ES2312801T3 - Composicion inmunogena o vacunal no inmunosupresora, que comprende una proteina e7 mutada del virus hpv-16. - Google Patents
Composicion inmunogena o vacunal no inmunosupresora, que comprende una proteina e7 mutada del virus hpv-16. Download PDFInfo
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Abstract
Composición vacunal desprovista de propiedad inmunosupresora, preventiva o curativa frente a un cáncer provocado por una infección por papilomavirus, caracterizada porque comprende, a título de principio activo, una proteína E7 mutada no inmunosupresora que comprende la secuencia de aminoácidos que consiste, desde el extremo N-terminal hacia el extremo C-terminal, en: - (i) la secuencia de aminoácidos 1-19 de la secuencia SEC ID nº 3; - (ii) una secuencia de aminoácidos que posee (a) la sustitución de por lo menos un aminoácido con relación a la secuencia correspondiente de aminoácidos 20-29 de la secuencia SEC ID nº 3 o (b) la supresión de por lo menos cuatro aminoácidos consecutivos, con relación a la secuencia correspondiente de aminoácidos 20-29 de la secuencia SEC ID nº 3; y - (iii) la secuencia de aminoácidos 30-98 de la secuencia SEC ID nº 3, en asociación con uno o varios adyuvantes de la inmunidad fisiológicamente compatibles.
Description
Composición inmunógena o vacunal no
inmunosupresora, que comprende una proteína E7 mutada del
virus
HPV-16.
HPV-16.
La presente invención se refiere al campo de la
prevención o del tratamiento de ciertos cánceres asociados a una
infección por papilomavirus de tipo HPV-16.
Varias especies de papilomavirus humano, o HPV,
se consideran en la actualidad como los agentes causantes de
cánceres. En particular, los HPV de tipo 16, 18, 31, 33 y 51 están
frecuentemente asociados a los cánceres
ano-genitales, incluyendo el cáncer del cuello
uterino de la mujer.
Más del 50% de los carcinomas escamosos del
cuello uterino están asociados al papilomavirus HPV de tipo 16.
Las oncoproteínas víricas E6 y E7 de HPV están
implicadas en gran medida en los mecanismos moleculares por los
cuales estos virus contribuyen al desarrollo de estos cánceres.
Estas dos oncoproteínas actúan desactivando los reguladores del
ciclo celular que constituyen la proteína p53 y la proteína del
retinoblastoma, provocando así el acontecimiento iniciador de la
progresión de etapas múltiples hacia el cáncer.
En general, los tumores malignos están
constituidos por células cancerígenas portadoras de antígenos
asociados (TAA) o de antígenos específicos (TSA) y por un
micro-entorno estromal particular, caracterizados
por una hipervascularización, o neoangiogénesis, que puede estar
acompañada de una parálisis de las células inmunitarias, es decir,
en un estado de inmunosupresión. Inicialmente, la inmunosupresión
permanece localizada a nivel del tumor, puesto que el individuo es
todavía capaz de defenderse contra las demás agresiones tales como
unas infecciones.
Sin embargo, con la diseminación metastática, la
inmunosupresión puede extenderse y generalizarse, tal como lo
muestra la fragilidad a las infecciones del enfermo de cáncer en
estado terminal. Esta inmunosupresión pone en juego unos factores
paralizantes que están producidos por las células cancerígenas o por
las células de su entorno. La parálisis local de las células del
sistema inmunitario, o inmunosupresión, representa por lo tanto un
arma principal de las células cancerígenas que les permite escapar
al sistema inmunitario del hospedante.
Este estado de inmunosupresión también se ha
observado en los cánceres provocados por una infección por
HPV-16. Esta inmunosupresión constituye en la
actualidad un obstáculo técnico principal en la puesta a punto de
composiciones vacunales preventivas o curativas contra los cánceres
provocados por una infección por HPV-16. En efecto,
las estrategias vacunales
anti-HPV-16 actuales privilegian la
inducción de una proliferación de células
T-citotóxicas que reconocen específicamente ciertos
antígenos producidos por HPV-16, en particular las
proteínas E6 y E7, cuando se asocian a los antígenos de clase I del
complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) en la superficie
membranaria de las células cancerígenas infectadas.
Algunos autores han asociado la inmunosupresión
observada en unos cánceres provocados por HPV-16 a
la observación de niveles de expresión reducidos de las moléculas
de clase I del MHC en la superficie de las células cancerígenas del
cuello uterino (Cruz et al., 1999), o también a una
reducción de la expresión de la cadena delta del receptor de las
células T (TCR) en unos pacientes que expresan una displasia
pre-neoplástica (Muderspach et al., 2000).
Otros autores han asociado el estado de inmunosupresión a un
defecto de respuesta de las células T a eventuales señales
producidas por las células tumorales y transmitidas a las células
inmunitarias provocando su apoptosis, por ejemplo debido a una
interacción Fas/Fas-ligando (Schoell et al.,
1999).
Otros autores han observado que la
inmunosupresión asociada a un cáncer provocado por una infección
por HPV era concomitante con un aumento de IL-10 (El
Sherif et al. 2001; Giannini et al. 1998; Giannini
et al. 2002) y de TGF-beta-1
(Giannini et al. 1998) así como con una reducción del
IFN-gamma sub-epitelial (El Sherif
et al. 2001).
Trabajos anteriores de los inventores relatados
en la solicitud internacional publicada con el nº WO 00/03732 han
mostrado que, en el caso del cáncer del cuello uterino provocado
por HPV, la proteína E7 del papilomavirus estaba implicada en una
inmunosupresión local a nivel de los tumores o de las células
infectadas.
La inmunosupresión inducida por la proteína E7
ha sido caracterizada mediante la inhibición de la proliferación de
las células T estimuladas por el PPD o el toxoide tetánico, la
inhibición de la proliferación de las células T estimuladas por unas
células alogénicas, la sobre-producción de
IFN-\alpha (citoquina inmunosupresora) mediante
las células que presentan el antígeno (APC). Con el fin de reducir
o bloquear la inmunosupresión inducida por la proteína E7 soluble
de HPV, se ha propuesto el uso de derivados no tóxicos de la
proteína E7 como antígeno con vistas a la inducción de anticuerpos
dirigidos específicamente contra la proteína E7 extracelular. Con
vistas a fabricar unos compuestos inmunógenos derivados de E7
desprovistos de los efectos supresores de la proteína nativa, se ha
propuesto modificar la proteína E7 nativa, o bien mediante
modificación química, o bien mediante modificación genética,
realizando en particular unas inserciones, unas supresiones o unas
sustituciones de residuos de aminoácidos destinados a disminuir o
suprimir los sitios funcionales supresores de la proteína nativa. En
este contexto, se ha descrito una proteína E7 modificada
químicamente, desprovista de actividad inmunosupresora, después del
tratamiento de la proteína E7 nativa mediante el
glutaraldehído.
Las modificaciones químicas propuestas para
reducir o bloquear las propiedades de inmunosupresión de la
proteína E7 nativa, tal como se han descrito en el estado de la
técnica, tienen como objetivo añadir un grupo químico al esqueleto
carbonado de la proteína E7 nativa, mediante el enlace de una
función reactiva de uno de los aminoácidos de esta proteína con una
función aldehído, carboxamida o maleimida, sin ninguna alteración
de la secuencia en aminoácidos de la proteína nativa, es decir, sin
aportar ninguna modificación significativa a la estructura primaria
de la proteína E7.
De hecho, las diversas composiciones inmunógenas
anti-E7 descritas en el estado de la técnica, con
vistas a la realización de preparaciones vacunales preventivas o
curativas contra cánceres provocados por una infección por
HPV-16, que tienen como objetivo prioritario la
inducción de una respuesta inmunitaria mediante la producción de
linfocitos citotóxicos (CTL) específicos de la proteína E7 expresada
en la superficie de las células infectadas, contienen, como
antígeno, o bien la proteína E7 completa, eventualmente modificada
químicamente (Gérard et al., 2001) o bien unos péptidos
derivados de la proteína E7 (Muderspach et al., 2000;
Schoell, 1999 - citados anteriormente). En todos los casos,
incluyendo cuando se usan unos péptidos derivados de la proteína E7
nativa, no se ha introducido ninguna modificación en la secuencia de
aminoácidos de la proteína nativa, y por consiguiente en la
estructura primaria de aminoácidos inicial. Esto se explica
simplemente por la voluntad de conservar intactos los epítopos de
interés de la proteína E7 nativa con el fin de favorecer la
inducción de una respuesta inmunitaria, en particular la producción
de células CTL, capaces de reconocer específica y eficazmente la
proteína E7 nativa producida por las células infectadas.
Incluso cuando se prevé una reorganización de la
estructura primaria de aminoácidos de la proteína E7, con vistas a
la producción de una proteína inmunógena que tiene unas propiedades
carcinógenas, o transformantes reducidas, se proporciona una gran
atención a la conservación de por lo menos una copia completa de la
secuencia de aminoácidos de la proteína E7 nativa en el seno del
compuesto inmunógeno reorganizado, con el fin de mantener presente,
en el seno de dicho compuesto inmunógeno, el conjunto de los
epítopos potenciales de la proteína E7 nativa.
Así, Osen et al. (2001) han descrito la
construcción de un ADN que codifica un compuesto inmunógeno
susceptible de inducir la producción de linfocitos citotóxicos (CTL)
que reconocen específicamente la proteína E7 nativa expresada en la
superficie de las células cancerígenas infectadas por
HPV-16, en una estrategia vacunal
anti-HPV con ADN, y no directamente con un
compuesto inmunógeno peptídico. Con el fin de evitar cualquier
acontecimiento de recombinación que podría llegar a una
superproducción de proteína E7 nativa, o por lo menos de una
proteína recombinada que posee las propiedades carcinógenas de la
proteína E7 nativa, estos autores han construido un ADN que
codifica una proteína inmunógena en la que el conjunto de los
epítopos de la proteína E7 nativa está representado, aunque cada
uno de los campos peptídicos, respectivamente (i) campo
1-10, (ii) campo 11-40, (iii) campo
41-70 y (iv) campo 71-98, han sido
invertidos en el compuesto peptídico inmunógeno final. Estos
autores insisten en la necesidad de producir un compuesto peptídico
inmunógeno que ha conservado todos los epítopos CTL potenciales de
la proteína E7 nativa, habiendo perdido al mismo tiempo y
simultáneamente sus propiedades de transformación cancerígenas de
las células. En último lugar, estos autores sugieren aumentar
todavía la inocuidad del compuesto peptídico inmunógeno
reorganizado, en lo que se refiere a su poder cancerígeno,
suprimiendo el campo de la unión de la proteína E7 nativa a la
proteína pRB del retinoblastoma, que va desde el aminoácido 21
hasta el aminoácido 26 de E7, responsable de la actividad
carcinógena de la proteína E7 nativa. Sin embargo, concretamente
este modo de realización de un compuesto peptídico inmunógeno no
carcinógeno no se ha realizado.
De manera sorprendente, se ha demostrado a
partir de ahora según la invención que se podía obtener, mediante
mutagénesis dirigida del ADN que codifica la proteína E7 nativa,
una proteína mutada que posee una capacidad idéntica, incluso una
capacidad mejorada, para inducir una respuesta inmunitaria
específica contra la proteína E7 nativa, y en la que se han
bloqueado las propiedades de inmunosupresión de la proteína E7
nativa.
Así, se ha demostrado por primera vez según la
invención, de manera sorprendente, que un fragmento peptídico
localizado en la región que va desde el aminoácido en posición 20
(Thr o T) hasta el aminoácido en posición 29 (Asn o N) de la
proteína E7 nativa del papilomavirus HPV-16 era
responsable de la actividad inmunosupresora de esta proteína.
Para los fines de la presente memoria, se
designa una proteína que difiere en por lo menos un aminoácido, con
relación a la proteína E7 nativa de HPV-16 de
secuencia SEC ID nº 3, como una proteína E7 "mutada" según la
invención, cuando la o las diferencias de aminoácidos están
localizadas en la región peptídica correspondiente
20-29 de la proteína E7 nativa de secuencia SEC ID
nº 3.
En particular, se ha demostrado según la
invención que una proteína E7 mutada que comprende la sustitución
de por lo menos un aminoácido, preferentemente de por lo menos dos
aminoácidos, con relación a la secuencia SEC ID nº 3 de la proteína
E7 nativa, ha perdido la propiedad de inducir la inmunosupresión
que se había indicado anteriormente para la proteína E7 nativa.
Así, se ha mostrado que una proteína E7 mutada que comprende la
sustitución del residuo ácido de cisteína en posición 24 por un
residuo de glicina (CYS24GLY) y la sustitución del residuo de ácido
glutámico en posición 26 por un residuo glutamina (GLU26GLN), con
relación a la secuencia SEC ID nº 3 de la proteína E7 nativa, ha
perdido la propiedad inmunosupresora de la proteína E7 nativa.
Asimismo, se ha demostrado que una proteína E7 mutada que comprende
la sustitución del residuo de cisteína en posición 24 por un
residuo de serina (SYR24SER) y la sustitución del residuo de ácido
glutámico en posición 26 por un residuo de glutamina (GLU26GLN), con
relación a la secuencia SEC ID nº 3 de la proteína E7 nativa, ha
perdido la propiedad inmunosupresora de la proteína E7
nativa.
nativa.
Asimismo, se ha demostrado según la invención
que una proteína E7 mutada que comprende, con relación a la
secuencia de aminoácidos SEC ID nº 3 de la proteína E7 nativa, una
supresión de por lo menos cuatro, preferentemente una supresión de
cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez aminoácidos
consecutivos en la región polipeptídica correspondiente de la
secuencia SEC ID nº 3 que va desde el aminoácido en posición 20
hasta el aminoácido en posición 29, según la numeración de la
secuencia SEC ID nº 3, ha perdido la propiedad inmunosupresora
observada para la proteína E7 nativa.
En particular, se ha demostrado que la proteína
E7 mutada que comprende la supresión del fragmento peptídico 21
(Asp o D) a 26 (Glu o E), según la numeración de la secuencia SEC
ID nº 3, ha perdido la propiedad inmunosupresora observada para la
proteína E7 nativa. La proteína E7 mutada cuya región que
corresponde a los aminoácidos 21 a 26 de la proteína E7 está
suprimida se denomina asimismo como la proteína
E7\Delta21-26 para los fines de la presente
memoria.
Como tal, la proteína
E7\Delta21-26, producida mediante recombinación
genética, se ha descrito por Anna et al. (2001, J. Natl.
Cancer Inst. Vol. 93(24): 1843-1851).
Asimismo, se ha demostrado que la proteína E7
mutada que comprende la supresión del fragmento peptídico 21 (Asp o
D) a 25 (Tyr o Y), según la numeración de la secuencia SEC ID nº 3,
ha perdido la propiedad inmunosupresora observada para la proteína
E7 nativa. La proteína E7 mutada cuya región que corresponde a los
aminoácidos 21 a 25 de la proteína E7 nativa está suprimida se
denomina asimismo como la proteína E7\Delta21-25
para los fines de la presente memoria.
Por lo tanto, se demuestra según la invención
que unas simples sustituciones de aminoácidos en la región
peptídica 20-29 de la proteína E7 nativa permiten
bloquear la actividad inmunosupresora observada para esta proteína.
Así, unas alteraciones mínimas de la estructura primaria de la
proteína E7 nativa, en la región peptídica 20-29,
destruyen las propiedades inmunosupresoras características de la
proteína E7 nativa.
Según la invención, una proteína es
"inmunosupresora" cuando esta proteína inhibe como mínimo 60%,
preferentemente por lo menos 70%, la proliferación in vitro
de células mononucleadas que proceden de la sangre periférica
humana de un individuo vacunado contra el tétanos (Antígeno tétanos
toxoide) y/o la difteria (antígeno del tipo
"tuberculin-Purified Protein Derivative" o
"PPD"), siendo dicha proliferación de las células
mononucleadas inducida por pre-incubación de estas
células con (i) el antígeno PPD, (ii) con el antígeno tetanus
toxoide, (iii) con una asociación del antígeno PPD y del antígeno
tetanus toxoide, o también (iv) con unas células alogénicas frente a
dichas células mononucleadas. En este ensayo, la proteína
potencialmente inmunosupresora se usa con la concentración que
induce el valor máximo de inhibición de proliferación, según na
criba de efecto-dosis. Una ilustración de dicho
ensayo se indica en el ejemplo 6.
Asimismo, una proteína es "inmunosupresora"
cuando esta proteína induce un nivel de producción in vitro
anormal de citoquinas inmunosupresoras, respectivamente la
IL-10 por las células mononucleadas de la sangre
periférica, y el IFN-\alpha o la
IL-10 por las células que presentan el antígeno
(APC).
Además, tal como se precisará más adelante en la
descripción, y tal como se ilustra en los ejemplos, todas las
proteínas E7 mutadas anteriormente poseen en común, además de su
carácter no inmunosupresor, la capacidad de estimular la producción
de anticuerpos "neutralizantes" frente a la proteína E7
nativa, es decir, la producción de anticuerpos que reconocen la
proteína E7 nativa y que bloquean la actividad inmunosupresora de
la proteína E7 nativa, supresora para las células del sistema
inmunitario. Según la invención, un anticuerpo
anti-E7 se denomina "neutralizante" en
particular cuando bloquea la capacidad de la proteína E7 nativa para
estimular la producción de TNF-\alpha por unos
macrófagos humanos pre-tratados por
IFN-\gamma, según el ensayo descrito con mayor
detalle en el ejemplo 1.
Estos resultados han permitido definir una
familia de proteínas E7 mutadas que tienen todas en común el hecho
de poseer unas mutaciones, sustituciones o supresión de
aminoácidos, con relación a la secuencia de aminoácidos de la
proteína E7 nativa.
De manera general, por proteína "E7 mutada"
no inmunosupresora según la invención, se entiende una proteína que
comprende la secuencia de aminoácidos que consiste, desde el
extremo N-terminal, hacia el extremo
C-terminal, en:
- - (i)
- la secuencia de aminoácidos 1-19 de la secuencia SEC ID nº 3;
- - (ii)
- una secuencia de aminoácidos que posee (a) la sustitución de por lo menos uno, y preferentemente de por lo menos dos aminoácidos, con relación a la secuencia correspondiente de aminoácidos 20-29 de la secuencia SEC ID nº 3, o (b) la supresión de por lo menos cuatro aminoácidos consecutivos, con relación a la secuencia correspondiente de aminoácidos 20-29 de la secuencia SEC ID nº 3; y
- - (iii)
- la secuencia de aminoácidos 30-98 de la secuencia SEC ID nº 3.
Según la invención, una proteína E7 mutada que
"comprende" la secuencia de aminoácidos tal como se ha
definido anteriormente es una proteína cuya secuencia de
aminoácidos "consiste esencialmente" en la secuencia de
aminoácidos anterior. En otras palabras, una proteína E7 mutada
según la invención puede comprender, además de la secuencia de
aminoácidos anterior, asimismo una o dos secuencias de aminoácidos
adicionales de como máximo 20, ventajosamente de como máximo 15,
preferentemente de como máximo 10, y de manera muy preferida de
como máximo 6 aminoácidos, siendo la o las secuencias de
aminoácidos adicionales localizadas respectivamente en el extremo
N-terminal de la región (i) o en el extremo
C-terminal de la región (ii), y en ciertos casos al
mismo tiempo en el extremo N-terminal de la región
(i) y en el extremo C-terminal de la región (ii).
En el último caso, la secuencia adicional localizada en el extremo
N-terminal de la región (i) puede ser distinta de
la secuencia adicional localizada en el extremo
C-terminal, o por el contrario las dos secuencias
adicionales pueden ser idénticas. En general, una proteína E7
mutada según la invención comprende, con relación a la secuencia de
aminoácidos anterior que la define, una sola secuencia de
aminoácidos adicional, tal como una secuencia de aminoácidos
poli(histidina), por ejemplo una secuencia que consiste en
un polímero de seis residuos histidina.
Se desprende de la definición anterior que una
proteína E7 mutada según la invención posee dos regiones de
aminoácidos idénticas a las regiones peptídicas correspondientes de
la secuencia SEC ID n 03, respectivamente la región (i) de
aminoácidos idéntica a la región peptídica 1-19 de
la proteína E7 nativa de secuencia SEC ID nº 3, y la región (iii)
de aminoácidos idéntica a la región peptídica 30-98
de la proteína E7 nativa de secuencia SEC ID nº 3. La región (ii)
de aminoácidos central de la proteína E7 mutada comprende una o
varias sustituciones de un aminoácido, o alternativamente comprende
una supresión de por lo menos cuatro aminoácidos, con relación a la
región peptídica 20-29 correspondiente de la
secuencia SEC ID nº 3.
Según la primera alternativa, la región (ii) de
aminoácidos de una proteína E7 mutada comprende preferentemente por
lo menos dos sustituciones de nucleótidos, y puede comprender tres,
cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez sustituciones de un
aminoácido, con relación a los aminoácidos correspondientes de la
región peptídica 20-29 de la secuencia SEC ID nº 3
de la proteína nativa. En el modo de realización en el que la
región (ii) de aminoácidos de la proteína E7 mutada comprende diez
sustituciones de aminoácidos, la región (ii) de aminoácidos de la
proteína E7 mutada es totalmente distinta de la región peptídica
correspondiente 20-29 de la proteína E7 nativa de
secuencia SEC ID nº 3.
Cada sustitución de un aminoácido, en la región
20-29 de la proteína E7 nativa, para obtener una
proteína E7 mutada según la invención, se realiza preferentemente de
manera que el aminoácido sustituido en la proteína E7 mutada
pertenezca a una "clase" distinta del aminoácido
correspondiente de la proteína E7 nativa, entre las clases de los
aminoácidos aromáticos, hidrófobos, polares, básicos, ácidos, o
aminoácidos pequeños, respectivamente, de forma ventajosa como
sigue:
- -
- residuo Thr en posición 20 sustituido por un residuo diferente a Ala, Ser, Met y Gly;
- -
- residuo Asp en posición 21 sustituido por un residuo diferente a Glu;
- -
- residuo Leu en posición 22 sustituido por un residuo diferente a Ile y Val;
- -
- residuo Tyr en posición 23 sustituido por un residuo diferente a Phe y Trp;
- -
- residuo Cys en posición 24 sustituido por cualquier residuo de aminoácido diferente;
- -
- residuo Tyr en posición 25 sustituido por un residuo diferente a Phe y Trp;
- -
- residuo Glu en posición 26 sustituido por un residuo diferente a Asp;
- -
- residuo Gln en posición 27 sustituido por un residuo diferente a Asn;
- -
- residuo Leu en posición 28 sustituido por un residuo diferente a Ile y Val; y
- -
- residuo Asn en posición 29 sustituido por un residuo diferente a Gln.
El conjunto de los aminoácidos está constituido
por los siguientes aminoácidos, Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu,
Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val,
así como sus derivados químicamente modificados sobre uno o varios
grupos químicos que no participan en su unión con otro aminoácido
en la secuencia de una proteína E7 mutada según la invención.
Una familia preferida de proteínas E7 mutadas es
la familia de proteínas cuyos residuos Cys en posición 24 y Glu en
posición 26 han sido sustituidos.
Una primera proteína E7 mutada particularmente
preferida que comprende dos sustituciones de un nucleótido es la
proteína E7 (CYS24GLY, GLU26GLN).
Una segunda proteína E7 mutada particularmente
preferida que comprende dos sustituciones de un nucleótido es la
proteína E7 (CYS24SER, GLU26GLN).
Según la segunda alternativa, la región (ii) de
aminoácidos comprende la supresión de cinco, seis, siete, ocho,
nueve o diez aminoácidos consecutivos, con relación a la secuencia
correspondiente de aminoácidos 20-29 de la secuencia
SEC ID nº 3. Cuando la región (ii) de aminoácidos comprende la
supresión de diez aminoácidos, dicha región (ii) no comprende
ningún aminoácido y la proteína E7 mutada resultante consiste, del
extremo N-terminal hacia el extremo
C-terminal, en la región (i) 1-19 de
la secuencia SEC ID nº 3 que está directamente unida por un enlace
peptídico a la región (iii) 30-98 de la secuencia
SEC ID nº 3.
Una primera familia preferida de proteínas E7
mutadas según la segunda alternativa anterior es la familia de
proteínas que comprenden la supresión de seis aminoácidos
consecutivos en la región (ii), con relación a la secuencia
correspondiente de aminoácidos 20-29 de la
secuencia SEC ID nº 3.
Una tercera proteína E7 mutada preferida según
la invención consiste en la proteína cuya secuencia de aminoácidos
comprende la supresión de los aminoácidos 21 a 26 correspondientes
de la secuencia SEC ID nº 3 de la proteína E7 nativa. Esta proteína
E7 mutada, también denominada E7\Delta21-26, posee
la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 1 y está codificada por el
ácido nucleico de secuencia SEC ID nº 2. La región (ii) de la
proteína E7\Delta21-26 posee la supresión de seis
aminoácidos consecutivos, con relación a la secuencia
correspondiente de aminoácidos 20-29 de la secuencia
SEC ID nº 3.
Una segunda familia preferida de proteínas E7
mutadas según la segunda alternativa anterior es la familia de
proteínas que comprenden la supresión de cinco aminoácidos
consecutivos en la región (ii), con relación a la secuencia
correspondiente de aminoácidos 20-29 de la
secuencia SEC ID nº 3.
Una cuarta proteína E7 mutada preferida según la
invención consiste en la proteína cuya secuencia de aminoácidos
comprende la supresión de los aminoácidos 21-25
correspondientes de la secuencia SEC ID nº 3 de la proteína E7
nativa. Esta proteína E7 mutada, también denominada
E7\Delta21-25 en la presente memoria. La región
(ii) de la proteína E7\Delta21-25 posee la
supresión de cinco aminoácidos consecutivos, con relación a la
secuencia correspondiente de aminoácidos 20-29 de la
secuencia SEC ID nº 3.
Según la invención, se demuestra que el producto
de expresión del ADN que codifica una proteína E7 mutada de
HPV-16 tal como se ha definido anteriormente,
cuando se combina con un adyuvante de la inmunidad apropiado, es
capaz de generar en el ratón una respuesta humoral y celular
específica, permitiendo así inducir una inmunidad antitumoral
protectora, comparable sino superior, a la inducida por la proteína
E7 nativa.
Mediante la expresión "producto de
expresión" del ADN que codifica la proteína E7 mutada, se
entiende según la invención la o las proteínas resultantes de la
traducción del ADN (o del ARN mensajero correspondiente) que
codifica la proteína E7 mutada definida anteriormente, en una
célula hospedante.
Además, se demuestra que el producto de
expresión del ADN que codifica la proteína E7 mutada de
HPV-16 según la invención posee una actividad
terapéutica antitumoral igual o superior a la de la proteína E7
nativa.
Además, un carácter esencial del producto de
expresión del ADN que codifica la proteína E7 mutada de la
invención consiste, por un lado, en la ausencia de actividad
inmunosupresora directa de este último y, por otro lado, en la
inducción de un bloqueo de la inmunosupresión inducida por la
proteína E7 nativa segregada por las células cancerígenas.
La presente invención tiene por objeto una
composición inmunógena que induce una respuesta inmunitaria contra
la proteína E7 nativa del papilomavirus HPV-16, sin
inducir simultáneamente ninguna inmunosupresión, que comprende, a
título de principio activo, una proteína E7 mutada no
inmunosupresora tal como se ha definido anteriormente en la
presente memoria, llegado el caso en asociación con uno o varios
excipientes o adyuvantes de la inmunidad fisiológicamente
compatible.
La invención se refiere asimismo a una
composición vacunal desprovista de propiedad inmunosupresora,
preventiva o curativa con respecto a un cáncer provocado por una
infección por papilomavirus, caracterizada porque comprende, a
título de principio activo, una proteína E7 mutada no
inmunosupresora tal como se ha definido anteriormente en la
presente memoria, en asociación con uno o varios adyuvantes de la
inmunidad fisiológicamente compatibles.
La presente invención se refiere asimismo al uso
de una proteína E7 mutada no inmunosupresora tal como se ha
definido anteriormente, para la preparación de una composición
inmunógena o de una composición vacunal no inmunosupresora y que
induce la producción de anticuerpos que neutralizan la actividad
inmunosupresora de la proteína E7 nativa.
\newpage
Tal como se ilustra en los ejemplos, una
composición inmunógena o una composición vacunal según la invención
induce una respuesta inmunitaria celular citotóxica contra las
células que expresan la proteína E7 nativa, o un péptido derivado de
la proteína E7 nativa. En particular, se demuestra en los ejemplos
que una composición inmunógena o una composición vacunal según la
invención induce una respuesta inmunitaria celular citotóxica
contra células tumorales que expresan la proteína E7 nativa, o un
péptido derivado de la proteína E7 nativa.
La secuencia de aminoácidos de referencia de la
proteína E7 nativa de HPV-16 es, por ejemplo, la
secuencia descrita por Seedorf et al. (1985) cuyo número de
acceso en la base de datos Swissprot es el nº P03129, y que se
reproduce en la presente memoria como la secuencia SEC ID nº 3. El
ácido nucleico que codifica la proteína E7 nativa de
HPV-16 comprende la secuencia nucleotídica SEC ID nº
4.
Una proteína E7 mutada tal como se ha definido
en la presente memoria se puede preparar mediante cualquier técnica
habitual de síntesis de una proteína, bien conocida por el experto
en la materia.
Por ejemplo, una proteína E7 mutada se puede
preparar mediante la tecnología del ADN recombinante, por ejemplo
mediante la sobreexpresión del ácido nucleico que codifica ésta en
un sistema de células bacterianas recombinadas, tales como unas
células de E. coli recombinadas, tal como se ha descrito por
Kiefer et al. (1996) y Tucker et al. (1996).
Asimismo, se puede preparar una proteína E7
mutada por vía de síntesis química, o bien en una disolución
homogénea, o bien en una fase sólida. Una primera ilustración de una
técnica apropiada de síntesis química es, por ejemplo, la descrita
por Houben Weyl (1974).
Asimismo, una proteína E7 mutada se puede
preparar mediante una técnica de síntesis química en disolución o
en fase sólida mediante unos acoplamientos sucesivos de diferentes
residuos de aminoácidos que se deben incorporar (a partir del
extremo N-terminal hasta el extremo
C-terminal en fase líquida, o desde el extremo
C-terminal hasta el extremo
N-terminal en fase sólida), técnica de síntesis en
la que los extremos N-terminal y las cadenas
laterales de los residuos de aminoácidos se bloquean previamente
mediante unos grupos químicos protectores apropiados. Una
ilustración de una técnica que se puede usar para sintetizar una
proteína E7 mutada es la descrita por Merrifield (1965a;
1965b).
Según la invención, una proteína E7 mutada se
puede producir mediante traducción de un ácido nucleico que
codifica dicha proteína E7 mutada, por ejemplo mediante un ácido
nucleico que codifica la proteína E7 mutada de secuencia SEC ID nº
1.
Preferentemente, cualquier ácido nucleico y
cualquier polipéptido según la invención se presentan en forma
aislada o purificada.
El término "purificada" no necesita que el
material esté presente en forma de pureza absoluta, exclusiva de la
presencia de otros compuestos. Se trata más bien de una definición
relativa. Un polinucleótido o un polipéptido está en estado
purificado después de una purificación del material de partida o
del material natural de por lo menos un orden de magnitud,
preferentemente 2 ó 3 y preferentemente 4 ó 5 órdenes de
magnitud.
Los términos "ácido nucleico",
"polinucleótido", "oligonucleótido" o también
"secuencia nucleotídica" comprenden unas secuencias de ARN, de
ADN, de ADNc o también de las secuencias híbridas ARN/ADN de por lo
menos dos nucleótidos, indiferentemente en forma monocatenaria o en
forma de dúplex.
El término "nucleótido" designa al mismo
tiempo los nucleótidos naturales (A, T, G, C) así como unos
nucleótidos modificados que comprenden por lo menos una
modificación tal como (i) un análogo de una purina, (ii) un análogo
de una pirimidina, o (iii) un azúcar análogo, estando dichos
nucleótidos modificados descritos, por ejemplo, en la solicitud PCT
nº WO 95/04064.
Para los fines de la presente invención, un
primer nucleótido se considera como "complementario" de un
segundo polinucleótido cuando cada base del primer nucleótido está
emparejada con la base complementaria del segundo polinucleótido
cuya orientación está invertida. Las bases complementarias son A y
T (o A y U), y C y G.
Según un modo de realización preferido, el ácido
nucleico que codifica la proteína E7 mutada de secuencia SEC ID nº
1 comprende la secuencia nucleotídica SEC ID nº 2.
Un ácido nucleico tal como se ha definido
anteriormente es útil principalmente cuando se usa para la
producción del producto de expresión correspondiente.
Por consiguiente, el ácido nucleico que codifica
la proteína E7 mutada comprende, preferentemente, un polinucleótido
regulador que controla la expresión de la proteína E7 mutada en una
célula hospedante procariota o eucariota.
\newpage
El polinucleótido regulador comprende por lo
menos una secuencia promotora capaz de iniciar la transcripción del
ADN que codifica una proteína E7 mutada en la célula hospedante
elegida. Este polinucleótido regulador puede asimismo comprender
otras secuencias nucleotídicas que favorecen la expresión del ADN
que codifica la proteína E7 mutada, por ejemplo unas secuencias
activadoras de la transcripción bien conocidas por el experto en la
materia.
Preferentemente, se elegirá un promotor
denominado "inducible", es decir, un promotor sensible a la
presencia de un compuesto inductor, dirigiendo dicho promotor la
transcripción del ADN situado bajo su control únicamente en
presencia del compuesto inductor.
El promotor LacZ es un ejemplo ilustrativo de
dicho promotor inducible.
Según la invención, se puede usar cualquier
técnica habitual de biología molecular, de microbiología y de ADN
recombinante conocida por el experto en la materia con el fin de
preparar un ácido nucleico tal como se ha definido anteriormente. Se
describen dichas técnicas, por ejemplo, por Sambrook et al.
(1989), Glover (1985), Gait (1984) y Ausubel et al.
(1989).
El ácido nucleico que comprende un ADN que
codifica una proteína E7 mutada según la invención, dispuesto bajo
el control de un polinucleótido regulador tal como se ha definido
anteriormente está incluido en un casete de expresión.
Dicho casete de expresión puede comprender,
además del polinucleótido regulador del ADN que codifica la
proteína E7 mutada, unas secuencias no traducidas localizadas por
el lado 5' del marco abierto de lectura, denominadas secuencias
"leader", capaces de aumentar la traducción del producto de
expresión, o unas secuencias denominadas "terminadoras" bien
conocidas por el experto en la materia.
De manera muy preferida, un casete de expresión
tal como se ha definido anteriormente comprende además una
secuencia que codifica un péptido señal con vistas a la producción
de un polipéptido de fusión entre dicho péptido señal y la proteína
E7 mutada, por ejemplo entre dicho péptido señal y la proteína
E7\Delta21-26, con el fin de favorecer la
secreción del producto de expresión del ADN que codifica la proteína
E7 mutada y volver a encontrar a éste principalmente en el exterior
de las células, por ejemplo en el sobrenadante de cultivo celular.
Preferentemente, la secuencia nucleotídica que codifica el péptido
señal está localizada inmediatamente por el lado 5' de la secuencia
nucleotídica que codifica la proteína E7 mutada.
En general, un casete de expresión tal como se
ha definido anteriormente comprende además un polinucleótido
marcador de selección, por ejemplo el gen his, con el fin de
seleccionar positivamente las células hospedantes transformadas por
éste.
El ácido nucleico que codifica una proteína E7
mutada tal como se ha definido en la presente memoria, llegado el
caso después de la inserción en un casete de expresión, se
introduce preferentemente en un vector recombinante de clonación y/o
de expresión, que comprende dicho ácido nucleico o dicho casete de
expresión, tal como se han definido anteriormente.
Por el término "vector", en el sentido de
la presente invención, se entiende una molécula de ADN o de ARN
circular o lineal que está indiferentemente en forma monocatenaria
o bicatenaria.
Un vector recombinante es indiferentemente un
vector de clonación o un vector de expresión.
Puede tratarse de un vector de origen bacteriano
o vírico.
Los vectores bacterianos preferidos según la
invención son, por ejemplo, los vectores Pbr322 (ATCC37017) o
también unos vectores tales como PAA223-3
(Pharmacia, Uppsala, Suecia) y pGEM1 (Promega Biotech, Madison, WI,
Estados unidos).
También se pueden citar otros vectores
comercializados tales como los vectores pQE70, pQE60, pWE9
(Qiagen), psiX174, pBluescript SA, p NH8A, p NH16A, p NH18A, p
NH46A, p WLNEO, p SV2CAT, p G344, pXTI, pSG (Stratagene).
Según un primer modo de realización, un vector
recombinante tal como se ha definido anteriormente se usa con el
fin de amplificar el ácido nucleico o el casete de expresión que se
inserta en el mismo, después de la transformación o transfección del
hospedante celular deseado.
Según un segundo modo de realización, se trata
de un vector de expresión que comprende un ácido nucleico o un
casete de expresión tal como se han definido anteriormente, con
vistas a la transformación de una célula hospedante seleccionada
para la producción del producto de expresión del ADN que codifica
una proteína E7 mutada según la invención.
Un vector recombinante tal como se ha definido
anteriormente comprende también ventajosamente unas secuencias de
iniciación y de parada de la transcripción apropiada.
Un casete de expresión tal como se ha definido
anteriormente constituye un modo de realización particular de un
vector recombinante según la invención.
Para permitir la expresión del ácido nucleico
que codifica una proteína E7 mutada según la invención, se deben
introducir en una célula hospedante un ácido nucleico, un casete de
expresión o un vector recombinante tal como se han definido
anteriormente.
Para usar ciertos modos de producción de una
proteína E7 mutada tal como se ha definido en la presente memoria,
se recurre ventajosamente a una célula hospedante transformada por
un ácido nucleico, un casete de expresión o un vector recombinante
tal como se han definido anteriormente.
La célula hospedante transformada es
ventajosamente una célula bacteriana, tal como una célula de E.
coli, o también una célula de levadura, tal como una célula de
Saccharomyces cerevisiae.
Dicha célula hospedante transformada es
ventajosamente una célula eucariota.
Una categoría de células hospedantes
recombinantes preferidas son las células de mamíferos, tales como
unas células de ratones, transformadas por un ácido nucleico, un
casete de expresión o también un vector recombinante según la
invención.
La invención describe asimismo un procedimiento
para la fabricación de un ácido nucleico que codifica una proteína
E7 mutada tal como se ha definido en la presente memoria,
comprendiendo dicho procedimiento las siguientes etapas:
- (a)
- realizar una mutagénesis dirigida del ácido nucleico que codifica la proteína E7 nativa, mediante amplificación de dicho ácido nucleico con la ayuda de un primer cebador nucleotídico y de un segundo cebador nucleotídico que se hibrida con el extremo 3' del ADN que codifica la proteína E7 nativa, respectivamente.
- (b)
- recuperar el ADN amplificado.
El primer cebador nucleotídico comprende, en su
secuencia, la serie de los codones que codifican para las
mutaciones que se desean insertar en la secuencia de aminoácidos de
la proteína E7 nativa de partida.
Así, si se desea preparar una proteína E7 mutada
cuya región (ii) comprende una o varias sustituciones de un
aminoácido, la secuencia del primer cebador es tal que contiene los
codones apropiados que codifican para el o los aminoácidos
sustituidos.
Si, según otra alternativa, se desea preparar
una proteína E7 mutada cuya región (ii) comprende la supresión de
cuatro, cinco, seis, y, ocho, nueve o diez aminoácidos
consecutivos, con relación a la secuencia correspondiente de
aminoácidos 20-29 de la secuencia SEC ID nº 3,
entonces el primer cebador comprende, en su secuencia, un primer
codón que codifica para el aminoácido localizado inmediatamente por
el lado N-terminal del fragmento peptídico a
suprimir, primer codón que precede inmediatamente a un segundo
codón, segundo codón que codifica para el aminoácido localizado
inmediatamente por el lado N-terminal del fragmento
peptídico a suprimir.
El uso del primer cebador permite la obtención
de un producto final de amplificación en el que los codones
deseados han sido modificados, producto final de amplificación que
codifica la proteína E7 mutada deseada.
El segundo cebador nucleotídico usado en la
etapa (a) de amplificación puede comprender, además de una
secuencia que se hibrida con el extremo 3' del ADN que codifica la
proteína E7 nativa, también uno o varios sitios de reconocimiento
mediante unas endonucleasas.
El ácido nucleico que codifica la proteína E7
mutada se inserta en un vector de clonación o en un vector de
expresión, en un sitio de inserción predeterminado, por ejemplo
mediante el enlace de dicho ácido nucleico con el ácido nucleico del
vector, después de haber abierto previamente el vector hospedante,
por ejemplo mediante corte nucleotídico con la ayuda de una
endonucleasa de restricción, preferentemente a nivel de un
polisitio de clonación.
La invención tiene por objeto una composición
que comprende la proteína E7 mutada, tal como se ha definido en la
presente memoria, y preferentemente una composición inmunógena o
una composición vacunal que comprende dicha proteína E7 mutada.
La invención tiene por objeto cualquier
composición que comprende una proteína E7 mutada no inmunosupresora
según la invención, tal como la proteína E7 mutada que comprende la
secuencia de aminoácidos de secuencia SEC ID nº 1.
La invención tiene asimismo por objeto cualquier
composición que comprende el producto de expresión del ADN que
codifica una proteína E7 mutada según la invención, tal como la
proteína E7\Delta21-26 de secuencia SEC ID nº
2.
Se ha demostrado según la invención que una
proteína E7 mutada tal como se ha definido en la presente memoria
está desprovista de propiedad inmunosupresora, tal como se ilustra
en los ejemplos.
En particular, se ha demostrado que la proteína
E7\Delta21-26 no inducía ninguna inmunosupresión,
la cual se administra a un mamífero, en asociación con un adyuvante
de la inmunidad apropiado.
Se ha demostrado asimismo que las proteínas E7
mutadas, respectivamente la proteína E7 (CYS24GLY,
GLU26GLN) y la proteína E7 (CYS24SER, GLU26GLN), no inducían ninguna inmunosupresión cuando se administran a un mamífero, en asociación con un adyuvante de la inmunidad apropiado.
GLU26GLN) y la proteína E7 (CYS24SER, GLU26GLN), no inducían ninguna inmunosupresión cuando se administran a un mamífero, en asociación con un adyuvante de la inmunidad apropiado.
Como ya se ha precisado sucintamente
anteriormente, el producto de expresión del ADN que codifica la
proteína E7 mutada de secuencia SEC ID nº 1 induce una respuesta
inmunitaria contra la proteína E7 nativa por lo menos del mismo
orden que la respuesta inmunitaria inducida por la proteína E7
nativa en sí, y la proteína E7 mutada según la invención está
desprovista, sobre las células inmunitarias humanas, de las
propiedades inmunosupresoras que caracterizan en particular la
proteína E7 nativa.
Por lo tanto, la invención tiene asimismo por
objeto una composición farmacéutica preventiva o curativa de una
infección por HPV-16, y más específicamente de un
cáncer inducido por una infección por HPV-16,
caracterizada porque comprende, a título de principio activo, el
producto de expresión del ADN que codifica la proteína E7 mutada tal
como se ha definido anteriormente, llegado el caso en asociación
con uno o varios excipientes fisiológicamente compatibles.
Preferentemente, dicha composición farmacéutica
se presenta en forma adaptada para la administración de una
cantidad semanal comprendida entre 10 y 1.000 \mug de la proteína
E7 mutada, o del producto de expresión del ADN que la codifica.
Se demuestra según la invención que el producto
de expresión del ADN que codifica la proteína E7 mutada de
secuencia SEC ID nº 1, cuando se administra en combinación con un
adyuvante de la inmunidad apropiado, es capaz de generar una
respuesta inmunitaria humoral y celular dirigida contra la proteína
E7 nativa permitiendo así inducir una inmunidad preventiva contra
los tumores. Además, la inmunidad protectora que induce un estado
de resistencia antitumoral provocada por la administración del
producto de expresión del ADN que codifica la proteína E7 mutada es
igual o superior a la que se obtiene después de la inmunización
previa con la proteína E7 nativa.
También se ha demostrado que el producto de
expresión del ADN que codifica la proteína E7 mutada de secuencia
SEC ID nº 1 es capaz de inducir una inmunidad antitumoral
terapéutica, cuando se administra esta proteína, en asociación con
un adyuvante de la inmunidad apropiado, a un individuo que ya ha
desarrollado unos tumores. La respuesta inmunitaria antitumoral
terapéutica inducida por el producto de expresión del ADN que
codifica la proteína E7 mutada es significativamente superior a la
que se puede obtener después de la administración de la proteína E7
nativa.
Dichos resultados se ilustran en el ejemplo 3 en
el que se muestra, en un modelo murino, que la inmunidad
terapéutica antitumoral inducida por el producto de expresión del
ADN que codifica la proteína E7 mutada permite alargar la duración
de vida media de los animales 1,5 veces con relación a la duración
de vida media de los animales a los que se les ha administrado la
proteína E7 nativa.
Asimismo se ha mostrado que la inmunidad
antitumoral preventiva de la inmunidad antitumoral terapéutica
inducida por el producto de expresión del ADN que codifica la
proteína E7 mutada se debía a la inducción simultánea de una
respuesta inmunitaria humoral y celular específica.
Así, los resultados de los ejemplos muestran que
una proteína E7 mutada tal como se ha definido en la presente
memoria es capaz de inducir una inmunidad humoral sistémica contra
la proteína E7 nativa. Se ha mostrado en particular que se producía
un alto nivel de anticuerpos anti-E7 de isotipo
IgG, principalmente unos anticuerpos de isotipos IgG2b e IgG1.
Además, la administración de una proteína E7
mutada según la invención a un individuo, en las condiciones
apropiadas, permite también inducir una inmunidad de tipo mucosal,
tal como lo demuestra el alto nivel de respuesta de anticuerpos de
isotipo IgA presentado en el ejemplo 3.
Además, según una característica esencial de la
proteína E7 mutada, esta proteína que está desprovista a su vez de
la actividad inmunosupresora directa de la proteína E7 nativa,
permite bloquear la actividad inmunosupresora de la proteína E7
soluble segregada por las células cancerígenas, debido al carácter
neutralizante de los anticuerpos pro-
ducidos después de la inmunización con la proteína E7 mutada, tal como lo demuestran los resultados del ejemplo 2.
ducidos después de la inmunización con la proteína E7 mutada, tal como lo demuestran los resultados del ejemplo 2.
Los resultados de los ejemplos muestran asimismo
que una proteína E7 mutada según la invención permite la
proliferación de células TCD4+ y TCD8+ que reconocen
específicamente la proteína E7 nativa, siendo esta proliferación
celular acompañada por una sobreproducción de la citoquina
IFN-\gamma.
La invención se refiere asimismo a una
composición inmunógena que induce una respuesta inmunitaria contra
la proteína E7 nativa del papilomavirus HPV-16, sin
inducir simultáneamente una inmunosupresión, comprendiendo dicha
composición, a título de principio activo, una proteína E7 mutada
no inmunosupresora cuya secuencia de aminoácidos consiste, desde el
extremo N-terminal hacia el extremo
C-terminal, en:
- - (i)
- la secuencia de aminoácidos 1-19 de la secuencia SEC ID nº 3;
- - (ii)
- una secuencia de aminoácidos que posee (a) la sustitución de por lo menos un aminoácido con relación a la secuencia correspondiente de aminoácidos 20-29 de la secuencia SEC ID nº 3, o (b) la supresión de por lo menos cuatro aminoácidos consecutivos con relación a la secuencia correspondiente de aminoácidos 20-29 de la secuencia SEC ID nº 3; y
- - (iii)
- la secuencia de aminoácidos 30-98 de la secuencia SEC ID nº 3,
en asociación con uno o varios excipientes o
adyuvantes de la inmunidad fisiológicamente compatibles.
\vskip1.000000\baselineskip
Dicha composición inmunógena se puede usar de
manera preventiva, con el objetivo de inducir una inmunidad
antitumoral protectora frente a una infección por
HPV-16.
Dicha composición inmunógena se puede usar
asimismo a título terapéutico o curativo de una infección por
HPV-16, en particular de un cáncer provocado por una
infección por HPV-16.
La invención se refiere asimismo al uso de una
proteína E7 mutada tal como se ha definido en la presente memoria
para la preparación de una composición farmacéutica, o para la
preparación de una composición inmunógena tal como se ha definido
anteriormente.
La presente invención tiene asimismo por objeto
un procedimiento para la preparación de una composición
farmacéutica, o de una composición inmunógena, destinada a inducir
una inmunidad protectora preventiva o una inmunidad terapéutica
contra un cáncer provocado por una infección por
HPV-16, bloqueando al mismo tiempo el estado de
inmunosupresión inducido por la proteína E7 nativa, caracterizado
porque comprende una etapa durante la cual una proteína E7 mutada
tal como se ha definido anteriormente se combina con uno o varios
adyuvantes de la inmunidad fisiológicamente compatibles.
La invención se refiere asimismo a una
composición vacunal preventiva o curativa de un cáncer provocado
por una infección por papilomavirus, caracterizada porque comprende
a título de principio activo, una proteína E7 mutada no
inmunosupresora cuya secuencia de aminoácidos consiste, desde el
extremo N-terminal hacia el extremo
C-terminal, en:
- - (i)
- la secuencia de aminoácidos 1-19 de la secuencia SEC ID nº 3;
- - (ii)
- una secuencia de aminoácidos que posee (a) la sustitución de por lo menos un aminoácido con relación a la secuencia correspondiente de aminoácidos 20-29 de la secuencia SEC ID nº 3, o (b) la supresión de por lo menos cuatro aminoácidos consecutivos con relación a la secuencia correspondiente de aminoácidos 20-29 de la secuencia SEC ID nº 3; y
- - (iii)
- la secuencia de aminoácidos 30-98 de la secuencia SEC ID nº 3,
en asociación con uno o varios adyuvantes de la
inmunidad fisiológicamente compatibles.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de luchar contra la inmunosupresión
local a nivel de las células cancerígenas infectadas por
HPV-16, que es inducida por la proteína E7
extracelular, y estimular después una respuesta inmunitaria eficaz
contra estas células cancerígenas, que presentan en su superficie
membranaria la proteína E7 nativa, o unos péptidos derivados de la
proteína E7 nativa después de la maduración intracelular, en
asociación con un antígeno de clase I del MHC, es importante
inducir la producción de anticuerpos, en particular de anticuerpos
del isotipo IgG, capaces de neutralizar el efecto inmunosupresor de
la proteína E7 soluble segregada por las células cancerígenas
infectadas por el virus HPV-16. Además, es esencial
inducir simultáneamente la producción de linfocitos citotóxicos
(CTL) capaces de reconocer específicamente la proteína E7 nativa, o
un péptido que se deriva de ésta, expuesto en la superficie
membranaria de las células cancerígenas, con el fin de destruir
estas células. Para alcanzar este objetivo, es necesario inducir
una respuesta inmunitaria de tipo sistémica.
Además, siendo los papilomavirus humanos
detectados principalmente en los cánceres de las mucosas, en
particular los cánceres ano-genitales, incluyendo el
cáncer del cuello uterino en la mujer, es importante completar los
efectos preventivos o terapéuticos de la inducción de una respuesta
inmunitaria de tipo sistémico mediante la inducción de una
respuesta inmunitaria de tipo mucosal, en particular estimulando la
producción de anticuerpos de isotipo IgA a nivel local, sobre las
mucosas.
Según los objetivos pretendidos, se usan unos
adyuvantes de la inmunidad capaces de orientar la respuesta hacia
una inmunidad sistémica o mucosal.
Entre los adyuvantes de la inmunidad sistémica,
se usan preferentemente los adyuvantes de tipo IFA (adyuvante
incompleto de Freund), el fosfato de calcio o el hidróxido de
alúmina. También se puede usar el adyuvante QuilA, comercializado
por Brenntay Biosector, Dinamarca. Entre los adyuvantes de la
inmunidad mucosal, se usan preferentemente unos adyuvantes tales
como la clorotoxina B (CTB) o también un mutante de la toxina LT
(LT\mu), bien conocidos por el experto en la materia.
La inducción de una respuesta inmunitaria de
tipo sistémica y/o de tipo mucosal también esta influenciada por la
vía de administración de la composición vacunal de la
invención.
Así, la administración de la composición vacunal
por vía parenteral, sub-cutánea o intradérmica
favorecerá la inducción de una respuesta inmunitaria sistémica,
acompañada asimismo, llegado el caso, de una respuesta inmunitaria
mucosal.
La administración de la composición vacunal
según la invención a nivel local, por ejemplo mediante instilación
nasal o también mediante aplicación local en la superficie de las
mucosas, favorecerá la inducción de una respuesta inmunitaria de
tipo mucosal.
La presente invención tiene asimismo por objeto
un método de tratamiento preventivo o curativo de un cáncer
provocado por una infección por HPV-16,
caracterizado porque comprende una etapa durante la cual se
administra a los pacientes una cantidad inmunológicamente eficaz de
una composición vacunal tal como se ha definido en la presente
memoria.
Preferentemente, se administra a un paciente, en
una forma adaptada para la administración sistémica y/o mucosal,
una composición vacunal de la invención en cantidad suficiente para
ser eficaz en el plano preventivo o terapéutico, a un sujeto que
necesita dicho tratamiento. La dosis administrada de la proteína E7
mutada, o del producto de expresión del ADN que codifica la
proteína E7 mutada, puede estar comprendida por ejemplo entre 10 y
1.000 \mug por vía parenteral, una vez por semana durante dos
meses, y después periódicamente en función del nivel de la respuesta
celular o humoral inducida, por ejemplo cada dos a seis meses.
Según un primer aspecto, la composición vacunal
según la invención se caracteriza porque comprende por lo menos un
adyuvante susceptible de orientar preferentemente la respuesta
inmunitaria hacia la producción de anticuerpos que neutralizan la
actividad inmunosupresora de la proteína E7 salvaje.
Según un primer modo de realización particular,
dicha composición vacunal se caracteriza porque comprende por lo
menos un adyuvante susceptible de orientar preferentemente la
respuesta inmunitaria hacia la producción de anticuerpos de isotipo
IgA.
Según un segundo modo de realización preferido,
dicha composición vacunal se caracteriza porque comprende por lo
menos un adyuvante susceptible de orientar preferentemente la
respuesta inmunitaria hacia la producción de anticuerpos de isotipo
IgG.
Según un segundo modo de realización preferido,
dicha composición vacunal está caracterizada porque comprende por
lo menos un adyuvante susceptible de orientar preferentemente la
respuesta inmunitaria hacia la producción de anticuerpos de tipo
IgG.
Según todavía otro modo de realización
preferido, una composición vacunal según la invención se
caracteriza porque comprende la combinación (i) de un adyuvante
susceptible de orientar preferentemente la respuesta inmunitaria
hacia la producción de anticuerpos de isotipo IgA y (ii) de un
adyuvante susceptible de orientar preferentemente la respuesta
inmunitaria hacia la producción de anticuerpos de isotipo IgG.
Preferentemente, la composición vacunal según la
invención se caracteriza porque comprende por lo menos un adyuvante
de la inmunidad susceptible de inducir una respuesta inmunitaria al
mismo tiempo humoral y celular.
Preferentemente, se buscará obtener la inducción
de una respuesta celular, caracterizada en particular por la
proliferación de linfocitos T que expresan el antígeno CD8 y que
reconocen específicamente la proteína E7 salvaje, tal como se
presenta en la superficie de las células cancerígenas en asociación
con los antígenos de clase I del MHC.
Según otro modo de realización particular de una
composición vacunal según la invención, esta composición vacunal
puede comprender uno o varios diferentes compuestos antigénicos o
inmunógenos de HPV. Por ejemplo, en una composición vacunal según
la invención, el producto de expresión del ADN que codifica la
proteína E7 mutada se puede asociar a una o varias proteínas de
cápside de HPV-16, o a unos péptidos obtenidos a
partir de estas proteínas de cápside, en particular las proteínas L1
y L2 de HPV-16 bien conocidas por el experto en la
materia.
Según todavía otro modo de realización
particular, la composición vacunal según la invención puede
comprender uno o varios compuestos antigénicos o inmunógenos
capaces de inducir una respuesta inmunitaria celular o humoral
contra tipos de HPV distintos de HPV-16,
preferentemente de tipo de HPV conocidos para provocar unos
cánceres, tales como HPV-18, 31, 33 y 51.
En todavía otro modo de realización particular
de una preparación vacunal según la invención, el producto de
expresión del ADN que codifica la proteína E7 mutada se puede
combinar con uno o varios compuestos antigénicos o inmunógenos
capaces de inducir la producción de anticuerpos contra factores
solubles con propiedades inmunosupresoras o angiogénicas tales como
el IFN\alpha, el TGF\beta, el TNF\alpha o también el VEGF.
Preferentemente, estos compuestos antigénicos o inmunógenos son
respectivamente el IFN\alpha, el TGB\beta, el TNF\alpha o el
VEGF modificados químicamente con el fin de destruir sus propiedades
inmunosupresoras y/o con el fin de estabilizarlas. Dichas
modificaciones químicas, por ejemplo mediante carboximetilación,
son bien conocidas por el experto en la materia. Se describen en
particular por Frankel et al. (1988).
Según un aspecto preferido de este modo de
realización particular de una composición vacunal según la
invención, el producto de expresión del ADN que codifica la
proteína E7 mutada y por lo menos otro compuesto antigénico o
inmunógeno están enlazados químicamente para formar un
superinmunógeno compuesto tal como se describe en la solicitud de
patente francesa nº 0110751 presentada el 10 de agosto de 2001 a
nombre de la compañía NEOVACS.
Dicho superinmunógeno compuesto comprende dos
polipéptidos inmunógenos distintos físicamente enlazados uno al
otro, consistiendo los dos polipéptidos respectivamente en:
- (a)
- un primer polipéptido inmunógeno que induce una reacción inmunitaria celular, o una reacción inmunitaria celular y humoral, contra una estructura antigénica patógena celular de HPV-16;
- (b)
- un segundo polipéptido inmunógeno que induce la producción de anticuerpos neutralizantes o bloqueantes contra una proteína circulante local del estroma seleccionada de entre un factor citoquínico o un factor de regulación celular con propiedades inmunotóxicas o angiogénicas, siendo este factor producido por las células cancerígenas o las células estromales, incluyendo los linfocitos T y las células que presentan el antígeno (APC).
El superinmunógeno compuesto usado según la
invención se denomina "bifuncional" puesto que los dos
polipéptidos (a) y (b), que son las dos partes esenciales que lo
constituyen, permiten la inducción simultánea de una reacción
inmunitaria dirigida contra dos dianas distintas, respectivamente
la estructura antigénica patógena y la proteína circulante local
del estroma. Sin embargo, un superinmunógeno compuesto bifuncional
según la invención puede comprender en su estructura una pluralidad
de copias respectivamente de un polipéptido (a) y/o de un
polipéptido (b).
El polipéptido (a) y el polipéptido (b)
constitutivos de un superinmunógeno compuesto de la invención se
denominan "físicamente unidos" uno al otro puesto que están en
todos los casos incluidos ambos en una misma estructura física,
molécula o partícula (micropartícula o nanopartícula), en el seno
de la cual están poco distantes uno del otro. Debido a que están
unidos físicamente uno a otro en el superinmunógeno compuesto, el
polipéptido (a) y el polipéptido (b)
se presentan conjuntamente a las mismas células inmunocompetentes, tanto los macrófagos como los linfocitos T o B.
se presentan conjuntamente a las mismas células inmunocompetentes, tanto los macrófagos como los linfocitos T o B.
Según un primer modo de realización preferido de
un superinmunógeno compuesto, los polipéptidos (a) y (b) se
seleccionan respectivamente de entre:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
Según un segundo modo de realización preferido
de un superinmunógeno compuesto, los polipéptidos (a) y (b) se
seleccionan respectivamente de entre:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
Según un modo de realización ventajoso, la
invención se refiere asimismo a una composición que comprende
varios superinmunógenos compuestos que se distinguen por la
identidad de la proteína E7 mutada (polipéptido (a) o polipéptido
(b), según el tipo de superinmunógeno compuesto).
Para fabricar un superinmunógeno compuesto según
la invención, se realiza un acoplamiento del polipéptido (a) y del
polipéptido (b) por vía química o por recombinación genética.
En un modo de realización particular del
conjugado peptídico inmunógeno de la invención, los polipéptidos
(a) y (b) se enlazan directamente entre sí de manera covalente, por
ejemplo a través de un enlace -CO-NH-.
Sin embargo, con el fin de introducir una cierta
flexibilidad en la estructura del conjugado peptídico inmunógeno, y
en particular de permitir una movilidad en el espacio de los
polipéptidos (a) y (b), uno con relación al otro en el seno del
conjugado peptídico inmunógeno, se prefiere un conjugado peptídico
en el que los polipéptidos (a) y (b) están separados uno del otro,
en el seno de dicho conjugado, mediante una cadena espaciadora.
Según un primer modo de realización preferido de
un conjugado peptídico inmunógeno, los polipéptidos (a) y (b) están
separados uno del otro, en el seno de dicho conjugado, por una
cadena espaciadora seleccionada de entre el SMCC o el SIAB, que son
ambos los unos compuestos bifuncionales.
El compuesto SIAB, descrito por Hermanson G.T.
(1996, Biconjugates techniques, San Diego: Academic Press, p.
239-242), es el compuesto de fórmula (i)
siguiente:
El compuesto SIAB comprende dos grupos
reactivos, respectivamente un grupo yodoacetato y un grupo éster
sulfo-NHS, reaccionando estos grupos sobre unos
grupos amino y sulfhidrilo.
El compuesto SMCC, descrito por Samoszuk M.K.
et al. (1989, Antibody, Immunoconjugates Radiopharm.,
2(1): 37-46), es el compuesto de fórmula (ii)
siguiente:
El compuesto SMCC comprende dos grupos
reactivos, respectivamente un grupo éster sulfo-NHS
y un grupo maleimida, que reaccionan respectivamente con un grupo
amino y un grupo sulfhidrilo.
Según un segundo modo de realización preferido,
el superinmunógeno compuesto comprende una cadena espaciadora
constituida por un péptido espaciador lineal. Se seleccionará
preferentemente un péptido espaciador lineal que tiene de 3 a 30
aminoácidos de longitud, ventajosamente de 5 a 20 aminoácidos de
longitud y de manera muy preferida de 7 a 15 aminoácidos de
longitud.
Preferentemente, el péptido espaciador lineal
está esencialmente, incluso exclusivamente, constituido por
aminoácidos cargados positivamente o negativamente a pH 7,0 con el
fin de aumentar la hidrofilicidad global de dicho superinmunógeno
compuesto. Se entiende que se deberá evitar usar unos péptidos
espaciadores constituidos por aminoácidos hidrófobos. De manera
preferida, el péptido espaciador se caracteriza porque está
constituido por una cadena de poli-(lisina) constituida por 3 a 30
residuos lisina, ventajosamente de 5 a 20, y de manera muy preferida
de 7 a 15 residuos lisina de longitud.
Según todavía otro modo de realización de un
superinmunógeno compuesto según la invención, los polipéptidos (a)
y (b) están separados uno del otro, en el seno de dicho conjugado
peptídico, por una cadena espaciadora constituida por un péptido
espaciador ramificado, preferentemente una estructura
oligodendrimérica de poli(lisina), tal como se ha descrito,
por ejemplo, por Basak et al. (1995).
En este último modo de realización de un
superinmunógeno compuesto según la invención, dicho conjugado
peptídico puede comprender varias copias de los polipéptidos (a) y
(b) por molécula de conjugado, ventajosamente de 2 a 8 copias de los
polipéptidos (a) y (b), preferentemente como máximo 4 copias de
cada uno de los polipéptidos (a) y (b) por molécula de
conjugado.
Ambos polipéptidos (a) y (b) también pueden
estar incluidos en el seno de una misma estructura física, por
ejemplo, sobre unas nanopartículas que tienen un diámetro
comprendido entre 10 y 500 nanómetros, preferentemente entre 10 y
2.000 nanómetros, y de manera muy preferida entre 10 y 100
nanómetros, por ejemplo, unas nanopartículas de IMS, tal como se
han descrito por ejemplo por Aucouturier et al. (2001), de
quitosano, tal como se ha descrito por ejemplo por Skaugrud et
al. (1999), de liposomas, o de partículas biodegradables tal
como la polilactida ácida (PLA), la
poli-\varepsilon-caprolactona
(PLC) o la poli(lactida-coglicólida) (PLG)
descrita por Baras et al. (1999).
Según todavía otro modo de realización, los
polipéptidos (a) y (b) están enlazados físicamente en el seno de
una misma estructura portadora que permite su presentación
simultánea a las células del sistema inmunitario. En este modo de
realización particular, los polipéptidos (a) y (b) están
inmovilizados sobre unas nanopartículas, por ejemplo unas
nanopartículas de quitosano, de IMS (inmunomodulador accesible de la
compañía Seppic, Francia), constituido por nanopartículas lipídicas
de un diámetro de 100 a 300 nanómetros) o por liposomas.
Preferentemente, dichas partículas son de tamaño
pequeño de manera que presentan simultáneamente los polipéptidos
(a) y (b) a las células, de la misma manera que si estos
polipéptidos estuvieran enlazados de manera covalente en el seno de
la misma molécula. Ventajosamente, las nanopartículas tienen un
diámetro comprendido entre 10 y 1.000 nm, mejor entre 10 y 500 nm,
preferentemente entre 10 y 300 nm y de manera muy preferida entre
10 y 200 nm.
La invención tiene asimismo por objeto una
composición inmunógena, o una composición vacunal desprovista de
propiedad inmunosupresora, preventiva o curativa de un cáncer
provocado por una infección por un papilomavirus, caracterizada
porque comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un ácido
nucleico que codifica una proteína E7 mutada tal como se ha
definido en la presente memoria, de un casete de expresión o
también de un vector recombinante tal como se ha definido en la
presente memoria.
Para la utilización de la composición vacunal
anterior, se prefiere, como vector de expresión, un vector
retrovírico o también un vector adeno-asociado (MV).
Dichos vectores adeno-asociados de describen, por
ejemplo, por Flotte et al. (1992), Samulski et al.
(1989), o también McLaughlin et al. (1996). Para introducir
los ácidos nucleicos, los casetes de expresión o los vectores en
una célula hospedante, el experto en la materia podrá
ventajosamente referirse a diferentes técnicas, tal como la técnica
de precipitación con fosfato de calcio (Graham. et al.,
1973, Chen et al., 1987), el DEAE dextrano (Gopal, 1985), la
electroporación (Tur-kaspa, 1986, Potter et
al. 1984), la microinyección directa (Harland et al.,
1985) o también los liposomas cargados con ADN (Nicolau et
al., 1987; Fraley et al., 1980).
Según un modo de realización particular, un
método para introducir un ácido nucleico o un casete de expresión
según la invención en una célula hospedante, en particular una
célula hospedante que procede de un mamífero, in vivo,
comprende una etapa durante la cual se introduce una preparación que
comprende el ácido nucleico o el casete de expresión en un vehículo
farmacéuticamente compatible, mediante la inyección local a nivel
del tejido elegido, por ejemplo, un tejido muscular liso o también
un tejido mucoso, siendo el ácido nucleico o el casete de expresión
absorbido por las células de este tejido.
Una composición para el uso in vitro e
in vivo que comprenden unos ácidos nucleicos o unos casetes
de expresión "desnudos" se describen, por ejemplo, en la
solicitud PCT nº WO 95/11.307 así como en los artículos de Tacson
et al. (1996) y de Huygen et al. (1996).
También puede tratarse de vectores adenovíricos
tales como el adenovirus humano de tipo 2 ó 5.
La cantidad de vector que se inyecta al
organismo hospedante elegido varía según el sitio de la inyección.
A título indicativo, se puede inyectar entre aproximadamente 10
\mug y 1.000 \mug del ácido nucleico o del casete de expresión
que codifican la proteína E7 mutada según la invención en el cuerpo
de un paciente.
Tal como se desprende claramente de la presente
memoria, la producción de anticuerpos sistémicos o mucosales es
esencial con el fin de bloquear las propiedades inmunosupresoras de
la proteína E7 segregada por las células cancerígenas infectadas
por HPV-16.
\newpage
En la situación en la que una composición
vacunal que comprende una proteína E7 mutada según la invención, o
la composición vacunal que comprende un ácido nucleico, un casete
de expresión o un vector recombinante que codifica la proteína E7
mutada, se usa a título terapéutico, es decir, después del
acontecimiento de infección por HPV-16, es
ventajoso bloquear rápidamente el efecto inmunosupresor de la
proteína E7 producida y segregada por las células cancerígenas con
el fin de favorecer la inducción rápida de una respuesta
inmunitaria humoral y celular por dicha composición vacunal, con el
objetivo de aumentar todavía más la eficacia de ésta.
El bloqueo precoz del efecto inmunosupresor de
la proteína E7 producida por las células infectadas se puede
realizar administrando a los pacientes una cantidad eficaz de
anticuerpos neutralizantes obtenidos después de la inmunización del
ser humano o del animal contra la proteína E7 nativa, usando una
proteína E7 mutada de la invención como compuesto antigénico o
inmunógeno, en asociación con uno o varios adyuvantes de la
inmunidad apropiados.
La invención se refiere asimismo a un
procedimiento de preparación de anticuerpos que neutralizan el
efecto inmunosupresor de la proteína E7 nativa de
HPV-16, caracterizado porque comprende una etapa en
la que se inmuniza un mamífero, incluyendo el ser humano, con la
ayuda de una proteína E7 mutada de la invención, y después se
recuperan los anticuerpos producidos.
La invención se refiere asimismo a unos
anticuerpos dirigidos contra una proteína E7 mutada según la
invención. Estos anticuerpos se caracterizan en particular porque
son neutralizantes, es decir, que neutralizan el efecto
inmunosupresor de la proteína E7 nativa.
La invención tiene asimismo por objeto una
composición farmacéutica que contiene unos anticuerpos que
neutralizan el efecto inmunosupresor de la proteína E7 nativa de
HPV-16, en particular la proteína E7 segregada por
unas células infectadas por HPV-16, siendo dichos
anticuerpos dirigidos contra una proteína E7 mutada según la
invención.
Se refiere asimismo a una composición para la
vacunación pasiva contra una infección por HPV-16,
incluyendo contra un cáncer provocado por una infección por
HPV-16, que contiene los anticuerpos definidos
anteriormente.
Para verificar la capacidad neutralizante de los
anticuerpos según la invención, el experto en la materia se refiere
ventajosamente al ensayo descrito en el ejemplo 1, que consiste en
cuantificar el porcentaje de inhibición de la producción de
IFN-\alpha o de TNF-\alpha por
unos macrófagos humanos expuestos a la proteína E7 nativa.
La invención tiene asimismo por objeto un método
para bloquear el efecto inmunosupresor de la proteína E7 producida
por unas células infectadas por el virus HPV-16,
caracterizado porque se administra a los pacientes una cantidad
neutralizante de anticuerpos obtenidos después de la inmunización
del ser humano o del animal con una proteína E7 mutada tal como se
ha definido en la presente memoria.
La "cantidad neutralizante" de anticuerpos
a administrar al paciente varía según la extensión de la infección
por HPV. En general, se administra al paciente una cantidad de
anticuerpos neutralizantes que corresponde a la cantidad de
anticuerpos neutralizantes necesaria para bloquear la actividad
inmunosupresora de una cantidad de proteína E7 nativa comprendida
entre 100 ng y 1 mg, en el ensayo de inmunosupresión descrito en el
ejemplo 1.
Los anticuerpos pueden ser unos anticuerpos de
isotipo IgA o de isotipo IgG. Pueden ser unos anticuerpos
policlonales o también unos anticuerpos monoclonales.
Los anticuerpos según la invención comprenden
asimismo los fragmentos F(ab')2 o F(ab).
Las células dendríticas son unas células que
presentan el antígeno (APC) que están especializadas en la
iniciación de la inmunidad celular T. Se requiere un contacto
físico entre unas células dendríticas y unas células T para la
inducción de una respuesta inmunitaria de las células T. Las
células dendríticas activan las respuestas inmunitarias específicas
de un antígeno dado, a través de dos etapas de señalización. La
primera etapa de señalización implica una interacción péptido
antigénico-MHC/receptor de las células T (TCR). La
segunda etapa de señalización implica unas moléculas
coestimuladoras, tales como los marcadores de superficie celular y
las citoquinas.
Las células dendríticas producen diversas
citoquinas cuando presentan el antígeno a las células T, lo que
influye en el micro-entorno de citoquinas, y después
en la respuesta inmunitaria subsiguiente.
Más específicamente, se sabe que la vacunación
con unas células dendríticas permite romper la tolerancia
inmunológica del sistema inmunitario frente a unas células
tumorales, e induce la tisis del tumor en el organismo hospedante
mediante la estimulación de una respuesta inmunitaria celular T de
tipo Th1, por lo menos en los cánceres para los cuales no existe
ninguna situación de inmunosupresión concomitante con el desarrollo
del tumor.
Se ha demostrado según la invención que la
incubación in vitro de una población de células dendríticas
de un individuo con una cantidad apropiada de una proteína E7
mutada, tal como se ha definido en la presente memoria, convertía
estas células dendríticas en apropiadas para presentar
subsiguientemente dicha proteína E7 mutada a las células T
presentes en una población de células mononucleadas autólogas,
obtenidas a partir del mismo individuo, y para inducir la
activación de las células T específicas de la proteína E7, que se
visualiza mediante la proliferación de estas células T. La
activación de las células T se puede medir, por ejemplo, mediante
la cantidad de incorporación intracelular de
[^{3}H]timidina, tal como se ilustra en el ejemplo.
En un experimento similar, pero en el que las
células dendríticas se incuban previamente in vitro con la
proteína E7 nativa, no se observa ninguna activación de las células
T, como en la población de células dendríticas de control incubada
en ausencia de cualquier antígeno exógeno. En este sistema se
observa, otra vez, la actividad inmunosupresora de la proteína E7
nativa.
Por el contrario, una proteína E7 mutada según
la invención está desprovista de actividad inmunosupresora y
permite la inducción de una respuesta inmunitaria celular T
específica eficaz, contra la proteína E7 nativa.
La invención tiene asimismo por objeto una
composición vacunal desprovista de propiedades inmunosupresoras,
preventiva o curativa para un cáncer provocado por una infección
por papilomavirus, caracterizada porque comprende, a título de
principio activo, una cantidad apropiada de células dendríticas
autólogas o alogénicas frente al individuo a tratar, habiendo sido
dichas células dendríticas autólogas incubadas con una proteína E7
mutada tal como se ha definido en la presente memoria y convertidas
así en apropiadas para presentar dicha proteína E7 mutada a las
células T que la reconocen específicamente.
La invención tiene asimismo por objeto un método
para prevenir o curar un cáncer provocado por una infección por
papilomavirus, caracterizado porque comprende una etapa en la que
se administra al individuo a tratar una cantidad apropiada de
células dendríticas autólogas (isogénicas) o alogénicas frente al
individuo a tratar, habiendo sido dichas células dendríticas
autólogas (isogénicas) o alogénicas incubadas, previamente a su
administración al individuo, con una proteína E7 mutada tal como se
ha definido en la presente memoria y convertidas así en apropiadas
para presentar dicha proteína E7 mutada a las células T que la
reconocen específicamente.
Preferentemente, las células dendríticas se
obtienen por diferenciación de monocitos preparados por elutriación
a partir de la sangre periférica humana, o bien sangre del
paciente, o bien sangre de un individuo que comparte con el paciente
un haplotipo del complejo mayor de histocompatibilidad, tal como un
haplotipo del HLA-A2.
Preferentemente, las células dendríticas, una
vez extraídas a partir del paciente, se ponen en cultivo en un
medio de cultivo apropiado para el cultivo de células de mamífero,
tales como el medio HL1 (Bio Whittaker), llegado el caso adicionado
con glutamina, y eventualmente también con uno o varios
antibióticos, tal como la estreptomicina, y se realiza el cultivo a
37ºC en una incubadora de atmósfera húmeda y a 5% (V/V) de
CO_{2}.
Las células dendríticas en cultivo se incuban a
continuación con una cantidad elegida de la proteína E7 mutada,
preferentemente una cantidad comprendida entre 5 y 50
\mug/ml.
Preferentemente, se incuban las células
dendríticas con la proteína E7 mutada, a razón de una cantidad de
proteína E7 mutada por 10^{6} células dendríticas comprendida
entre 1 y 50 \mug.
Preferentemente, se administra al paciente a
tratar una cantidad de células dendríticas tratadas con una
proteína E7 mutada según la invención comprendida entre 10^{1} y
500 x 10^{6} células.
Ventajosamente, se realiza una única
administración al paciente, mediante inyección por vía parenteral,
de las células dendríticas tratadas por la proteína E7 mutada.
También se puede realizar, si fuese necesario, múltiples inyecciones
al paciente, en función de la intensidad de la respuesta
inmunitaria anti-E7 que se provoca, por ejemplo por
una administración mensual, bimestral, trimestral o
bi-anual, de las células dendríticas tratadas.
La invención se ilustra además, sin por ello
estar limitada, mediante las figuras y los ejemplos siguientes.
Figura 1, un gráfico de los títulos de
anticuerpos IgG anti-E7 séricos de ratón, antes y
después de la inmunización con una preparación
E7\Delta21-26;
Figura 2, un gráfico del porcentaje de
neutralización de los anticuerpos IgG anti-E7
séricos de ratón, antes y después de la inmunización con una
preparación E7\Delta21-26;
Figura 3, un gráfico del índice de proliferación
Ip de esplenocitos de ratones no sometidos a ningún tratamiento
previo y de ratones inmunizados con una preparación
E7\Delta21-26, cultivados en presencia de la
proteína E7 nativa;
Figura 4, un gráfico del índice de
IFN-\gamma de esplenocitos de ratones no sometidos
a ningún tratamiento previo y de ratones inmunizados con una
preparación E7\Delta21-26, cultivados en
presencia de la proteína E7 nativa;
Figuras 5 a 8, unos gráficos del título de IgG
anti-E7 sérico de ratón y unos porcentajes de
neutralización de los anticuerpos IgG anti-E7
séricos de ratón, antes y después de la inmunización con una
preparación E7\Delta21-26;
\newpage
Figuras 9 y 10, unos gráficos del título de IgG
anti-E7 sérico de ratón y unos porcentajes de
neutralización de los anticuerpos IgG anti-E7
séricos de ratón, antes y después de la inmunización con una
preparación E7\Delta21-26;
Figura 11, un gráfico que representa el índice
de IgA presente en las secreciones vaginales de ratón, antes y
después de la inmunización con una preparación
E7\Delta21-26;
Figuras 12 y 13, unos gráficos del título de IgG
anti-E7 sérico de ratón y unos porcentajes de
neutralización de los anticuerpos IgG anti-E7
séricos de ratón, antes y después de la inmunización con una
preparación E7\Delta21-26;
Figura 14, un gráfico que representa el índice
de IgA presente en las secreciones vaginales de ratón, antes y
después de la inmunización con una preparación
E7\Delta21-26;
Figura 15, un gráfico del crecimiento tumoral de
las células C3 inyectadas a unos ratones inmunizados o no con una
preparación E7\Delta21-26;
Figura 16, unos gráficos que representan el
desarrollo de los tumores C3 en unos ratones que han recibido 7 x
10^{3} células C3 que expresan E7 de HPV-16.
Figura 16A: ratones de control; Figura 16B: ratones tratados con
E7\Delta21-26. En las abscisas, el número de días
después de la inyección de las células C3. En las ordenadas, la
superficie de los tumores.
Figura 17, unos gráficos que representan el
desarrollo de los tumores C3 en unos ratones que han recibido 9 x
10^{3} células C3 que expresan E7 de HPV-16.
Figura 18, gráfico que representa el nivel de
reacción linfocitaria mixta, medida mediante el nivel de
proliferación de las células mononucleadas efectoras estimuladas por
las células dendríticas de control (rombo vacío), pretratadas con
la proteína E7 nativa (círculo lleno) o pretratadas con la proteína
E7\Delta21-26 (cuadrado rayado). En las
ordenadas, la proliferación de las células mononucleadas efectoras,
visualizadas mediante la incorporación de [^{3}H]timidina.
En las abscisas, la relación entre el número de células
estimulantes (células dendríticas) y el número de células efectoras
(células T).
Ejemplo
1.1
Se ha estudiado la actividad inmunógena (humoral
y celular) de la preparación E7\Delta21-26 en los
ratones C57BL/6(H-2^{b}) hembras, de 6
semanas de edad, compradas en Charles River, en presencia de ACF y
de AIF.
En el día 0, un grupo de 6 ratones recibe una
inyección de 0,2 ml (50 \mug) de una emulsión en ACF por vía
intramuscular. Se aplica una inyección de recuerdo de 5 \mug en
AIF el D21 y D60.
Se efectúa una toma de sangre a nivel
retro-orbital en cada ratón antes de la primera
inyección el D2 y 12 días después de la última inmunización.
- -
- 8 ratones de control reciben las mismas preparaciones sin inmunógeno.
- -
- 3 ratones reciben 100 \mug de la preparación, y se estudia la ausencia de síntomas de la enfermedad durante los 7 días después de la inyección.
Se provocan los ratones con unas células C3, 12
días después de la última inmunización. Las células C3 son unas
células embrionarias de origen C57BL/6, transformadas con el genoma
HPV-16 completo y el oncogén ras (Feltkamp, M.C.,
H.L. Smits, M.P. Vierboom, R.P. Minnaar, B.M. de Jongh, J.W.
Drijfhout, J. ter Schegget, C.J. Melief, y W.M. Kast. 1993.
Vaccination with cytotoxic T lymphocyte
epitope-containing peptide protects against a tumor
induced by human papillomavirus type 16-transformed
cells. Eur. J. Immunol. 23:2242-2249.). Se cultivan
en un medio DMEM (Bio-Whittaker) adicionado con 10%
de FCS, 50 U/ml de penicilina, 50 \mug/ml de estreptomicina y 250
ng/ml de fungizona a 37ºC en una atmósfera húmeda que contiene 7% de
CO_{2}. Las células destinadas a ser inyectadas a los ratones se
lavan en un medio sin suero después de haber sido despegadas del
plástico con la ayuda de tripsina.
La ausencia de toxicidad de la preparación se
mide mediante la ausencia de señales clínicas: (comportamiento,
pelos, peso) y mediante el examen anatómico después de la
autopsia.
Los ratones inmunizados mediante la preparación
E7\Delta21-26, en presencia de ACF y de AIF, no
presentan ninguna señal clínica y ninguna lesión anatómica.
Ninguno de los 3 ratones inmunizados con 100
\mug de la preparación manifiesta síntomas de enfermedad durante
los 7 días tras la inyección.
La reacción inmunitaria se mide por:
Se mide la presencia en el suero de anticuerpos
de tipo IgG dirigidos contra la proteína recombinante E7 nativa
mediante ELISA y se expresa en título (inversa de la dilución que
da una densidad óptica superior a 0,3).
Figura
1
Los ratones inmunizados con la preparación de
E7\Delta21-26, en presencia de ACF y de AIF,
presentan unos títulos de anticuerpos de tipo IgG
anti-E7 muy importantes.
La actividad neutralizante de estos anticuerpos
se ha medido con la ayuda del ensayo de inmunosupresión siguiente.
Se incuba una dilución al 1/50 del suero extraído el D2 y D72
durante 2 horas con 50 ng/ml de E7 nativo. Estas diluciones se
depositan a continuación sobre unos macrófagos humanos,
pre-tratados mediante IFN-\gamma
durante 16 horas. Después de 24 horas de cultivo, se recuperan los
sobrenadantes de cultivo y se mide la cantidad de
TNF-\alpha producida mediante un ensayo ELISA, el
DuoSet DTA 50 (R&D). Los sueros neutralizantes impiden que la
proteína E7 induzca la expresión de TNF-\alpha,
mientras que los sueros no neutralizantes permiten la síntesis de
esta citoquina.
Los resultados se indican en % de
neutralización.
Figura
2
Los anticuerpos inducidos por la preparación
E7\Delta21-26 en presencia de ACF y a
continuación de AIF tienen un poder neutralizante muy
importante.
Las células esplénicas de los ratones
inmunizados y de los ratones de control se aíslan y después se
cultivan en unos pocillos de fondo redondo de una placa de
micro-cultivo en una cantidad de 100.000
células/pocillo en presencia de E7 nativo. El cultivo celular
continúa a 37ºC en atmósfera húmeda cargada al 5% de CO_{2}
durante 6 días. 18 horas antes del final de la incubación, se
añaden 0,5 \muCi de timidina tritiada/pocillo. La intensidad de
la respuesta inmunitaria es proporcional al índice de proliferación
Ip.
Ip = cpm
(golpes por minuto) para el antígeno dado/cpm de
control
Figura
3
Las células esplénicas de los ratones
inmunizados con la preparación E7\Delta21-26, en
presencia de ACF y de AIF, proliferan, cuando se activan in
vitro, con la proteína E7 nativa.
Se determina la presencia de IFN gamma en los
sobrenadantes de cultivo de las células esplénicas cultivadas en
presencia de 10 \mug/ml de E7 nativo después de 72 horas de
cultivo con la ayuda de un ensayo ELISA (LO-IMEX,
Bélgica) tal como se ha descrito anteriormente (De Smedt, T., B.
Pajak, E. Muraille, L. Lespagnard, E. Heinen, P. De Baetselier, J.
Urbain, O. Leo, y M. Moser. 1996. Regulation of dendritic cell
numbers and maturation by lipopolysaccharide in vivo. J.
Exp. Med. 184:1413-1424.). Los resultados se
expresan en UI/ml.
Figura
4
Las células esplénicas de ratones inmunizados
con la preparación E7\Delta21-26 en presencia de
ACF y después de AIF producen una cantidad importante de IFN gamma
cuando se activan in vitro con la proteína E7 nativa.
\newpage
Ejemplo
1.2
Se ha estudiado la actividad inmunogénica
(humoral) de la preparación E7\Delta21-26 en los
ratones C57BL/6 (H-2^{b}) hembras, de 6 semanas de
edad, comprados en Charles River, en presencia de AIF.
En el día 0, un grupo de 6 ratones recibe una
inyección de 0,2 ml (50 \mug) de una emulsión en AIF en presencia
de 1 \mug de GM-CSF murino y 1,5 \mug de
IL-2 murino por vía intramuscular. Se aplica una
inyección de recuerdo de 5 \mug en AIF el D21 y D60.
Se efectúa una toma de sangre a nivel
retro-orbital sobre cada ratón antes de la primera
inyección el D2 y 12 días después de la última inmunización.
- -
- 6 ratones de control reciben las mismas preparaciones sin inmunógeno.
- -
- 3 ratones reciben 100 \mug de la preparación, y se estudia la ausencia de síntomas de enfermedad durante los 7 días tras la inyección.
La ausencia de toxicidad de la preparación se
mide mediante la ausencia de señales clínicas: (comportamiento,
pelos, peso) y mediante el examen anatómico después de la
autopsia.
Los ratones inmunizados mediante la preparación
E7\Delta21-26 en presencia de AIF no presentan
ninguna señal clínica y ninguna lesión anatómica.
Ninguno de los 3 ratones inmunizados con 100
\mug de la preparación manifiesta síntomas de enfermedad durante
los 7 días después de la inyección.
La reacción inmunitaria se mide mediante:
Se mide la presencia en el suero de anticuerpos
de tipo IgG dirigidos contra la proteína recombinante E7 nativa
mediante ELISA y se expresa en título (inversa de la dilución que
da una densidad óptica superior a 0,3).
Figura
5
Los ratones inmunizados con la preparación de
E7\Delta21-26, en presencia de AIF presentan unos
títulos de anticuerpos IgG anti-E7 muy
importantes.
La actividad neutralizante de estos anticuerpos
se ha medido con la ayuda del ensayo de inmunosupresión siguiente.
Se incuba una dilución al 1/50 del suero extraído el D2 y D72
durante 2 horas con 50 ng/ml de E7 nativo. Estas diluciones se
depositan a continuación sobre unos macrófagos humanos,
pre-tratados mediante IFN-\gamma
durante 16 horas. Después de 24 horas de cultivo, se recuperan los
sobrenadantes de cultivo y se mide la cantidad de
TNF-\alpha producida mediante un ensayo ELISA, el
DuoSet DTA 50 (R&D). Los sueros neutralizantes impiden que la
proteína E7 induzca la expresión de TNF-\alpha,
mientras que los sueros no neutralizantes permiten la síntesis de
esta citoquina.
Los resultados se indican en % de
neutralización.
Figura
6
Los anticuerpos inducidos por la preparación
E7\Delta21-26 en presencia de AIF tienen un poder
neutralizante muy importante.
Ejemplo
1.3
Se ha estudiado la actividad inmunogénica
(humoral) de la preparación E7\Delta21-26
intercalada en unas nanopartículas de quitosano en los ratones
C57BL/6 (H-2^{b}) hembras, de 6 semanas de edad,
comprados en Charles River, en presencia de AIF.
En el día 0, un grupo de 6 ratones recibe una
inyección de 0,2 ml (50 \mug) de una emulsión en AIF en presencia
de 1 \mug de GM-CSF murino y 1,5 \mug de
IL-2 murino por vía intramuscular. Se aplica una
inyección de recuerdo de 5\mug en AIF el D21 y D60.
Se efectúa una toma de sangre a nivel
retro-orbital sobre cada ratón antes de la primera
inyección el D2 y 12 días después de la última inmunización.
- -
- 6 ratones de control reciben las mismas preparaciones sin inmunógeno.
- -
- 3 ratones reciben 100 \mug de la preparación, y se estudia la ausencia de síntomas de enfermedad durante los 7 días tras la inyección.
La ausencia de toxicidad de la preparación se
mide mediante la ausencia de señales clínicas: (comportamiento,
pelos, peso) y mediante el examen anatómico después de la
autopsia.
Los ratones inmunizados mediante la preparación
E7\Delta21-26 intercalada en unas nanopartículas
de quitosano en presencia de AIF no presentan ninguna señal clínica
y ninguna lesión anatómica.
Ninguno de los 3 ratones inmunizados con 100
\mug de la preparación manifiesta síntomas de enfermedad durante
los 7 días después de la inyección.
La reacción inmunitaria se mide mediante:
Se mide la presencia en el suero de anticuerpos
de tipo IgG dirigidos contra la proteína recombinante E7 nativa
mediante ELISA y se expresa en título (inversa de la dilución que
da una densidad óptica superior a 0,3).
Figura
7
Los ratones inmunizados con la preparación de
E7\Delta21-26 intercalada en unas nanopartículas
de quitosano en presencia de AIF presentan unos títulos de
anticuerpos IgG anti-E7 muy importantes.
La actividad neutralizante de estos anticuerpos
se ha medido con la ayuda del ensayo de inmunosupresión siguiente.
Se incuba una dilución al 1/50 del suero extraído el D2 y D72
durante 2 horas con 50 ng/ml de E7 nativo. Estas diluciones se
depositan a continuación sobre unos macrófagos humanos,
pre-tratados mediante IFN-\gamma
durante 16 horas. Después de 24 horas de cultivo, se recuperan los
sobrenadantes de cultivo y se mide la cantidad de
TNF-\alpha producida mediante un ensayo ELISA, el
DuoSet DTA 50 (R&D). Los sueros neutralizantes impiden que la
proteína E7 induzca la expresión de TNF-\alpha,
mientras que los sueros no neutralizantes permiten la síntesis de
esta citoquina. Los resultados se indican en % de
neutralización.
Figura
8
Los anticuerpos inducidos por la preparación
E7\Delta21-26 intercalada en una nanopartículas
de quitosano en presencia de AIF tienen un poder neutralizante muy
importante.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2.1
Se ha estudiado la actividad inmunogénica
(humoral) de la preparación E7\Delta21-26 en los
ratones C57BL/6 (H-2^{b}) hembras, de 6 semanas de
edad, comprados en Charles River, en presencia de IMS 1113
(SEPPIC).
En el día 0, un grupo de 6 ratones recibe una
inyección de 0,2 ml que contiene 50 \mug de
E7\Delta21-26 en presencia de IMS 1113 con 1
\mug de GM-CSF murino y 1,5 \mug de
IL-2 murino por vía intramuscular, así como 20
\mul que contienen 20 \mug de esta misma preparación por vía
intranasal.
El día 7, 14 y 21, estos ratones reciben por vía
intranasal 20 \mul, es decir, 20 \mug de la preparación en IMS
1113.
El día 60, estos ratones reciben una inyección
de 0,2 ml que contiene 5 \mug de la preparación en IMS 1113 y 20
\mul que contienen 20 \mug de esta misma preparación por vía
intranasal.
Se efectúa una toma de sangre a nivel
retro-orbital así como una extracción de las
secreciones vaginales sobre cada ratón antes de la primera inyección
el D2 y 12 días después de la última inmunización.
- -
- 6 ratones de control reciben las mismas preparaciones sin inmunógeno.
- -
- 3 ratones reciben 100 \mug de la preparación y se estudia la ausencia de síntomas de enfermedad durante los 7 días tras la inyección.
La ausencia de toxicidad de la preparación se
mide mediante la ausencia de señales clínicas: (comportamiento,
pelos, peso) y mediante el examen anatómico después de la
autopsia.
Los ratones inmunizados mediante la preparación
E7\Delta21-26 en presencia de IMS 1113 no
presentan ninguna señal clínica y ninguna lesión anatómica.
Ninguno de los 3 ratones inmunizados con 100
\mug de la preparación manifiesta unos síntomas de enfermedad
durante los 7 días después de la inyección.
La reacción inmunitaria se mide mediante:
Se mide la presencia en el suero de anticuerpos
de tipo IgG dirigidos contra la proteína recombinante E7 nativa
mediante ELISA y se expresa en título (inversa de la dilución que
da una densidad óptica superior a 0,3).
Figura
9
Los ratones inmunizados con la preparación de
E7\Delta21-26 en presencia de IMS 1113 presentan
unos títulos de anticuerpos IgG anti-E7 muy
importantes.
La actividad neutralizante de estos anticuerpos
se ha medido con la ayuda del ensayo de inmunosupresión siguiente.
Se incuba una dilución al 1/50 del suero extraído el D2 y D72
durante 2 horas con 50 ng/ml de E7 nativo. Estas diluciones se
depositan a continuación sobre unos macrófagos humanos,
pre-tratados mediante IFN-\gamma
durante 16 horas. Después de 24 horas de cultivo, se recuperan los
sobrenadantes de cultivo y se mide la cantidad de
TNF-\alpha producida mediante un ensayo ELISA, el
DuoSet DTA 50 (R&D). Los sueros neutralizantes impiden que la
proteína E7 induzca la expresión de TNF-\alpha,
mientras que los sueros no neutralizantes permiten la síntesis de
esta citoquina.
Los resultados se indican en % de
neutralización.
Figura
10
Se mide la presencia en el suero de anticuerpos
de tipo IgA dirigidos contra la proteína recombinante E7 nativa
mediante ELISA y se expresa en título (inversa de la dilución que
da una densidad óptica superior a 0,3).
Figura
11
Los ratones inmunizados con la preparación de
E7\Delta21-26 en presencia de IMS 1113 presentan
unos títulos de anticuerpos de tipo IgA anti-E7 muy
importantes.
Ejemplo
2.2
Se ha estudiado la actividad inmunogénica
(humoral) de la preparación E7\Delta21-26
intercalada en quitosano en los ratones C57BL/6
(H-2^{b}) hembras, de 6 semanas de edad,
comprados en Charles River.
En el día 0, un grupo de 6 ratones recibe una
inyección de 0,2 ml que contiene 50 \mug de
E7\Delta21-26 intercalada en quitosano en
presencia de AIF con 1 \mug de GM-CSF murino y
1,5 \mug de IL-2 murino por vía intramuscular, así
como 20 \mul que contienen 20 \mug de esta misma preparación en
presencia de PBS adicionado con 1 \mug de GM-CSF
murino y 1,5 \mug de IL-2 murino por vía
intranasal.
El día 7, 14 y 21, estos ratones reciben por vía
intranasal 20 \mul, es decir, 20 \mug de
E7\Delta21-26 intercalada en quitosano en
presencia de PBS.
El día 60, estos ratones reciben una inyección
de 0,2 ml que contiene 5 \mug de la preparación en AIF y 20
\mul que contiene 20 \mug de esta misma preparación en presencia
de PBS por vía intranasal.
Se efectúa una toma de sangre a nivel
retro-orbital así como una extracción de las
secreciones vaginales sobre cada ratón antes de la primera inyección
el D2 y 12 días después de la última inmunización.
- -
- 6 ratones de control reciben las mismas preparaciones sin inmunógeno.
- -
- 3 ratones reciben 100 \mug de la preparación, y se estudia la ausencia de síntomas de enfermedad durante los 7 días tras la inyección.
La ausencia de toxicidad de la preparación se
mide mediante la ausencia de señales clínicas: (comportamiento,
pelos, peso) y mediante el examen anatómico después de la
autopsia.
Los ratones inmunizados mediante la preparación
E7\Delta21-26 intercalada en quitosano no
presentan ninguna señal clínica y ninguna lesión anatómica.
Ninguno de los 3 ratones inmunizados con 100
\mug de la preparación manifiesta síntomas de enfermedad durante
los 7 días después de la inyección.
La reacción inmunitaria se mide mediante:
Se mide la presencia en el suero de anticuerpos
de tipo IgG dirigidos contra la proteína recombinante E7 nativa
mediante ELISA y se expresa en título (inversa de la dilución que
da una densidad óptica superior a 0,3).
Figura
12
Los ratones inmunizados con la preparación de
E7\Delta21-26 intercalada en quitosano presentan
unos títulos de anticuerpos IgG anti-E7 muy
importantes.
La actividad neutralizante de estos anticuerpos
se ha medido con la ayuda del ensayo de inmunosupresión siguiente.
Se incuba una dilución al 1/50 del suero extraído D2 y D72 durante
2 horas con 50 ng/ml de E7 nativo. Estas diluciones se depositan a
continuación sobre unos macrófagos humanos,
pre-tratados mediante IFN-\gamma
durante 16 horas. Después de 24 horas de cultivo, se recuperan los
sobrenadantes de cultivo y se mide la cantidad de
TNF-\alpha producida mediante un ensayo ELISA, el
DuoSet DTA 50 (R&D). Los sueros neutralizantes impiden que la
proteína E7 induzca la expresión de TNF-\alpha,
mientras que los sueros no neutralizantes permiten la síntesis de
esta citoquina.
Los resultados se indican en % de
neutralización.
Figura
13
Se mide la presencia en el suero de anticuerpos
de tipo IgA dirigidos contra la proteína recombinante E7 nativa
mediante ELISA y se expresa en título (inversa de la dilución que
da una densidad óptica superior a 0,3).
Figura
14
Los ratones inmunizados con la preparación de
E7\Delta21-26 intercalada en quitosano presentan
unos títulos de anticuerpos de tipo IgA anti-E7 muy
importantes.
Ejemplo
3.1
Se ha ensayado la medición de una respuesta
antitumoral protectora en los ratones inmunizados con la
preparación de E7\Delta21-26 en presencia de ACF y
después de AIF (ejemplo 1.1) de la siguiente manera.
12 días después de la última inmunización, se
han inyectado los ratones con 500.000 células C3, subcutáneamente
(s-c) en el costado. Las células C3 son unas
células embrionarias de origen C57BL/6, transformadas con el genoma
HPV-16 completo y el oncogén ras. Se evalúa el
crecimiento tumoral 1 vez por semana mediante la medición de la
superficie del tumor.
Figura
15
Se ha desarrollado un tumor en todos los ratones
de control tratados únicamente con el adyuvante. Entre los 6
ratones inmunizados con la preparación
E7\Delta21-26 en presencia de ACF y después de
AIF:
- -
- 4 ratones no han desarrollado ningún tumor
- -
- en 1 ratón se ha desarrollado un tumor y después se ha estabilizado
- -
- en 1 ratón se ha desarrollado un tumor
La proteína E76.21-26 genera en
el ratón, en presencia de ACF y de AIF, una respuesta inmune
específica protectora contra un tumor inducido por el papilomavirus
humano de tipo 16.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha ensayado la capacidad de la preparación
E7\Delta21-26 en presencia de AIF para inducir el
rechazo de tumores C3 pre-implantados en unos
ratones C57BL/6 (H-2^{b}) de la manera descrita a
continuación.
Ejemplo
4.1
Se han inyectado unos ratones (grupos de 8) en
s.c. en el costado con un número creciente de células C3: 0;
5,10^{2}; 5,10^{3}; 5,10^{4} y 5,10^{5}. Se evalúa el
crecimiento tumoral 1 vez por semana mediante la medición de la
superficie del tumor.
Los ratones que han recibido 5.10^{5} células
han desarrollado todos un tumor 12 días después de la inyección de
células (8/8). Entre los ratones que han recibido 5.10^{4}
células, 4 ratones/8 han desarrollado un tumor 21 días después de
la inyección de las células y 4 ratones/8, 28 días después de la
inyección.
Entre los ratones que han recibido 5.10^{3}
células, 1 ratón/8 ha desarrollado un tumor 35 días después de la
inyección de las células, 3 ratones/8, 42 a 60 días después de la
inyección y los otros 4 ratones no presentan todavía ningún
tumor.
Entre los ratones que han recibido 5.10^{2}
células, 1 ratón/8 ha desarrollado un tumor 35 días después de la
inyección de las células, los otros 7 ratones no han desarrollado
todavía ningún tumor.
Ejemplo
4.2
Se han inyectado en primer lugar unos ratones
s.c. en el costado con 7.000 ó 9.000 células C3 (día 0). Los días
2, 9, 16 y 23, los ratones han recibido una inyección intramuscular
de 10 \mug de la preparación E7\Delta21-26 en
AIF y 1 \mug de GM-CSF y de
IL2-murino. En los días 9, 16, 23 y 60 los ratones
han recibido una inyección intramuscular de 10 \mug de la
preparación E7\Delta21-26 en AIF.
Se ha medido el tamaño de los tumores 2 veces
por semana tal como se ha descrito anteriormente en el ejemplo
4.1.
Las figuras 16 y 17 presentan los resultados
obtenidos.
Los ratones de control desarrollan todos unos
tumores (8/8) 10 a 20 días después de la inyección de las células
C3 mientras que el 80% (7.000 células inyectadas - Figura 16) y el
75% (9.000 células inyectadas - Figura 17) de los ratones
inmunizados no desarrollan ninguno.
\vskip1.000000\baselineskip
Una reacción linfocitaria mixta autóloga
unidireccional consiste en co-cultivar unas células
mononucleadas de un individuo (células efectoras o respondedoras)
con unas células dendríticas (células estimulantes) portadoras de
antígenos (TSA). Las células efectoras, que poseen unos receptores
específicos para el antígeno transportado por las células
estimulantes, proliferan. La proliferación se mide mediante el
ensayo de incorporación a la timidina tritiada.
Las células dendríticas proceden de la
diferenciación de monocitos obtenidos por elutriación a partir de
los PBMC de la sangre periférica de un donante (Sallusto et
al., Journal of Experimental Medicine, 1994, 179,
1109-18). Se han cultivado unos monocitos, a
2,5.10^{6} células/ml en unas bolsas de teflón en RPMI 1640
enriquecido con SAB (10%), en GMC-SF (50 ng/ml) y
en IL4 (1.000 unidades/ml). Después de 6 días de cultivo, estas
células presentan el fenotipo de células dendríticas
diferenciadas.
Estas células dendríticas así obtenidas se
tratan después con una dosis de 3 \mug/ml de E7 nativo, o de
E7\Delta21-26 y/o del medio de cultivo, y después
se co-cultivan en placas de 96 pocillos de fondo
redondo con los PBMC del mismo donante en las relaciones 1/10; 3/10
y 10/10. 18 horas antes del final de la reacción, se añaden 0,5
\muCi de timidina tritiada/pocillo. Los resultados, indicados en
golpes por minuto, se presentan en la Figura 18.
Cuando las células dendríticas se
pre-incuban con la proteína E7 nativa, y después se
cultivan con las células respondedoras, no se observa ninguna
proliferación (a causa de la actividad inmunosupresora de la
proteína E7 nativa). Cuando las células dendríticas se
pre-incuban con la proteína E7 mutada (desprovista
de la actividad inmunosupresora de la proteína nativa), se observa
una proliferación de las estimulantes.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha medido la ausencia de actividad
inmunosupresora in vitro con la ayuda de un ensayo de
proliferación celular. Se aíslan unas células mononucleadas de la
sangre periférica humana y después se cultivan en unos pocillos de
fondo redondo a razón de 150.000 células/pocillo en presencia de 3
\mug/ml de diferentes proteínas E7 nativas y de su mutante
respectivo o en presencia de sobrenadante (SN) de cultivo de vacuna
E7 HPV 16 (\Delta21-25), donación de MP Kieny,
Transgéne, y en presencia de antígeno de recuerdo (PPD + TT). El
cultivo celular continúa a 37ºC en atmósfera húmeda cargada al 5% de
CO_{2} durante 6 días. La proliferación celular se mide mediante
el ensayo de incorporación de timidina tritiada. Los resultados,
indicados en golpes por minuto, se resumen en la Tabla 2
siguiente.
Los resultados obtenidos demuestran que los
mutantes han sido detoxificados (pérdida de la actividad
inmunosupresora de la proteína nativa).
\bullet AUSUBEL F M, Brent R. Kingstone Re,
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E. Muraille, L. Lespagnard, E. Heinen, P. De
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maturation by lipopolysaccharide in vivo. J. Exp. Med.
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<110> NEOVACS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Composición inmunógena o vacunal no
inmunosupresora, que comprende una proteína E7 mutada del virus
HPV-16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> NEOVACS -
N729-PCT
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<150> FR0205173
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
24-04-2002
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 92
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial:
E7-delta-21-26
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 276
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial:
E7-delta-21-26
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<400> 2
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<210> 3
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<212> PRT
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<213> Virus del papiloma humano tipo
16
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<400> 3
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<210> 4
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<212> ADN
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<213> Virus del papiloma humano tipo
16
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<400> 4
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Claims (23)
1. Composición vacunal desprovista de propiedad
inmunosupresora, preventiva o curativa frente a un cáncer provocado
por una infección por papilomavirus, caracterizada porque
comprende, a título de principio activo, una proteína E7 mutada no
inmunosupresora que comprende la secuencia de aminoácidos que
consiste, desde el extremo N-terminal hacia el
extremo C-terminal, en:
- - (i)
- la secuencia de aminoácidos 1-19 de la secuencia SEC ID nº 3;
- - (ii)
- una secuencia de aminoácidos que posee (a) la sustitución de por lo menos un aminoácido con relación a la secuencia correspondiente de aminoácidos 20-29 de la secuencia SEC ID nº 3 o (b) la supresión de por lo menos cuatro aminoácidos consecutivos, con relación a la secuencia correspondiente de aminoácidos 20-29 de la secuencia SEC ID nº 3; y
- - (iii)
- la secuencia de aminoácidos 30-98 de la secuencia SEC ID nº 3,
en asociación con uno o varios adyuvantes de la
inmunidad fisiológicamente compatibles.
2. Composición vacunal según la reivindicación
1, en la que la proteína E7 mutada se caracteriza porque la
región (ii) de aminoácidos de dicha proteína E7 mutada comprende
por lo menos dos sustituciones de aminoácidos con relación a los
aminoácidos correspondientes de la región peptídica
20-29 de la secuencia SEC ID nº 3 de la proteína
nativa.
3. Composición vacunal según la reivindicación
2, en la que la proteína E7 mutada se caracteriza porque la
región (ii) de aminoácidos de dicha proteína E7 mutada comprende
tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez sustituciones
de aminoácidos con relación a los aminoácidos correspondientes de
la región peptídica 20-29 de la secuencia SEC ID nº
3 de la proteína nativa.
4. Composición vacunal según la reivindicación
2, en la que la proteína E7 mutada se caracteriza porque los
residuos Cys en posición 24 y Glu en posición 26 han sido
sustituidos por un residuo de aminoácido distinto.
5. Composición vacunal según la reivindicación
4, en la que la proteína E7 mutada es la proteína E7
caracterizada por CYS24GLY y GLU26GLN.
6. Composición vacunal según la reivindicación
4, en la que la proteína E7 mutada es la proteína E7
caracterizada por CYS24SER y GLU26GLN.
7. Composición vacunal según la reivindicación
1, en la que la proteína E7 mutada se caracteriza porque la
región (ii) de aminoácidos de dicha proteína E7 mutada comprende la
supresión de cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez aminoácidos
consecutivos, con relación a la secuencia correspondiente de
aminoácidos 20-29 de la secuencia SEC ID nº 3.
8. Composición vacunal según la reivindicación
7, en la que la proteína E7 mutada se caracteriza porque la
región (ii) de aminoácidos de dicha proteína E7 mutada comprende la
supresión de seis aminoácidos consecutivos, con relación a la
secuencia correspondiente de aminoácidos 20-29 de
la secuencia SEC ID nº 3.
9. Composición según la reivindicación 8, en la
que la proteína E7 mutada consiste en la proteína E7 mutada cuya
secuencia de aminoácidos comprende la supresión de los aminoácidos
21 a 26 correspondientes de la secuencia SEC ID nº 3 de la proteína
E7 nativa.
10. Composición vacunal según la reivindicación
7, en la que la proteína E7 mutada se caracteriza porque la
región (ii) de aminoácidos de dicha proteína E7 mutada comprende la
supresión de cinco aminoácidos consecutivos, con relación a la
secuencia correspondiente de aminoácidos 20-29 de
la secuencia SEC ID nº 3.
11. Composición vacunal según la reivindicación
10, en la que la proteína E7 mutada consiste en la proteína E7
mutada cuya secuencia de aminoácidos comprende la supresión de los
aminoácidos 21 a 25 correspondientes de la secuencia SEC ID nº 3 de
la proteína E7 nativa.
12. Composición vacunal según una de las
reivindicaciones 1 a 11, caracterizada porque comprende por
lo menos un adyuvante susceptible de orientar preferentemente la
respuesta inmunitaria hacia la producción de anticuerpos que
neutralizan la actividad inmunosupresora de la proteína E7
nativa.
13. Composición vacunal según la reivindicación
12, caracterizada porque comprende por lo menos un adyuvante
susceptible de orientar preferentemente la respuesta inmunitaria
hacia la producción de anticuerpos de isotipo IgA.
14. Composición vacunal según la reivindicación
12, caracterizada porque comprende por lo menos un adyuvante
susceptible de orientar preferentemente la respuesta inmunitaria
hacia la producción de anticuerpos de isotipo IgG.
15. Composición vacunal según la reivindicación
12, caracterizada porque comprende la combinación (i) de un
adyuvante susceptible de orientar preferentemente la respuesta
inmunitaria hacia la producción de anticuerpos de isotipo IgA y (ii)
de un adyuvante susceptible de orientar preferentemente la
respuesta inmunitaria hacia la producción de anticuerpos de isotipo
IgG.
16. Composición vacunal según la reivindicación
15, caracterizada porque comprende por lo menos un adyuvante
de la inmunidad susceptible de inducir una respuesta inmunitaria
humoral o celular.
17. Composición vacunal según la reivindicación
7, caracterizada porque la respuesta celular se caracteriza
en particular por la proliferación de linfocitos que expresan el
antígeno CD8 y que reconocen específicamente la proteína E7
salvaje.
18. Composición inmunógena que induce una
respuesta inmunitaria contra la proteína E7 nativa del
papilomavirus HPV-16, sin inducir simultáneamente
una inmunosupresión, comprendiendo dicha composición, a título de
principio activo, una proteína E7 mutada no inmunosupresora cuya
secuencia de aminoácidos consiste, desde el extremo
N-terminal hacia el extremo
C-terminal, en:
- - (i)
- la secuencia de aminoácidos 1-19 de la secuencia SEC ID nº 3;
- - (ii)
- una secuencia de aminoácidos que posee (a) la sustitución de por lo menos un aminoácido con relación a la secuencia correspondiente de aminoácidos 20-29 de la secuencia SEC ID nº 3 o (b) la supresión de por lo menos cuatro aminoácidos consecutivos con relación a la secuencia correspondiente de aminoácidos 20-29 de la secuencia SEC ID nº 3; y
- - (iii)
- la secuencia de aminoácidos 30-98 de la secuencia SEC ID nº 3,
en asociación con uno o varios excipientes o
adyuvantes de la inmunidad fisiológicamente compatibles.
19. Composición vacunal preventiva o curativa de
un cáncer provocado por una infección por HPV-16,
caracterizada porque comprende una cantidad inmunológicamente
eficaz de un ácido nucleico que codifica una proteína E7 mutada
según una de las reivindicaciones 1 a 11, de un casete de expresión
que comprende dicho ácido nucleico o de un vector recombinante que
comprende dicho casete de expresión.
20. Uso de una proteína E7 mutada no
inmunosupresora según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11,
para la preparación de una composición inmunógena o de una
composición vacunal no inmunosupresora y que induce la producción de
anticuerpos que neutralizan la actividad inmunosupresora de la
proteína E7 nativa.
21. Anticuerpos neutralizantes dirigidos contra
el producto de expresión del ADN que codifica la proteína E7 mutada
según una de las reivindicaciones 1 a 11.
22. Composición para la vacunación pasiva contra
una infección por HPV-16 que contiene unos
anticuerpos según la reivindicación 21.
23. Composición vacunal desprovista de propiedad
inmunosupresora, preventiva o curativa para un cáncer provocado por
una infección por papilomavirus, caracterizada porque
comprende, como principio activo, una cantidad apropiada de células
dendríticas autólogas o alogénicas frente al individuo a tratar,
habiendo sido dichas células dendríticas autólogas incubadas con
una proteína E7 mutada según una de las reivindicaciones 1 a 11, y
convertidas así en apropiadas para presentar dicha proteína E7
mutada a las células T.
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