ES2312454T3 - Gfp-aequorina quimerica como indicador de ca++ bioluminiscente a nivel de celulas individuales. - Google Patents
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Abstract
Proteína de fusión que comprende: (a) una molécula fluorescente, (b) una fotoproteína que es sensible a calcio, y (c) un ligador entre a) y b) que permite la transmisión de energía mediante CRET (transferencia de energía mediante resonancia por quimioluminiscencia) entre la molécula fluorescente y la fotoproteína que es sensible a calcio.
Description
GFP-aequorina quimérica como
indicador de Ca^{++} bioluminiscente a nivel de células
individuales.
Esta invención se refiere a un sistema
bioluminiscente modificado que comprende una molécula fluorescente
unida covalentemente con una fotoproteína que permite la
transferencia de energía mediante transferencia de energía mediante
resonancia por quimioluminiscencia (CRET). Esta invención también se
refiere al uso del sistema bioluminiscente modificado en ensayos
in vivo e in vitro.
El calcio está implicado está implicado en la
regulación de una gran variedad de procesos intracelulares (1). Se
usan lo más comúnmente varias técnicas para monitorizar el Ca^{++}
intracelular. El registro electrofisiológico de fijación de voltaje
y los microelectrodos selectivos de Ca^{++} proporcionan
mediciones acumulativas de los flujos de Ca^{++} en un número
restringido de células. Por otra parte, puede visualizarse la
dinámica del [Ca^{++}] intracelular en grandes poblaciones de
células con sondas fluorescentes (2). Herramientas genéticas
podrían proporcionar nuevos métodos para monitorizar el
Ca^{++}.
Actualmente están disponibles dos grupos de
sondas de Ca^{++} genéticas. La primera categoría usa el principio
de transferencia de energía mediante resonancia por fluorescencia
(FRET) entre dos variantes de la proteína fluorescente verde (GFP).
Las dos GFP están unidas covalentemente mediante una secuencia de
unión a calmodulina sola o en combinación con calmodulina de modo
que se produce (3) o no se produce (4) FRET intramolecular en
respuesta a la entrada de Ca^{++}. Las referencias (3) y (31)
describen moléculas "camaleones" que comprenden dos variantes
de GFP, calmodulina, un ligador y el dominio de unión a caM de la
cinasa de la cadena ligera de miosina. En presencia de altas
concentraciones de Ca^{2+}, la calmodulina y el dominio de unión a
caM se fusionan entre sí, permitiendo, tras la excitación de dos
fotones de alta velocidad, la transferencia mediante FRET de la
energía recibida por la primera variante de GFP a la segunda
variante de GFP. Por tanto, la segunda variante emite, a una
longitud de onda diferente, una señal fuerte, indicando así la
presencia de una alta concentración de Ca^{2+}. La emisión y
detección de la señal requieren por tanto la interacción correcta
de la calmodulina y el dominio de unión a caM, así como la
excitación de dos fotones de alta velocidad. En consecuencia, los
camaleones y la excitación de dos fotones son complementarios. La
segunda categoría está compuesta por proteínas bioluminiscentes,
tales como aequorina (5, 6). La proteína activa se forma en
presencia de oxígeno molecular a partir de apoaequorina (189
aminoácidos) y su luciferina, coelenterazina (Mr 423) (7).
La unión de Ca^{++} a aequorina, que tiene
tres estructuras de mano EF características de sitios de unión a
Ca^{++}, induce un cambio conformacional que da como resultado la
oxidación de la coelenterazina mediante una reacción
intramolecular. Además, la coelenterazina así producida está en un
estado excitado, y se emite luz azul (máx.: 470 nm) cuando vuelve a
su estado fundamental (8). Un marcador genético bioluminiscente de
este tipo presenta la ventaja con respecto a colorantes
fluorescentes sensibles a Ca^{++} de dirigirse fácilmente a
células específicas y en compartimentos subcelulares con elementos
reguladores apropiados y señales peptídicas (9). El proceso
bioluminiscente no requiere la excitación con luz como las sondas o
proteínas fluorescentes, y por tanto no induce problemas de
degradación biológica, autofluorescencia ni fotoblanqueado. Además,
la aequorina no es tóxica, no se une a otros cationes divalentes y
no interfiere con el sistema tampón de [Ca^{++}]_{i}
incluso cuando se microinyecta a altas concentraciones. Su baja
afinidad por el Ca^{++} (Kd = 10 (\muM) es probablemente
responsable de esto y hace que la aequorina sea un buen detector en
el intervalo de variaciones biológicas de [Ca^{++}].
Aunque proporciona una buena razón de señal con
respecto al fondo, las señales de la aequorina son muy difíciles de
detectar debido al bajo rendimiento de cuantos de luz de la
aequorina, es decir, el número de fotones emitidos por proteína que
se une a Ca^{++}. En la medusa Aequorea victoria, de la que
se ha aislado la aequorina (10), la proteína está asociada con la
GFP (11). Tras la unión a Ca^{++}, la energía adquirida por la
aequorina se transfiere desde la oxiluciferina activada hasta la
GFP sin emisión de luz azul. El fluoróforo aceptor de GFP se excita
mediante la oxicoelenterazina a través de una transferencia de
energía sin radiación. Entonces, se emite una luz verde (máx., 509
nm) cuando la GFP excitada vuelve a su estado fundamental (12).
Tal transferencia de energía sin radiación
intermolecular no es inusual en bioluminiscencia y ya se ha mostrado
que aumenta el rendimiento cuántico del proceso bioluminiscente en
Renilla, otro celentéreo (13). La ganancia medida in
vitro oscila de desde 3 hasta 5 veces (14). Es posible
reconstituir in vitro el sistema de Renilla y obtener
el desplazamiento espectral con bajas concentraciones equimolares de
sus componentes debido a que la luciferasa y la proteína
fluorescente verde se unen entre sí (14).
En el sistema de Aequorea, la unión entre
la fotoproteína purificada y GFP no se produce en disolución,
incluso cuando están presentes a altas concentraciones (15). In
vivo, la transferencia de energía se produce debido a la alta
concentración de GFP. Puede obtenerse in vitro a través de la
adsorción conjunta de aequorina y GFP sobre membranas de
DEAE-celulosa (15). La ecuación de Förster muestra
que la eficacia de este proceso depende de varias condiciones
descritas en el caso de FRET. El espectro de emisión del donador
debe tener el mayor solapamiento con el espectro de excitación del
aceptor. La energía transferida también depende fuertemente de la
geometría, en particular, la distancia y orientación relativas de
los dos dipolos y se modula mediante su movimiento respectivo
(16).
\global\parskip0.930000\baselineskip
Un objetivo de esta invención es desarrollar un
gen indicador dual que combina las propiedades de sensibilidad a
Ca^{++} y fluorescencia de la aequorina y GFP, respectivamente. La
proteína de fusión, que puede detectarse con epifluorescencia
clásica, puede usarse para monitorizar las actividades del calcio.
La configuración de las moléculas de la invención aumenta su
renovación global y permite una transferencia de energía mediante
resonancia por quimioluminiscencia (CRET) intramolecular eficaz.
Como resultado, el rendimiento cuántico de la aequorina parece ser
superior. Esta invención muestra que pueden visualizarse señales de
calcio fisiológico en células eucariotas individuales con una
cámara CCD intensificada. Otros constructos descritos en el presente
documento dirigen la proteína de fusión a la membrana de la
neurita.
Por tanto, esta invención proporciona un sistema
bioluminiscente modificado que comprende una molécula fluorescente
unida covalentemente con una fotoproteína, en la que la unión entre
las dos proteínas tiene la función de estabilizar el sistema
bioluminiscente modificado y permitir la transferencia de la energía
mediante transferencia de energía mediante resonancia por
quimioluminiscencia (CRET). En una realización preferida, el sistema
bioluminiscente comprende una proteína GFP unida covalentemente a
una proteína aequorina, en el que la unión entre las dos proteínas
tiene la función de estabilizar el sistema bioluminiscente
modificado y permitir la transferencia de la energía mediante
transferencia de energía mediante resonancia por quimioluminiscencia
(CRET).
En una realización de un sistema bioluminiscente
modificado según la invención, el sistema bioluminiscente comprende
una proteína GFP unida covalentemente a una proteína aequorina, en
el que la unión entre las dos proteínas está constituida por al
menos 5 aminoácidos y opcionalmente al menos 5 aminoácidos y al
menos una copia de 9 aminoácidos. La unión tiene la función de
estabilizar el sistema y permitir la transferencia de energía
mediante transferencia de energía mediante resonancia por
quimioluminiscencia (CRET).
En una realización preferida, el sistema
bioluminiscente comprende una proteína GFP unida covalentemente a
una proteína aequorina, en el que la unión entre las dos proteínas
está constituida preferiblemente por al menos 5 aminoácidos y cinco
copias de 9 aminoácidos y tiene la función de estabilizar el sistema
y permitir la transferencia de energía mediante transferencia de
energía mediante resonancia por quimioluminiscencia (CRET).
Las dos proteínas pueden ser funcionales juntas
o por separado. Además, el sistema bioluminiscente modificado puede
ser sensible a calcio y/o sensible a la luz
Esta invención también proporciona un método
para examinar in vitro un cambio en un estado físico, químico
bioquímico o biológico. El método comprende:
a) proporcionar en diferentes muestras un
sistema bioluminiscente según la invención en un sistema de reacción
que contiene un analito de interés;
b) medir si se produce luz; y
c) detectar un cambio basándose en la producción
de luz.
\vskip1.000000\baselineskip
Además, esta invención proporciona un método
para examinar in vivo un cambio en un estado físico, químico,
bioquímico o biológico. El método comprende las etapas de:
a) administrar a un mamífero una composición
aceptable que comprende un sistema bioluminiscente según la
invención;
b) detectar si se produce luz; y
c) medir opcionalmente la concentración iónica
del flujo de calcio.
\vskip1.000000\baselineskip
Además, esta invención proporciona una
composición que comprende un polipéptido purificado, teniendo la
composición las características funcionales de unirse a iones
calcio y permitir una energía medible, dependiendo dicha energía de
la cantidad de calcio unido y de la cantidad de polipéptidos en
dicha composición en ausencia de cualquier excitación con luz.
Además, esta invención proporciona un
polipéptido purificado que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ
ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; y
SEQ ID NO: 6.
En otras realizaciones, esta invención
proporciona un polinucleótido que tiene la secuencia de SEQ ID NO:
7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; y SEQ
ID NO: 12.
Esta invención también proporciona un cultivo
tal como está depositado en la C.N.C.M. y que contiene el plásmido
nº I-2507; el plásmido nº I-2508; el
plásmido nº I-2509; el plásmido nº
I-2510; el plásmido nº 1-2511; el
plásmido nº I-2512; o el plásmido nº
I-2513.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Además, esta invención proporciona un ligador de
péptido que tiene la función tras la traducción de aproximar un
sitio donador a un sitio aceptor en condiciones óptimas para
permitir una transferencia directa de energía mediante
quimioluminiscencia en un polipéptido purificado según la invención.
El ligador nucleotídico puede tener, por ejemplo, la secuencia de
nucleótidos de SEQ ID No: 13; SEQ ID No: 14; SEQ ID No: 15; SEQ ID
No: 16 o SEQ ID No: 17. El ligador de péptido puede comprender al
menos 5 aminoácidos y comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ
ID No: 18; SEQ ID No: 19; SEQ ID No: 20; SEQ ID No: 21 o SEQ ID No:
22.
Un kit para medir la transferencia de energía
in vivo o in vitro contiene al menos uno de los
polipéptidos según la invención o el polinucleótido según la
invención y los reactivos necesarios para visualizar o detectar
dicha transferencia en presencia o ausencia de una molécula de
interés.
En otra realización, la invención proporciona
una proteína de fusión de fórmula:
GFP - LIGADOR -
AEQ;
en la que GFP es proteína
fluorescente verde; AEQ es aequorina; y el LIGADOR es un polipéptido
de 4-63 aminoácidos, preferiblemente
14-50
aminoácidos.
\vskip1.000000\baselineskip
El ligador puede comprender los siguientes
aminoácidos:
(Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gln Ser [SEQ ID NO:
25])_{n}, en la que n es 1-5. Preferiblemente n es
1 o n es 5. El LIGADOR también puede incluir la secuencia de
aminoácidos Ser Gly Leu Arg Ser [SEQ ID NO: 26].
\vskip1.000000\baselineskip
Otra proteína de fusión para la transferencia de
energía desde la aequorina hasta la proteína fluorescente verde
mediante transferencia de energía mediante resonancia por
quimioluminiscencia (CRET) tras la activación de la aequorina en
presencia de Ca^{++} tiene la fórmula:
GFP - LIGADOR -
AEQ;
en la que GFP es proteína
fluorescente verde; AEQ es aequorina; y el LIGADOR comprende los
siguientes
aminoácidos:
(Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gln Ser [SEQ ID NO:
25])_{n}, en la que n es 1-5; y en la que la
proteína de fusión tiene una afinidad por iones Ca^{++} y una
semivida de al menos 24 horas. El LIGADOR puede incluir la
secuencia de aminoácidos Ser Gly Leu Arg Ser [SEQ ID NO: 26].
Además, la proteína de fusión puede comprender adicionalmente una
secuencia de señal de péptido para dirigir la proteína de fusión a
una célula o a un compartimento subcelular.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta invención también proporciona
polinucleótidos que codifican para proteínas de fusión tal como se
describió anteriormente.
Esta invención se describirá con referencia a
los dibujos en los que:
La figura 1 es un mapa esquemático de diferentes
construcciones. Todos los constructos estaban bajo el control del
promotor de citomegalovirus humano (PCMV). Un asterisco indica la
posición de una mutación
Val-163-Ala. En pGA, las secuencias
codificantes de GFP y aequorina están separadas por 5 codones. Se
han añadido de uno a cinco ligadores (entre paréntesis) en
pG_{i}A en el que i es el número de ligador. Los ligadores estaban
orientados de modo que codificaban para una repetición de 9
aminoácidos. Se fusionaron en marco la sinaptotagmina 1 o su parte
transmembrana (tSyn) con el G5A.
La figura 2 representa actividades de CRET de
Ca^{++} sobre extractos celulares. Se calibraron los espectros de
emisión de aequorina y varias proteínas de fusión
GFP-aequorina como un porcentaje de la intensidad
máxima. Se expresan las mediciones de CRET como la razón de fotones
verdes (500 nm) con respecto a azules (450 nm).
La figura 3 representa la fluorescencia de GFP
de proteínas GFP-apoaequorina en células Neuro2A
transfectadas con pGm (A), pGA (B), pG2A (C) y pG5A (D). Se muestra
la superposición confocal de la fluorescencia de GFP y la
inmunotinción de sinaptotagmina en células que expresan o bien pSG5A
(E) o bien pStG5A (F).
La figura 4 representa la bioluminiscencia
inducida por Ca^{++} detectada a nivel de células individuales.
Se preincubaron células Neuro2A transfectadas con pGA (A.
1-4) o pSG5A (B) con coelenterazina 5 \muM en un
tampón libre de Ca^{++}. (A.3) La fluorescencia de GFP hizo
posible elegir las células transfectadas. El fondo registrado antes
de la adición de CaCl_{2} (A2) corresponde al nivel de unidad
relativa de luz (URL) en el tiempo 0 del experimento (A.4, B). Las
intensidades de la actividad de fluorescencia y bioluminiscencia se
traducen en pseudocolores a escala. Se muestran fotografías
representativas del campo elegido tras la adición de CaCl_{2} 5
mM y A23187 5 \muM a 13 s y 159 s, respectivamente, tras el
comienzo de la adquisición (A. 1). (A.4) Cada perfil indica la
intensidad de luz emitida por una célula individual.
Se definieron cinco regiones de interés rodeando
el soma de células individuales. Con transfección con pGA (datos no
mostrados) o pSG5A (B), se añadió una alta concentración de
CaCl_{2}, (100 mM) al final del experimento (500 s) para
comprobar que la proteína bioluminiscente era todavía activa. (C) Se
realizaron experimentos control con Fluo-3 AM sobre
células Neuro2A transfectadas de manera simulada.
La figura 5 representa los resultados del
análisis de estabilidad de proteína para diversas proteínas de
fusión.
La figura 6 representa los resultados de la
determinación de la afinidad por Ca^{++} de la aequorina y G5A de
proteína de fusión.
La figura 7 representa las curvas de calibración
entre la actividad bioluminiscente y Ca^{2+}, para G5A, SG5A y
aequorina.
La figura 8 muestra la fluorescencia y la
actividad bioluminiscente inducida por Ca^{2+} en neuronas
disociadas en cultivo infectadas con vectores adenovirales G5A.
La figura 9 muestra la fluorescencia y las
actividades bioluminiscentes inducidas por Ca^{2+} en neuronas
disociadas en cultivo infectadas con vectores adenovirales SG5A.
La figura 10 muestra el patrón representativo de
la actividad de bioluminiscencia tras la inyección de plásmido GA
en una fase celular del embrión de Xenopus.
La figura 11 muestra una larva de Xenopus
transgénica con GFP-aequorina.
Entre los celentéreos, existen especies
bioluminiscentes. Numerosos estudios han mostrado que la
bioluminiscencia se genera mediante fotoproteínas que son sensibles
a calcio. Estas proteínas emiten un destello de luz en respuesta a
un aumento en la concentración de iones calcio. Entre estas
fotoproteínas, la aequorina es una de las mejor estudiadas (Blinks
et al., 1976).
Aislada en la medusa Aequoria victoria
(Shimomura et al., 1962), la aequorina, tras unirse a tres
iones calcio, emite un destello de luz azul con un espectro de
longitud de onda máxima de 470 nm. Al contrario que la reacción de
luciderasa-luciferina clásica, la emisión de luz no
requiere oxígeno, y la cantidad total de luz es proporcional a la
cantidad de proteína. Sin embargo, es necesario oxígeno para
reconstituir la aequorina, mediante la acción de la apoaequorina,
una proteína con una masa molecular de 21 kDa, y coelenterazina. La
emisión de fotones está provocada por una reacción de peroxidación
en la coelenterazina, tras la unión con los tres iones calcio en la
aequorina. Se han sugerido dos hipótesis para este proceso: (i) la
unión entre la aequorina y los iones calcio induce la emisión de
luz mediante un cambio conformacional en la proteína, permitiendo
que el oxígeno reaccione con la coelenterazina, y (ii) el oxígeno
desempeña un papel en la unión entre coelenterazina y apoaequorina
(Shimomura y Johnson, 1978). La aequorina puede recrearse in
vitro e in vivo eliminado oxiluciferina, añadiendo
luciferina (coelenterazina) en presencia de
\beta-mercaptoetanol y oxígeno (Shimomura y
Johnson, 1978). La necesidad de añadir
\beta-mercaptoetanol o un agente reductor para
reconstituir la aequorina se debe presumiblemente a la presencia de
al menos un grupo sulfhidrilo de cisteína 145 incluido en un
microentorno cargado negativamente (Charbonneau et al.,
1985).
Se han caracterizado más de treinta aequorinas
semisintéticas que tienen diferentes afinidades por iones calcio,
basándose en el tipo de coelenterazina que se une a la proteína
(Shimomura, 1991; incorporado como referencia en el presente
documento). La constante de disociación entre la aequorina y los
iones calcio se estima que es de entre 0,1 mM (Allen et al.,
1997) y 1 mM (Prasher et al., 1985). Aunque la relación entre
la emisión de luz y la concentración de ión calcio puede no ser
lineal, no obstante se ha determinado una relación logarítmica
entre la emisión de luz y la concentración de ión calcio (Johnson y
Shimomura, 1978). De hecho, se mide un aumento de 200 veces en la
razón de señal con respecto a ruido de fondo cuando la concentración
de Ca^{++} asciende desde 10^{-7} M hasta 10^{-6} M, y en un
factor de 1000, desde 10^{-6} M hasta 10^{-5} M (Cobbold y
Rink, 1987). Además, la cinética de la emisión de señal es lo
suficientemente rápida para detectar aumentos transitorios en las
concentraciones de ión Ca^{++}. Se ha mostrado un aumento en la
intensidad de luz con una constante de tiempo de 6 ms, en
condiciones de saturación de calcio (Blinks et al., 1978).
Por tanto, la aequorina es una proteína que se adapta bien para
medir aumentos rápidos y elevados en iones Ca^{++} en condiciones
fisiológicas.
La clonación del gen de apoaequorina por Prasher
et al., (1985) e Inouye et al. (1985) ha conducido a
la creación de vectores de expresión, haciendo posible su transporte
dirigido en un compartimento celular específico mediante fusión con
péptidos señal nucleares, citoplasmáticos, mitocondriales, del
retículo endoplasmático o de la membrana plasmática (Kendall et
al., 1992; Di Giorgio et al., 1996). Además, la expresión
in vivo de la proteína hace posible su detección a bajos
niveles, dejando la fisiología intracelular del calcio sin
alterar.
En la naturaleza, la actividad de fotoproteína
está unida muy frecuentemente a una segunda proteína. La más común
es la "proteína fluorescente verde" o GFP. La luz emitida en
este caso es de hecho verde. En los años sesenta, Johnson et
al., (1962) propusieron la hipótesis de una transferencia de
energía entre aequorina y GFP mediante un mecanismo radiactivo. La
luz azul emitida por la aequorina en presencia de Ca^{++} es
absorbida presumiblemente por la GFP y reemitida con un espectro que
tiene una longitud de onda máxima de 509 nm. Otros estudios han
mostrado que esta transferencia de energía se produce a través de un
mecanismo no radiactivo posibilitado a través de la formación de un
heterotetrámero entre GFP y aequorina. Morise et al. (1974)
han tenido éxito en la visualización de esta transferencia de
energía in vitro, y una adsorción conjunta de las dos
moléculas sobre una membrana de DEAE-celulosa
facilita el proceso. A través de este mecanismo, parece posible por
tanto aumentar la eficiencia cuántica del sistema (Ward y Cormier,
1976).
La GFP, también aislada en la medusa Aequoria
victoria, se clonó recientemente (Prasher et al., 1992).
Se ha usado en diferentes sistemas biológicos como marcador de
linaje y de expresión celular (Cubitt et al., 1995). La
detección de esta proteína usando microscopía de fluorescencia
clásica es relativamente fácil de hacer tanto en organismos vivos
como tejido fijado. Además, la emisión fluorescente no requiere la
adición de un cofactor o coenzima y depende de un proceso
postraduccional autocatalítico. El fluoróforo, que consiste en
nueve aminoácidos, se caracteriza por la formación de un ciclo entre
la serina 65 y la glicina 67, que da lugar a una imidazolidina 5
intermedia, seguido por oxidación de la tirosina 66, transformándola
en deshidrotirosina (Heim et al., 1994). Este grupo se
encuentra en el interior de un cilindro compuesto por 11 capas
\beta, que constituye un entorno que interacciona directamente
con el cromóforo (Yang et al., 1996).
La monitorización de los flujos de calcio en
tiempo real podría ayudar a entender el desarrollo, la plasticidad
y el funcionamiento del sistema nervioso central. En las medusas, la
proteína aequorina quimioluminiscente, que se une a calcio está
asociada con la proteína fluorescente verde (GFP), y se emite una
señal bioluminiscente verde tras la estimulación con Ca^{++}. La
aequorina sola es difícil de detectar a nivel celular y subcelular
debido a la débil emisión de fotones tras la excitación.
Por tanto, se inició el desarrollo de un nuevo
marcador sensible a calcio con un rendimiento cuántico superior. La
invención utiliza transferencia de energía mediante resonancia por
quimioluminiscencia (CRET) entre dos moléculas. Se han construido
genes indicadores bioluminiscentes sensibles a calcio fusionando GFP
y aequorina dando como resultado que se emita mucha más luz.
Se han evaluado las actividades
quimiluminiscentes y fluorescentes de estas proteínas de fusión en
células de mamífero. Se tomaron imágenes de los aumentos de
Ca^{++} citosólico a nivel de células individuales con una cámara
CCD (dispositivo de carga acoplada) intensificada enfriada. Este gen
indicador bifuncional debe permitir la investigación de las
actividades de calcio en redes neuronales y en compartimentos
subcelulares específicos en animales
transgénicos.
transgénicos.
Proteínas de fusión
GFP-aequorina como genes indicadores activados por
Ca^{++}.
Según esta invención, se ha construido una
proteína de fusión con aequorina y GFP para aumentar el rendimiento
cuántico de la bioluminiscencia inducida por Ca^{++}. Esta
actividad no puede aumentarse simplemente mediante la expresión
conjunta de GFP con aequorina (datos no mostrados). Se fusionó una
GFP termorresistente (Gm) en marco con la región terminal NH_{2}
de la apoaequorina (figura 1), dado que se ha mostrado que el
residuo de prolina C-terminal está implicado en el
proceso bioluminiscente activado por Ca^{++} (20).
Se han preparado diferentes constructos con
tamaño creciente de ligador entre GFP y apoaequorina. El espaciador
más corto está formado por 5 aminoácidos y el más largo por 50
aminoácidos (figura 1). Todas las proteínas de fusión mostraron una
mejor actividad bioluminiscente desencadenada por Ca^{++} que la
aequorina sola. El aumento de la actividad de emisión de luz
oscilaba desde 19 hasta 65 veces (tabla 1), posiblemente debido a
la mayor estabilidad de la proteína.
\vskip1.000000\baselineskip
Los plásmidos identificados en la tabla 1 se
describen en detalle a continuación en el presente documento. Se
usan los siguientes identificadores de secuencia para describir las
secuencias de aminoácidos y nucleótidos de cada inserto de
plásmido.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
La identidad del ligador usado es estos
constructos es tal como sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de ADN del ligador de
GFP-aequorina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
pSeG5A (cepa I-2512) y pStG5A
(cepa I-2513) misma secuencia de ligador que
pG5A.
\newpage
Secuencia de péptido del ligador
\vskip1.000000\baselineskip
Los plásmidos que contienen los polinucleótidos
anteriores se han depositado en la Colección Nacional de Cultivos
de Microorganismos ("C.N.C.M."), Instituto Pasteur, 28, rue du
Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, Francia, tal como sigue:
La apoaequorina recombinante es inestable dentro
del citosol, con una semivida de aproximadamente 20 minutos (21).
En cambio, la GFP es una proteína muy estable y probablemente
estabiliza la apoaequorina en las proteínas quiméricas. Los tiempos
de renovación de las diferentes proteínas citosólicas se estimaron
en expresión transitoria en células COS 7 mediante tratamiento con
puromicina (50 \mug/ml) durante 6 horas. A lo largo de esta
periodo, la mayoría de las proteínas de fusión presentaban una
disminución del 30% de actividad en comparación con la pérdida del
80% de la apoaequorina cuando estaba sola (figura 5). Se ha
observado que, in vitro, las proteínas de fusión de la
invención eran más sensibles que la aequorina sola. G4A da una señal
significativa con respecto al fondo con una concentración de
Ca^{++} de tan sólo 38 nM, mientras que la aequorina necesita 28
veces más calcio (1 \muM) para producir una señal comparable
(figura 6). La transferencia de energía también puede mejorar el
rendimiento cuántico de la GFP-aequorina permitiendo
una detección de los iones calcio más eficaz. Para diferenciar
entre los factores que contribuyen a la emisión de luz más alta,
será necesario estudiar los mecanismos de relajación del estado
excitado fluorescente de GFP en proteínas híbridas purificadas.
Más generalmente, una realización de esta
invención proporciona una proteína quimérica que comienza con los
genes para GFP y aequorina. La mejora del rendimiento cuántico
dependerá del acoplamiento funcional de las proteínas mediante un
mecanismo de transferencia de energía mediante resonancia por
quimioluminiscencia (CRET). Por tanto, tras la reconstitución de la
aequorina y su unión con iones calcio, la aequorina activada
transmite su energía a la GFP, que a su vez emite una luz verde
para volver a su estado fundamental. La optimización del
acoplamiento funcional entre las dos proteínas se ha centrado en
tres puntos:
- 1.
- mejorar la inducción de un cambio conformacional en la GFP a 37ºC, lo que conduce a una emisión más alta de GFP en las células de mamífero;
- 2.
- cambiar al uso de codones de aequorina adaptados para células de mamífero para potenciar su expresión; y
- 3.
- añadir un péptido de enlace entre las dos proteínas.
Con respecto al tercer punto, se completó en
primer lugar un constructo molecular inicial con cinco aminoácidos
que separaban las dos proteínas. Entonces se añadió una secuencia de
nueve aminoácidos en una secuencia de una a cinco copias. Estos
constructos se colocaron en un vector de expresión eucariota bajo el
control del promotor de CMV (citomegalovirus) permitiendo confirmar
su capacidad funcional. Estas proteínas de fusión pueden
identificarse: (i) mediante la señal de GFP, a través de la
excitación de las preparaciones biológicas con luz de longitud de
onda de 470 nm, mediante microscopía de fluorescencia (filtro FTTC);
(ii) mediante la actividad de la aequorina, a través de la emisión
de luz azul tras la unión con iones Ca^{++}.
Los siguientes términos tienen los siguientes
significados cuando se usan en el presente documento:
Emisión de una radiación electromagnética a
partir de un átomo o una molécula en el UV, en el visible o el IR.
Esta emisión resulta de la transición desde un estado
electrónicamente excitado hacia un estado de energía más débil,
generalmente el estado fundamental.
Fluorescencia producida por un singlete, muy
corto, excitado electrónicamente. Esta luminiscencia desaparece al
mismo tiempo que la fuente de excitación.
\vskip1.000000\baselineskip
Luminiscencia que resulta de una reacción
química.
\vskip1.000000\baselineskip
Quimioluminiscencia visible, producida por
organismos vivos. La invención imita el sistema presente de manera
natural en las medusas, sin fijación a un soporte.
\vskip1.000000\baselineskip
El sistema bioluminiscente según la invención es
una molécula tripartita quimérica, en la que la parte central es un
ligador de péptido, y una coenzima (es decir, coelenterazina). La
primera molécula y la segunda molécula unidas covalentemente con el
ligador pueden ser todas si tienen para la primera un sitio donador
y para la segunda un sitio aceptor unido sobre ellas
(receptores-ligador-ligando,
anticuerpo-ligador-antígeno). La
proteína quimérica puede fusionarse con un fragmento de la toxina
tetánica para su transporte retrógrado y transináptico en el axón,
por Coen, L., Osta, R., Maury, M., y Brulet, P., Construction of
hybrid proteins that migrate retrogradely and transynaptically into
the central
nervous system. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 94 (1997) 9400-9405, o fusionarse con un receptor de membrana.
nervous system. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 94 (1997) 9400-9405, o fusionarse con un receptor de membrana.
\vskip1.000000\baselineskip
No emisión de fotones desde la aequorina hasta
la GTP cuando la aequorina está unida a iones calcio (por tanto, no
hay transmisión de luz azul por la aequorina en la invención, la
transferencia de energía se realiza directamente entre las dos
proteínas).
\vskip1.000000\baselineskip
Transferencia de energía mediante resonancia por
fluorescencia (es decir, entre dos variantes de GFP).
\vskip1.000000\baselineskip
Fluorescent indicators for Ca2+ based on green
fluorescent proteins and calmodulin. Miyawaki, A.,
Llopis, J., Heim, R, McCaffery, J.M.,
Adams, J.A., Ikura, M y Tsien, RY.
Nature, (1997) vol. 388 págs.
882-887.
Detection in living cells of Ca2+-dependent
changes in the fluorescence emission of an indicator composed of
two green fluorescent proteins variants linked by a
calmodulin-binding sequence. A new class of
fluorescent indicators. Romoser, V.A., Hinkle, P.M y
Persechini, A., J. Biol. Chem., (1997) vol.
272, págs. 13270-13274.
\vskip1.000000\baselineskip
Transferencia de energía mediante resonancia por
quimioluminiscencia (es decir, proteína de fusión con
GFP-aequorina (medusa Aequorea) pero sin
ligador o GFP-obelina).
\vskip1.000000\baselineskip
Chemiluminescence energy transfer.
Campbell, A.K, en Chemiluminescence:
Principles and application in Biology and Medicine, Eds Ellis
Horwood, Chichester, RU 1988, págs.
475-534.
\vskip1.000000\baselineskip
Transferencia de energía mediante resonancia por
bioluminiscencia (es decir, interacción entre GFP y luciferasa
(medusa Renilla).
\vskip1.000000\baselineskip
A bioluminescence resonance energy transfer
(BRET) system: application to interacting circadian clock protein.
Xu, Y., Piston, D.W. y Johnson, C.H. Proc.
Natl. Acad. Sci., (USA) (1999) vol. 96, págs.
151-156.
\vskip1.000000\baselineskip
Aplicación
1
Puede lograrse la selección como diana de la
proteína bioluminiscente sensible a calcio en una población de
células o en un tejido específico a través de recombinación homóloga
o mediante transgénesis bajo el control de un promotor específico.
La sustitución de genes mediante recombinación homóloga en células
embrionarias en ratones, tales como Hoxc-8 y
Otxl, con este nuevo marcador posibilitará obtener nuevas líneas de
ratones mutantes. Este enfoque permitirá la detección de actividad
eléctrica en un grupo de células neuronales, y también posibilitará
completar el estudio del fenotipo de mutantes obtenidos sustituyendo
el gen LacZ (Le Mouéllic et al., 1990, 1992; Acampora
et al., 1996). Para el locus Hoxc-8,
la expresión del marcador debe ubicarse en las astas ventrales de
la médula espinal comenzando en la sección C7 (Le Mouellic et
al., 1990). Se han sacado a la luz anomalías en la organización
somatotópica de las neuronas motoras que inervan estos músculos
(Tiret et al., 1998), y por tanto puede emprenderse un
estudio del papel del flujo de calcio en el establecimiento de
estas conexiones neuronales durante el desarrollo. En el modelo de
Otxl, el transgén debe expresarse en regiones específicas del
prosencéfalo, dado que se ha mostrado una expresión localizada en
las capas V y VI de la corteza cerebral, y en regiones del
diencéfalo, mesencéfalo y cerebelo (Frantz et al., 1994).
Ratones mutantes obtenidos mediante la sustitución del gen por el
gen LacZ muestran una reducción en el grosor de la corteza cerebral
y anomalías en el hipocampo, mesencéfalo y cerebelo (Acampora et
al., 1996). La pérdida de equilibrio y movimiento rotatorio
observada en estos ratones puede atribuirse presumiblemente a
anomalías en los órganos sensoriales, específicamente en los ojos y
el oído interno. Estos ratones también son sujeto de convulsiones
epilépticas generalizadas. El establecimiento de conexiones
defectuosas y/o la actividad eléctrica anómala podrían estar
implicados en la génesis de estos procesos patológicos (McNamara,
1992). El uso de este nuevo marcador posibilitará, por una parte,
verificar estas hipótesis a través de un enfoque dinámico y
funcional, y por otra parte, abordar el desarrollo de la epilepsia
en el adulto así como durante el desarrollo.
\vskip1.000000\baselineskip
Aplicación
2
El calcio está implicado en un gran número de
mecanismos celulares, tales como migración celular, excitabilidad
de la membrana, metabolismo mitocondrial, secreción, mitosis y
plasticidad sináptica (Berridge et al., 1998). El registro
de información sobre el calcio a nivel celular y subcelular es
complejo, implicando factores espaciales, temporales y
cuantitativos. El transporte dirigido del marcador de la invención a
diferentes compartimentos subcelulares es posible mediante fusión
con una señal de péptido, por ejemplo, sinaptotagmina.
Ejemplo A: la selección como diana del
compartimento nuclear posibilitará estudiar el papel del calcio en
los mecanismos de activación de la transcripción y durante los
mecanismos relacionados con la muerte celular programada
(apoptosis).
Ejemplo B: la selección como diana de dos
proteínas de fusión con GFP produce espectros de emisión diferentes
en los dos compartimentos celulares, por ejemplo, citoplasma y
retículo endoplasmático, posibilitará estudiar la regulación del
flujo de calcio durante activaciones celulares.
Ejemplo C: la selección como diana de la
proteína de fusión en las sinapsis posibilitará estudiar la
actividad del calcio unida a la actividad eléctrica en células
neuronales durante la liberación de neurotransmisores. La primera
posibilidad es el logro de una fusión triple entre una proteína
sináptica, tal como sinaptotagmina o SNAP25, GFP y aequorina. La
existencia de interacciones proteína-proteína
durante la exocitosis posibilita considerar una segunda
posibilidad: un acoplamiento funcional entre GFP y aequorina, una en
fusión con una proteína vesicular y la otra con una proteína
plasmática. Se obtendrá una señal sólo durante la interacción de
diferentes proteínas en presencia de un aumento en la concentración
de iones calcio.
\vskip1.000000\baselineskip
Aplicación
3
La fusión triple de una proteína que tiene
propiedades de transporte intercelular tal como el fragmento C de
la toxina tetánica (TTC) o la proteína VP22 del virus del herpes con
GFP y aequorina posibilitará observar la actividad de calcio en una
población de células conectadas, por ejemplo una red neuronal.
\newpage
Fase
1
Digestión doble del plásmido
pEGFP-Cl (Clontech, véase la figura) con las enzimas
KpnI y SmaI. Tras hacer romos los extremos de la
extensión de KpnI con nucleasa "Mung bean", se ligan las dos
extremidades.
\vskip1.000000\baselineskip
Fase
2
Se usaron cuatro oligonucleótidos de mutagénesis
en una molécula monocatenaria preparada usando
pEGFP-CIdKS. Cada oligonucleótido comprende uno o
varios apareamientos erróneos (identificados a continuación en
letras minúsculas), que provocan la mutación deseada. En el
plásmido pEGFP-Clmut elegido, cortado con la enzima
SacII pero no con la enzima AgeI, se verificaron todas las
mutaciones mediante secuenciación.
- Destrucción del sitio AgeI,
introducción de un sitio SacII y deleción de un codón de
valina ausente normalmente en GFP de "tipo natural" (Prasher,
D.C., Eckenrode, R.K, Ward, W.W., Prendergast, F.G., y Cormier,
M.J., Primary structure of the Aequorea victoria
green-fluorescent protein. Gene 111 (1992)
229-233.)
- Sustitución del codón de valina 163 por un
codón de alanina con el fin de aumentar la cantidad de GFP que
asume una conformación correcta a 37ºC (Siemering, KR, Golbik, R,
Sever, R., y Haseloff, J., Mutations that suppress the
thermosensitivity of green fluorescent protein. Current Biol. 6
(1996) 1653-1663.)
- Sustitución de un codón de Leu 231 por un
codón de histidina presente normalmente en GFP de "tipo
natural" (Prasher, D.C., Eckenrode, V.K, Ward, W.W.,
Prendergast, F.G., y Cormier, M.J., Primary structure of the
Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene
111 (1992) 229-233.)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Fase
3
Cuatro PCR (reacción en cadena de la polimerasa)
realizadas sobre un vector que comprendía la fase codificante de
aequorina (Aeq) posibilita amplificar los fragmentos A, B, C y D
con, respectivamente, los cebadores oAE5A y oAE3A, oAE5B y oAE3B,
oAE5C y oAE3C, oAE5D y oAE3D. Se usan las regiones solapantes para
ensamblar las diferentes partes durante PCR sucesivas (Ho, S.N.,
Hunt, H.D., Horton, R.M., Pullen, J.K, y Pease, L.R.
Site-directed mutagenesis by overlap extension
using the polymerase chain reaction Gene 77 (1989)
51-59.). Se amplifica un fragmento A+B partiendo de
una mezcla de fragmentos A y B, y los cebadores oAE5A y oAE3B. De
manera similar, se amplifica un fragmento C+D con una mezcla de
fragmentos C y D, usando los cebadores oAE5C y oAE3D. Finalmente,
se desarrolla la fase codificante completa, A+B+C+D con los
cebadores oAE5A y
oAE3D.
oAE3D.
- \bullet
- Cada oligonucleótido comprende uno o varios apareamientos erróneos que se identifican a continuación en minúsculas. La secuencia "natural" se representa enfrente, en mayúscula. El cebador oAE5A suprime el codón de iniciación de la traducción original (ATG) e introduce un sitio BglII. El cebador oAE3D introduce un sitio XhoI justo detrás del codón terminal de la traducción (TAA). El producto de PCR final, digerido con las enzimas BglII y XhoI, se clona en los sitios BglTI-SalI del plásmido pEGFP-Clmut de tal forma que el codón de valina (GTC), el primer codón de la aequorina, está en la misma fase de lectura que la GFP (véase la figura). Los otros cebadores introducen mutaciones "silenciosas" que no cambian la secuencia de la proteína sino que modifican seis codones en la medusa, Aequoria victoria, para mejorar su expresión en mamíferos (Wada, K-N., Aota, S.-L, Tsuchiya, R, Ishibashi, F., Gojobori, T. y Ikemura, T. Codon usage tabulated from the GenBank genetic sequence data: Nucleic Acids Res. 18 supl. (1990) 2367-2411.). Se verificó la completitud de la totalidad de la secuencia completa mediante secuenciación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Fase
4
En el plásmido pEGFPmur-Aeq,
existe una secuencia de cinco aminoácidos entre las fases
codificantes de la GFP y la aequorina. Las observaciones condujeron
al alargamiento de esta región intercalando una secuencia en el
sitio BspEL. Dos oligonucleótidos complementarios que
codifican para una secuencia de nueve aminoácidos dan a la
composición mucha flexibilidad, debido a la abundancia de glicina y
serina. Tras la inserción, se conserva el sitio BspEI sólo
en un lado aunque pueden añadirse sucesivamente nuevas secuencias
intercaladas. En cada fase, la orientación se controla mediante la
enzima BspEI. Se necesitan dos copias de esta secuencia para
restaurar la fluorescencia normal de GFP, pero la transferencia de
energía entre la aequorina y la GFP es óptima con cinco copias. Se
verificó la secuencia intercalada completa del plásmido pGCA (5 x 9
aa + los cinco aminoácidos iniciales = 50 aa) mediante
secuenciación:
secuenciación:
\newpage
Una transferencia de energía no radiante entre
la oxiluciferina excitada y el cromóforo de GFP dependerá
fuertemente de su geometría global y sus movimientos respectivos.
Por tanto, se diseñó un ligador compuesto principalmente por
residuos de serina y glicina para intercalar un elemento de
flexibilidad de longitud variable.
La razón de fotones verdes y azules emitidos
tras el desencadenamiento por Ca^{++} se ha medido en extractos
celulares preparados 48 h tras la transfección transitoria de
células Neuro2A. Los fotones emitidos a través de un divisor del
haz se contaron tras pasar por filtros apropiados. La unión
covalente de GFP a aequorina (GA) modificó significativamente la
longitud de onda de la emisión de luz máxima (figura 2), demostrando
de ese modo la transferencia de energía intramolecular. La razón de
luz verde con respecto a azul (500/450 nm) se elevó adicionalmente
desde 3 hasta aproximadamente 7 añadiendo de 1 a 5 ligadores (figura
2, CRET). La medición preliminar indica que esta razón puede
alcanzar casi 11 con SG5A probablemente debido a la acumulación de
la proteína de fusión anclada a la membrana (véase materiales y
métodos).
También se analizaron emisiones espectrales de
los diferentes constructos usando un monocromador. La aequorina
mostró un amplio espectro con una longitud de onda máxima a 474
\pm 6,9 nm y una anchura de banda, correspondiente a la distancia
entre longitudes de onda bajas y altas a valores del 50% de la
emisión máxima, a 108,3 \pm 20,1 nm (figura 2). Hubo un claro
desplazamiento hacia el verde la emisión pico de las construcciones
de GFP-aequorina que oscilaba desde 506,7 \pm 1,2
nm hasta 514,1 + 3,4 nm. El aumento de la longitud del ligador
afectó adicionalmente a la nitidez del espectro, tal como se indicó
mediante las anchuras de banda más estrechas, 88,4 + 9,4 nm y 56,0
\pm 3,3 nm, para pGA y pG5A respectivamente. No hubo pruebas de un
espectro bimodal con ninguno de los constructos de
pG1A-pG5A indicando una transferencia óptima que
podría estar incompleta en el caso de pGA.
Cuando el espaciador entre GFP y aequorina es
mayor de 14 aminoácidos, los dipolos donadores y aceptores tienen
probablemente más libertad para estar en una configuración favorable
para una transferencia de energía intramolecular óptima. El sistema
de la invención produce una eficacia comparable a la CRET
intermolecular medida in vivo (22, 23) y proporciona un
modelo conveniente para los estudios biofísicos de mecanismos de
transferencia de energía sin radiación.
Se ha examinado la localización celular de los
constructos de GFP-apoaequorina. La figura 3 ilustra
la actividad de GFP 48 h tras la transfección transitoria en
células Neuro2A. La expresión de la GFP mutante sola (Gm) mostró
una fluorescencia homogénea en el citosol así como en el núcleo tal
como se esperaba dado que la GFP es una proteína pequeña que puede
difundir en el núcleo. La mutación V163A mejora notablemente la
señal de fluorescencia y reduce el fotoblanqueado en comparación
con la GFP original (datos no mostrados) probablemente debido a una
concentración superior de proteína plegada apropiadamente. También
se observa una distribución uniforme para todas las construcciones
de GFP-apoaequorina en células Neuro2A (figura
3A-D) así como en células COS-7. A
menudo aparecían puntos brillantes en el citosol con proteínas de
fusión que tenían los ligadores más cortos: GA, G1A y G2A. Estos
puntos eran menos frecuentes con G4A y no se observaron nunca con Gm
y G5A. Altas concentraciones de proteínas expresadas durante
transfecciones transitorias podrían inducir la agregación de GFP
(24), a la que también va a influir la presencia de la proteína
aequorina y la distancia que las separa.
La GFP-apoaequorina también se
ha dirigido a las vesículas de neurotransmisor con una molécula de
sinaptotagmina I completa o parcial. La sinaptotagmina I es una
proteína transmembrana de las vesículas sinápticas y está implicada
en la exocitosis del neurotransmisor (25). Para tomar imágenes de
microdominios de calcio en compartimentos presinápticos, la señal
debe ser más precisa que si se distribuyese uniformemente en el
citoplasma de neuronas. En una proteína de fusión de tres partes,
SG5A (figura 1), la secuencia codificante completa de la
sinaptotagmina I se ha puesto en marco en sentido 5' de G5A. En
este caso, la fluorescencia de GFP puede superponerse con la
inmunotinción de sinaptotagmina pero también es visible en la
superficie celular (figura 3E). En neuronas (26) y en células
Neuro2A, sinaptotagmina I se localiza en protuberancias neuronales,
pero es indetectable en membranas plasmáticas, probablemente porque
a los mecanismos dinámicos de la exocitosis le siguen endocitosis
rápida. Cuando la GFP-apoaequorina se fusiona sólo
con la parte N-terminal de la sinaptotagmina que
incluye el dominio transmembrana pero que carece del dominio
citoplasmático (tSG5A, figura 1), una fluorescencia fuerte se
restringe al citosol (figura 3F). El marcaje punteado sugiere que
esta proteína está encerrada en el sistema de
trans-golgi. El transporte dirigido correcto de la
molécula de fusión de tres partes de la invención no se produce con
tSG5A y parece ralentizarse en el caso de SG5A. Cuando se fusiona
con la proteína sinaptotagmina completa, el marcador
bioluminiscente se retrasa en la membrana plasmática, pero no
obstante marca todos los brotes de neuritas presentes en células
Neuro2A.
Se transfectaron de manera transitoria células
Neuro2A con pA, pGA, pG2A, pG5A o se cotransfectaron con pA y pGm
(figura 1). Tras la reconstitución de la aequorina con
coelenterazina nativa en tampón libre de Ca^{++}, se ha medido
una emisión de fotones con una cámara CCD intensificada clásica tras
la adición de disolución de CaCl_{2} (5 mM) (figura 4A.1 y 4A.4).
Con el fondo insignificante (figura 4A.2), es suficiente un tiempo
de integración de 1 segundo para registrar la señal en células
individuales (figura 4A.1) que expresan cualquiera de las proteínas
de fusión. No pudo visualizarse ninguna señal con aequorina sola o
con GFP libre expresada conjuntamente (datos no mostrados). La
presencia de GFP no unida no mejora la quimioluminiscencia de la
aequorina tal como se observó in vitro. Debido al bajo nivel
de luz producida, no se ha detectado nunca aequorina expresada
in situ en células individuales excepto cuando se dirigen en
la mitocondrias. Con una cámara CCD intensificada enfriada,
Rutter et al. (1996) (27) han detectado con éxito señales de
Ca^{++} intramitocondrial cuando se fusiona la aequorina a la
citocromo C oxidasa. Transgenes que codifican para aequorina
citoplasmática pueden notificar actividades de calcio en monocapas
de células sólo cuando se usan fotomultiplicadores (PMT), que son
más sensibles pero carecen de la resolución espacial para análisis
de células individuales. La estabilidad de las fusiones de
GFP-aequorina de la invención y la mejora de la
emisión de luz han posibilitado detectar señales de Ca^{++}
fisiológico a nivel de células
individuales.
individuales.
La carencia de calcio antes de las mediciones o
las condiciones de transfección usadas pueden inducir
despolarización celular, tal como la abertura de los canales de
Ca^{++} dependientes de voltaje, es posible que sea responsable
de la rápida respuesta bioluminiscente a la adición de CaCl_{2}
(figura 4A). Entonces, la emisión de luz volvería al nivel de fondo
debido a la desensibilización de los canales de Ca^{++} y la
despolarización de la membrana mediante canales de K' dependientes
de Ca^{++} (28). Fluo-3 mostró un perfil similar
en transfecciones simuladas de células Neuro2A (figura 4C). La
posterior adición de un ionóforo de Ca^{++} (A23187) indujo una
segunda emisión de fotones con intensidad comparable pero con
cinética diferente. Puede detectarse una intensidad de luz inferior
en células Neuro2A transfectadas con pSG5A (figura 4B). Cuando se
ancla una sonda de calcio fluorescente a la superficie interna de
la membrana, la cinética de respuesta es mucho más rápida que
cuando la sonda no está dirigida (29). El uso del indicador
bioluminiscente SG5A requiere probablemente un sistema con
resoluciones espaciales y temporales superiores. En cualquier caso,
las respuestas observadas no se deben al consumo completo de la
aequorina ya que todavía puede observarse quimioluminiscencia cuando
se aplica a las células una disolución de Ca^{++} concentrada
(véase la figura 4B, por ejemplo). Para cada construcción, se han
repetido las mediciones al menos 4 veces. Se observó una
variabilidad de respuestas de células individuales, probablemente
debido a la heterogeneidad de la población de células. Se requieren
investigaciones adicionales para calibrar la unidad relativa de luz
(URL) frente a las concentraciones de Ca^{++}. Las técnicas de
registro electrofisiológico de fijación de voltaje también
permitirán la identificación del tipo de canales de calcio
implicados en estas respuestas y el efecto de la transfección
celular sobre el potencial de
membrana.
membrana.
Los transgenes de la invención deben permitir la
obtención de imágenes de la actividad eléctrica en redes neuronales
en animales completos. In vitro, se usaron dos enfoques hasta
hace poco. El primer método se basa en el acoplamiento de la
exocitosis con la emisión de luz de sinaptoleucinas en células
nerviosas (3). La emisión de luz se produce cuando la luciferasa,
dirigida al interior de las vesículas sinápticas, reacciona con el
ATP en el espacio extracelular. Con este sistema, los autores
obtienen señales correlacionadas con la liberación de
neurotransmisor pero el bajo nivel de luz requiere tiempos de
adquisición muy largos (por encima de 30 segundos). En el segundo
enfoque, se han usando marcadores sensibles a la fluorescencia de
Ca^{++} para mediciones de [Ca^{++}] intracelular mediante FRET
(3, 4, 31). Para la detección de células individuales, esta técnica
requiere una concentración suficiente de sonda para diferenciar la
señal del fondo que se genera mediante la autofluorescencia de
compuestos biológicos y la posibilidad de transferencia de energía
independiente de calcio entre las dos GFP. Los tiempos de
integración son también relativamente largos, de entre 4 y 20
segundos.
Por tanto, esta invención proporciona nuevos
híbridos bifuncionales en los que pueden seguirse los patrones de
expresión mediante la fluorescencia de GFP mientras que el resto de
aequorina es el indicador de la actividad de Ca^{++}. Además, el
acoplamiento funcional de los dos componentes, que sigue el
principio de CRET, da como resultado una cantidad superior de
emisión de luz y una mayor sensibilidad a Ca^{++}. Se han evaluado
las actividades bioluminiscentes de estos marcadores genéticos en
células individuales con una cámara CCD intensificada enfriada en
tiempos de integración de 1 segundo. El desarrollo reciente de
sistemas de detección de luz de nivel bajo debe permitir la
detección de señales de CRET con tiempos de integración mucho más
cortos y resolución espacial superior. Puede abordarse la
señalización de Ca^{++} intracelular e intercelular in
vivo en animales trangénicos en los que la
GFP-aequorina se dirige a una población de células
particular y/o a compartimentos subcelulares específicos.
Particularmente, puede obtenerse imágenes entonces de las
oscilaciones del calcio simultáneamente en células de un circuito
neuronal integrado en tiempo real.
Esta invención se describirá en mayor detalle en
los siguientes ejemplos.
Se prepararon todos los constructos en el vector
pEGFP-Cl (Clontech). El gen de la EGFP es de codón
optimizado para su expresión máxima en células de mamífero. También
contiene 2 mutaciones en el cromóforo, F64L y S65T, que modifican
los espectros de excitación y potencian la intensidad de
fluorescencia (17). La valina 163 de la EGFP también se sustituyó
por alanina, usando mutagénesis de cadena sencilla, para mejorar el
plegamiento apropiado de la proteína y aumentar la fluorescencia a
371C (18, 19). La secuencia codificante de la aequorina, un regalo
generoso de M.-T. Nicolas, se ha fusionado en marco en el extremo 3'
del gen de EGFP en los sitios BgIII/SaII de
pEGFP-Cl. Se modificaron siete codones para una
mejor expresión en células de mamífero por medio de mutagénesis
dirigida al sitio usando PCR (reacción en cadena de la polimerasa)
con extensión de solapamiento. Entonces, se insertaron
oligonucleótidos complementarios,
5'-CCGGCGGGAGCGGATCCGGCGGCCAGT-3'
[SEQ ID NO: 23] y 5'-CCGGACTGGCCGCCGGATCCGCTCCCG-
3' [SEQ ID NO: 24] en el sitio BspEI en la secuencia de 15 pb
entre GFP y aequorina. La conservación del sitio BspEI sólo
en un extremo permitió la adición secuencial de una a cinco
secuencias de ligador (pG1A-pG5A).
Se prepararon dos constructos de fusión
adicionales en pG5A con una proteína sináptica, sinaptotagmina I de
la que el plásmido de ADNc lo regaló generosamente M. Fukuda. Se
fusionaron en marco secuencias que codificaban para o bien el marco
de lectura abierto completo o bien los primeros 134 aminoácidos
N-terminales, que comprendían el dominio
transmembrana de la proteína, en el extremo 5' del gen de
GFP-aequorina.
Se hicieron crecer células de neuroblastoma
(Neuro2A, ratón) en medio Eagle modificado por Dulbecco (Life
Technologies - Gibco, RU) complementado con suero de ternero fetal
al 10% (V/V) tratado con calor, glutamina 2 mm (Life Technologies -
Gibco, RU) y 100 unidades de
estreptomicina-penicilina (Life Technologies -
Gibco, RU). Se incubó el cultivo a 37ºC en una atmósfera
humidificada que contenía CO_{2} al 8% y se transfectó de manera
transitoria usando o bien la técnica de CaPO_{4}, o bien el
reactivo de transfección FuGENE 6^{TM} (Roche).
Se recogieron las células 48 h tras la
transfección en 250 \mul de \beta-mercaptoetanol
10 mM, EDTA 4 mM, coelenterazina 5 \muM en PBS a 4ºC durante de 2
a 4 horas. Se aclararon las células en EDTA 1 mM en PBS y se
recogieron en 400 \mul de tampón hiposmótico
(Tris-HCl 20 mM pH 7,5/EDTA 5
mM/\beta-mercaptoetanol 5 mM con un cóctel de
inhibidor de proteasa según el fabricante, Roche), durante de 30
min. a 1 h. a 4ºC. Se rompieron las membranas celulares haciéndolas
pasar a través de una aguja de calibre 30 y se obtuvo el extracto
celular tras la microcentrifugación a 13000 rpm durante 1 h a 40ºC.
Se recogió el sobrenadante para todas las construcciones menos SGSA
para la que se resuspendió adicionalmente el sedimento de membrana.
Se midió la actividad quimioluminiscente sensible a calcio en un
luminómetro (Lumat LB95501 E&EG Berthold). Se colocaron
alícuotas (10 \mul) en un tubo de muestra (con 90 \mul de
Tris-HCl 10 mM pH 7,5) en el luminómetro y se midió
la intensidad de luz expresada en unidad relativa de luz (URL) tras
la inyección de 100 \mul de disolución de CaCl_{2} 50
mM/Tris-HCl 10 mM pH 7,5.
Para mediciones de CRET, se colocaron alícuotas
de extractos de células transfectadas en una cámara de depósito y
se pusieron en contacto con un conjunto de fibra óptica unido a una
cámara de recuento de fotones (cámara CCD intensificada con placa
de tres microcanales Photek: Photek 216). Antes de la captura de
señales, la luz pasa a través de un monocromador que permite el
análisis espectral de fotones emitidos. La adquisición comienza 20
segundos antes de la inyección de CaCl_{2} y continúa durante 40
segundos tras la inyección de la disolución de CaCl_{2} (50 mM).
Para las determinaciones de la razón de fotones verdes/azules, se
siguió el mismo procedimiento pero en este caso el sistema mide la
luz emitida a través de filtros azules (450 nm) y verdes (500 nm)
después de un divisor del haz.
Se fijaron células Neuro2A 48 h tras la
transfección en paraformaldehído al 4% en PBS pH 7,4, se aclararon
con PBS y se montaron. Se visualizó la fluorescencia de GFP bajo un
microscopio de barrido láser confocal (Zeiss, Heidelberg, Alemania)
que usa un láser de argón-criptón que funciona en un
modo multilínea o un microscopio Axiophot con un sistema
epiluminiscente (Zeiss, Heidelberg, Alemania). Para la
inmunolocalización de la GFP-aequorina fijada como
diana, se trataron previamente las células fijadas con NH_{4}Cl 50
mM en PBS pH 7,4 durante 5 min. a temperatura ambiente, se
permeabilizaron en disolución de BSA al 2%/Triton al 0,02%/suero de
cabra en PBS durante 1 h. Entonces se aplicaron anticuerpos contra
sinaptotagmina (StressGen SYA-130) durante
2-4 h. Entonces se aclararon las células con PBS y
se incubaron en BSA al 2%/Triton al 0,02% en PBS con anticuerpo
secundario diluido a 1/100 (anticuerpo conjugado TRITC). Entonces se
lavaron las células con PBS y se montaron.
Cuarenta y ocho horas tras la transfección, se
aclararon las células en NaCl 124 mM/KCl 5 mM/Hepes 15 mM pH
7,4/NaHCO_{3} 5 mM/NaH_{2}PO_{4} 1 mM/MgSO_{4} 0,5
mM/CaCl_{2} 1,5 mM/glucosa 5,5 mM y más tarde se incubaron en el
mismo tampón sin CaCl_{2} con coelenterazina 5 \muM para
aequorina reconstituida, durante de 2 a 4 h a 37ºC y luego se
aclararon. Se visualizaron las señales de calcio con un microscopio
vertical Olympus modificado (BHS) equipado con una unidad de
epifluorescencia BH2-RFCA que registra a través de
lentes de inmersión en agua de larga distancia de trabajo Olympus
Plan x40 (N.A. 0,7). La fluorescencia de GFP permitió elegir el
área de registro en células transfectadas. Se apagó la lámpara de
excitación y se aumentó la amplificación de la cámara. Se
integraron las imágenes cada segundo con una videocámara ISIS
ampliada enfriada de Photonic Science. Cada perfil en la figura 4
representa la cantidad de luz emitida a lo largo del área que se
define alrededor del soma de células individuales usando el
software Imaging Workbench 2214 de Axon. Las intensidades de
fluorescencia y la actividad de CRET se tradujeron en pseudocolores
a escala. Se prepararon controles con Fluo-3 AM en
células Neuro2A transfectadas de manera simulada para comprobar las
condiciones experimentales.
Se estimaron los tiempos de renovación de las
diferentes proteínas citosólicas en expresión transitoria en
células COS7 mediante tratamiento con puromicina (50 \mug/ml)
durante 6 h. Se realizaron actividades de quimioluminiscencia
inducidas por Ca^{2+} sobre extractos celulares obtenidos tras la
reconstitución de la aequorina en presencia de coelenterazina 5
\muM. Se midió la actividad de quimioluminiscencia sensible a
calcio en un luminómetro (Lumat LB95501 E&EG Berthold). Se
colocaron alícuotas (10 \mul) en un tubo de muestra (con 90
\mul de Tris-HCl 10 mM, pH 7,5) en el luminómetro
y se expresó la intensidad de luz, en unidades relativas de luz
(URL), tras la inyección de 100 \mul de disolución de CaCl_{2}
50 mM/Tris-HCl 10 mM pH 7,5. Se expresaron las
actividades de quimioluminiscencia relativas como un porcentaje de
la actividad a tiempo cero (100%). Los resultados se muestran en la
figura 5. Tal como se observa en la figura 5, a lo largo de este
periodo, la mayoría de las proteínas de fusión presentaban un 30% de
disminución o actividad en comparación con la pérdida del 80% de
apoaequorina cuando estaba sola.
Se realizaron actividades de quimioluminiscencia
inducida por Ca^{2+} sobre extracto celular obtenido tras la
reconstitución de aequorina en presencia de coelenterazina 5 \muM.
Se midió la actividad de quimioluminiscencia sensible a calcio en
un luminómetro (Lumat LP95501 E&EG Berthold). Se colocaron
alícuotas (10 \mul) en un tubo de muestra (con 90 \mul de
Tris-HCl 10 mM, pH 7,5) en el luminómetro y se
expresó la intensidad de luz, en unidades relativas de luz (URL),
tras la inyección de 100 \mul de diferentes disoluciones de
Ca/EGTA. Los resultados se muestran en la figura 6. Tal como se
observa en la figura 6, G5A da una señal significativa con respecto
al fondo con concentraciones de Ca^{2+} de tan sólo 38 nM,
mientras que la aequorina necesita 28 veces más calcio (1 M) para
producir una señal comparable.
Acerca de la invención de indicadores
bioluminiscentes sensibles a calcio de GFP-aequorina
quimérica, se han desarrollado nuevas aplicaciones y se han
obtenido algunos datos preliminares sobre la sensibilidad de
proteínas GFP-aequorina a iones Ca^{2+}.
Se realizaron mediciones de la sensibilidad a
Ca^{2+} de dos constructos G5A y SGSA sobre extractos cellares
obtenidos tras la reconstitución de aequorina en presencia de
colenterazina 5 \muM. Se midió la actividad de
quimioluminiscencia sensible a calcio en un luminómetro (Lumat
LP95501 E&EG Berthold). Se colocaron alícuotas (10 \mul) en
un tubo de muestra con 90 \mul de Tris-HCl 10 mM,
pH 7,5 en el luminómetro y se expresó la intensidad de luz, en
unidades relativas de luz (URL), tras la inyección de 100 ml de
diferentes disoluciones de Ca/EGTA (Kit de tampón de calibración de
Molecular Probes). La figura 7 muestra la curva de respuesta a
Ca^{2+} de G5A, SG5A y aequorina. Las curvas representan la
relación entre la razón L/Lmax. y [Ca^{2+}]. L es la tasa de URL
a cualquier [Ca^{2+}] dada y Lmax. es la tasa de URL a [Ca^{2+}]
en saturación. Estos resultados muestran una afinidad mucho más
alta por Ca^{2+} de las diversas formas de
GFP-aequorina que la aequorina.
Se desarrollaron vectores adenovirales con
GFP-aequorina usando estos nuevos constructos,
pueden transfectarse neuronas disociadas de la médula espinal de
rata en cultivo con eficacia superior. Las figuras 8 y 9 representan
señales bioluminiscentes inducidas por Ca^{2+} detectadas a nivel
de células individuales en células neuronales disociadas. Se
preincubaron células neuronales infectadas por vectores adenovirales
con G5A (figura 8) o SG5A (figura 9) con coelenterazina 5 \muM en
un tampón libre de Ca^{2+}. Se tradujeron las intensidades de
fluorescencia y la actividad de bioluminiscencia en pseudocolores.
Se muestran fotografías representativas de los campos elegidos tras
la adición de 5 mM y 2,5 mM de CaCl_{2}, respectivamente, para las
figuras 8a-c y 9a a 12 y 9 segundos. Las figuras
8d-e y 9b se obtuvieron tras la adición de
ionomicina y alta concentración de CaCl_{2} (100 mM).
Se estudió la señalización de calcio durante la
embriogénesis temprana y tardía en Xenopus. La figura 10
muestra el patrón representativo de actividad de luminiscencia que
ilustra los cambios en el calcio intracelular durante la inducción
neural tras la inyección del plásmido GA en la fase de una célula en
el embrión de Xenopus. La figura 11 muestra una larva de
Xenopus transgénica con GFP-aequorina. Estas
técnicas también pueden emplearse con transgénicos de pez cebra o
ratón. Estos resultados muestran que estos indicadores de calcio
pueden usarse en una gran variedad de organismos o tejidos para
visualizar la actividad de calcio y medir concentraciones de
calcio.
En resumen, el nuevo ligador útil para la
transferencia de energía mediante el sistema CRET en un sistema
bioluminiscente tiene las siguiente propiedades:
Se describen diferentes secuencias de
aminoácidos y secuencias de péptido del ligador. Su longitud
comprende un tamaño mínimo de 4 a 9 aminoácidos, que pueden
prolongarse mediante un grupo de 7 a 12 aminoácidos (en una
realización preferida 9 aminoácidos). Dicho grupo puede extenderse a
63 aminoácidos, es decir, 9 x 6 veces. Se realizó el experimento,
por ejemplo, con un ligador de péptido que comprendía 5 aminoácidos
seguido por de 1 a 5 veces de 9 aminoácidos.
Su primera función es aproximar sitios donadores
y sitios aceptores de dos moléculas para una transmisión directa de
energía. Este ligador confiere un entorno óptimo para la transmisión
de energía mediante CRET.
La segunda función es la estabilización del
sistema descrito aumentando la semivida de la aequorina debido a la
fusión de GFP. La aequorina se une a la GFP, que tiene una semivida
superior a 24 horas.
En un sistema bioluminiscente, aptitud para la
interacción proteína-proteína.
Aplicación del sistema bioluminiscente con el
ligador: epileptogénesis, enfermedad de SNC (visualización de las
actividades de células neuronales durante el desarrollo y en el
adulto), conexión neuromuscular con la implicación del homeogén
HOX-C8 en la médula espinal.
Aplicación en apoptosis con una proteína
quimérica que comprende el ligador según la invención mediante la
visualización de las modificaciones de las reservas de calcio
intracelular.
Visualización y precisión del papel de las ondas
de calcio en órganos vivos como el bazo (ondas de calcio intra e
intercelular).
La proteína quimérica es más estable mediante el
aumento de la semivida de la molécula. El aumento de la sensibilidad
por iones calcio es importante.
El ligador de la invención tiene propiedades
sorprendentes. La sensibilidad de iones calcio de la molécula
quimérica que contiene la aequorina y el ligador es diferente de la
de la aequorina sola. La invención proporciona una mejor
sensibilidad.
Este ligador posibilita unir entre sí una
molécula de aequorina con una GFP. La siguiente referencia demuestra
que ambas moléculas no interaccionan entre sí sin un ligador:
Morise, H. Shimomura, O., Johonson, F.H. y Winant, J. (1974)
Intermolecular Energy Transfer in the bioluminiscent system of
Aequoria. Biochemistry 13, 2656-
2662.
2662.
Es la primera vez que se puede obtener la
visualización de la señal de aequorina en un sistema de célula
individual viva (o en un animal vivo).
En resumen, la monitorización de los flujos de
calcio en tiempo real podría ayudar a entender el desarrollo, la
plasticidad y el funcionamiento del sistema nervioso central. En la
medusa, la proteína aequorina que se une a calcio
quimioluminiscente está asociada con la proteína fluorescente verde
(GFP) y se emite una señal bioluminiscente verde tras la
estimulación con Ca^{++}. Se decidió usar esta transferencia de
energía mediante resonancia por quimioluminiscencia (CRET) entre
las dos moléculas. Se han construido genes indicadores
bioluminiscentes sensibles a calcio fusionando GFP y aequorina
dando como resultado que se emita mucha más luz. Se han evaluado
las actividades quimioluminiscentes y fluorescentes de estas
proteínas de fusión en células de mamífero. Se obtuvieron imágenes
de los aumentos de Ca^{++} citosólico a nivel de células
individuales con una cámara CCD intensificada enfriada. Este gen
indicador bifuncional debe permitir la investigación de las
actividades de calcio en redes neuronales y en compartimentos
subcelulares específicos en animales transgénicos.
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Lo siguiente son secuencias y los
identificadores de secuencia correspondientes a los que se hace
referencia en el presente documento:
Secuencias de péptido:
GA
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G1A
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G2A
\newpage
G4A
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G5A
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SeG5A
\newpage
GA
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G1A
\newpage
G2A
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\vskip1.000000\baselineskip
G4A
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\vskip1.000000\baselineskip
G5A
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\vskip1.000000\baselineskip
SeG5A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de ADN de ligadores de
GFP-aequorina
pSeG5A (cepa I2512) y pStG5A (cepa
I2513) misma secuencia de ligador que
pG5A.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencias de péptido de ligadores
Las siguientes publicaciones se han citado en el
presente documento.
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LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN
CIENTÍFICA)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> GFP-AEQUORINA
QUIMÉRICA COMO INDICADOR DE Ca^{++} BIOLUMINISCENTE A NIVEL DE
CÉLULAS INDIVIDUALES
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<130> B4892-AD/CAL
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14-12-2000
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<160> 48
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 432
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<212> PRT
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<213> Aequorea victoria
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<212> PRT
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<213> Aequorea victoria
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<400> 2
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<213> Aequorea victoria
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<212> ADN
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de secuencia artificial:
Secuencia de ADN de ligador de GFP-aequorina
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<400> 13
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<211> 42
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Secuencia de ADN de ligador de GFP-aequorina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
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<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 69
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Secuencia de ADN de ligador de GFP-aequorina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
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<210> 16
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<211> 123
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Secuencia de ADN de ligador de GFP-aequorina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
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<211> 150
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Secuencia de ADN de ligador de GFP-aequorina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Secuencia de péptido de ligador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Secuencia de péptido de ligador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de secuencia artificial:
Secuencia de péptido de ligador
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<223> Descripción de secuencia artificial:
Secuencia de péptido de ligador
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de secuencia artificial:
Secuencia de péptido de ligador
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de secuencia artificial:
Oligonucleótido sintético
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de secuencia artificial:
Oligonucleótido sintético
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de secuencia artificial:
Ligador
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<400> 25
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<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Ligador
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<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
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<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Organismo desconocido
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<220>
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<223> Descripción de organismo
desconocido: plásmido pEGFP-Cl
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<400> 27
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<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Ácido nucleico ilustrativo
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<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (19) .. (33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aequorea victoria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (19)..(36)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aequorea victoria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
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\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3) .. (20)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aequorea victoria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3) .. (20)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aequorea victoria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(17)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Constructo sintético
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aequorea victoria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(17)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aequorea victoria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 596
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Secuencia de Aequoria victoria alterada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (21)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
Claims (50)
1. Proteína de fusión que comprende:
(a) una molécula fluorescente,
(b) una fotoproteína que es sensible a calcio,
y
(c) un ligador entre a) y b) que permite la
transmisión de energía mediante CRET (transferencia de energía
mediante resonancia por quimioluminiscencia) entre la molécula
fluorescente y la fotoproteína que es sensible a calcio.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Polipéptido purificado que tiene la secuencia
de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
3. Polipéptido purificado que tiene la secuencia
de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
4. Polipéptido purificado que tiene la secuencia
de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
5. Polipéptido purificado que tiene la secuencia
de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.
6. Polipéptido purificado que tiene la secuencia
de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.
7. Polipéptido purificado que tiene la secuencia
de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.
8. Polinucleótido purificado que tiene la
secuencia de SEQ ID NO: 7.
9. Polinucleótido purificado que tiene la
secuencia de SEQ ID NO: 8.
10. Polinucleótido purificado que tiene la
secuencia de SEQ ID NO: 9.
11. Polinucleótido purificado que tiene la
secuencia de SEQ ID NO: 10.
12. Polinucleótido purificado que tiene la
secuencia de SEQ ID NO: 11.
13. Polinucleótido purificado que tiene la
secuencia de SEQ ID NO: 12.
14. Ligador polinucleotídico que tiene la
secuencia polinucleotídica de SEQ ID No: 13.
15. Ligador polinucleotídico que tiene la
secuencia polinucleotídica de SEQ ID No: 14.
16. Ligador polinucleotídico que tiene la
secuencia polinucleotídica de SEQ ID No: 15.
17. Ligador polinucleotídico que tiene la
secuencia polinucleotídica de SEQ ID No: 16.
18. Ligador polinucleotídico que tiene la
secuencia polinucleotídica de SEQ ID No: 17.
19. Ligador polinucleotídico según una
cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18 que tiene la función tras
la traducción de aproximar un sitio donador a un sitio aceptor en
condiciones óptimas para permitir una transferencia directa de
energía mediante transferencia de energía mediante resonancia por
quimioluminiscencia (CRET) en un polipéptido purificado según la
reivindicación 1.
20. Ligador peptídico de al menos 5 aminoácidos
y que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 18.
21. Ligador peptídico que comprende la secuencia
de aminoácidos de SEQ ID No: 19.
22. Ligador peptídico que comprende la secuencia
de aminoácidos de SEQ ID No: 20.
23. Ligador peptídico que comprende la secuencia
de aminoácidos de SEQ ID No: 21.
24. Ligador peptídico que comprende la secuencia
de aminoácidos de SEQ ID No: 22.
25. Ligador de péptido que tiene la función de
aproximar un sitio donador a un sitio aceptor en condiciones óptimas
para permitir una transferencia directa de energía mediante
quimioluminiscencia en un polipéptido purificado según las
reivindicaciones 2 a 7.
\newpage
26. Ligador de péptido según una cualquiera de
las reivindicaciones 20 a 25, que tiene la función de aproximar un
sitio donador a un sitio aceptor en condiciones óptimas para
permitir una transferencia directa de energía en presencia de un
polipéptido purificado según la reivindicación 1.
27. Ligador de péptido según una cualquiera de
las reivindicaciones 20 a 26, que tiene la capacidad de estabilizar
un sistema bioluminiscente modificado in vivo y/o in
vitro.
28. Sistema bioluminiscente modificado que
comprende dos proteínas bioluminiscentes y un ligador de péptido
según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 27.
29. Sistema bioluminiscente modificado según la
reivindicación 28, en el que dichas dos proteínas bioluminiscentes
comprenden al menos una proteína aequorina.
30. Sistema bioluminiscente modificado según las
reivindicaciones 28 ó 29 que comprende los siguientes
constituyentes: proteína aequorina y una proteína GFP.
31. Kit para medir la transferencia de energía
in vivo o in vitro y que contiene al menos uno de los
polipéptidos según las reivindicaciones 2 a 7 o el polinucleótido
según las reivindicaciones 8 a 13 y los reactivos necesarios para
visualizar o detectar dicha transferencia en presencia o ausencia de
una molécula de interés.
32. Proteína de fusión según la reivindicación 1
de fórmula:
GFP - LIGADOR -
AEQ;
en la que GFP es proteína
fluorescente
verde;
AEQ es aequorina; y
el LIGADOR es un polipéptido de
4-63 aminoácidos.
33. Proteína de fusión según la reivindicación
32, en la que el ligador comprende 14-50
aminoácidos.
34. Proteína de fusión según las
reivindicaciones 32 y 33, en la que el ligador comprende los
siguientes aminoácidos:
(Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gln Ser [SEQ ID NO:
251])_{n}, en la que n es 1-5.
35. Proteína de fusión según la reivindicación
34, en la que n es 1.
36. Proteína de fusión según la reivindicación
34, en la que n es 5.
37. Proteína de fusión para la transferencia de
energía desde la aequorina hasta la proteína fluorescente verde
mediante transferencia de energía mediante resonancia por
quimioluminiscencia (CRET) tras la activación de la aequorina en
presencia de Ca^{++}, presentando la proteína de fusión la
fórmula:
GFP - LIGADOR -
AEQ; en la
que
GFP es proteína fluorescente
verde;
AEQ es aequorina; y
el LIGADOR comprende los siguientes
aminoácidos:
(Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gln Ser [SEQ ID NO:
25])_{n},
en la que n es 1-5; y
en la que la proteína de fusión
tiene una afinidad por los iones Ca^{++} y una semivida de al
menos 24
horas.
38. Proteína de fusión según las
reivindicaciones 32 a 37, en la que el ligador incluye la secuencia
de aminoácidos Ser Gly Leu Arg Ser [SEQ ID NO: 26].
39. Proteína de fusión según las
reivindicaciones 32 a 38, que comprende además una secuencia de
señal de péptido para dirigir la proteína de fusión a una célula o
a un compartimento subcelular.
40. Polinucleótido que codifica para una
proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 32 a
39.
41. Composición que comprende un péptido de
fusión según la reivindicación 1 o un polipéptido purificado según
una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, o un sistema
bioluminiscente modificado según las reivindicaciones 28 a 30, o
una proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones
32 a 39.
42. Cultivo tal como está depositado en la
C.N.C.M. y que contiene el plásmido nº I-2507.
43. Cultivo tal como está depositado en la
C.N.C.M. y que contiene el plásmido nº I-2508.
44. Cultivo tal como está depositado en la
C.N.C.M. y que contiene el plásmido nº I-2509.
45. Cultivo tal como está depositado en la
C.N.C.M. y que contiene el plásmido nº I-2514.
46. Cultivo tal como está depositado en la
C.N.C.M. y que contiene el plásmido nº I-2511.
47. Cultivo tal como está depositado en la
C.N.C.M. y que contiene el plásmido nº I-2512.
48. Cultivo tal como está depositado en la
C.N.C.M. y que contiene el plásmido nº 1-2513.
49. Método para examinar in vitro un
cambio en un estado físico, químico, bioquímico o biológico,
comprendiendo el método:
- (a)
- añadir en un sistema de reacción una composición según la reivindicación 41 que contiene un analito de interés en presencia o ausencia de una molécula de interés que va a someterse a prueba; y
- (b)
- visualizar la emisión de energía producida en la etapa (a).
50. Método para examinar in vitro una
molécula que puede modular la energía en una composición según la
reivindicación 41, comprendiendo el método:
- (a)
- proporcionar en una muestra biológica una composición según la reivindicación 41 en un sistema de reacción que contiene la molécula que va a someterse a prueba;
- (b)
- detectar una modulación de la energía mediante comparación con una muestra control que contiene dicha composición según la reivindicación 41 sin la molécula que va a someterse a prueba; y
- (c)
- opcionalmente, determinar la concentración mínima eficaz de dicha molécula que puede inhibir o aumentar la transferencia de energía de dicha composición.
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