ES2311736T3 - Tintes hidrofilicos de cianina tiol reactivo y conjugados de los mismos con biomoleculas para el diagnostico por fluorescencia. - Google Patents

Tintes hidrofilicos de cianina tiol reactivo y conjugados de los mismos con biomoleculas para el diagnostico por fluorescencia. Download PDF

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Abstract

Tinte de indotricarbocianina de fórmula general (I), (Ver fórmula) en la cual X es O, S o C que es sustituida en dos lugares, por lo que los sustituyentes pueden ser seleccionados de metilo, etilo, propilo, isopropilo y/o butilo, Y es CH2-CH2 o CH2-CH2-CH2, Z es C1 a C5 alquileno; por lo que los átomos de C son reemplazados opcionalmente por O o por S, o es (Ver fórmula) R1 a R4, independientemente uno de otro, son SO3H o H, con la condición de que al menos tres de R1 a R4 sean SO3H, R 5 es -CO-NH-R8-R9, -NH-CS-NH-R8-R9 o -NH-CO-R8-R9, en la cual R8 es seleccionado del grupo que consiste en C2-C13 alquileno no ramificado en el cual los átomos de C son reemplazados opcionalmente por O o por S, y R 9 es seleccionado de (Ver fórmula) o cloroacetilo, bromoacetilo, yodoacetilo, cloroacetamido, yodoacetamido, cloroalquilo, bromoalquilo, yodoalquilo, disulfuro de piridilo y vinil sulfonamida, y en la cual R6 y R7 son CH o están conectados para formar un anillo hexilo mediante un C3-alquileno que opcionalmente puede ser sustituido en para-posición por un radical C1-C4 alquilo, y sales y solvatos de este compuesto.

Description

Tintes hidrofílicos de cianina tiol reactivo y conjugados de los mismos con biomoléculas para el diagnóstico por fluorescencia.
La presente invención se relaciona con nuevos tintes de fluorescencia de la clase de tintes de cianina, especialmente indotricarbocianina con un máximo de absorción y fluorescencia en el rango espectral entre 700 y 900 nm, un grupo tiol reactivo específico y tres, preferiblemente cuatro, grupos sulfonato, para un incremento en la solubilidad en agua así como en la producción de tintes. Esta invención también se relaciona con los conjugados de estos tintes con biomoléculas y los usos de los mismos.
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Antecedente de la invención
El uso de la luz en el diagnóstico médico ha ganado importancia recientemente (ver, por ejemplo, Biomedical Fotonics Handbook (editor: T. Vo-Dinh) CRP Press). Una amplia variedad de procedimientos de diagnóstico son encontrados en la prueba experimental para la aplicación en diversas disciplinas médicas, como por ejemplo, endoscopia, mamografía, cirugía o ginecología. Los procesos basados en la luz tienen una alta sensibilidad instrumental y hacen posible la detección y representación de imágenes moleculares de las cantidades más pequeñas de cromóforos y/o fluoróforos (Weissleder y otros (2001) Molecular Imaging, Radiology 219, 316-333).
Los tintes que son introducidos al tejido como medios de contraste exógenos para el diagnóstico por fluorescencia y la representación de imágenes, y aquí en particular tintes fluorescentes con un máximo de absorción y fluorescencia en el rango espectral entre 700 y 900 nm (ventana diagnóstica del tejido), son de especial interés para el uso in vivo. Los fotones de esta longitud de onda son comparativamente poco absorbidos por el tejido y por lo tanto pueden penetrar varios centímetros en el tejido antes de que el proceso de absorción (primariamente por medio de oxihemoglobina y deoxihemoglobina) termine el transporte de la luz. La absorción puede tener lugar, además, por los tintes fluorescentes que son introducidos en el tejido, pero que emiten la energía absorbida en forma de radiación fluorescente de onda más larga. Esta radiación fluorescente puede ser detectada separada espectralmente y posibilita la localización de los tintes y la correlación con estructuras moleculares a las cuales el tinte se ha adherido (ver en este sentido también a Licha, K. (2002) Contrast Agents for Optical Imaging) (Review). En: Topics in Current Chemistry - Contrast Agents II (Editor: W. Krause), Volumen 222, Springer Heidelberg, pp. 1-31.).
Para lograr una diferenciación significativa desde el punto de vista del diagnóstico entre las estructuras enfermas y los tejidos sanos, el tinte que es alimentado debe conducir a una diferencia de concentración entre los tejidos tan alta como sea posible. Esto puede ser llevado a cabo basado en las propiedades fisiológicas de los tumores (suministro de sangre, cinética de distribución y eliminación demorada). Para el marcado molecular de estructuras específicas de enfermedades, pueden ser usados conjugados que consisten en tintes de fluorescencia con biomoléculas afines a la diana, tales como proteínas, péptidos y antibióticos. Después de la inyección, una cierta porción de estos conjugados se une con estructuras moleculares diana, tales como receptores o proteínas matrices, mientras la porción no unida es excretada del cuerpo. De este modo, resulta una diferencia de concentración más alta y por ende un mayor contraste de imagen al implementar el diagnóstico por fluorescencia.
Los tintes de fluorescencia de la clase de tintes de cianina caen en la categoría de representantes prometedores y fueron sintetizados en muchas amplitudes estructurales diferentes. En particular, esqueletos de indotricarbocianina, carbocianinas con indocarbocianina e indodicarbocianina tienen altos coeficientes de extinción y buen rendimiento cuántico de fluorescencia [Licha, K. (2002) Contrast Agents for Optical Imaging) (Review). En: Topics in Current Chemistry - Contrast Agents II (Editor: W. Krause), Volumen 222, Springer Heidelberg, pp. 1-31. y las referencias citadas allí].
La WO 96/17628 describe así un proceso de diagnóstico in vivo por medio de radiación cercana al infrarrojo. En este caso, tintes solubles en agua y aductos de biomoléculas de los mismos con propiedades farmacoquímicas y fotofísicas específicas son usados como medios de contraste para el diagnóstico por fluorescencia y transilumi-
nación.
La síntesis de tintes de cianina con esqueletos de indotricarbocianina, indocarbocianina e indodicarbocianina aparece bien descrita en el arte anterior. Literatura relevante en este sentido es, por ejemplo: Bioconjugate Chem. 4, 105-111, 1993; Bioconjugate Chem. 7, 356-62, 1996; Bioconjugate Chem. 8, 751-56, 1997; Cytometry 10, 11-19, 1989 y 11, 418-30, 1990; J. Heterocycl. Chem. 33, 1871-6, 1996; J. Fluoresc. 3, 153-155, 1993; y Anal. Biochem. 217, 197-204, 1994. Procesos adicionales son descritos en las publicaciones de patente US 4,981,977; US 5,808,044, WO 97/42976; WO 97/42978; WO 98/22146; WO 98/26077; y EP 0 800 831.
Además, indotricarbocianinas con sustituyentes alterados fueron sintetizadas y acopladas a biomoléculas (descrito en, i.a., Photochem, Photobiol, 72, 234, 2000; Bioconjugate Chem. 12, 44, 2001; Nature Biotechnolo. 19, 237, 2001; J. Biomed. Optics 6, 122, 2001; J. Med. Chem. 45, 2003, 2002). Otros ejemplos son encontrados en particular en las publicaciones WO 00/61194 ("Short-Chain Peptide Dye Conjugates as Contrast Agents for Optical Diagnostics"), WO 00/71162, WO 01/52746, WO 01/52743, WO 01/62156 y US 2002/0077487.
A. Zaheer y otros describe en "IRDye78 Conjugates for Near-Infrared Fluorescente Imaging" MOLECULAR IMAGING vol. 1, no. 4 de octubre de 2002, páginas 354-364, MIT PRESS US ISSN: 1535-3508, (XP008029547) el uso de compuestos de indocianina que tienen cuatro grupos sulfonato así como un sustituyente que contiene un éster de N-hidroxisuccinamida en la meso-posición de la cadena de heptametina, para la representación de imágenes in vivo.
Las indotricarbocianinas conocidas usadas con anterioridad en el arte anterior aún poseen inconvenientes, sin embargo, que perjudican su uso eficiente.
Bajos rendimientos cuánticos de fluorescencia de las indotricarbocianinas siempre existen después de un acoplamiento a biomoléculas. Para el tinte Cy7 disponible comercialmente, Gruber y otros, (Bioconjugate Chem. 11, 696-704, 2000) por tanto describen que una pérdida de la eficiencia de fluorescencia ocurre después del acoplamiento a una biomolécula. Becker y otros (Photochem. Photobiol. 72, 234, 2000) describen conjugados de una indotricarbocianina con HSA y transferrina con rendimientos cuánticos de fluorescencia de 2.9% o 2.8% y espectros de absorción deformados en medios fisiológicos.
Además, los conjugados de tintes muestran tendencia a la aglomeración. Becker y otros (Photochem. Photobiol. 72, 234, 2000) para conjugados de una indotricarbocianina con HSA y transferrina y Licha y otros (Bioconjugate Chem. 12, 44-50. 2001) para péptidos aglutinantes de receptores describen que tienen espectros de absorción deformados en medios fisiológicos. Estas deformaciones indican la formación de agregados y la extinción de fluorescencia que ocurre como resultado. Un problema similar existe en el caso de una inadecuada solubilidad en agua de los
tintes.
Con un grupo reactivo, también hay siempre acceso ineficiente a los derivados. Gruber y otros, (Bioconjugate Chem. 11, 696-704, 2000) describen así el uso de ésteres NHS de Cy7 bifuncional con dos grupos reactivos, que pudieran producir potencialmente entrecruzamiento de dos biomoléculas. Por dos grupos carboxi en la molécula, sin embargo, el acceso sintético a derivados es obstaculizado con un solo grupo reactivo y conduce a subproductos (por ejemplo, contiene ésteres NHS monoreactivos de porciones de Cy7 de la molécula de Cy7 no activada y doble activada). Hay por lo tanto una continua necesidad de tintes de cianina que sean eficientes y fáciles de producir para el diagnóstico por fluorescencia que reducen o no tienen los inconvenientes antes mencionados. Además, estos tintes deben ser bien adecuados para la producción de conjugados con biomoléculas.
Un primer objetivo de la invención es logrado mediante la preparación de un tinte de indotricarbocianina de fórmula general (I)
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en la cual
X es O, S o C que es sustituido en dos lugares, por medio del cual los sustituyentes pueden ser seleccionados entre metilo, etilo, propilo, isopropilo, y/o butilo; Y es CH_{2}-CH_{2} o CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}; Z es C_{1} a C_{5} alquileno, por medio del cual los átomos de C son opcionalmente reemplazados por O o S o
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R_{1} a R_{4}, independientemente uno de otro, son SO_{3}H o H, con la condición de que al menos tres de R_{1} a R_{4} sean SO_{3}H, R_{5} es -CO-NH-R_{8}-R_{9}, -NH-CS-NH-R_{8}-R_{9} o -NH-CO-R_{8}-R_{9}, en la cual R_{8} es seleccionado de un grupo que consiste en C_{2}-C_{13} alquileno no ramificado, en la cual los átomos de C son opcionalmente reemplazados por O o S, y R_{9} es seleccionado de
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o cloroacetilo, bromoacetilo, yodoacetilo, cloroacetamido, yodoacetamido, cloroalquilo, bromoalquilo, yodoalquilo, disulfuro de piridilo y vinil sulfonamida, y en la cual R_{6} y R_{7} son CH o están conectados por un C_{3}-alquileno para formar un anillo hexilo, que puede ser sustituido opcionalmente en para-posición con un radical C_{1} a C_{4}-alquilo, y sales y solvatos de este compuesto.
Es preferido un tinte de indotricarbocianina de esta invención, en el cual Y es CH_{2}-CH_{2}, Z es C_{1} a C_{5} alquileno, en el cual los átomos de C son opcionalmente reemplazados por O o S, y en el cual R_{6} y R_{7} son CH, y sales y solvatos de este compuesto.
Más preferido es un tinte de indotricarbocianina de esta invención, en el cual Z es C_{1}-C_{5} alquileno.
Más preferido aún es un tinte de indotricarbocianina de esta invención, en el cual
Z es
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y R_{6} y R_{7} están conectados de manera tal que forman un anillo de hexilo a través de un C_{3}-alquileno.
Los tintes de fluorescencia de la clase de los tintes de cianina, en particular las indotricarbocianinas con un máximo de absorción y fluorescencia en el rango espectral entre 700 y 900 nm, con un grupo reactivo específico y tres, preferiblemente cuatro, grupos sulfonato, son por lo tanto temas de esta invención. Los últimos son usados para aumentar la solubilidad en agua.
Ahora pudo ser descubierto, bastante sorprendentemente, que las indotricarbocianinas de acuerdo con la invención con la estructura antes mencionada (posición compacta de 3-4 grupos sulfonato con radicales sulfonatoetil) tienen un alto rendimiento cuántico de fluorescencia > 15% y que el rendimiento cuántico de fluorescencia después del acoplamiento a biomoléculas permanece aproximadamente invariable (pérdida máxima de alrededor de 10%). El espectro de absorción de los conjugados no muestra, además, ninguna deformación de la absorción del tinte en el rango NIR de alrededor de 750 nm. De este modo, son producidos buena hidrofilia, agregación reducida y rendimiento cuántico de fluorescencia aumentado con respecto a las indotricarbocianinas convencionales o a los derivados de Cy7 con menos de tres grupos sulfonato, especialmente en el caso de Cy7 y otras estructuras conocidas.
Otro aspecto esencial en la preparación de tintes de cianina para el diagnóstico por fluorescencia de acuerdo con la invención se refiere a esos derivados que tienen grupos funcionales reactivos para posibilitar un acoplamiento covalente a biomoléculas específicas de la diana. Derivados apropiados son, por ejemplo, ésteres de NHS e isotiocianatos (Bioconjugate Chem. 4, 105-111, 1993; Bioconjugate Chem. 8, 751-56, 1997), que reaccionan con grupos amino, tales como, por ejemplo, maleimidas, alfa-halocetonas o alfa-haloacetamidas (Bioconjugate Chem. 13, 387-391, 2002; Bioconjugate Chem. 11, 161-166, 2000), que reaccionan con grupos tiol. Otros enlazadores bifuncionales pueden originarse del grupo que comprende arilenodiisotiocianato, alquilenodiisotiocianato, bis-N-hidroxi-succinimidilésteres, hexametilenodiisocianato y éster de N-(\gamma-maleimidobutiriloxi)succinimida.
La WO 01/77229 describe tintes de cianina con una combinación de grupos sulfoarilo, sustituyentes de alquilo en meso-posición de la cadena de metina y al menos un grupo reactivo que hace posible el enlace de las biomoléculas. Las realizaciones se relacionan con indodicarbocianinas (cadena de polimetina que consiste en 5 átomos de C), sin embargo, y los compuestos no tienen ningún grupo reactivo en la meso-posición.
La WO 00/16810 ("Near-Infrared Fluorescent Contrast Agent and Fluorescence Imaging") describe indotricarbocianinas, i.a., con sustituyentes en la meso-posición de la cadena de C7-polimetina. No es indicado, sin embargo, cómo los grupos reactivos pueden ser introducidos o producidos.
Otro aspecto de esta invención se refiere a un tinte de indotricarbocianina, en el cual R_{5} es COOH o NH_{2}.
Los derivados publicados están basados primariamente en la estructura básica Cy3-, Cy5-, Cy5.5- y Cy7 (comercialmente disponible en Amersham Pharmacia Biotech; US 5,268,486; Cy3=indocarbocianina, Cy5=indodicarbocianina, Cy7=indotricarbocianina). Los derivados de grupos tiol reactivos son de especial interés, ya que estos últimos permiten una conjugación dirigida con cisteínas biotecnológicas que son posicionadas específicamente en las biomoléculas. El arte anterior está concentrado aquí primariamente en derivados Cy3 y Cy5.
Tintes de indotricarbocianina especialmente preferidos de acuerdo con la invención son seleccionados de los tintes con fórmulas (II) a la (XX) que son listados en la Tabla 1 a continuación:
TABLA 1 Tintes Preferidos de Acuerdo con la Invención
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Otro aspecto de esta invención se refiere a un proceso para la producción de un tinte de indotricarbocianina de esta invención. En este caso, fue encontrado un acceso simple a través de piridinas 4-sustituidas. Bastante sorprendentemente, varias piridinas 4-sustituidas en altos rendimientos pudieran ser convertidas por medio de la reacción de Zincke (reacción de Zincke-König, ver Römpps Chemie Lexikon [Römpps Chemical Dictionary], 10ma Edición, pág. 5067) en glutaconaldehído-dianilida meso-sustituida (precursores del tinte de cianina).
Además de la síntesis simple y eficiente de piridinas 4-sustituidas, la estructura simétrica de los tintes de esta invención abre la posibilidad de una derivación definida con un grupo del grupo tiol selectivo reactivo en meso-posición simétrica de la molécula.
Así fue llevada a cabo la derivación ulterior a compuestos del grupo tiol reactivo. Funcionalidades del grupo tiol reactivo son, por ejemplo, maleinimida (maleimida), cloroacetilo, bromoacetilo, yodoacetilo, cloroacetamido, bromoacetamido, yodoacetamido, cloroalquilo, bromoalquilo, yodoalquilo, disulfuro de piridilo y vinil sulfonamida.
Aún otro aspecto de esta invención se refiere a un proceso para la producción de un conjugado que comprende el acoplamiento de un tinte de indotricarbocianina de esta invención con una biomolécula. Dentro del alcance de esta invención, "biomolécula" debe ser definida como cualquier molécula de origen biológico que tiene una actividad biológica, en particular actividad enzimática o enlace de sustancias de origen sintético o biológico, tales como, por ejemplo, agentes farmacéuticos, péptidos, proteínas, receptores o ácidos nucleicos. A sus vez, las biomoléculas preferidas son proteínas, tales como, por ejemplo, enzimas, péptidos, anticuerpos y fragmentos de anticuerpos (tales como, por ejemplo, cadenas simples, Fab, F(ab)_{2}, diacuerpos, etc.), lipoproteínas, ácidos nucleicos, tales como, por ejemplo, oligonucleótidos o polinucleótidos de ADN o ARN, aptámeros, APN, y azúcares, tales como, por ejemplo, mono-, di-, tri-, oligo- y polisacáridos.
La síntesis y caracterización biológica de conjugados de tintes de cianina con biomoléculas, tales como péptidos, anticuerpos y fragmentos de los mismos y proteínas para el diagnóstico por fluorescencia in vivo de tumores, es descrita en el arte anterior en varias publicaciones. En este caso, fueron usados primariamente los Cy3, Cy5, Cy5.5 y Cy7 antes mencionados (ver en este sentido, i.a., Nature Biotechnol. 15, 1271, 1997; Cancer Detect. Prev. 22, 251, 1998; J. Immunol. Meth. 231, 239, 1999; Nature Biotechnol. 17, 375, 1999; Nature Medicine 7, 743,
2001).
Otro aspecto de esta invención se refiere a un conjugado de un tinte de indotricarbocianina de acuerdo con la invención con una biomolécula que fue producida de acuerdo con un proceso de la invención. Este conjugado puede estar caracterizado porque comprende una biomolécula como es definida anteriormente, donde como una biomolécula es más preferida, al menos, una biomolécula seleccionada de péptidos, proteínas, lipoproteínas, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, ácidos nucleicos, tales como, por ejemplo, oligonucleótidos o polinucleótidos de ADN o ARN, aptámeros, APN, y azúcares, tales como, por ejemplo, mono-, di, tri-, oligo- y polisacáridos. La proteína acoplada puede de este modo estar caracterizada porque es seleccionada del grupo de proteínas del esqueleto o proteínas solubles del cuerpo. Bastante especialmente preferidas son las proteínas del suero (por ejemplo, HSA), anticuerpos/fragmentos de anticuerpos, tales como, por ejemplo, un fragmento csFv o F(ab), así como péptidos, BSA, la albúmina de huevo o una peroxidasa derivada de los mismos.
De tal manera son conocidos del arte anterior, por ejemplo, anticuerpos que son dirigidos contra moléculas que son expresadas intensivamente en el tejido angiogenéticamente activo y solo a muy bajo nivel en el tejido colindante (ver WO 96/01653). De especial interés son los anticuerpos que están contra los receptores de factores de crecimiento vascular, receptores con células endoteliales a los cuales se enlazan mediadores de inflamación, y proteínas matrices que son expresadas específicamente en la formación de nuevos vasos sanguíneos. Preferidos son otros anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que son dirigidos contra la proteína matriz EDB-fibronectina y conjugados de los mismos de acuerdo con la invención. La EDB-fibronectina, también conocida como fibronectina oncofetal, es una variante de empalme de la fibronectina, la cual es formada específicamente alrededor de vasos sanguíneos recién formados en el proceso de angiogénesis. Son especialmente preferidos los anticuerpos L19, E8, AP38 y AP39 contra la EDB-fibronectina (Cancer Res 1999, 59, 347; J. Immunol Meth 1999, 231,239; Protein Exp. Purif. 2001, 21,
156).
Es preferido un conjugado de acuerdo con la invención que está caracterizado porque el tinte de indotricarbocianina es acoplado a la biomolécula a través de un grupo SH, especialmente a través de un grupo SH a una cisteína. Opcionalmente aún más preferiblemente producidos de la misma son aquellos anticuerpos y sus fragmentos que son producidos por técnicas recombinantes, tal como en el C-terminal o en el N-terminal (dentro de los aminoácidos 1-10 exteriores), ellos contienen una cisteína que no forma ningún puente S-S intramolecular y por lo tanto pueden ser usados para acoplarse con los tintes de acuerdo con la invención.
Otro aspecto de esta invención se refiere a un kit de diagnóstico que comprende un tinte de indotricarbocianina de esta invención y/o un conjugado de esta invención. Además, el kit puede contener adyuvantes adicionales para implementar el diagnóstico in vivo de, en particular, tumores. Estos adyuvantes son, por ejemplo, tampones apropiados, recipientes, reactivos de detección o indicaciones de uso. El kit contiene preferiblemente todos los materiales para una administración intravenosa de los tintes de acuerdo con la invención. Realizaciones especiales de dichos kits de acuerdo con la invención son, por ejemplo, las siguientes.
Un primer recipiente que contiene el anticuerpo (biomolécula) con un grupo SH libre y tampones/aditivos estándares ya sea en forma de solución o en forma de un material liofilizado. Otro recipiente que contiene los tintes de acuerdo con la invención en forma de solución (aditivos comunes) o material liofilizado en una proporción molar de 0.1 a 1 (déficit de 10x en una cantidad equimolar). El recipiente que contiene el tinte es opcionalmente mezclado con solución tampón o agua destilada y añadido al recipiente que contiene la biomolécula, incubado durante 1-10 minutos y usado directamente como una solución inyectable.
En otra realización, el kit está presente en un sistema de dos cámaras (por ejemplo, una jeringuilla), la cual contiene en una cámara la solución del anticuerpo, y físicamente separada por una pared rompible en una segunda cámara contiene el tinte en forma de solución o de material sólido. Después que la pared es rota, es realizada una mezcla y producción de la solución inyectable.
Un último aspecto de esta invención se refiere luego al uso de un conjugado de acuerdo con la invención como medio de contraste de fluorescencia para el diagnóstico in vivo de tumores. El máximo de absorción de Cy7 en este sentido está en el rango de 745 nm y es por tanto especialmente apropiado para la detección in vivo de fluorescencia desde capas más profundas del tejido (ver anteriormente). Sin embargo, los derivados de Cy7 con grupos del grupo tiol selectivo reactivo todavía no están descritos. Además, el uso de conjugados de anticuerpos para la detección de las áreas periféricas de los tumores ya está descrita en la WO 01/23005 (Antibody Dye Conjugates for Binding to Target Structures of Angiogenesis in Order to Intraoperatively Depict Tumor Peripheries), pero no con el uso de tintes ventajosos de acuerdo con la invención.
Ahora la invención será descrita más detalladamente en términos de los siguientes ejemplos y figuras, sin embargo, sin limitarse a los mismos.
La figura 1 muestra el espectro de fluorescencia y de absorción estandarizado del conjugado K11 (A) y K15 (B) (ver la Tabla 2) en PBS, y
La figura 2 muestra los resultados de las propiedades de representación de imágenes de los conjugados de acuerdo con la invención del ejemplo 24 con: sustancia: conjugado K15; tumor: teratocarcinoma F9 en el flanco trasero derecho del ratón; dosis: 50 nmol/kg de peso corporal (datos relativos al tinte); excitación: 740 nm (láser de diodo); detección: cámara CCD (Hamamatsu) con un filtro de paso de banda de 802.5 \pm 5 nm y los tiempos: antes de la inyección, y 1 hora, 6 horas y 24 horas después de la inyección. La posición del tumor es identificada por flechas.
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Ejemplos
Ejemplos 1-16
Síntesis de Tintes de Indotricarbocianina con Grupos Maleimida
Ejemplo 1
Sal interna de trisodio 3,3-dimetil-2-{7-[3,3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoetil)-3H-indolio-2-il]-4-(2-{[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etil]carbamoil}-etil)hepta-2,4,6-trien-1-ilideno}-1-(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonato (Fórmula II) 
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11
a) Sal interna del ácido 1-(2-sulfonatoetil)-2,3,3-trimetil-3H-indolenina-5-sulfónico
10 g (0.04 mol) de ácido 2,3,3-trimetil-3H-indolenina-5-sulfónico (Bioconjugate Chem 1993, 4, 105), 6.8 g (0.04 mol) de cloruro del ácido 2-cloroetanosulfónico y 4.2 g (0.04 mol) de trietilamina son refluidos en 200 ml de acetonitrilo durante 6 horas. El precipitado es succionado y secado. Rendimiento 5.0 g (35% de la teoría). Anal Biochem 1994, 217, 197. 
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b)tert-butil éster del ácido 3-piridin-4-il-propiónico
20 g (89 mmol) de t-butil-P,P-dimetilfosfonoacetato en 50 ml de THF son añadidos en gotas a 0ºC a una suspensión de 3.9 g (98 mmol) de hidruro de sodio (60% en aceite mineral) en 250 ml de THF. Después de 1 hora de agitación a 0ºC, una solución de 10 g (93 mmol) de piridina-4-carbaldehído en 50 ml de tetrahidrofurano es añadida en gotas, y la mezcla de reacción es agitada durante 1 hora a 0ºC y durante 18 horas a temperatura ambiente. El sólido precipitado es retirado por filtración, y la solución es concentrada por evaporación. El residuo es disuelto en isopropanol mientras es calentado, las porciones no solubles son filtradas, y la solución es enfriada hasta 0ºC para la cristalización. El sólido que es producido es filtrado, agitado con hexano, filtrado y secado. El producto intermedio (15.3 g) es hidrogenado en 150 ml de etanol con 0.15 g de 10% de paladio/carbón activado durante 6 horas. El catalizador es filtrado, la solución es concentrada por evaporación, y el residuo es filtrado sobre gel de sílice (solvente móvil éter dietílico). Son obtenidos 13.0 g de un aceite amarillo claro (71% de la teoría).
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c) 3-[2-(tert-butiloxicarbonil)etil]glutaconaldehído-dianilida-hidrobromuro
Una solución de 10 g (48 mmol) de tert-butil éster del ácido 3-piridina-4-il-propiónico en 150 ml de éter dietílico es mezclada con 8.9 g (96 mmol) de anilina y después mezclada a 0ºC con una solución de 5.4 g (48 mmol) de bromocianógeno en 2 ml de éter dietílico. Después de 3 horas de agitación a 0ºC, el sólido rojo que es producido es filtrado, lavado con éter y secado al vacío.
Rendimiento: 20.3 g (92% de la teoría).
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d) Sal interna de trisodio 3,3,metil-2-{7-[3,3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoetil)-3H-indolio-2-il]-4-(2-carboxietil)hepta-2,4,6-trien-1-ilideno}-1-(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonato
Una suspensión de 1.0 g (2.2 mmol) de 3-[2-(tert-butiloxicarbonil)etil]-glutaconaldehído-dianilida-hidrobromuro (Ejemplo 1c)) y 1.5 g (4.4 mmol) de ácido 1-(2-sulfonatoetil)-2,3,3-trimetil-3H-indolenina-5-sulfónico (Ejemplo la)) en 20 ml de ácido acético anhídrido y 5 ml de ácido acético es mezclado con 0.75 g (9.1 mmol) de acetato de sodio y agitado durante 1 hora a 120ºC. Después de enfriado, éste es mezclado con éter dietílico, el sólido precipitado es filtrado y purificado por cromatografía (RP-C18-gel de sílice, solvente móvil agua/metanol) y el producto es liofilizado (0.5 g). La escisión del grupo protector es llevada a cabo por medio de la agitación del producto intermedio en 4 ml de diclorometano/1 ml de ácido trifluoroacético durante 1 hora. Después de la concentración por evaporación y purificación cromatográfica (RP-C18-gel de sílice, solvente móvil agua/metanol), 0.45 g (23% de la teoría) es obtenido un liofilizado azul.
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e) Sal interna de trisodio 3,3-dimetil-2-{7-[3,3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoetil)-3H-indolio-2-il]-4-(2-{[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etil]carbamoil}etil)hepta-2,4,6-trien-1-ilideno}-1-(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonato
0.4 g (0.45 mmol) del compuesto título del Ejemplo 1d) y 45 mg (0.45 mmol) de trietilamina son disueltos en 10 ml de dimetilformamida, mezclados a 0ºC con 0.15 g (0.45 mmol) de TBTU y agitados durante 10 minutos. Entones, una solución de 0.17 g (0.68 mmol) de N-(2-aminoetil)maleimida-trifluoroacetato (Int J Pept Protein Res 1992, 40, 445) y 68 mg (0.68 mmol) de trietilamina en 0.5 ml de dimetilformamida son añadidos, y es agitada durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de ser añadidos 10 ml de éter dietílico, el sólido es centrifugado, secado y purificado por cromatografía (RP C-18 gel de sílice, gradiente metanol/agua). Rendimiento: 0.30 g de un liofilizado (65% de la teoría).
Análisis elemental: Calc.: C 47.24 H 4.26 N 5.51 S 12.61 Na 6.78
Encon: C 47.74 H 4.47 N 5.40 S 11.99 Na 7.02 
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Ejemplo 2
Sal interna de trisodio 3,3-dimetil-2-{7-[3,3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoetil)-3H-indolio-2-il]-4-(2-{[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexil]carbamoil}etil)hepta-2,4,6-trien-1-ilideno}-1-(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonato (Fórmula III) 
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12 
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La síntesis es llevada a cabo de manera análoga al Ejemplo 1e) a partir de 0.4 g (0.45 mmol) del compuesto título del Ejemplo 1d) y 0.21 g (0,68 mmol) de N-(6-aminohexil)maleimida-trifluoroacetato (Int J Pept Protein Res 1992, 40, 445). Rendimiento: 0.38 g de un liofilizado azul (81% de la teoría).
Análisis elemental: Calc.: C 49.25 H 4.79 N 5.22 S 11.95 Na 6.43
Encon: C 48.96 H 4.92 N 5.32 S 11.88 Na 6.56 
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Ejemplo 3
Sal interna de trisodio 3,3-dimetil-2-{7-[3,3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoetil)-3H-indolio-2-il]-4-(2-{[13-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-4,7,10-trioxatridecil]carbamoil}etil)hepta-2,4,6-trien-1-ilideno}-1-(2-sulfonato- etil)-23-dihidro-1H-indol-5-sulfonato (Fórmula IV) 
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13 
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La síntesis es llevada a cabo de manera análoga al Ejemplo 1e) a partir de 0.4 g (0.45 mmol) del compuesto título del Ejemplo 1d) y 0.28 g (0.68 mmol) de N-(13-amino-4,7,10-trioxatridecil)maleimida-trifluoroacetato (Int J Pept Protein Res 1992, 40, 445) Rendimiento: 0.27 g de un liofilizado azul (51% de la teoría).
Análisis elemental: Calc.: C 48.97 H 5.05 N 4.76 S 10.89 Na 5.86
Encon: C 49.22 H 5.16 N 4.62 S 10.67 Na 5.66 
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Ejemplo 4
Sal interna de trisodio 3,3-dimetil-2-{7-[3,3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoetil)-3H-indolio-2-il]-4-(4-{[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etil]carbamoil}-butil)hepta-2,4,6-trien-1-ilideno}-1-(2-sulfonatoetil)-2-3-dihidro-1H-indol-5-sulfonato (Fórmula V)
14 
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a) Bromuro de (3-tert-Butoxicarbonil-propil)-trifenil-fosfonio
50 g (0.30 mol) de ácido 4-bromobutírico son mezclados por gotas en 400 ml de THF a -40ºC con 187 g (0.89 mol) de ácido trifluoroacético anhídrido. Después de 30 minutos de agitación a -40ºC, 400 ml de tert-butanol/30 ml de THF son añadidos en gotas en una hora. Después de agitar durante 16 horas a temperatura ambiente, la mezcla de reacción es vertida en una solución de carbonato de sodio enfriada con hielo, la fase acuosa es extraída tres veces con éter dietílico, y las fases orgánicas son secadas sobre sulfato de sodio y concentradas por evaporación. El residuo es destilado al vacío (punto de ebullición 72ºC/0.9 mbar; rendimiento: 41 g). La reacción para formar sal de fosfonio es llevada a cabo mediante calentamiento por reflujo de 41 g (0.18 mol) del producto intermedio, 44.6 g (0.17 mol) de trifenilfosfina y 32.5 g (0.36 mol) de bicarbonato de sodio en 250 ml de acetonitrilo durante 20 horas. La mezcla de reacción es filtrada, concentrada por evaporación, y el residuo es llevado a la cristalización mediante agitación con éter dietílico. Rendimiento: 58.5 g (40% de la teoría, con respecto al ácido 4-bromobutírico) de un sólido blanco.
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b) t-butil éster del ácido 5-piridina-4-il-pentanóico
Una solución de 14 g (28 mmol) de bromuro de (3-tert-butoxicarbonil-propil)-trifenil-fosfonio (Ejemplo 4a)) en 100 ml de THF anhídro es mezclada a -40ºC en un ambiente libre de aire en 20 minutos con 17.5 ml (28 mmol) de butillitio (1.6 M en hexano) y agitada durante 1 hora a -40ºC. Una solución de 2.78 g (26 mmol) de 4-piridinocarbaldehído en 20 ml de THF es añadida en gotas y agitada durante 16 horas a temperatura ambiente, luego es vertida sobre agua helada, la fase acuosa es extraída tres veces con éter dietílico, y las fases orgánicas son secadas sobre sulfato de sodio y concentradas por evaporación. Después de la purificación cromatográfica (gel de sílice, solvente móvil hexano/acetato de etilo), el producto es obtenido en forma de una mezcla E,Z (4:1 después de ^{1}H-NMR; 5.0 g). Para hidrogenar el doble enlace, el producto intermedio es disuelto en 200 ml de metanol y agitado con 100 mg de catalizador PtO_{2} a temperatura ambiente sobre hidrógeno. Después de la filtración y la concentración por evaporación, es obtenido un aceite amarillo. Rendimiento: 4.9 g (74% de la teoría).
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c) 3-[4-(tert-butiloxicarbonil)butil]glutaconaldehído-dianilida-hidrobromuro
Una solución de 4.0 g (17 mmol) de t-butil éster del ácido 5-piridina-4-il-pentanóico en 35 ml de éter dietílico son mezclados con 3.2 g (34 mmol) de anilina y luego a 0ºC con una solución de 1.9 g (17 mmol) de bromocianógeno en 8 ml de éter dietílico. Después de agitación durante 3 horas a 0ºC, el sólido rojo que es producido es filtrado, lavado con éter y secado al vacío. Rendimiento: 7.8 g (95% de la teoría).
d) Sal interna de trisodio 3,3-dimetil-2-{7-[3,3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoetil)-3H-indol-2-il]-4-(4-carboxibutil)hepta-2,4,6-tríen-1-ilideno}-1-(2-sulfonatoetil)-2, 3-dihidro-1H-indol-5-sulfonato
La síntesis es llevada a cabo de manera análoga al Ejemplo 1d) a partir del compuesto título del Ejemplo 4c) (2.5 mmol) y ácido 1-(2-sulfonatoetil)-2,3,3-trimetil-3H-indolenina-5-sulfónico (5 mmol). Rendimiento: 0.85 g (37% de la teoría) de un liofilizado azul.
e) Sal interna de trisodio 3,3-dimetil-2-{7-[3,3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoetil)-3H-indolio-2-il]-4-(4-{[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etil]carbamoil}butil)hepta-2,4,6-trien-1-ilideno}-1-(2-sulfonatoetil)2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonato
La síntesis es llevada a cabo de manera análoga al Ejemplo 1e) a partir de 0.4 g (0.43 mmol) del compuesto título del Ejemplo 4d). Rendimiento: 0.31 g (69% de la teoría) de un liofilizado azul.
Análisis elemental: Calc.: C 48.27 H 4.53 N 5.36 S 12.27 Na 6.60
Encon: C 48.01 H 4.44 N 5.56 S 12.10 Na 6.81 
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Ejemplo 5
Sal interna de trisodio 3,3-dimetil-2-{7-[3,3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoetil)-3H-indol-2-il]-4-(4-{[6-(2,5-di- oxo-2,5-dihidro-1H pirrol-1-il)hexil]carbamoil}butil)hepta-2,4,6-trien-1-ilideno}-1-(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonato (Fórmula VI)
15
La síntesis es llevada a cabo de manera análoga al Ejemplo 1e) a partir de 0.4 g (0.43 mmol) del compuesto título del Ejemplo 4d) y 0.20 g (0.66 mmol) de N-(6-aminohexil)maleimida-trifluoroacetato. Rendimiento: 0.35 g de un liofilizado azul (74% de la teoría).
Análisis elemental: Calc.: C 50.17 H 5.03 N 5.09 S 11.65 Na 6.26
Encon: C 49.83 H 4.89 N 5.34 S 12.05 Na 6.42 
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Ejemplo 6
Sal interna de trisodio 3,3-dimetil-2-{7-[3,3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoetil)-3H-indolio-2-il]-4-(4-{[13-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-4,7,10-trioxatridecil]carbamoil}butil)hepta-2,4,6-trien-1-ilideno}-1-(2-sulfonato- etil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonato (Fórmula VII)
16
La síntesis es llevada a cabo de manera análoga al Ejemplo 1e) a partir de 0.4 g (0.43 mmol) del compuesto título del Ejemplo 1d) y 0.30 g (0.72 mmol) de N-(13-amino-4,7,10-trioxatridecil)maleimida-trifluoracetato. Rendimiento: 0.27 g de un liofilizado azul (52% de la teoría).
Análisis elemental: Calc.: C 49.83 H 5.27 N 4.65 S 10.64 Na 5.72
Encon: C 49.45 H 5.19 N 4.66 S 10.85 Na 5.80 
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Ejemplo 7
Sal interna de trisodio 3,3-dimetil-2-{7-[3,3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoeti1)-3H-indolio-2-il]-4-(6-{[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-il)etil]carbamoil}hexil)hepta-2,4,6-trien-1-ilideno}-1-(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonato (Fórmula VIII) 
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17 
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a) Bromuro de (3-terct-butoxicarbonil-pentil)-trifenil-fosfonio
La producción es llevada a cabo como es descrito en el Ejemplo 4a), por medio del cual el producto intermedio tert-butil éster del ácido 6-bromohexanóico es reaccionado como producto crudo. 79 g de producto (69% de la teoría) son obtenidos en forma de un aceite viscoso, incoloro a partir de 50 g del ácido 6-bromohexanoico.
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b) t-butil éster del ácido 7-Piridina-4-il-heptanóico
La producción es llevada a cabo como es descrito en el Ejemplo 4b). 7.5 g de t-butil éster del ácido 7-piridina-4-il-heptanóico (65% de la teoría) son obtenidos en forma de aceite amarillo a partir de 25 g (48.7 mmol) de bromuro de (3-tert-butoxicarbonil-pentil)-trifenil-fosfonio (Ejemplo 7a).
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c) 3-[6-(tert-Butiloxicarbonil)hexil]glutaconaldehído-dianilida-hidrobromuro
Una solución de 5.0 g (19 mmol) de t-butil éster del ácido 7-piridina-4-il-heptanóico en 30 ml de éter dietílico es mezclada con 3.6 g (38 mmol) de anilina y luego a 0ºC con una solución de 2.1 g (19 mmol) de bromocianógeno en 5 ml de éter dietílico. Después de agitar durante 2.5 horas a 0ºC, el sólido rojo que es producido es filtrado, lavado con éter y secado al vacío. Rendimiento: 8.9 g (91% de la teoría).
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d) Sal interna de trisodio 3,3-dimetil-2-{7-[3,3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoetil)-3H-indolio-2-il]-4-(6-carboxihexil)hepta-2,4,6-trien-1-ilideno}-1-(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonato
La síntesis es llevada a cabo de manera análoga al Ejemplo 1d) a partir del compuesto del título del Ejemplo 7c) (3 mmol) y ácido 1-(2-sulfonatoetil)-2,3,3-trimetil-3H-indolenina-5-sulfónico (6 mmol). Rendimiento: 1.5 g (54% de la teoría) de un liofilizado azul.
e) Sal interna de trisodio 3,3-dimetil-2-{7-[3,3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoetil)-3H-indolio-2-il]-4-(6-{[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etil]carbamoil}hexil)hepta-2,4,6-trien-1-ilideno}-1-(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonato
La síntesis es llevada a cabo de manera análoga al Ejemplo 1e) a partir de 0.4 g (0.43 mmol) del compuesto del título del Ejemplo 7d). Rendimiento: 0.31 g (69% de la teoría) de un liofilizado azul.
Análisis elemental: Calc.: C 49.25 H 4.79 N 5.22 S 11.95 Na 6.43
Encon: C 48.98 H 4.86 N 5.12 S 11.76 Na 6.77 
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Ejemplo 8
Sal interna de trisodio 3,3-dimetil-2-{7-[3,3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoetil)-3H-indolio-2-il]-4-(6-{[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexil]carbamoil}hexil)hepta-2,4,6-trien-1-ilideno}-1-(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonato (Fórmula IX) 
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18 
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La síntesis es llevada a cabo de manera análoga al Ejemplo 1e) a partir de 0.5 g (0.53 mmol) del compuesto título del Ejemplo 7d) y 0.23 g (0.75 mmol) de N-(6-aminohexil)maleimida-trifluoroacetato. Rendimiento: 0.42 g de un liofilizado azul (70% de la teoría).
Análisis elemental: Calc.: C 51.05 H 5.27 N 4.96 S 11.36 Na 6.11
Encon: C 50.74 H 5.55 N 4.76 S 11.38 Na 6.35 
\newpage
Ejemplo 9
Sal interna de trisodio 3,3-dimetil-2-(7-{3,3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoetil)-3H-indolio-2-il]-4-(6-([13-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-4,7,10-trioxatridecil]carbamoil}hexil)hepta-2,4,6-trien-1-ilideno}-1-(2-sulfonato- etil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonato (Fórmula X)
19
La síntesis es llevada a cabo de manera análoga al Ejemplo 1e) a partir de 0.5 g (0.53 mmol) del compuesto del título del Ejemplo 7d) y 0.44 g (1.06 mmol) de N-(13-amino-4,7,10-trioxatridecil)maleimida-trifluoroacetato. Rendimiento: 0.24 g de un a liofilizado azul (37% de la teoría).
Análisis elemental: Calc.: C 50.64 H 5.48 N 4.54 S 10.40 Na 5.59
Encon: C 50.30 H 5.56 N 4.34 S 10.15 Na 5.73 
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Ejemplo 10
Sal interna de trisodio 3,3-dimetil-2-{7-[3)3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoetil)-3H-indolio-2-il]-4-(5-([2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H pirrol-1-il)etil]carbamoil}-3-oxa-pentil)hepta-2,4,6-trien-1-ilideno}-1-(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonato (Fórmula XI)
20
a)tert-butil éster del ácido 3-oxa-6-(4-piridinil)hexanóico
Una solución de 75 g (0.4 mol) de 3-(4-piridinil)-1-propanol en 400 ml de tolueno/50 ml de THF es mezclada con 10 g de sulfato de tetrabutilamonio y 350 ml de solución de hidróxido de sodio al 32%. Luego, son añadidos 123 g (0.68 mol) de tert-butil éster del ácido bromoacético en gotas y agitado durante 18 horas a temperatura ambiente. La fase orgánica es separada, y la fase acuosa es extraída tres veces con éter dietílico. Las fases orgánicas combinadas son lavadas con una solución de NaCl, secadas sobre sulfato de sodio y concentradas por evaporación. Después de purificación cromatográfica (gel de sílice: solvente móvil hexano:acetato de etilo), 56 g del producto (41% de la teoría) son obtenidos en forma de aceite marrón.
b) 3-[4-Oxa-5-(tert-butiloxicarbonil)pentil]glutaconaldehído-dianilida-hidrobromuro
Una solución de 5.0 g (20 mmol) de tert-butil del ácido 3-oxa-6-(4-piridinil)hexanóico en 60 ml de éter dietílico es mezclada con 3.7 g (40 mmol) de anilina y luego a 0ºC con una solución de 2.2 g (20 mmol) de bromocianógeno en 8 ml de éter dietílico. Después de agitar durante 1 hora a 0ºC, 50 ml de éter dietílico son mezclados, y el sólido rojo que es producido es filtrado, lavado con éter y secado al vacío. Rendimiento: 8.5 g (85% de la teoría) de un sólido color violeta.
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c) Sal interna de trisodio 3,3-dimetil-2-{7[3,3-dimetil-5-sulfonato-1(2-sulfonatoetil)-3H-indolio-2-il]-4-(6-carboxi-4-oxahexil)hepta-24,6-tríen-1-ilideno}-1-(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonato
Una suspensión de 3.0 g (6 mmol) de 3-[2-tert-butiloxicarbonil)etil]-glutaconaldehído-dianilida hidrobromuro (Ejemplo 10b)) y 4.2 g (12 mmol) de ácido 1-(2-sulfonatoetil)-2,3,3-trimetil-3H-indolenina-5-sulfónico (Ejemplo 1a)) en 50 ml de ácido acético anhídrido y 10 ml de ácido acético es mezclada con 2.5 g (30 mmol) de acetato de sodio y agitada durante 50 minutos a 120ºC. Después de enfriar, es mezclada con éter dietílico, el sólido precipitado es filtrado, precipitado de manera absorbente en acetona y secado a alto vacío. Después de la purificación cromatográfica (RF-C18-gel de sílice, solvente móvil agua/metanol), la eliminación del metanol al vacío y la liofilización, el compuesto del título es obtenido inmediatamente. Rendimiento: 2.3 g (41% de la teoría) de un liofilizado azul.
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d) Sal interna de trisodio 3,3-dimetil-2-{7[3,3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoetil)-3H-indolio-2-il]-4-(5-{[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etil]carbamoil}-3-oxa-pentil)hepta-2,4,6-trien-1-ilideno}-1-(2-sulfonatoemil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonato
La síntesis es llevada a cabo de manera análoga al Ejemplo 1c) a partir de 1.0 g (1.1 mmol) del compuesto del título del Ejemplo 10c). Rendimiento: 0.85 g (73% de la teoría) de un liofilizado azul.
Análisis elemental: Calc.: C 47.54 H 4.46 N 5.28 S 12.09 Na 6.50
Encon: C 47.97 H 4.65 N 5.10 S 12.02 Na 6.68 
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Ejemplo 11
Sal interna de trisodio 3,3-dimetil-2-{7-[3,3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoetil)-3H-indolio-2-il]-4-(5-{[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H pirrol-1-il)hexil]carbamoil}-3-oxa-pentil)hepta-2,4,6-trien-1-ilideno}-1-(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonato (Fórmula XII) 
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21 
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La síntesis es llevada a cabo de manera análoga al Ejemplo 1e) a partir de 0.5 g (0.55 mmol) del compuesto título del Ejemplo 10c) y 0.23 g (0.75 mmol) de N-(6-aminohexil)maleimida-trifluoroacetato. Rendimiento: 0.42 g de un liofilizado azul (68% de la teoría).
Análisis elemental: Calc.: C 49.46 H 4.96 N 5.01 S 11.48 Na 6.17
Encon: C 48.95 H 5.21 N 5.22 S 11.23 Na 6.60 
\newpage
Ejemplo 12
Sal interna de trisodio 3,3-dimetil-2-{7-[3,3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoetil)-3H-indolio-2-il]-4-(5-{[13-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-4,7,10-trioxatridecil]carbamoil}-4-oxapentil)hepta-2,4,6-trien-1-ilideno}-1-(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonato (Fórmula XIII) 
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22 
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La síntesis es llevada a cabo de manera análoga al Ejemplo 1e) a partir de 0.5 g (0.55 mmol) del compuesto del título del Ejemplo 10c) y 0.46 g (1.06 mmol) del N-(13-amino-4,7,10-trioxatridecil)maleimida-trifluoroacetato.
Rendimiento: 0.34 g de un liofilizado azul (56% de la teoría).
Análisis elemental: Calc.: C 49.17 H 5.20 N 4.59 S 10.50 Na 5.65
Encon: C 49.34 H 5.32 N 4.45 S 10.28 Na 5.56 
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Ejemplo 13
Sal interna de trisodio 3,3-dimetil-2-[2-(1-{[3,3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoetil)-3H-indolio-2-il]vinileno}-2-[4-(2-{[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etil]carbamoil}etil)-fenoxi]ciclohex-1-en-3-iliden)etilideno]-1-(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonato (Fórmula XIV) 
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23 
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a) Sal interna de trisodio 3,3 dimetil-2-[2-(1-{[3,3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoetil)-3H-indolio-2-il]vinileno}-2-cloro-ciclohex-1-en-3-ilideno)etilideno]-1-(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonato
5.0 g (14.4 mmol) de ácido 1-(2-sulfonatoetil)-2,3,3-trimetil-3H-indolenina-5-sulfónico (Ejemplo 1a)) y 2.6 g (7.2 mmol) de N-[(3-(anilinometileno)-2-cloro-1-ciclohexeno-1-il)metileno]anilina hidrocloruro (Aldrich Company) son refluidos junto con 2.5 g (30 mmol) de acetato de sodio anhidro en 100 ml de metanol durante 1 hora, enfriado, mezclado con 150 ml de éter dietílico y agitado durante toda la noche. El precipitado es succionado, secado y purificado por cromatografía (gel de sílice, gradiente: diclorometano/metanol). Rendimiento: 3.8 g (58% de la teoría) de un sólido azul.
b) Sal interna de trisodio 3,3-dimetil-2-[2-(1-{[3,3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoetil-3H-indolio-2-il]vinileno}-2-[4-(2-carboxietil)fenoxi]ciclohex-1-en-3-ilideno)etilideno]-1-(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonato
0.37 g (2.2 mmol) de ácido 3-(4-hidroxifenil)propiónico en 30 ml de dimetilformamida son mezclados con 0.18 g (4.5 mmol) de hidruro de sodio (60% dispersión de aceite mineral). Después de agitar durante 30 minutos a temperatura ambiente, es enfriado a 0ºC, una solución de 2.0 g (2.2 mmol) del compuesto del título del Ejemplo 12a) en 100 ml de dimetilformamida es añadida en gotas y agitada durante 2 horas a temperatura ambiente. La mezcla es apagada con hielo seco, y el solvente es retirado al vacío. El residuo es disuelto en metanol, agitado con 200 ml de éter, y el sólido precipitado es filtrado. Una purificación cromatográfica es realizada (gel de sílice, gradiente: acetato de etilo/metanol). Rendimiento: 1.9 g de un sólido azul (83% de la teoría).
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c) Sal interna de trisodio 3,3-dimetil-2-[2-(1-{[3,3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoetil)-3H-indolio-2-il]vinileno}-2-[4-(2-{[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-m-pirrol-1-il)etil]carbamoil} etil)-fenoxi]ciclohex-1-en-3-ilideno)etilideno]-1-(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonato
0.1 mg (0.10 mmol) del compuesto del título del Ejemplo 12b) es hecho reaccionar como es descrito en el Ejemplo 1e) con TBTU y N-(2-aminoetil)maleimida-trifluoroacetato en presencia de trietilamina, y el producto que es obtenido es purificado por cromatografía. Rendimiento: 93 mg de un liofilizado azul (81% de la teoría).
Análisis elemental: Calc.: C 51.21 H 4.47 N 4.88 S 11.16 Na 6.00
Encon: C 51.50 H 4.55 N 4.95 S 10.93 Na 6.15 
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Ejemplo 14
Sal interna de trisodio 3,3-dimetil-2-[2-(1-{[3,3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoetil)-3H-indolio-2-il]vinileno}-2-[4-(2-{[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexil]carbamoil}etil)-fenoxi]ciclohex-1-en-3-ilideno)etilideno]-1-(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonato (Fórmula XV) 
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24 
\vskip1.000000\baselineskip
La síntesis es llevada a cabo de manera análoga al Ejemplo 1e) a partir de 0.7 g (0.68 mmol) del compuesto del título del Ejemplo 14a) y 0.53 g (1.22 mmol) de N-(13-amino-4,7,10-trioxatridecil)maleimida-trifluoracetato. Rendimiento: 0.56 g de un liofilizado azul (68% de la teoría).
Análisis elemental: Calc.: C 48.27 H 4.53 N 5.36 S 12.27 Na 6.60
Encon: C 48.01 H 4.44 N 5.56 S 12.10 Na 6.81 
\newpage
Ejemplo 15
Sal interna de trisodio 3,3-dimetil-2-[2-(1-{[3,3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoetil)-3H-indolio-2-il]vinileno}-2[4-(2-{[13-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-il)-4,7,10-trioxatridecil)carbamoil}etil)fenoxi]ciclohex-1-en-3-ilideno)etilideno]-1-(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonato (Fórmula XVI)
25
La síntesis es llevada a cabo de manera análoga al Ejemplo 1e) a partir de 0.7 g (0.68 mmol) del compuesto del título del Ejemplo 14a) y 0.59 g (1.36 mmol) de N-(13-amino-4,7,10-trioxatridecil)maleimida-trifluoroacetato. Son llevadas a cabo dos purificaciones cromatográficas. Rendimiento: 0.67 g de un liofilizado azul (75% de la teoría).
Análisis elemental: Calc.: C 52.29 H 5.16 N 4.28 S 9.79 Na 5.27
Encon: C 51.88 H 5.40 N 4.34 S 9.53 Na 5.68 
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Ejemplo 16
Sal interna de trisodio 3,3-dimetil-2-[2-(1-{[3,3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoetil)-3H-indolio-2-il]vinileno}-2-[4-(2-{[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etil]carbamoil}etil)-fenoxi]-5-tert-butil-ciclohex-1-en-3-ilideno)etilideno]-1-(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonato (Fórmula XVII)
26
a) N-[(3-(Anilinometileno)-2-cloro-tert-butil-1-ciclohexeno-1-il)metileno]anilina hidrocloruro
6.7 ml (73.4 mmol) de oxicloruro de fósforo son añadidos en gotas a 0ºC a 8 ml de dimetil-formamida. Luego, una solución de 5.0 g (32.4 mmol) de 4-tert-butilciclohexanona en 30 ml de diclorometano son añadidos en gotas, y la mezcla de reacción es agitada bajo reflujo durante 3 horas. Después de enfriar a 0ºC, 6 g (64.8 mmol) de anilina en 5.5 ml de etanol son añadidos lentamente en gotas, la mezcla es vertida sobre 200 g de hielo, y 5 ml de ácido clorhídrico concentrado son añadidos mientras está siendo agitada. El sólido precipitado es filtrado, lavado con éter y secado. Rendimiento: 6.8 g (50% de la teoría) de un sólido rojo.
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b) Sal interna de trisodio 3,3-dimetil-2-[2-(1-{[3,3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoetil)-3H-indolio-2-il]vinileno}-2-cloro-5-tert-butilciclohex-1-en-3-ilideno)etilideno]-1-(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonato
5.0 g (14.4 mmol) de ácido 1-(2-sulfonatoetil)-2,3,3-trimetil-3H-indolenina-5-sulfónico (Ejemplo 1a)) y 3.0 g (7.2 mmol) de N-[(3-(anilinometileno)-2-cloro-5-tert-butil-1-ciclohexeno-1-il)metileno]anilina hidrocloruro (Ejemplo 16a)) son refluidos junto con 2.5 g (30 mmol) de acetato de sodio anhidro en 100 ml de metanol durante 1.5 horas, enfriados, mezclados con 200 ml de éter dietílico y agitados durante toda la noche. El precipitado es succionado, secado y purificado por cromatografía (gel de sílice, gradiente: diclorometano/metanol). Rendimiento: 4.7 g (68% de la teoría) de un sólido azul.
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c) Sal interna de trisodio 3,3-dimetil-2-[2-(1-{[3,3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoetil)-3H-indolio-2-il]vinileno}-2-[4-(2-carboxietil)fenoxi]-5-tert-butilciclohex-1-en-3-ilideno)etilideno]-1-(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonato
La reacción es llevada a cabo a partir de 2.0 g (2.1 mmol) del compuesto del título del Ejemplo 16b) como es descrito en el Ejemplo 13b). Rendimiento: 1.5 g (66% de la teoría).
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d) Sal interna de trisodio 3,3-dimetil-2-[2-(1-{[3,3-dimetil-5-sulfonato-1(2-sulfonatoetil)-3H-indolio-2-il]vinileno}-2-[4-(2-{[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etil]carbamoil}etil)-fenoxi]-5-tert-butilciclohex-1-en-3-ilideno)etilideno]-1-(2-sulfonatoetil)-2, 3-dihidro-1H-indol-5-sulfonato
La reacción es llevada a cabo a partir de 1.0 g (0.92 mmol) del compuesto del título del Ejemplo 16c) como es descrito en el Ejemplo 13c). La purificación por cromatografía es llevada a cabo dos veces con RP C-18 gel de sílice (solvente móvil: acetonitrilo/agua). Rendimiento: 0.24 g (22% de la teoría).
Análisis elemental: Calc.: C 52.82 H 4.93 N 4.65 S 10.64 Na 5.72
Encon: C 52.23 H 5.20 N 4.31 S 10.30 Na 6.15 
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Ejemplos 17-19
Síntesis de Tintes de Indotricarbocianina con Grupos Bromoacetilamida
Ejemplo 17
Sal interna de trisodio 3,3-dimetil-2-{7-[3,3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoetil)-3H-indolio-2-il-4-(5-{[6-(bromoacetilamino)hexil]carbamoil}-4-oxapentil)hepta-2,4,6-trien-1-ilideno}-1-(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonato (Fórmula XIX)
27
a) Sal interna de trisodio 3,3-dimetil-2-{7-[3,3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoetil)-3H-indolio-2-il]-4-(5-{(6-aminohexil)carbamoil}-4-oxapentil)hepta-2,4,6-trien-1-ilideno}-1-(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonato
La síntesis es llevada a cabo de manera análoga al Ejemplo 1e) a partir de 0.5 g (0.55 mmol) del compuesto del título del Ejemplo 10c) y 0.15 g (0.70 mmol) de N-boc-hexanodiamina (Fluka). El producto de la reacción es purificado por cromatografía (RP C18-cromatografía, gradiente: metanol/agua) y después de liofilizado, éste es agitado en 2 ml de ácido trifluoroacético/8 ml de diclorometano durante 15 minutos mientras es enfriado con hielo. Después de centrifugar al vacío, el residuo es disuelto en metanol, precipitado con éter dietílico y aislado. Rendimiento: 0.26 g de un sólido azul (41% de la teoría).
b) Sal interna de trisodio 3,3-dimetil-2-{7-[3,3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoetil)-3H-indolio-2-il]-4-(5-{[6-(bromoacetilamino)hexil]carbamoil}-4-oxapentil)hepta-2,4,6-trien-1-ilideno}-1-(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonato
0.26 g (0.23 mmol) del compuesto del título del Ejemplo 18a) son enfriados en 5 ml de dimetil-formamida a -20ºC, mezclados con 28 mg (0.28 mmol) de trietilamina y una solución de 0.10 g (0.46 mmol) de bromuro de bromoacetil en 0.2 ml de dimetilformamida. Después de agitar durante 5 horas a un máximo de 0ºC, el producto es precipitado mediante la adición de éter dietílico y obtenido por medio de la repreciptación repetida a partir de dimetilformamida/éter dietílico y a continuación secado. Rendimiento: 0.23 g (86% de la teoría) de un sólido azul.
Análisis elemental: Calc.: C 45.63 H 4.87 N 4.84 S 11.07 Na 5.96
Encon: C 45.13 H 4.66 N 4.67 S 10.83 Na no determinado. 
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Ejemplo 18
Sal interna de trisodio 3,3-dimetil-2-{7-[3,3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoetil)-3H-indolio-2-il]-4-(3-{[3-(bromoacetilamino)propil]carbamoil}-etil)hepta-2,4,6-trien-1-ilideno}-1-(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonato (Fórmula XVIII)
28
La síntesis es llevada a cabo a partir de un compuesto título del Ejemplo 1d) (0.5 g; 0.56 mmol) y N-boc-propilenodiamina de manera análoga al Ejemplo 17. Rendimiento durante todas las etapas: 0.22 g (37% de la teoría).
Análisis elemental: Calc.: C 43.70 H 4.33 N 5.23 S 11.96 Na 6.43
Encon: C 43.21 H 4.14 N 5.53 S 10.89 Na no determinado. 
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Ejemplo 19
Sal interna de trisodio 3,3-dimetil-2-[2-(1-{[3,3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoetil)-3H-indolio-2-il]vinileno}-2-[4-(2-{[3-(bromoacetilamino)propil]carbamoil}etil)-fenoxi]ciclohex-1-en-3-ilideno)etilideno]-1-(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonato (Fórmula XX)
29 
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
La síntesis es llevada a cabo a partir de un compuesto del título del Ejemplo 13b) (0.5 g; 0.49 mmol) y N-boc-propilenodiamina de manera análoga al Ejemplo 17. Rendimiento durante todas las etapas: 0.31 g (53% de la teoría).
Análisis elemental: Calc.: C 47.88 H 4.52 N 4.65 S 10.65 Na 5.73
Encon: C 48.04 H 4.43 N 4.69 S 10.72 Na 5.84 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplos 20-23
Síntesis de conjugados con biomoléculas y caracterización fotofísica de los conjugados
Ejemplo 20
Marcado de BSA (albúmina de suero bovino) con los compuestos del título de los Ejemplos 1-16
Instrucciones generales: Una solución de 5 mg (0.074 \mumol) de BSA (Sigma Company) en 5 ml de solución tampón de fosfato (0.1 M Na_{2}HPO_{4}/NaH_{2}PO_{4}, pH 6.8) es mezclada en cada caso con 0.74 \mumol de los compuestos del título de los Ejemplos 1-16 (soluciones madre de 0.5 mg/ml en PBS) e incubada durante 30 minutos a 25ºC. La purificación de los conjugados es llevada a cabo por cromatografía en gel (columna: Sefadex G50, diámetro 1.5 cm, Pharmacia, eluyente: PBS).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 21
Marcado de BSA con los compuestos del título de los Ejemplos 17-19
Instrucciones generales: Una solución de 5 mg (0.074 \mumol) de BSA (Sigma Company) en 5 ml de solución tampón de fosfato (0.1 M solución tampón de borato, pH 8.5) es mezclada en cada caso con 1.10 \mumol de los compuestos del título de los Ejemplos 17-19 (soluciones madre de 0.5 mg/ml en PBS) e incubada durante 5 horas a 25ºC. La purificación del conjugado es llevada a cabo por cromatografía en gel (columna: Sefadex G50, diámetro 1.5 cm, Pharmacia, eluyente: PBS).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 22
Marcado del anticuerpo scFv anti-ED-B-fibronectina AP39 (fragmento de cadena simple) con los compuestos del título de los Ejemplos 1-16
AP39 es un scFv con una cisteína de C-terminal y está presente como dímero S-S covalente de masa molar de alrededor de 56,000 g/mol (Curr Opin Drug Discov Devel. 2002 Mar; 5(2): 204-13). Mediante reducción de los puentes de disulfuro, son producidos dos monómeros con grupos SH accesibles (masa molar 28,000 g/mol).
Instrucciones generales: 0.3 ml de una solución de AP39 en PBS (conc. 0.93 mg de dímero/ml) son mezclados con 60 \mul de una solución de tris(carboxietil)fosfina (TCEP) en PBS (2.8 mg/ml) e incubados bajo nitrógeno durante 1 hora a 25ºC. El exceso de TCEP es separado mediante filtración por gel sobre una columna de NAP-5 (eluyente: PBS). La cantidad de monómero AP39 obtenido (OD_{280 \ nm} = 1.4), determinado por fotometría, es 230-250 \mug (volúmenes 0.5-0.6 ml). La solución es mezclada con 0.03 \mumol de los compuestos del título de los Ejemplos 1-16 (soluciones madre de 0.5 mg/ml en PBS) e incubada durante 30 minutos a 25ºC. El conjugado es purificado por cromatografía en gel sobre una columna de NAP-5 (eluyente: PBS/10% glicerol). La inmuno reactividad de la solución del conjugado es determinada por cromatografía de afinidad (resina de fibronectina ED-B-) (J Immunol Meth 1999, 231, 239). La inmuno reactividad obtenida de los conjugados fue de >80% (AP39 antes de la conjugación >95%).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 23
Marcado de los anticuerpos scFv anti-ED-B-fibronectina AP39 (fragmento de cadena simple) con los compuestos del título de los Ejemplos 17-19
Instrucciones generales: 0.3 ml de una solución de AP39 en PBS (conc. 0.93 mg de dímero/ml) son mezclados con 60 \mul de una solución de tris(carboxietil)fosfina (TCEP) en PBS (2.8 mg/ml) e incubados bajo nitrógeno durante 1 hora a 25ºC. El exceso de TCEP es separado mediante filtración en gel sobre una columna de NAP-5 (eluyente: 50 mmol de solución tampón de borato pH 8.5). La cantidad de monómero AP39 (OD_{280 \ nm} = 1.4) que es obtenida, determinada por fotometría, es 230 - 250 \mug (volúmenes 0.5 - 0.6 ml). La solución es mezclada con 0.06 \mumol de los compuestos del título de los Ejemplos 17-19 (soluciones madre de 0.5 mg/ml en PBS) e incubada durante 4 horas a 25ºC. El conjugado es purificado por cromatografía en gel sobre una columna de NAP-5 (eluyente: PBS/10% glicerol). La inmuno reactividad de la solución de conjugado es determinada por cromatografía de afinidad (resina de ED-B-fibronectina) (J Immunol Meth 1999, 231, 239). Las inmuno reactividades de los conjugados que fueron obtenidos fue de >75% (AP39 antes de la conjugación >95%).
\global\parskip1.000000\baselineskip
Caracterización Fotofísica de los Conjugados de Tintes de BSA de los Ejemplos 21 y 22 y los Conjugados de Tintes de Anticuerpos scFv de los Ejemplos 23 y 24
El grado de concentración (proporción molar tinte/anticuerpo) es determinado por fotometría y está basado en un coeficiente de extinción de 75000 L mol^{-1} cm^{-1} en el soporte de absorción de onda corta (alrededor de 690 - 710 nm); la absorción del anticuerpo (AP39) es determinada con una OD_{280 \ nm} de 1.4; y/o la absorción de proteína (BSA) es determinada con una OD_{277 \ nm} de 0.58. El rendimiento cuántico de fluorescencia es determinado con un fluorolog SPEX (sensibilidad dependiente de la longitud de onda calibrada por lámpara y detector) con respecto al Verde Indocianina (Q = 0.13 in DMSO, J. Chem Eng. Data 1977, 22, 379, Bioconjugate Chem 2001, 12, 44).
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 2 Propiedades de los Conjugados de Acuerdo con la Invención
30
32 
\newpage
Ejemplo 24
Las propiedades de representación de imágenes de los conjugados de acuerdo con la invención fueron examinadas in vivo después de la inyección en ratones lampiños portadores de tumores. Con este fin, los conjugados fueron administrados por vía intravenosa, y la concentración en la región del tumor fue observada en un período de 0 a 24 horas. La fluorescencia de las sustancias fue excitada por medio de la irradiación de área de los animales con luz cercana al infrarrojo con una longitud de onda de 740 nm, la cual fue producida con un diodo de láser (potencia de salida 0.5 W). La radiación de fluorescencia fue detectada por medio de una cámara de CCD intensificada, y las imágenes de fluorescencia fueron almacenadas digitalmente. La efectividad in vivo de los conjugados de tintes es representada en la Figura 2 basada en un ejemplo.
Sin más detalles, se cree que un experto en el arte puede, usando la descripción precedente, utilizar la presente invención en toda su extensión. Las siguientes realizaciones preferidas específicas deben ser, por consiguiente, interpretadas como meramente ilustrativas, y no como limitantes en modo alguno del resto de la descripción.
En lo expuesto anteriormente y en los siguientes ejemplos, todas las temperaturas están expresadas sin corregir en grados Celsius, y todas las partes y porcentajes son por peso, a menos que sea indicado de otra forma.
Los ejemplos precedentes pueden ser repetidos con éxito similar sustituyendo los reactivos descritos genérica o específicamente y/o las condiciones operativas de esta invención por los usados en los ejemplos precedentes.

Claims (34)

1. Tinte de indotricarbocianina de fórmula general (I),
\vskip1.000000\baselineskip
33
en la cual
X
es O, S o C que es sustituida en dos lugares, por lo que los sustituyentes pueden ser seleccionados de metilo, etilo, propilo, isopropilo y/o butilo,
Y
es CH_{2}-CH_{2} o CH_{2}-CH_{2}-CH_{2},
Z
es C_{1} a C_{5} alquileno; por lo que los átomos de C son reemplazados opcionalmente por O o por S, o es
\vskip1.000000\baselineskip
34
R_{1} a R_{4}, independientemente uno de otro, son SO_{3}H o H, con la condición de que al menos tres de R_{1} a R_{4} sean SO_{3}H,
R^{5}
es -CO-NH-R_{8}-R_{9}, -NH-CS-NH-R_{8}-R_{9} o -NH-CO-R_{8}-R_{9},
\quad
en la cual R_{8} es seleccionado del grupo que consiste en C_{2}-C_{13} alquileno no ramificado en el cual los átomos de C son reemplazados opcionalmente por O o por S, y
R^{9}
es seleccionado de
\vskip1.000000\baselineskip
35
\quad
o cloroacetilo, bromoacetilo, yodoacetilo, cloroacetamido, yodoacetamido, cloroalquilo, bromoalquilo, yodoalquilo, disulfuro de piridilo y vinil sulfonamida, y
\quad
en la cual R_{6} y R_{7} son CH o están conectados para formar un anillo hexilo mediante un C_{3}-alquileno que opcionalmente puede ser sustituido en para-posición por un radical C_{1}-C_{4} alquilo, y sales y solvatos de este compuesto.
2. Tinte de indotricarbocianina de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual
Y
es CH_{2}-CH_{2},
Z
es C_{1} a C_{5} alquileno, por lo que los átomos de C son opcionalmente reemplazados por O o S, y en el cual R_{6} y R_{7} son CH, y sales y solvatos de este compuesto.
3. Tinte de indotricarbocianina de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el cual
Z
es C_{1}-C_{5} alquileno.
4. Tinte de indotricarbocianina de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el cual
Z es
\vskip1.000000\baselineskip
36 
\vskip1.000000\baselineskip
y R_{6} y R_{7} están conectados para formar un anillo hexilo a través de un C_{3}-alquileno.
5. Tinte de indotricarbocianina de fórmula general (I) descrita en la reivindicación 1 en la cual R_{5} es COOH o NH_{2}.
6. Tinte de indotricarbocianina de acuerdo con la reivindicación 3 de fórmula (II)
\vskip1.000000\baselineskip
37 
\vskip1.000000\baselineskip
y sales y solvatos de este compuesto.
\newpage
7. Tinte de indotricarbocianina de acuerdo con la reivindicación 3 de fórmula (III)
38
y sales y solvatos de este compuesto.
\vskip1.000000\baselineskip
8. Tinte de indotricarbocianina de acuerdo con la reivindicación 3 de fórmula (IV)
39
y sales y solvatos de este compuesto.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Tinte de indotricarbocianina de acuerdo con la reivindicación 3 de fórmula (V)
40
y sales y solvatos de este compuesto.
10. Tinte de indotricarbocianina de acuerdo con la reivindicación 3 de fórmula (VI)
41
y sales y solvatos de este compuesto.
11. Tinte de indotricarbocianina de acuerdo con la reivindicación 3 de fórmula (VII)
42
y sales y solvatos de este compuesto.
12. Tinte de indotricarbocianina de acuerdo con la reivindicación 3 de fórmula (VIII)
43
y sales y solvatos de este compuesto.
13. Tinte de indotricarbocianina de acuerdo con la reivindicación 3 de la fórmula (IX)
44
y sales y solvatos de este compuesto.
14. Tinte de indotricarbocianina de acuerdo con la reivindicación 3 de fórmula (X)
45
y sales y solvatos de este compuesto.
15. Tinte de indotricarbocianina de acuerdo con la reivindicación 2 de fórmula (XI)
46
y sales y solvatos de este compuesto.
16. Tinte de indotricarbocianina de acuerdo con la reivindicación 2 de fórmula (XII)
47
y sales y solvatos de este compuesto.
17. Tinte de indotricarbocianina de acuerdo con la reivindicación 2 de fórmula (XIII)
48
y sales y solvatos de este compuesto.
18. Tinte de indotricarbocianina de acuerdo con la reivindicación 4 de fórmula (XIV)
49
y sales y solvatos de este compuesto.
\newpage
19. Tinte de indotricarbocianina de acuerdo con la reivindicación 4 de fórmula (XV)
\vskip1.000000\baselineskip
50 
\vskip1.000000\baselineskip
y sales y solvatos de este compuesto.
20. Tinte de indotricarbocianina de acuerdo con la reivindicación 4 de fórmula (XVI)
\vskip1.000000\baselineskip
51 
\vskip1.000000\baselineskip
y sales y solvatos de este compuesto.
\newpage
21. Tinte de indotricarbocianina de acuerdo con la reivindicación 4 de fórmula (XVII)
52
y sales y solvatos de este compuesto.
22. Tinte de indotricarbocianina de acuerdo con la reivindicación 3 de fórmula (XVIII)
53
y sales y solvatos de este compuesto.
23. Tinte de indotricarbocianina de acuerdo con la reivindicación 2 de fórmula (XIX)
54
y sales y solvatos de este compuesto.
24. Tinte de indotricarbocianina de acuerdo con la reivindicación 4 de fórmula (XX)
55
y sales y solvatos de este compuesto.
25. Proceso para la producción de un tinte de indotricarbocianina de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a la 24, que comprende
a)
Preparación de una o más piridinas 4-sustituidas,
b)
Conversión de una o más piridinas 4-sustituidas en glutaconaldehído-dianilidas meso-sustituidas como precursores en tintes de cianina, por medio de la reacción de Zincke-König, y
c)
Obtención de los glutaconaldehído-dianilidas meso-sustituidas como precursores para tintes de cianina.
26. Proceso para la producción de un conjugado, que comprende el acoplamiento de un tinte de indotricarbocianina de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a la 4 y 6 a la 24 con una biomolécula.
27. Un conjugado de un tinte de indotricarbocianina con una biomolécula, producido de acuerdo con la reivindicación 26.
28. Un conjugado de acuerdo con la reivindicación 27, caracterizado porque como una biomolécula, comprende al menos una biomolécula que es seleccionada de péptidos, proteínas, lipoproteínas, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, ácidos nucleicos, tales como, por ejemplo, oligo- o polinucleótidos de ADN o ARN, aptámeros, PNA, y azúcares, tales como, por ejemplo, mono-, di-, tri-, oligo- y polisacáridos.
29. Conjugado de acuerdo con la reivindicación 28, donde la proteína es seleccionada del grupo de proteínas del esqueleto o proteínas solubles del cuerpo.
30. Conjugado de acuerdo con la reivindicación 28 ó 29, donde la proteína soluble es una proteína del suero, tal como, por ejemplo, HSA, BSA, albúmina de huevo, una enzima, tal como, por ejemplo, una peroxidasa o un anticuerpo, un fragmento de scFv o F(ab).
31. Conjugado de acuerdo con una de las reivindicaciones 27 a la 30, donde la proteína soluble tiene una afinidad con respecto a la ED-B-fibronectina.
32. Conjugado de acuerdo con una de las reivindicaciones 27 a la 31, donde el tinte de indotricarbocianina es acoplado a la biomolécula a través de un grupo SH, en particular a través de un grupo SH a una cisteína.
33. Kit de diagnóstico, que comprende un tinte de indotricarbocianina de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a la 4 y 6 a la 24 y/o un conjugado de acuerdo con una de las reivindicaciones 27 a la 31, junto con adyuvantes adicionales para implementar un diagnóstico in vivo de, en particular, tumores.
34. Un conjugado de acuerdo con una de las reivindicaciones 27 a la 31 para la fabricación de un medio de contraste por fluorescencia para el diagnóstico in vivo de tumores.
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