ES2312213T3 - Procedimiento, equipamiento y reactivo para la separacion celular. - Google Patents

Procedimiento, equipamiento y reactivo para la separacion celular. Download PDF

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Abstract

Procedimiento de separación celular para el aislamiento de células patogénicas elegidas del grupo que consiste en: células epiteliales, células endoteliales, micrometástasis y células infectadas por un virus, estando presentes dichas células patogénicas en concentración muy baja en una muestra sanguínea, caracterizado porque consta de las etapas que consisten en: - añadir a la muestra sanguínea un reactivo de lisis de glóbulos rojos y de fijación de las células nucleadas; - la filtración de la muestra sanguínea con ayuda de un filtro que presenta una porosidad comprendida entre 5 y 10 mum y - el aislamiento de células patogénicas elegidas del grupo que consiste en: células epiteliales, células endoteliales, micrometástasis y células infectadas por un virus.

Description

Procedimiento, equipamiento y reactivo para la separación celular.
La presente invención se refiere al campo de la detección de células cancerosas que circulan en un líquido biológico, especialmente en la sangre o en el líquido cefalorraquídeo.
La invención se refiere más en particular a la detección de células patológicas tales como de las micrometástasis, que se pueden difundir espontáneamente después de una intervención quirúrgica, en particular la ablación de un órgano canceroso o de células linfocíticas infectadas por virus.
La detección precoz de las micrometástasis permite evaluar los riesgos de diseminación y aparición de tumores malignos secundarios. La dificultad de la detección de dichas micrometástasis procede de la muy reducida cantidad de células presentes en una muestra de sangre.
La detección precoz de los linfocitos infectados por virus permite proceder a una detección indirecta y precoz de enfermedades víricas.
Para separar tales casos raros, se ha propuesto en la técnica anterior proceder anticipadamente a un marcado celular. En particular, se ha propuesto fijar específicamente células cancerosas sobre bolas magnéticas. Se utilizan igualmente cribadores de células e incluso el método PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa, por sus siglas en inglés). Estos métodos son largos y poco explotables en rutina.
Se ha propuesto igualmente en la patente internacional PCT WO9104318 un procedimiento de separación de células vivas diferentes, utilizando dichas células de islotes del páncreas y las células acinosas una composición que comprende una sustancia hidrosoluble, metabólicamente inerte, que sirve para regular la densidad, osmolaridad y el pH, una disolución fisiológica de almacenaje en frío que contiene modificadores de la viscosidad que aumentan la viscosidad y agentes de impermeabilización a la acción osmótica que destruyen los edemas inducidos por el frío, todo contenido en un medio capaz de mantener las células viables. Las disoluciones se combinan para formar una primera disolución con una densidad superior a la de los dos tipos de células en su estado natural, pero inferior a la del segundo tipo de células después de incubación en esta disolución, así como una segunda disolución con una densidad inferior a la de los dos tipos de células. Se obtiene la separación dejando reposar el sistema o efectuando una centrifugación.
Se ha descrito igualmente en C.H. ZIERDT "Development of a lysis-filtration blood culture technique" Revista de microbiología clínica, vol. 5 Nº 1 1.977, páginas 46-50, un sistema de cultivo que se traduce en la retención de células en las membranas de filtración. Se somete la muestra biológica a la acción de una disolución de lisis. Se lava a continuación el filtro para permitir la recuperación de las células retenidas por el filtro.
La patente de EE.UU. 4.751.179 describe un método de determinación de diferentes poblaciones de leucocitos en la sangre.
Dichas disoluciones son relativamente difíciles de aplicar por diferentes artefactos propios de estos procedimientos. Una de las dificultades procede por ejemplo de la aglomeración de bolas y del enmascaramiento de las células fijadas en las bolas, por las bolas magnéticas sobrantes. De hecho, este método no es aplicable de manera satisfactoria debido a que hace difícil el acceso a la morfología de las células.
El objeto de la invención es remediar estos inconvenientes proponiendo un procedimiento fácil de aplicar, que presenta una fiabilidad mayor que los métodos de la técnica anterior y que permite la confirmación del diagnóstico por el acceso a la morfología celular como los anatomopatologistas tienen la práctica.
La invención se refiere según su acepción más general a un procedimiento de separación y en particular un procedimiento de detección de células raras. Consiste en tratar la muestra biológica para modificar de manera diferencial las células raras investigadas por una parte y por otra parte las otras células y asegurar una migración diferencial de las células que hayan reaccionado con el reactivo, en relación con las células que no hayan reaccionado.
A tal efecto, la invención se refiere a un procedimiento de separación celular para el aislamiento de células patogénicas presentes en una concentración muy baja en una muestra de líquido biológico tal como se define en las reivindicaciones.
Por "líquido biológico", se entenderá, en el contexto de la presente patente, la sangre y sus derivados (plasma, suero), así como el líquido cefalorraquídeo, líquido linfático y el líquido articular.
Por "células patogénicas" se entenderá, en el contexto de la presente patente, células que presentan un estado anormal revelador de una enfermedad:
-
células epiteliales
-
células endoteliales
-
micrometástasis
-
células infectadas por un virus.
\vskip1.000000\baselineskip
Como ejemplo, la invención permite detectar micrometástasis en una muestra de sangre o de células infectadas por el virus de la hepatitis B o de la hepatitis C en un líquido biológico o incluso células infectadas en una muestra de líquido cefalorraquídeo.
Preferiblemente, se procede a la filtración de la muestra con un filtro que presenta poros de 8 \mum.
Según la invención, se procede antes de la etapa de filtración a una etapa de preparación de la muestra que consiste en añadir a la muestra de sangre un reactivo de lisis de glóbulos rojos y endurecimiento diferencial de las células extrañas en la sangre. La función de este reactivo es proteger las células nucleadas de la sangre, preservando su deformabilidad y volver rígidas las células extrañas, especialmente las células ricas en citoqueratina.
Las células de la sangre también pueden, debido a su flexibilidad, atravesar el filtro a pesar de que pueda existir una sección nominal superior a la porosidad del filtro, por deformación de la membrana. Las otras células son detenidas por el filtro, incluso si sus dimensiones son comparables a las de las células blanco, debido a la rigidificación de la membrana.
Según una variante preferida, se adiciona a la muestra de sangre un reactivo compuesto por AEDT, suero de albúmina bovina, Saponina, formaldehído y PBS.
Ventajosamente, el procedimiento consta de una etapa de preparación de la muestra que consiste en adicionar a una unidad de muestra de sangre nueve unidades de reactivo de lisis de glóbulos rojos y fijación de las células nucleadas y en que se deja incubar dicha preparación durante aproximadamente 15 minutos.
Según un modo de realización preferido, la filtración se efectúa bajo una depresión de aproximadamente 50.000 Pa.
Se puede proceder a la agitación de la muestra encima del filtro.
La invención se refiere a un procedimiento de separación celular para el aislamiento de células patogénicas elegidas en el grupo que consiste en: células epiteliales, células endoteliales, micrometástasis y células infectadas por un virus, estando presentes dichas células patogénicas en concentración muy baja en una muestra sanguínea, caracterizado por que consta de las etapas que consisten en:
-
añadir a la muestra sanguínea un reactivo de lisis de glóbulos rojos y fijación de células nucleadas;
-
filtración de la muestra sanguínea con ayuda de un filtro que presenta una porosidad comprendida entre 5 y 10 \mum y
-
aislamiento de células patogénicas elegidas del grupo que consiste en: células epiteliales, células endoteliales, micrometástasis y células infectadas por un virus.
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Se puede proceder al revelado de la presencia eventual de partículas investigadas en la parte de la muestra enriquecida en partículas investigadas.
Se hace reaccionar un reactivo que modifica la deformabilidad relativa de las células investigadas en relación con la deformabilidad de las células susceptibles de enmascarar las células investigadas.
Se describe un reactivo para la separación celular caracterizado por que consta de un detergente propio para degradar la membrana lipídica de los glóbulos rojos y un fijador propio para endurecer la membrana de las células nucleadas.
Ventajosamente, el reactivo consta de una parte al menos de los siguientes productos: AEDT, BSA, Saponina, Formaldehído y PBS o equivalentes de estos productos.
Según un modo de aplicación particular, el reactivo está constituido por: 372 mg de AEDT, 1 g de BSA, 1,75 g de Saponina, 10 ml de Formaldehído dosificado al 37% y una cantidad suficiente de PBS para preparar 1 l de reactivo.
Se describe un equipo para la detección de células cancerosas en una muestra de sangre, caracterizado por que consta de una membrana de filtración que presenta una porosidad comprendida entre 5 y 10 \mum y preferiblemente una porosidad de aproximadamente 8 \mum.
\newpage
Según una variante, el equipo consta de medios para crear un flujo sensiblemente tangencial a la superficie del filtro.
Puede constar además de medios para crear una depresión de aproximadamente 50.000 Pa bajo el filtro.
Por otro lado, el equipo para la numeración de células aisladas consta de un filtro que presenta una porosidad de aproximadamente 8 micrómetros y un medio de análisis de imagen del líquido filtrado.
El equipo permite la selección y la recopilación individual de las células para los propósitos de caracterización ulterior (por ejemplo mediante PCR) y consta de un filtro de porosidad adaptada al tamaño de las células blanco.
La invención permite la aplicación del procedimiento de separación para la detección de micrometástasis en una muestra sanguínea, para la detección de células infectadas por un virus en un líquido biológico, para la detección de células infectadas por un virus en una muestra de líquido cefalorraquídeo o para el diagnóstico y el seguimiento de recaídas de enfermedades cancerosas o víricas.
La invención permite la detección rápida de infecciones en pacientes inmunodeprimidos por separación celular a partir de una muestra de líquido cefalorraquídeo; así como la prevención, detección y seguimiento en las enfermedades cancerosas o virológicas.
La invención se describirá en adelante como ejemplo no limitante.
Se extrae una muestra de 5 ml de sangre global, poco tiempo después de la toma de sangre.
Se añaden a esta muestra 45 ml de reactivo y se deja reposar durante 15 minutos.
Según una variante de aplicación, el reactivo está compuesto como sigue:
-
372 mg de AEDT, comercializado por la compañía SIGMA con la referencia E5134
-
1 g de BSA Fracción V (Suero de albúmina bovina) comercializado por la compañía SIGMA con la referencia E4503
-
1,75 g de Saponina comercializada por la compañía FLUKA con la referencia 84510
-
10 ml de Formaldehído al 37% comercializado por la compañía MERCK con la referencia 4003
-
QSP de PBS.
Se ajusta el pH a 7,2.
El PBS se prepara como sigue:
-
8 g de cloruro de sodio
-
0,2 g de cloruro de potasio
-
2,3 g de hidrogenofosfato disódico
-
0,2 g de dihidrogenofosfato de potasio.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de una incubación durante aproximadamente 15 minutos a temperatura ambiente, se procede a la filtración de esta preparación en una hoja de policarbonato que presenta agujeros de aproximadamente 8 \mum de sección. Se somete el filtro a una depresión del orden de 50.000 Pa.
La filtración se efectúa con ayuda de un equipo que presenta un recipiente en el que se deposita la preparación de sangre y de reactivo. El fondo de este recipiente está formado por un filtro. Según una variante, se dispone un rotor en el interior del recipiente. Forma un flujo tangencial a la superficie del filtro de manera que se provoca la desunión de las células y se evita el taponamiento del filtro durante la filtración.
A continuación, se procede al enjuague con ayuda de 5 ml de una disolución de cloruro de sodio al 0,9%, a un pH de 7.
El impacto se tiñe con 1 ml de acridina al 0,025% a pH 6,6 (tampón de citrato) o por 1 ml de yoduro de propidio 40 \mug/ml (tampón NaCl) durante 10 min. Durante la coloración, el filtro que forma el fondo del recipiente se obtura para evitar la perfusión del líquido. A continuación, se enjuaga el filtro con 1 ml de tampón de citrato, pH 3.
Las células aisladas así pueden a continuación ser objeto de un recuento por un sistema de diagnóstico por la imagen, por microscopía o por un sistema de recuento de fotones en un amplio campo.
Igualmente se pueden recuperar para una amplificación por PCR del ADN de las células aisladas.
Las células aisladas se pueden marcar o ser objeto de una hibridación selectiva por un reactivo específico de tipo PNA (Ácidos Nucleicos peptídicos) o por anticuerpos monoclonales.

Claims (5)

1. Procedimiento de separación celular para el aislamiento de células patogénicas elegidas del grupo que consiste en: células epiteliales, células endoteliales, micrometástasis y células infectadas por un virus, estando presentes dichas células patogénicas en concentración muy baja en una muestra sanguínea, caracterizado porque consta de las etapas que consisten en:
-
añadir a la muestra sanguínea un reactivo de lisis de glóbulos rojos y de fijación de las células nucleadas;
-
la filtración de la muestra sanguínea con ayuda de un filtro que presenta una porosidad comprendida entre 5 y 10 \mum y
-
el aislamiento de células patogénicas elegidas del grupo que consiste en: células epiteliales, células endoteliales, micrometástasis y células infectadas por un virus.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho filtro presenta una porosidad de 8 \mum.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque dicha filtración de la muestra sanguínea se efectúa sobre una hoja de policarbonato.
4. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dicho reactivo de lisis de glóbulos rojos y de fijación de las células nucleadas está compuesto por: ácido etilendiaminotetraacético (AEDT), albúmina de suero bovino, saponina, formaldehído y tampón salino de fosfatos (PBS).
5. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque dicha filtración de la muestra sanguínea se efectúa con ayuda de un filtro sometido a una depresión de 50 000 Pa.
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