CH686982A5 - Méthode pour le diagnostic de cancers. - Google Patents

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CH686982A5 CH03761/93A CH376193A CH686982A5 CH 686982 A5 CH686982 A5 CH 686982A5 CH 03761/93 A CH03761/93 A CH 03761/93A CH 376193 A CH376193 A CH 376193A CH 686982 A5 CH686982 A5 CH 686982A5
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Philippe Anker
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Description

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CH 686 982 A5
Description
La présente invention concerne une méthode de diagnostic et/ou de suivi de l'évolution de divers types de cancers après un traitement de chimiothérapie ou après une opération.
On sait que le diagnostic et le suivi de l'évolution des cancers sont effectués, à part l'observation et l'examen direct de tumeurs, par analyse de biopsies ou, dans le cas de cancers du sang, de la mœlie osseuse, ce qui implique soit une intervention chirurgicale soit un test invasif du type biopsie ou aspiration médullaire avec aiguille. Or, en plus du caractère désagréable voire dangereux pour les patients de telles méthodes, il a été constaté qu'elles pouvaient en outre être peu précises. Dans le cas de certaines maladies leucémiques par exemple, l'analyse de l'échantillon de moelle prélevée n'a pas permis de retrouver toutes les variétés clonales malignes.
Le but de cette invention consiste donc à fournir une méthode de diagnostic de cancers qui soit d'une part plus précise et plus fiable et d'autre part qui soit plus facile à réaliser et n'impliquant pas de test invasif sur les patients.
La méthode de diagnostic et/ou suivi de l'évolution de cancers, objet de l'invention et visant à atteindre le but précité, comprend l'analyse de l'acide désoxyribonucléique (ADN) présent dans le plasma sanguin.
Il a en effet maintenant pu être démontré que des patients atteints de différentes maladies cancéreuses présentaient des taux augmentés d'ADN dans le plasma sanguin. La méthode de diagnostic selon l'invention est donc basée sur la détection de mutations géniques dans cet ADN plasmique, la plasma sanguin étant un matériau humain beaucoup plus facilement accessible que des biopsies de tumeurs par exemple. Ainsi, des mutations d'oncogènes sont fréquemment mises en évidence dans de nombreux types de tumeurs malignes, et parmi elles les mutations du gène ras sont particulièrement significatives. Toutefois, la méthode peut s'appliquer à n'importe quel type de mutation ou délé-tion de gènes ras, APC, DCC, P53, etc., ou n'importe quel oncogène ou antioncogène (gène de suppression de tumeurs). On a même observé que différentes mutations des gènes ras détectées dans l'ADN du plasma sanguin pouvaient être absentes dans l'ADN des cellules sanguines périphériques ou dans le cas de certains patients leucémiques de la moelle osseuse, ce qui tend à confirmer la plus grande fiabilité de la méthode selon l'invention en comparaison avec les méthodes de diagnostic connues.
D'une manière générale, la méthode de diagnostic selon l'invention consiste à extraire l'ADN du plasma sanguin, à purifier et amplifier cet ADN, puis à déterminer les mutations ou délétions géniques dans celui-ci, ceci en principe de manière comparative entre le plasma sanguin d'une personne présumée malade et celui de personnes en bonne santé.
La portée de la présente invention s'étend à toute technique d'extraction, purification et amplification d'ADN du plasma sanguin; de même, n'importe quelle méthode de détermination des mutations géniques peut être utilisée.
La méthode de diagnostic selon l'invention sera maintenant illustrée plus en détails en référence aux deux exemples qui suivent:
Exemple 1;
Diagnostic du cancer du colon par détection de mutations du gène K-ras.
Dans cette première application de la méthode selon l'invention, on a utilisé la détermination de mutations dans le codon 12 des gènes K-ras contenus dans des adénocarcinomes du colon. Ces mutations apparaissent généralement lors de la transition du stade adénome I en adénome II, avant la délé-tion ou la mutation du gène P53, c'est-à-dire relativement tôt dans l'évolution de la tumeur.
Des échantillons de sang (20-30 ml) de 15 patients présentant différents stades d'adénocarcinome colorectal ont été prélevés sur héparine, ces patients n'ayant reçu durant cette période aucun médicament anti-cancéreux. Treize des 15 patients ont ensuite subi une ablation chirurgicale de la tumeur; de même, on a également prélevé environ 400 ml de sang au total sur des personnes saines afin d'en isoler l'ADN du plasma.
L'ADN a été extrait des tumeurs et des cellules sanguines selon des techniques usuelles bien connues.
Quant à l'extraction de l'ADN du plasma sanguin, elle peut être effectuée de la manière suivante: le plasma est d'abord soumis à des traitements par du phénol, de l'éther et du choloroforme. Après dialyse contre la SSC (chlorure de sodium 0,15 M, citrate de trisodium 0,015 M), on fait passer le produit à travers une colonne Concanavaline A-Sépharose afin d'éliminer les Polysaccharides, puis on le centrifuge dans un gradient de CS2SO4.
L'ADN ainsi extrait et purifié (10 à 100 ng) a ensuite été soumis à une amplification par PCR du premier exon du gène K-ras dans un volume de 100 ni.
Les amplimers étaient le 5-G ACT G AAT ATAA ACTTGTGGTAGT-3' et le 5'-CT ATT GTT GGAT CAT ATT CGT CC-3'.
Les amplifications ont été effectuées dans un tampon contenant 50 mM de KCl, 10 mM de Tris-MCI
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à pH 0,3, 200 mM de chaque nucléotide, 1,8 mM de MgCh, 0,2 (iM de chaque précurseur et 2,5 unités de «AmpliTaq» ADN polymérase. 35 cycles ont été réalisés pour l'ADN des tumeurs et des cellules sanguines et 45 cycles pour l'ADN du plasma (94°C pendant 1 min., 59°C pendant 1,5 min., 72°C pendant 1 min., le dernier cycle étant prolongé de 7 min. à 72°C).
En ce qui concerne la détection des mutations, elle peut être effectuée par n'importe quelle méthode connue et appropriée. Dans le présent exemple, elle a été réalisée de deux manières différentes pour chaque échantillon testé.
(a) Hybridisation de produits PCR avec sondes oligonucléotiques spécifiques aux mutations (selon Verlaan de Vries et al., Gene 50, 313-320, 1986):
Les produits PCR ont été disposés en quantités égales sur des membranes «Zeta-probe» (Bio-Rad, Hercules, CA) et hybridisées avec les oligonucléotides spécifiques pour des K-ras mutants ou sauvages. Les oligonucléotides étaient marqués avec 32P ddATP (Amersham, GB). Afin de séparer les hybrides parfaits des «mismatchs», le lavage final des membranes a été effectué dans une solution contenant du chlorure de tétraméthylamonnium 3M, 50 mM de Tris-HCI à pH 8,0 et 0,2 mM EDTA et 0,1% SDS à 58°C pendant 1 heure.
(b) Amplification PCR avec amplimers spécifiques de mutations ponctuelles ou amplification PCR pour allèles spécifiques (PASA) (selon Sommer et al, Biotechnique 12, 82-87, 1992):
Dans cette méthode plus sensible, l'ADN est soumis à une amplification PCR avec des amplimers complémentaires aux séquences normales GLY ou mutées ALA, VAL, SER, ASP ou CYS. Les amplimers spécifiques aux mutations ont des terminaisons 3' complémentaires aux mutations au point spécifiques. L'enzyme Taq I polymérase (Perkin-Elmer Cetus, CH), n'a pas d'activité exonucléasique en 3' et est donc incapable d'amplifier l'ADN si le mismatch d'une seule base est situé à la terminaison 3' de l'amplimer.
Chaque PCR a été effectué dans un volume de 40 ^ d'une solution contenant 50 mM de KCl, 10 mM de Tris-HCI à pH 8,3, 2 mM de chaque nucléotide, 0,7 mM MgCI2, 0,2 mM de chaque précurseur et 1 unité de «AmpliTaq» ADN polymérase. Trente-cinq cycles ont été effectués (94°C pendant 1 min., recuit à 55-62°C pendant 2 min., extension à 72°C pendant 1 min.). Le dernier cycle a été étendu de 7 min. à 72°C.
Chaque réaction a été amorcée avec la technique «hot-start». Les amplimers utilisés étaient les suivants:
5'-ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGG-3' pour le K-ras sauvage (renaturation à 55°C), 5'-ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGC-3' pour le mutant ALA 12 (renaturation à 62°C), 5'-ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGT-3' pour le mutant VAL 12 (renaturation à 61 °C), 5'-ACTTGTGGTAGTTGGAGCTA-3' pour le mutant SER 12 (renaturation à 59°C), 5-ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGA-3' pour le mutant ASP 12 (renaturation à 60°C), 5'-ACTTGTGGTAGTTGGAGCTT-3' pour le mutant CYS 12 (renaturation à 59°C) et dans chaque cas l'amplimer «antisense» 5-CTATTGTTGGATCATATTCGTCC-3'.
Après amplification, les produits de la réaction ont été analysés par électrophorèse dans un gel de Polyacrylamide 0,8%.
En utilisant la première technique (a) décrite ci-dessus, il s'est avéré qu'il n'était pas possible de mettre en évidence les mêmes mutations dans l'ADN du plasma que celles détectées dans l'ADN des tumeurs prélevées (GLY en VAL, GYS en ALA); cette technique ne semble pouvoir être appliquée ici que si environ 10% au moins de l'ADN total présente une mutation ponctuelle. Par contre, les mutations précitées ont pu être identifiées dans l'ADN du plasma avec la seconde technique (b) décrite précédemment; il apparaît que cette technique permet d'identifier les mutations dans un échantillon d'ADN du plasma mélangé avec un excès de 104 à 105 d'ADN normal non muté. D'autre part, avec la même technique, il n'a pas été possible de détecter les mêmes mutations sur les échantillons d'ADN de cellules sanguine.
Enfin, tous les échantillons de contrôle provenant de personnes en bonne santé se sont révélés négatifs, c'est-à-dire ne présentant pas de mutations de l'ADN du plasma.
Exemple 2:
Diagnostic de cancers dus à des désordres myéloïdes par détection de mutations du gène N-ras.
On sait qu'une prédominance de mutations N-ras ont été observées dans l'ADN de la moelle osseuse de patients présentant un syndrome myélodysplasique (MDS) ou une leucémie myéloblastique aigüe (AML).
On a prélevé 20 à 30 ml de sang sur dix patients atteints de AML ou MDS, ce sang étant recueilli sur héparine et centrifugé sur gradient «Ficoll Hipaque» (Pharmacia, SE). On a également prélevé 400 ml de sang sur des personnes saines. L'interphase contenant des cellules mononucléaires a été recueilli et utilisé pour l'extraction de l'ADN des cellules sanguines. La phase supérieure a été centrifugée à 2500 G pendant 15 minutes, et le surnagent a été utilisé pour l'extraction de l'ADN du plasma. De plus, quelques échantillons de moelle osseuse des mêmes patients ont été prélevés pour analyse de contrôle.
L'ADN des cellules sanguines et de la moelle a été isolé par traitement à la Protéinase K (Merck,
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DE) en présence de SDS, puis extraction au phénol, précipitation à l'éthanol et gradient de CS2SO4. L'ADN du plasma a été extrait comme décrit dans l'exemple 1.
L'ADN (10-100 ng) a été amplifié dans un volume de 100 pJ. Les amplimers utilisés (Oncogène Science, NY, USA) étaient 5-GACT G AGT AC AAACT GGT GG-3' et 5-CT CT AT GGT GGGAT CAT ATT-3' pour le premier exon du gène N-ras. Les amplifications ont été effectuées dans un «Thermo-Cycler 480» automatique (Perkin-Elmer Cetus, CH) dans les mêmes conditions que celles de l'Exemple 1. Chaque cycle consistait en une étape de dénaturation à 94°C pendant 1 minute, une renaturation (à 51°C pour N-ras) pendant 1,5 minutes et une extension d'une minute à 72°C avec un troisième segment d'extension de 5 secondes par cycle. Le dernier cycle a été suivi par une extension de 7 minutes à 72°C. Les produits de l'amplification (109 np) ont été analysés par électrophorèse dans du gel Polyacrylamide 0,8%.
Les deux mêmes méthodes de détection des mutations que dans l'Exemple 1 ont été employées. Dans la seconde technique (b), on a utilisé comme amplimers pour N-ras 5 -CTGGTGGTGGTTGGAGCAGA-3' pour le mutant ASP 12,
5 -GGTGGTGGTTGGAGCAGGTT-3' pour le mutant CYS 13, et 5-CT CT ATGGTGGGAT CAT ATT-3' comme amplimer «antisense».
Les résultats des analyses obtenus permettent de confirmer que l'ADN des patients malades présentait une ou plusieurs mutations du codon 12 (GLY en CYS ou en ASP) ou du codon 13 (GLY en CYS) du gène N-ras, alors que toutes ces mutations n'ont pas pu être identifiées dans l'ADN des cellules sanguines, ni même dans celui de la mœlle osseuse.
Ainsi, il ressort des deux exemples illustratifs ci-dessus que l'analyse de l'ADN du plasma sanguin peut constituer une méthode de diagnostic et du suivi de l'évolution d'une maladie cancéreuse qui est plus pratique, moins traumatisante (simple prélèvement de sang chez le patient) et parfois même plus fiable que les méthodes connues impliquant le prélèvement d'une biopsie.

Claims (7)

Revendications
1. Méthode pour le diagnostic et/ou le suivi de l'évolution de cancers comprenant l'analyse de l'acide désoxyribonucléique (ADN) présent dans le plasma sanguin.
2. Méthode selon la revendication 1 comprenant l'extraction de l'ADN présent dans le plasma sanguin, la purification et l'amplification de l'ADN, et la détection de mutations géniques dans cet ADN.
3. Méthode selon la revendication 2, dans laquelle on détecte les mutations ou délétions d'oncogè-nes, ou bien les mutations ou délétions de gènes suppresseurs de tumeurs.
4. Méthode selon la revendication 3, dans laquelle la détection est appliquée à tout oncogène ou an-tioncogène ou gène de suppression de tumeurs, par exemple aux gènes APC, ras, DCC ou P53.
5. Méthode selon l'une des revendications 2 à 4, dans laquelle l'ADN est amplifié par réaction de la polymérase en chaîne (ci-après «PCR»).
6. Méthode selon l'une des revendications 2 à 5, dans laquelle la détection des mutations géniques est effectuée par hybridisation des produits par PCR avec des sondes oligonucléotiques spécifiques aux mutations.
7. Méthode selon l'une des revendications 2 à 5, dans laquelle la détection des mutations géniques est effectuée par amplification par PRC avec des amplimers spécifiques aux mutations ponctuelles.
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