JP4511033B2 - Ｆａｃｓを用いて細胞表現型を変化し得る生物活性剤についてスクリーンする方法 - Google Patents

Description

【０００１】
（発明の分野）
本発明は、細胞パラメータの変化を検出する新規方法、詳細には、ペプチドなどの化学ライブラリィを含む、有機分子の総合的化学ライブラリィなどの小さな分子のライブラリィを、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）機器を用いて標的分子への結合についてスクリーンする新規方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
薬剤の発見および候補薬剤をスクリーンしてリード化合物を同定する分野は急速に発展している。新規および有効な候補薬剤を同定し、特徴化する従来の方法には、天然生成物または合成製造物を単離し、続いて既知のまたは未知の標的について検査することが含まれる。参照、例えば、WO94/24314, Gallop et al., J. Med. Chem. 37(9):1233 (1994); Gallop et al., J. Med. Chem. 37(10):1385(1994); Ellman, Acc. Chem. Res. 29:132(1996); Gordon et al., E. J. Med. Chem. 30:388s (1994); Gordon et al., Acc. Chem. Res. 29:144(1996); WO95/12608、すべて出典明示により本明細書の一部とする。
【０００３】
これらのライブラリィのスクリーンは様々な方法で行われる。一つの方法はビーズへの付着と色素による視覚化を伴う；参照、Neslter et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 6(12):1327(1996)。別の方法はビースおよび蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）を使用している；参照、Needles et al., PNAS USA 90:10700(1993)およびVetter et al., Bioconjugate Chem. 6:319(1995)。
【０００４】
蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）はフロー・サイトメトリーとも呼ばれ、蛍光発光を含む光学的特性に基づいて個々の細胞を分別するのに使用される。蛍光活性化セルソーターは一般に速いので、比較的短時間で大きな細胞集団をスクリーンし得る。
【０００５】
ＦＡＣＳスクリーンなどの迅速で費用のかからないスクリーンが特に重要である多くの例がある。このような領域は細胞周期アッセイである。細胞はＭ期に始まり、様々な成長段階を経て循環する。Ｍ期において有糸分裂および細胞質分裂（細胞分裂）が発生する。Ｍ期の後にＧ１期が続き、Ｇ１期において細胞は高速度の生合成および成長を再び始める。Ｓ期はＤＮＡ合成で始まり、細胞核のＤＮＡの内容量が倍加すると終わる。次いで、細胞はＧ２期に入り、凝集された染色体が現れることにより示される有糸分裂が始まると終わる。定期的に分化される細胞はＧ１期で停止され、それ以上細胞分裂をしない。
【０００６】
悪性細胞の顕著な特徴は、制御されない増殖である。この表現型は遺伝子の変異の蓄積から得たものであり、その大部分は細胞周期を通して継代を促進する。癌細胞は成長制御シグナルを無視し、細胞分裂を続ける。ｒａｓなどの典型的な癌遺伝子は細胞周期のＧ１期からＳ期への不適切な転移を導き、増殖細胞外シグナルを模倣する。細胞周期チェックポイント制御により、確実にゲノムが正確に複製および分離される。細胞周期チェックポイント制御が失われると、ゲノムが不安定になり、悪性形質転換をもたらす変異の蓄積が大いに促進される。よって、ｐ５３およびＡＴＭ（変異性毛細管拡張失調症）などのチェックポイント制御因子はまた、腫瘍抑制因子としても機能する。従って、治療剤で細胞周期チェックポイント経路を調節すると、正常細胞と腫瘍細胞との間の相違を利用して、放射線療法と化学療法の選択性を向上させ、新規な癌治療を導くことができる。
【０００７】
従って、本発明の目的は、細胞周期チェックポイント制御の調節因子についてのスクリーンに有効な組成物および方法を提供することである。
【０００８】
迅速なスクリーン方法が特別な使用を見出した別の領域は、エキソサイトーシスのアッセイの領域である。エキソサイトーシスは、分泌小胞の細胞原形質膜との融合であり、２つの主な機能を有する。一つは細胞外空間に小胞内容物を放出することであり、もう１つは原形質膜自体に新しいタンパク質および脂質を組み込むことである。
【０００９】
エキソサイトーシスは２つの種類：構造性および制御性に分けられる。すべての真核生物細胞は構造性エキソサイトーシスを示し、形成後の分泌小胞の連続融合により特徴づけられる。制御性エキソサイトーシスは、外分泌性細胞、内分泌性細胞および神経細胞を含む特定の細胞に制限される。制御性エキソサイトーシスは、適切なシグナルを受け取るときのみ、通常は（常にではないが）細胞基質遊離Ｃａ²⁺濃度が増加すると、原形質膜と融合する分泌小胞の蓄積をもたらす。
【００１０】
制御性エキソサイトーシスは多くの分化した細胞に重要であり、しばしば特定の細胞は同じエキソサイトーシス顆粒から多数の媒介物質を放出し得る。エキソサイトーシス顆粒は標的細胞において調整された生理的反応を産生するために協力して機能する。これらの制御性エキソサイトーシス細胞には、神経細胞（神経伝達物質放出）、副腎性クロマフィン細胞（アドレナリン分泌）、膵臓腺房細胞（消化酵素分泌）、膵臓β細胞（インシュリン分泌）、肥満細胞（ヒスタミン分泌）、乳房細胞（乳タンパク質分泌）、精子（酵素分泌）、卵細胞（受精外被の発生）および含脂肪細胞（グルコース輸送体の原形質膜への挿入）が含まれる。さらに現在の理論において、小胞のドッキングおよび融合の基本的メカニズムは酵母菌から哺乳動物の脳へと保存されることが示唆されている。
【００１１】
さらに、エキソサイトーシスに関する疾患が知られている。例えば、肥満細胞からの炎症性媒介物質の放出は、喘息を含む様々な疾患を引き起こす。米国だけで５０００万以上の人々が喘息、鼻炎またはアレルギーによるいくつかの他の疾患にかかっている。アレルギーに対する治療は、肥満細胞により放出される媒介物質を遮断すること（抗ヒスタミン）、ステロイドなどの非特異的抗炎症剤および肥満細胞安定剤に制限され、肥満細胞安定剤はアレルギーの症状を制限するのにわずかに有効であるにすぎない。同様に、Chediak-Higashi症候群（ＣＨＳ）は、稀な常染色体の劣性疾患であり、その疾患において好中球、単核細胞およびリンパ球などのほとんどの細胞は大きな細胞質顆粒を含有する。同様の疾患がマウス、ミンク、ウシ、ネコおよびシャチについて報告されており、ＣＨＳ（beigeまたはbgと呼ばれる）のマウスの相同器官が最もよく特徴づけられている。参照、Perou et al., J. Biol. Chem. 272(47):29790(1997)およびBarbosa et al., Nature 382:262(1996)、両方とも出典明示により本明細書の一部とする。
【００１２】
さらに、広範な一連の精神医学的疾患は神経伝達物質エキソサイトーシスと媒介物質の再取り込みとの間の不均衡の結果であると広く考えられている。
【００１３】
非常に多くの医薬品は、主にエキソサイトーシス媒介物質の受容体を遮断することによりエキソサイトーシス媒介物質を特に阻害するように設計されてきた。しかしながら、この方法は、単一の受容体遮断剤が多くの異なる媒介物質の作用を克服し得ないことから限度がある。
【００１４】
従って、本発明の目的は、エキソサイトーシスにおける変化をスクリーンする方法、特にこのようなエキソサイトーシスを媒介し得る薬剤をスクリーンする方法を提供することである。また、アッセイの共通事項を減少し、特異性を増加するようなスクリーン方法を提供することも目的である。
【００１５】
（発明の要旨）
上に概記した目的に一致して、本発明は、細胞表現型を変化させる能力、または変化を調節する能力について生物活性剤をスクリーンする方法を提供する。この方法は、少なくとも１つの候補生物活性剤と細胞集団とを合わせ、そしてＦＡＣＳ機器における該細胞の分別を、少なくとも３、４または５の細胞パラメーターに基づく該細胞の分離により行うことを一般的に含む。候補剤は、候補生物活性剤をコードする融合核酸を含有する分子ライブラリィの一部である。
【００１６】
更なる態様で、本発明は、細胞集団での、種々の状態での単独細胞での、または種々の生物活性剤との組み合せでの、エキソサイトーシスにおける変化の検定によってＦＡＣＳ機器での細胞を分別することを含む。本発明は、該細胞パラメーターが光分散、蛍光色素取り込み、蛍光色素放出、アネキシン顆粒結合、表面顆粒酵素活性、顆粒特異的タンパク質の量よりなる群から選ばれる少なくとも３の特性でもって変化の検定をなして、ＦＡＣＳ機器での細胞を分別することを含む。
【００１７】
本発明が提供するのは、細胞でのエキソサイトーシスを調節し得る生物活性剤についてスクリーンする方法である。この方法は、候補生物活性剤と細胞集団を合わせ、該細胞をエキソサイトーシスを正常に起こすような状態にすることを含む。細胞のＦＡＣＳ機器での分別は、光分散、蛍光色素取り込み、蛍光色素放出、アネキシン顆粒結合、表面顆粒酵素活性、顆粒特異的タンパク質の量よりなる群から選ばれる少なくとも３の特性についての変化の検定による。該特性の少なくとも１つにおける変化を、候補生物活性剤に接触していない細胞と比較すると、該生物活性剤がエキソサイトーシスを調節するのが分かる。
【００１８】
生物活性剤をスクリーンする方法の好ましい実施態様において、選択される特性は、蛍光色素放出、アネキシン顆粒結合、表面顆粒酵素活性、顆粒特異的タンパク質の量よりなる群から選ばれる少なくとも１つの特性を含む。
【００１９】
蛍光色素取り込みが検出されるとき、色素はスチリル色素である。蛍光色素放出が検出されるとき、色素は低ｐＨ濃度色素またはスチリル色素であり得る。
【００２０】
好ましい実施態様において、表面顆粒酵素活性の検出は、インシトゥ酵素学アッセイまたは集団による酵素アッセイでなされる。酵素基質は検出可能基質であり得る。好ましくは、酵素基質はＦＲＥＴ構築体にカップルする。ＦＲＥＴ構築体はプロテアーゼ部位で分割された２つの蛍光タンパク質を含む。この場合、プロテアーゼ部位は顆粒タンパク質に特異的である。
【００２１】
好ましい実施態様において、顆粒特異的タンパク質が検出される。顆粒特異的タンパク質はいかなる検出可能タンパク質でもあり得る。ある実施態様において、顆粒特異的タンパク質は、顆粒特異的タンパク質およびＦＲＥＴ構築体であり得る検出可能分子を含む融合タンパク質である。
【００２２】
別の実施態様において、細胞におけるエキソサイトーシスを調節し得る生物活性剤についてのスクリーン方法が提供され、該方法は、少なくとも１つの候補生物活性剤と、顆粒特異的タンパク質をコードする核酸および標識を含む融合核酸を各含有する細胞集団とを合わすことを含む。細胞はエキソサイトーシスを正常に起こす状態に置かれ、標識量での変化が検出される。標識量での変化は生物活性剤がエキソサイトーシスを調節したことを示す。好ましくは、標識は、エピトープ・タグまたは蛍光分子である。好ましい実施態様において、蛍光分子はＦＲＥＴ構築体である。
【００２３】
別の態様において、本発明は、エキソサイトーシスの調節剤をスクリーンする方法を提供する。この方法は、候補生物活性剤、検出可能顆粒特異的タンパク質をコードする核酸を含む細胞、およびこのタンパク質の検出用剤を組み合せることを含む。細胞はエキソサイトーシスを正常に起こす状態に置かれ、タンパク質の存在または不存在が測定される。
【００２４】
他の好ましい実施態様において、本発明は、細胞でのエキソサイトーシスを調節し得る生物活性剤をスクリーンする方法を提供する。この方法は、少なくとも１つの候補生物活性剤と細胞集団を合わすことを含む。細胞はエキソサイトーシスを正常に起こす状態に置かれ、蛍光アネキシンが加えられる。細胞表面での蛍光アネキシン量の変化が検査される。
【００２５】
他の好ましい実施態様において、本発明は、細胞でのエキソサイトーシスを調節し得る生物活性剤をスクリーンする方法を提供する。この方法は、低ｐＨ濃度色素を取り込む細胞の集団を提供することを含む。低ｐＨ濃度色素を保持する細胞は、少なくとも１つの候補生物活性剤と合されて、エキソサイトーシスを正常に起こす状態に置かれる。低ｐＨ濃度色素の放出が検出される。放出色素量の変化は、生物活性剤がエキソサイトーシスを調節したことを示す。
【００２６】
他の好ましい実施態様において、本発明は、細胞でのエキソサイトーシスを調節し得る生物活性剤をスクリーンする方法を提供する。この方法は、少なくとも１つの候補生物活性剤と細胞集団を合すことを含む。細胞はエキソサイトーシスを正常に起こす状態に置かれ、顆粒酵素に特異的な蛍光基質が加えられる。顆粒酵素に特異的な蛍光基質の検出において、蛍光基質量の変化が生物活性剤のエキソサイトーシス調節の指標となる。好ましい実施態様において、基質はＦＲＥＴ構築体を含む。
【００２７】
更なる態様において、本発明は、細胞周期を調節し得る生物活性剤についてのスクリーン方法および条件を提供する。本発明は、候補生物活性剤のライブラリィと細胞集団を組合せ、ＦＡＣＳ機器での細胞を少なくとも細胞生存能アッセイ、増殖アッセイ、細胞相アッセイに基づく細胞分離によって分別することを含む。
【００２８】
更なる態様において、本発明は、細胞ライブラリィにおける融合核酸ライブラリィを発現することを含む。融合核酸は、候補生物活性剤および検出可能部分をコードする核酸を含む。ＦＡＣＳ機器における細胞の分別は、細胞の分離による。細胞表現型が細胞周期であるとき、細胞の分別は、細胞の生存能、増殖および細胞相に基づく。
【００２９】
（図面の簡単な説明）
図１Ａ、１Ｂ、１Ｃは、実施例１の３つのレトロウイルス構築を模式的に示す。図１Ａは、ＣＲＵ５−ＧＦＰ−ｐ２１構築であって、ＣＲＵ５プロモーター、ψレトロパッキングシグナル、ｐ２１のコード領域に融合したＧＦＰのコード領域、次いでＬＴＲを含む。図１Ｂは、ＣＲＵ５−ＧＦＰ−ｐ２１Ｃ構築を示し、ｐ２１のＣ末２４アミノ酸を含む。図１Ｃは、ＣＲＵ５−ＧＦＰ−ｐＵＣｍｕｔ構築体を示し、これは３アラニン置換を有するＣＲＵ５−ｐ２１Ｃｐ２１の変異体である。
【００３０】
図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄは、実施例１の実験の結果を示す。図２Ａは、前方および側面分散を用いる生存能アッセイを示す。特性割合を表す細胞が集められる。図２Ｂは、ベクターのＧＦＰの蛍光を示す。図２Ｃは、増殖アッセイにおけるＰＫＨ２６、包含色素の使用を表す；細胞を拘束する既知のタンパク質であるｐ２１を含有する細胞は、輝く蛍光を保持し、一方、対照の細胞は、増殖を続けて色素を希釈し蛍光を無くする。図２Ｄは、細胞相アッセイにおける Hoechst 33342 の使用を表す。
【００３１】
図３は、Ｇ１相における細胞拘束剤、ｐ２１に感染のJurkat細胞に対するＡｒａＣ処置の効果を示す。ＡｒａＣは、分割細胞に毒性のヌクレオチド類似体である。従って、拘束された細胞周期であるこれらの細胞が生存する。下側の線はｐ２１の挿入のないJurkat細胞を示し，上側の線はｐ２１挿入のJurkat細胞を示す。
【００３２】
図４Ａおよび４Ｂは、集団についてのエキソサイトーシス酵素活性アッセイの結果を示す。図４Ａは、ＤＭＳＯ(−)またはイオノマイシン(＋)と組み合わせた細胞の上澄み液におけるグルクロニダーゼまたはヘキソサミニダーゼ活性を示す。図４Ｂは、種々の量のＩｇＥアンチＤＮＰで感受性化され、増加量の抗原ＢＳＡ−ＤＮＰで刺激された細胞の上澄み液におけるヘキソサミニダーゼ活性を示す。
【００３３】
図５Ａ−５Ｆは、フロー・サイトメーター、側面分散対前方分散に見られたエキソサイトシス・分散変化を示す。ＲＢＬ-２Ｈ３細胞(図５Ａおよび５Ｄ)およびＭＣ−９細胞(図５Ｂ、５Ｃ、５Ｅ、５Ｆ)について２変数ヒストグラムとしてプロットした。イオン透過担体での刺激後、細胞の観察を０分(図５Ａおよび５Ｃ)、５分(図５Ｅ)、１０分(５Ｄ)、３０分(図５Ｂおよび５Ｆ)で行った。
【００３４】
図６Ａ−６Ｅは、ＦＡＣＳによるエキソサイトーシスを検出するスチリル色素アッセイの結果を示す。細胞は、ＤＭＳＯ(左ピーク)またはイオノマイシン(右ピーク)と、ＦＭ４−６４(図６Ａおよび６Ｂ)またはＦ１−４３(図６Ｃ、６Ｄ、６Ｅ)のいずれかの存在下にて、組み合わせた。図６Ａおよび６Ｃは蛍光チャネル１で検出された細胞を示す。図６Ｂおよび６Ｄは、蛍光チャネル３で検出された細胞を示す。図６Ｅは、蛍光チャネル１でのフロ−・サイトメトリーで検出された平均チャネルシフトを棒グラフで示す。種々の量のＰｌ−３キナーゼ阻害剤ウォルトマニンとの前インキュベートが、ＦＭ１−４３の存在下にイオン透過担体(棒１−４)またはＤＭＳＯ(棒５)の投与前になされた。
【００３５】
図７Ａ−７Ｄは、ＦＡＣＳによるエキソサイトーシスのアネキシン-Ｖ検出アッセイの結果を示すグラフである。細胞は、ＤＭＳＯ(図７Ａおよび７Ｂ)またはイオノマイシン(図７Ｃおよび７Ｄ)のいずれかと組み合わせ、次いでヨウ化プロピジウム(図７Ａおよび７Ｃ)およびアネキシン-Ｖ-ＦＩＴＣ(図７Ｂおよび７Ｄ)の両者で着色された。
【００３６】
図８Ａ−８Ｃは、ＦＡＣＳにより可視化されたエキソサイトーシス細胞のインシトゥ酵素学アッセイの結果を表すグラフである。細胞は、ＤＭＳＯ(図８Ａ)またはイオン透過担体(図８Ｂおよび８Ｃ)と組み合わせ、次いでインシトゥグルクロニダーゼ活性について着色した。図８Ｃは細胞表面酵素活性のｐＨプロファイルを示し、棒グラフで、フロー・サイトメトリー中の平均チャネルシフトにより測定された最大シグナルの百分率を表す。
【００３７】
図９は、チャネル１中に検出された蛍光強度のヒストグラフである。細胞に、LYSOTRACKER GREEN(商標)を負荷し、ＤＭＳＯ(左)またはイオノマイシン(右)のいずれかと組み合わせ、フロー・サイトメトリーで測定した。
【００３８】
図１０Ａ−１０Ｈは、LYSOTRACKER GREEN(商標)、アネキシン-Ｖ-ＡＰＣ、前方および側面分散を含む複数パラメーター分析の結果を示す。図１０Ａ−１０Ｄおよび１０Ｅ−１０Ｈの各々は、イオノマイシンの増加量で処理され、次いで４パラメーターのフロー・サイトメーターで同時に観測された細胞を示す。細胞に、低ｐＨ濃度色素を負荷し、刺激し、アネキシン-Ｖ-ＡＰＣで着色した。図１０Ａ−１０Ｄは、側面対前方の光分散の２変数ヒストグラムを示し、図１０Ｅ−１０Ｈは、アネキシン-Ｖ-ＡＰＣ対低ｐＨ濃度色素シグナルの２変数ヒストグラムを示す。
【００３９】
図１１は、ＦＭ１−４３の存在下で刺激され、アネキシン-Ｖ-ＡＰＣで着色された細胞についてのグラフである。イオノマイシン刺激後の種々の時点で、細胞の分析をフロー・サイトメトリーおよび酵素活性について上澄み液(細胞上澄み液)で行った。パラメーター、前方分散、ＦＭ−１４３、アネキシン-Ｖ-ＡＰＣ、ヘキソサミニダーゼを、各パラメーターについての最大応答に比較してグラフとした。カルシウム情報伝達について、分離管の細胞にＦｌｏｕ−３を負荷し、同様に処理した。
【００４０】
発明の詳細な説明
本発明は、蛍光活性化セルソーター(ＦＡＣＳ)機器の使用を介した、種々の細胞性パラメーターの評価またはアッセイによる、細胞周期規制、エキソサイトーシス、小分子毒性、細胞表面受容体発現、酵素発現等のような細胞表現型の変化の検出に関する。下記により詳述するように、種々の細胞表現型の変化の検出を可能にするために測定できる多くのパラメーターが存在する。多数のこれらのパラメーターの連続的、または好ましくは同時のアッセイにより、速く正確なスクリーニングを成し得る。
【００４１】
好ましい態様において、本明細書に概説の方法は、細胞表現型の調節剤のスクリーンに使用する。アッセイし得る細胞表現型は、細胞周期規制を含む細胞アポトーシス、エキソサイトーシス、小分子への毒性、受容体を含む多くの部分の発現(特に細胞表面受容体)、接着分子、サイトカイン分泌、タンパク質−タンパク質相互作用等を含むが、これらに限定されない。
【００４２】
好ましい態様において、本方法は、細胞周期規制の評価に使用する。この態様において、好ましい細胞性パラメーターまたはアッセイは、細胞生存能アッセイ、細胞が特定の細胞周期段階に拘束されているかのアッセイ(「細胞増殖アッセイ」)およびどの段階に細胞が拘束されているかのアッセイ(「細胞相アッセイ」)である。これらのパラメーターの１以上のアッセイまたは測定により、細胞周期規制の変化だけでなく、細胞周期規制経路の異なる段階の変化の検出も可能である。これは、天然の細胞の評価のために行い得、例えば、腫瘍細胞タイプの病原力の定量、または細胞周期規制に対する作用を試験する候補薬剤の効果の評価のために行い得る。この方法において、候補薬剤の速く正確なスクリーニングを、細胞周期規制を調節する薬剤の同定のために行い得る。
【００４３】
このように、本方法は細胞の集団の、一つの成長相から他への移動、または一つの成長相への拘束をもらすことができる生物活性薬剤の解明に有用である。ある態様において、細胞を、特定の成長相に拘束し、その相から出すか、他の相へ移動させることが望ましい。あるいは、細胞を一つの成長相、例えばＧ１に拘束させることが、むしろ細胞周期を通して移動させるより望ましいことがある。同様に、ある状況下において、非拘束であるが、遅く移動する集団の細胞を、次の相にまたは細胞周期を通して加速させるか、または次の相の発現の遅延が望ましいことがあり得る。例えば、細胞相変化の開始に寄与するある酵素、例えば、キナーゼ、ホスファターゼ、プロテアーゼまたはユビキチン化酵素の活性を変えることが可能であり得る。
【００４４】
好ましい態様において、本明細書に概説の方法は、Ｇ１相に拘束されていない細胞で行う；即ち、これらの細胞は、腫瘍細胞のように急速にまたは抑制できない成長および複製をしている。この方法において、細胞周期規制を変えることができる、即ち、細胞のＧ１のような細胞周期チェックポイントへの拘束をもたらす(Ｓ、Ｇ２およびＭのような他の相への拘束もまた望ましいが)薬剤の発見のために候補薬剤を評価する。あるいは、候補薬剤を、細胞の集団の増殖をもたらすことができる薬剤、すなわち、一般にＧ１に拘束されている細胞；例えば、末梢血細胞、最終分化細胞、培養中の幹細胞等の再増殖を開始させる薬剤の評価に使用する。
【００４５】
したがって、好ましい態様において、本発明は細胞の集団における細胞周期規制の変化のスクリーニングのための方法を提供する。「変化」および「修飾」(本明細書では交換可能に使用する)なる用語は、本明細書での使用に関して、測定するパラメーターまたは表現型の増加および減少の両方を含むことができる。細胞周期規制の内容に関する「変化」または「調節」は、一般に、二つのうちの一つを意味する。好ましい態様において、他の細胞または異なる条件下での同じ細胞と比較して、変化は細胞の細胞周期に変化、即ち、一つの相に拘束された細胞の増殖、または拘束細胞のその拘束相からの移動および細胞周期の開始をもたらす。あるいは、細胞の特定の相を通った進行を変え得る。即ち、細胞が特定の成長相を通って移動するのにかかる時間の長さを加速または遅延し得る。例えば、細胞は通常Ｇ１相を数時間経過する。薬剤の添加はＧ１相を延長し得る。
【００４６】
測定は、各測定において全ての条件が同じであるか、種々の条件下、生物活性薬剤有りまたは無しで、または細胞周期過程の異なる段階で測定できる。例えば、細胞周期規制の測定は、候補生物活性薬剤が存在するおよび候補生物活性薬剤が不存在である細胞集団で測定できる。他の例において、細胞周期規制の測定は、細胞集団の条件または環境が他のものと異なって測定する。例えば、細胞を生理学的シグナル、例えば、ホルモン、抗体、ペプチド、抗原、サイトカイン、成長因子、活動電位、薬理学的試薬(即ち、化学療法剤等)、または他の細胞(即ち、細胞−細胞接触)の存在下または非存在下評価し得る。他の例において、細胞周期規制の測定は、細胞周期過程の異なる段階で測定する。更に別の例において、細胞周期規制の測定は、条件が同じであり、変化が一つの細胞または細胞集団と他の細胞または細胞集団の間であるもので行う。
【００４７】
「細胞の集団」または「細胞のライブラリー」または「複数の細胞」は、本明細書では少なくとも２個の細胞を意味し、少なくとも約１０³が好ましく、少なくとも約１０⁵が特に好ましく、少なくとも約１０⁸から１０⁹が特に好ましい。集団またはサンプルは、一次または二次培養のいずれかからの異なる細胞タイプの混合物を含むことができるが、一つの細胞タイプのみを含むサンプルが好ましく、例えば、サンプルが一つの細胞系、特に腫瘍細胞系由来であり得る(特に、下に概説のとき)。細胞は、同時にまたはそうでなく、Ｍ、Ｇ１、ＳおよびＧ２を含む任意の細胞相である。好ましい態様において、複製または増幅している細胞を使用する。これは、候補生物活性薬剤の導入のためのレトロウイルスベクターの使用を可能にし得る。あるいは、非複製細胞を使用し得、他のベクター(アデノウイルスおよびレンチウイルスベクターのような)を使用できる。加えて、必要ではないが、細胞は色素および抗体と適合性である。
【００４８】
本発明で使用するのに好ましい細胞タイプは、調節する細胞表現型により変化する。適当な細胞は、特に胸部、皮膚、肺、頸部、結直腸、白血病、脳等を含む全てのタイプの腫瘍細胞を含む、動物(マウス、ラット、ハムスターおよびアレチネズミを含む齧歯類)、霊長類、およびヒト細胞を含む哺乳類細胞を含むが、これらに限定されない。下に概説のように、更なる細胞タイプをエキソサイトーシスのスクリーニングに使用し得る。
【００４９】
好ましい態様において、細胞周期規制法は、細胞生存能、細胞増殖および細胞相を含む数個の異なる細胞パラメーターのアッセイにより、細胞をＦＡＣＳ機器に分類することを含む。
【００５０】
好ましい態様において、細胞性変化の欠乏が実験条件(すなわち、候補生物活性薬剤の導入)のためであり、細胞死のためでないことを確認するために、細胞生存能をアッセイする。使用できる多くの適当な細胞生存能アッセイがある。限定でないが、光散乱、生存能色素染色および排除色素染色の使用ができる。
【００５１】
好ましい態様において、光分散アッセイを、当分野で周知されているように、生存能アッセイとして使用する。ＦＡＣＳで見たとき、細胞はその前方および９０度(側面)光分散特性で測定して、特定の特徴を有する。これらの分散特性は、細胞のサイズ、形および顆粒含量を示す。これらの特性は、生存能の読み出しとして測定する二つのパラメーターを説明する。簡単に、死ぬまたは死んだ細胞は一般に凝縮しており、９０°分散を変える；同様に、膜小泡形成が前方分散を変え得る。光分散の強度または細胞屈折指数の変化は生存能の変化を示す。
【００５２】
このように、一般に、光分散アッセイに関して、特定の細胞タイプの生存細胞集団を評価して、その前方および側面分散特性を測定する。これは続いて使用できる分散の標準化を設定する。
【００５３】
好ましい態様において、生存能アッセイは生存能染色を利用する。死んだまたは死ぬ細胞を染色するが、生育細胞を染色しない多くの既知の生存能色素がある。例えば、アネキシンＶは、２価イオン依存的方法でリン脂質(ホスホチジルセリン)に特異的結合を示すタンパク質ファミリーのメンバーである。このタンパク質は、アポトーシス(計画細胞死)の測定に、細胞表面へのホスファチジルセリンの曝露がこの過程の顕著な初期シグナルであるため広く使用されている。適当な生存能色素は、アネキシン、エチジウムホモダイマー−１、ＤＥＡＤレッド、ヨウ化プロピジウム、ＳＹＴＯＸグリーン等および当分野で既知の他のものである；出典明示により本明細書の一部とするMolecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Haugland, Sixth Edition参照；特に、２８５頁のApoptosis Assayおよび１６章参照。
【００５４】
細胞生存能のための生存能色素染色のプロトコールは既知であり、前記Molecular Probes参照。この態様において、アネキシンのような生存能色素を、直接または間接的に標識し、細胞集団と合わせる。アネキシンは、例えば、PharMingen, San Diego, CaliforniaまたはCaltag Laboratories, Millbrae, Californiaから商品として入手可能である。好ましくは、生存能色素は、色素の濃度が約１００ng／mlから約５００ng／ml、より好ましくは約５００ngから約１μg／ml、および最も好ましくは約１μg／mlから約５μg／mlである溶液として提供する。好ましい態様において、生存能色素は直接標識する。例えば、アネキシンはフルオレッセインイソチオシアネート(ＦＩＴＣ)、Ａｌｅｘａ色素、ＴＲＩＴＣ、ＡＭＣＡ、ＡＰＣ、tri-color、Ｃｙ−５および、当分野で既知であるか、商品として利用可能な他のもののような螢光色素で標識し得る。別の好ましい態様において、生存能色素は、ビオチンのようなハプテンのような第１標識で標識し、第２蛍光標識を使用する。他の第１および第２標識ペアは、当業者によく知られているように使用できる。
【００５５】
添加したら、生存能色素染色を細胞と一定時間インキュベートし、必要であれば洗浄する。細胞を、非生存可能細胞を除くために、下に概説のように分別する。
【００５６】
好ましい態様において、排除色素染色を生存能アッセイに使用する。排除色素は、生存細胞から排除されるもの、即ち、受動的に取りこまれないものである(それらは生存細胞の細胞膜を浸透しない)。しかし、死んだまたは死ぬ細胞の透過性により、それらは死亡細胞により取りこまれる。一般にはあるが、常にではなく、排除色素はＤＮＡに、例えば、挿入(インターカレーション)を介して結合する。好ましくは排除色素は、ＤＮＡの非存在下で蛍光でないか、蛍光が乏しい；これで洗浄段階の必要性がなくなる。あるいは、第２標識の使用を必要とする排除色素も使用し得る。好ましい排除色素は、臭化エチジウム；エチジウムホモダイマー−１；ヨウ化プロピジウム；ＳＹＴＯＸグリーン核酸染色；Ｃａｌｃｅｉｎ ＡＭ、ＢＣＥＣＦ ＡＭ；フルオレッセイン二酢酸；TOTO(登録商標)およびTO-PRO(登録商標)(Molecular Probesから；前掲、１６章参照)および当分野で既知の他のものである。
【００５７】
細胞生存能のための排除色素染色のプロトコールは既知であり、Moelcular Probesカタログ、前掲参照。一般に、排除色素を、約１００ng／mlから約５００μg／ml、より好ましくは約５００ng／mlから約１μg／ml、および最も好ましくは約０.１μg／mlから約５μg／mlの濃度で細胞に添加し、約０.５μg／mlが特に好ましい。細胞および排除色素を一定時間インキュベートし、必要に応じて洗浄し、次いで細胞を下に概略のように分別し、集団から非生存可能細胞を除去する。
【００５８】
加えて、例えば、生存細胞(即ち、分泌されたプロテアーゼ等)または死亡細胞(即ち、媒体中の細胞内酵素の存在；例えば、細胞内プロテアーゼ、ミトコンドリア酵素等)の細胞外酵素活性の測定ができる、酵素アッセイを含んで行い得る他の細胞生存能アッセイがある。出典明示により本明細書の一部とするMolecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Haugland, Sixth Edition参照；特に１６章参照。
【００５９】
好ましい態様において、少なくとも一つの細胞生存能アッセイを行い、蛍光が同等な場合、少なくとも二つの異なる細胞生存能アッセイが好ましい。一つの生存能アッセイのみを行う場合、好ましい態様は光分散アッセイ(前方および側面分散両方)を使用する。二つの生存能アッセイを行うとき、好ましい態様は光分散および色素排除を使用し、光分散および生存能色素染色も可能であり、全３つを、ある場合、同様に行う。このように、生存能アッセイは、非生存可能または死亡細胞から生存能細胞の分離を可能にする。
【００６０】
細胞生存能アッセイに加えて、好ましい態様は細胞増殖アッセイを使用する。本明細書の「増殖アッセイ」は、細胞集団が増殖、即ち複製しているかまたは複製していないかの測定を可能にするアッセイを意味する。
【００６１】
好ましい態様において、増殖アッセイは色素包含アッセイである。色素包含アッセイは、細胞相を分けるための希釈効果に基づく。簡単に、色素(一般に、下に概説のような蛍光色素)を細胞に導入し、細胞により取りこませる。一度取りこまれたら、色素を細胞に捕獲し、外に分散させない。細胞集団が分割するために色素は比例して希釈される。即ち、包含色素の導入後、細胞を一定時間インキュベートさせる；経時的に蛍光を失う細胞は分割し、蛍光を残す細胞は非成長相に拘束される。
【００６２】
一般に、包含色素の導入は、二つの方法の一つで行い得る。色素が細胞に受動的に入ることができないか(例えば、荷電されている)、細胞が色素を取りこむように処理しなければならない；例えば、電気パルスの使用を介して。あるいは、色素は、受動的に細胞に入ることができるが、一度取りこまれたら、細胞の外に分散しないように修飾する。例えば、包含色素の酵素的修飾は、包含色素を荷電し得、したがって細胞の外に拡散できなくする。例えば、Molecular Probes CellTracker(登録商標)色素は、蛍光クロロメチル誘導体であり、細胞内に自由に拡散し、次いでグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ介在反応が膜不浸透性色素を作る。
【００６３】
適当な包含色素は、CellTracker(登録商標)色素のMolecular Probesライン、PKH26(Sigma)、および当分野で既知の他のものを含むが、限定されない。これらはCellTracker(登録商標)Blue、CellTracker(登録商標)Yellow-Green、CellTracker(登録商標)Green、CellTracker(登録商標)Orangeを含むが、限定されない。Molecular Probes Handbook、前掲参照；特に１５章。
【００６４】
一般に、包含色素は約１００ng／mlから約５μg／mlの範囲の濃度で細胞に提供する。約５００ng／mlから約１μg／mlが好ましい。洗浄段階を使用し得、またはし得ない。好ましい態様において、候補生物活性剤を本明細書に記載の細胞と合わせる。細胞および包含色素を一定時間インキュベートし、細胞を分割させ、そして色素希釈をさせる。時間の長さは特定の細胞の細胞周期に依存する。一般に、少なくとも約２細胞分割が好ましく、少なくとも約３が特に好ましく、少なくとも約４が特別に好ましい。細胞を次いで下に概略のように分別し、複製する細胞およびしない細胞の集団を作る。当業者には認められるように、ある場合、例えば、抗増殖剤のスクリーニングの時に、明るい(即ち蛍光)細胞を集める；他の態様において、例えば、増殖剤のスクリーニングのために、低い蛍光の細胞を集める。変化は、異なる時点かまたは異なる細胞集団で蛍光の測定により決定し、互いにまたは標準と測定結果を比較する。
【００６５】
好ましい態様において、増殖アッセイは代謝拮抗物質アッセイである。一般に、代謝拮抗物質アッセイは、Ｇ１またはＧ２静止相への細胞拘束をもたらす薬剤が望ましいとき、最も有用である。代謝拮抗物質増殖アッセイにおいて、分割細胞を殺す毒性代謝拮抗物質の使用は分割しない細胞のみの生存をもたらす。適当な代謝拮抗物質は、メトトレキサート、シスプラチン、タキソール、ＡｒａＣのようなヌクレオチドアナログ等のような標準化学療法剤を含むが、これらに限定されない。加えて、代謝拮抗物質アッセイは発現により細胞死をもたらす遺伝子の使用を含む。
【００６６】
代謝拮抗物質を添加する濃度は、特定の代謝拮抗物質の毒性に依存し、当分野で既知のように決定する。代謝拮抗物質を添加し、細胞を一般に一定時間インキュベートする；再び、正確な時間は代謝拮抗物質の特性および同一性、および特定の細胞集団の細胞周期時間に依存する。一般に、少なくとも１回の細胞分割が起こるのに十分な時間である。
【００６７】
好ましい態様において、少なくとも一回の増殖アッセイを行い、１回以上が好ましい。このように、増殖アッセイは増殖細胞の集団および拘束細胞の集団をもたらす。
【００６８】
好ましい態様において、上記に概略の１回またはそれ以上の増殖アッセイの後または同時に、少なくとも１回の細胞相アッセイを行う。「細胞相」アッセイは、どの細胞相、Ｍ、Ｇ１、ＳまたはＧ２に細胞が拘束されているかを決定する。
【００６９】
好ましい態様において、細胞相アッセイはＤＮＡ結合アッセイである。簡単に、ＤＮＡ結合色素を細胞に挿入し、受動的に取りこませる。細胞内に入ったら、ＤＮＡ結合色素はＤＮＡに、一般に、挿入(インターカレーション)により結合するが、ある場合、色素は主溝または副溝結合化合物であり得る。色素の量は、このように直接細胞中のＤＮＡの量に依存し、これは細胞相で変化する。Ｇ２およびＭ相細胞は、Ｇ１相細胞の２倍のＤＮＡ含量を有し、Ｓ相細胞は、Ｓ相のどの点に細胞があるかに依存して中間の量を有する。適当なＤＮＡ結合色素は浸透性であり、Hoechst 33342および33258、アクリジンオレンジ、７−ＡＡＤ、ＬＤＳ ７５１、ＤＡＰＩおよびＳＹＴＯ １６を含むが、これらに限定されない；Molecular Probes Handbook、前掲；特に８および１６章。
【００７０】
一般にＤＮＡ結合染料は約１μg/mlないし約５μg/mlの範囲の濃度で添加する。該染料を細胞に加えて一定時間インキュベートするが、この時間の長さは選択される染料にいく分か依存する。１つの態様では、染料の添加直後に測定値をとる。次ぎに以下に概説されるように細胞を分別し、種々の量の染料を含む、従って種々の量のＤＮＡを含む細胞集団を作製し、このようにして複製している細胞から複製していない細胞を分離する。当業者には理解されるであろうが、ある場合、例えば増殖阻害剤に関してスクリーンする場合には、最小の蛍光（従って、１コピーのゲノム）しか持たない細胞を、複製している、従って１コピーを超えるゲノムＤＮＡを含む細胞から分離することができる。変化は、種々の時点で、または種々の細胞集団で蛍光を測定し、その測定値を互いに、または標準と比較することにより決定される。
【００７１】
好ましい態様では、細胞相アッセイとはサイクリン分解アッセイである。この態様では、スクリーンに先立ち（および一般に以下に概説されるような候補生物活性剤の導入に先立ち）、細胞に融合核酸を導入する。該融合核酸はサイクリン分解ボックスをコードする核酸と検出可能な分子をコードずる核酸とを含んでなる。「サイクリン分解ボックス」は、当技術分野で公知であり、特定の細胞相の間に該ボックスを含むタンパク質のユビキチン化経路によって分解を引き起こす配列である。すなわち、例えば、Ｇ１サイクリンはＧ１では安定であるが、Ｇ１サイクリン分解ボックスが存在するためにＳ期では分解され得る。従って、サイクリン分解ボックスと検出可能な分子、例えば緑色蛍光タンパク質とを連結することで、検出可能な分子の有無を利用して、その細胞集団の細胞相を同定することができる。好ましい態様では、複数のボックス、好ましくは各々異なる４種のボックスを用い、細胞相の検出が可能となる。
【００７２】
いくつかのサイクリン分解ボックスが当術分野で知られており、例えば、サイクリンＡは配列
【化１】

を含む分解ボックスを有し、サイクリンＢ１の分解ボックスは配列
【化２】

を含んでなる。Glotzer et al., Nature 349: 132-138 (1991)参照。その他の分解ボックスもよく知られている：
【化３】

（ラットサイクリンＢ）；
【化４】

（マウスサイクリンＢ）；
【化５】

（マウスサイクリンＢ１）；
【化６】

（マウスサイクリンＢ２）；および
【化７】

（マウスサイクリンＡ２）。
【００７３】
該サイクリン分解ボックスをコードする核酸は、検出可能な分子をコードする核酸に機能し得る形で連結する。該融合タンパク質は当技術分野で公知の方法によって構築される。例えば、該分解ボックスをコードする核酸を、検出可能な分子をコードする核酸に連結する。本明細書において「検出可能な分子」とは、検出可能な分子を含む細胞または化合物が、それを含まない細胞から識別可能となる分子、すなわち、抗原ＴＡＧと呼ばれることがあるエピトープ、特異的酵素、または蛍光分子を意味する。好ましい蛍光分子としては、限定されるものではないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、ならびにルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼをはじめとする酵素が挙げられる。抗原ＴＡＧを用いる場合、好ましい態様では細胞表面抗原を利用する。エピトープとしては細胞膜には通常見られない検出可能なペプチドのいずれかであることが好ましく、エピトープが細胞に通常見られるものであれば増強が検出され得る場合があるが、これは一般に好ましくない。同様に、例えば新規な産物または発色産物を生成する酵素など検出可能な酵素分子を用いてもよい。
【００７４】
従って、細胞相アッセイ後の分別の結果、種々の細胞相にある少なくとも２つの細胞集団が得られる。
【００７５】
好ましい態様では、本方法を用い、細胞周期チェックポイント経路の活性化または抑制、およびチェックポイント欠陥の改善をはじめとする、その細胞周期調節を変調する能力に関して候補生物活性剤をスクリーンする。候補生物活性剤は、細胞集団に外生的に加えることもできるし、あるいは本明細書にさらに記載されるように細胞中へ導入することもできる。
【００７６】
本明細書において「候補生物活性剤」または「外生化合物」とは、例えば、タンパク質、小型の有機分子、炭水化物（多糖類を含む）、ポリヌクレオチド、脂質などのいずれかの分子をいう。一般に、複数のアッセイ混合物を種々の薬剤濃度を用いてパネルに流し、種々の濃度に対しての種々の示差応答を得る。典型的には、これらの濃度のうち１つ、すなわち０または検出レベルに満たない濃度が負の対照として用いられる。さらに、正の対照も使用できる。例えば、細胞周期アッセイでは、細胞周期を変化させることが知られている薬剤を使用してもよい。例えば、ｐ２１は、Ｇ１サイクリン−ＣＤＫ複合体と結合することにより、Ｇ１細胞相にある細胞を拘束させることが知られている分子である。同様に、エキソサイトーシスに対してはエキソサイトーシスを誘導することが知られている化合物を以下にさらに十分概説されるように使用できる。
【００７７】
候補薬剤は多くの化学クラスを包含するが、典型的にはそれらは有機分子、好ましくは分子量が１００ダルトンより大きく約２,５００ダルトン未満の小型の有機分子である。候補薬剤はタンパク質との構造相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含んでなり、典型的には少なくとも１つのアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基、好ましくは少なくとも２つの官能化学基を含む。該候補薬剤は環式炭素または複素環式構造および／または上記の１以上の官能基で置換された芳香族もしくはポリ芳香族構造を含んでなる。候補薬剤はまた、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似体またはそれらの組合せを含む生体分子間に見出せる。特に好ましいのはペプチドである。
【００７８】
候補薬剤は合成または天然化合物のライブラリーを含む多様な供給源から得られる。例えば、ランダム化オリゴヌクレオチドの発現をはじめ、多様な有機化合物および生体分子のランダムな、また所定の合成には多くの手段が利用できる。あるいは、細菌、真菌、植物および動物の抽出物形態における天然化合物のライブラリーが入手可能であるか、または容易に作製できる。さらに、天然の、または合成により作製したライブラリーまたは化合物は従来の化学的、物理的、生化学的手段により容易に修飾される。公知の薬理活性物質は、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などの所定のまたはランダムな化学修飾を受けて構造類似体を形成し得る。
【００７９】
好ましい態様では、該候補生物活性剤はタンパク質である。本明細書において「タンパク質」とは共有結合した少なくとも２つのアミノ酸を意味し、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチドおよびペプチドが含まれる。該タンパク質は天然に存在するアミノ酸およびペプチド結合または合成ペプチド模倣構造からなってもよい。従って本明細書において「アミノ酸」または「ペプチド残基」とは、天然に存在するアミノ酸と合成アミノ酸の双方を意味する。例えば、ホモフェニルアラニン、シトルリンおよびノルロイシンは、本発明の目的のためのアミノ酸と考えられる。また「アミノ酸」には、プロリンおよびヒドロキシプロリンなどのイミノ酸残基が含まれる。その側鎖は（Ｒ）配置または（Ｓ）配置のいずれであってもよい。好ましい態様では、該アミノ酸は（Ｓ）またはＬ配置である。天然に存在しない側鎖を用いる場合は、例えばインビボ分解を妨げるまたは遅延させるために非アミノ酸置換基を用いてもよい。また、化学ブロッキング基またはその他の化学置換基を付加してもよい。
【００８０】
好ましい態様では、候補生物活性剤は天然に存在するタンパク質または天然に存在するタンパク質の断片である。従って、例えば、タンパク質またはタンパク質性細胞抽出物のランダムなもしくは所定の消化物を含む細胞抽出物を用いてもよい。このように、本明細書に記載の系のスクリーンのためには、原核生物および真核生物のタンパク質ライブラリーを作製すればよい。本態様において特に好ましいのは、細菌、真菌、ウイルスおよび哺乳類タンパク質のライブラリーであり、後者が好ましく、ヒトタンパク質が特に好ましい。
【００８１】
好ましい態様では、該候補生物活性剤は、約５ないし約３０のアミノ酸からなるペプチドであり、約５ないし約２０のアミノ酸からなるものが好ましく、約７ないし約１５のアミノ酸からなるものが特に好ましい。該ペプチドは上記に概説したような天然に存在するタンパク質の消化物、ランダムペプチド、または「偏りのある」ランダムペプチドであってもよい。本明細書において「ランダム化された」または文法上の同義語は、核酸およびペプチドがそれぞれ実質的にランダムなヌクレオチドおよびアミノ酸からなることを意味する。一般にこれらのランダムペプチド（または以下に論じる核酸）は化学的に合成されるので、いずれの位置にいずれのヌクレオチドまたはアミノ酸でも組み込める。この合成法は、ランダム化されたペプチドまたは核酸を作製し、その長さおよび配列においてあり得る組合せのすべてまたは大部分の形成を可能にし、ランダム化されたタンパク質性生理活性剤候補のライブラリーを形成するよう設計することができる。
【００８２】
１つの態様では、該ライブラリーは十分にランダム化され、いずれの位置でも優先のまたは一定の配列は存在しない。好ましい態様では、該ライブラリーには偏りがある。すなわち、配列内のある位置では一定であるか、または限られた数の可能性から選択される。例えば、好ましい態様では、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基は、例えば、疎水性アミノ酸、親水性残基、立体的に偏りのある（小さいまたは大きい）残基、架橋のためのシステイン、ＳＨ−３ドメインのためのプロリン、リン酸化部位のためのセリン、トレオニン、チロシンもしくはヒスチジンの作出などに対して、またはプリンに対してといった所定のクラス内でランダム化される。
【００８３】
好ましい態様では、該候補生物活性剤は核酸である。本明細書において「核酸」もしくは「オリゴヌクレオチド」または文法上の同義語は、共有結合した少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。本発明の核酸は一般にホスホジエステル結合を含むが、以下に概説されるいくつかの場合では、例えば、ホスホルアミド(Beaucage, et al., Tetrahedron, 49(10):1925 (1993)およびその参照文献; Letsinger, J. Org. Chem., 35:3800 (1970); Sprinzl, et al., Eur. J. Biochem., 81:579 (1977); Letsinger, et al., Nucl. Acids Res., 14:3487 (1986); Sawai, et al., Chem. Lett., 805 (1984); Letsinger , et al., J. Am. Chem. Soc., 110:4470 (1988); およびPauwels, et al., Chemica Scripta, 26:141 (1986))、ホスホロチオエート(Mag, et al., Nucleic Acids Res., 19:1437 (1991);および米国特許第 5,644,048号)、ホスホロジチオエート(Briu, et al., J. Am. Chem. Soc., 111:2321 (1989))、Ｏ−メチルホスホロアミダイト結合(Eckstein , Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press参照)、ならびにペプチド核酸主鎖および結合(Egholm, J. Am. Chem. Sci., 114:1895 (1992); Meier, et al., Chem. Int. Ed. Engl., 31:1008 (1992); Nielsen, Nature, 365:566 (1993); Carisson, et al., Nature, 380:207 (1996)参照。なお、これらは出典明示により本明細書の一部とする)を含んでなる選択的主鎖を有し得る核酸類似体が含まれる。
【００８４】
その他の核酸類似体としては正電荷主鎖(Denpcy, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:6097 (1995))；非イオン性主鎖(米国特許第５,３８６,０２３号、同第５,６３７,６８４号；同第５,６０２,２４０号；同５,２１６,１４１号；および同第４,４６９,８６３号; Kiedroeshi, et al., Angew. Chem. Intl. Ed. English, 30;423 (1991); Letsinger, et al., J. Am. Chem. Sci., 110:4470 (1988); Letsinger, et al., Nucleoside & Nucleotide, 13:1597 (1994); Chapters 2 and 3, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate modifications in Antisense Research", Ed. Y.S. Sanghui and P. Dan Cook; Mesmaeker, et al., Bioorganic & Medicinal Chem. Lett., 4:395 (1994); Jeffs, et al., J. Biomolecular NMR, 34:17 (1994); Tetrahedron Lett., 37:743 (1996))、ならびに米国特許第５,２３５,０３３号、同５,０３４,５０６号、およびChapters 6 and 7, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y.S. Sanghui and P.Dan Cookに記載のものをはじめとする非リボース主鎖を有するものが挙げられる。
【００８５】
１以上の炭素環式糖を含む核酸もまた本核酸定義内に含まれる(Jenkins, et al., Chem. Soc. Rev., (1995) pp. 169-176参照)。いくつかの核酸類似体がRawls, C & E News, June 2, 1997, page 35に記載されている。これらの参照文献はすべて出典明示して本明細書の一部とする。リボース−リン酸主鎖のこれらの修飾を行い、標識などの付加部分の付加を助けたり、あるいは生理学的環境下でかかる分子の安定性を高め、半減期を延ばしてもよい。さらに、天然に存在する核酸と類似体の混合物を作製することもできる。あるいは、種々の核酸類似体の混合物や天然に存在する核酸と類似体の混合物を作製してもよい。該核酸は明示したように一本鎖であっても二本鎖であってもよく、あるいは二本鎖または一本鎖配列の双方の部分を含んでもよい。該核酸は、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドのいずれかの組合せ、およびウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニンなどを含む塩基のいずれかの組合せを含む限り、ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの双方）、ＲＮＡまたはハイブリッドであってもよい。
【００８６】
一般にタンパク質に関して上記したように、核酸候補生物活性剤は天然に存在する核酸、ランダム核酸、または「偏りのある」ランダム核酸であってよい。例えば、タンパク質に関して先に概説したように原核生物ゲノムまたは真核生物ゲノムの消化物を用いてもよい。
【００８７】
好ましい態様では、該候補生物活性剤は有機化学部分であり、多様なものが文献から得られる。
【００８８】
好ましい態様では、種々の候補生物活性剤のライブラリーを用いる。好ましくは、該ライブラリーはランダム化された薬剤の十分構造的に多様な集団を提供して、特定の標的との結合を可能とするに見込みとして十分な範囲の多様性を達成する。従って、相互作用ライブラリーは、メンバーの少なくとも１つがそれに標的に対する親和性を与える構造を持つよう十分大きくなければならない。相互作用ライブラリーの必要とされる絶対的なサイズを測るのは難しいが、自然が免疫応答でヒントを与えてくれる。すなわち、多様な１０⁷ないし１０⁸個の異なる抗体は、生物が直面する大部分のあり得る抗原と相互作用するに十分な親和性を有する少なくとも１つの組合せを与える。また、公表されているインビトロ選択技術も、１０⁷ないし１０⁸のライブラリーサイズが、標的親和性を有する構造を見出すに十分であることを示している。本明細書で一般に提案されるものなど７ないし２０アミノ酸長のペプチドのすべての組合せに関するライブラリーは、２０⁷（１０⁹）ないし２０²⁰をコードする可能性を有する。従って、１０⁷ないし１０⁸の異なる分子のライブラリーを用い、本方法では理論的に完全な相互作用ライブラリーの「実働」サブセットをアミノ酸７個とし、形態サブセットを２０²⁰とする。このように好ましい態様では、主題の方法において少なくとも１０⁶、好ましくは１０⁷、より好ましくは少なくとも１０⁸、最も好ましくは少なくとも１０⁹個の異なる配列が同時に解析される。好ましい方法はライブラリーのサイズおよび多様性を最大にする。
【００８９】
該候補生物活性剤は細胞または細胞集団に結合または付加される。種々の態様に好適な細胞種は先に概説されている。該候補生物活性剤と細胞は結合させる。当業者には理解されるであろうが、これは候補薬剤を細胞表面へ、細胞を含む培地へ、または細胞が増殖している、もしくは接触している表面へ該候補薬剤を添加する。例えば、薬剤を細胞に導入するベクターを用いることにより該薬剤を細胞に付加する（ずなわち、薬剤が核酸またはタンパク質である場合）ことをはじめ、多くの方法のいずれで達成してもよい。
【００９０】
好ましい態様では、該候補生物活性剤は、ウイルスベクターをはじめとするベクターを用いて宿主細胞へ導入される核酸またはタンパク質（この場合タンパク質とはタンパク質、オリゴペプチドおよびペプチドを含む）のいずれかである。ベクター、好ましくはウイルスベクターの選択は細胞種による。細胞が複製する場合、以下にさらに十分記載されるようにレトロウイルスベクターを用いる。細胞が複製しない場合（すなわちある増殖期で拘束されている場合）には、レンチウイルスおよびアデノウイルスベクターをはじめとするその他のウイルスベクターを使用してもよい。
【００９１】
好ましい態様では、細胞は複製するかまたは複製を誘導できるかのいずれかであり、ＰＣＴ ＵＳ８７／０１０１９およびＰＣＴ ＵＳ８７／０１０４８に一般に概説されているように、レトロウイルスベクターを使用して候補生物活性剤を細胞に導入する。なおこの双方は出典明示により本明細書の一部とする。一般に、レトロウイルスベクターのライブラリーはヘルパーは欠くが、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖをはじめとする必要なすべてのトランスタンパク質、ならびにシスにψパッケージングシグナルを有するＲＮＡ分子を産生できるレトロウイルスパッケージング細胞系統を用いて作製される。便宜には、レトロウイルスＤＮＡ構築主鎖にライブラリーを作製し、当技術分野において十分に公知である技術を用いて標準的なオリゴヌクレオチド合成を行い、候補薬剤またはタンパク質、例えばランダムペプチドをコードする核酸のいずれかを作製する。ＤＮＡライブラリーを作製した後、該ライブラリーを第１のプライマーにクローン化する。第１のプライマーはレトロウイルス構築物に挿入される「カセット」として機能する。第１のプライマーは一般に、例えば、必要とされる調節配列（例えば、翻訳、転写、プロモーターなど）、融合パートナー、制限エンドヌクレアーゼ（クローニングおよびサブクローニング）部位、拘束コドン（好ましくは３フレームすべての）、第２鎖プライミングのための相補性領域（好ましくは停止コドン領域の末端に小さな欠失または挿入としてランダムな領域に起こり得る）などをはじめとするいくつかのエレメントを含む。
【００９２】
次いで、第２のプライマーを加えるが、これは一般に相補性領域のいくつかまたはすべてからなり、第１のプライマーおよびサブクローニングのための第２の唯一の制限部位に必要な任意の配列をプライミングする。ＤＮＡポリメラーゼを加えて二本鎖オリゴヌクレオチドを作製する。この二本鎖オリゴヌクレオチドを適当なサブクローニング制限エンドヌクレアーゼで切断して以下に記載する標的レトロウイルスベクターにサブクローン化する。
【００９３】
いずれの数の好適なレトロウイルスベクターを使用してもよい。一般に、レトロウイルスベクターは、以下でさらに十分に記載される選択マーカー遺伝子、５'ＬＴＲに対してセンスまたはアンチセンスに置かれた、第２の遺伝子を発現させるプロモーター、ＳＩＮにおけるＣＲＵＳ（合成ＬＴＲ）テトラサイクリン調節エレメント、細胞特異的プロモーターなどを含み得る。
【００９４】
好ましいレトロウイルスベクターとしては、ネズミ幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）（Hawley et al., Gene Therapy 1:136(1994)参照）および改変ＭＦＧウイルス（Rivere et al., Genetics 92:8733(1995)）およびＰＣＴ ＵＳ９７／０１０１９に概説されたｐＢＡＢＥを基にしたベクターが挙げられる。
【００９５】
レトロウイルスは候補薬剤の発現のための誘導プロモーターおよび構成プロモーターを含み得る。例えば選択過程のある相の間でのみ、またはある細胞相においてのみペプチド発現を誘導する必要がある場合（すなわち、Ｅ２Ｆ応答プロモーター、ｐ５３応答プロモーター、サイクリンプロモーターなどの相特異的プロモーターを用いる場合）がある。誘導プロモーターおよび構成プロモーター双方の多数のもが知られている。
【００９６】
さらに、標的細胞における単一ベクターの組み込み後にレトロウイルス挿入部の誘導発現が可能となるようにレトロウイルスベクターを配置することができるが、完全な系が単一のレトロウイルスに含まれていることが重要である。３’ＬＴＲエンハンサー／プロモーターレトロウイルス欠失変異体の自己不活化（ＳＩＮ）特性を組み込んだＴｅｔ誘導性のレトロウイルスが設計されている（Hoffman et al., PNAS USA 93:5185(1996)）。細胞におけるこのベクターの発現はテトラサイクリンまたは他の有効な類似体の存在下では実質的には検出できない。しかしながら、Ｔｅｔの不在下では誘導後４８時間以内に発現が最大を示し、誘導可能なレトロウイルスを含む細胞の全集団の発現が一様に増加するが、このことは、感染細胞集団内では発現が一様に調節されるということを示す。同様に、関連する系は、Ｔｅｔの存在下でＤＮＡに結合するが、Ｔｅｔの不在下では除去されるような変異ＴｅｔＤＮＡ結合ドメインを使用する。これらの系はいずれも好適である。
【００９７】
好ましい態様では、候補生物活性剤は融合パートナーに結合している。本明細書において「融合パートナー」または「機能的グループ」とは、候補生物活性剤と会合し、そのクラスのライブラリーのすべてのメンバーに共通の機能または能力を付与する配列を意味する。融合パートナーは異種（すなわち、宿主にとり天然でない）、または合成のもの（いずれの細胞にとっても天然でない）であり得る。好適な融合パートナーとしては、限定されるものではないが、ａ）候補生物活性剤を立体配位上制限されまたは安定な形で提供される以下に定義の提示構造、ｂ）候補生物活性剤を細胞下または細胞外区画へ局在化させる、以下に定義される標的配列、ｃ）候補生物活性剤かまたはそれらをコードする核酸のいずれかの精製または単離を可能にする以下に定義のレスキュー配列、ｄ）候補生物活性剤またはそれをコードする核酸に安定性または分解からの保護、例えばタンパク質分解耐性を付与する安定配列、ｅ）ペプチド二量化を可能にする二量化配列、あるいはｆ）ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）およびｅ）ならびに要すればリンカー配列のいずれかの組合せが挙げられる。
【００９８】
好ましい態様では、融合パートナーは提示構造である。本明細書みにおいて「提示構造」または文法上の同義語は、候補生物活性剤と融合した場合に候補薬剤に立体配位的上制限された形をとらせる配列を意味する。タンパク質は立体配位上拘束されたドメインを介して互いに強く相互作用する。当技術分野で公知のように、自由に回転するアミノおよびカルボキシル末端を有する小さなペプチドは強い機能を有していても、かかるペプチド構造の薬理活性剤への変換は、ペプチド模倣合成に関する側鎖の位置を予測できないために困難である。従って、立体配位上拘束された構造でのペプチドの提示は、その後の医薬の製造にも有益であるし、またおそらくペプチドと標的タンパク質とのより高い親和性の相互作用をもたらす。この事実は、細菌ファージ系において生物学的に作製した短いペプチドを用いる組合せライブラリー作製系において認められている。何人かの研究者が、ランダム化されたペプチド構造を提示する小ドメイン分子を構築している。
【００９９】
候補生物活性剤は核酸またはペプチドのいずれであってもよいが、提示構造はペプチド候補薬剤とともに用いるのが好ましい。従って合成提示構造、すなわち人工ポリペプチドはランダム化されたペプチドを立体配位上制限されたドメインとして提示できる。一般に、かかる提示構造は、ランダム化されたペプチドのＮ末端に結合した第１の部分と、そのペプチドのＣ末端に結合した第２の部分とを含んでなり、すなわち該ペプチドは、以下に概説されるように、変異体を作製できるが提示構造に挿入されている。ランダム化された発現産物の機能的単離を高めるには、標的細胞において発現された場合に最小の生物学的活性しか持たないように提示構造を選択または設計する。
【０１００】
好ましい提示構造は、外側のループにそれを提示することにより、ペプチドへの接近性が最大となる。従って、好適な提示構造としては、限定されるものではないが、ミニボディ構造、βシートターン上のループ、構造に重要でない残基がランダム化されている超らせん幹構造、ジンクフィンガードメイン、システイン結合（ジスルフィド）構造、トランスグルタミナーゼ結合構造、環状ペプチド、Ｂループ構造、らせんバレルまたはらせん束、ロイシンジッパーモチーフなどが挙げられる。
【０１０１】
好ましい態様では、該提示構造は超らせん構造であり、外側のループでランダム化ペプチドの提示を可能にする。例えば、出典明示により本明細書の一部とする、Myazka et al., Biochem. 33:2362-2373(1994)参照。この系を用いて、研究者らは適当な標的と高い親和性の相互作用が可能なペプチドを単離している。一般に、超らせん構造は６ないし２０個の間のランダムな位置にある。
【０１０２】
好ましい超らせん提示構造は以下のとおりである。
【化８】

下線の領域はこれまでに定義された超らせんロイシンジッパー領域を示す（出典明示により一部とする、Martin et al., ENBO J. 13(22):5303-5309(1994)参照）。太字のＧＲＧＤＭＰ領域は、ループ構造を示し、ランダム化されたペプチド（すなわち、本明細書では概して（Ｘ）_n（ここで、Ｘはアミノ酸残基であり、かつ、ｎは少なくとも５または６の整数である）で示される候補生物活性剤）で適当に置換された場合に可変の長さとなり得る。太字領域の置換は下線領域に制限エンドヌクレアーゼ部位をコードすることによって促進されて、その位置でのランダム化されたオリゴヌクレオチドの直接組み込みが可能となる。例えば、好ましい態様は、二重下線のＬＥ部位にＸｈｏＩ部位を、また二重下線のＫＬ部位にＨｉｎｄIII部位を作り出す。
【０１０３】
好ましい態様では、該提示構造はミニボディ構造である。「ミニボディ」は実質的に最小の抗体相補性領域からなる。該ミニボディ提示構造は一般に折り畳まれたタンパク質において三次構造の単一面に沿って提示される２個のランダム化領域を提供する。例えば、Bianchi et al., J. Mol. Biol. 236(2):648-59(1994)およびそこで引用されている文献参照、なお、すべて出典明示により本明細書の一部とする。研究者らはこの最小ドメインが溶液中で安定であることを示し、組合せライブラリーにおいて相選択系を使用して炎症性サイトカインＩＬ−８にＫｄ＝１０^-7といった高い親和性を示すペプチド領域を用いてミニボディを選択している。
【０１０４】
好ましいミニボディ提示構造は以下のとおりである。
【化９】

太字で下線の領域はランダム化され得る領域である。イタリック体のフェニルアラニンは第１のランダム化領域において不変でなくてはならない。完全なペプチドが超らせんの態様の３つのオリゴヌクレオチドからなる可変部分にクローン化され、従って２個の異なるランダム化領域の同時組み込みが可能となる。この態様は末端の非パリンドロームＢｓｔＸＩ部位を利用する。
【０１０５】
好ましい態様では、該提示構造は一般に２個のシステイン残基を含む配列であり、その結果ジスルフィド結合が形成され、立体配位上拘束された配列が得られる。この態様は分泌標的配列を用いる場合には特に好ましい。当業者には理解されるであろうが、いずれの数のランダム配列でも、スペーサーまたは連結配列を伴い伴わなくて、システイン残基でフランクされ得る。他の態様では、効果的な提示構造はランダム領域自体によって作出され得る。例えば、ランダム領域は、システイン残基で「処理」するが、適当な酸化還元条件下では提示構造に類似した高度に架橋した構造の立体配位をもたらし得る。同様に、ランダム化領域は制御されてβシートまたはαへリックス構造を与える一定数の残基を含み得る。
【０１０６】
好ましい態様では、該融合パートナーは標的配列である。当業者には理解されるであろうが、細胞内でのタンパク質の局在化は有効濃度を高め、かつ機能を決定するための単純な方法である。例えば、ＲＡＦ１はミトコンドリア膜に局在した場合にはＢＣＬ−２の抗アポトーシス作用を阻害し得る。同様に、膜に結合したＳｏｓはＴリンパ球においてＲａｓ媒介性のシグナル伝達を誘導する。これらの機構はリガンドの探索領域を限定する原理によるものと考えられ、すなわち、タンパク質の原形質膜への局在化はそのリガンドの探索を細胞質の三次元空間に対して膜付近の二次元空間に限定することとなる。あるいはまた、タンパク質の濃度も局在化という性質により簡単に高められる。核へタンパク質を往復させることによりそれらをより小さい空間に制限し、それにより濃度が高まる。最後に、リガンドまたは標的は特定のコンパートメントに簡単に局在化され得るし、阻害剤も適当に局在化するはずである。
【０１０７】
このように好適な標的配列としては、限定されるものではないが、発現産物の生物活性を維持しつつ発現産物を所定の分子またはクラスの分子と結合させることができる結合配列（例えば、酵素阻害剤または基質配列を用いてある関連する酵素クラスを標的化する）；それ自体またはともに結合しているタンパク質の選択的分解のシグナルを伝達する配列；ならびに、候補発現産物を、ａ）ゴルジ体、小胞体、核、仁、核膜、ミトコンドリア、葉緑体、分泌小胞、リソソーム、および細胞膜などの細胞下の位置、およびｂ）分泌シグナルを介する細胞外の位置を含む、細胞の所定の場所へ構成的に局在化させ得るシグナル配列が挙げられる。細胞下への局在化または分泌を介する細胞外への局在化のいずれかが特に好ましい。
【０１０８】
好ましい態様では、標的化配列は核局在化シグナル（ＮＬＳ）である。ＮＬＳは一般に、ＮＬＳが生じる完全なタンパク質を細胞核へ向かわせるように働く、正電荷を有する（塩基性）短いドメインである。ＳＶ４０（サルのウイルス）ラージＴ抗原（
【化１０】

）、
Kalderon(1984), et al., Cell, 39:499-509;ヒトレチノイン酸受容体−β核局在化シグナル (
【化１１】

)
；ＮＦｋＢ ｐ５０（
【化１２】

；Ghosh et al., Cell 62:1019(1990)；ＮＦｋＢｐ６５（
【化１３】

；Nolan et al., Cell 64:961(1991)；およびその他（例えば出典明示により本明細書の一部とするBoulikas, J. Cell. Biochem. 55(1):32-58(1994)参照）などの単一塩基性ＮＬ、ならびにツメガエル（アフリカツメガエル）タンパク質のヌクレオプラスミン（
【化１４】

）、
Dingwall, et al., Cell, 30:449-458 1982 and Dingwall et al., J. Cell Biol., 107:841-849;1988）などの二塩基性ＮＬＳをはじめとする多数のＮＬＳアミノ酸配列が報告されている。多数の局在化研究では、合成ペプチドに組み込まれたＮＬＳまたは通常は細胞核に向かわないリレポータータンパク質につぎ足されたＮＬＳは、これらのペプチドおよびリポータータンパク質を核内に集中させることが証明されている。例えば、Dingwall, and Laskey, Ann. Rev. Cell Biol., 2:367-390, 1986; Bonnerot, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:6795-6799, 1987; Galileo, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:458-462, 1990参照。
【０１０９】
好ましい態様では、該標的化配列は膜固定シグナル配列である。多くの細胞内事象が原形質で起こるということの他、多くの寄生虫および病原体が膜に結合するので、これは特に有用である。このように、膜結合ペプチドライブラリーは、これらの過程における重要な要素の同定、ならびに有効な阻害剤の発見の双方に有用である。本発明は、ランダムな発現産物を細胞外または細胞質空間で提示する方法を提供する；図３参照。細胞外提示に関しては、ペプチド提示構造のカルボキシル末端に膜固定領域が提供される。ランダムな発現産物領域は細胞表面で発現され、細胞外空間に提示され、他の表面分子（それらの機能に影響する）または細胞外媒体中に存在する分子と結合できるようになる。かかる分子の結合により、その分子と結合するペプチドを発現する細胞に機能を付与できる。細胞質領域は、きわだった特徴がなくてもよいし、または細胞外のランダムな発現産物領域が結合する場合、細胞に機能（キナーゼ、ホスファターゼの活性化、機能を遂行するための他の細胞成分との結合）を付与するドメインを包含することもできる。同様に、ランダムな発現産物を含む領域は、細胞質領域に包含されることが可能で、かつ、貫通膜領域および細胞外領域は不変のままであるか、または明らかな機能を有する。
【０１１０】
膜固定配列は、当技術分野で十分公知であり、哺乳類の貫通膜分子の遺伝的幾何学に基づく。ペプチドは、シグナル配列（本明細書ではｓｓＴＭと表す）に基づいて膜に挿入され、疎水性貫通膜ドメイン（本明細書ではＴＭ）を必要とする。この貫通膜タンパク質は、貫通膜ドメインの５'側にコードされる領域は細胞外に、３'部分をコードする領域は細胞内になるように膜に挿入する。もちろん、これらの貫通膜ドメインが可変領域の５'側に置かれた場合には、それらは細胞内ドメインとしてそれを固定する働きをするであろうし、これはいくつかの態様においては望ましいものであり得る。ｓｓＴＭおよびＴＭは、多様な膜結合タンパク質として公知であり、従ってこれらの配列は、特定のタンパク質由来の対として、または各成分を異なるタンパク質から取って使用してもよく、あるいは該配列は人工送達ドメインとして合成してもよいし、また全体が共通配列に由来してもよい。
【０１１１】
当業者には理解されるであろうが、ｓｓＴＭおよびＴＭ双方を含む膜固定配列は多様なタンパク質について公知であり、これらのうちいずれを用いてもよい。特に好ましい膜固定配列としては、限定されるものではないが、ＣＤ８、ＩＣＡＭ−２、ＩＬ−８Ｒ、ＣＤ４およびＬＦＡ−１が挙げられる。
【０１１２】
有用な配列としては、1）ＩＬ−２受容体β鎖（残基１−２６はシグナル配列、２４１−２６５は貫通膜残基；Hatakeyama et al., Science 244:551(1989) and von Heijne et al., Eur. J. Biochem. 174:871(1988)参照）およびインスリン受容体β鎖（残基１−２７はシグナル配列、９５７−９５９は貫通膜ドメイン、および９６０−１３８２は細胞質ドメイン；Hatakeyama, supra, and Ebina et al., Cell 40:747(1983)参照）などのクラスＩ内在性膜タンパク質；２）中性エンドペプチダーゼ（残基２９−５１は貫通膜ドメイン、２−２８は細胞質ドメイン；Malfroy et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 144:59(1987)参照）などのクラスII内在性膜タンパク質；３）ヒトシトクロムＰ４５０ ＮＦ２５（Hatakeyama, supra）などのタイプIIIタンパク質；ならびに４）ヒトＰ−糖タンパク質（Hatakeyama, supra）などのタイプIVタンパク質由来の配列が挙げられる。特に好ましいのはＣＤ８およびＩＣＡＭ−２である。例えば、ＣＤ８およびＩＣＡＭ−２由来のシグナル配列は、転写物の最も５'末端に位置する。これらは、ＣＤ−８の場合はアミノ酸１−３２（
【化１５】

；Nakauchi et al., PNAS USA 82:5126(1985)を、ＩＣＡＭ−２の場合にはアミノ酸１−２１（
【化１６】

；Staunton et al., Nature(London) 339:61(1989)）からなる。これらのリーダー配列は、構築体を膜へと送達する一方で、ランダムな候補領域の３'に位置する疎水性貫通膜ドメインは構築体を膜に固定させる。これらの貫通膜ドメインはＣＤ８由来のアミノ酸１４５−１９５（
【化１７】

；Nakauchi, supra）およびＩＣＡＭ−２由来のアミノ酸２２４−２５６（
【化１８】

；Staunton, supra）に包含される。
【０１１３】
あるいは、膜固定配列はＧＰＩアンカーを含み、その結果として例えばＤＡＦ（
【化１９】

、
アンカー部位に太字のセリンを有する、Homans et al., Nature 333(6170):269-72(1968),およびMoran et al., J. Biol. Chem. 266:1250(1991)参照）においては、グリコシル−ホスファチジルイノシトール結合を介して該分子と脂質二重層の間の共有結合を形成する。これを達成するには、Ｔｈｙ−１由来のＧＰＩ配列を貫通膜配列の代わりに可変領域の３'にカセットとして挿入できる。
【０１１４】
同様に、ミリスチル化配列は膜固定配列として働き得る。ｃ−ｓｒｃのミリスチル化によりそれが原形質膜に補充されることが知られている。該タンパク質の最初の１４個のアミノ酸：
【化２０】

（Cross et al., Mol.Cell. Biol. 4(9):1834(1984); Spencer et al., Science 262:1019-1024(1993)参照、双方とも出典明示により本明細書の一部とする）が単にこの機能のみを担うと仮定すると、これは膜局在化の単純かつ有効な方法である。このモチーフはすでにリポーター遺伝子の局在化に有効であることが示されており、ＴＣＲのゼータ鎖を固定するために使用できる。このモチーフは、該構築体を原形質膜に局在化させるには可変領域の５'側に置かれる。パルミトイル化のような他の修飾を用いて原形質膜に構築体を固定することもができる；例えば、Ｇタンパク質結合受容体キナーゼＧＰＫ６配列（
【化２１】

；太字のシステインがパルミトイル化されている；Stoffel et al., J. Biol. Chem 269:27791(1994)）由来；ロドプシン（
【化２２】

；Barnstable et al., J. Mol. Neurosci. 5(3):207(1994)）由来；およびｐ２１ Ｈ−ｒａｓ１タンパク質（
【化２３】

；Capon et al., Nature 302:33(1983)）のパルミトイル化配列がある。
【０１１５】
好ましい態様では、該標的化配列は、例えばＬａｍｐ−２のようなリソソーム分解配列（ＫＦＥＲＱ；Dice, Ann. N.Y. Acad. Sci. 674:58(1992)；またはＬａｍｐ−１由来のリソソーム膜配列（
【化２４】

；Uthayakumar et al., Cell. Mol. Biol. Res. 41:405(1995)）、またはＬａｍｐ−２（
【化２５】

、
Koneckl et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 205:1-5(1994)、双方ともイタリック体は貫通膜ドメイン、下線は細胞質標的シグナルを示す）をはじめとするリソソーム標的化配列である。
【０１１６】
あるいは、該標的化配列は、ミトコンドリア・マトリックス配列（例えば、酵母アルコールデヒドロゲナーゼIII；
【化２６】

；Schalz, Eur. J. Biochem. 165:1-5(1987)）；ミトコンドリア膜内配列（酵母シトクロムｃオキシダーゼサブユニットIV；
【化２７】

Schalz, supra）；ミトコンドリア膜間空間配列（酵母シトクロムｃ１；
【化２８】

；Schalz, supra）またはミトコンドリア膜外配列（酵母７０ｋＤ膜外タンパク質；
【化２９】

【０１１７】
該標的配列はまた、カルレチクリン由来配列（ＫＤＥＬ；Pelham, Royal SocietyLondon Transactions B; 1-10(1992)）またはアデノウイルスＥ３／１９Ｋタンパク質由来の配列（
【化３０】

；Jackson et al., EMBO J. 9:3153(1990)をはじめとする小胞体配列であってもよい。
【０１１８】
さらに標的配列はまた、ペルオキシソーム配列（例えば、ルシフェラーゼ由来のペルオキシソームマトリックス配列；ＳＫＬ；Ketler et al., PNAS USA 4:3264(1987)）；ファルネシル化配列（例えば、Ｐ２１ Ｈ-ｒａｓ１；
【化３１】

太字のシステインがファルネシル化されている；Capon, supra）；ゲラニルゲラニル化配列（例えば、タンパク質ｒａｂ−５Ａ；
【化３２】

太字のシステインがゲラニルゲラニル化されている；Farnsworth, PNAS USA 91:11963(1994)）；または分解配列（サイクリンＢ１；
【化３３】

；Klotzbucher et al., EMBO J. 1:3053(1996)）を含む。
【０１１９】
好ましい態様では、該標的化配列は候補翻訳産物の分泌に作用できる分泌シグナル配列である。可変ペプチド領域の５'側に置かれた公知の分泌シグナル配列は多数あり、ペプチド領域から切断されて細胞外空間への分泌を果たす。分泌シグナル配列とそれらの関連のないタンパク質への転移能力は十分公知である。例えば、Sllhavy, et al., (1985) Microbiol. Rev. 49, 398-418。これは、宿主細胞以外の、例えば該ペプチドを発現する細胞のような標的細胞の表面に結合できる、またはその生理学に作用できるペプチドを作製するのに特に有用である。好ましい試みにおいて、融合産物は一連の分泌シグナルペプチド−提示構造−ランダムな発現産物領域−提示構造を含むように配置する。この方法において、ペプチドライブラリーを発現した細胞の近傍で増殖した標的細胞は、分泌したペプチドに浸される。標的細胞はペプチドの存在に応答して、例えばペプチドが表面受容体に結合するか、または取り込まれて細胞内の標的に結合することにより生理学的変化を示し、種々の分泌スキームのいずれかによって分泌細胞が局在化し、該ペプチドが所定の作用を引き起こす。作用の例としては、デザイナーサイトカイン（すなわち、造血幹細胞を分裂させ、それらの全能性を維持できる幹細胞因子）、癌細胞を自発的アポトーシスに導く因子、標的細胞の細胞表面に結合してそれらを特異的に標識する因子など様々なものが挙げられる。
【０１２０】
ＩＬ−２（
【化３４】

；Villinger et al., J. Immunol. 155:3948(1995)）、成長ホルモン（
【化３５】

；Roskam et al., Nucleic Acids Res. 7:30(1979)）；プレプロインスリン（
【化３６】

；Bell et al., Nature 284:26(1980)）およびインフルエンザＨＡタンパク質（
【化３７】

；Sekiwawa et al., PNAS 80:3563）)由来のシグナルをはじめとする好適な分泌配列が知られている。なおここで、非下線部と下線部の接点が切断される。特に好ましい分泌シグナル配列は、分泌型サイトカインＩＬ−４由来のシグナルリーダー配列であり、これは以下に示すＩＬ−４の最初の２４個のアミノ酸を含む：
【化３８】

【０１２１】
好ましい態様では、該融合パートナーはレスキュー配列である。レスキュー配列は、候補薬剤またはそれをコードする核酸のいずれかを精製または単離するために使用できる配列である。このようにペプチドレスキュー配列としては、例えば、Ｎｉ親和性カラムと併用するＨｉｓ₆タグ、および検出、免疫沈降またはＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞分別）のためのエピトープ標識などの精製配列が挙げられる。好適なエピトープタグとしては、ｍｙｃ（市販の９Ｅ１０抗体と併用）、細菌酵素ＢｉｒＡのＢＳＰビオチン化標的配列、ｆｌｕタグ、ｌａｃＺおよびＧＳＴが挙げられる。
【０１２２】
あるいは、レスキュー配列は、ＰＣＲ、関連技術またはハイブリダイゼーションによるレトロウイルス構築体の迅速かつ容易な単離を可能にするプローブ標的部位として働く特異なオリゴヌクレオチド配列であってもよい。
【０１２３】
好ましい態様では、該融合するパートナーは、候補生物活性剤またはそれをコードする核酸に安定性を付与する安定配列である。このように、例えば、VarahavskyのＮ−Ｅｎｄ則に従い、ペプチドのユビキチン化を保護するため、開始メチオニン（ＭＧまたはＭＧＧＯ）の後にグリシンを組み込むことによりペプチドは安定化され、このようにして細胞質中での長い半減期が付与され得る。同様に、Ｃ末端の２個のプロリンは、ペプチドにカルボキシペプチダ−ゼの作用に対する強い耐性を付与する。プロリンの前に２個のグリシンが存在すると、可変性が付与されるとともに、２個のプロリンで一連の事象が起こる構造候補ペプチド構造へ伝わるのを防げる。このような好ましい安定配列を以下に示す：ＭＧ(Ｘ)_nＧＧＰＰ、ここでＸはいずれかのアミノ酸であり、ｎは少なくとも４の整数である。
【０１２４】
１つの態様では、該融合パートナーは二量化配列である。二量化配列により、通常の生理学的条件下で結合を維持するに十分な親和性で、あるランダムなペプチドと別のランダムなペプチドとの非共有結合が可能となる。このことにより、細胞あたり２個のペプチドが生じ、次いで二量化して１０⁸（１０⁴×１０⁴）の有効なライブラリーが形成されるとすると、ランダムペプチドの小さなライブラリー（例えば、１０⁴）が効果的に大きなライブラリーとなる。それはまた、要すればより長いランダムペプチドの形成も可能にし、あるいはより構造的に複雑なランダムペプチド分子の形成も可能にする。この二量体は、ホモ二量体であってもヘテロ二量体であってもよい。
【０１２５】
二量化の配列は、自己凝集する単一の配列、または２つの配列であってもよく、各配列は異なるレトロウイルス構築体内で生成する。すなわち、二量化配列１を持つ第一のランダムペプチドおよび二量化配列２をもつ第二のランダムペプチド双方をコードする核酸は、細胞への導入と該核酸の発現に基づき、二量化配列１が二量化配列２と会合して新らしいランダムペプチド構造を形成するようにしたものである。
【０１２６】
適切な二量化配列は広範な配列を包含する。相当数のタンパク質−タンパク質相互作用部位が知られている。さらに、二量化配列はまた酵母の２ハイブリッドシステム、伝統的な生化学的親和性結合研究法などの標準的方法、あるいは本発明方法を用いても解明することができる。
【０１２７】
融合パートナーは生物学と活性が許す限り、構造中のいずれの部分（すなわち、Ｎ−末端、Ｃ−末端、内部）にあってもよい。
好ましい態様において、融合パートナーは、ＰＣＴ ＵＳ９７／０１０１９に一般的に記載されているように、リンカーまたはつなぎ鎖配列を包含して、妨害されていない潜在的標的と候補薬剤が相互作用するのを可能とする。例えば、候補生物活性剤がペプチドである場合、有用なリンカーはグリシン−セリン・ポリマー（例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎおよび（ＧＧＧＳ）ｎを包含し、ｎは少なくとも１の整数である）、グリシン−アラニン・ポリマー、アラニン−セリン・ポリマー、およびシェーカー型カリウムチャンネルのつなぎ鎖などの他の柔軟性リンカー、さらに当業者が認める多様な他の柔軟性リンカーを包含する。グリシン−セリン・ポリマーは、このアミノ酸の両方が比較的非構造的であり、それ故に成分間の中性的つなぎ鎖として働くことができるので、好適である。第二に、セリンは親水性であり、したがって、球状のグリシン鎖であり得るものを可溶化することが可能である。第三に、同様の鎖は、例えば、一本鎖抗体などの組換えタンパク質のサブユニットを連接するのに有効であることが示されている。
【０１２８】
さらに、提示構造を含む融合パートナーは、修飾、ランダム化、および／または成熟化してランダム化発現産物の提示方向を変えることもできる。例えば、ループ塩基の決定因子を修飾し、ランダム化アミノ酸配列を保持した内部ループペプチドの三級構造を僅かに修飾することが可能である。
【０１２９】
好ましい態様においては、融合パートナーを合わせて用いる。このように、例えば、提示構造、標的配列、レスキュー配列および安定配列の多様な合わせをリンカー配列の存在下または不存在下に使用することができる。
【０１３０】
このように、候補薬剤はこれらの成分を含むことが可能であり、したがって、各断片が異なるペプチドをコードし得る異なるランダムヌクレオチド配列を含む断片ライブラリーの生成に使用することができる。連結反応産物は次いで大腸菌などのバクテリアに形質転換し、一般手法として概括されている（Kitamura, PNAS USA 92: 9146-9150 (1996); 出典明示により本明細書の一部とする）ように、得られるライブラリーからＤＮＡを調製する。
【０１３１】
レトロウイルスパッケージシステムにライブラリーＤＮＡを導入すると、感染性ウイルスに転換する。適切なレトロウイルスパッケージシステムは、これらに限定されるものではないが、ビング（Bing）およびＢＯＳＣ２３細胞株（ＷＯ９４／１９４７８；Soneoka et al., Nucleic Acid Res. 23 (4): 628 (1995); Finer et al., Blood 83: 43 (1994)に記載）、フェオニックス（Pheonix）パッケージ株、例えば、ＰｈｉＮＸ−ｅｃｏおよびＰｈｉＮＸ−ａｍｐｈｏ（下記）、２９２Ｔ＋ｇａｇ−ｐｏｌおよびレトロウイルスエンベロープ、ＰＡ３１７、および細胞株（Markowitz et al., Virology 167: 400 (1988), Markowitz et al., J. Virol. 62: 1120 (1988); Li et al., PNAS USA 93: 11658 (1996); Kinsella et al., Human Gene Therapy 7: 1405 (1996)に概説）を包含する（これらの文献すべてを出典明示により本明細書の一部とする）。好ましいシステムはＰＣＴ／ＵＳ９７／０１０１９に開示されたＰｈｉＮＸ−ｅｃｏおよびＰｈｉＮＸ−ａｍｐｈｏまたは類似の細胞株である。
【０１３２】
細胞が複製しない場合は、他のウイルスベクター、例えば、アデノウイルスベクター、ネコ免疫ウイルス（ＦＩＶ）ベクターなどを使用してもよい。
好ましい態様において、候補薬剤をウイルスベクターにより細胞に導入する場合には、候補ペプチド薬剤を検出可能な分子に連結するが、本発明方法は少なくとも１つの発現アッセイ法を包含する。発現アッセイ法は、候補生物活性剤が発現されたかどうか、すなわち、候補ペプチド薬剤が細胞内に存在するかどうかの決定を可能とするアッセイ法である。このように、標識などの検出可能な分子の発現に候補薬剤の発現を連結することにより、候補ペプチド薬剤の存在または不存在を決定し得る。したがって、この態様において、候補薬剤は検出可能な分子に操作可能に連結される。一般に、これは融合核酸を創製することにより実施される。融合核酸は候補生物活性剤（上に概説したように融合パートナーを含んでもよい）をコードする第一核酸と検出可能な分子をコードする第二核酸を含んでなる。「第一」および「第二」という用語は、融合核酸の５’−３’方向に関して配列の方向を付与することを意味するものではない。例えば、融合配列の５’−３’方向を仮定すると、第二核酸に対し５’、または第二核酸に対し３’に位置してもよい。本態様において好ましい検出可能な分子は、これらに限定されるものではないが、蛍光タンパク質、例えば、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＢＦＰおよびＲＦＰなどを包含し、取分け前者が好ましい。
【０１３３】
一般に、候補薬剤は、薬剤−標的相互作用を好む反応条件下に細胞に加えられる（上に概説したように、細胞外または細胞内のいずれか）。一般に、これは生理的条件である。インキュベーションは最適活性を容易とする温度で実施し得るが、典型的には４℃および４０℃の間である。インキュベーション時間は最適活性のために選択されるが、迅速な高処理能力スクリーンを容易にするように最適化してもよい。典型的には、０.１と１時間の間で十分である。過剰の試薬は一般に除去または洗い流す。
【０１３４】
様々な他の試薬類を本アッセイ法に含めることができる。これらは塩、中性タンパク質、例えば、アルブミン、洗剤などを包含し、これらは最適なタンパク質−タンパク質結合を容易にし、および／または非特異的もしくは共通の相互作用を低減させるために用いる。また、その他アッセイの効率を改善する試薬、例えば、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗微生物剤などを用いてもよい。成分の混合物は検出に必要な順番で添加する。細胞の洗浄またはすすぎは異なる時点で当業者が認めるように実施するが、濾過および遠心分離の使用も包含する。第二標識部位（本明細書では「第二標識体」ともいう）を用いる場合、それらの部位は、好ましくは、非特異的結合を減らすために、過剰の非結合標的分子を除去した後に添加する。しかし、一部の条件下では、成分のすべてを同時に加えてもよい。
【０１３５】
好ましい態様において、細胞は蛍光細胞活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）により分別する。本発明において、細胞周期規制は、共通事項を低下させ、特異的性を高めるような複数のパラメーターにより評価する。それに対し、ＦＡＣＳは、２つの異なるまたは無関係の特性を同時に評価するためにこれまで用いられてきたが、これら２つの特性を有する細胞を同定はするが、合わされた特性の共通事項を低下させるものではない。
【０１３６】
このように、細胞は１種以上のアッセイ法、例えば、細胞生存能アッセイ、増殖アッセイ、細胞相アッセイ、および（候補薬剤が検出可能な部分と共に発現される場合の）発現アッセイなどに基づきＦＡＣＳにおいて分別または濃厚化される。１種以上のこれらアッセイ法からの結果は、候補生物活性剤に暴露しなかった細胞と、または候補薬剤での誘導前の同一細胞と比較する。これらの結果の変化は、当該薬剤が細胞周期規制を調節することを示している。
【０１３７】
本発明の利点は、候補薬剤ライブラリーが細胞のライブラリーで試験し得るということであり、その理由は本方法が、非常に稀な事象を検出し得るような非常に高い特異的性によって単一細胞の分別を可能とするからである。複数のレーザー経路を使用することにより、７０％を超える精度で１０ ⁶ 中１の分別精度を可能とする。
【０１３８】
さらに、本発明は、複数の細胞周期規制の同定法に加えて、他の細胞特性の同定法と合わせることができる。例えば、全般的な細胞健常性のパラメーターは、例えば、カルシウム応答を示す色素インド−１を用いることにより測定および選択することができる。当業者が常套的に同定する他の細胞性パラメーターは、これらに限定されるものではないが、細胞の大きさ、細胞の形、レドックス状態、ＤＮＡ含量、核酸配列、染色質構造、ＲＮＡ含量、総タンパク質、抗原、脂質、表面タンパク質、細胞内受容体、酸化性代謝、ＤＮＡの合成と分解、および細胞内ｐＨなどである。
【０１３９】
好ましい態様において、各測定値は細胞が複数レーザーのビーム経路を通過する際に、個々の細胞から同時に決定される。あるいは、測定は連続的になされる。細胞周期規制または細胞周期規制における変化を検出するための１種以上のパラメーターを使用することにより、共通事項を減少させ、特異的性を高める。所望性質のパラメーターに合致する細胞を、所望パラメーターに合致しない細胞から物理的に分別することができるか、またはそれらの細胞は細胞集団中の百分比により同定することができる。
【０１４０】
一般に、Ｋｏは≦１μＭであることが好ましく、ＦＡＣＳ分別に存在する剪断力の存在下に結合の保持を可能とする。好ましい態様において、細胞は非常な高速で分別される、例えば、その速度は毎秒約５,０００を超える分別事象、好ましくは毎秒約１０,０００を超える分別事象、特に好ましくは毎秒約２５,０００を超える分別事象、取分け好ましいのは、約５０,０００〜１００,０００を超える速度である。
【０１４１】
刺激および染色用に処理加工した細胞は、一般に緩衝液に取り込み、サイトメトリーに先立ち濾過する。細胞はＦＡＣＳＣＡＮ（ベオトン・ディキンソン・インク、レーザー線４８８nm）またはＭｏ−Ｆｌｏ（サイトメーション、インク、レーザー線３５０ｎＭ幅広いバンド（ＵＶ）、４８８nmおよび６４７nm）サイトメーターにより分析することができる。細胞は、所望により、Ｍｏ−Ｆｌｏにより分別する。
【０１４２】
細胞を顕微鏡使用により分析する場合、刺激または染色後の細胞は通常スライドガラスに載せ、ドーバースリップさせる。これらは倒立顕微鏡（すなわち、ＴＥ３００、ニコン）上、標準のＢＦＰ、ＦＩＴＣ、またはＴＲＩＴＣ（例えば）フィルターセットを用いる明視野および蛍光顕微鏡検査により直接可視化する。また、画像は倒立共焦点走査顕微鏡（ツアイス、インク、バイオ−ラッド、インク）により、標準のＦＩＴＣおよびＴＲＩＴＣ（例えば、）フィルターセットを用いることができる。
【０１４３】
分別により所望の性質を有する細胞の集団を得る。好ましい態様において、該パラメーターは細胞周期規制を調節する少なくとも１つの候補生物活性剤を同定するために設定する。
【０１４４】
好ましい態様においては、該生物活性剤を特徴づける。これは当業者の認める通りに進め、通常、活性剤の構造分析、同定、結合親和性および機能を包含する。一般に、同定すると、該生物活性剤は再合成され、標的細胞と合わせて、種々の条件下、また、他の種々の生物活性剤の存在下または不存在下に細胞周期規制変調を確認する。該生物活性は細胞周期規制を調節するために治療有効量を調製し、適切な医薬担体と合わせる。
【０１４５】
好ましい態様において、細胞集団は候補薬剤の存在下または不存在下に種々の実験条件に付すことができる。条件の変化はｐＨ、温度、緩衝液または塩濃度などであるが、これらに限定されるものではない。好ましい態様において、ｐＨは一般にｐＨの増減により、通常、約０.５ないし約３のｐＨ単位で変化させる。あるいは、温度の変更は、好ましくは、約５℃ないし約３０℃の上昇または下降により行う。同様に、塩濃度は、好ましくは、約０.１Ｍないし約２Ｍの増減により変更する。
【０１４６】
当業者は理解するところであるが、本明細書に提供されるアッセイの段階は順序を変えることができる。しかし、さらに理解し得ることは、種々の選択肢（選択された化合物、性質、または段階の順序について）が本明細書において提供される一方、その選択肢は、それぞれが個々に提供されるものであり、それぞれが本明細書に提供された他の選択肢から個々に分離されるものである。さらに、アッセイの感度を上げる技術上明瞭な既知の工程は、本発明の範囲内にある。例えば、さらには、洗浄工程、または分離、単離工程があってもよい。さらに理解されることは、ある場合には、検出が細胞内でのものであるが、培地中でも起こり得るものであり、その逆もある。
【０１４７】
好ましい態様において、細胞の表現型はエキソサイトーシスであり、本発明の方法と組成物はエキソサイトーシスの変化の検出を指向するものであって、再びＦＡＣＳ機器を使用する。そこには多くのパラメーターがあり、それを評価または検定してエキソサイトーシス経路での変化を検出し得るが、その検出は光分散、蛍光色素取込み、蛍光色素放出、顆粒暴露、表面顆粒酵素活性、および顆粒特異的タンパク質の量などを包含するが、これらに限定されるものではない。これらパラメーターの一つ以上を検定または測定することにより、エキソサイトーシスの変化のみならず、エキソサイトーシス経路の異なる段階での変化をも検出することが可能である。さらに、複数パラメーター分析は、共通事項、または検出される「偽陽性」を低下させる。この様式において、候補薬剤の迅速で正確なスクリーンが、エキソサイトーシスを調節する薬剤を同定するために実施し得る。
【０１４８】
好ましい態様において、本発明は細胞集団のエキソサイトーシスにおける変化をスクリーンする方法を提供する。エキソサイトーシスと関連する「変化」または「変調」が意味するのは、１個の細胞を他のもう１つの細胞に比較したときの、または同一細胞において異なる条件下に置いたときの、エキソサイトーシスの量の増減である。測定値はすべての条件が各測定値について同一である場合について、または様々な条件下に、生物活性剤の存在下または不存在下、またはエキソサイトーシス過程の異なる段階で決定することができる。例えば、エキソサイトーシスの測定値は細胞集団において、候補生物活性剤が存在する場合について、また、候補生物活性剤が存在しない場合について決定することができる。もう一つの例において、エキソサイトーシスの測定値は細胞集団の条件または環境が他のもう一つのものと異なる場合について決定される。例えば、細胞は、生理的シグナル、例えば、エキソサイトーシス誘発物質（すなわち、Ｃａ⁺⁺、イオノマイシンなど）、ホルモン、抗体、ペプチド、抗原、サイトカイン、成長因子、作用タンパク質、または他の細胞（すなわち、細胞−細胞接触）などの存在下または不存在下に評価してもよい。他の例において、エキソサイトーシスの測定値はエキソサイトーシス工程の異なる段階で定量する。さらに他の例において、エキソサイトーシスの測定値は、条件が同じで、その変化が１個の細胞または細胞集団、およびもう一つの細胞または細胞集団の間にある場合について測定する。
【０１４９】
本明細書において「細胞集団」とは、上記定義の細胞のサンプルを意味する。この態様において、細胞は、好ましくは（要件ではない）、急速に増殖し、レトロウイルスに感染性であり、かつ、色素および抗体と適合し得るものである。この態様において使用する好ましい細胞型は、これらに限定されるものではないが、肥満細胞、神経細胞、副腎クロム親和性細胞、好塩基球、膵臓β細胞を含む内分泌細胞、外分泌細胞を含む膵臓腺房細胞、好中球、単球、リンパ球、乳房細胞、精子、卵子細胞とＰＭＮ白血球、内皮細胞、脂肪細胞、および筋肉細胞などを包含する。
【０１５０】
エキソサイトーシス法は細胞の少なくとも３種の性質における変化を検定することにより、ＦＡＣＳ機器において細胞を分別することからなるが、その性質は光分散、蛍光色素取込み、蛍光色素放出、顆粒暴露、表面顆粒酵素活性および顆粒特異的タンパク質の量からなる群から選択される。好ましい態様において、各測定値は細胞が複数レーザーのビーム経路を通過する際に、個々の細胞から同時に決定される。あるいは、測定は連続的になされる。エキソサイトーシスまたはエキソサイトーシスにおける変化を検出するたの１種以上のパラメーターを使用することにより、共通事項を減少させ、特異的性を高める。所望性質のパラメーターに合致する細胞を、所望パラメーターに合致しない細胞から物理的に分別することができるか、またはそれらの細胞は細胞集団中の百分比により同定することができる。
【０１５１】
好ましい態様において、光分散の変化を検定し、細胞集団中のエキソサイトーシス変化を定量する。ＦＡＣＳで検視するとき、細胞はその前方および９０度（側面）への光分散性により測定される特別な性質をもつ。これらの分散性は細胞の大きさ、形および顆粒含量を示している。プロ−エキソサイトーシス刺激により細胞を活性化すると、細胞の前方および側面光分散性双方が相当に変化する。これらの性質はエキソサイトーシス事象に対する読み出し値として測定されるべき２つのパラメーターとみなされる。これらの性質は細胞のエキソサイトーシスの度合いに比例して変化し、同様に経時的エキソサイトーシス事象に依存する。光分散強度の変化、または細胞屈折率の変化は、異なる時点で同じ細胞において、または異なる条件下または候補生物活性剤の存在下もしくは不存在下に同じ細胞に比較して、あるいは異なる細胞または細胞集団に比較して、エキソサイトーシスの変化を示すものである。
【０１５２】
本明細書に提供した一態様において、細胞集団はエキソサイトーシスを刺激することが知られている薬剤と合わせ、光分散性を定量する。望ましいエキソサイトーシス活性を示す光分散性の細胞を同定および／または分別し得る。本明細書にて使用するエキソサイトーシス活性とは活性を欠く場合も包含する。好ましい態様において、候補生物活性剤はエキソサイトーシス刺激に先立ってまたは同時に細胞集団と併合する。より詳しくは下記に概説する。この態様において、光分散性が、ａ）既知のエキソサイトーシス刺激剤および候補生物活性剤と合わせた細胞集団と、ｂ）候補生物活性剤が存在しない場合の既知エキソサイトーシス刺激剤と合わせた細胞集団と、で相違する場合、候補生物活性剤はエキソサイトーシスを調節すると決定することができる。ある場合には、エキソサイトーシスを誘導する生物活性剤を同定するために、エキソサイトーシスの阻害剤を含ませるか、またはエキソサイトーシス刺激剤を排除することが望ましいこともある。好ましくは、光分散性は、エキソサイトーシス活性を示す少なくとも１つ、好ましくは他の２つの性質と合わせて測定する。一般的な光分散測定についての方法は、さらに以下の文献に記載されている：Perretti, et al., J. Pharmacol. Methods, 23 (3) 187-194 (1990)およびHide et al., J. Cell Biol., 123 (3) 585-593 (1993)（出典明示により両文献を本明細書の一部とする）。一般に、ベースラインから少なくとも約５％の変化が好ましく、より好ましくは少なくとも約２５％であり、特に好ましくは少なくとも約５０％であり、そして取分け好ましいのは少なくとも約７５％ないし１００％である。この場合のベースラインとは、エキソサイトーシス刺激前の細胞の光分散性を一般に意味する。本明細書に提供した各事例において、ベースラインは対照のパラメーターについて設定してもよい。例えば、ベースラインは特定細胞、異なる条件下での類似細胞のエキソサイトーシス測定にて、またはエキソサイトーシスの際の特定時点において設定してもよい。
【０１５３】
もう一つの好ましい態様においては、蛍光色素取込みの変化を評価する。好ましい蛍光色素はスチリル色素であり、これはエンドサイトーシスに関連してエキソサイトーシス活性を示す色素であり、場合により共役エンドサイトーシスという。共役エンドサイトーシスを支持する理論は、エキソサイトーシスを受ける細胞は細胞容積と膜の完全性を維持するために、エンドサイトーシスをも受けなければならないということである。このように、エキソサイトーシスの刺激に基づき、エンドサイトーシスも増大し、スチリル色素取込み量を定量することにより間接的なエキソサイトーシス測定値を得る。
【０１５４】
本明細書にて提供される態様においては、細胞はスチリル色素溶液に漬け、プロ−エキソサイトーシス刺激剤により刺激し、色素を定量する。好ましくは、エキソサイトーシス刺激の後、細胞を遠心し、吸引し、新たな緩衝液に再懸濁する。好ましい態様において、候補生物活性剤は本明細書に記載のように細胞と合わす。ある事例において、候補生物活性剤はエキソサイトーシスの阻害剤をもつ細胞と、またはプロ−エキソサイトーシス刺激剤をもたない細胞と合わせることができる。好ましくは、プロ−エキソサイトーシス刺激剤は細胞集団に加えるが、この集団では色素の蛍光シグナルが劇的に増大するに至る。細胞関連のシグナル増大はスチリル色素の共役エンドサイトーシスによるものであり、時間と強度においてエキソサイトーシス応答に比例する。逆に、このシグナルはエキソサイトーシスが阻害されるか、または誘導されなければ増大しない。変化は、異なる時点で、または異なる細胞集団において蛍光を測定し、その測定値を互いにまたは標準値に比較して定量する。一般に、ベースラインから少なくとも約５０％の変化が好ましく、より好ましくは少なくとも約７５％〜１００％であり、特に好ましくは少なくとも約２５０％であり、そして取分け好ましいのは少なくとも約１０００％〜２０００％である。この場合のベースラインとは、エキソサイトーシス刺激前の細胞のスチリル色素取込みを意味する。
【０１５５】
好ましいスチリル色素は、ＦＭ１−４３、ＦＭ４−６４、ＦＭ１４−６８、ＦＭ２−１０、ＦＭ４−８４、ＦＭ１−８４、ＦＭ１４−２７、ＦＭ１４−２９、ＦＭ３−２５、ＦＭ３−１４、ＦＭ５−５５、ＲＨ４１４、ＦＭ６−５５、ＦＭ１０−７５、ＦＭ１−１８、ＦＭ９−４９、ＦＭ４−９５、ＦＭ４−５９、ＦＭ９−４０、およびその合わせなどを包含するが、これらに限定されるものではない。ＦＭ１−４３などの好ましい色素は水中で僅かに蛍光性であるが、膜と会合した場合には非常に蛍光性であり、その結果、色素の取込みが容易に識別できる。適切な色素は市販入手可能である。すなわち、モレキュラー・プローブ・インク、ユージン、オレゴン、「蛍光性プローブと研究試薬の便覧」第６版、１９９６、特に第１７章、およびより詳しくは、第１７章、第２項（参照関連の章を含む）（出典明示により本明細書の一部とする）。好ましくは、色素は溶液として提供されるが、色素濃度は約２５ないし１０００〜５０００ｎＭであり、好ましくは約５０ないし約１０００ｎＭであり、特に好ましくは約５０ないし２５０である。スチリル色素の使用はさらに、Betz, et al., Current Opinion in Neurobiology, 6: 365-371 (1995) （出典明示により本明細書の一部とする）に記載されている。好ましくは、蛍光色素取込みは、少なくとも１種のエキソサイトーシス活性の指示薬、好ましくは２種の他の指示薬と合わせて測定する。
【０１５６】
もう一つの好ましい態様においては、蛍光色素放出の変化を評価する。本発明は、通常リソゾームの染色に使用される低ｐＨ濃度色素が、低ｐＨでエキソサイトーシス顆粒を染色するという発見に一部向けられる。一般に、これらの色素は受動的に細胞により取込まれ、顆粒中に濃縮される；しかし、細胞は色素を取込むように、すなわち、共役エンドサイトーシスにより誘導される。好ましい態様においては、細胞集団を低ｐＨ濃度色素に浸け、細胞が色素を取込むようにする。好ましくは、細胞を洗浄する。細胞はプロ−エキソサイトーシス刺激剤および／または阻害剤に暴露することができる。好ましい態様において、候補生物活性剤は細胞集団および、好ましくは、プロ−エキソサイトーシス刺激剤と合わせる。蛍光を評価する。細胞間のまたは同一細胞内での異なる時点での蛍光色素放出の変化はエキソサイトーシスの変化を示す。好ましくは、この変化は、細胞間、最も好ましくは添加した異なる生物活性剤をもつ細胞間にある。一般に、ベースラインから少なくとも約５％の変化が好ましく、より好ましくは少なくとも約２５％であり、特に好ましくは少なくとも約５０％であり、そして取分け好ましいのは少なくとも約１００％である。この場合のベースラインとは、刺激前の細胞中の色素量を一般に意味する。
【０１５７】
この態様において、低ｐＨ濃度色素が好ましい。かかる低ｐＨ濃縮色素は、アクリジン・オレンジ、リソトラッカー（LYSOTRACKER）（商標）レッド、リソトラッカー（商標）グリーン、およびリソトラッカー（商標）ブルーなどであるが、これらに限定されるものではない。かかる色素は市販入手可能である。すなわち、上記モレキュラー・プローブからであり、特に、第１７章、第１７章の第４項、および引用された「関連の章」、すなわち、第２３章である。好ましい態様において、該色素は溶液で投与するが、その場合の色素濃度は約５０ｎＭないし約２５μＭであり、好ましくは約５μＭないし約２５μＭであり、そして特に好ましくは約１ないし５μＭである。低ｐＨ濃度色素の使用については、Haller, et al., Cell Calcium, 19 (2): 157-165 (1996)（出典明示により本明細書の一部とする）に一般的に記載されている（リソゾームの研究に関して）。
【０１５８】
蛍光色素放出の変化を評価する場合の替わり得る態様においては、上清に放出された蛍光を評価する。この態様においては、エンドサイトーシスした膜を可逆的に標識するスチリル色素、または低ｐＨ濃度色素のいずれかを使用する。この態様においては、色素が細胞中に受動的にまたは誘導により取込まれるように、細胞集団を色素に浸ける。次いで、細胞を好適に洗浄する。細胞はプロ−エキソサイトーシス刺激剤および／または阻害剤に、また任意には候補生物活性剤に暴露することができる。プロ−エキソサイトーシス刺激剤に暴露する細胞は細胞外培地に色素を放出する。培地中の蛍光は測定または検出することができる。この過程はある場合に細胞の脱染という。任意には、培地中色素の検出を改善および容易にする薬剤が添加されてもよい。例えば、ミセル形成洗剤、例えば、３−［（３−クロラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパン硫酸塩（ＣＨＡＰＳ）は蛍光を増加させて、少量のエキソサイトーシス活性の検出を可能とする。色素放出の変化は、同一細胞内での、細胞間での、また、最も好ましくは、添加された異なる生物活性剤をもつ細胞間でのエキソサイトーシスの変化を示すものである。一般に、ベースラインから少なくとも約５％の変化が好ましく、より好ましくは少なくとも約２５％であり、特に好ましくは少なくとも約５０％であり、そして取分け好ましいのは少なくとも約１００％である。この場合のベースラインとは、エキソサイトーシス刺激前の色素の放出を意味する。好ましくは、培地中で測定する場合の色素放出は、少なくとも１種の他のエキソサイトーシス指示薬の評価と合わせる。
【０１５９】
好ましい態様においては、顆粒暴露での変化を定量する。顆粒はエキソサイトーシスの間、培地に暴露する、すなわち、顆粒は細胞膜と融合し、その内容物を暴露し／放出する。したがって、顆粒暴露はエキソサイトーシス活性を示すものであり、それが欠如することはエキソサイトーシスが誘導されなかったか、または阻害されたことを示す。好ましくは、顆粒暴露は顆粒に特異的的に結合する検出可能な薬剤により検出される。本明細書で使用される検出可能な薬剤の例は、アネキシンＶであるが、これは二価イオン依存性様式でリン脂質（ホスホチジルセリン）に特異的的に結合するタンパク質ファミリーの一員である。このタンパク質は、ホスホチジルセリンの細胞表面露出がこの過程の折り紙付き初期シグナルであるため、アポトーシス（プログラムされた細胞死）の測定に広く使用されている。驚くべきことに、アネキシンＶは、分泌過程でエキソサイトーシス顆粒が細胞表面に暴露されるとエキソサイトーシス顆粒に特異的的に結合するということが決定されている。細胞の内部にある顆粒は標識されない。アネキシンＶのこの性質は、エキソサイトーシス依存性結合に基づく単一のエキソサイトーシスアッセイを創製するために、使用される。細胞のエキソサイトーシス刺激により、細胞は時間と強度においてエキソサイトーシス応答に比例してアネキシン結合および蛍光シグナルの増加を示す。
【０１６０】
この態様において、アネキシンは直接または間接的に標識し、細胞集団と合わせる。アネキシンは市販品として入手できる。すなわち、ファーミンゲン、サンジエゴ、カリフォルニア、またはカルタック・ラボラトリー、ミルブラエ、カリフォルニアから入手できる。好ましくは、アネキシンは溶液として提供し、その場合のアネキシン濃度は約１００ng／mlないし約５００ng／mlであり、より好ましくは約５００ng／mlないし約１μg／mlであり、最も好ましくは約１μg／mlないし約５μg／mlである。好ましい態様において、アネキシンを直接標識する。例えば、アネキシンは蛍光発色団、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、アレキサ（Alexa）色素、ＴＲＩＴＣ、ＡＭＣＡ、ＡＰＣ、トリカラー、Ｃｙ−５、および技術上既知または市販入手可能な他の発色団などで標識することができる。替わり得る好ましい態様において、アネキシンは第一標識、例えば、ビオチンなどのハプテンで標識し、また、第二蛍光標識には蛍光ストレプトアビジンなどを使用する。他の第一および第二標識対は当業者が認めるように使用することができる。
【０１６１】
好ましい態様において、細胞は正常にエキソサイトーシスを引起す条件に付す。任意に、候補生物活性剤が細胞に加えられる。ある事例では、候補薬剤が阻害を逆転し得るかどうかを決めるためにエキソサイトーシスの阻害剤を包含させること、または該薬剤がエキソサイトーシスを誘導するどうかを決めるためにエキソサイトーシス刺激剤なしに候補生物活性剤を加えることが望ましい。細胞は、好ましくは洗浄し、蛍光を顕微鏡で、またはフローサイトメーター上で検出する。アネキシン結合の検出における変化は、同一条件下で、および／またはそれと併用した薬剤の存在下、同一細胞内での、または異なる細胞間でのエキソサイトーシスの変化を示している。一般に、ベースラインから少なくとも約２５％の変化が好ましく、より好ましくは少なくとも約５０％であり、特に好ましくは少なくとも約１００％であり、そして取分け好ましいのは少なくとも約５００％である。この場合のベースラインとは、エキソサイトーシス刺激前のアネキシン結合量を意味する。
【０１６２】
もう一つの好ましい態様において、顆粒暴露はベルベリンまたはルテニウムレッドなどのカチオン性色素により検出する。かかるカチオン性色素は分泌顆粒を特異的的に染色する。このように、エキソサイトーシスが生じ、分泌顆粒が細胞表面で暴露されるとき、蛍光の増大が検出される。好ましい態様において、カチオン性色素はエキソサイトーシス刺激剤および／または阻害剤の存在下または不存在下に、任意には、候補生物活性剤の存在下または不存在下に細胞集団と合わせる。特に好ましい態様においては、候補生物活性剤がエキソサイトーシス活性を調節し得るかどうかを決めるために、ベルベリンを細胞とエキソサイトーシス刺激剤と候補生物活性剤と合わせる。好ましくは、細胞を洗浄し、次いで、蛍光を定量する。好ましい態様において、カチオン性色素の評価は少なくとも１種の他のエキソサイトーシス指示薬の評価と合わせる。色素は技術上知られているとおりに細胞と合わせる。ベルベリンについて記載する一般的な方法論は、Berlin and Enerback, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., 73 (3): 256-262 (1984)（出典明示により本明細書の一部とする）に記載されている。一般に、ベースラインから少なくとも約５％の変化が好ましく、より好ましくは少なくとも約２５％であり、特に好ましくは少なくとも約５０％であり、そして取分け好ましいのは少なくとも約１００％である。この場合のベースラインとは、刺激前の色素結合量を意味する。
【０１６３】
同様に、ＣｏｎＡ−ＦＩＴＣを使用することができるが、その理由は本明細書に概括したと同様の様式で、それが顆粒タンパク質上の炭水化物に結合するからである。
【０１６４】
もう一つの好ましい態様においては、表面顆粒酵素活性の変化を定量する。分泌顆粒はエキソサイトーシス過程の一部として放出されるプロテアーゼおよびグリコシダーゼなどの酵素を含んでいる。多くの場合、これらの酵素は、低ｐＨのために顆粒内で不活性であるが、生理的ｐＨの細胞外培地に曝されると活性化する。これらの酵素活性は細胞外培地成分としての色原体または発蛍光体基質を用い測定することができる。これは様々な方法でエキソサイトーシス細胞の検出を可能とする。
【０１６５】
一態様において、ある場合に本明細書では集団に基づく酵素アッセイと呼ぶが、色原体または発蛍光体基質の切断を経てのシグナル生成を培地中で定量することができる。すなわち、培地中検出可能な反応生成物の量は、存在する酵素量、すなわち、エキソサイトーシスの量に関係する。この態様において、検出可能となるのは培地であって、細胞ではない。
【０１６６】
好ましい態様において、細胞はエキソサイトーシス刺激剤、任意には候補生物活性剤に付される。色原体または発蛍光体基質を培地に加え、酵素が細胞外基質を切断する際のシグナルの変化を評価する。
【０１６７】
替り得る好ましい態様において、ある場合に本明細書では「インシトゥ酵素学的アッセイ」と呼ぶが、切断により沈殿する発蛍光体基質を使用する。すなわち、エキソサイトーシスにより相当量の酵素活性が会合した細胞／顆粒に残存し、活性部位で沈殿する蛍光基質を用い可視化することができる。例えば、ＥＬＦ−９７グルクロニドなどのグルクロニダーゼの基質はエキソサイトーシス細胞上に沈殿するが、休止細胞には沈殿せず、その結果、細胞は蛍光の増大を示すことができる。蛍光はエキソサイトーシスの直接の測定値であり、開口分泌した酵素のｐＨ最適化を反映して、ｐＨ依存性である。この方法はまたその酵素プロフィールに基づいて顆粒の異なるサブタイプを識別する方法を提供する。
【０１６８】
好ましい態様において、細胞集団はエキソサイトーシス刺激剤に付され、次いで検出可能な基質とインキュベートする。候補生物活性剤を任意に加える。細胞を洗浄し、次いで、顕微鏡またはフロー・サイトメーターで観察する。
【０１６９】
好ましい顆粒酵素は、キマーゼ、トリプターゼ、アリールスルファターゼＡ、ベータ−ヘキソサミニダーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、およびベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼなどを包含するが、これらに限定されるものではない。基質はＥＬＦ−９７グルクロニド、Ｎ−アセチル−ベータ−Ｄ−グルクロニド、ペプチドに共役したＥＬＦ−９７などであり、その多くが市販購入可能である。すなわち、上記モレキュラー・プローブからであり、特に、第１０章、より詳しくは第１０章の第２項、および引用された「関連の章」である。
【０１７０】
検出可能な基質とは、基質が本明細書にさらに記載しているような蛍光分子を含んでなるか、あるいは基質または切断された基質に特異的的な蛍光分子、すなわち、蛍光抗体により検出し得るということを意味する。好ましい態様において、基質は２種類の蛍光タンパク質、すなわち、青色および緑色蛍光タンパク質（ＢＦＰおよびＧＦＰ）と他の同様の分子から形成された検出可能な分子を含んでなる。技術上知られるように、近接位置にあるこれら２種類のタンパク質を有するＧＦＰとＢＦＧの構築体は蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を可能とする。すなわち、ＧＦＰの励起スペクトルはＢＦＰの発光スペクトルに重なる。したがって、ＢＦＰを励起するとＧＦＰが発光する。もしプロテアーゼ切断部位をＧＦＰとＢＦＰの間に組込み、「ＦＲＥＴ構築体」を形成するなら、該構築体を切断する活性プロテアーゼにＦＲＥＴ構築体を暴露すると、ＧＦＰとＢＦＰ分子が別々に離れる。その結果、ＧＦＰの励起はＢＦＰ発光とＢＦＰ発光喪失に至る。
【０１７１】
好ましくは、ＦＲＥＴ構築体の２つの蛍光タンパク質間に挿入されたプロテアーゼ依存性切断部位は顆粒特異的酵素に特異的的である。このように、ＦＲＥＴ構築体は、ＦＲＥＴ構築体の切断部位に特異的的な顆粒特異的酵素の検出に使用し得る。この態様において、細胞または培地と合わされるプロテアーゼ基質はＦＲＥＴ構築体を包含する。ＦＲＥＴシステムは切断状態および未切断状態の検出可能分子の検出を可能とし、二者間を識別する。このシステムについては以下に記載されている：Xu et al., Nucleic Acid Res. 26 (8): 2034 (1998); and Miyawaki et al., Nature 388 (6645): 882-887 (1997) （出典明示により両文献を本明細書の一部とする）。
【０１７２】
細胞または培地に添加される基質の量は、酵素特異的活性および基質それ自体に部分的に依存するが、一般的には約２５０ｎＭないし約１ｍＭであり、好ましくは約１μＭないし約１００μＭであり、特に好ましくは約１μＭないし約１０μＭである。一般に、ベースラインから少なくとも約５％の変化が好ましく、好ましくは少なくとも約２５％であり、特に好ましくは少なくとも約１００％であり、そして取分け好ましいのは少なくとも約１０００％である。この場合のベースラインとは、エキソサイトーシス誘導前の基質切断量を意味する。
【０１７３】
好ましい態様において、顆粒特異的タンパク質量の変化が定量される。分泌顆粒は、これらタンパク質の特異的性により顆粒区画に特異的的に標的化されるタンパク質を含んでいる。エキソサイトーシス誘導により、顆粒特異的タンパク質は、その表面に露呈され、検出される。
【０１７４】
好ましい態様において、検出可能な顆粒特異的タンパク質は細胞集団と合わせて、エキソサイトーシスを誘導することの知られている条件に付される。任意には、候補生物活性剤は細胞集団および検出可能な顆粒特異的タンパク質と合わせ、顆粒特異的タンパク質を検出する。顆粒特異的タンパク質とは、ＶＡＭＰおよびシナプトタグミンなどであるが、限定されない。また、顆粒特異的タンパク質の定義に含まれるものとして、エキソサイトーシスに際し放出される調節物質、例えば、セロトニン、ヒスタミン、ヘパリン、ホルモンなどがあるが、これらに限定されない。
【０１７５】
顆粒タンパク質の定量は数種の方法で実施し得る。一態様においては、顆粒特異的タンパク質に対する標識抗体（蛍光性抗体など）を使用する。他の態様においては、細胞は顆粒タンパク質と検出可能な分子からなる融合タンパク質を含むように加工調製する。好ましい態様において、検出可能な分子を検出のために細胞に加える。例えば、直接または間接に標識した抗体のいずれかを使用することができる。好ましい態様では第一標識抗体、好ましくは蛍光標識抗体を用いる。もう一つの態様では第一および第二標識体、例えば、標識した第二抗体を用いる。一般にこの態様では、顆粒タンパク質に特異的的に結合する薬剤または直接もしくは間接に標識し得る化合物を使用することができる。
【０１７６】
好ましい態様において、標識体は細胞中に組入れるように加工する。例えば、組換えタンパク質は、顆粒特異的タンパク質と検出可能な分子との融合タンパク質であり、細胞集団に導入する。これは一般に顆粒特異的タンパク質と検出可能な分子とからなる融合タンパク質をコードする融合核酸で細胞を形質転換することにより実施される。これは一般に技術的に知られたとおりに実施するが、細胞型に依存する。一般に、哺乳動物細胞については、レトロウイルスのベクターおよび方法が好ましい。
【０１７７】
融合タンパク質は技術上既知の方法により構築される。例えば、顆粒特異的タンパク質をコードする核酸が検出可能分子と共に結合される。本明細書において検出可能な分子とは、検出可能な分子含む細胞または化合物を、この分子を含まない細胞または化合物と識別し得る分子を意味する。、すなわち、ある場合に抗原ＴＡＧと称されるエピトープまたは蛍光分子である。好ましい蛍光分子は、ＧＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰ、およびルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼを含む酵素などを包含するが、これらに限定されない。これらの構築体は、エキソサイトーシスに際し、顆粒に対し内部にあるエピトープが細胞表面に露呈され、そのため検出可能となるような様式で調製することができる。エピトープは、好ましくは検出可能なペプチドであるが、一般には細胞質膜上に見出されない。しかし、ある場合には、そのエピトープが細胞上に正常に見出されるならば、増加が検出され得るが、これは一般的に好ましいことではない。
【０１７８】
好ましい態様において、融合タンパク質または検出可能な顆粒特異的タンパク質を含む細胞集団は、エキソサイトーシス条件に付される。任意に、候補生物活性剤および／またはエキソサイトーシス阻害剤が含まれる。好ましくは、細胞を洗浄する。細胞上の蛍光を検出する。一般に、ベースラインから少なくとも約５％の変化が好ましく、より好ましくは少なくとも約２５％であり、特に好ましくは少なくとも約５０％であり、そして取分け好ましいのは少なくとも約１００％である。一般に、この場合のベースラインとは、エキソサイトーシス刺激前の蛍光量を意味する。
【０１７９】
本発明においては、エキソサイトーシスの同じ特性が複数のパラメーターにより評価され、その結果、共通事項が低下し、特異的性が上昇する。それに対し、ＦＡＣＳは、従来２つの異なるまたは無関係の特性を同時に評価するために使用されていたが、これら２つの特性をもつ細胞を同定するが、合わされた特性に対する共通事項を低減させない。しかし、本発明は複数のエキソサイトーシス性の同定に加えて、上に概説したように、他の細胞性パラメーターの同定と合わせることができる。
【０１８０】
好ましい態様において、細胞は正常にエキソサイトーシスを引起す条件に付される。プロ−エキソサイトーシス薬剤は、イオノマイシン、Ｃａ⁺⁺、イオノホア（イオノマイシン、ＡＺ３１８７）、化合物４８／８０、サブスタンスＰ、補体Ｃ３ａ／Ｃ５ａ、トリプシン、トリプターゼ、インシュリン、インターロイキン−３、特異的ＩｇＥ、アレルゲン、抗ＩｇＥ、または抗ＩｇＧ受容体抗体などを包含する。これらは技術上知られているように、一般に１ピコモルないし１０μＭの範囲で、化合物に依存する濃度で提供される。ある事例では、エキソサイトーシスを阻害する薬剤と細胞を合わせることが望ましい。エキソサイトーシス阻害剤はウオートマンニン（Wortmannin)、ジェネスタイン（Genestein)およびその他技術上既知のものであるが、これらに限定されるものではない。
【０１８１】
好ましい態様において、本方法はエキソサイトーシスを調節する能力に対し候補生物活性剤を選抜するために使用する。候補生物活性剤はエキソサイトーシス刺激の前、途上または以後に細胞集団と合わせるが、刺激前が好ましい。ある場合には、エキソサイトーシスが誘導されない場合またはエキソサイトーシスが阻害される場合の細胞について、本明細書では「候補薬剤」とも称する候補生物活性剤の効果を定量することが望ましい。候補生物活性剤は外因性に細胞集団に加えてもよいし、またはさらに本明細書に記載するように細胞に導入してもよい。
【０１８２】
好ましい態様においては、細胞周期アッセイについての上記のように、異なる候補生物活性剤のライブラリーを使用する。
上記のように、候補生物活性剤は細胞または細胞集団に合わせるか添加する。さらに、上に概説したように、好ましい態様では核酸候補薬剤および融合パートナーを利用する。好ましくはレトロウイルス構築体である。
【０１８３】
候補薬剤が核酸である場合、技術上既知の方法、例えば、リン酸カルシウム、エレクトロポレーション、およびインジェクションがこれらを細胞に導入するために使用される。エキソサイトーシス刺激剤は一般に生理的条件下に細胞と合わせる。インキュベーションは最適活性を容易にする温度、一般には４℃と４０℃の間の温度で実施する。インキュベーション時間は最適活性のために選定するが、迅速で高処理量のスクリーンを容易にするために最適化してもよい。
【０１８４】
上記のように、様々な他の試薬がアッセイに含まれてもよく、細胞は上記のように分別される。分別の結果として所望のエキソサイトーシス細胞集団を得る。好ましい態様においては、エキソサイトーシスを調節する少なくとも１種の候補生物活性剤を同定するために、パラメーターを設定する。
【０１８５】
好ましい態様において、生物活性剤が特性化される。これは当業者の認識どおりに進めるが、通常、薬剤の構造分析、同定、結合親和性および機能を包含する。一般に、同定すると、該生物活性剤は再合成され、標的細胞と合わせて、種々の条件下、また、他の種々の薬剤の存在下または不存在下にエキソサイトーシスの変調を確認する。該生物活性剤は、エキソサイトーシスを調節するために治療有効量で調製され、適切な医薬担体と組み合わされる。
【０１８６】
好ましい態様において、細胞集団は、候補薬剤の存在下または不存在下に、また、エキソサイトーシス刺激または阻害の存在下または不存在下に、様々の実験条件に付される。条件の変化はｐＨ、温度、緩衝液または塩濃度などであるが、これらに限定されない。好ましい態様において、ｐＨは、一般にｐＨの増減により、通常、約０.５ないし約３のｐＨ単位で変化させる。あるいは、温度の変更は、好ましくは、約５℃ないし約３０℃の上昇または下降により行う。同様に、塩濃度は、好ましくは、約０.１Ｍないし約２Ｍの増減により変更する。
【０１８７】
好ましい態様において、調節すべき細胞の表現型は小分子（または他の候補薬剤）の毒性である。これらは一般に上に概説したように、細胞生存能アッセイに対するものである。小分子の用量応答は、最大機能応答保有の細胞を比較し、次いで、そこに多少ともこれらの細胞と会合する毒性があるか否かを見直すことで比較することも可能である。
【０１８８】
好ましい態様において、細胞の表現型は細胞表面受容体の発現または活性に関与する。１６種までの細胞表面マーカーを同時に追跡することが可能であるが、好ましいのは８種までである。特定の細胞表面マーカーの存在または不存在は、どの細胞表面発現が研究対象細胞と会合した重要な機能パラメーターを反映しているか、いずれかの細胞表面タンパク質に対する、直接またな間接に会合した抗体により検出することができる。小分子などの候補薬剤の効果は、次いで個々のまたは複数のマーカーについて試験することができる。
【０１８９】
好ましい態様において、細胞の表現型は、一次測定と同時に起こる、または一次測定の結果である、生物事象を伝え得る蛍光ベースのリポーターシステムなど、酵素の発現または活性に関与する。このリポーターシステムは、細胞質における活性な上流シグナル伝達経路の、または核内転写もしくは翻訳事象並びに核もしくは細胞からの輸出事象の読み出しである。
【０１９０】
好ましい態様において、細胞の表現型は、二量化などのタンパク質−タンパク質相互作用（または他の結合リガンド間の相互作用）に関与し、それが候補薬剤により中断または刺激される。これらの事象は２つの標識化した結合リガンド間のＦＲＥＴの出現または消失により測定し得る。
【０１９１】
以下の実施例は、上記本発明の使用方法につきさらに詳細に説明し、同様に本発明の様々な局面を実施するために期待される最良の形態を明らかにするものである。これらの実施例は、如何なる意味でも本発明の真の範囲を制限するものではなく、むしろ説明を目的として提供されるものである。本明細書に引用した文献はすべて出典明示により本明細書の一部とする。
【０１９２】
（発明を実施するための最良の形態）

【実施例】
実施例１：
正対照としてｐ２１を用いる細胞周期アッセイ
材料および方法：ベクター構築
ｐ２１遺伝子のコード領域を、開始メチオニンを含む上流領域のプライマー
【化３９】

およびＣ末端
【化４０】

を用いるＰＣＲによるジャカット（Jurkat）ｃＤＮＡからクローンとして発生させた。
【０１９３】
シングルＰＣＲ産物を、ＣＲＵ５−ＧＦＰレトロウイルスベクター（Rigel，IInc.）中で、プライマー内のフランキングＢｓｔＸＩ部位から直接クローンとして発生させた。この得られた構築体、ＣＲＵ−ＧＦＰ−ｐ２１Ｆは、Ｃ末端位置でＦＬＡＧ−エピトープと２位の位置でＧｌｙ挿入を伴うヒトｐ２１タンパク質と融合した（フレーム内）ＧＦＰをコードする（図１）。ｐ２１のＣ-末端の２４個のアミノ酸を、ＰＣＲプライマー：
【化４１】

内のフランキングＢｓｔＸＩ部位から、ＣＲＵ５−ＧＦＰレトロウイルスベクター（Rigel,Inc.）中でクローンを発生させた。得られた構築体、ＣＲＵ５−ＧＦＰｐ２１Ｃ(図１)は、Ｃ末端で
【化４２】

およびＦＬＡＧ−エピトープに関するインフレームを融合したＧＦＰをコードした。３つのアラニンの変異を有するｐ２１のＣ末端２４個のアミノ酸を、ＰＣＲプライマー：
【化４３】

内のフランキングＢｓｔＸＩ部位を通じてＣＲＵ５−ＧＦＰ中でクローンを発生させた。得られた構築体、ＣＲＵ５−ＧＦＰｐ２１Ｃmut(図１)は、Ｃ末端で
【化４４】

（変異部位は下線を付した）およびＦＬＡＧ−エピトープに関するインフレームを融合したＧＦＰをコードした。
【０１９４】
レトロウイルス形質転換；1.５ml ＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）において１０⁶細胞で、フェニックス(Phoenix)Ｅ細胞を、６ウェルプレート中でまき、１６時間３７℃でインキュベートした。ＣａＣｌ₂沈殿トランスフェクションを、５０μMクロロキンの存在下、８時間３７℃で、ＣＲＵ５−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターまたはＣＲＵ５−ｐ２１Ｆ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰクローンで行った（２μlＤＮＡ（１μg／μl）、３０.５μｌ、２Ｍ ＣａＣｌ₂、２１７.５μｌＨ₂Ｏ、０.５ml）。トランスフェクション培地を、除去し、２mlの完全なＤＭＥＭで置換し、該細胞をさらに１６時間、３７℃でインキュベートした。該培地を、１.５mlの完全なＲＰＭ１（ＲＰＭ１＋１０％ＦＢＳ＋Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）にかえて、４８時間、３７℃でインキュベートした。トランスフェクションしたプレートからのウイルス上清を、濾過し（０.４５μm）、６ウェルプレートに移した。異所性受容体を発現するジャカットＴ細胞（JurkatE）の１００μl数（５×１０⁶細胞）を各ウエルに添加した。ポリブレンを終濃度０.５μg／mlで添加した。該プレートをパラフィルムで密封し、２５００rpmで、９０分間、３２℃で遠心分離した。パラフィルムを除去し、該プレートを３７℃でインキュベートした。培地を、１６時間後に、４mlの完全ＲＰＭ１に替え、７２時間、３７℃でインキュベートした。
【０１９５】
細胞周期のＦＡＣＳ−アッセイ
レトロウイルスベクター形質転換細胞を集め、完全ＲＰＭ１中に１０⁵細胞／mlで再懸濁した。４μMＰＫＨ２６細胞のトラッキング色素（Sigma）のある容積（１ml）を細胞に添加し、５分、２５℃でインキュベートした。該懸濁液を、５倍希釈し、該細胞を４００×g、１０分、２５℃で集めた。該細胞を、さらに６mlの完全ＲＰＭ１で２回洗浄し、６ウェルプレート中で、３×１０⁵細胞／mlで、７２時間インキュベートした。標識した細胞を集め、５μg／mlのヘキスト（Hoechst）33342(分子プローブ)を含む完全ＲＰＭ１中、１０⁶細胞／mlで再懸濁し、２時間３７℃でインキュベートした。染色細胞を集め、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ／０.５％ＦＣＳ／５μg／ml ヘキスト33342）中で、＞１０⁶細胞／mlで再懸濁した。該細胞を、３つのレンズを有するMoFloフロー・サイトメトリー分析に供し、前方、側面の分散を４８０nm系のアルゴンレーザーによって誘因し、分散光を分散前方の検出器および４８０nmバンドパスフィルターで集めた。ＧＦＰを４８０nm系のアルゴンレーザーによって励起させ、５３０nmバンドパスフィルターから分散光を集めた。ＰＫＨ２６細胞のトラッキング色素を５３３nm系のＨｅＮｅ−レーザーによって励起させ、５７０nmバンドパスフィルターから分散光を集めた。ヘキスト33342色素を、ＵＶレーザーによって励起し、分散光を４５０nmバンドパスフィルターから集めた。
【０１９６】
結果
ジャカットＴ細胞を、ＧＦＰに融合したヒトｐ２１（Ｇｐ２１）をコードするレトロウイルスベクター、またはＰＣＮＡ結合Ｃ末端の２４アミノ酸（Ｇｐ２１Ｃ）を用いて形質導入した（図１）。ｐ２１Ｃ末端の２４個のアミノ酸の非ＰＣＮＡ結合変異体型[GP21Cmut、Cyrol et al.,Oncogene 16:311（1998）]は、負の対照として働く。形質導入したｐ２１の発現は、ウエスタンブロッティングによるＦＬＡＧ−エピトープにより内生タンパク質と区別することができる（示さない）。融合タンパク質の発現は、ＦＡＣＳにおいてＧＦＰ蛍光によって示された（図２Ｂ）。
形質導入細胞を細胞追跡化合物ｐｋｈ２６で標識した。この化合物は赤色蛍光脂肪族分子を細胞膜中に導入し、選択的な分割よって細胞周期と蛍光強度との相関関係を明かにする：拘束細胞は細胞追跡色素の明るさを保つ：細胞周期中の細胞はシグナルが薄くぼんやりいる。図２Ｃで示したように、ＧＦＰ上に捕捉された生存ＧＦＰ−ｐ２１発現細胞は、同一ＧＦＰレベルを発現するベクター形質導入細胞よりも強い赤色蛍光を示し、細胞周期の拘束を表す。同様の効果が、Ｇｐ２１Ｃ発現細胞で見られる。しかし、Ｇｐ２１Ｃｍｕｔは、非発現細胞と同一であった。同一のＧＦＰ捕捉細胞のＤＮＡ含量を、図２Ｄに示した。Ｇｐ２１発現細胞は、細胞周期のＧ１期で拘束され、Ｇｐ２１Ｃ発現細胞は、Ｇ１およびＧ２チェックポイント蓄積を示し、前記の結果と一致する（Wade Harper, et al., 1993;Cayrol etal., 1998）。Ｇｐ２１ｍｕｔ発現細胞は、通常の細胞周期分布を示す。存続可能の拘束発現細胞（３つの開始パラメーターを満たす）は、ＤＮＡ含量を基に別個のチャンバーに分別した：左屈曲(deflection)、Ｇ１；右屈曲、Ｇ２。
【０１９７】
実施例２
集団を基にしたエキソサイティック酵素活性測定
材料：全ての化学物質はSigma Chemical Co.から得た。色素およびグルクロニドは、Molecular Probes, Inc.から得た。細胞系ＭＣ−９およびＲＢＬ−２Ｈ３はAmerican Type Culture Collection(ATCC)から得た。細胞培養試薬はFisher Scientificから、そして分子生物学的試薬はClontech Inc.から得た。
【０１９８】
細胞培養：ＭＣ−９細胞を、フラスコ中に、Ｌ−アルギニン(１１６mg／ml)、Ｌ−アスパラギン(３６mg／ml)、ピルビン酸ナトリウム(１mM)、非必須アミノ酸(０.１mM)、葉酸(６mg／ml)、２−メルカプトエタノール(０.０５mM)、Ｌ−グルタミン(２mM)、熱不活性化ウシ胎児血清(１０％)および１０％Ｔ-stim条件培地(Collaborative Research, Inc.)を添加したDMEMを含む培地中の懸濁培養として維持した。細胞を０.２５から２×１０⁶／mlの間の密度に保った。実験はトリパンブルー除外で測定して９５％より大きい生存可能の細胞でのみ行った。ＲＢＬ−２Ｈ３細胞を、２mM Ｌ−グルタミンおよびＥａｒｌ’ｓ ＢＳＳ、１５％熱不活性化ウシ胎児血清を添加されたＥａｇｌｅｓ ＭＥＭを含む培地中の非被覆(組織培養処理)フラスコ上の接着培養として維持した。細胞を継代(０.０５％トリプシン)し、１日以上コンフルエントにならないようにした。
【０１９９】
エキソサイトーシス刺激プロトコール：実験を、ＮａＣｌ(１３７mM)、ＫＣｌ(２.７mM)、ＣａＣｌ₂(１.８mM)、ＭｇＣｌ₂(１mM)、グルコース(５.６mM)、Hepes(２０mM、ｐＨ７.４)およびウシ血清アルブミン(０.１％)から成る修飾タイロード緩衝液(ＭＴ中)で行った。ＭＣ−９細胞を４００×ｇで回転させ、培地を吸引した。次いで、細胞をＭＴで洗浄し、再回転／吸引し、５×１０⁶細胞／mlの濃度でＭＴに取りこませた。次いで、細胞をＤＭＳＯまたはイオン透過担体のいずれかで３０分(または時間経過の場合、時間を変える)処理した。次いで、酵素分析のために、細胞を回収した上清とペレット化した；ある場合、細胞はフローサイトメトリーのために処理した。全ての刺激は３７℃で行った。ＲＢＬ−２Ｈ３４細胞の刺激は、接着細胞を１回ＭＴで洗浄し、次いで刺激剤を含む温かいＭＴ(１ml／１０⁶細胞)の添加により行った。細胞を３７℃で３０分インキュベートし、上清を更なる分析のために回収した。実施例のいつくかにおいて(実施例４−６)、プレートに結合した細胞をアネキシンで染色し、次いで、フローサイトメトリーのための更なる処理のためにNo-Zyme(Collaborative Research, Inc.)を使用してフラスコから回収した。ＲＢＬ−２Ｈ３細胞の抗原架橋による刺激のために、細胞を、完全培地中で５０ng／mlの濃度のＩｇＥ抗-DNP(Sigma Chemical Co.)と一晩インキュベートした。翌日、それらをＭＴで一回洗浄し、ＤＮＰに結合したウシ血清アルブミンをを刺激剤として１００ng／mlの濃度で使用した以外、上記のように刺激した。
【０２００】
集団をベースにした酵素アッセイ：酵素アッセイを、エキソサイティック刺激に続いて細胞上清およびペレットで行った。細胞上清を刺激後に回収し、氷上で冷やし、５０００×ｇ回転後上清を回収して酵素活性分析をした。同様に、細胞ペレットを０.１％トリトンＸ−１００含有ＭＴ中に回収／融解させ、５０００×ｇ回転後上清を回収して酵素活性分析をした。各分析に関して、１００μlの融解物および上清を、２mM基質(４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄグルクロニド[グルクロニダーゼ基質]または４−メチルウンベリフェリルＮ−アセチルβ−Ｄグルコサミニド[ヘキソサミニダーゼ基質])を含む１００μlの反応緩衝液(４０mMクエン酸、ｐＨ４.５)と、固体黒色９６ウェルプレート(Costar, Inc.)中で混合し、３７℃で１５分インキュベートした。プレートを蛍光プレートリーダー(Wallac, Inc.)で、励起３８０nm／放出４４０nmフィルターを３分毎に５回使用して読取り、酵素の速度を得た；分析は３回行った。
【０２０１】
フローサイトメトリー：刺激および染色のために処理された細胞を、血球計算前に氷上のＭＴに取りこみ、１００μmフィルターを通して濾過した。細胞をFACSCAN(Becton Dickinson Inc., レーザーライン４５８nm)またはＭｏ−Ｆｌｏ(Cytomation, Inc., レーザーライン広いバンドで３５０nM(UV)、488nmおよび６４７nm)Cytometerを使用して分析した。望ましい場合、Ｍｏ−Ｆｌｏを使用して細胞を分類した。
【０２０２】
結果：結果を図４に示す。細胞上清中の酵素活性をＭＣ９(Ａ)およびＲＢＬ−２Ｈ３(Ｂ)細胞について、種々の条件下で測定した。Ａ)ＭＣ−９細胞をＤＭＳＯ(−)または２μmロノマイシン(＋)存在下で３０分刺激した。上清を回収し、グルクロニダーゼまたはヘキソサミニダーゼ活性についで分析した。顆粒酵素活性の刺激による放出は明白である。Ｂ)ＲＢＬ−２Ｈ３細胞を１６時間、種々の量のＩｇＥ抗−ＤＮＰで感作し、増加した量の抗原ＢＳＡ−ＤＮＰに曝すことによりエキソサイトーシスによる分泌を刺激した。両方の抗体および抗原の用量応答が、上清ヘキソサミニダーゼ活性の測定において明白である。
【０２０３】
実施例３：肥満細胞エクソサイトーシス性光分散変化
実施例２に記載のように細胞を調製し、光分散性を測定した。
【０２０４】
結果：結果を図５に示す。フローサイトメーター上で観察された光分散の変化(側面分散対前方分散)を、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞(Ａ、Ｄ)およびＭＣ−９細胞(Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ)についての二変数ヒストグラムとしてプロットする。細胞はイオン透過担体Ａ２３１８７(０.５ug/mL)で刺激し、様々な時点[０分(Ａ、Ｃ)、５分(Ｅ)、１０分(Ｄ)および３０分(Ｂ、Ｆ)]で観察した。時間に依存した分散の変化は、最初の１０分間で有意な変化が起こっている両方のセルラインで明らかであり、これらの細胞における大量のエクソサイトーシスを示すものである。
【０２０５】
実施例４：ＦＡＣＳによるスチリル色素が肥満細胞エクソサイトーシスを検出する
スチリル色素着色：細胞は上記のように調製した。スチリル色素(ＦＭ１−４３またはＦＭ４−６４；Molecular Probes,Inc.)をＭＴ中２５０nMの最終濃度に希釈し、刺激緩衝液に加えた(実施例２、参照)。刺激プロトコルの後、細胞を遠沈し、吸引し、新しい氷冷ＭＴに再懸濁した。この細胞について、フローサイトメーターでの分析の準備が完了した(実施例２、参照)。
【０２０６】
結果：結果を図６に示す。ＭＣ−９細胞は、ＦＭ４−６４(Ａ、Ｂ)またはＦＭ１−４３(Ｃ、Ｄ、Ｅ)のいずれかの存在下で刺激した(青＝ＤＭＳＯ、赤＝２μMイオノマイシン)。Ａ）蛍光チャンネル１のフローサイトメーターで検出されたＦＭ４−６４標識化細胞。Ｂ）蛍光チャンネル３のフローサイトメーターで検出されたＦＭ４−６４標識化細胞。Ｃ）蛍光チャンネル１のフローサイトメーターで検出されたＦＭ１−４３標識化細胞。Ｄ）蛍光チャンネル３のフローサイトメトリーで検出されたＦＭ１−４３標識化細胞。いずれの色素を用いても、明白な刺激依存性の蛍光強度の増強がある；ＦＭ４−６４は最も赤色偏位であり、且つチャンネル３で専ら検出され、一方ＦＭ１−４３はチャンネル１および３の両方でより広域の蛍光が検出されている。Ｅ）ＭＣ−９細胞を、種々の用量のＰＩ−３キナーゼ阻害剤ウォートマニン(１μM−棒グラフ１、１００ｎＭ−棒グラフ２、１０nM−棒グラフ３、および０nM−棒グラフ１および２)と共に予備インキュベートした後、ＦＭ１−４３の存在下でＡ２３１８７(０.５ug/mL、棒グラフ１−４)またはＤＭＳＯ(棒グラフ５)で刺激した。蛍光チャンネル１のフローサイトメーターで検出された平均のチャンネルシフトを棒グラフとしてプロットする。肥満細胞のエクソサイトーシスの阻害剤として知られるウォートマニンは、ＦＭ１−４３シグナルの用量依存的減少を惹起し、ＦＭ１−４３シグナルがＭＣ−９肥満細胞セルラインの分解の程度を反映していることを示す。
【０２０７】
実施例５：ＦＡＣＳによりアネキシン−Ｖ着色が肥満細胞エキソサイトーシスを検出する
材料：アネキシン−Ｖビオチン、アネキシン−Ｖ ＦＩＴＣおよびストレプトアビジンＡＰＣはCaltag Laboratoriesより取得した。本実施例で使用する他の材料および方法は、他の実施例、特に実施例２から採用することができる。
【０２０８】
アネキシン−Ｖ着色：エキソサイトーシス刺激後の細胞を、ＭＴ中１／１００の希釈で室温下に１０分間アネキシン−ＰＩＴＣで着色した。次いでこの細胞をＭＴで１回洗浄し、ＭＴに溶解し、フローサイトメーターまたは顕微鏡で調べた。間接的標識化については、アネキシン−ビオチンを１／２００の希釈で刺激過程の間にＭＴに加えた。次に細胞を氷冷ＭＴ中でペレット化し、遠沈し、吸引し、ストレプトアビジン−ＡＰＣを添加した氷冷ＭＴに１／２００の希釈で溶解し、氷上に１０分間保持した。細胞をペレット化し、ストレプトアビジン−ＡＰＣを吸引した後、細胞をＭＴに再懸濁し、フローサイトメーターで観察した。幾つかの実験では、顕微鏡で視覚化するためにストレプトアビジン・アレキサ４８８または５９４(Molecular Probes,Inc.)といったような異なる二次物質を適用した。
【０２０９】
結果：結果を図７に示す。ＭＣ−９細胞は、ＤＭＳＯ(図ＡおよびＢ)または２μmのイオノマイシン(図ＣおよびＤ)のいずれかで刺激し、次いでヨウ化プロピジウム[ＰＩ](図ＡおよびＣ)およびアネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣ(図ＢおよびＤ)の両方で着色した。この用量のイオノマイシンによる刺激は、エキソサイトーシスを行っている細胞で有意なＰＩ着色の増加がないことにより証明されるように、原形質膜を傷つけない。図ＤおよびＢの比較により認められるように、脱顆粒は、アネキシン結合の有意な増加をもたらす。
【０２１０】
実施例６：アネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣは共焦点顕微鏡検査により視覚化されたＭＣ−９細胞中のエキソサイトーシス性顆粒を着色する
顕微鏡検査：刺激または着色後の細胞を、スライドガラス上に載せ、カバーガラスをかぶせ；標準的ＢＦＰ、ＦＩＴＣまたはＴＲＩＴＣフィルターセットを使用する倒立顕微鏡(ＴＥ３００、Nicon)上で明視野および蛍光顕微鏡検査によって直接視覚化した。幾つかの像は、標準的ＦＩＴＣおよびＴＲＩＴＣフィルターセットを使用する倒立共焦点顕微鏡(Zeiss,Inc.、Bio-Rad,Inc.)を使用して得られた。
【０２１１】
結果：ＭＣ−９細胞は、２μmイオノマイシンまたはＤＭＳＯで刺激し、アネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣで着色し、共焦点顕微鏡用のスライドガラスに載せた(結果は示されていない)。刺激されなかった生存細胞は、全て低値のアネキシン結合を示し、細胞表面顆粒の着色を示さない。
【０２１２】
実施例７：アネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣは、抗原架橋により刺激したＲＢＬ−２Ｈ３細胞中のエキソサイトーシス顆粒を着色する
別途下記する場合を除き、本実施例のための方法は先の実施例に記載されている。
【０２１３】
結果：ＲＢＬ−２Ｈ３細胞をＩｇＥで感作し、ＭＴ緩衝液のみ、またはＢＳＡ−ＤＮＰ抗原(１００ng/mL)のいずれかによりエキソサイトーシスが起こるよう刺激し、次いでアネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣで着色した。ＭＣ−９細胞に見られるパターンと同様、抗原刺激された細胞中に、多数の細胞表面顆粒が着色される。刺激されなかった生存細胞のアネキシン−Ｖ着色は無視できるものである(データは示されていない)。
【０２１４】
実施例８：ＦＡＣＳで視覚化される細胞のエキソサイトーシスについてのインシトゥ酵素法
インシトゥ酵素法：ＭＣ−９細胞を上記のようにエキソサイトーシスを目的として刺激し、次いで、基質ＥＬＦ−９７グルクロニド(２５０μM)を含有する酵素基質緩衝液(ＢＳＡを含有しないＭＴ、ｐＨ４.３−７.４の範囲)中、３７℃で１５分間でインキュベートした。この細胞をＭＴ中で１回洗浄し、次いで顕微鏡またはフローサイトメーター上で観察した。方法の他の詳細は前実施例に記載されている。
【０２１５】
結果：結果を図８に示す。ＭＣ−９細胞をＤＭＳＯ(図Ａ)またはＡ２３１８７(０.５μg/mL - 図ＢおよびＣ)で刺激し、次いでインシトゥ・グルクロニダーゼ活性を調べるために着色した。Ａ）細胞表面酵素沈降物を示すＥＬＦ−９７検出のフローサイトメーター・ヒストグラム。ＤＭＳＯ処理した細胞では極めて低いシグナルが見られる。Ｂ）細胞表面酵素沈降物を示すＥＬＦ−９７検出のフローサイトメーター・ヒストグラム。イオン透過担体による分泌刺激時にシグナルの有意な増強が見られる。Ｃ）細胞表面酵素活性のｐＨプロフィール。異なるｐＨで作成したＭＴ緩衝液を使用して、フローサイトメーター中に見られるシグナルのｐＨプロフィールを作成した。棒グラフは、観察された最大シグナルのパーセントを示す(フローサイトメーターでの平均チャンネルシフトにより測定)。酵素活性は、ｐＨ依存性であり、ｐＨ６未満でピークとなる；このことは、酸性分泌性顆粒から誘導された酵素活性と合致する。
【０２１６】
実施例９：Lysotracker緑は、エキソサイトーシス時に肥満細胞顆粒から放出され、ＦＡＣＳにより検出できる。
Lysotracker色素着色：Lysotracker色素(青、緑、および赤)を完全培地中１μMの最終濃度に希釈し、これらの存在下で細胞を３７℃で６０分間インキュベートすることにより、Lysotracker色素を細胞中に負荷した。負荷後、細胞をＭＴで２回洗浄すると、さらなる分析または刺激への準備が完了した。方法の詳細は前実施例に記載されている。
【０２１７】
結果：結果を図９に示す。ＭＣ−９細胞にLysotracker緑を１時間負荷し、次いでＤＭＳＯまたはイオノマイシン(２μM)のいずれかで刺激し、フローサイトメーターで観察した。チャンネル１で検出された蛍光強度のヒストグラムを示す；ＤＭＳＯ対照と比較してイオン透過担体刺激された試料には、シグナルの有意な喪失が見られ、これは、分泌顆粒からのLysotracker緑色素の放出を反映するものである。
【０２１８】
実施例１０：複数パラメータ分析 − Lysotracker緑、アネキシン−Ｖ−ＡＰＣ、前方および側面分散
別途に下記しない限り、前実施例に記載の方法を使用した。
【０２１９】
結果：結果を図１０に示す。ＭＣ−９細胞を異なる用量のイオノマイシン(０μM−Ａ、Ｅ；１μM−Ｂ、Ｆ；２μM−Ｃ、Ｇ；および３μM−Ｄ、Ｈ)で処理し、４パラメータのフローサイトメーターで同時に観察した。細胞にlysotracker緑を１時間負荷し、次いで刺激し、アネキシン−ＶＡＰＣを目的として着色した。図Ａ−Ｄ：側面対前方光分散の二変数ヒストグラム。前方分散が増加し側面分散が減少するにつれて、両パラメータが左から右に用量依存的に変化することに注目されたい。図Ｅ−Ｈ：アネキシン−Ｖ−ＡＰＣ対Lysotracker緑シグナルの二変数ヒストグラム。エキソサイトーシスが増加(左から右へ)するにつれてアネキシンシグナルが大きくなり、lysotrackerシグナルが減少する。これは、細胞表面顆粒へのアネキシン−Ｖの結合、および顆粒が細胞外環境に暴露されるために顆粒からlysotrackerが失われることを反映するものである。
【０２２０】
実施例１１：複数パラメータ分析 − ＦＭ１−４３、アネキシン−Ｖ−ＡＰＣ、前方および側面分散
別途下記しない限り、上記の方法を使用した。
【０２２１】
結果：ＭＣ−９細胞をＤＭＳＯまたはイオノマイシン(２μM)のいずれかで処理し、４パラメータのフローサイトメーターで同時に観察した。細胞はＦＭ１−４３の存在下で刺激し、アネキシン−Ｖ−ＡＰＣを目的として着色した(データは示されていない)。３０分の時点で両方のパラメータに刺激依存的変化があった。両シグナルに刺激依存的増強があった。この変化は、細胞表面顆粒へのアネキシン−Ｖの結合、およびＭＣ９細胞中へのＦＭ１−４３色素の同時結合エンドサイトーシスを反映するものである。
【０２２２】
実施例１２：ＦＡＣＳでの同時複数パラメータ測定が集団に基づく酵素読み出しと相関する
カルシウムシグナル検定：ＭＣ−９またはＲＢＬ−２Ｈ３細胞をＭＴ中で１回洗浄し、ＭＴ中のCa⁺⁺感受性プローブFluo-３(1μM、Molecular Probes,Inc.)を３７℃で２０分間負荷した。細胞を温ＭＴで１回洗浄し、次いで上記プロトコルにしたがって刺激した。細胞内Ca⁺⁺濃度上昇によるシグナルを、フローサイトメーター(下記参照)、蛍光顕微鏡検査、または蛍光板読み取り機による読み取り(Wallac,Inc.)のいずれかを用いて視覚化した。細胞の負荷は、０.１％トリトンＸ−１００を含有するＭＴで細胞内色素を放出させることにより測定した。
別途下記しない限り、上記の方法を使用した。
【０２２３】
結果：結果を図１１に示す。ＭＣ−９細胞をＦＭ１−４３の存在下で刺激し、上の方法に記載のようにアネキシン−Ｖ−ＡＰＣ着色した。イオノマイシン刺激後の様々な時点で、細胞を氷上に置き、フローサイトメトリーにより分析するか、または酵素活性について分析した(細胞上清)。前方分散、ＦＭ１−４３、アネキシン−Ｖ−ＡＰＣおよびヘキソサミニダーゼのパラメータを、各パラメータについての最大反応に対してグラフ上にプロットする。カルシウムシグナルについては、別の試験管の細胞にFluo-３を負荷し、同一の操作を行った。サイトメトリーに基づくパラメータの時間経過によると、このパラメータがヘキソサミニダーゼの放出により測定されるエキソサイトーシスとかなりよく相関する。この実施例において、前方分散は、時間と共に正および負の両方に変化する効果を示している。
【０２２４】
実施例１２：ＶＡＭＰ−ＧＦＰおよびＶＡＭＰ−ＦＲＥＴ構築体の発現
ｃＤＮＡ構築体：
ＶＡＭＰ−ＧＦＰ構築体：ラットＶＡＭＰ−２ ｃＤＮＡ(R.Scheller(スタンフォード大学)より取得)をＰＣＲ修飾して、(１) 発現およびインビボ安定性をそれぞれ促進するための、共通Kozakおよびグリシンの挿入(a.a.２)をコードする５'BstXI部位；(２) ３'末端にBamHI部位を有するセリン−グリシンリンカー、を導入した。ＣｄｉｍＧＦＰ(Clontech,Inc.)由来のＧＦＰコード化配列をＰＣＲ修飾して、停止コドンをコードする３'BstXI部位を導入した。この修飾したｒＶＡＭＰおよびＧＦＰ ＰＣＲ断片を、セリン−グリシンリンカー中の共通のBamHI部位を介してライゲーションすることにより、ＶＡＭＰ−ＧＦＰ融合物を構築し、以下の配列を有するフレーム内融合タンパク質を製造した：
【０２２５】
【化４５】

ＶＡＭＰ配列は下線を付してあり、セリン−グリシンリンカーはイタリックとし、ＧＦＰ配列は通常の表記とした。
【０２２６】
このＶＡＭＰ−ＧＦＰ融合配列を、直接的BstXI部位を有する９６.７レトロウイルス・ベクター中にクローニングしてｐＶＧを作成した。配列は、両方向に配列決定することにより確認した。ウエスタン分析および蛍光顕微鏡検査により、トランスフェクトされ感染した細胞での適正な発現を確認した。
【０２２７】
Trp−ＦＲＥＴ構築体：ｃＧＦＰ(Clontech,Inc.)由来のＧＦＰコード化配列をＰＣＲ修飾して、(１) 発現およびインビボ安定性をそれぞれ促進するための、共通Kozakおよびグリシンの挿入(a.a.２)をコードする５'BstXI部位；(２) Ｃ末端にAla２２８をコードする３'末端SacII部位、を作り出した。ｃＢＦＰ(Clontech,Inc.)由来のＢＦＰコード化配列をＰＣＲ修飾して、(１)Ser２をコードする５'BamHI部位；(２) 停止コドンをコードする３'末端BstXIを作り出した。ＧＳＧＳスペーサーが側面に位置し因子Ｘおよびトリプターゼプロテアーゼ開裂部位をコードするSacII-BamHI変換リンカー(ＧＳＧＳＩＥＧＲＬＲＫＱＧＳＣＳ)を用いて、ＧＦＰとＢＦＰとを融合させ、以下の配列を有するフレーム内融合タンパク質を作成した：
【０２２８】
【化４６】

ＧＦＰ配列は下線を付してあり、因子Ｘ／トリプターゼ部位リンカーはイタリックとし、ＢＥＰ配列は通常の表記とした。
【０２２９】
このＶＡＭＰ−ＧＦＰ融合配列を、レトロウイルスベクター９６.７のBamHIおよびBstXI中にクローニングしてｐＧＸ／ＴＢを作成した。配列は、両方向に配列決定することにより確認した。ウエスタン分析および蛍光顕微鏡検査により、トランスフェクトされ感染した細胞での適正な発現を確認した。
【０２３０】
ＶＡＭＰ−ＧＦＰコード化配列をＰＣＲ修飾して、Ｃ末端にAla２２８をコードする３'末端SacII部位を作り出した。この断片をXhoIおよびSacIIで開裂し、ｐＧＸ／ＴＢのXhoI/SacII部位中にクローニングして、ｒＶＡＭＰ−２−ＢＦＰ−因子Ｘ／トリプターゼ部位−ＧＦＰ融合タンパク質をコードする、以下の配列のｐＶＧＸ／ＴＢ(Trp−ＦＲＥＴ)を作成した。
【化４７】

ＶＡＭＰ配列は下線を付してあり、セリン−グリシンリンカーはイタリックとし、因子Ｘ／トリプターゼ部位リンカーは太字とし、ＧＦＰおよびＢＦＰ配列は通常の表記とした。
【０２３１】
このｒＶＡＭＰ−２−ＢＦＰ−因子Ｘ／トリプターゼ部位−ＧＦＰ融合配列を両方向に配列決定することにより確認した。ウエスタン分析および蛍光顕微鏡検査およびＦＡＣＳ分析により、トランスフェクトされ感染した細胞での適正な発現を確認した。
【０２３２】
トランスフェクションおよび感染：ＭＣ−９およびＲＢＬ−２Ｈ３細胞にＶａｍｐ構築体を発現する組換えレトロウイルスを感染させるために、以下の方法を実施した。第一日目、Phoenix EまたはA細胞(G.Nolan(スタンフォード大学)より入手)を、培地(ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ)１.５mLを入れた６ウェルプレートに８ｘ１０Ｅ５細胞で接種した。二日目、この細胞中にクロロキン５０μMの存在下でＣａＰＯ₄沈澱法を用いてＤＮＡ ５μgをトランスフェクトした。沈澱を細胞と共に３７℃で８時間インキュベートし、この時点で培地を除去し、新たな培地で１回洗浄し、新しいＭＣ−９またはＲＢＬ−２Ｈ３培地のいずれかと交換した。次いでこの細胞を３２℃で４８−７２時間インキュベートした。Phoenix細胞からの上清(ウイルス上清)を１０００ｘｇで１０分間遠沈し、硫酸プロタミンを最終濃度５μg/mLとなるまで加えた。この上清を、６ウェルプレート(ウェル当たり５ｘ１０Ｅ５細胞)に入れたＭＣ−９またはＲＢＬ−２ＨＳ(新たにトリプシン処理)細胞に加え、混合物を室温下に１０００ｘｇで９０分間遠沈した。次にこの細胞を３２℃で１６時間インキュベートした。ウイルス上清を除去し、新しい培地を加えた。感染の２４時間後に標的遺伝子の発現が認められた。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ−１Ｃ】 図１Ａ、１Ｂ、１Ｃは、実施例１の３つのレトロウイルス構築を模式的に示す。図１Ａは、ＣＲＵ５−ＧＦＰ−ｐ２１構築であって、ＣＲＵ５プロモーター、ψレトロパッキングシグナル、ｐ２１のコード領域に融合したＧＦＰのコード領域、次いでＬＴＲを含む。図１Ｂは、ＣＲＵ５−ＧＦＰ−ｐ２１Ｃ構築を示し、ｐ２１のＣ末２４アミノ酸を含む。図１Ｃは、ＣＲＵ５−ＧＦＰ−ｐＵＣｍｕｔ構築体を示し、これは３アラニン置換を有するＣＲＵ５−ｐ２１Ｃｐ２１の変異体である。
【図２Ａ−２Ｄ】 図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄは、実施例１の実験の結果を示す。図２Ａは、前方および側面分散を用いる生存能アッセイを示す。特性割合を表す細胞が集められる。図２Ｂは、ベクターのＧＦＰの蛍光を示す。図２Ｃは、増殖アッセイにおけるＰＫＨ２６、包含色素の使用を表す；細胞を拘束する既知のタンパク質であるｐ２１を含有する細胞は、輝く蛍光を保持し、一方、対照の細胞は、増殖を続けて色素を希釈し蛍光を無くする。図２Ｄは、細胞相アッセイにおける Hoechst 33342 の使用を表す。
【図３】 図３は、Ｇ１相における細胞拘束剤、ｐ２１に感染のJurkat細胞に対するＡｒａＣ処置の効果を示す。ＡｒａＣは、分割細胞に毒性のヌクレオチド類似体である。従って、拘束された細胞周期であるこれらの細胞が生存する。下側の線はｐ２１の挿入のないJurkat細胞を示し，上側の線はｐ２１挿入のJurkat細胞を示す。
【図４Ａおよび４Ｂ】 図４Ａおよび４Ｂは、集団についてのエキソサイトーシス酵素活性アッセイの結果を示す。図４Ａは、ＤＭＳＯ(−)またはイオノマイシン(＋)と組み合わせた細胞の上澄み液におけるグルクロニダーゼまたはヘキソサミニダーゼ活性を示す。図４Ｂは、種々の量のＩｇＥアンチＤＮＰで感受性化され、増加量の抗原ＢＳＡ−ＤＮＰで刺激された細胞の上澄み液におけるヘキソサミニダーゼ活性を示す。
【図５Ａ−５Ｆ】 図５Ａ−５Ｆは、フロー・サイトメーター、側面分散対前方分散に見られたエキソサイトシス・分散変化を示す。ＲＢＬ-２Ｈ３細胞(図５Ａおよび５Ｄ)およびＭＣ−９細胞(図５Ｂ、５Ｃ、５Ｅ、５Ｆ)について２変数ヒストグラムとしてプロットした。イオン透過担体での刺激後、細胞の観察を０分(図５Ａおよび５Ｃ)、５分(図５Ｅ)、１０分(５Ｄ)、３０分(図５Ｂおよび５Ｆ)で行った。
【図６Ａ−６Ｄ】 図６Ａ−６Ｅは、ＦＡＣＳによるエキソサイトーシスを検出するスチリル色素アッセイの結果を示す。細胞は、ＤＭＳＯ(左ピーク)またはイオノマイシン(右ピーク)と、ＦＭ４−６４(図６Ａおよび６Ｂ)またはＦ１−４３(図６Ｃ、６Ｄ、６Ｅ)のいずれかの存在下にて、組み合わせた。図６Ａおよび６Ｃは蛍光チャネル１で検出された細胞を示す。図６Ｂおよび６Ｄは、蛍光チャネル３で検出された細胞を示す。
【図６Ｅ】 図６Ｅは、蛍光チャネル１でのフロ−・サイトメトリーで検出された平均チャネルシフトを棒グラフで示す。種々の量のＰｌ−３キナーゼ阻害剤ウォルトマニンとの前インキュベートが、ＦＭ１−４３の存在下にイオン透過担体(棒１−４)またはＤＭＳＯ(棒５)の投与前になされた。
【図７Ａ−７Ｄ】 図７Ａ−７Ｄは、ＦＡＣＳによるエキソサイトーシスのアネキシン-Ｖ検出アッセイの結果を示すグラフである。細胞は、ＤＭＳＯ(図７Ａおよび７Ｂ)またはイオノマイシン(図７Ｃおよび７Ｄ)のいずれかと組み合わせ、次いでヨウ化プロピジウム(図７Ａおよび７Ｃ)およびアネキシン-Ｖ-ＦＩＴＣ(図７Ｂおよび７Ｄ)の両者で着色された。
【図８Ａ−８Ｃ】 図８Ａ−８Ｃは、ＦＡＣＳにより可視化されたエキソサイトーシス細胞のインシトゥ酵素学アッセイの結果を表すグラフである。細胞は、ＤＭＳＯ(図８Ａ)またはイオン透過担体(図８Ｂおよび８Ｃ)と組み合わせ、次いでインシトゥグルクロニダーゼ活性について着色した。図８Ｃは細胞表面酵素活性のｐＨプロファイルを示し、棒グラフで、フロー・サイトメトリー中の平均チャネルシフトにより測定された最大シグナルの百分率を表す。
【図９】 図９は、チャネル１中に検出された蛍光強度のヒストグラフである。細胞に、LYSOTRACKER GREEN(商標)を負荷し、ＤＭＳＯ(左)またはイオノマイシン(右)のいずれかと組み合わせ、フロー・サイトメトリーで測定した。
【図１０Ａ−１０Ｈ】 図１０Ａ−１０Ｈは、LYSOTRACKER GREEN(商標)、アネキシン-Ｖ-ＡＰＣ、前方および側面分散を含む複数パラメーター分析の結果を示す。図１０Ａ−１０Ｄおよび１０Ｅ−１０Ｈの各々は、イオノマイシンの増加量で処理され、次いで４パラメーターのフロー・サイトメーターで同時に観測された細胞を示す。細胞に、低ｐＨ濃度色素を負荷し、刺激し、アネキシン-Ｖ-ＡＰＣで着色した。図１０Ａ−１０Ｄは、側面対前方の光分散の２変数ヒストグラムを示し、図１０Ｅ−１０Ｈは、アネキシン-Ｖ-ＡＰＣ対低ｐＨ濃度色素シグナルの２変数ヒストグラムを示す。
【図１１】 図１１は、ＦＭ１−４３の存在下で刺激され、アネキシン-Ｖ-ＡＰＣで着色された細胞についてのグラフである。イオノマイシン刺激後の種々の時点で、細胞の分析をフロー・サイトメトリーおよび酵素活性について上澄み液(細胞上澄み液)で行った。パラメーター、前方分散、ＦＭ−１４３、アネキシン-Ｖ-ＡＰＣ、ヘキソサミニダーゼを、各パラメーターについての最大応答に比較してグラフとした。カルシウム情報伝達について、分離管の細胞にＦｌｏｕ−３を負荷し、同様に処理した。

Claims (10)

1. 細胞表現型を変化し得る生物活性剤についてスクリーンする方法であって、
   ａ）少なくとも１つの候補生物活性剤と細胞集団とを組み合せて；
   ｂ）ＦＡＣＳ機器における該細胞の分別を、該細胞表現型を測定することができる少なくとも５の細胞パラメーターに基づく該細胞の分離により行う；
   ことを含む方法。
2. 候補生物活性剤のライブラリィを該集団と組み合す、請求項１の方法。
3. 細胞表現型を変化し得る生物活性剤についてスクリーンする方法であって、
   ａ）候補生物活性剤を各コードする核酸のライブラリィを細胞集団に導入し；
   ｂ）ＦＡＣＳ機器における該細胞の分別を、該細胞表現型を測定することができる少なくとも３の細胞パラメーターに基づく該細胞の分離により行う；
   ことを含む方法。
4. 該ライブラリィがレトロウイルス・ライブラリィである、請求項３の方法。
5. 該細胞表現型がエキソサイトーシスであり、該細胞パラメーターが光分散、蛍光色素取り込み、蛍光色素放出、アネキシン顆粒結合、表面顆粒酵素活性、顆粒特異的タンパク質の量よりなる群から選ばれる、請求項３または４の方法。
6. 該細胞を、エキソサイトーシスを正常に起こすような状態にすることをさらに含む、請求項５の方法。
7. 該表現型が細胞周期調節であり、該細胞パラメーターが細胞の生存能、増殖および細胞相を含む、請求項３または４の方法。
8. 該核酸が下記を含有する融合核酸を含む、請求項３、４、５、６または７の方法：
   ａ）該候補生物活性剤をコードする該核酸；
   ｂ）検出可能部分。
9. 該細胞が腫瘍細胞である、請求項１、２、３、４、５、６、７または８の方法。
10. 該検出可能部分が蛍光タンパク質である、請求項８の方法。

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