ES2312580T3 - Vacunacion en dosis unica con i mycoplasma hyopneumoniae/i. - Google Patents
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Abstract
Uso de una bacterina de Mycoplasma hyopneumoniae para la fabricación de una vacuna para el tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno en un animal causada por una infección con Mycoplasma hyopneumoniae para la administración al animal de entre 3 y 10 días de edad, de una cantidad efectiva de una dosis única de una vacuna de Mycoplasma hyopneumoniae.
Description
Vacunación en dosis única con Mycoplasma
hyopneumoniae.
La presente invención se refiere al uso de una
bacteria Mycoplasma hyopneumoniae para la fabricación de una
vacuna para el tratamiento o prevención de una enfermedad o
trastorno en un animal causada por una infección con Mycoplasma
hyopneumoniae (M. hyo) mediante la administración al animal de
aproximadamente tres (3) a diez (10) días de edad, de una dosis
única de una cantidad efectiva de una vacuna de M. hyo. La
vacuna de M. hyo es una preparación de células vivas
inactivadas o modificadas de células parciales o totales. La vacuna
de M. hyo administrada de acuerdo con la presente invención
puede producirse sintéticamente o por recombinación.
El M. hyo es un patógeno bacteriano que
provoca neumonía enzoótica en puercos. La neumonía enzoótica es una
enfermedad crónica que da lugar a una pobre conversión de los
alimentos, crecimiento atrofiado y predisposición a infecciones
pulmonares secundarias. El M. hyo se transmite fácilmente a
través de las secreciones del tracto respiratorio y por transmisión
cerda a lechón, y es altamente frecuente en las granjas de cerdos.
Aproximadamente un 99% de las piaras de Estados Unidos están
infectadas, lo que cuesta a la industria porcina aproximadamente
300 millones de dólares al año.
La mayoría de las vacunas conocidas contra el
M. hyo se han basado en preparaciones de células totales
inactivadas adyuvadas de M. hyo. Además, las vacunas basadas
en proteínas o polipéptidos inmunogénicos se pueden sintetizar o
preparar por clonación y expresión recombinante de genes de M.
hyo. También se pueden emplear como vacunas los genes de M.
hyo capaces de expresar los mencionados polipéptidos o proteínas
in vivo.
Los ejemplos de vacunas de M. hyo
inactivadas de células totales incluyen RESPISURE y STELLAMUNE,
comercialmente disponibles por parte de Pfizer Inc., Estados
Unidos.
Además, se han descrito varios polipéptidos y
proteínas inmunogénicos de M. hyo producidos por
recombinación que pueden ser útiles como vacunas de subunidades. La
publicación de patente internacional WO 96/28472 describe seis
especies de antígeno proteico de M. hyo de pesos moleculares
de 46-48, 52-54,
60-64, 72-75, 90-94
y 110-114 kilodaltons, y describe secuencias de
proteína parciales de los antígenos de 52-54,
60-64 y 72-75 kilodaltons y las
secuencias de aminoácido y nucleótido de longitud completa del
antígeno de 46-48 kilodalton.
Futo y col. (1995; J. Bacteriol 177:1915 - 1917)
describieron también la clonación del gen que codifica la proteína
P46 de M. hyo, es decir la p46. El mismo grupo mostró que el
producto de gen expresado in vitro era útil en el
diagnóstico de respuestas de anticuerpos a infecciones de M.
hyo sin reactividad cruzada a otras especies de
Mycoplasma (Futo y col., 1995, J. Clin. Microbiol.
33:680-683). Las secuencias y los usos de
diagnóstico del gen de la p46 descritos por Futo y col. se describen
además en la publicación de patente europea nº 0 475 185 A1.
Wise y Kim (1987, J. Bacteriol.,
169:5546-5555) describen que hay cuatro especies de
proteína de membrana integral en M. hyo, denominadas p70,
p65 (P65, supra), p50 y p44, y que las tres últimas están
modificadas por uniones covalentes de lípidos e inducen una
respuesta inmune humoral fuerte. No se investigaron los efectos
protectores de la respuesta inmune. Se ha clonado el gen que
codifica la proteína P65, y se describen sus secuencias y usos en
vacunas y diagnósticos en la patente de Estados Unidos Nº
5.788.962.
La publicación de patente internacional WO
91/15593 describe cinco proteínas de M. hyo de pesos
moleculares aparentes de 105, 90, 85, 70 y 43 kilodaltons. Se
proporciona una secuencia de longitud completa del gen que codifica
la proteína de 85 kilodaltons (proteína C), ya que fueron secuencias
de nucleótidos parciales las que codificaban las otras cuatro
proteínas.
La patente de Estados Unidos Nº 5.252.328 de
Faulds describe secuencias con terminación en amino de proteínas de
M. hyo inmunoreactivas, los pesos moleculares de las mismas
son 36, 41, 44, 48, 64, 68, 74,5, 79, 88,5, 96 y 121 kilodaltons.
Otras proteínas identificadas se basan en movilidades
electroforéticas pero para estas no se ha descrito secuencias
proteicas que tuviesen pesos moleculares aparentes de22,5, 34 y 52
kilodaltons. Aunque la patente de Estados Unidos nº 5.252.328
propuso el uso de estas proteínas en formulaciones de vacuna no se
han reseñado los resultados de los ensayos de las vacunas.
La publicación de patente internacional WO
95/09870 describe procedimientos bioquímicos para la purificación
de adhesinas de M. hyo, las proteínas de membrana integrales
micoplasmales responsables de la adhesión al cilio del epitelio
respiratorio superior del huésped. El documento WO 95/09870 también
propone ensayos y usos para estas proteínas, por ejemplo en vacunas
y diagnósticos.
Un trabajo de investigación de King y col.
(1997; Vacuna 15:25-35) describe la Mhp1, una
adhesina de 124 kilodaltons que es una variante de la cepa de la
P97.
Wilton y col. (1988, Microbiology
144:1931-1943) identificaron una variante de la P97
de 94 kilodalton. De forma adicional se mostró que el gen p97 era
parte de un operon que también codificaba una segunda proteína,
denominada P102, de un peso molecular estimado de aproximadamente
102 kilodaltons (Hsu y col., 1998, gen 214:13-23).
Minion y Hsu sugirieron el uso de P102 en vacunas en la publicación
de patente internacional WO 99/26664 pero no reseñaron ensayos de
vacunas.
Loyd L. C. et al (1989; Australian
Veterinary Journal, vol. 66, nº 1, páginas 9 - 12) describe un
procedimiento para el tratamiento o prevención de una enfermedad en
cerdos provocada por la infección con Mycoplasma
hyopneumoniae. La edad media de los animales tratados es 75,6
días.
Ninguna de las vacunas de M. hyo
conocidas se ha descrito como efectiva en un tratamiento en dosis
única de puercos de aproximadamente 3 a 10 días de edad. Tal vacuna
eliminaría la necesidad de dosificación múltiple y por tanto
disminuiría de forma significativa los costes y el trabajo asociado
con la vacunación masiva de piaras en todo el mundo. Por lo tanto,
hay una necesidad de una vacuna efectiva de M. hyo que se
pueda administrar a puercos en una vacunación en dosis única a
aproximadamente 3 a 10 días de edad para la protección y prevención
de enfermedades o trastornos causados por M. hyo.
La presente invención proporciona el uso de una
bacteria Mycoplasma hyopneumoniae para la fabricación de una
vacuna para el tratamiento o prevención de una enfermedad o
trastorno en un animal causada por una infección con Mycoplasma
hyopneumoniae que comprende la administración al animal de
aproximadamente 3 a aproximadamente 10 días de edad de una cantidad
efectiva de una dosis única de una vacuna de Mycoplasma
hyopneumoniae.
El uso de la presente invención elimina la
necesidad de dosis adicionales con el fin de generar y/o mantener
la inmunidad contra M. hyo. El presente procedimiento de
vacunación en dosis (una) única proporciona protección a cerdos
tanto seronegativos como seropositivos contra desafío con M.
hyo virulento. El uso de la presente invención es efectivo en
el tratamiento o prevención de los síntomas causados por infección
por M. hyo, incluyendo, por ejemplo, la prevención y la
reducción de lesiones pulmonares en puercos.
La vacuna de M. hyo administrada de
acuerdo con la presente invención puede incluir componentes
adicionales, tales como un adyuvante. Los diferentes adyuvantes que
se pueden emplear incluyen aquellos descritos en el presente
documento y los conocidos en la técnica.
La presente invención comprende el uso de una
bacteria Mycoplasma hyopneumoniae para la fabricación de una
vacuna para el tratamiento o prevención de una enfermedad o
trastorno en un animal causada por una infección con Mycoplasma
hyopneumoniae que comprende la administración al animal de
aproximadamente 3 a 10 días de edad de una cantidad efectiva de una
dosis única de una vacuna de Mycoplasma hyopneumoniae.
La vacunación en dosis única de la presente
invención elimina la necesidad de administrar dosis adicionales a
puercos con el fin de generar y/o mantener la inmunidad contra M.
hyo.
Para claridad de la descripción, y no a modo de
limitación, la descripción detallada de la invención se divide en
las siguientes subsecciones que describen o ilustran ciertas
características, realizaciones o aplicaciones de la invención.
En determinadas realizaciones, las vacunas
empleadas en el uso de presente invención comprenden una preparación
(bacterina) inactivada de células parciales o totales de M.
hyo o una vacuna de células vivas modificadas y un vehículo
farmacéuticamente aceptable, o una preparación (bacterina)
inactivada de células parciales o totales de M. hyo o una
vacuna de células vivas modificadas y un adyuvante.
El término "tratar o prevenir" respecto a
una infección por M. hyopneumoniae tal como se usa en el
presente documento significa inhibir la replicación de las
bacterias M. hyopneumoniae para inhibir la transmisión de
M. hyopneumoniae o evitar que M. hyopneumoniae se
establezca por si mismo en su huésped, y aliviar los síntomas de la
enfermedad o trastorno provocado por infección de M.
hyopneumoniae. Se considera que el tratamiento es terapéutico
si hay una reducción en la carga bacteriana, disminución de las
infecciones pulmonares y/o aumento en la captación de alimentos y/o
crecimiento. El procedimiento de la presente invención es, por
ejemplo, efectivo en la prevención o reducción de lesiones
pulmonares.
El término "vacuna de M. hyo" tal
como se usa en el presente documento se refiere a una vacuna útil en
el tratamiento o prevención de un trastorno o enfermedad causada
por infección por M. hyo. La vacuna de M. hyo puede
incluir cualquier vacuna efectiva en el tratamiento o prevención de
una infección en puercos por M. hyo. La vacuna de M.
hyo que se puede emplear en la presente invención puede incluir,
por ejemplo, una preparación de células M. hyo totales o
parciales, vacunas de células vivas inactivadas o modificadas, una
vacuna de subunidades que presenta uno o más polipéptidos o
proteínas derivadas de M. hyo, o fragmentos inmunogénicos de
las mencioandas proteínas o polipéptidos, o uno o más genes o ácidos
nucleicos de M. hyo que codifican para una o más proteína o
polipéptidos derivados de M. hyo o fragmentos inmunogénicos
de los mismos y cuyos genes o ácidos nucleicos son capaces de ser
expresados in vivo en puercos. Los polipéptidos, proteínas,
fragmentos inmunogénicos de M. hyo de los mencionados
polpéptidos y proteínas, o genes o ácidos nucleicos de M.
hyo se pueden producir sintéticamente o de forma recombinante
empleando técnicas conocidas en la técnica. Preferiblemente, la
vacuna de M. hyo empleada en el procedimiento de la presente
invención es una bacterina.
El término "animal" tal como se usa en el
presente documento se refiere a todo animal no humano incluyendo
mamíferos.
El término "cerdo" tal como se usa en el
presente documento se refiere a lechones, puercos, cerdos, ganado
porcino, cerdas, cerdas jóvenes, cerdos castrados, jabalís y
miembros de la familia Suidae.
Preferiblemente el procedimiento de la presente
invención se aplica a un animal que es un mamífero no humano; lo
más preferiblemente, un cerdo.
El término "bacterina" tal como se usa en
el presente documento se refiere a una preparación de células de
M. hyo parciales o totales inactivadas adecuada para su uso
como una vacuna.
El término "cantidad efectiva" se refiere a
una cantidad de vacuna M. hyo suficiente para dar lugar a
una respuesta inmune en el sujeto al que se administra. La respuesta
inmune puede comprender, sin limitación, la inducción de innato,
inmunidad celular y/o humoral.
En la técnica se conocen los procedimientos para
la preparación de vacunas de células vivas inactivadas o
modificadas para usar en el procedimiento de la presente
invención.
Las bacterinas de M. hyo que se pueden
emplear en el presente procedimiento de vacunación en dosis única
se pueden obtener a partir de varias fuentes públicamente
disponibles. Por ejemplo, las bacterinas de M. hyo se pueden
preparar a partir de aislados de M. hyo. Los especialistas en
la técnica conocen numerosos aislados de M. hyo y están
disponibles en, por ejemplo, el American Type Culture Collection,
University Bolevard 10801, Manassas, VA 20110-2209.
Estos incluyen por ejemplo: los ATTC números 25095, 25617, 25934,
27714 y 27715.
Los aislados de M. hyo se pueden obtener
también directamente a partir de lesiones pulmonares porcinas
infectadas de forma natural o experimental empleando técnicas
conocidas.
Los aislados de M. hyo se pueden
inactivar empleando una variedad de procedimientos conocidos, por
ejemplo, tratamiento del aislado bacteriano con etilenimina binaria
(BEI) tal como se describe en la patente de Estados Unidos nº
5.565.205 o inactivación con, por ejemplo, formalina, calor, BPL,
irradiación o glutaraldehído.
Las bacterinas de M. hyo adecuadas para
su uso en el procedimiento de la presente invención se pueden
obtener también a partir de varias fuentes comerciales. Las
mencionadas fuentes incluyen pero sin limitarse a estas: RESPIFEND
(Fort Dodge, American Home Products), HYORESP (Merial Ltd), M + PAC
(Schering Plough), PROSYSTEM M (Intervet), INGLEVAC M (Boehringer),
RESPISURE (Pfizer Inc.) y STELLAMUNE MYCOPLASMA (Pfizer Inc.).
Una fuente preferida de bacterina de M.
hyo para el uso en el procedimiento de la presente invención es
RESPISURE y STELLAMUNE MYCOPLASMA.
Una fuente particularmente preferida de
bacterina de M. hyo para su uso en el procedimiento de la
presente invención es el RESPISURE-1 (Pfizer Inc.),
que contiene la cepa P-5722-3 (NL
1042), adquirida a Purdue University, Estados Unidos.
Preferiblemente la cepa
P-5722-3 se inactiva con BEI y se
adyuva con un adyuvante comercialmente disponible, preferiblemente
AMPHIGEN (Hydronics, Estados Unidos). Una dosis preferida es de
aproximadamente 2,0 ml. Los conservantes que se emplean
convencionalmente incluyen mertiolato/EDTA (ácido
etilendiaminotetracético). Se puede añadir un vehículo,
preferiblemente PBS. Se conoce en la técnica la preparación de
vacunas de células vivas modificadas tal como por medio de
atenuación de cepas virulentas por pase en cultivo.
Las preparaciones adecuadas de vacunas empleadas
en la presente invención incluyen preparaciones inyectables, bien
en soluciones líquidas o suspensiones; también se pueden preparar
formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, líquido
previo a inyección. La preparación también se puede emulsionar. Los
ingredientes inmunogénicos activos se mezclan frecuentemente con
adyuvantes que sean farmacéuticamente aceptables y compatibles con
el ingrediente activo.
Los polipéptidos se pueden formular en vacunas
en formas neutras o sales. Las sales farmacéuticamente aceptables
incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupo amino
libres del polipéptido) y las formadas con ácidos orgánicos, tales
como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos
orgánicos tales como ácido acético, oxálico, tartárico, maleico y
similares. Las sales formadas con los grupo carboxilo libres pueden
derivarse también de bases inorgánicas, tales como, por ejemplo
hidróxidos de potasio, sodio, amonio, calcio o férrico, y bases
orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina,
2-etilamino, etanol, histidina, procaína y
similares.
Las formulaciones de vacuna empleadas en la
presente invención comprenden una cantidad inmunizante del
inmunógeno de M. hyo y un vehículo farmacéuticamente
aceptable. Las preparaciones de vacuna comprenden una cantidad de
inmunización eficaz de uno o más antígenos y un vehículo
farmacéuticamente aceptable. Los vehículos farmacéuticamente
aceptables son bien conocidos en la técnica e incluyen pero sin
limitarse a estos, solución salina, solución salina tamponada,
dextrosa, agua, glicerol, tampón acuoso isotónico estéril y
combinaciones de los mismos. Un ejemplo de tal vehículo aceptable
es un medio de cultivo equilibrado fisiológicamente que contenga uno
o más agentes de estabilización tales como proteínas hidrolizadas
estabilizadas, lactosa etc. El vehículo es preferiblemente estéril.
La formulación se adecuaría al modo de administración.
El uso de antígenos purificados como
preparaciones de vacuna se puede llevar a cabo por procedimientos
convencionales. Por ejemplo, la(s) proteína(s)
purificada(s) debería(n) ajustarse a una concentración
adecuada, formulada con cualquier adyuvante de vacuna adecuado y
embalado para el uso. Los adyuvantes adecuados pueden incluir, pero
sin limitarse a estos: geles minerales, por ejemplo, hidróxido de
aluminio; sustancias tensioactivas tales como lisolecitina;
glicósidos, por ejemplo derivados de saponina tales como Quil A o
GPI-0100; tensioactivos catiónicos, por ejemplo,
DDA (halogenuros de amonio de hidrocarburos cuaternarios, polioles
plurónicos; polianiones; polímeros de bloque no iónicos, por
ejemplo Pluronic F-127 (B.A.S.F., Estados Unidos);
Avidina y Rantidina; péptidos; toxinas mutantes hábiles
recombinantes, por ejemplo leucotoxina (mlT) o toxina de cólera
(CT); transportadores moleculares unidos químicamente o de
proximidad estrecha; aceites minerales, por ejemplo, Montanide
ISA-50 (Seppic, París, Francia), carbopol, Amphigen
(Hydronics, Estados Unidos, Omaha, NE estados Unidos, Alhydrogel
(Superfos Biosector, Frederikssund, Dinamarca), emulsiones de
aceite, por ejemplo una emulsión de aceite mineral tal como
BayolF/Arlacel A y agua o una emulsión de aceite vegetal, agua y un
agente emulsificante tal como lecitina; alumbre, MDP,
N-acetil-muramil-L-treonil-D-isogluramina
(thr-MDP),
N-acetil-nor-muramil-L-alanil-D-isoglutamina,
N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoíl-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina;
citoquinas de coloesterol y combinaciones de adyuvantes. Iones
policatiónicos también pueden funcionar como una suspensión
monodispersa después de un período más prolongado de sedimentación.
Las combinaciones de adyuvantes pueden estar presentes en formas
encapsuladas (de liberación controlada o retrasada) o
microencapsuladas.
El inmunógeno también puede incorporarse en
liposomas o conjugarse con polisacáridos y/o otros polímeros para
su uso en una formulación de vacuna. En casos en los que el antígeno
recombinante es un hapteno, es decir, una molécula que es
antigénica de forma que pueda reaccionar de forma selectiva con
anticuerpos afines, pero no inmunogénicos de forma que no puedan
dar lugar a una respuesta inmune, el hapteno pueden unirse de forma
covalente a un vehículo o molécula inmunogénica; por ejemplo, una
proteína grande tal como albúmina del suero que conferirá
inmunogenicidad al hapteno acoplado con ella. El
vehículo-hapteno se puede formular para su uso como
una vacuna.
El procedimiento de la presente invención puede
llevarse a la práctica empleando genes o ácidos nucleicos de M.
hyo que codifican proteínas, polipéptidos inmunogénicos y
fragmentos inmunogénicos de las mencionadas proteínas y
polipéptidos. Los mencionados genes y ácidos nucleicos se pueden
expresar in vivo y se pueden preparar empleando técnicas
conocidas en la técnica.
En una realización específica la vacuna empleada
en la presente invención comprende al menos un gen o ácido nucleico
que codifica para una proteína de M. hyo tal como, pero sin
limitarse a estas, P46, P65, P97, P102, P70, P50, y P44.
En una realización específica adicional los
genes o ácidos nucleicos empleados en el procedimiento de la
presente invención codifican para los fragmentos inmunogénicos de
las proteínas o polipéptidos de M. hyo que presentan una
secuencia que comprende al menos 10, al menos 20, al menos 30, al
menos 40, al menos 50 o al menos 100 aminoácidos contiguos de las
proteínas y polipéptidos inmunogénicos empleados en el procedimiento
de la presente invención, incluyendo pero sin limitarse a estos,
P46, P65, P97, P102, P70, P50, y P44.
En otras realizaciones del procedimiento de la
presente invención, el gen o ácidos nucleicos empleados se
administran por procedimientos conocidos, tales como, por ejemplo,
mediante el uso de una pistola génica.
Aún en otras realizaciones del procedimiento de
la presente invención, el gen o ácidos nucleicos empleados son
vacunas de ADN. Además, el ácido nucleico o genes pueden estar
presentes asociados a liposomas u otros agentes que favorezcan la
transfección, tal como se conoce en la técnica.
Los procedimientos para la preparación y
liberación de vacunas de ADN son conocidos en la técnica, Véase por
ejemplo, Krishnan, B. R., "Current status of DNA vaccines in
veterinary medicine", Advenced Drug Delivery Reviews, Elsevier
Science (2000).
Se puede utilizar una variedad de sistemas
vector de expresión en el huésped para expresar las secuencias de
proteína antigénica de la presente invención. Tales sistemas de
expresión en huésped representan vehículos por lo cuales se pueden
producir las secuencias que codifican de interés y consiguientemente
purificarse, pero también representa células que pueden, cuando se
transforman o transfectan con los nucleótidos adecuados que
codifican secuencias, mostrar los productos de gen de M. hyo
empleados en el procedimiento de la presente invención in
situ. Estos incluyen, pero sin limitarse a estos,
microorganismos tales como bacterias (por ejemplo E. coli,
B. subtilis) transformadas con vectores de expresión de ADN
bacteriófago recombinante, ADN plásmido o ADN cósmido que contienen
secuencias que codifican mhp3; levadura (por ejemplo
Saccharomyces Pichia) transformada con vectores de expresión de
levadura recombinantes que contienen secuencias que codifican el
producto génico de M. hyo; sistemas de células de insectos
infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (por
ejemplo baculovirus) que contienen las secuencias que codifican
M. hyo; sistemas de células de plantas infectadas con
vectores de expresión de virus recombinante (por ejemplo virus del
mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o
transformadas con vectores de expresión de plásmido recombinantes
(por ejemplo, plásmido Ti) que contienen secuencias que codifican
M. hyo; o sistemas de células de mamíferos (por ejemplo COS,
CHO, BHK, 293, 3T3) que engloban construcciones de expresión
recombinantes que contienen promotores derivados del genoma de
células de mamíferos (por ejemplo promotor de metalotioneina) o de
virus de mamíferos (por ejemplo el promotor último del adenovirus;
el promotor 7,5K del virus vaccinia). En una realización preferida,
el sistema de expresión es un sistema bacteriano.
Los polipéptidos y proteínas de Mycoplasma
hyopneumoniae y sus fragmentos inmunogénicos también se pueden
expresar y administrar usando los vectores virales y bacterianos
recombinantes vivos tales como adenovirus o Salmonella. Los
vectores reales también se conocen y están fácilmente disponibles en
la técnica o se pueden construir por los expertos en la técnica
usando la metodología bien conocida.
De acuerdo con la presente invención una única
dosis de una cantidad efectiva de una vacuna de M. hyo
administrada a puercos de aproximadamente 3 a 10 días de edad
proporciona inmunidad efectiva contra un desafío posterior de M.
hyo. Preferiblemente la vacuna de M. hyo se administra a
aproximadamente seis a aproximadamente ocho días de edad. Lo más
preferible es que la vacuna de M. hyo se administre a
aproximadamente siete días de edad.
La cantidad de una vacuna de bacterina de M.
hyo efectiva en la administración de una dosis contiene
aproximadamente de 1 x 10^{6} a aproximadamente a 5 x 10^{10}
unidades de cambio de color (CCU) por dosis. Preferiblemente una
vacuna de bacterina de M. hyo que proporciona inmunidad
efectiva en una única dosis contiene de aproximadamente 1 x
10^{8} a 5 x 10^{10} CCU/dosis y más preferiblemente de
aproximadamente 5 x 10^{8} a 5 x 10^{10} CCU/dosis.
De acuerdo con la presente invención cuando se
administra el producto de bacterina preferido
RESPISURE-1, la cantidad de
RESPISURE-1 para una administración de una dosis es
de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 3,0 ml, preferiblemente de
aproximadamente 1,5 ml a aproximadamente 2,5 ml y más
preferiblemente de aproximadamente 2 ml.
La cantidad de una vacuna de M. hyo que
constituye una vacuna de subunidades que comprende una o más
proteínas o polipéptidos o fragmentos inmunogénicos de las
mencionadas proteínas o polipéptidos efectiva en el procedimiento
de la presente invención es de aproximadamente 0,01 \mug a
aproximadamente 200 \mug.
La cantidad de una vacuna de M. hyo que
constituye una vacuna que comprende uno o más genes o ácidos
nucleicos (preferiblemente de ADN) de M. hyo que codifican
para proteínas o polipéptidos inmunogénicos o fragmentos
inmunogénicos de las mencionadas proteínas o polipéptidos efectiva
en el procedimiento de la presente invención es de aproximadamente
0,1 \mug a aproximadamente 200 mg.
De acuerdo con la presente invención se puede
lograr la administración por vías conocidas, incluyendo oral,
intranasal, tópica, transdérmica y parenteral (por ejemplo
intravenosa, intraperitoneal, intradérmica, subcutánea o
intramuscular). Una vía de administración también se puede lograr
usando dispositivos de administración sin aguja. La administración
se puede lograr usando una combinación de vías, por ejemplo, primero
la administración usando una vía parenteral y posteriormente la
administración usando una vía mucosal. Una vía preferida de
administración es la administración intramuscular.
Las dosis efectivas (cantidades de inmunización)
de vacunas de la presente invención se pueden extrapolar a partir
de curvas de respuesta a dosis derivadas de sistemas de ensayo
modelo.
Los presentes procedimientos de vacunación
proporcionan inmunidad protectora tanto a lechones seropositivos
como a lechones seronegativos en M. hyo. Los lechones
seronegativos se refieren a aquellos lechones que presentan en el
suero anticuerpos contra M. hyo. Los lechones seronegativos
se refieren a aquellos lechones que no presentan en el suero
cantidades detectables de anticuerpos contra M. hyo.
La presente invención se ilustra adicionalmente,
pero sin limitación, mediante los siguientes ejemplos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se emplea etilenimina binaria (BEI) para la
inactivación de la cepa NL1042 de M. hyo.
Al final del período de crecimiento el pH del
cultivo aumentó hasta 7,8 \pm 0,2, y se mantuvo el pH dentro de
este intervalo durante al menos una hora. En ese momento se añade
una solución acuosa de bromhidrato de
2-bromoetilamina (BEA) esterilizada con filtro
hasta una concentración final de aproximadamente 4,0 mM. En
presencia del pH elevado, el BEA se transforma químicamente en BEI.
Se incuba el cultivo a 37 \pm 2ºC con agitación constante durante
al menos 24 horas.
Tras la incubación de 24 horas se añade se añade
una solución acuosa esterilizada con filtro de tiosulfato de sodio
hasta una concentración final de aproximadamente 4 mM para
neutralizar el exceso de BEI. El cultivo se incuba a
37 \pm 2ºC con agitación constante durante 24 horas más.
37 \pm 2ºC con agitación constante durante 24 horas más.
Tras la inactivación, pero antes de la
neutralización con tiosulfato de sodio, se toma una muestra
representativa y se comprueba si se ha completado la inactivación.
Se inocula medio fresco que contenga un 0,0026% de rojo de fenol
con un 5 a un 20% de inóculo y se incuba a 37 \pm 2ºC durante al
menos una semana antes del examen del cambio de color, el cual es
indicativo del fallo en la inactividad. Se ensaya la esterilidad de
las muestras a granel en medio fluido de tioglicolato a 37 \pm
2ºC y medio fluido de soja tripticasa a temperatura ambiente. El
cultivo inactivado se puede transferir a recipientes de
almacenamiento estéril y se almacena a 2-8ºC hasta
que se haya ensamblado.
Se determina la potencia mediante un ensayo
serológico in vitro para cuantificar el antígeno en el envase
final. La potencia de las vacunas empleadas en el estudio de
eficacia determina la potencia mínima que debe estar presente en la
vacuna en la fecha de caducidad.
Se ensayó el M. hyo de las muestras a
granel o en envase final del producto acabado de cada serie o
primera subserie como sigue.
La bacterina se almacena a -50ºC en viales de
100 ml. Los viales se descongelaron y se almacenaron en subalícuotas
de 15 ml a 5 +/- 2ºC hasta su uso.
Para comprobar la potencia de una serie
ensamblada se compara una muestra de la serie con una referencia, y
se determinan unidades de RP (potencia relativa) para la serie. Una
serie o subserie debería contener preferiblemente al menos 6,33 RP
al comienzo del fechado y al menos 5,06 RP a lo largo del
fechado.
RP se refiere a potencia relativa. Las RPs se
pueden determinar mediante una cuantificación de antígenos relativa
comparada con una vacuna de referencia. En este caso la referencia
presenta una RP por definición = 1,0. El producto de dosis única de
la presente invención presenta preferiblemente una RP de 6,33 que es
6,33 veces el valor de la referencia.
Se añade mertiolato como conservante a una
concentración final que no exceda de un 0,01% (en relación
peso/volumen).
Se añade solución de ácido
etilendiaminotetracético al 10% (EDTA, sal disódica o tetrasódica)
como conservante hasta una concentración final de aproximadamente
un 0,07% (en relación peso/volumen).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se seleccionaron cerdos de aproximadamente una
semana de edad para la vacunación. Se ensaya el estado serológico
en M. hyo en un ensayo ELISA. Los cerdos con un valor ELISA
menor o igual a 0,50 se consideraron negativos en M. hyo.
Los cerdos con un valor ELISA superior a 0,50 se consideraron
serológicamente positivos en M. hyo.
Se emplea bacterina M. hyo
RESPISURE-1 (Pfizer Inc.) para vacunar los cerdos.
Se determina la potencia de la vacuna antes del uso mediante
cuantificación de antígenos relativa en comparación con una
bacterina M. hyo de referencia. La vacuna de referencia (RP
= 1,0) contenía aproximadamente 8000 unidades de antígeno
(aproximadamente de 1 a 2 x 10^{8} CCU de células viables
recolectadas antes de la inactivación) por dosis, determinado
mediante un ensayo inmune en fase sólida que medía la cantidad de
antígeno de M. hyo en la vacuna.
Se emplea el mismo adyuvante líquido (AMPHIGEN)
empleado en la formulación de RESPISURE - 1 como el placebo (es
decir, sin células bacterianas).
\vskip1.000000\baselineskip
El inóculo de desafío estaba constituido por
alícuotas de 10 ml de homogenato de pulmón, congelado a -70º C, y
se identificó como un derivado de la cepa 11 (L1 36) de M.
hyo. Se descongela el inóculo y luego se diluye en caldo Friis
Mycoplasma para alcanzar una dilución 1:25 y se mantiene en hielo
hasta que se administra. Cada cerdo recibe una dosis intranasal de
5 ml (2,5 ml por orificio nasal) de la suspensión 1:25 en los días
especificados en cada uno de los siguientes ejemplos. En cada día de
desafío se cultiva una alícuota del inóculo de pulmón para
confirmar la ausencia de contaminación bacteriana. Se valora
nuevamente una segunda alícuota en cada uno de los tres días, los
resultados indican que el inóculo contenía aproximadamente de
10^{6} a 10^{7} unidades de cambio de color (CCU)/ml de M.
hyo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se identificaron los cerdos con etiquetas de
oreja mientras estaban todavía con la madre [día (-1)]. Se
distribuyeron los cerdos en jaulas y en grupos de tratamiento de
acuerdo con un diseño en bloques aleatorio generalizado. Los cerdos
se agruparon en camadas y corrales después del destete.
Los cerdos se vacunaron en el día 0 bien con una
dosis intramuscular de 2 ml de bacterina de M. hyo
RESPISURE-1 (Pfizer Inc.) o con una dosis
intramuscular de 2 ml de placebo. Cada cerdo recibió una dosis
intranasal de 5 ml de la suspensión 1:25 del inóculo de desafío en
los días especificados en cada uno de los siguientes ejemplos. Se
controla y comprueba diariamente en todos los cerdos signos clínicos
de enfermedad.
En el momento especificado después del primer
día de desafío se sacrifican todos los cerdos y se les somete a
necropsia. Se extraen los pulmones y se evalúan. El examen
postmortem incluyó una estimación de la extensión de la patología
asociada con la enfermedad respiratoria micoplasmal. Se examinó cada
lóbulo pulmonar y se bosquejan las lesiones para estimar el
porcentaje afectado de cada lóbulo. Se registra el grado de lesiones
macroscópicas presentes.
\vskip1.000000\baselineskip
Se evalúa la eficacia en base al porcentaje de
las lesiones en el pulmón típicas de una infección por M.
hyo. Se determinan los cerdos del grupo de tratamiento
(vacunados) que presentan un porcentaje de pulmón total con
lesiones que fuera significativamente (P menor o igual a 0,05)
inferior que el de los cerdos en el grupo de placebo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se pondera la implicación macroscópica en
porcentaje por cada lóbulo pulmonar empleando las siguientes
proporciones de lóbulos pulmonares individuales a masa de pulmón
total: craneal izquierdo 10%, medio izquierdo 10%, caudal izquierdo
25%, craneal derecho 10%, medio derecho 10%, caudal derecho 25% y
accesorio 10%. Los valores de lóbulo pulmonar ponderados se sumaron
luego a lo largo de los lóbulos para dar el porcentaje de pulmón
total con lesiones (Pointon y col., 1992).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se evalúa la protección contra el desafío con
M. hyo virulento en cerdos serológicamente positivos en
M. hyo empleando una dosis única de bacterina de M.
hyo RESPISURE-1 (Pfizer Inc.), administrada a
cerdos en los días 3 a 8 de edad.
Se llevan a cabo cinco ensayos de potencia
repetidos para RESPISURE-1 en o en torno al momento
de vacunación. Se determina la potencia relativa (RP) mediante la
cuantificación de antígeno relativa en comparación con una vacuna
de referencia. La vacuna de referencia, que presenta una RP = 1,0,
contenía aproximadamente 8000 unidades de antígeno de M.
hyo. Las RPs de estos cinco ensayos fueron 5,42, 3,96, 4,71,
5,49 y 4,36 respectivamente.
En el día 0 se vacunaron los cerdos en el grupo
de tratamiento T02 (véase Tabla 1 a continuación) con una dosis
intramuscular de 2 ml de bacterina de M. hyo
RESPISURE-1 (Pfizer Inc.). Se vacunaron los cerdos
en el grupo T01 intramuscularmente con 2 ml de un placebo. Cada
cerdo recibió una dosis intranasal de 5 ml de la suspensión 1:25
del inóculo de desafío en los días 178, 179 y 180. En cada uno de
los tres días se cultivó una alícuota del material de desafío en el
momento de la inoculación para confirmar la ausencia de
contaminación bacteriana. Se valoró nuevamente una segunda alícuota
para confirmar que el lote de desafío contenía aproximadamente
10^{7} CCU/ml de M. Hyo. Se controló y comprobó diariamente
en todos los cerdos la presencia de signos de enfermedad
clínica.
Treinta días después del primer día de desafío
se sacrifican todos los cerdos y se les somete a necropsia. Se
extraen y evalúan los pulmones. El examen postmortem incluyó una
estimación de la extensión de la patología asociada con la
enfermedad respiratoria micoplasmal. Se examina cada lóbulo pulmonar
y se bosquejan las lesiones para estimar el porcentaje afectado en
cada lóbulo. Se registra el grado de lesiones totales presente.
Los resultados de lesión pulmonar se resumen en
la Tabla 2. Los resultados indican que los cerdos vacunados (T02)
presentaban un porcentaje medio obtenido por mínimos cuadrados
significativamente (P = 0,0385) inferior de lesiones pulmonares
neumónicas que los cerdos del placebo (T01) (2,0 frente a un
4,5%).
Los resultados indican que la vacunación única
de cerdos de aproximadamente una semana de edad con bacterina de
M. hyo RESPISURE-1 inducía la protección
contra un desafío consiguiente con M. hyo virulento.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Se evalúa la protección contra el desafío con
M. hyo virulento en cerdos serológicamente negativos en
M. hyo empleando una dosis única de bacterina de M.
hyo RESPISURE-1 administrada a cerdos de 3 a 8
días de edad.
Se llevan a cabo cinco ensayos de potencia
repetidos para la vacuna en o en torno al momento de vacunación. Se
determina la RP mediante una cuantificación de antígeno relativa en
comparación con una vacuna de referencia. La vacuna de referencia,
que presenta un RP = 1,0, contenía aproximadamente 8000 unidades de
antígeno de M. hyo. Las RP de estos cinco ensayos fueron
5,42, 3,96, 4,71, 5,49 y 4,36 respectivamente.
En el día 0 se vacunaron los cerdos en el grupo
de tratamiento T02 con una dosis intramuscular de 2 ml de bacterina
de M. hyo RESPISURE-1. Se vacunaron los
cerdos en el grupo T01 intramuscularmente con 2 ml de un placebo.
Cada cerdo recibió una dosis intranasal de 5 ml de la suspensión
1:25 del inóculo de desafío en los días 173, 174 y 175. En cada uno
de los tres días se cultivó una alícuota del material de desafío en
el momento de la inoculación para confirmar la ausencia de
contaminación bacteriana. Se valoró nuevamente una segunda alícuota
para confirmar que el lote de desafío contenía aproximadamente
10^{6} CCU/ml de M. hyo. Se controlaron todos los cerdos y
se comprobó diariamente la presencia de signos de enfermedad
clínica.
Veintinueve días después del primer día de
desafío se sacrifican todos los cerdos y se les somete a necropsia.
Se extraen y evalúan los pulmones. El examen postmortem incluyó una
estimación de la extensión de la patología asociada con la
enfermedad respiratoria inducida por M. hyo. Se examinó cada
lóbulo pulmonar y se bosquejan las lesiones para estimar la
consolidación en porcentaje en cada lóbulo. Se registra el grado de
lesiones macroscópicas presente.
La Tabla 3 resume el diseño experimental.
Se resumen las lesiones pulmonares en la Tabla
4. El análisis global indicó que los cerdos vacunados (T02)
presentaban un porcentaje medio obtenido por mínimos cuadrados
significativamente (P = 0,0001) inferior de lesiones pulmonares
neumónicas que los cerdos del placebo (T01) (0,3 frente a 5,9%).
Los resultados de este estudio indican que la
vacunación única de cerdos con bacterina de M. hyo RESPISURE
ONE inducía la protección contra un desafío consiguiente
experimental con M. hyo virulento.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Se evalúa la protección contra el desafío con
M. hyo virulento en cerdos serológicamente negativos en
M. hyo empleando una dosis única de bacterina de M.
hyo RESPISURE-1 administrados a cerdos de 3 a 8
días de edad.
Se llevan a cabo cinco ensayos de potencia
repetidos para la vacuna en o en torno al momento de vacunación. Se
determina la RP mediante una cuantificación de antígeno relativa en
comparación con una vacuna de referencia. La vacuna de referencia,
que presenta un RP = 1,0, contenía aproximadamente 8000 unidades de
antígeno de M. hyo. Las RP de estos cinco ensayos fueron
5,42, 3,96, 4,71, 5,49 y 4,36 respectivamente.
En el día 0 se vacunaron los cerdos en el grupo
de tratamiento T02 con una dosis intramuscular de 2 ml de bacterina
M. hyo RESPISURE-1. Se vacunaron los cerdos
en el grupo T01 intramuscularmente con 2 ml de un placebo. Cada
cerdo recibió una dosis intranasal de 5 ml (2,5 ml por orificio) de
la suspensión 1:25 del inóculo de desafío en los días 76, 77 y 78.
En cada uno de los tres días se cultivó una alícuota del material de
desafío en el momento de la inoculación para confirmar la ausencia
de contaminación bacteriana. Se valoró nuevamente una segunda
alícuota para confirmar que el lote de desafío contenía
aproximadamente 10^{6} CCU/ml de M. hyo. Se controlaron
todos los cerdos y se comprobó diariamente la presencia de signos de
enfermedad clínica.
Veintinueve días después del primer día de
desafío se sacrifican todos los cerdos y se les somete a necropsia.
Se extraen y evalúan los pulmones. El examen postmortem incluyó una
estimación de la extensión de la patología asociada con la
enfermedad respiratoria inducida por M. hyo. Se examinó cada
lóbulo pulmonar y se esbozan las lesiones para estimar la
consolidación en porcentaje en cada lóbulo. Se registra el grado de
lesiones totales presente.
La Tabla 5 resume el diseño experimental.
Se resumen las lesiones pulmonares en la Tabla
6. El análisis global indicó que los cerdos vacunados (T02)
presentaban un porcentaje medio obtenido por mínimos cuadrados
significativamente (P = 0,0001) inferior de lesiones pulmonares
neumónicas que los cerdos del placebo (T01) (0,5 frente a 9,9%).
Claims (9)
1. Uso de una bacterina de Mycoplasma
hyopneumoniae para la fabricación de una vacuna para el
tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno en un animal
causada por una infección con Mycoplasma hyopneumoniae para
la administración al animal de entre 3 y 10 días de edad, de una
cantidad efectiva de una dosis única de una vacuna de Mycoplasma
hyopneumoniae.
2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 en
el que la vacuna monodosis de Mycoplasma hyopneumoniae
contiene entre 1 x 10^{6} y 5 x 10^{10} unidades de cambio de
color (CCU) por dosis.
3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 en
el que la cantidad de dicha vacuna administrada es entre 0,5 y 3,0
ml.
4. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 en
el que la bacterina de Mycoplasma hyopneumoniae contiene la
cepa P-5722-3
5. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 en
le que la vacuna de Mycoplasma hyopneumoniae comprende
además un antígeno viral o bacteriano distinto a Mycoplasma
hyopneumoniae.
6. El uso de acuerdo con la reivindicación 5 en
el que dichos antígenos virales o bacterianos se seleccionan entre
el virus de la gripe en puercos (SIV), virus de la enfermedad
respiratoria y reproductiva porcina (PRRS o enfermedad porcina
misteriosa), diarrea después del destete (PWD) y enteritis
proliferativa porcina (PPE).
7. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 en
el que dicha preparación de Mycoplasma hyopneumoniae se
administra de forma intramuscular.
8. El uso de acuerdo con la preparación 1 en el
que dichos puercos están protegidos hasta 25 semanas tras la
vacunación.
9. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 en
el que la vacuna de Mycoplasma hyopneumoniae comprende
además un adyuvante.
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