ES2312523T3 - Procedimiento para la produccion y purificacion de eritropoyetina. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para purificar isoformas ácidas de eritropoyetina a partir de una mezcla de proteínas compleja, caracterizado porque el procedimiento comprende dos etapas de cromatografía de intercambio de aniones, que están separadas por etapas de cromatografía basadas en un principio diferente al de la cromatografía de intercambio de aniones y al menos una etapa de lavado ácido en una de las etapas de intercambio de aniones.
Description
Procedimiento para la producción y purificación
de eritropoyetina.
La presente invención se refiere a la producción
de glicoproteínas recombinantes, particularmente eritropoyetina
humana recombinante, en células de mamífero, así como a los
procedimientos para purificar las glicoproteínas producidas a partir
del cultivo celular.
Con pocas excepciones, las proteínas secretadas
y asociadas a membrana de todas las células eucariotas están
glicosiladas. Es bien conocido que las fracciones carbohidrato de
tales glicoproteínas son importantes para ejercer sus funciones y
actividades biológicas, tales como secreción, semivida biológica,
antigenicidad y estabilidad. La mayoría de los terapéuticos
recombinantes actuales y potenciales para aplicaciones en humanos
son glicoproteínas. La modificación de la glicofracción de una
proteína humana recombinante puede llevar a un producto con
características farmacodinámicas y farmacocinéticas mejoradas, tales
como mayor semivida en la circulación, orientación al sitio de
acción (especifidad y bioactividad incrementadas) así como mayor
estabilidad in vivo e in vitro, menor heterogeneidad
y menor antigenicidad/inmunogenicidad. Se han demostrado relaciones
estructura-función para las glicofracciones para un
número de glicoproteínas humanas recombinantes terapéuticas, tales
como eritropoyetina, Factor VIII y
\beta-glucocerebrosidasa.
En general, no se observa una función biológica
específica que pueda asociarse a una única estructura carbohidrato
definida. Por el contrario, las relaciones
estructura-función deben buscarse en el contexto de
los patrones analíticos de glicosilación y la abundancia relativa de
cadenas de carbohidratos. Estas a su vez están caracterizadas por
propiedades físico-químicas tales como el número y
tipo de estructura de ramificación (antenaridad), estructuras
repetidas y contenido de ácido siálico. Como resultado de extensivas
evaluaciones estructura-función de unas pocas
proteínas modelo, han emergido unas pocas reglas para clasificar la
calidad de una glicoproteína recombinante en base a las
características de su glicofracción.
La eritropoyetina es una hormona glicoproteína
bien estudiada implicada en la maduración de las células
progenitoras eritroides en eritrocitos. Es esencial en la regulación
de los niveles de células rojas sanguíneas en la circulación. La
eritropoyetina natural es producida por el hígado durante la vida
fetal y por el riñón de los adultos y circula en la sangre y
estimula la producción de células rojas sanguíneas en la médula
ósea. La anemia es casi invariablemente una consecuencia de un
fallo renal debido a una menor producción de eritropoyetina desde el
riñón.
La eritropoyetina recombinante producida
mediante técnicas de ingeniería genética que implican la
transferencia y expresión de un gen que codifica la eritropoyetina
en una célula huésped de mamífero ha demostrado ser eficaz cuando
es usada en el tratamiento de anemia resultante de un fallo renal
crónico. La eritropoyetina es una glicoproteína con un peso
molecular comprendido entre 34 y 38 kDa, del cual aproximadamente
entre el 40% y el 50% es debido a las fracciones de carbohidrato.
La mayor parte de las cadenas de carbohidrato están
N-ligadas a 3 asparaginas y los carbohidratos
menores están O-ligados a una serina. La
glicosilación de tipo complejo con glicoestructuras antenarias
altas puede observarse con la eritropoyetina y la galactosa terminal
está altamente sialilada. La glicosilación o sialilación no parece
ser un prerrequisito para la unión a receptor y la actividad de la
eritropoyetina in vitro, sin embargo la eritropoyetina
desglicosilada o desialilada ejerce un semivida corta in
vivo. De esta manera, las características de la glicosilación y
sialilación de la eritropoyetina son necesarias para la mejora de
la semivida in vivo e influyen también en la ruta de
depuración y la orientación a órgano de la molécula.
La provisión de glicoestructuras adecuadas
fijadas a la proteína eritropoyetina debe ser el foco de los
esfuerzos de desarrollo para obtener una preparación de
eritropoyetina terapéuticamente viable. Además de la semivida, la
ruta de depuración y la orientación órgano, los estudios
fisico-químicos han mostrado que la glicosilación
incrementa también la estabilidad de la eritropoyetina contra la
degradación química y biológica. La glicosilación y sialilación de
la eritropoyetina natural (eritropoyetina urinaria) y la
eritropoyetina recombinante han sido estudiadas extensivamente a
nivel analítico descriptivo, sin embargo sólo hay pocos datos
disponibles para correlacionar los datos analíticos con los
resultados terapéuticos. A partir de los datos disponibles parece
que las características siguientes parecen ser deseables para
obtener un buen producto que sea terapéuticamente eficaz.
Primero, la calidad del producto eritropoyetina
parece estar influida por el tipo y el grado de sialilación de la
galactosa terminal. Imai et al. (1990, Eur. J. Biochem.
194:457-462) mostraron que las isoformas de
eritropoyetina con alto contenido de ácido siálico ejercían una
actividad específica más alta que las que tenían un menor contenido
de ácido siálico. Rush et al. (1995, Anal. Chem.
67:1442-1452) describieron la
O-acetilación de residuos de ácido siálico de
eritropoyetina y su efecto sobre el tiempo de circulación
incrementado. Los estudios de depuración realizados por Fukuda
et al. (1989, Blood 73:84-89) en ratas
mostraron que la eritropoyetina derivada de células de Ovario de
Hámster Chino (CHO) fue depurada de la sangre con una semivida de
aproximadamente 2 horas, después de un mecanismo de depuración
bifásico. La asialo eritropoyetina fue aclarada en un intervalo de
diez minutos, sugiriendo un mecanismo de unión a galactosa de las
células hepáticas como el responsable de la depuración de la asialo
eritropoyetina. Spivak and Hogans (1989, Blood
73:90-99) mostraron que con la eritropoyetina
comercial, la depuración en plasma de la eritropoyetina era
multiexponencial con una fase de distribución rápida inicial
(T_{1/2}=53 min.) y una fase de eliminación más lenta
((T_{1/2}=180 min.). La acumulación orgánica en los riñones,
médula ósea y bazo empezó 30 minutos después de la inyección de la
eritropoyetina comercial. La asialo eritropoyetina fue depurada
rápidamente vía la ruta hepática.
Por lo tanto, la evidencia publicada sobre la
sialilación de la eritropoyetina mostró tres efectos principales en
la sialilación de la eritropoyetina en la actividad in
vivo:
- La depuración de la eritropoyetina en la
circulación decrece cuando la eritropoyetina está sialilada. La
extensión de la sialilación depende de la extensión de las
estructuras antenarias presentes que proporcionan el sustrato para
la sialilación de las galactosas terminales.
- Las isoformas de eritropoyetina con el mayor
número de ácidos siálicos parecen ejercer la actividad específica
más alta.
- La asialo eritropoyetina es depurada
rápidamente vía la ruta hepática, la eritropoyetina poco sialilada
(estructuras biantenarias) está dirigida a los riñones y al bazo.
Las estructuras sialiladas más antenarias (triantenarias y
tetraantenarias) están dirigidas principalmente a las células de la
médula ósea.
- Un alto grado de O-acetilación
de los residuos de ácido siálico incrementa el tiempo de circulación
reduciendo la depuración hepática.
Por lo tanto, es deseable usar condiciones,
durante el cultivo de células de mamífero, que permitan
consistentemente la máxima sialilación de la mayoría de las
estructuras de carbohidrato N-ligadas. Las
condiciones para la máxima sialilación serían una ventaja
considerable para la fabricación de glicoproteínas terapéuticas.
Dados los efectos beneficiosos de las glicoproteínas altamente
sialiladas, particularmente la eritropoyetina, es un objeto de la
presente invención proporcionar procedimientos para incrementar el
nivel de sialilación de las glicoproteínas, particularmente la
eritropoyetina, mediante la modificación de las condiciones de
cultivo celular durante la producción de las glicoproteínas.
Sorprendentemente, se ha descubierto que el
grado de sialilación de las glicoproteínas, particularmente la
eritropoyetina, puede ser optimizada mediante el cultivo de las
células de mamífero productoras de glicoproteína a un pH que
mantiene la producción de proteínas altamente sialiladas.
Tradicionalmente, el pH de un medio de cultivo
es manipulado con el objetivo de alcanzar una producción y/o
crecimiento celular máximo. Los medios para el cultivo celular son
preparados típicamente con un pH ajustado a 7,4, similar al pH de
la sangre humana. Sin embargo, el pH óptimo depende de la línea
celular y puede variar entre los valores de pH de 6,9 a 7,6
(revisado en Eagle (1973) J. Cell Physiol.
82:1-89).
De esta manera, el efecto del pH sobre la
producción y/o el crecimiento celular, y no su efecto sobre la
naturaleza de un producto celular ha sido el factor determinante en
la selección de los valores de pH en el cultivo celular
tradicional. Por ejemplo, la técnica anterior ha descrito la
modificación del pH, producción de lactato y glucosa en las fases
de crecimiento y producción del procedimiento de cultivo celular con
el fin de optimizar el crecimiento y la producción, respectivamente
(ver por ejemplo WO 88/01643, cuya referencia no detalla la
naturaleza de los productos celulares producidos). La patente US
5.096.816 describe el efecto del amoníaco sobre la glicosilación de
los productos celulares mediante el control del pH. El procedimiento
preferente describe una estrategia multi-pH para el
crecimiento celular óptimo a un pH superior y a continuación el uso
de un pH bajo para minimizar la inhibición de la sialilación
terminal de los productos celulares debido a altos niveles de
amoníaco.
Sorprendentemente, los solicitantes han
descubierto en la actualidad un efecto opuesto al descrito en la
patente US 5.096.816. La producción del producto celular deseado que
contiene un grado máximo de sialilación es mejor en el intervalo de
pH superior.
Tal como se muestra en la Figura 1, el cultivo
celular que emplea el control de pH entre los valores de pH
7,2-7,5 resulta en la formación de producto con un
mayor grado de sialilación. Las Figuras 1A y 1B muestran los
resultados de los perfiles de distribución de las isorformas del
producto de la eritropoyetina humana recombinante obtenida tras el
cultivo bajo diferentes condiciones de pH controlado. El producto
producido bajo las diferentes condiciones de pH del cultivo fue
aislado mediante un procedimiento de purificación de 2 etapas
(captura de producto con una Q-Sefarosa XL (Amersham
Lifesciences, Alemania) y elución escalonada con sal seguida por
una etapa de Cromatografía de Interacción Hidrofóbica (HIC) con
Butil Sefarosa FF (Amersham Lifesciences, Alemania) y fue analizado
mediante electroforesis capilar (CE). La CE separa las isoformas de
eritropoyetina por carga y por lo tanto es una herramienta analítica
adecuada para analizar el estado de sialilación de un
producto
celular.
celular.
Tal como puede observarse en la Figura 1A, hay
un desplazamiento de la distribución de isoformas hacia las
isoformas más cargadas (números de pico mayores) en las condiciones
de cultivo que emplean un pH de 7,2-7,5. Una
preparación purificada de una preparación de referencia altamente
glicosilada y sialilada, el estándar de eritropoyetina BRP de la
European Pharmacopoeia (Ph. Eur. (2002) 4a edición) fue incluido en
el análisis, para la comparación. Particularmente, las formas más
altas del producto eritropoyetina sialilada, representadas por las
isoformas en los picos 7 y 8 están presentes en una proporción
considerablemente inferior en los productos derivados del cultivo
celular a un pH de 6,9. De esta manera, el cultivo celular que
emplea un control de pH con un pH entre 7,2 y 7,5 resulta en la
formación de un producto con un mayor grado de sialilación de
productos. El valor preferente de pH es 7,2, que proporcionó una
buena productividad de producto y un alto grado de sialilación. A
pesar de que la densidad celular global a este pH es inferior a por
ejemplo a un pH de 6,9, la calidad de la glicoproteína (en este
caso eritropoyetina) con respecto al contenido de sialil- es mejor a
un pH de entre 7,2 y 7,5.
Además, el descubrimiento inesperado de que el
cultivo celular a valores de pH comparablemente altos, tales como
un pH entre 7,2 y 7,5, lleva a una eritropoyetina con un mayor
contenido de grupos glicosil- y sialil- aunque la masa celular es
reducida puede extenderse a la producción de otras glicoproteínas
tales como t-PA, Factor XIII, Factor VIII,
Interferon-\beta, IL-2.
El valor óptimo de pH puede ser específico del
tipo de célula y línea celular y puede ser determinado mediante
experimentos tal como se expone en la Figura 2. En el caso de las
células CHO será un pH de 7,2 tal como se ejemplifica mediante las
células CHO productoras de EPO.
El término "isoforma", tal como se usa en
la presente memoria, se refiere a una preparación/fracción de
eritropoyetina que contiene glicoproteínas que tienen secuencias de
aminoácidos idénticas o muy similares y un punto isoeléctrico común
pero que pueden diferir con respecto a la extensión, la complejidad,
la naturaleza, la antenaridad y con el orden de los grupos
glicosil- y sialil- unidos. Las isoformas según la invención pueden
comprender también múltiples formas de eritropoyetina con la misma
secuencia de aminoácidos o muy similar y un punto isoeléctrico que
difiere además en otras modificaciones transportadoras de carga
tales como la acetilación o sulfatación. La expresión "secuencia
de aminoácidos muy similar" indica que la secuencia de
aminoácidos de una proteína comprende también las secuencias que son
funcionalmente equivalentes a la secuencia de aminoácidos de tipo
salvaje.
De esta manera, las isoformas de glicoproteína
según la invención están definidas por su punto isoeléctrico y la
secuencia de aminoácidos y cada isoforma puede comprender realmente,
por lo tanto, múltiples isoformas en el sentido químico
estricto.
La presente invención se refiere también a un
procedimiento para la purificación de glicoproteínas altamente
glicosiladas y particularmente sialiladas, particularmente
eritropoyetina humana recombinante, a partir de un cultivo
celular.
La eritropoyetina humana recombinante, cuando es
analizada a partir del sobrenadante de un cultivo celular mediante
enfoque isoeléctrico (IEF), muestra un perfil de isoformas de punto
isoeléctrico (pI) amplio con más de 14 isoformas diferentes sobre
un rango de pH de 3-9 (Gokana et al. (1997)
J. Chromatogr., 791 (1-2):109-18).
Las isoformas de eritropoyetina surgen principalmente debido a su
variable contenido de glicosil con un número variable de residuos
de ácido siálico terminal cargados negativamente. Las formas de
eritropoyetina con más residuos de ácido siálico y por lo tanto un
perfil pI más ácido se cree que son de mayor valor terapéutico
debido a que los residuos de ácido siálico terminal en las
glicoestructuras previenen la depuración rápida in vivo vía
la ruta del receptor asialo.
La solicitud de patente internacional
WO-A 1-86/07594 describe un
procedimiento para purificar eritropoyetina a partir de un fluido
que comprende las etapas de someter dicho fluido a una separación
mediante cromatografía líquida en fase inversa que implica una
resina C_{4} o C_{6} inmovilizada, para unir selectivamente de
esta manera la eritropoyetina en dicho fluido a dicha resina,
seguido de una elución selectiva de la eritropoyetina unida de
dicha resina con una solución acuosa de etanol de entre 50 a 80 por
ciento a un pH de entre aproximadamente 4,5 y 8,0 y aislando las
fracciones que contienen eritropoyetina del eluyente.
La solicitud de patente internacional
WO-A1-96/35718 describe una
preparación de proteína que tiene actividad eritropoyetina que es
obtenida de un medio de cultivo celular libre de suero usando un
proceso de purificación que implica una cromatografía de tinta,
cromatografía hidrofóbica sobre un portador alquilado o arilado,
cromatografía en hidroxiapatita, cromatografía hidrofóbica y
cromatografía de intercambio de aniones.
Inoue N. et al. (1994, Biol. & Pharm.
Bulletin 17(2):180-184) describe un
procedimiento para la purificación de eritropoyetina humana con
alta actividad in vivo de la orina que implica el intercambio
de iones, permeación de gel, cromatografía de afinidad y
cromatografía en fase inversa pero no procedimientos
estabilizadores.
Por lo tanto, es un objeto de la invención
desarrollar un procedimiento de purificación aguas abajo (DSP) en
el que las isoformas ácidas de las glicoproteínas en general, las
isoformas ácidas de eritropoyetina en particular, son
enriquecidas.
Según la invención, las "isoformas ácidas"
de eritropoyetina comprenden las isoformas que tienen un alto grado
o contenido de grupos glicosil- y preferentemente de grupos
sialil-.
Un mayor grado de sialilación de una
glicoproteína puede conseguirse generalmente si un número creciente
de cadenas de azúcar es terminada por grupos sialil-. De esta
manera, si el contenido global de glicosil- de una glicoproteína es
incrementado, puede conseguirse un mayor grado de silalilación ya
que puede haber más cadenas de azúcar disponibles para la
sialilación.
Según la invención, la eritropoyetina tiene un
alto grado o contenido de grupos glicosil- y preferentemente grupos
sialil- si muestran un perfil de isoformas comparable a los
estándares respectivos de la Eur. Ph., tales como el estándar de
eritropoyetina BRP de la Eur. Ph. tal como se determina mediante
IEF.
Según la invención, la expresión "mezcla de
proteína compleja" se refiere a una mezcla que comprende una
multitud de diferentes proteínas e isoformas de las mismas, tales
como por ejemplo extractos celulares.
Los productos de proteína son generalmente
aislados de los fluidos del cultivo biológico empleando una
secuencia de etapas de purificación. Cada etapa de purificación
contiene una o varias etapas de lavado. Las condiciones de lavado
generalmente no proporcionan una alta selectividad para la
separación cuantitativa de las impurezas relacionadas (por ejemplo,
impurezas de isoformas de proteína) de las moléculas del producto
deseado. Los procedimientos de purificación con mayor selectividad,
tales como el cromatoenfoque emplean gradientes de pH usando
anfolitos, sin embargo generalmente no son adecuados para la
fabricación a gran escala debido a sus altos costos y escalabilidad
limitada. Las etapas con un único lavado de sal proporcionan una
selectividad limitada para el enriquecimiento de las moléculas
deseadas. Las etapas de lavado fuerte producirán un enriquecimiento
para las moléculas deseadas, sin embargo con el costo de una pérdida
de producción global.
Se ha descubierto ahora, de manera sorprendente,
que las isoformas de la eritropoyetina con un punto isoeléctrico
bajo o ácido, es decir, con un alto contenido de fracciones sialil-,
pueden ser enriquecidas selectivamente mediante un procedimiento
DSP si la cromatografía de intercambio de aniones es combinada con
al menos una etapa de lavado ácido durante el procedimiento de
purificación.
De esta manera, según la presente invención, una
manera de superar la selectividad limitada de las etapas de lavado
de sal es usar al menos una etapa de lavado ácido, proporcionando de
esta manera una mayor selectividad global del procedimiento de
purificación.
El procedimiento de purificación según la
invención emplea múltiples etapas de cromatografía de aniones con
al menos una etapa de lavado ácido en el procedimiento DSP,
proporcionando una alta selectividad hacia la selección de las
isoformas ácidas de proteína de un conjunto de isoformas de
proteína.
En otra forma de realización preferente de la
invención la etapa de captura mediante cromatografía de aniones es
seguida por una etapa de lavado ácido y otras etapas de
cromatografía de diferentes principios, tales como HIC o
cromatografía de afinidad. Esto puede permitir la reducción de
impurezas y proteínas que se copurifican con la etapa de captura
mediante cromatografía. El experto en la materia entiende que la
secuencia y la naturaleza de las etapas de cromatografía después de
la etapa de captura de cromatografía de aniones dependen de la
glicoproteína a purificar y pueden ser determinadas fácilmente por
el experto en la materia.
En una forma de realización todavía más
preferente de la invención, una etapa de captura mediante
cromatografía de aniones y una etapa de lavado ácido opcional son
seguidas por etapas de cromatografía de diferentes principios. En
una última etapa, otra cromatografía de intercambio de aniones y una
etapa de lavado ácido obligatoria son aplicadas a continuación para
enriquecer selectivamente la preparación para glicoproteínas con
alto contenido glicosil- y sialil-.
Por lo tanto, el procedimiento DSP de la
invención para la purificación de isoformas de eritropoyetina
humana recombinante con alto contenido de glicosil- y sialil-, a
partir de fluidos de cultivo celular, comprende el procedimiento de
purificación siguiente:
- a)
- una etapa de cromatografía de intercambio de aniones como una etapa de captura y una etapa de lavado ácido.
\vskip1.000000\baselineskip
Preferentemente, el procedimiento para la
purificación de isoformas de eritropoyetina humana recombinante con
un alto contenido de sialil-, a partir de los fluidos de cultivo
celular comprende las etapas siguientes:
- a)
- una primera etapa de cromatografía de intercambio de aniones como una etapa de captura y una etapa de lavado ácido,
- b)
- etapas de cromatografía basadas en un principio diferente a la cromatografía de intercambio de aniones, tal como una cromatografía HIC y de afinidad.
\vskip1.000000\baselineskip
Otro procedimiento preferente para la
purificación de isoformas de eritropoyetina humana recombinante con
un alto contenido de glicosil- y sialil-, a partir de los fluidos de
cultivo celular, comprende las etapas siguientes:
- a)
- una primera etapa de cromatografía de intercambio de aniones como una etapa de captura,
- b)
- etapas de cromatografía basadas en un principio diferente a la cromatografía de intercambio de aniones, tal como una purificación por cromatografía HIC y de afinidad,
- c)
- una segunda etapa de cromatografía de intercambio de aniones.
en el que al menos una etapa de lavado ácido es
combinada con la subetapa a) y/o la subetapa c).
\newpage
Un procedimiento todavía más preferente para la
purificación de isoformas de eritropoyetina humana recombinante con
un alto contenido de glicosil- y sialil-, a partir de los fluidos de
cultivo celular, comprende las etapas siguientes:
- a)
- una primera etapa de cromatografía de intercambio de aniones como una etapa de captura y una etapa de lavado ácido opcional,
- b)
- HIC,
- c)
- cromatografía de afinidad,
- d)
- una segunda etapa de cromatografía de intercambio de aniones y una etapa de lavado ácido.
La cromatografía de interacción hidrofóbica de
la etapa b) usa preferentemente una resina de cromatografía butil
sefarosa. La cromatografía de afinidad de la etapa c) usa
preferentemente una resina de cromatografía en hidroxiapatita. El
orden de las subetapas b) y c) puede ser también invertido. La
elución en las subetapas a) a d) puede realizarse como elución
escalonada o de gradiente, dependiendo de las circunstancias
específicas.
En adelante, se describirán en detalle las
diferentes etapas del procedimiento DSP.
\vskip1.000000\baselineskip
Los fluidos del cultivo celular eran
generalmente de fermentaciones, realizadas al valor preferente de
pH de 7,2, proporcionando glicoproteína altamente sialilada,
cualificadas así para el enriquecimiento adicional de la isoforma
pl ácida mediante la secuencia especificada anteriormente. Una forma
de realización preferente de la preparación del fluido del cultivo
celular se proporciona en la sección de ejemplo.
Generalmente los fluidos del cultivo celular o
generalmente las mezclas de proteínas complejas fueron concentrados
mediante ultrafiltración y dialisados contra un tampón que permite
la unión de la glicoproteína a la resina de intercambio de
aniones.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
a)
La cromatografía de intercambio de aniones como
etapa de captura puede realizarse con todas las membranas o resinas
de intercambio de aniones comunes disponibles comercialmente. Las
resinas de intercambio de aniones pueden ser usadas en forma de
columnas pre-vertidas. Alternativamente, las
columnas pueden ser auto-preparadas.
No hay limitaciones específicas en relación a la
capacidad y la geometría de las columnas aparte de las normales. El
experto en la materia conoce que la cantidad de resina de
intercambio de aniones a usar depende del contenido global de
proteína del fluido del cultivo celular aplicado a la columna en la
etapa de captura.
Las resinas de intercambio de aniones típicas
que pueden ser usadas para el propósito de la invención comprenden
grupos funcionales tales como:
- \bullet
- Fracciones dietilaminoetil (DEAE), las resinas incluyen por ejemplo DEAE-Sefarosa (Amersham Biosciences, Alemania), soporte Macroprep DEAE (Bio-Rad, Alemania), Fractorgel EMD DEAE (Merck, Alemania) y otros
- \bullet
- Fracciones aminoetil cuaternario (QAE), las resinas incluyen por ejemplo Toyopearl QAE (Toyo Biosep, Alemania) y otros
- \bullet
- Fracciones de amoníaco cuaternario (Q), las resinas incluyen por ejemplo Q-Sefarosa XL (Amersham Biosciences, Alemania), Q-Sefarosa FF (Amersham Biosciences, Alemania), Resource Q (Amersham Biosciences, Alemania), Macro Prep. High Q (Biorad, Alemania), Toyopearl Super Q (Toyo Biosep, Alemania)
- \bullet
- Fracciones dimetilaminoetil (DMAE), las resinas incluyen por ejemplo Fractogel EMD DMAE (Merck AG, Alemania)
- \bullet
- Fracciones trimetilaminoetil (TMAE), las resinas incluyen por ejemplo Fractogel EMD TMAE (Merck AG, Alemania)
- \bullet
- Absorbedor de membrana Sartobind (MA) Q100 (Sartorius, Alemania)
La captura puede realizarse normalmente entre
2ºC y temperatura ambiente. Preferentemente se realiza entre
2-8ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Los tampones de equilibrado, lavado y elución
pueden comprender todos los tipos de tampones usados normalmente
para la cromatografía de intercambio de aniones (Deutscher (1990)
Protein Purification, Academic Press, NY). De esta manera, los
agentes tamponadores comprenden fosfato de Na, acetato de Na
Tris/HCl, HEPES u tros agentes tamponadores adecuados. Además los
tampones pueden contener entre 5 mM y 1 M de NaCl, KCl u otras
sales adecuadas, dependiendo de si el tampón es usado para el
equilibrado, lavado o elución. Los tampones de equilibrado y lavado
contienen concentraciones más bajas de las sales indicadas
anteriormente que los tampones de elución. Los tampones pueden
contener también entre 1 y 10 mM de MgCl_{2} o CaCl_{2}. Además
los tampones pueden contener entre 0,5 y 10 mM EDTA y otros
inhibidores de proteasa tales como fluoruro de fenilmetanosulfonilo
(PSMF). El pH de los tampones se ajustará normalmente a un pH entre
6,8 y 7,8, preferentemente entre 7,0 y 7,6 y más preferentemente
entre 7,2 y 7,5 e incluso más preferentemente a un pH de 7,5. Para
la composición de tampón de los tampones usados para las etapas de
lavado ácido ver más adelante.
Preferentemente los tampones de equilibrado y
lavado contienen entre 5-50 mM fosfato de Na pH 7,5
y más preferentemente 20 mM fosfato de Na pH 7,5. Los tampones de
elución contienen entre 150-500 mM NaCl y 5- 50 mM
fosfato de Na pH 7,5 y preferentemente 300 mM NaCl, 20 mM fosfato de
Na pH 7,5.
\vskip1.000000\baselineskip
El equilibrado de columnas es realizado
normalmente con 5 a 20 volúmenes de columna (CV) del tampón de
equilibrado. El lavado de las columnas tras la carga es realizado
normalmente con 2 a 5 CV de tampón de lavado. La elución se realiza
normalmente mediante una etapa de elución con 2 a 5 CV del tampón de
elución.
El índice de fluencia de las diversas etapas
depende de la geometría de las columnas y de la resina usada. Puede
ser calculado según las instrucciones del fabricante o según
principios generales. El índice de fluencia durante la elución es
generalmente menor que el índice de fluencia durante el equilibrado,
carga y lavado.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
b)
El material eluído a partir de la etapa de
captura contiene normalmente altas concentraciones de sal (entre
100 y 500 mM NaCl o KCl). Por lo tanto, una continuación útil como
etapa siguiente es una cromatografía de interacción hidrofóbica
(HIC) como la primera etapa de pulido. El eluato de la etapa de
captura es cargado después de que ha sido diluido, normalmente con
tampón fosfato e isopropanol.
La HIC puede realizarse con todas las resinas
HIC normales disponibles comercialmente. La HIC puede usarse en
forma de columnas pre-vertidas. Alternativamente,
las columnas pueden ser auto-preparadas.
No hay limitaciones específicas en relación a la
capacidad y la geometría de las columnas aparte de las normales. El
experto en la materia conoce que la cantidad de resina HIC a usar
depende del contenido global de proteína de la preparación de
proteína aplicada a la columna.
\vskip1.000000\baselineskip
Las resinas HIC que pueden ser usadas para el
propósito de la invención comprenden matrices tales como butil-,
fenil-, propil- u octil- sefarosa (Amersham Bioscience, Alemania),
Macro-Prep metil o t-butil HIC
soporte (Biorad, Alemania) o Fractogel EMD con ligandos propil o
fenil (Merck AG, Alemania). El material preferente para la
cromatografía de interacción hidrofóbica es
butil-sefarosa.
\vskip1.000000\baselineskip
La HIC puede realizarse normalmente entre 2 y
35ºC. Preferentemente se realiza a 15-25ºC. En el
caso de la eritropoyetina la temperatura no debería ser inferior a
18ºC, ya que la eritropoyetina no se une cuantitativamente a la
resina HIC a temperaturas menores.
\vskip1.000000\baselineskip
Los tampones de equilibrado, lavado y elución
pueden comprender todos los tipos de tampones usados normalmente
para HIC (Deutscher (1990) Protein Purification, Academic Press,
NY). De esta manera, los agentes tamponadores comprenden fosfato de
Na, acetato de Na, Tris/HCl, HEPES u otros agentes tamponadores.
Además, los tampones pueden contener entre 0,5 mM y 3 M NaCl, KCl u
otras sales dependiendo de si el tampón es usado para el
equilibrado, lavado o elución. Los tampones de equilibrado y lavado
contienen concentraciones mayores de la sales indicadas
anteriormente que los tampones de elución.
El tampón de equilibrado y el tampón de lavado
contienen hasta el 30%, preferentemente hasta el 10% de un alcohol,
tal como isopropanol. El tampón de elución contiene hasta el 50%,
preferentemente hasta el 19% de un alcohol, tal como
isopropanol.
Los tampones pueden contener también entre 1 y
10 mM de MgCl_{2} o CaCl_{2}. Además los tampones pueden
contener entre 0,5 y 10mM EDTA y otros inhibidores de proteasa,
tales como fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF).
El pH de los tampones de dilución, equilibrado y
lavado se ajustará normalmente a un valor de pH entre 6,8 y 7,8,
preferentemente entre 7,0 y 7,7, más preferentemente entre 7,2 y 7,6
e incluso más preferentemente a un pH de 7,5. El pH del tampón de
elución se ajustará normalmente a un valor de pH entre 6,5 y 7,5,
preferentemente entre 6,7 y 7,2 e incluso más preferentemente a un
pH de 6,9.
El tampón de dilución contiene preferentemente
entre 2 y 6 M NaCl, 5-50 mM de fosfato de Na pH 7,5
y más preferentemente 4 M NaCl, 20 mM fosfato de Na pH 7,5.
Preferentemente, los tampones de equilibrado y lavado contienen
entre 1-2,5 M NaCl, 5-50 mM fosfato
de Na pH 7,5, 5-15% isopropanol y más
preferentemente 2 M NaCl, 20 mM fosfato de Na pH 7,5, 10%
isopropanol. El tampón de elución contiene entre
0,5-1 M NaCl, 5-50 mM Tris/HCl, pH
6,9, 10-50% de isopropanol, 5-10 mM
CaCl_{2} y preferentemente 0,75 M NaCl, 20 mM Tris/HCl, pH 6,9,
19% isopropanol, 5 mM de CaCl_{2}.
\vskip1.000000\baselineskip
El equilibrado de las columnas se realiza
normalmente con 5 a 15 volúmenes de columna (CV) de tampón de
equilibrado. El lavado de las columnas tras la carga se realiza
normalmente con entre 3 y 7 CV de tampón de lavado. La elución se
realiza normalmente mediante una elución escalonada con entre 2 y 5
CV de tampón de elución.
El índice de fluencia de las diversas etapas
depende de la geometría de las columnas y de la resina usada. Puede
calcularse según las instrucciones del fabricante o según principios
generales.
\vskip1.000000\baselineskip
El ajuste de la conductividad de la carga fue
identificado como crítico con el fin de no perder eritropoyetina y
otras glicoproteínas en el flujo continuo. Según la invención la
conductividad de la carga durante la HIC debería ser comparable a
la del tampón de equilibrado. La conductividad en la carga fue
ajustada típicamente a entre 95-105 mS/cm.
\vskip1.000000\baselineskip
La formación de precipitación fue observada
inmediatamente después de la elución de la resina HIC en algunos
casos, quizás debido al contenido de isopropanol. Incluso si el
eluato era diluido al 10% de isopropanol o menos (ver más adelante),
ocurrió la precipitación.
De esta manera, en el caso de la eritropoyetina
la precipitación ocurrió después de la elución de la columna
butil-sefarosa (ver más adelante). Además, cuando el
eluato fue diluido a 6,3% de isopropanol con tampón a temperatura
ambiente y fue almacenado durante la noche a 4ºC, la precipitación
se incrementó adicionalmente. Se asume que la precipitación fue
inducida por un efecto combinado de la concentración de solvente y
la temperatura. La precipitación llevó a pérdidas considerables
(pérdida < 30% en eritropoyetina).
Por lo tanto, según la invención, las fracciones
de eluato de la etapa HIC que contienen eritropoyetina o la
glicoproteína deseada deberían ser diluidas inmediatamente con
tampón frío a una concentración inferior al 10%, preferentemente
inferior al 7% e incluso más preferentemente inferior al 5% de
isopropanol. En el caso de una dilución de eritropoyetina a una
concentración de \leq 6,3% de isopropanol previene la formación de
precipitado.
\newpage
Etapa
c)
La purificación por afinidad puede realizarse
con todas las resinas de afinidad normales disponibles
comercialmente que son adecuadas para la purificación de
glicoproteínas. Las resinas de afinidad pueden estar diseñadas
también específicamente para determinas glicoproteínas. Las resinas
de afinidad pueden ser usadas en forma de columnas
pre-vertidas. Alternativamente las columnas pueden
ser auto-preparadas.
No hay limitaciones específicas en relación a la
capacidad y la geometría de las columnas aparte de las normales. El
experto en la materia conoce que la cantidad de resina de afinidad a
usar depende del contenido global de proteína de la preparación de
proteína aplicada a la columna.
\vskip1.000000\baselineskip
Las resinas de afinidad que pueden usarse para
el propósito de la invención comprenden matrices tales como
Macro-Prep (Bio-Rad, Alemania),
tinta-Sefarosa (Biotechnol. Appl. Biochem. 29,
151-156, 1999), resinas de afinidad por ligando
peptídico (Kaufmann D.B., Biotech. Bioeng., Vol. 77, No. 3, Feb. 5,
278-288, 2002) resinas de afinidad por anticuerpos
(Ben Ghanem et al., Preparative Biochemistry 24 (2):
127-142, 1994), resinas de afinidad por lectina
(Amersham Biosciences, Alemania).
\vskip1.000000\baselineskip
La cromatografía de afinidad puede realizarse
normalmente entre 2ºC y la temperatura ambiente. Preferentemente se
realiza a temperatura ambiente.
\vskip1.000000\baselineskip
Los tampones de equilibrado, lavado y elución
pueden comprender todos los tipos de tampones usados normalmente
para las resinas de afinidad respectivas (Deutscher (1990) Protein
Purification, Academic Press, NY). De esta manera, los agentes
tamponadores, por ejemplo para la cromatografía de hidroxiapatita,
pueden comprender fosfato de Na, acetato de Na, Tris/HCl, HEPES y
otros agentes tamponadores adecuados. Además los tampones pueden
contener entre 0 y 1 M de NaCl, KCl y otras sales adecuadas,
dependiendo de si el tampón es usado para el equilibrado, lavado o
elución. Los tampones de elución comprenderán también entre 0 y 200
mM K_{2}HPO_{4} para formar un gradiente. El tampón de
equilibrado puede contener también entre 1 y 10 mM de MgCl_{2},
CaCl_{2}. Además los tampones pueden contener entre 0,5 y 10 mM
EDTA y otros inhibidores de proteasa tales como fluoruro de
fenilmetanosulfonilo (PMSF).
El pH de los tampones será ajustado normalmente
a un pH entre 6,7 y 7,8, preferentemente entre 6,8 y 7,5, más
preferentemente entre 6,8 y 7,2 e incluso más preferentemente a un
pH de 6,9. Si la HIC ha precedido a la cromatografía de afinidad,
el tampón de equilibrado y el primer tampón de lavado pueden
comprender hasta 250 mM NaCl y hasta el 9% de isopropanol. El
segundo tampón de lavado puede no contener isopropanol, NaCl y
CaCl_{2}.
En el caso de la cromatografía de
hidroxiapatita, los tampones de equilibrado y elución contienen
preferentemente entre 5-50 mM de Tris/HCl pH 6,9 y
más preferentemente 10-20 mM Tris/HCl pH 6,9. El
tampón de equilibrado comprende también preferentemente 250 mM NaCl
y 9% de isopropanol en el caso en el que la eritropoyetina es
purificada y HIC ha precedido a la purificación por afinidad. Los
tampones de elución contienen entre 0-150 mM
K_{2}HPO_{4} y 5-50 mM Tris/HCl pH 6,9 y
preferentemente de 0 a 40 mM K_{2}HPO_{4} y 20 a 16 mM Tris/HCl
pH 6,9 para formar un gradiente.
\vskip1.000000\baselineskip
El equilibrado de las columnas se realiza
normalmente con 5 a 20 volúmenes de columna (CV) de tampón de
equilibrado. El lavado de las columnas después de la carga se
realiza normalmente con 2 a 6 CV de tampón de lavado. Un segundo
lavado con 1 a 2 y preferentemente con 1 a 1,2 volúmenes de columna
de un tampón de lavado puede seguir a éste. La elución se realiza
normalmente mediante una elución por gradiente con 2 a 6 CV de
tampón de elución.
El índice de fluencia de las diversas etapas
depende de la geometría de las columnas y de la resina usada. Puede
calcularse según las instrucciones del fabricante. El índice de
fluencia, durante la elución, carga y lavado es normalmente de 80
cm/h y durante el equilibrado es normalmente de 113 cm/h.
\newpage
Etapa
d)
Tal como se ha indicado anteriormente puede
realizarse una segunda etapa de cromatografía de intercambio de
aniones al final del procedimiento DSP que define la composición de
la isoformas del producto final. Esta etapa incluye una etapa de
lavado ácido para retirar específicamente las isoformas de EPO de pI
más básico.
\vskip1.000000\baselineskip
En esta etapa puede realizarse una cromatografía
de intercambio de aniones con todas las membranas o resinas de
intercambio de aniones normales disponibles comercialmente. Las
resinas de intercambio de aniones pueden ser usadas en forma de
columnas pre-vertidas. Alternativamente, las
columnas pueden ser auto-preparadas.
No hay limitaciones específicas en relación a la
capacidad y la geometría de las columnas aparte de las normales. El
experto en la materia conoce que la cantidad de resina de
intercambio de aniones a usar depende del contenido global de
proteína del preparado de proteína aplicado a la columna.
Generalmente todas las resinas que pueden usarse
para la etapa de captura mediante cromatografía de intercambio de
aniones (tales como las expuestas en la etapa A) pueden ser usadas
para esta segunda etapa de cromatografía de intercambio de aniones.
Debido a que una cantidad considerable de proteínas habrán sido
retiradas ya en esta etapa del procedimiento DSP, pueden aplicarse
resinas de intercambio de aniones que permitan específicamente una
separación de proteínas de alta resolución.
Por lo tanto, las resinas tales como Resource Q
(Amersham Biosciences, Alemania) son usadas preferentemente en esta
etapa del procedimiento DSP. Por lo tanto, los índices de fluencia
serán generalmente más bajos que durante la etapa de captura
mediante cromatografía de intercambio de aniones (ver los
ejemplos).
\vskip1.000000\baselineskip
La captura puede realizarse normalmente entre
2ºC y la temperatura ambiente. Preferentemente se realiza a la
temperatura ambiente.
\vskip1.000000\baselineskip
Los tampones de equilibrado, lavado y elución
pueden comprender todos los tipos de tampones usados normalmente
para la cromatografía de intercambio de aniones (Deutscher (1990)
Protein Purification, Academic Press, NY). De esta manera, los
agentes tamponadores comprenden fosfato de Na, acetato de Na,
Tris/HCl, HEPES o cualquier agente tamponador adecuado. Además los
tampones pueden contener entre 0 y 1 M NaCl, KCl o cualquier sal
adecuada, dependiendo de si el tampón es usado para el equilibrado,
lavado o elución. Los tampones de equilibrado y lavado contienen
concentraciones más bajas de las sales indicadas anteriormente que
los tampones de elución. Los tampones pueden contener también entre
1 y 10 mM MgCl_{2} o CaCl_{2}. Además, los tampones pueden
contener entre 0,5 y 10 mM EDTA y otros inhibidores de proteasa
tales como fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF). El pH de los
tampones se ajustará normalmente a un valor de pH de entre 6,8 y
7,8, preferentemente entre 7,0 y 7,6, más preferentemente entre pH
7,2 y 7,5 e incluso más preferentemente a un valor de pH de 7,5.
Para la composición de tampón de los tampones usados para las etapas
de lavado ácido ver más adelante.
Preferentemente los tampones de equilibrado y
lavado contienen entre 5-50 mM fosfato de Na pH 7,4
y más preferentemente 10 mM fosfato de Na pH 7,4. Los tampones de
elución contienen entre 150-750 mM NaCl y
5-50 mM fosfato de Na pH 7,5 y preferentemente 500
mM NaCl, 15 mM fosfato de Na pH 7,4.
\vskip1.000000\baselineskip
Las columnas de equilibrado se realizan
normalmente con 5 a 20 volúmenes de columna (CV) de tampón de
equilibrado. El lavado de las columnas después de la carga es
realizado normalmente con 5 a 15 CV de tampón de lavado. La elución
es realizada normalmente bien mediante elución por gradiente o
elución escalonada con 3 a 10 CV de tampón de elución.
El índice de fluencia de las diversas etapas
depende de la geometría de las columnas y de la resina usada. Puede
ser calculado según las instrucciones del fabricante. El índice de
fluencia es generalmente de aproximadamente 200 cm/h durante el
equilibrado, carga, lavado y elución.
\vskip1.000000\baselineskip
Según la invención, al menos una etapa de lavado
ácido debe ser realizada durante el procedimiento DSP en una de las
etapas de cromatografía de intercambio de aniones. En qué etapa del
procedimiento DSP debe realizarse esta etapa de lavado ácido
depende de la glicoproteína purificada. Sin embargo, si una segunda
etapa de cromatografía de intercambio de iones es realizada durante
el procedimiento DSP, tal como es preferente para la purificación
de formas de eritropoyetina altamente sialiladas, la etapa de lavado
ácido es realizada preferentemente en la segunda etapa de
cromatografía de intercambio de aniones.
Las características generales de la etapa de
lavado ácido se exponen a continuación.
Una etapa de lavado ácido puede ser empleada
cuando en general una glicoproteína (específicamente eritropoyetina)
es unida a una matriz de intercambio de aniones, las fuerzas de
unión predominantes siendo interacciones iónicas entre los grupos
cargados positivamente de la matriz y los residuos de glicoproteína
cargados negativamente, resultando predominantemente de los
residuos de ácido siálico. Otras glicoproteínas que pueden ser
purificadas mediante este enfoque comprenden t-PA,
Factor XIII, Factor VIII, Interferon-\beta,
IL-2.
Las interacciones iónicas entre la
glicoproteína, por ejemplo eritropoyetina, y la matriz pueden ser
moduladas mediante el pH o la fuerza iónica. Se asume que reduciendo
el pH, los residuos de ácido siálico son gradualmente neutralizados
por protonación, de manera que la unión de la glicoproteína, por
ejemplo eritropoyetina, a la matriz se hace más débil, resultando
eventualmente en la elución de la eritropoyetina de la columna. Por
lo tanto, el procedimiento ácido puede ser usado para retirar las
isoformas de glicoformas con un estado de sialilación menor
(isoformas de glicoproteínas básicas, por ejemplo de
eritropoyetina), manteniendo de esta manera las isoformas de
glicoformas con un estado de sialilación mayor (isoformas de
glicoproteínas ácidas por ejemplo de eritropoyetina). Empleando una
combinación de la fuerza de la sal y el pH, el sistema puede ser
modulado adicionalmente para obtener las isoformas deseadas o para
retirar las isoformas no deseadas.
De esta manera, era un objeto de la invención
identificar las condiciones de lavado ácido (fuerza iónica y pH)
que permitan eluir selectivamente isoformas de glicoproteínas
básicas (por ejemplo eritropoyetina) y las impurezas no
relacionadas, manteniendo al mismo tiempo las isoformas de
glicoproteínas ácidas (por ejemplo eritropoyetina)
cuantitativamente preferentes. Según la invención, el procedimiento
DSP incluye de esta manera al menos una etapa de lavado ácido en una
de las etapas de cromatografía de intercambio de aniones.
De esta manera, según la invención, las etapas
de lavado ácido pueden realizarse en la etapa a) o la etapa d) sólo
si el procedimiento DSP comprende dos etapas de cromatografía de
intercambio de aniones. En otra forma de realización de la
invención, las etapas de lavado ácido pueden realizarse en la etapa
a) y la etapa d) si el procedimiento DSP comprende dos etapas de
cromatografía de intercambio de aniones.
De esta manera, la posición de la etapa de
lavado ácido no está restringida a ninguna de las 2 posiciones de
la etapa de intercambio de iones. Sin embargo, para la purificación
de glicoproteínas específicas tales como la eritropoyetina, puede
ser preferente que se realice una sola etapa de lavado ácido en la
etapa d) del procedimiento DSP. El uso de al menos una etapa de
lavado ácido en conexión con el uso repetido del mismo principio de
cromatografía de columna (intercambio de aniones) es particularmente
adecuado para incrementar la selectividad de separación de las
moléculas relacionadas de manera cercana que se diferencian por
sutiles diferencias de carga.
Si se realiza un lavado ácido en la primera
etapa de cromatografía de intercambio de aniones en la etapa a)
(etapa de captura), ésta puede servir i) para retirar principalmente
las impurezas no relacionadas de los fluidos del cultivo celular y
ii) para retirar algunas isoformas de glicoproteínas básicas (por
ejemplo, eritropoyetina).
La etapa de lavado ácido en la etapa d) (segunda
cromatografía de intercambio de aniones) sirve para retirar
específicamente de manera selectiva las isoformas de glicoproteínas
básicas (por ejemplo, eritropoyetina).
Las ventajas y características del procedimiento
de lavado ácido según la invención son las siguientes:
- -
- las etapas de lavado ácido demasiado fuertes tanto en la etapa a) como en la etapa d) causarán pérdidas de producto inaceptables;
- -
- un único lavado ácido en la etapa d) con una fuerza intermedia proporciona un perfil de isoformas de glicoformas con un enriquecimiento favorable de isoformas pI ácidas; y
- -
- una etapa de lavado ácido suave adicional en la etapa a) proporcionará un conjunto de isoformas de glicoproteínas que tiene un menor contenido de isoformas de glicoproteínas básicas y proteínas básicas contaminantes no relacionadas. Este conjunto pre-purificado de glicoproteínas está cualificado para una purificación adicional para una retirada selectiva adicional de isoformas básicas, empleando un segundo lavado ácido. Esta combinación proporciona un fuerte enriquecimiento de las isorformas pI ácidas.
Los tampones para el lavado ácido pueden
contener fosfato de Na, acetato de Na, citrato de Na, MES u otros
agentes tamponadores adecuados. Los tampones preferentes para la
etapa de lavado ácido en la etapa de captura comprenden normalmente
entre 5 y 50 mM, preferentemente entre 10 y 40 mM e incluso más
preferentemente entre 20 y 35 mM acetato de Na.
Los tampones pueden comprender también entre 1 y
10 mM MgCl_{2} o CaCl_{2}. Además los tampones pueden
comprender entre 0,5 y 5 mM EDTA y otros inhibidores de proteasa
tales como fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF).
El pH de los tampones para el lavado ácido será
ajustado normalmente a un pH entre 2,0 y 5,5, preferentemente entre
2,5 y 4,5 e incluso más preferentemente entre 3,0 y 4,0 dependiendo
del agente tamponador usado y de la glicoproteína a purificar.
Debido a que la fuerza iónica del tampón también
tiene influencia sobre la selectividad de la etapa de lavado ácido,
los tampones que contienen acetato de Na son preferentes.
Preferentemente, los tampones de lavado ácido
contienen entre 20 y 40 mM acetato de Na pH 3,0-4,0
y más preferentemente 33 mM acetato de Na pH 4,0.
\vskip1.000000\baselineskip
Una etapa de lavado ácido en la segunda etapa de
cromatografía de intercambio de aniones es realizada generalmente
con tampones de una composición igual o parecida a los tampones
usados para las etapas de lavado ácido en la etapa de captura.
Los tampones preferentes en esta segunda etapa
de intercambio de iones contienen entre 5 y 30 mM acetato de Na pH
3,0-4,0 y más preferentemente 20 mM acetato de Na pH
4,0.
\vskip1.000000\baselineskip
Más adelante, se proporcionan ejemplos que
ilustran las formas de realización preferentes de la invención para
la purificación y enriquecimiento de isoformas de eritropoyetina
altamente glicosiladas y sialiladas. Los ejemplos no deberían ser
interpretados como restrictivos de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
La eritropoyetina fue expresada con una
suspensión de línea celular de Ovario de Hámster Chino (DHFR) (CHO,
Puck et al., (1958) J. Exp. Med. 108: 945; Urlaub et
al. (1980) PNAS USA 77: 4216-4220). La línea
celular del huésped negativo de dihidrofolato reductasa (DHFR) fue
adaptada para el crecimiento en un medio libre de proteína. El gen
eritropoyetina fue subclonado en un vector portador del gen DHFR
bajo el control de un fuerte promotor de citomegalovirus. Las
células transfectadas fueron seleccionadas y el gen eritropoyetina
fue amplificado en presencia de metotrexato. Después de dos rondas
de clonación celular, los clones fueron seleccionados para un buen
crecimiento, una alta titración de producto y producción de
eritropoyetina con un patrón de glicosilación favorable. Los
patrones de glicosilación de las líneas celulares de eritropoyetina
recombinante fueron determinados mediante el mapeado de
oligosacáridos N-ligados con HPAD (Hermentin et
al. (1996) Glycobiology, 6 (2): 217-30) y HPLC
(Kanazawa (1999) Biol. Pharm. Bull 22 (4)
339-346).
El clon, que fue seleccionado para estudios
adicionales, creció (en lote) en un tiempo de duplicación de
aproximadamente 22 horas y produjo aproximadamente 45 mg/l de
eritropoyetina a una densidad celular de 2x10^{6} células/ml con
una glicoestructura altamente antenaria.
\vskip1.000000\baselineskip
Las células CHO recombinantes que producían
eritropoyetina fueron cultivadas a la escala de 2 litros y a la
escala de 20 litros en procedimientos a) discontinuos, b)
discontinuos repetidos y c) semicontinuos repetidos. Los
fermentadores fueron inoculados a una densidad celular de
aproximadamente 2x10^{5} células por ml. En los cultivos
discontinuos, las células fueron cultivadas en la fase de meseta y
fueron cosechadas a aproximadamente 2x10^{6} células por ml
(concentración de producto de aproximadamente 45 mg/l).
En un procedimiento discontinuo repetido, la
células fueron cultivadas a aproximadamente
1,5-2x10^{6} células por ml (concentración de
producto de aproximadamente 20 mg/ml) y el cultivo fue dividido a
aproximadamente 2x10^{5} células por ml retirando una parte del
cultivo y remplazando el volumen de cultivo retirado con medio
fresco para iniciar el ciclo de producción subsiguiente. El cultivo
retirado que contenía el producto fue purificado.
En el procedimiento semicontinuo repetido, el
tiempo de cultivo de los ciclos individuales del cultivo
discontinuo repetido podría extenderse 1 día suministrando un
concentrado de nutrientes al cultivo. La cosecha fue realizada 4
días después del inicio a aproximadamente
2-3x10^{6} células por ml (la productividad de
producto era de aproximadamente 30-40 mg/l). Otros
procedimientos (por ejemplo, cultivo continuo o en perfusión) son
alternativas viables.
El medio para la fermentación era un medio libre
de proteína, usado típicamente para el cultivo de células CHO, que
fue suplementado con 2 mM glutamina, 0,1% F68 Plurónico (Sigma,
Alemania) y 2 ppm antiespuma C (Sigma, Alemania). Las temperaturas
eran de entre 34ºC y 37ºC, preferentemente de 37ºC. El pH se
encontraba entre un pH de 7,2 y un pH de 7,5, preferentemente era
un pH de 7,2. Durante el cultivo, se realizó la corrección del pH
en el medio tamponado de bicarbonato mediante la inyección de
CO_{2} o adición de NaOH. La concentración de oxígeno fue
controlada a un 40% de saturación de aire mediante la aspersión del
cultivo con aire, nitrógeno y oxígeno.
Las cosechas de cultivo fueron depuradas de la
mayoría de las células (98%) mediante una centrifugación continua
con un dispositivo Biofuge 17RS (a aproximadamente 3540 x g). Las
células restantes y los desechos fueron separados mediante
filtración con un dispositivo Sartocon II (Sartorius, Alemania) y un
módulo de filtración 0,2 \mum de acetato de celulosa 0,6 m^{2}
(Nr. 3021230706W, Sartorius, Alemania).
El filtrado fue concentrado mediante
ultrafiltración y la conductividad fue ajustada por debajo de 5 mS
a aproximadamente 4 mS. La cosecha fue concentrada a entre 6 y 9
veces y fue diafiltrada con 20 mM fosfato de Na, pH 7,5. El volumen
resultante era de entre 2,2 y 3,3 litros.
Después de que la cosecha fue concentrada
mediante ultrafiltración y fue dializada, la EPO fue purificada
mediante la secuencia de etapas de cromatografía siguiente.
Por supuesto, pueden usarse también otras líneas
celulares y clones productores de EPO, por ejemplo tal como se
expone en EP-A-0 148 605 y
EP-A-0 205 564. Lo mismo se aplica a
las condiciones de cultivo, también aquí varios protocolos y
condiciones se han descrito en la literatura de patentes así como en
la literatura científica.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
a)
200 ml de resina Q Sefarosa XL (Amersham
Biosciences, Alemania) fueron empaquetados en una columna XK50
(Amersham Biosciences, Alemania). La captura fue realizada a
2-8ºC.
Se usaron los tampones siguientes:
tampón A: 20 mM fosfato de Na pH 7,5
tampón B: 300 mM NaCl, 20 mM fosfato de Na pH
7,5
\vskip1.000000\baselineskip
El procesamiento de esta etapa de cromatografía
fue realizado como se indica a continuación:
Equilibrado de la columna con 10 CV de tampón A
a 70 ml/min (220 cm/h)
Carga de la muestra a 70 ml/min (220 cm/h)
Etapa de lavado con tampón A con 2 CV a 70
ml/min (220 cm/h)
Elución con gradiente escalonado: 100% tampón B
a 25 ml/min (80 cm/h) (Pico E1 de la Figura 3)
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados se proporcionan en la Tabla
1.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
b)
400 ml de Butil-Sefarosa FF
(Amersham Biosciences, Alemania) fueron empaquetado en una columna
XK-50 (Amersham Biosciences, Alemania). La
purificación fue realizada a temperatura ambiente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usaron los tampones siguientes:
tampón A: 4 M NaCl, 20mM fosfato de Na pH
7,5
tampón B: 5 mM CaCl_{2}, 20 mM Tris HCl pH
6,9
tampón C: 2 M NaCl, 10% Isopropanol, 20 mM
fosfato de Na pH 7,5
tampón D: 0,75 M NaCl, 5 mM CaCl_{2}, 20 mM
Tris HCl pH 6,9
tampón E: 0,75 M NaCl, 5 mM CaCl_{2}, 50%
isopropanol, 20 mM Tris HCl pH 6,9
\vskip1.000000\baselineskip
El procesamiento de esta etapa de cromatografía
fue realizado como se indica a continuación:
El eluato capturado de la etapa a) fue diluido
con 85% (v/v) de tampón A. Se añadió 10% isopropanol (v/v) para
establecer una condiciones del tampón comparables al tampón C. La
conductividad era de entre 95 y 105 mS/cm.
- Equilibrado:
- 10 CV de tampón C a 25 ml/min (80 cm/h)
- Carga:
- a 25 ml/min (80 cm/h)
- Lavado:
- 3 CV de tampón C a 25 ml/min
- Elución (gradiente escalonado):
- 3 CV de 38% de tampón E y 62% de tampón D a 25 ml/min (80 cm/h)
\vskip1.000000\baselineskip
El pico E1 (ver Figura 4) fue recogido en 2,5 CV
(1000 ml) de tampón B helado y fue procesado inmediatamente en la
columna de afinidad de hidroxiapatita.
Los resultados de esta etapa se proporcionan en
la Tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
c)
135 ml de Macro-Prep (Ceramic),
Tipo I, 40 \mum (BioRad, Alemania) fueron empaquetados en un XK
26/40 (Amersham Biosciences, Alemania). El procedimiento fue
realizado a temperatura ambiente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usaron los tampones siguientes:
tampón A: 0,25 M NaCl, 5 mM CaCl_{2}, 9%
isopropanol, 20 mM Tris pH 6,9
tampón B: 20 mM Tris HCl pH 6,9
tampón D: 100 mM K_{2}HPO_{4}, 10 mM Tris,
pH 6,9
\newpage
El procesamiento de esta etapa de cromatografía
fue realizado como se indica a continuación:
- Equilibrado:
- 11,5 CV de tampón A a 10 ml/min (113 cm/h)
- Carga:
- a 7 ml/min (80 cm/h)
- Etapa de lavado 1:
- 5,75 CV de tampón A a 7 ml/min (80 cm/h)
- Etapa de lavado 2:
- 1,15 CV de tampón B a 7 ml/min (80 cm/h)
- Elución: tampón B, D:
- gradiente de 0% a 40% de tampón D en 4,6 CV a 7 ml/min
\vskip1.000000\baselineskip
Resultados: la eritropoyetina se eluye en un
pico (Figura 5), que fue procesada adicionalmente en una segunda
columna de intercambio de aniones.
Los resultados de esta etapa se proporcionan en
la Tabla 3:
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
d)
Esta etapa fue realizada con un Resource Q 1 ml
pre-empaquetado (1 ml Source 15Q, Amersham
Biosciences, Alemania). El recorrido de la columna fue realizado a
temperatura ambiente. Alternativamente, se usó una membrana de
intercambio de iones (Sartobind Membraneadsorber (MA) Q100
(Sartorius, Alemania).
Se usaron los tampones siguientes:
tampón A: 10 mM fosfato de Na pH 7,4
tampón B: 1 M NaCl, 20 mM fosfato de Na pH
7,4
tampón C: 20 mM acetato de Na pH 4,0
El procesamiento de esta etapa de cromatografía
fue realizado como se indica a continuación:
- Equilibrado:
- 10 CV de tampón A a 1 ml/min
- Carga:
- a 1 ml/min (186 cm/h)
- Lavado:
- 10 CV de tampón A a 1 ml/min
- Lavado ácido:
- 2 CV de tampón C a 1 ml/min
- Lavado:
- 10 CV de tampón A a 1 ml/min
- Elución-escalonada:
- 1 CV 50% de tampón B a 1 ml/min
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados se proporcionan en la Tabla
4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación, el pico E1 de la Figura 6 fue
analizado mediante electroforesis en gel SDS-PAGE y
la tinción Coomassie subsiguiente. Tal como puede observarse en la
Figura 6, la eritropoyetina fue eluída en una única etapa a alta
pureza, comparable a la del estándar Ph. Eur. BRP.
A continuación se analizó el pico E1 de la
Figura 6 con respecto a su contenido de isoformas mediante IEF (se
realizó una electroforesis en gel de enfoque isoeléctrico en un gel
prefabricado (Amersham Biosciences) usando el sistema Phast
(Amersham Biosciences) y aplicando un gradiente de pH de 3,5 a 6,5)
(Figura 8). Las isoformas de EPO fueron visualizadas bien mediante
transferencia Western o tinción con plata. El lavado ácido llevó a
una reducción de las isoformas pI básicas, que produjo un perfil de
isoformas muy parecido al del estándar Ph. Eur. BRP (Figura 8).
Esto fue confirmado adicionalmente por un
análisis HPLC DEAE de oligo-azúcares AB
(2-aminobenzamida) etiquetados nativo (Figura 9) y
neutral (Figura 10), que fueron liberados de la eritropoyetina
purificada (Kanazawa (1999) Biol. Pharm. Bull 22 (4)
339-346).
En otra forma de realización de la invención, el
procedimiento DSP, tal como se ha ejemplificado para la
purificación de la eritropoyetina puede comprender una etapa de
lavado ácido en la primera etapa de cromatografía de intercambio de
aniones. Esto se ejemplifica como se indica a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
a)
Los extractos del cultivo fueron preparados como
se ha detallado anteriormente. El mismo volumen fue aplicado a la
columna de intercambio de aniones.
170 ml de resina Q sefarosa XL (Amersham
Bioscience, Alemania) fueron empaquetados en una columna XK50
(Amersham Biosciences, Alemania). La captura fue realizada a
temperatura ambiente.
Se usaron los tampones siguientes:
tampón A1: 20 mM fosfato de Na pH 7,5
tampón A2: 33 mM acetato de Na pH 4,0
tampón B: 300 mM NaCl, 20 mM fosfato de Na pH
7,5
\vskip1.000000\baselineskip
El procesamiento de esta etapa de cromatografía
fue realizado como se indica a continuación:
Equilibrado de la columna con 5 CV de tampón A1
a 25 ml/min (80 cm/h)
Carga de la muestra a 25 ml/min (80 cm/h)
Etapa de lavado con tampón A1 con 2 CV a 25
ml/min (80 cm/h)
Etapa de lavado con tampón A2 con 3 CV a 25
ml/min (80 cm/h)
Elución con gradiente escalonado con tampón B a
25 ml/min (80 cm/h)
\vskip1.000000\baselineskip
La etapa de elución resultó en 2 picos (E2 y
E3). Los resultados se proporcionan en la Tabla 5.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Tal como puede observarse a partir de la Figura
11, la etapa de lavado ácido con 33 mM acetato de Na pH 4,0 lleva a
la pérdida de cierto material (E1). Ello permite, sin embargo, la
discriminación de las isoformas de eritropoyetina (E2 y E3), que se
parecen a la del estándar (Std) Ph. Eur. BRP y las isoformas de
eritropoyetina más básicas (E1). Esto proporciona un ajuste del
perfil de isoformas de eritropoyetina al del estándar BRP ya en la
etapa de captura.
También se ensayó qué condiciones de tampón de
sal son óptimas si se realiza una etapa de lavado ácido en la
segunda etapa de cromatografía de intercambio de aniones.
\vskip1.000000\baselineskip
Para optimizar las condiciones del tampón de la
etapa de lavado ácido en la segunda columna de cromatografía de
intercambio de aniones, los tampones fueron preparados de manera que
contenían 5, 10 ó 20 mM acetato de Na pH 4,0. La etapa de
purificación fue realizada tal como se ha descrito anteriormente
para la etapa d). Después los eluatos fueron analizados con
respecto a sus contenidos de isoformas de eritropoyetina mediante
IEF (Figura 12).
Las concentraciones en el intervalo de 5 mM, 10
mM y 20 mM de acetato de Na pH 4,0 produjeron material creciente en
el lavado ácido (1%, 6,3% y 10%) y un desplazamiento hacia un perfil
de isoformas más ácidas de la eritropoyetina eluída. Tal como se
muestra en la Figura 12, a un lavado de 20 mM acetato de Na pH 4,0,
el perfil de isoformas de eritropoyetina se parece mucho al del
estándar Ph. Eur. BRP. Por lo tanto, esta concentración es
preferente para la purificación de formas de EPO altamente
sialiladas.
La eritropoyetina, que fue expuesta a una etapa
de lavado ácido en la captura, fue procesada a través de un
protocolo de purificación de 4 etapas con o sin una segunda etapa de
lavado ácido en la segunda etapa de cromatografía de intercambio de
aniones. Las isoformas aisladas mediante la segunda etapa de
cromatografía de intercambio de aniones fueron analizadas mediante
IEF seguido por transferencia Western (ver Figura 13). La secuencia
de purificación fue por otra parte idéntica al procedimiento
descrito anteriormente.
La Figura 13 muestra que las isoformas de
eritropoyetina purificadas sin una etapa de lavado ácido adicional
en la segunda etapa de intercambio de aniones contienen la mayoría
de las bandas de isoformas tal como el estándar Ph. Eur. BRP de
eritropoyetina (Figura 13A). Pudo demostrarse además que una segunda
etapa de lavado ácido lleva a un enriquecimiento selectivo de
isoformas más ácidas, representadas por las isoformas
3-4 más ácidas (Figura 13B). El segundo lavado ácido
retira la mayoría de las isoformas de eritropoyetina básicas
restantes.
De esta manera, se ha demostrado que un
procedimiento de lavado ácido de 2 etapas es otro medio mediante el
cual puede conseguirse un enriquecimiento relativamente fuerte de
isoformas ácidas.
De esta manera, la presente invención permite la
purificación de una glicoproteína con una composición de isoformas
específica, rica en isoformas pI ácidas. Esto se consigue combinando
condiciones de cultivo celular favorables y nuevas técnicas de
purificación. En base a un clon celular, que fue seleccionado para
la productividad de producto altamente sialilado, i) las
condiciones de cultivo para la producción de isoformas altamente
sialiladas fueron identificadas como óptimas en el intervalo de pH
7,2 a pH 7,5 e ii) se descubrió que al menos una etapa de lavado
ácido en una de las etapas de intercambio de aniones durante la
purificación proporciona medidas para el enriquecimiento selectivo
adicional de las isoformas más ácidas.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
1:
Distribución de isoformas del estándar Ph. Eur.
BRP y eritropoyetina, que fue producida mediante los cultivos CHO a
pH 6,9, pH 7,2 y pH 7,5. La eritropoyetina fue purificada según un
protocolo de purificación de 2 etapas (captura con
Q-sefarosa XL y elución con sal escalonada seguida
por una etapa de HIC con butil-sefarosa FF tal como
se ha expuesto en los ejemplos) y fue analizada mediante
electroforesis capilar (CE). Los números de pico más bajos presentan
las isoformas básicas, los números de pico más altos presentan las
isoformas de pI ácido. El cultivo a pH alto proporciona un mayor
grado de isoformas ácidas de eritropoyetina. Los números de pico
corresponden a la anotación de la Ph. Eur.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
2:
Los cultivos CHO, que producen eritropoyetina,
fueron cultivados a pH 6,9, pH 7,2 y pH 7,5. Las células crecían
mejor a un pH bajo (pH 6,9) y presentaron la mejor productividad a
mayor pH (pH 7,5). El perfil de glicoformas era mejor a pH mayor (pH
7,2 y pH 7,5, ver Figura 1). Las condiciones de cultivo de pH 7,2
proporcionan buen crecimiento celular, alta sialilación de producto
y buena producción final de producto.
\newpage
Figura
3:
Perfil de elución de la etapa a) de la secuencia
de purificación. El pico E1 fue recogido, el pico E2 fue registrado
durante el lavado.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
4:
Perfil de elución de la etapa b) de la secuencia
de purificación. El pico E1 fue recogido, el pico E2 fue registrado
durante el lavado.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
5:
Perfil de elución de la etapa c) de la secuencia
de purificación. El pico de elución fue recogido tal como se indica
mediante la flecha.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
6:
Perfil de elución de la etapa d) del
procedimiento de purificación. El pico E1 fue recogido tal como se
indica mediante la flecha.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
7:
El análisis de tinción de gel
SDS-PAGE con azul Coomassie muestra una pureza
comparable entre la eritropoyetina después de la etapa d) (línea 1)
y el estándar Ph. Eur. BRP (línea 2). La línea 3 es un marcador.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
8:
Enfoque isoeléctrico del estándar Ph. Eur. BRP
(línea 1), la eritropoyetina eluída purificada de la etapa d) (línea
2) y la carga (línea 3) de esta etapa de cromatografía. La detección
se consiguió mediante transferencia Western (panel izquierdo) y
tinción de plata (panel derecho). Las isoformas pI más básicas en la
carga (línea 3) fueron significativamente retiradas por el lavado
ácido. Esto proporciona un producto (línea 2) con un perfil de
isoformas muy parecido al del estándar Ph. Eur. BRP (Línea 1).
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
9
La comparación de imagen especular de los
oligo-azúcares de la eritropoyetina nativa liberados
de la eritropoyetina purificada después de la etapa d) y los
liberados del estándar Ph. Eur. BRP. Los oligos fueron etiquetados
AB y separados mediante HPLC en una columna DEAE. Un lavado ácido en
la segunda etapa de cromatografía de intercambio de aniones produjo
una distribución de oligosacáridos de la muestra, que se compara con
la del estándar Ph. Eur. BRP (STD).
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
10:
Comparación de imagen especular de los
oligo-azúcares de la eritropoyetina neutral
liberados de la eritropoyetina purificada después de la etapa d) y
los liberados del estándar Ph. Eur. BRP. El lavado ácido en la
segunda captura produce un perfil de distribución de oligosacáridos
neutrales, que tiene un gran parecido con el del estándar Ph. Eur.
BRP (STD).
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
11:
La composición de isoformas de eritropoyetina en
la fracción de lavado ácido (E1) y los picos de elución (E2 y E3) en
la etapa de captura fueron analizados mediante IEF. Las isoformas de
proteína fueron visualizadas mediante transferencia Western. El
lavado ácido con 33 mM acetato de Na, pH 4,0 permite discriminar las
isoformas de eritropoyetina, que se parecen a las del estándar Ph.
Eur. BRP (Std) y las isoformas más básicas. Esto produce un ajuste
del perfil de isoformas de eritropoyetina al del estándar BRP ya en
la etapa de captura.
\newpage
Figura
12:
Análisis de la carga de la segunda columna de
intercambio de aniones (línea 4) y de las eluciones después de los
lavados ácidos con 20 mM (línea 3), 5 mM (línea 2) y 10 mM (línea 1)
acetato de Na pH 4,0 con respecto a la distribución de isoformas
mediante IEF. Las isoformas de proteína fueron visualizadas mediante
transferencia Western (panel izquierdo) o tinción de plata (panel
derecho). Después de un lavado ácido en la segunda etapa de
intercambio de aniones, los eluatos contenían considerablemente
menos isoformas pl básicas comparado con la carga (línea 4). El
tampón con 20 mM de acetato de Na pH 4,0 produjo la reducción más
fuerte. El perfil de isoformas es comparable al del estándar BRP
(STD).
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
13:
Análisis de las isoformas de eritropoyetina en
el eluato de la segunda etapa de intercambio de aniones, tal como es
analizado mediante IEF. Las proteínas fueron visualizadas mediante
transferencia Western. A) Purificación sin una etapa de lavado ácido
después de la segunda columna de intercambio de iones. B)
Purificación con una etapa de lavado ácido adicional después de la
segunda columna de intercambio de iones. El eluato fue recogido en 5
fracciones (F1 a F5). Se había realizado un lavado ácido en A) y B)
en la primera etapa de captura mediante cromatografía de intercambio
de aniones.
El producto sin un segundo lavado ácido (A)
contiene la mayoría de las isoformas del estándar Ph. Eur. Standard
(Estándar). El producto con un segundo lavado ácido (B) está
enriquecido selectivamente en las isoformas pl más ácidas,
representadas por las isoformas 3-4 más ácidas.
\vskip1.000000\baselineskip
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[0136]
Claims (17)
1. Procedimiento para purificar isoformas ácidas
de eritropoyetina a partir de una mezcla de proteínas compleja,
caracterizado porque el procedimiento comprende dos etapas de
cromatografía de intercambio de aniones, que están separadas por
etapas de cromatografía basadas en un principio diferente al de la
cromatografía de intercambio de aniones y al menos una etapa de
lavado ácido en una de las etapas de intercambio de aniones.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Procedimiento según la reivindicación 1
caracterizado porque
el procedimiento comprende las etapas
siguientes:
- a)
- una primera etapa de cromatografía de intercambio de aniones como una etapa de captura y una etapa de lavado ácido opcional,
- b)
- cromatografía de interacción hidrofóbica,
- c)
- cromatografía de afinidad,
- d)
- una segunda etapa de cromatografía de intercambio de aniones y una etapa de lavado ácido.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Procedimiento según la reivindicación 2
caracterizado porque
la elución en las subetapas a) a d) es realizada
mediante una elución escalonada o por gradiente.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Procedimiento según las reivindicaciones 2 ó
3 caracterizado porque
las subetapas a) y d) se realizan con membranas
o resinas de intercambio de aniones que contienen grupos
dietilaminoetil (DEAE), grupos aminoetil cuaternario (QAE), grupos
amoníaco cuaternario (Q), grupos dimetilaminoetil (DMAE) y/o grupos
trimetilaminoetil (TMAE) como grupos funcionales.
\vskip1.000000\baselineskip
5. Procedimiento según la reivindicación 4
caracterizado porque
la subetapa a) se realiza con una resina
Q-Sefarosa XL disponible comercialmente.
\vskip1.000000\baselineskip
6. Procedimiento según la reivindicación 4
caracterizado porque
la subetapa d) se realiza con una resina
Resource Q disponible comercialmente.
\vskip1.000000\baselineskip
7. Procedimiento según las reivindicaciones 2 ó
3 caracterizado porque
la subetapa b) se realiza con resinas que
contienen grupos butil-, fenil-, propil- y/o octil- como grupos
funciona-
les.
les.
\vskip1.000000\baselineskip
8. Procedimiento según la reivindicación 7
caracterizado porque
la subetapa b) se realiza con una resina
Butil-Sefarosa FF disponible comercialmente.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Procedimiento según las reivindicaciones 2 ó
3 caracterizado porque
la subetapa c) se realiza con resinas de
afinidad tales como hidroxiapatita, Ni-NTA, Talon,
resinas de cromatografía de tinción tales como Dye- o
Blue-Sefarosa, resinas de afinidad por anticuerpos,
resinas de afinidad por lectina y/o resinas de afinidad por ligandos
peptídicos.
\vskip1.000000\baselineskip
10. Procedimiento según la reivindicación 9
caracterizado porque
la subetapa c) se realiza con una resina
hidroxiapatita Macro-Prep de tipo I disponible
comercialmente.
\vskip1.000000\baselineskip
11. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10 caracterizado porque
el tampón para la etapa de lavado ácido tiene un
pH de entre 2,0 y 5,0, preferentemente entre 2,5 y 4,5 y más
preferentemente entre 3,0 y 4,0.
\vskip1.000000\baselineskip
12. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11 caracterizado porque
el tampón para la etapa de lavado ácido contiene
acetato de Na, citrato de Na, HEPES, PIPES, MES y/o MOPS como
agentes tamponadores.
\vskip1.000000\baselineskip
13. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12 caracterizado porque
el tampón para la etapa de lavado ácido en la
etapa de captura contiene entre 5 y 50 mM acetato de Na con un pH
entre 3,0 y 4,0, preferentemente entre 10 y 40 mM acetato de Na con
un pH entre 3,0 y 4,0, incluso más preferentemente entre 15 y 35 mM
acetato de Na con un pH entre 3,0 y 4,0 y más preferentemente 33 mM
acetato de Na con un pH de 4,0.
\vskip1.000000\baselineskip
14. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12 caracterizado porque
el tampón para la etapa de lavado ácido en la
segunda etapa de cromatografía de intercambio de aniones contiene
entre 5 y 50 mM acetato de Na con un pH entre 3,0 y 4,0,
preferentemente entre 10 y 40 mM acetato de Na con un pH entre 3,0 y
4,0, incluso más preferentemente entre 15 y 30 mM acetato de Na con
un pH entre 3,0 y 4,0 y más preferentemente 20 mM acetato de Na pH
4,0.
\vskip1.000000\baselineskip
15. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14 caracterizado porque la
eritropoyetina es eritropoyetina humana recombinante.
16. Isoformas ácidas de eritropoyetina
purificadas mediante un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14.
17. Isoformas ácidas de eritropoyetina según la
reivindicación 16 en las que la eritropoyetina es eritropoyetina
humana recombinante.
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