-proteína específicas.

Los estudios son realizados para confirmar el grado de asociación de 85P1B con moléculas efectoras, tales como receptores, proteínas adaptadoras y proteínas que contienen SH_{2}. Los estudios que comparan las células 85P1B3 positivas y 85P1B3 negativas así como los estudios que comparan células no estimuladas/restantes y las células tratadas con activadores de célula epiteliales, tales como citoquinas, factores de crecimiento, andrógeno y anticuerpo anti-integrina revelan interacciones únicas.

Además, las interacciones de proteína-proteína son confirmadas usando la metodología de dos híbridos de levadura (Curr Opin Chem Biol. 1999, 3: 64). Un vector que presenta una genoteca de proteínas fusionadas al dominio de activación de un factor de transcripción es introducido en la levadura que expresa una proteína de fusión del dominio de unión de 85P1B3-DNA y un constructo de reportero. La interacción proteína-proteína es detectada por la actividad colorimétrica del reportero. La asociación específica con moléculas efectoras y factores de transcripción le dirige al experto al modo de acción de 85P1B3, y así sus identifica fines terapéuticos, pronósticos, preventivos y/o diagnósticos para el cáncer. Estos y otros ensayos similares también son usados para identificar y seleccionar pequeñas moléculas que interaccionan con 85P1B3.

Cuando 85P1B3 se asocia con proteínas o pequeñas moléculas esto se usa como una diana para fines diagnósticos, pronóstico, preventivos y/o terapéuticos.

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Tablas

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TABLA I Tejidos que expresan 85P1B3 cuando son malignos

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\quad: - próstata

\quad: - vejiga

\quad: - riñón

\quad: - colón

\quad: - pulmón

\quad: - ovario

\quad: - pecho

\quad: - estómago

\quad: - útero

\quad: - cerviz

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TABLA II Abreviaturas de aminoácidos

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TABLA III Matriz de sustitución de aminoácidos

Adaptado a partir de la matriz de sustitución de aminoácidos del Software GCG 9.0 BLOSUM62 (matriz de sustitución de bloqueo). El valor más alto, la sustitución más probable es encontrada en proteínas naturales relacionadas. (Véase URL www.ikp.unibe.ch/manual/blosum62.html)

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TABLA IV (A)

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Los residuos en negrita son preferidos, los residuos puestos en cursiva son menos preferidos: Un péptido es considerado portador de motivo si tiene anclas primarias en cada posición de anclaje primaria para un motivo o supermotivo como se especifica en la tabla anterior.

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TABLA IV (B) Supermotivo HLA clase II

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TABLA XIX Motivos y modificaciones Post-translacionales

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TABLA XXV Propiedades de la proteína

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Claims

1. Un método in vitro para detectar los niveles de expresión de un producto génico en una muestra de ensayo y una muestra normal, comprendiendo el método:

comparar los niveles de expresión del producto génico detectado en la muestra de ensayo y la muestra normal; en el que el producto génico es seleccionado a partir del grupo que consiste en un mARN correspondiente a la Figura 2 o una proteína que es al menos 90% idéntica a la Figura 2 y por la cual la presencia de niveles elevados de producto génico en la muestra de ensayo en relación con la muestra normal indica la presencia de un cáncer en un tejido seleccionado del grupo que consiste en próstata, vejiga, riñón, colon, pulmón, ovario, mama, estómago, útero y cerviz.

2. El uso de un anticuerpo o sus fragmentos que se une específicamente a una proteína de la reivindicación 1 para la preparación de un medicamento que inhibe el crecimiento de células cancerígenas que expresan la proteína de la Figura 2.

3. El uso de una composición inmunogénica para la fabricación de un medicamento para generar una respuesta inmune de mamífero dirigido a una proteína de la reivindicación 1 para el tratamiento del cáncer.

4. El uso de la reivindicación 3, en el que la proteína comprende al menos un epítopo de linfocitos T o al menos de células B.

5. El uso de la reivindicación 4, en el que la respuesta inmune comprende una célula B inducida que genera anticuerpos que se unen específicamente a la proteína.

6. El uso de la reivindicación 4, en el que la respuesta inmune comprende linfocitos T citotóxicos activados (CTL) que matan a las células autólogas que expresan a la proteína.

7. El uso de la reivindicación 4, en el que la respuesta inmune comprende linfocitos T auxiliares (HTL) activados que secretan las citoquinas que facilitan la actividad citotóxica de un CTL o el anticuerpo que produce la actividad de células B.

8. Un ensayo in vitro para detectar la presencia de una proteína de la reivindicación 1 o polinucleótido de la reivindicación 1 en una muestra de ensayo que comprende las etapas de:

determinar que hay un complejo de la sustancia y la proteína o la sustancia y el nucleótido, por el cual la presencia de niveles elevados de producto génico en la muestra de ensayo en relación con la muestra normal indica la presencia de un cáncer en un tejido seleccionado a partir del grupo que consiste en próstata, vejiga, riñón, colon, pulmón, ovario, mama, estómago, útero y cerviz.

9. Un ensayo de la reivindicación 8, en el que el polinucleótido es un mARN que codifica la proteína.

10. El uso de la reivindicación 3, en el que la composición inmunogénica comprende un vector de expresión viral que codifica y expresa la proteína que tiene al menos una identidad de secuencia del 90% respecto a la Figura 2.

11. El método de la reivindicación 1, en el que el mARN corresponde a la secuencia de nucleótidos de la Figura 2.

12. El método de la reivindicación 1, en el que la proteína comprende la secuencia de aminoácidos de la Figura 2.

13. El uso de la reivindicación 2, en el que la proteína comprende la secuencia de aminoácidos de la Figura 2.

14. El uso de la reivindicación 4, en el que la proteína comprende la secuencia de aminoácidos de la Figura 2.

15. El ensayo de la reivindicación 8, en el que el polinucleótido comprende la secuencia de nucleótidos de la Figura 2.

16. El ensayo de la reivindicación 8, en el que la proteína comprende la secuencia de aminoácidos de la Figura 2.