ES2311751T3 - Biomarcadores de polipeptidos para la diagnosis de la enfermedad de alzheimer. - Google Patents
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-
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Abstract
Procedimiento de evaluación del estado de la enfermedad de Alzheimer en un sujeto que comprende la detección de un polipéptido que consta de la secuencia de SEQ ID NO: 7 en una muestra del sujeto.
Description
Biomarcadores de polipéptidos para la diagnosis
de la enfermedad de Alzheimer.
La invención pertenece al campo de diagnóstico.
Más específicamente, la invención pertenece al campo de determinar
el estado de los polipéptidos marcadores específicos de la
enfermedad de Alzheimer.
La enfermedad de Alzheimer es una forma cada vez
más predominante de neurodegeneración que es responsable de
aproximadamente el 50-60% de los casos globales de
demencia entre las personas mayores de 65 años de edad.
Patológicamente, la neurodegeneración de la enfermedad de Alzheimer
se caracteriza por una atrofia prominente de las estructuras
corticolímbicas con muerte neuronal y pérdida de la sinapsis
neuronal, formación de marañas neurofibrilares (NFT), y la
formación de placas seniles que contienen depósitos de agregados de
amiloide \beta1-42 (A\beta42) en el cerebro
[Francis PT 1999]. La duración de la disminución cognitiva
progresiva es de aproximadamente 7 años desde la aparición de los
primeros signos hasta la muerte. Se asume que la fase clínica está
precedida por un período preclínico de 15-30 años
de continua deposición de placas amiloides y marañas
neurofibrilares. La edad de la aparición y progresión de la
enfermedad se determinan en gran medida por mutaciones génicas
causativas y por factores de susceptibilidad genética. Se pueden
añadir algunos factores de riesgo ambientales a los factores de
riesgo ambientales. Los factores genéticos que se sabe que están
implicados en la forma familiar de la enfermedad de Alzheimer con
aparición temprana de la enfermedad son: mutaciones en los genes de
presenilina 1 (PS1), presenilina 2 (PS2), y proteína precursora
amiloide (APP), y la presencia del alelo de apolipoproteína E4. Sin
embargo, la mayoría (95%) de los casos de enfermedad de Alzheimer es
esporádico y heterogéneo.
Actualmente, la diagnosis clínica de la
enfermedad de Alzheimer se puede establecer solamente en las fases
más tardías de la enfermedad, cuando el comportamiento cognitivo
disminuye de manera significativa y de forma paralela mediante
alteraciones estructurales del cerebro. El tratamiento del
diagnóstico clínico requiere una historia médica cuidadosa; examen
físico y neurológico; exámenes de sangre, orina y fluido
cefalorraquídeo (CSF) para excluir estados patológicos metabólicos
y médicos que pudieran enmascarar la enfermedad de Alzheimer;
exámenes psicométricos detallados para determinar el estado mental y
comportamiento cognitivo, y técnicas de formación de imágenes tales
como formación de imágenes de barrido por tomografía computarizada o
resonancia magnética del cerebro. Las evaluaciones. De diagnóstico
en los centros expertos alcanzan una exactitud de aproximadamente
80-85%. Debido al hecho que estos ensayos con caros
y requieren mucho tiempo, y son inconvenientes de manera particular
para los pacientes, existe una necesidad creciente de marcadores
biomoleculares de diagnóstico específicos fácilmente accesibles,
que se pueden medir en los fluidos corporales, tales como CSF,
sangre u orina, y que tienen un valor predictivo positivo alto para
la diagnosis de la enfermedad de Alzheimer, o ayudarían a
distinguir la enfermedad de Alzheimer a partir de otras formas de
demencia. Además, los marcadores fiables sensibles a la progresión
de la enfermedad pueden constituir parámetros sustitutos, un
requisito previo principal para la evaluación y desarrollo de nueva
orientación causal y enfermedad que modifica las estrategias
terapéuticas en la enfermedad de
Alzheimer.
Alzheimer.
Ya que el CSF directamente envuelve el cerebro,
los cambios en la composición de proteína puede reflejar lo más
exactamente las afecciones patológicas que están asociadas a
alteraciones específicas de los patrones de expersión de proteínas.
Durante la última década, un número de anormalidades biológicas se
han reseñado en el fluido cefalorraquídeo (CSF) de pacientes de la
enfermedad de Alzheimer, en particular los niveles alterados de del
fragmento A\beta1-42 de la proteína precursora de
amiloides, y niveles alterados de la proteína tau hiperfosforilada.
Sin embargo, la sensibilidad y especificidad de estos marcadores es
baja o solamente modesta [The Ronald and Nancy Reagan Research
Institue of the Alzheimer's Association and the National Institute
on Aging Working Group, 1998, Robles A 1998, Teunissen CE et
al., 2002].
Por lo tanto, existe la necesidad de de
biomarcadores novedosos con suficiente sensibilidad y especificidad
para (i) detectar la enfermedad de Alzheimer tan pronto como sea
posible, y (ii) para permitir la diferenciación de enfermedad de
otros tipos de demencia o enfermedades neurodegenerativas, y (iii)
controlar la eficacia terapéutica como parámetro sustituto, por
ejemplo, en el desarrollo de fármacos clínicos, y para iniciar la
farmacoterapia tan pronto como sea posible y retrasar la pérdida de
memoria y progresión de la enfermedad.
Una tecnología de procesador de proteínas
llamada Espectrometría de Masas en Tiempo de Vuelo mediante
Desabsorción/Ionización por Láser de Superficie
(SELDI-TOF MS) se ha desarrollado recientemente para
facilitar el perfilado de la proteína de mezclas biológicas
complejas [Davies HA 2000, Fung ET 2001, Merchant M
2000].
2000].
\newpage
La espectrometría de masas de procesador de
proteína ya se ha usado mediante varios grupos para detector los
biomarcadores potencialmente novedosos de próstata y vejiga [Adam BL
2001] o cáncer de mama [Wulfkuhle JD 2001] en suero, plasma seminal,
fluido de pezón, orina extractos de células. Para una revisión sobre
la investigación de biomarcadores usando SELDI-TOF
MS, véase [Issaq HJ 2002].
Inicialmente descrito en 1961 en el fluido
cefalorraquídeo (CSF), la cistatina C (indicios \gamma o
post-\gamma globulina, Acc. No. P01034) es un
pequeño inhibidor de la cisteína proteinasa presente en todos los
fluidos corporales humanos a concentraciones fisiológicamente
relevantes. El papel fisiológico de la cistatina C es probable que
regule la actividad de la cisteína proteasa extracelular, que se
produce por la invasión microbiana de las proteinasas de lisosomas
a partir de las células que mueren o enfermas. La Cistatina C se
localiza conjuntamente con \beta-amiloide
(A\beta) dentro de las paredes de las arteriolas en los cerebros
de la enfermedad de Alzheimer y angiopatía amiloide cerebral [Levy
E 2001]. Existen dos haplotipos comunes del gen CST3 que codifican
la cistatina C (A y B) que difieren entre sí en los tres sitios: dos
cambios de pares de bases individuales en la región promotora y uno
en el dominio de péptido señal que provoca una sustitución de
aminoácidos (alanina a treonina). Recientemente, los estudios de
control de casos encontraron asociaciones de CST3 con un incremento
de riesgo para la aparición tardía de la enfermedad de Alzheimer
[Crawford FC 2000, Finckh U 2000, Beyer K 2001].
La hemorragia hereditaria cerebral con
amiloidosis, tipo islandés (HCHWA-I), también
llamada angiopatía amiloide hereditaria por cistatina C (HCCAA), es
una forma dominante autosómica de la angiopatía amiloide cerebral
(CAA). El amiloide depositado en las paredes de los vasos del
cerebro se compone principalmente de una variante de cistatina C
caracterizada por la sustitución de Leu68-Gln [Cohen
1983, Ghiso 1986]. Esta patología también está unida a la
disminución de la concentración de este inhibidor de la cisteína
proteinasa principal en el fluido cefalorraquídeo y conduce a su
deposición amiloide en el cerebro [Grubb AO 1984].
Leung-Tack et al también
han purificado dos isoformas N-terminal truncadas de
cistatina C en orina de un paciente que ha recibido un transplante
renal. De acuerdo con estos datos, (desl-4)
cistatina C tiene un efecto inhibidor sobre funciones de las
células mononucleares periféricas humanas (PMN): liberación de
O_{2} y fagocitosis, que se pueden deber a la secuencia
N-terminal "KPPR". Sus datos soportan un papel
potencialmente importante para la cistatina C como un posible
inmunomodulador durante la inflamación. La acumulación de evidencia
indica que el incremento del daño mediado por radical libre a a la
función celular contribuye con el proceso de envejecimiento y
trastornos neurodegenerativos relacionados con la edad. El estrés
oxidante puede jugar un papel en la enfermedad de Alzheimer,
enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica (ALS).
Aunque el daño del radical libre a las neuronas puede no ser el
episodio primario que inicia estas enfermedades, parece que el daño
de radical libre está implicado en la cascada patogénica de estos
trastornos.
La
Beta-2-microglobulina (Acc. No.
P01884) constituye el componente constante pequeño del complejo de
histocompatibilidad principal de la clase I (CMH) y su presencia en
los fluidos biológicos representa el equilibrio entre el recambio
de proteína de membrana y la eliminación. Ya que este péptido parece
que se incrementa en algunas enfermedades caracterizadas por una
elevación de la respuesta inmune, su cuantificación en los fluidos
corporales ha llegado a ser un índice útil de estado inmunológico
in vivo [Hoekman et al 1985]. La función de esta
proteína no está clara, pero parece que está implicada en
enfermedades, que implican la destrucción de células gliales
[Ernerudh et al 1987].
El problema técnico que se soluciona mediante la
presente invención es la provisión de procedimientos mejorados para
diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer y/o control de la
progresión de la enfermedad de Alzheimer en un sujeto.
VGF (VGF humana, Nº de acceso: O15240) es un
precursor de péptido secretor que se expresa y procesa por las
células neuronales [Canu et al. 1997]. Los estudios de
hibridación in situ en el sistema nerviso central de ratas
adultas han revelado que el ARNm de VGF está distribuido ampliamente
por todo el cerebro con la expersión prominente en el hipocampo,
corteza entorhinal, y neocorteza. Además, se ha mostrado que la
transcripción y secreción de VGF está regulada hacia arriba de
manera selectiva por las neurotrofinas como NGF y BDNF, y por la
despolarización in vitro. El incremento de la expresión de
BDNF se puede observar en el giro dentado y regiones CA3 del
hipocampo, que son tejidos que aparecen que mueren pronto en la
patogénesis de la enfermedad de Alzheimer.
El documento WO00/25138 desvela polipéptidos
como marcadores específicos de la enfermedad de Alzheimer que se
expresan de manera diferencial en el tejido enfermo y sano.
El documento WO01/63294 desvela la expersión
diferencial de la SEQ ID NO: 7 como un marcador para el Trastorno
Afectivo Bipolar (BAD).
La invención se basa en el hallazgo sorprendente
de polipéptidos específicos que se expresan de manera diferencial
en sujetos que tienen la enfermedad de Alzheimer cuando se compara
con un grupo de control sano. Estos polipéptidos que se expresan de
manera diferencial pueden ser, por ejemplo, detectados en muestras
de fluido cefalorraquídeo del sujeto en el que la enfermedad de
Alzheimer se va a diagnosticar. El polipéptido individual usado en
la invención constituido por la secuencia de la SEQ ID NO: 7 se
puede detectar y/o cuantificar solo o en combinación con otros
polipéptidos.
Los marcadores de polipéptidos se definen por su
peso molecular respectivo. Cinco marcadores identificados por el
procedimiento SAX2 como se desvela en los Ejemplos muestran las
siguientes masas moleculares:
Marcador 1 (M1): 4824 \pm 20 Da;
Marcador 2 (M2): 7691 \pm 20 Da;
Marcador 3 (M3): 11787 \pm 20 Da;
Marcador 4 (M4): 11988 \pm 20 Da;
Marcador 5 (M5): 13416 \pm 20 Da.
\vskip1.000000\baselineskip
La Tabla uno muestra el peso molecular observado
de marcadores de polipéptidos M1 a M5 como se determina por
SELDI-TOF MS, las secuencias de aminoácidos de los
fragmentos observados de los marcadores de polipéptidos M1 a M5, y
la proteína a partir de la que los marcadores de polipéptidos M1 a
M5 se originan.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los polipéptidos expresados de manera
diferencial se pueden, por ejemplo, detectar en las muestras de
fluido cefalorraquídeo del sujeto en el que se va a diagnosticar la
enfermedad de Alzheimer. Además dependiendo de la realización
específica, la fuente de las muestras para medir la abundancia de
los marcadores de polipéptidos, también puede ser sangre, suero, u
orina, pero no se limita a estos compartimentos del cuerpo.
Como se muestra en la Figura 1, comparado con
una diagnosis negativa (controles sanos), M1 se expresa de manera
inferior en el CSF de pacientes con enfermedad de Alzheimer (p <
0,05), mientras que los marcadores M2 a M5 se expresan de manera
superior en el CSF de los pacientes con la enfermedad de Alzheimer
(p < 0,05).
Un nivel alterado de de uno o varios
polipéptidos, comparado con el nivel de polipéptidos en sujetos
sanos de control, permitirá determinar el estado de y/o control de
la progresión de la enfermedad de Alzheimer en un sujeto, permitirá
el control de la eficacia del tratamiento de la enfermedad de
Alzheimer, será una información útil para el desarrollo de
fármacos. Además, estos marcadores de biomolécula son útiles para
diferenciar la enfermedad de Alzheimer de otras formas de demencia
y trastornos neurodegenerativos.
Los sujetos preferidos en los que la enfermedad
de Alzheimer se va a diagnosticar o controlar son sujetos humanos.
Sin embargo, la diagnosis de la enfermedad de Alzheimer de acuerdo
con la invención también es posible con otros mamíferos. Si es
necesario, se pueden usar ortólogos de los marcadores de
péptidos.
La invención también se refiere al uso de
espectrometría de masas (MS) para detectar la enfermedad de
Alzheimer en sujetos humanos para determinar la progresión de la
enfermedad de Alzheimer en sujetos humanos mediante la detección
y/o cuantificación de de la cantidad de polipéptidos específicos en
muestras extraídas de los fluidos corporales del sujeto. En una
realización preferida de la invención, la muestra se extrae del
fluido cefalorraquídeo (CSF) del sujeto.
La detección y/o cuantificación de los
polipéptidos se logra preferiblemente mediante la cuantificación de
la señal que se detecta mediante MS a relaciones de masa molecular
carga (M/z) específicas que corresponden a las relaciones M/z de
los polipéptidos. Preferiblemente, las relaciones M/z cercanas a uno
de los polipéptidos también se miden.
La detección y/o cuantificación de los
polipéptidos también se puede lograr mediante el uso de un
inmunoensayo que usa anticuerpos específicos inducidos contra
el(los) marcador(es) especificados o fragmentos de
polipéptidos de los mismos. Los anticuerpos se pueden preparar
mediante el uso de marcador(es) purificados o fragmentos de
los mismos, o usando polipéptido(s) expresados de manera
recombinante que están constituidos por la secuencia de aminoácidos
específica del(de los) marcador(es) usando cualquier
procedimiento adecuado conocido en la técnica [Coligan 1991]. Tales
técnicas incluyen, pero no se limitan a, preparación de anticuerpos
mediante selección de anticuerpos a partir de genotecas de
anticuerpos recombinantes en fagos o vectores apropiados, así como
la preparación de anticuerpos policlonales o monoclonales mediante
inmunización de conejos o ratones [Huse 1989, Ward 1989]. Después
de que se proporciona el anticuerpo, se puede detectar un marcador
y/o cuantificar usando cualquiera de un número de ensayos de unión
inmunológicos convencionales [Patentes de Estados Unidos 4.366.241;
4.376.110; 4.517.288; y 4.837.168]. Los ensayos útiles incluyen,
pero no se limitan a, por ejemplo, un ensayo inmune de enzimas
(EIA) tal como ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), un
ensayo radioinmune (RIA), un ensayo de transferencia de Western, o
un ensayo de ranura o de puntos. Para una revisión de los
inmunoensayos generales véase [Coligan 1991]. En general, una
muestra obtenida a partir de un sujeto s puede poner en contacto
con el anticuerpo que se une de manera específica al marcador. Una
técnica potente para capturar el(los) marcador(es)
específico(s)
de una muestra de fluido corporal compleja es usar el anticuerpo fijado a soportes sólidos, tales como vidrio o plástico, por ejemplo, placa de microtitulación, una vara, una perla, o microperla. Como alternativa, el(los) marcador(es) también se pueden capturar de la muestra de fluido corporal mediante el anticuerpo específico inmovilizado a un sustrato de sonda o una disposición Protein Chip^{TM}, como se desvela para el inmunoensayo basado en SELDI [Xiao 2001]. Después de incubar la muestra con anticuerpos, el material no unido se lava en condiciones especificadas y el complejo anticuerpo formado se puede detectar, usando reactivos de detección apropiados. En una realización que usa la técnica de disposición SELDI ProteinChip^{TM} el(los) marcador(es) enriquecida de manera selectiva por el anticuerpo inmovilizado se puede detectar y cuantificar mediante espectrometría de masas de desabsorción ionización por láser asistida por matriz.
de una muestra de fluido corporal compleja es usar el anticuerpo fijado a soportes sólidos, tales como vidrio o plástico, por ejemplo, placa de microtitulación, una vara, una perla, o microperla. Como alternativa, el(los) marcador(es) también se pueden capturar de la muestra de fluido corporal mediante el anticuerpo específico inmovilizado a un sustrato de sonda o una disposición Protein Chip^{TM}, como se desvela para el inmunoensayo basado en SELDI [Xiao 2001]. Después de incubar la muestra con anticuerpos, el material no unido se lava en condiciones especificadas y el complejo anticuerpo formado se puede detectar, usando reactivos de detección apropiados. En una realización que usa la técnica de disposición SELDI ProteinChip^{TM} el(los) marcador(es) enriquecida de manera selectiva por el anticuerpo inmovilizado se puede detectar y cuantificar mediante espectrometría de masas de desabsorción ionización por láser asistida por matriz.
Se desvela
1. Un procedimiento de determinación del estado
de la enfermedad de Alzheimer en un sujeto que comprende la
detección de al menos un polipéptido comprendido en un grupo de
polipéptidos constituido por
i) un polipéptido que tiene una masa molecular
de 4824 \pm 20 Da,
ii) un polipéptido que tiene una masa molecular
de 7691 \pm 20 Da,
iii) un polipéptido que tiene una masa molecular
de 11787 \pm 20 Da,
iv) un polipéptido que tiene una masa molecular
de 11988 \pm 20 Da, and
v) un polipéptido que tiene una masa molecular
de 13416 \pm 20 Da.
Se desvela además un procedimiento de
determinación del estado de la enfermedad de de Alzheimer en un
sujeto que comprende la detección de al menos un polipéptido
comprendido en un grupo de polipéptidos que tienen,
respectivamente, masas moleculares de 4824 \pm 20 Da, de 7691
\pm 20 Da, de 11787 \pm 20 Da, de 11988 \pm 20 Da, de 13416
\pm 20 Da, de 4769 \pm 20 Da, de 6958 \pm 20 Da, de 6991 \pm
20 Da, de 13412 \pm 20 Da, de 13787 \pm 20 Da, de 17276 \pm
20 Da, de 40437 \pm 20 Da, de 6895 \pm 20 Da, de 6928 \pm 20
Da, de 7691 \pm 20 Da, de 7769 \pm 20 Da, de 7934 \pm 20 Da,
de 5082 \pm 20 Da, de 6267 \pm 20 Da, de 6518 \pm 20 Da, de
7274 \pm 20 Da, y de 8209 \pm 20 Da.
Mientras la detección de uno de tales
polipéptidos es en la mayoría de los casos suficiente para la
diagnosis de manera fiable de la enfermedad de Alzheimer, la
detección de dos o más polipéptidos de la invención puede
incrementar la sensibilidad y robustez del procedimiento.
Preferiblemente, 1, 2, 3, 4, 5, 10, y, lo más preferido, todos
estos polipéptidos se detectarán a partir de de la misma muestra. La
detección también se puede llevar a cabo de manera simultánea con
la detección de otros polipéptidos que también preferiblemente se
expresan de manera diferencial en sujetos que tienen la enfermedad
de Alzheimer cuando se compara con sujetos sanos. "Determinación
del estado de la enfermedad de Alzheimer" se entenderá como
diagnosis de la presencia de la enfermedad de Alzheimer en un
sujeto o un paciente, como determinación de la progresión de la
enfermedad en un sujeto o un paciente, y/o como determinación de la
propensión de un sujeto a desarrollar la enfermedad de
Alzheimer.
2. Se desvela además el procedimiento de punto 1
en el que 2, ó 3, ó 4, ó 5 polipéptidos de dicho grupo de péptidos
se detectan. La invención además se refiere a un procedimiento de
punto 1 en el que 2, ó 3, ó 4, ó 5, ó 10 o todos los polipéptidos de
dicho grupo de péptidos se detectan.
3. Se desvela además el procedimiento de
determinación del estado de la enfermedad de Alzheimer en un sujeto
que comprende la detección de al menos un polipéptido que comprende
la secuencia de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID
NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ
ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:
13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, y/o SEQ ID NO: 16. La invención
además se refiere a un procedimiento de determinación del estado de
la enfermedad de Alzheimer en un sujeto que comprende la detección
de al menos un polipéptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO:
1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID
NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ
ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO:
15, SEQ ID NO: 16, y/o SEQ ID NO: 17. Mientras que la detección de
uno de tales polipéptidos es en la mayoría de los casos suficiente
para la diagnosis de manera fiable de la enfermedad de Alzheimer,
detección de dos o más polipéptidos de la invención puede
incrementar la sensibilidad y robustez del procedimiento.
Preferiblemente, 1, 2, 3, 4, 5, 10, o todos estos polipéptidos se
detectarán a partir de al misma muestra. La detección también se
puede llevar a cabo de manera simultánea con la detección de otros
polipéptidos que también preferiblemente se expresan de manera
diferencial en sujetos que tienen la enfermedad de Alzheimer cuando
se compara con sujetos sanos.
4. Se desvela además un procedimiento de
determinación del estado de la enfermedad de Alzheimer en un sujeto
que comprende la detección de al menos un polipéptido comprendido en
un grupo de polipéptidos constituido por
i) cistatina C humana,
ii)
beta-2-microglobulina humana,
iii) mioglobina humana (nueva variante),
iv) un fragmento de al menos 5, 8, 10, ó 20
aminoácidos de cistatina C humana,
v) un fragmento de al menos 5, 8, 10, ó 20
aminoácidos de beta-2-microglobulina
humana, y
vi) un fragmento de al menos 5, 8, 10, ó 20
aminoácidos de mioglobina humana (nueva variante).
Se desvela además un procedimiento de
determinación del estado de la enfermedad de Alzheimer en un sujeto
que comprende la detección de al menos un polipéptido comprendido en
un grupo de polipéptidos constituido por
i) cistatina C humana,
ii)
beta-2-microglobulina humana,
iii) mioglobina humana (nueva variante),
iv) proteína neurosecretora VGF humana,
v) un fragmento de al menos 5, 8, 10, ó 20
aminoácidos de cistatina C humana,
vi) un fragmento de al menos 5, 8, 10, ó 20
aminoácidos de beta-2-microglobulina
humana, y
vii) un fragmento de al menos 5, 8, 10, ó 20
aminoácidos de mioglobina humana (nueva variante), y
viii) un fragmento de al menos 5, 8, 10, ó 20
aminoácidos de proteína neurosecretora VGF.
Mientras la detección de uno de tales
polipéptidos es en la mayoría de los casos suficiente para la
diagnosis de manera fiable de la enfermedad de Alzheimer, la
detección de dos o más polipéptidos de la invención puede
incrementar la sensibilidad y robustez del procedimiento. Más
preferiblemente, 1, 2, 3, 4, 5, 6 o todos estos polipéptidos se
detectarán a partir de al misma muestra. La detección también se
puede llevar a cabo de manera simultánea con la detección de otros
polipéptidos que también preferiblemente se expresan de manera
diferencial en sujetos que tienen la enfermedad de Alzheimer cuando
se compara con sujetos sanos.
5. Se desvela además un procedimiento de
investigación de la progresión de la enfermedad de Alzheimer en un
sujeto caracterizado porque un procedimiento de cualquiera de los
puntos 1 a 4 se realiza con al menos dos muestras distintas
extraídas del mismo sujeto. Para este propósito, se analizarán las
muestras extraídas de un sujeto en diferentes momentos. Los cambios
en la cantidad del(de los) polipéptido 8s) permitirá sacar
conclusiones sobre la progresión de la enfermedad de Alzheimer en el
sujeto.
6. Se desvela además un procedimiento de
cualquiera de los puntos 1 a 5, en el que la detección de
dicho(s) polipéptido(s) es mediante
SELDI-TOF MS. Otros procedimientos de espectrometría
de masas adecuados y otros procedimientos de detección se pueden
usar de manera alternativa. Más específicamente, la invención se
refiere a un procedimiento de cualquiera de los puntos 1 a 5, en el
que la detección de dicho(s) polipéptido(s) es
mediante SELDI-TOF MS en el que H50 hidrófobo, el
WCX2, o la superficie IMAC se usa como un soporta tras ionización.
Diferentes soportes para ionización producen sensibilidad para las
proteínas específicas de interés.
7. Se desvela además un procedimiento de
cualquiera de los puntos 1 a 5, en el que los anticuerpos
específicos o anticuerpos que reconocen dicho(s)
polipéptido(s) se usan para la detección de dicho(s)
polipéptido(s).
8. Se desvela además un procedimiento de
cualquiera de los puntos 1 a 7, en el que la detección es en una
muestra, que comprende CSF de dicho paciente. Una muestra extraída
de un sujeto se puede procesar inmediatamente después que se haya
tomado, o se puede primero congelar y analizarse más tarde. Las
muestras también pueden Constar o contener otros fluidos corporales
tales como sangre, suero, plasma, orina, plasma seminal, fluido de
pezón, o extractos de células.
9. Se desvela además un kit que comprende un
polipéptido que tiene una masa molecular de 4824 \pm 20 Da, un
polipéptido con una masa molecular de 7691 \pm 20 Da, un
polipéptido que tiene una masa molecular de 11787 \pm 20 Da, un
polipéptido que tiene una masa molecular de 11988 \pm 20 Da, y/o
un polipéptido que tiene una masa molecular de 13416 \pm 20 Da.
La invención además se refiere a un kit que comprende un
polipéptido que tiene una masa molecular de 4824 \pm 20 Da, un
polipéptido que tiene una masa molecular de 7691 \pm 20 Da, un
polipéptido que tiene una masa molecular de 11787 \pm 20 Da, un
polipéptido que tiene una masa molecular de 11988 \pm 20 Da, y un
polipéptido que tiene una masa molecular de 13416 \pm 20 Da. La
invención además se refiere a un kit que comprende polipéptidos que
tienen una masa molecular de 4824 \pm\pm 20 Da, de 7691 \pm
20 Da, de 11787 \pm 20 Da, de 11988 \pm 20 Da, de 13416 \pm 20
Da, de 4769 \pm 20 Da, de 6958 \pm 20 Da, de 6991 \pm 20 Da,
de 13412 \pm 20 Da, de 13787 \pm 20 Da, de 17276 \pm 20 Da,
de 40437 \pm 20 Da, de 6895 \pm 20 Da, de 6928 \pm 20 Da, de
7691 \pm 20 Da, de 7769 \pm 20 Da, de 7934 \pm 20 Da, de 5082
\pm 20 Da, de 6267 \pm 20 Da, de 6518 \pm 20 Da, de 7274
\pm 20 Da, y/o de 8209 \pm 20 Da. Tal kit se puede aplicar para
diversos propósitos, por ejemplo, para uso como un patrón en uno de
los procedimientos mencionados anteriormente. Dicho kit puede
comprender 2, 5, 10, o todos los polipéptidos anteriores.
10. Se desvela además un kit que comprende un
fragmento de al menos 5 aminoácidos de cistatina C humana, un
fragmento de al menos 5 aminoácidos de
beta-2-microglobulina humana, y un
fragmento de al menos 5 aminoácidos de mioglobina humana. Este kit
se puede aplicar para diversos propósitos, por ejemplo, para uso
como un patrón en uno de los procedimientos mencionados
anteriormente. Se desvela además un kit que comprende un fragmento
de al menos 5, 10 ó 20 aminoácidos de cistatina C humana, un
fragmento de al menos 5, 10 ó 20 aminoácidos de human
beta-2-microglobulina humana, un
fragmento de al menos 5, 10 ó 20 aminoácidos de mioglobina humana,
y un fragmento de al menos 5, 10 ó 20 aminoácidos de proteína
secretora VGF. Estos kits se pueden aplicar para diversos
propósitos, por ejemplo, para uso como un patrón en uno de los
procedimientos mencionados anteriormente.
Figura
1:
Intensidades medias de de los cinco marcadores
de péptidos de la Tabla 1, que se expresan de manera diferencial en
el grupo enfermo cuando se compara con los grupos control.
La invención se desvela además mediante uno o
varios de los siguientes ejemplos. Estos ejemplos no se han de
entender como restricción del ámbito de la invención para los
ejemplos mediante cualquier medio.
La diagnosis de la enfermedad de Alzheimer en
sujetos humanos se realizó de acuerdo con los criterios del
Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y de Comunicación y
Asociación de apoplejía - Enfermedad de Alzheimer y trastornos
relacionados (NINCDSADRDA). El grupo de Enfermedad de Alzheimer
constaba de 9 pacientes de edad 75 \pm 7 años, seis hombres y
tres mujeres. El grupo de sujetos de control sanos constaba de 10
individuos de edad 78 \pm 14 años, dos hombres y ocho mujeres sin
historia, síntomas o signos de enfermedad psiquiátrica o
neurológico.
Se proporcionó consentimiento informado por cada
paciente y los cuidadores de los pacientes antes de la
investigación. El estudio se aprobó por el comité de ética local.
Después de la punción lumbar, se congelaron muestras de CSF sobre
hielo seco inmediatamente después de la extracción al lado de la
cama en alícuotas de 0,5 ml y se almacenaron a -80ºC hasta los
análisis.
Disposición de procesador de proteína SAX 2
(Ciphergen Biosystems, Fremont, CA, Estados unidos) se equilibró
durante 5 min con 5 \mul de tampón de unión(100 mM Na
Acetato pH = 4,0). Se retiró el tampón cuidadosamente con un
pañuelo y se añadieron 2,5 \mul se tampón de unión a los pocillos.
Las muestras de CSF brutas (2,5 \mul) se añadieron a los pocillos
y se incubaron durante 20 min a temperatura ambiente en una cámara
húmeda sobre una plataforma de balanceo. Se retiró el CSF y los
pocillos se lavaron de manera individual con 10 \mul de tampón de
unión durante 5 min. Las disposiciones después se colocaron en un
Eppendorf cónico de 15 ml y se lavó dos veecs con el tampón de
unión durante 5 minutos. Finalmente, el procesador se enjuagó dos
veces con agua destilada. Se retiró el exceso de H_{2}O y
mientras la superficie estaba todavía húmeda, se realizaron dos
adiciones por pocillo de 0,5 \mul de ácido sinapínico (SPA) (2
mg/ml) en 50% (vol/vol) de acetonitrilo y 0,5% (vol/vol) de ácido
trifluoroacético y se secó. Las disposiciones después se leyeron en
un sistema lector de Procesador de proteína, serie PBS II
(Ciphergen Biosystems). El rayo láser se localizó sobre la muestra
a vacío. Esto provocó que las proteínas se absorbieran a la matriz
para que se ionizaran, de manera simultánea a las desabsorbida de
la superficie de la disposición de procesador de proteína. Las
proteínas ionizadas se detectaron y sus masas moleculares se
determinaron de acuerdo con su tiempo de (TOF). Los espectros de
masas de TOF, recogidos en el modo de ion positivo, se generaron
usando una media de 65 disparos de láser a lo largo de la mancha en
un conjunto de potencia láser ligeramente por encima del umbral
(10-15% más alto que el umbral) La masa alta a
conseguir se estableció a 40 kDa, optimizado de 1 a 15 kDa. Los
espectros se recogieron y se analizaron usando el software del
procesador de proteína Ciphergen (versión 3.0). La calibración
externa de del lector se realizó usando los patrones de peso
molecular de péptidos "todo en 1" (Ciphergen biosystems, Inc.)
diluidos en la matriz SPA (1:1, vol/vol) y directamente se
amplificaron en un pocillo. La comparación de perfil de proteína se
realizó después de la normalización sobre una corriente de iones
total de todos los espectros incluidos en el mismo experimento. Se
ensayó la reproducibilidad mediante análisis de alícuotas
diferentes de la misma muestra del CSF sobre 4 pocillos diferentes
de la misma disposición del procesador de proteínas
(reproducibilidad intraensayo intraprocesador), sobre dos diferentes
procesadores (reproducibilidad intraensayo intraprocesador)
procesados en paralelo, y reproducidos en otro experimento
(reproducibilidad intraensayo).
El análisis de las muestras de CSF de 9
pacientes diagnosticados con enfermedad de Alzheimer con relación a
10 controles reveló que 5 máximos se expresaban significativamente
de manera diferencial entre los dos grupos (p < 0,05). La masa
SELDI media aproximada asociada a las cinco proteínas expresadas de
manera diferencial era 4,82 kDa, 7,7 kDa, 11,8 kDa y 12,0 kDa y
13,4 kDa (p < 0.05) (véase la Tabla 1, Fig. 1).
Con el fin de identificar las proteínas
correspondientes a estos máximos, se realizó una fracción de CSF
bruto sobre una columna de giro SAX. Se analizaron las fracciones
eluidas mediante SELDI-TOF MS.
La columna de giro SAX, número de lote
SAX2-001116-01, (Ciphergen
Biosystems, Fremont, CA, USA) se rehidrató durante toda una noche a
4ºC en el tampón de equilibrio (20 mM
tris(hidroximetil)aminometano clorhidrato
(Tris-HCl), 5 mM NaCl, pH 9,0). La columna se
calentó a temperatura ambiente y se retiraron las burbujas de aire.
El tampón de equilibrio se dejó fluir a través de una matriz de
columna mediante gravedad. El tampón de equilibrio (0,5 ml) se
añadió a la columna y se pasó a través de la resina dos veces. Dos
ml de CSF control se diluyó en el tampón de equilibrio (1:1,
vol/vol). Se cargó la muestra de proteína a la columna mediante
fracción de 0,8 ml y se dejó correr a través de la columna mediante
gravedad hasta que no salía ninguna gota de la columna. Después la
columna se centrifugó a 150 x g durante 1 min. Después la resina se
lavó con un volumen equivalente de tampón de equilibrio. Esta etapa
se repitió varias veces con el fin de cargar la muestra entera en la
resina. La elución de las proteínas unidas se realizó disminuyendo
el pH. El tampón A de elución constaba de 20 mM
Tris-HCl, 5 mM NaCl pH 8,0; tampón B de elución B =
20 mM fosfato de sodio pH 7,0; tampón C de elución = 20 mM fosfato
de sodio pH 6,0; tampón D de elución = 20 mM fosfato de sodio y
citrato pH 5,0; tampón E de elución = 20 mM fosfato de sodio y
citrato pH 4,0; tampón F de elución = 20 mM fosfato de sodio y
citrato pH 3.4; tampón G de elución = 30% acetonitrilo en tampón F
de elución . La elución se realizó aplicando 2 x 75 \mul del
tampón de elución y centrifugación a 150 x g durante 1 min. Cda
fracción recogida (150 \mul) se concentró sobre un
speed-vac hasta un volumen de 10 \mul. Los
perfiles de proteína se analizaron sobre SELDI-TOF
MS usando la disposición de procesador de proteína SAX2. El
procesador se equilibró con un tampón de unión que constaba de 20 mM
Tris-HCl, 5 mM NaCl, pH = 9,0.
Una alícuota de 0,5 \mul de cada fracción
concentrada se aplicó directamente sobre 2,5 \mul de tampón de
unión por mancha y se procesó como se ha descrito previamente. El
ersto de las fracciones se cargaron en un gel de Tris tricina como
se desvela más adelante.
El máximo expresado de manera diferencial de
13,4 kDa se eluyó con tampón A (20 mM Tris-HCl 5 mM
NaCl pH 8,0) y B (20 mM fosfato de sodio pH 7,0). Los máximos
expresados de manera diferencial de 11,8 kDa y 12,0 kDa se
encontraron en las fracciones eluidas con el tampón C (20 mM fosfato
de sodio pH 6,0) y D (20 mM fosfato de sodio y citrato pH 5,0). El
grupo de 7,7 kDa se eluyó con tampón D (20 mM fosfato de sodio y
citrato pH 5,0) y E (20 mM fosfato de sodio y citrato pH 4,0).
Cada fracción eluida se cargó sobre un gel de
poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio Tris Tricine al 16,5% y
se sometió a electroforesis (SDS PAGE). Después de coloración con
azul coomassie, las bandas observadas sobre el gel confirmaron los
resultados, las bandas observadas sobre el gel confirmaron los
resultados obtenidos mediante análisis SELDI. La banda
correspondiente al grupo de 7,7 kDa, 11,8 kDa y 12,0 kDa se cortó.
Las proteínas se extrajeron como se ha descrito en el Ejemplo 6 y
se identificaron mediante Q-TOF. El análisis de MS
del máximo 7,7 kDa no coincidían con ninguna proteína humana
conocida, sin embargo, pueden indicar una nueva variante u homólogo
de mioglobina. Las secuencias de péptidos eran las siguientes
XXAD(L/I)AGHG(Q/K)EV(L/I)(L/I)R
y
HGTVV(L/I)TA(L/I)GG(L/I)(L/I)K.
El análisis de MS de los máximos de 11,8 kDa y
12,0 kDa identificó
beta-2-microglobulina de ambos de
ellos.
Ya que el grupo de 13,4 kDa no se puede observar
en el gel de Tris Tricine, se realizó una electroforesis de Tris
glicina SDS-PAGE cobre muestras de CSF brutas. La
banda correspondiente a la
beta-2-microglobulina se podría
fácilmente encontrar en este gel teñido. Los inventores concluyeron
que la proteína que migra justo antes de la
beta-2-microglobulina podrían
corresponder con la siguiente proteína abundante observada en le
perfil de SELDI, a saber el máximo de 13,4 kDa. La banda se escindió
del gel y se digirió por tripsina antes del análisis de MALDI. El
análisis de huella de masas de péptido permitió identificar la
Cistatina C. La cobertura de la secuencia proporcionada por el
análisis era 60%.
Veinte \mul de CSF se mezclaron con 10 \mul
de tampón desnaturalizante Laemmli [Laemmli 1970]. Las muestras se
calentaron hasta 95ºC durante 5 min, y se cargaron en un gel de
SDS-poliacrilamida al 15% T (T = concentración de
acrilamida total) de acuerdo con el procedimiento de Laemmli. Los
geles se tiñeron en una solución que contenía Azul Brillante
Coomassie R-250 (0,1% p/v) y metanol (50% v/v)
durante 30 min. La decoloración se realizó en una solución que
contenía metanol (40% v/v) y ácido acético (10% v/v).
La electroforesis Tris tricine
SDS-PAGE se realizó de acuerdo con Schagger y von
Jagow [1987] usando un premoldeo de 16,5% de geles T (Biorad,
Hercules, CA). El tampón de ánodo constaba de 0,2 M
Tris-HCl, pH 8,9 y el tampón de cátodo constaba de
0,1 M Tris-HCl, 0,1 M Tricina, 0,1% SDS, pH 8,25.
Las muestras se diluyeron en 10 \mul de 50 mM
Tris-HCl, 4% (p/v) SDS, 12% (p/v) sacarosa, 5% (v/v)
-mercaptoetanol, y pequeñas cantidades de azul de bromofenol, pH
6,8. Después de la desnaturalización a 95ºC durante 5 min, las
muestras se cargaron en el gel. Se desarrollaron los geles a 80 V
durante 3 horas. Después de la electroforesis, los geles se fijaron
en 40% de metanol, 10% de ácido acético durante 30 min. Los geles
después se tiñeron con azul Coloidal de coomassie G250 durante toda
una noche y se destiñeron en 30% de metanol. Las bandas a
identificar se cortaron inmediatamente, se colocaron en un
Eppendorf y se mantuvieron a 4ºC hasta el análisis posterior. Las
masas moleculares aparentes se determinaron mediante desarrollo de
los patrones del peso molecular (PM) del polipéptido: Triosafofato
isomerasa PM 26.625; Mioglobina PM 16.950;
\alpha-lactoalbúmina PM 14.437; Aprotinina PM
6.512; la cadena b de Insulina, PM oxidado de 3.496 y Bacitracina
de PM 1.423 (Biorad).
Los fragmentos de geles que contenían la
proteínas de interés se cortaron para digestión de las proteínas
con tripsina usando los procedimientos publicados anteriormente
[Shevchenko 1996, Hellman 1994, Rosenfeld 1992] y modificados como
se desvela a continuación. La parte de gel se destiñó primero con
100 \mul de 50 mM bicarbonato de amonio, 30% (v/v) acetonitrilo
durante 15 min a temperatura ambiente. La solución de decoloración
se retiró y se reemplazó por 25 \mul de 10 mM
DL-ditiotreitol (DTT) en 50 mM bicarbonato de amnio
y se incubó durante 35 min a 56ºC. La solución DTT de reemplazó
después por 25 \mul de 55 mM yodoacetamida en 50 mM de
bicarbonate de amonio y se incubó durante 45 min a temperatura
ambiente en la oscuridad. Las partes de gel se lavaron durante 10
min con 100 \mul de 50 mM de bicarbonato de amonio durante 10 min
con 100 \mul de 50 mM bicarbonato de amonio y 30% (v/v)
acetonitrilo.
Las partes de gel se secaron después durante 30
min en una centrífuga de vacío Hetovac (HETO, Allerod, Denmark).
Las partes secas de gel se rehidrataron durante 45 min a 4ºC en
5-20 \mul de una solución de 50 mM bicarbonato de
amonio que contenía tripsina a 6,25 ng/\mul. Después de una
incubación durante toda una noche a 37ºC, se secaron las partes de
gel en una centrífuga de alto vacío antes de que se rehidrate
mediante la adición de 20 \mul de agua destilada y finalmente se
secaron de nuevo en un speed-vac durante 30 min. La
extracción de los péptidos se realizó con 20 \mul de 0,1% (v/v)
de ácido trifluoroacético (TFA) durante 20 min a temperatura
ambiente con agitación ocasional. La solución de TFA que contenía
los péptidos se transfirieron a un tubo de polipropileno. Se
realizó una segunda elución con 20 \mul de 0,1% (v/v) TFA en 50%
(v/v) de acetonitrilo durante 20 min a temperatura ambiente con
agitación ocasional. La segunda solución de TFA se combinó con la
primera. El volumen de los extractos combinados se redujo hasta
1-2 \mul mediante evaporación a vacío. Las
extracciones de control (blancos) se realizaron usando partes de
geles sin proteínas.
1,5 \mul de muestra se colocó sobre una placa
Diana de 100 pocillos MALDI. Se añadieron los mismos volúmenes de
matriz (10 mg/ml ácido
\alpha-Ciano-4-hidroxicinámico
en 50% (v/v) acetonitrilo, 0,1% (v/v) TFA) a la digestión yodada
anteriormente. Las muestras se secaron tan rápido como fue posible
usando un recipiente de vacío. La medición de masa de la solución
líquida se llevaron a cabo con un espectrómetro de masas
MALDI-TOF Voyager^{TM} Elite y Super STR
(PerSeptive Biosystems, Framingham MA, Estados Unidos) equipado con
láser de nitrógeno 337 nm. Se usó el analizador en la forma
reflectrón a una tensión de aceleración de 20 kV, un parámetro de
extracción retrasada de 100-140 ns y una puerta de
masa baja de 850 Da. La potencia del láser se fijó ligeramente por
encima del umbral (10-15% mayor que el umbral) para
la producción de iones moleculares. Los espectros se obtuvieron
mediante la suma de 10 a 256 disparos de láser consecutivos. Las
masas de los 60 máximos mayores se extrajeron de los espectros y se
usaron para la identificación de proteína usando la herramienta de
huella de masa de péptido Smartldent [Gras 1999]. La investigación
se llevó a cabo contra las base de datos de
SWISS-PROT y TrEMBL. La consulta se hizo para el ser
humano, el número mínimo de masa que coincidía era 4, la tolerancia
máxima para las masas era 50 ppm después de una calibración interna
que usa producto de autolisis de tripsina, en la mayoría se
permitió una escisión omitida para los péptidos trípticos, y las
modificaciones aceptadas fueron carboximetilación con yodoacetamida
de cisternas y oxidación artefactual de metioninas.
\newpage
Antes de la separación por nano CL (CL =
cromatografía líquida), los volúmenes de las soluciones que
contenían péptido se ajustaron hasta 7 \mul mediante la adición
de una solución de ácido fórmico de 0,1% (v/v). las muestras se
colocaron en un automuestreador Triathlon (Spack, Emmen, Holland).
Para cada experimento, 5 \mul de solución que contenía péptido se
inyectó en una columna de fase inversa C18 de 75 \mum de diámetro
interno (YMS-ODS-AQ200, Michrom
Bioresource, Auburn, CA). Los péptidos se e3luyeron con un gradiente
de acetonitrilo (ACN) en la presencia de 0,1% (v/v) de ácido
fórmico, usando bombas SunFlow (SunChrom, Friderichsdorf, Alemania).
Se usó un divisor de flujo con el fin de disminuir el caudal de las
bombas de 200 a 0,4 \mul/min. Los péptidos se analizaron con un
espectrómetro de masas de tiempo de vuelo (Q- TOF) (Micromass,
Wythenshawe, Inglaterra). Se aplicó una tensión de 2700 V sobre el
capilar de nanoelectropulverización (New Objective, Woburn, MA,
Estados Unidos). Se usó argón como gas de colisión. La energía de
colisión se estableció como una función de la masa de ion
precursora. Los espectros de MS/MS se adquirieron mediante
conmutación automática entre modo MS y MS/MS. Los datos de MS/MS se
convirtieron en un formato compatible (archivos DTA) mediante el
software ProteinLynx (Micromass, Wythenshawe, Inglaterra) y se
analizaron usando motores de investigación convencionales contra
las bases de datos de SWISS-PROT, TrEMBL, NCBInr y
EST. En los casos de interpretación manual de los datos de MS/MS, la
identificación se realizó mediante secuencia solamente
investigación.
Se encontró que el marcador M5 era un fragmento
de Cistatina C, los marcadores de M3 y M4 eran isoformas de
beta-2-microglobulina y M2 era una
nueva variante u homólogo de mioglobulina. El marcador M1 se
encontró que era un fragmento de la proteína neurosecretora VGF.
Los valores P se calcularon usando
procedimientos estadísticos convencionales conocidos por los
expertos en la técnica. Los valores P menores que 0,05 se
consideraron que eran estadísticamente significativos.
Algunas muestras de CSF procedentes de pacientes
control se fraccionaron mediante el dispositivo de filtración
Centricon 30 (Millipore Corp., Bedford, MA) in con el fin de retirar
la proteína con un peso molecular mayor de 30 kDa. La sal y
polipéptido con un peso molecular menor de 3 kDa se retiraron usando
un Centricon 3 (Millipore Corp., Bedford, MA). El Centricon 3 se
lavó después con agua destilada ultrapura. En esa fracción de
lavado, el componente de 4,82 kDa se encontró que era el mayor
componente. Esta fracción líquida se redujo primero con una
solución 10 mM de 1,4-Ditioeritritol durante 1 h a
56ºC, dspués se alquiló con 54 mM yodoacetamida durante 45 min a
temperatura ambiente. Finalmente, el polipéptido se digirió con 6
mg/l de tripsina durante toda una noche a 37ºC. Esta fracción
líquida se analizó mediante CL y Q-TOF como se ha
descrito anteriormente.
Usando SELDI-TOF, se realizó un
análisis de 10 muestras de CSF de pacientes de AD y 10 controles en
tres superficies diferentes : el H50 hidrófobo, el WCX2, y la
superficie IMAC (Ciphergen Biosystems, Fremont, California, Estados
Unidos, resp.). Siete máximos expresados de manera diferencial se
encontraron sobre el H50, cinco marcadores sobre el WCX2, y cinco
marcadores sobre la superficie de IMAC. Un ensayo de diagnóstico que
usa los marcadores del procesador H50 chip reveló una especificidad
y sensibilidad de 100% y 70%, respectivamente. la combinación de
los marcadores encontrada sobre H50 y WCX2 proporcionó una
especificidad y sensibilidad de 100% y 80%. Finalmente, la
combinación de los marcadores encontrada sobre H50, WCX2 e IMAC
proporcionó una especificidad y sensibilidad de 100% y 90%.
Las masas medias de los polipéptidos expresados
de manera diferencial como se determina por
SELDI-TOF que usa diferentes materiales de
superficie eran como sigue:
Máximo de H50 hidrófobo: 7 máximos
Marcador 1: 4769 \pm desviación estándar
Da
Marcador 2: 6958 \pm desviación estándar
Da
Marcador 3: 6991 \pm desviación estándar
Da
Marcador 4: 13412 \pm desviación estándar
Da
Marcador 5: 13787 \pm desviación estándar
Da
Marcador 6: 17276 \pm desviación estándar
Da
Marcador 7: 40437 \pm desviación estándar
Da
\vskip1.000000\baselineskip
IMAC Cu de superficie: 5 máximos
Marcador 1: 6895 \pm desviación estándar
Da
Marcador 2: 6928 \pm desviación estándar
Da
Marcador 3: 7691 \pm desviación estándar
Da
Marcador 4: 7769 \pm desviación estándar
Da
Marcador 5: 7934 \pm desviación estándar
Da
\vskip1.000000\baselineskip
WCX2 de superficie: 5 máximos
Marcador 1: 5082 \pm desviación estándar
Da
Marcador 2: 6267 \pm desviación estándar
Da
Marcador 3: 6518 \pm desviación estándar
Da
Marcador 4: 7274 \pm desviación estándar
Da
Marcador 5: 8209 \pm desviación estándar
Da
La desviación estándar (desviación estándar) es
20 Da para cada marcador anterior. Sin embargo, la desviación
estándar también puede ser 40 Da, o 10 Da, o 5 Da para cada marcador
anterior.
\vskip1.000000\baselineskip
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<160> 17
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<170> PatentIn versión 3.1
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<210> 1
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<220>
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<221> misc_característica
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<222> (1).. (2)_
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = cualquier aminoácido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5).. (5)_
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = L o I
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<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10).. (10)_
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Q o K
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (13).. (13)_
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = L o I
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14).. (14)_
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = L o I
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<213> Homo sapiens
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1).. (14)_
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = L o I
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1).. (14)_
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Leu o Ile
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<400> 2
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 4
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 5
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<211> 13
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 5
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 7
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<211> 9
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<213> Homo sapiens
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<400> 7
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 8
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<211> 11
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 9
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 9
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<213> Homo sapiens
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<400> 10
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<210> 11
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<211> 16
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
\newpage
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<400> 11
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<210> 12
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<211> 17
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 12
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<210> 13
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<211> 17
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 13
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<210> 14
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<211> 18
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 14
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<400> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<211> 20
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (6)
1. Procedimiento de evaluación del estado de la
enfermedad de Alzheimer en un sujeto que comprende la detección de
un polipéptido que consta de la secuencia de SEQ ID NO: 7 en una
muestra del sujeto.
2. Procedimiento de evaluación del estado de la
enfermedad de Alzheimer de acuerdo con la reivindicación 1, en el
que al menos uno de los polipéptidos adicionales seleccionado entre
el grupo constituido por los polipéptidos que comprenden las SEQ ID
NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ
ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11,
SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID
NO: 16, SEQ ID NO: 17 o seleccionado entre el grupo constituido por
cistatina C humana,
beta-2-microglobulina humana, el
homólogo de 7,7 kD de mioglobina humana, una proteína neurosecretora
VGF, un fragmento de al menos 5 aminoácidos de cistatina C humana,
un fragmento de al menos 5 aminoácidos de
beta-2-microglobulina humana, un
fragmento de al menos 5 aminoácidos del homólogo de 7,7 kD de
mioglobina humana, y se detecta un fragmento de al menos 5
aminoácidos de proteína neurosecretora VGF.
3. Procedimiento de investigación de la
progresión de la enfermedad de Alzheimer en un sujeto
caracterizado porque un procedimiento de la reivindicación 1
o reivindicación 2 se realiza con al menos dos muestras distintas
extraídas del mismo sujeto.
4. Procedimiento de la reivindicación 1 a 3, en
el que la detección de dicho(s) polipéptido(s) es
mediante SELDI-TOF MS.
5. Procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que los anticuerpos específicos o
anticuerpos que reconocen dichos polipéptidos se usan para la
detección de dicho(s) polipéptido(s).
6. Procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que la detección es en una muestra que
comprende CSF, sangre, suero, plasma, orina, seminal plasma, fluido
de pezón, y/o extractos de células de dicho paciente.
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| EP02026643 | 2002-11-29 |
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