ES2163795T5 - Composicion farmaceutica contra los tumores e infecciones por papilomavirus. - Google Patents
Composicion farmaceutica contra los tumores e infecciones por papilomavirus.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UNA COMPOSICION FARMACEUTICA DESTINADA AL TRATAMIENTO O PREVENCION DE UNA INFECCION O UN TUMOR POR PAPILOMAVIRUS QUE COMPRENDE, COMO AGENTES TERAPEUTICOS, UN POLIPEPTIDO OIGINARIO DE UNA REGION PRECOZ Y UN POLIPEPTIDO OIGINARIO DE UNA REGION TARDIA DE UN PAPILOMAVIRUS, EVENTUALMENTE ASOCIADOS A UN POLIPEPTIDO CON ACTIVIDAD INMUNOESTIMULANTE, O UN POLIPEPTIDO OIGINARIO DE UNA REGION PRECOZ O TARDIA DE UN PAPILOMAVIRUS Y UN POLIPEPTIDO CON ACTIVIDAD INMUNOESTIMULANTE O, DE FORMA ALTERNATIVA, UN VECTOR RECOMBINANTE EN EL QUE SE HAN INSERTADO LOS FRAGMENTOS DE ADN CODIFICANTES PARA LAS COMBINACIONES DE POLIPEPTIDOS ANTES MENCIONADAS.
Description
Composición farmacéutica contra los tumores e
infecciones por papilomavirus.
La presente invención tiene por objeto una
composición farmacéutica destinada al tratamiento o la prevención
de las lesiones asociadas a los papilomavirus y más particularmente
a los papilomavirus humanos (HPV) de tipo 16, 18, 31, 33 y 45.
Los papilomavirus son unos virus con ADN que
posee un genoma circular de aproximadamente 7900 pares de bases
rodeado por un cápsido proteínico. Un cierto número de tipos de
papilomavirus bovinos (BPV), humanos (HPV) han sido identificados y
su genoma secuenciado (Pfister, 1987, in The papovaviridae: The
Papillomaviruses (edición Salzman y Howley) Plenum Press, Nueva
York, p 1-38). Comprende una región precoz y una
región tardía. La región tardía comprende dos marcos de lectura L1
y L2 que codifican para los componentes principales del cápsido. La
región precoz contiene por lo menos los marcos de lectura E1, E2,
E4, E5, E6 y E7. Los productos de expresión E1 y E2 regulan la
réplica viral y la expresión de los genes virales mientras que los
de las regiones E5, E6 y E7 están implicados en los procesos de
transformación oncogénica de las células infectadas. En efecto, se
ha demostrado experimentalmente que la proteína E5 de
BPV-1 puede in vitro transformar unas
células (Schlegel et al., 1986, Science 233,
464-467). Las proteínas E6 de BPV-1
y E7 de HPV-16 están implicadas en la inducción y
el mantenimiento de la transformación oncógena. El poder
transformante de E7 ha sido demostrado para HPV-16
y HPV-18 (Kanda et al., 1988, J. Virol.
62, 610-613, Vousden et al., 1988,
Oncogene Res. 3, 1-9; Bedell et al.,
1987, J. Virol. 61, 3635-3640). No ha sido
puesta en evidencia la función de E4.
En el hombre, los HPLV están asociados a unas
patologías que van de la infección benigna de la piel a las
verrugas y a los tumores malignos. Estos virus son altamente
específicos del epitelio de la epidermis de las vías genitales,
orales y respiratorias. Los datos epidemiológicos sugieren
fuertemente la función de algunas cepas en el cáncer del cuello del
útero y de las vías bajas, en particular los HPV-16
y 18 y en un menor grado los HPV-31, 33 y 45. El
cáncer del cuello uterino es la segunda causa de cáncer femenino en
el mundo. Según la OMS, 460000 nuevos casos son catalogados cada
año de los cuales 200000 casos por lo menos están claramente
asociados a los HPV. Toda una serie de estudios demuestra la función
transformante de estos virus, su integración específica en el
genoma de las células neoplásicas, su actividad génica en las
células cancerosas y la importancia de la expresión de los genes
precoces E6 y E7 en el mantenimiento del fenotipo maligno de las
células neoplásicas HPV positivas (Monsenego, J. Impact Medecin, 11
marzo 1994).
Las patologías asociadas a los virus HPV plantean
un problema terapéutico debido a su naturaleza persistente y
recurrente. Numerosas aproximaciones han sido ya utilizadas en el
tratamiento de estas enfermedades, tales como la cirugía, la
quimioterapia, los agentes antivirales y la inmunoterapia.
A este respecto, la patente europea EP 0 462 187
describe una aproximación de vacunación que utiliza los genes
precoces de los papilomavirus para establecer una inmunidad con
respecto a los tumores que resultan de la integración del genoma
HPV en el ADN celular y en los cuales las proteínas del cápsido no
son ya expresadas. La solicitud WO 93/02184 enseña una aproximación
terapéutica basada en la utilización de los antígenos de cápsido a
título de agentes inmunógenos. Estos documentos no sugieren la
posibilidad de asociar el efecto preventivo proporcionado por los
polipéptidos precoces y el efecto curativo conferido por los
polipéptidos tardíos de los papilomavirus para generar unas
composiciones adaptadas al conjunto de las patologías graves
debidas a los HPV. Por otra parte, en el curso de los últimos años,
se ha propuesto utilizar unos polipéptidos que tienen una actividad
inmunoestimulante con el fin de activar las células T con un
resultado más o menos benéfico según las patologías apuntadas (ver
por ejemplo WO 96/11279).
Por otra parte, los documentos WO 93/00436 y WO
94/23037 describen las propiedades inmunógenas de la proteína L2 de
BPV que pueden ser aprovechadas para el tratamiento o la prevención
de los tumores por papilomavirus. Una formulación particular asocia
las proteínas L2 y E7 de BPV-4 producidas por vía
recombinante en E. coli. Debe observarse que la actividad
antitumoral proporcionada por la asociación L2 + E7 es similar a la
obtenida con L2
sola.
sola.
El documento WO 96-11274 describe
unas composiciones farmacéuticas para la prevención o el tratamiento
de las infecciones por papilomavirus obtenidas por la expresión del
polipéptido L1 y de un polipéptido de fusión L2-E7
en el sistema baculovirus. Los VLPs (para Virus Like
Particles) quiméricos que presentan el polipéptido E7 en su
superficie se producen en las células de insectos Sf 9 y se
purifican por centrifugación sobre gradiente de sucrosa. Los
conejos inmunizados por estas partículas quiméricas generan unos
anticuerpos contra los polipéptidos virales L1 y E7. El documento
WO 96/11274 divulga también unos VLPs que presentan una molécula
inmunoestimulante en su superficie e ilustra su inserción en la
región de L2 expuesta en el exterior del cápsido.
Finalmente, los documentos WO 96/260912 y WO
97/16693 describen unas composiciones farmacéuticas destinadas al
tratamiento de las infecciones o tumores por papilomavirus que
comprenden un polipéptido original de la región precoz y/o un
polipéptido originario de región tardía del genoma de un
papilomavirus en asociación con una proteína que tiene actividad
inmunoestimulante. En particular, el documento WO 96/29091 describe
el efecto benéfico de la interleucina-12 para el
tratamiento de las lesiones asociadas al papilomavirus y prevé la
combinación de la interleucina-12 con un antígeno de
papilomavirus en forma o bien de composiciones polipéptidas, o bien
de vectores recombinantes que expresan dichos polipéptidos, y el
documento WO 97/46693 describe unos cápsidos vacíos VLPs formados
por el autoensamblado de los polipéptidos tardíos L1 ó L1+L2 a
título de vehículo de transferencia de un material genético que
codifica para una proteína de interés. Los VLPs son aprovechados
para suministrar in vivo un material genético de interés, por
ejemplo que codifica para una citoquina tal como la
interleucina-2, un polipéptido que tiene una
actividad coestimulante, tal como B7.1 y B7.2 o también los
polipéptidos precoces de un
papilomavirus.
papilomavirus.
La presente invención se refiere más precisamente
a una preparación basada en una mezcla de antígenos originarios de
las regiones precoces y tardías de un papilomavirus o un vector que
las expresa simultáneamente, con el fin de establecer una inmunidad
duradera en contra de las células infectadas. Los candidatos vacunas
propuestos en el marco de la presente invención pueden ser
utilizados a título preventivo (inmunoprofilaxia) para evitar el
desarrollo o la propagación de la infección viral a los tejidos
próximos o a título curativo (inmunoterapia) para impedir o reducir
una evolución tumoral en los pacientes infectados. La utilización de
los antígenos de cápsido inducirá a la producción de anticuerpos
contra los epítopos antigénicos localizados en la superficie de las
partículas virales que impiden a la infección establecerse de forma
duradera. El uso de las proteínas precoces permitirá inducir una
inmunidad contra unas células infectadas después de integración del
ADN viral.
La presente invención proporciona también una
preparación que asocia un polipéptido originario de un papilomavirus
y una molécula inmunoestimulante. Una de las ventajas de dicha
disposición es que combina la inmunidad específica inducida por los
antígenos virales y la inmunidad específica inducida por la molécula
inmunoestimulante y destinada a reforzar la respuesta
específica.
El objetivo de la presente invención es poner a
disposición del público unas composiciones farmacéuticas que
permitan el tratamiento de las infecciones por HPV y más
particularmente las patologías graves tales como el cáncer del
cuello del útero, de una eficacia mejorada con respecto a las
composiciones de la técnica anterior.
Es por lo que la presente invención tiene por
objeto una composición farmacéutica destinada al tratamiento o a la
prevención de una infección o tumor por papilomavirus que comprende
a título de agentes terapéuticos un polipéptido originario de la
región precoz E6, un polipéptido originario de la región precoz E7,
un polipéptido originario de la región precoz L1 y un polipéptido
originario de la región tardía L2 de un papilomavirus y por lo
menos un polipéptido que presenta actividad inmunoestimuladora
seleccionado de entre el grupo constituido por la
interleucina-2, la interleucina-7 y
las moléculas de co-adhesión B7.1 y B7.2;
quedando entendido que dicho polipéptido con
actividad inmunoestimuladora es un polipéptido nativo y dichos
polipéptidos originarios de la región precoz y dichos polipéptidos
originarios de la región tardía son polipéptidos nativos o
variantes caracterizadas al menos por una mutación de aminoácido.
Por mutación se entiende: deleción, inserción y/o sustitución de un
aminoácido. De manera más particular, un polipéptido en uso en el
marco de la presente invención tiene en particular una secuencia de
ácidos aminados cuyo grado de similitud con la secuencia de la
proteína nativa es superior a 75%, ventajosamente, superior a 85% y,
preferentemente, superior a 95%. El grado de similitud puede ser
fácilmente calculado con la ayuda de un programa de ordenador
apropiado o alineando las secuencias de manera que se obtenga el
grado máximo de homología y contabilizando el número de posiciones
en las cuales los ácidos aminados de las dos secuencias se
encuentran de forma idéntica con respecto al número total de
posiciones. La secuencia de los genomas de HPV-16 y
HPV-18 es divulgada en Genebank con los números de
acceso K02718 y X05015 respectivamente.
Como se ha recordado anteriormente, el genoma de
los virus de la familia de los papilomavirus, en particular BPV y
HPV, codifica para por lo menos 8 polipéptidos, dos polipéptidos
tardíos L1 y L2 que componen el cápsido viral y 6 polipéptidos
precoces (E1, E2, E4, E5, E6 y E7) implicados en la regulación, el
mantenimiento del genoma del viral y la transformación de las
células infectadas.
En el caso de las proteínas E6 y E7, puede
resultar ventajoso recurrir a una variante no oncógena mutada a
nivel de las regiones implicadas en el proceso de transformación de
células infectadas. Dichas variantes se describen el la literatura
(Munger et al., 1989, EMBO J. 8,
4099-4105; Crook et al., 1991, Cell
67, 547-556; Heck et al., 1992, Proc.
Natl. Acad. Sci, USA 89, 4442-4446; Phelps
et al., 1992, J. Virol 66,
2418-2427).
Por "imunoestimulante" se entiende la
capacidad para estimular una respuesta inmunitaria humoral activando
los linfocitos B a fin de amplificar la producción de anticuerpos
dirigidos contra los antígenos de papilomavirus o para estimular
una respuesta inmunitaria por mediación celular activando los
linfocitos T a fin de disparar una respuesta citotóxica
significativa contra las células tumorales no infectadas por un
papilomavirus. A título indicativo, la inmunoestimulación puede ser
evaluada en modelo animal (por comparación del porcentaje de
rechazo en un animal al cual se han injertado un tumor que expresa
el antígeno diana, esto en presencia y en ausencia del
inmunoestimulador). De manera más general, los medios para poner en
evidencia una inmunoestimulación están indicados en Roitt (en
Immunology, 4ª edición, Moby Ltd).
Se puede utilizar una molécula inmunoestimulante
nativa tal como la encontrada en un mamífero y, en particular en el
hombre.
Una composición preferida según la invención
comprende:
- (1)
- un polipéptido originario de la región E6, un polipéptido originario de la región E7, un polipéptido originario de la región L1, un polipéptido originario de la región L2 de un papilomavirus, y un polipéptido derivado de la interleucina-2,
- (2)
- un polipéptido originario de la región E6, un polipéptido originario de la región E7, un polipéptido originario de la región L1, un polipéptido originario de la región L2 de un papilomavirus, y un polipéptido derivado de la molécula B7.1, ó
- (3)
- un polipéptido originario de la región E6, un polipéptido originario de la región E7, un polipéptido originario de la región L1, un polipéptido originario de la región L2 de un papilomavirus, un polipéptido derivado de la molécula B7.1 y un polipéptido derivado de la interleucina-2.
Dadas las observaciones recordadas más arriba
sobre la frecuencia de infección por ciertos tipos de HPV en los
casos de cáncer del cuello del útero, una composición según la
invención comprende un polipéptido originario de un papilomavirus
de riesgo, del tipo HPV-16, HPV-18,
HPV-31, HPV-33 y/o
HPV-45 y en particular del virus
HPV-6. Desde luego, en el caso en que la composición
incluye diversos antígenos de papilomavirus, estos pueden ser de un
origen común o diferente.
De manera general, un polipéptido originario de
un papilomavirus o que tiene actividad inmunoestimulante puede ser
producido por los procedimientos convencionales de síntesis química
o bien por las técnicas del ADN recombinante (ver por ejemplo
Maniatis et al., 1989, Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Más
particularmente, un procedimiento de preparación comprende el acto
de cultivar una célula transformada por un fragmento de ADN que
codifica para el polipéptido en cuestión para generar una célula
productora y el acto de recolectar dicho polipéptido a partir del
cultivo. La célula productora puede ser de un origen cualquiera y
sin limitación, una bacteria, una levadura o bien una célula de
mamífero, en la medida en que el fragmento de ADN considerado está
o bien integrado en su genoma o bien integrado en un vector de
expresión apropiado capaz de replicarse. Desde luego, el fragmento
de ADN es colocado bajo el control de señales de transcripción y de
traducción que permitan su ex-
presión en la célula productora. Vectores de expresión y señales de control son conocidos por el experto en la materia.
presión en la célula productora. Vectores de expresión y señales de control son conocidos por el experto en la materia.
La presente invención prevé también una
composición farmacéutica destinada al tratamiento o a la prevención
de una infección o tumor por papilomavirus que comprende a título de
agente(s) terapéutico(s) uno o varios
vector(es) recombinante(s) que derivan de un poxvirus
en el(los) cual(es) están insertados unos fragmentos
de ADN que codifican para:
- (1)
- un polipéptido originario de la región precoz E6, un polipéptido originario de la región precoz E7, un polipéptido originario de la región L1, un polipéptido originario de la región L2, o
- (2)
- al menos un polipéptido originario de la región precoz de un papilomavirus, al menos un polipéptido originario de la región tardía de un papilomavirus y al menos un polipéptido que presenta una actividad inmunoestimuladora seleccionado de entre el grupo constituido por la interleucina-2, la interleucina-7 y las moléculas de co-adhesión B7.1 y B7.2,
siendo dichos fragmentos de ADN
colocados bajo el control de los elementos necesarios para su
expresión en una célula o en un organismo
huésped.
Según esta alternativa por otra parte preferida,
el agente terapéutico es un vector en el cual están insertados los
fragmentos de ADN que codifican para los polipéptidos originarios de
un papilomavirus o inmunoestimulantes tales como los definidos
anteriormente. Este tipo de composición presenta la ventaja de una
producción económica y de una gran estabilidad en condiciones de
entorno variadas. En particular, las condiciones de conservación son
menos obligatorias.
Los fragmentos de ADN que codifican por un
polipéptido originario de un papilomavirus pueden obtenerse por
clonado, por PCR (Polymerase Chain Reaction) o por síntesis química
según las técnicas convencionales comúnmente en uso a partir de
células papilomavirus positivas obtenidas de pacientes o de
colecciones.
El gen que codifica para un polipéptido que tiene
actividad inmunoestimulante puede también ser aislado según las
técnicas estándar a partir del genoma de una célula (tipo genómico)
o de los ARN mensajeros de una célula en la cual está expresado
(tipo ADN complementario). Por otra parte, el gen en cuestión puede
codificar para (i) una molécula soluble, o bien intracelular o bien
secretada en el medio exterior o (ii) una molécula anclada en la
membrana y por tanto presente en la superficie de las células que la
expresan.
El vector viral recombinante según la invención
deriva de un poxvirus y, en particular, de un poxvirus avícola, tal
como el virus de la viruela del canario, de un virus de viruela
avícola o de un virus de la viruela vacuna, siendo este último
preferido. Entre todos los virus de la viruela vacuna previsibles en
el marco de la presente invención, se eligen preferentemente las
cepas Copenhague, Wyeth y Ankara modificada (MVA para Modified
Vaccinia Virus Ankara). Las condiciones generales de obtención de
un virus de la viruela vacuna capaz de expresar un gen heterólogo
se enseñan en la patente europea EP 83 286 y la solicitud EP 206
920. En cuanto al virus MVA, se describe más particularmente en
(Mayr et al., 1975, Infection 3, 6-14;
Sutter y Moss, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89,
10847-10851).
Desde luego, en el marco de la presente
invención, los fragmentos de ADN son colocados bajo el control de
los elementos necesarios para su expresión. Estos incluyen los
elementos apropiados de regulación de la transcripción así como de
las señales de iniciación y de terminación de la traducción. El
promotor reviste una importancia particular. De manera general, se
recurrirá a un promotor funcional en el organismo o la célula
huésped que se quiere tratar y adaptado al vector empleado. Además,
puede ser modificado de manera que contenga unas secuencias
reguladoras, por ejemplo un elemento activador de la transcripción o
unas secuencias que responden a ciertas señales celulares. A este
respecto, puede ser ventajoso utilizar un promotor
tejido-específico puesto que las lesiones asociadas
a los papilomavirus están localizadas a nivel de las vías genitales
o promotor que responda a unas señales específicamente tumorales
(por ejemplo activado en presencia de factores de crecimiento
generalmente sobreexpresados por las células tumorales) a fin de
limitar la expresión a solamente las células tumorales.
Entre los promotores previsibles en el marco de
la invención, se pueden citar los promotores SV40 (Virus Simian
40), HMG
(Hidroxi-Metil-Glutaril-coenzima
A), TK (Thymidine Kinase), CMV (cytomegalovirus), RSV (Rous Sarcoma
Virus), el MLP (Major Late Promoter) del adenovirus adaptados al
vector adenoviral y el LTR del Mo-MLV (Moloney
Murine Leukemia Virus) más específicos de los vectores retrovirales.
Cuando el vector derivado de un poxvirus, preferentemente el
promotor será promotor de un gen del poxvirus utilizado, por ejemplo
el promotor del gen que codifica para la proteína 7,5 K, H5R, TK o
K1L del virus de la viruela vacuna. Estos últimos se describen en la
literatura y pueden ser clonados a partir del genoma viral por las
técnicas clásicas.
Por otra parte, los elementos necesarios para la
expresión pueden también comprender unas secuencias que mejoran la
expresión o el mantenimiento en la célula huésped (intrón, secuencia
señal, secuencia terminal de la transcripción, lugar de iniciación
de la traducción, secuencias que modifican la presentación de
polipéptido en las células del sistema inmunitario del huésped...).
Sin embargo, tratándose de un vector derivado de un poxvirus, se
evitará el empleo de intrones.
Una composición según la invención puede
obtenerse o bien con varios vectores recombinantes que expresan cada
uno un polipéptido dado o bien con un solo vector que expresa los
fragmentos de ADN correspondientes a los polipéptidos elegidos
puestos bajo el control de elementos independientes o comunes. Según
esta última opción se puede recurrir a unas secuencias que permitan
iniciar la traducción de manera interna (IRES) o a unas fusiones en
fase de los diferentes genes.
Las condiciones generales de obtención de un
vector recombinante en uso en la presente invención están
ampliamente descritas en el estado de la técnica. Tratándose de un
vector poxviral, se puede hacer referencia a la patente europea EP
83 286. Estas condiciones son aplicables a los otros virus
aceptables como vector que poseen una región genómica no esencial
en la cual los bloques de expresión pueden ser incorporados. Desde
luego, pueden ser insertados en el mismo lugar o un lugar
diferente. Por ejemplo, cuando se utiliza un virus de la viruela
vacuna de la cepa Copenhague, el lugar de inserción preferido es el
lugar TK y/o el lugar K1L. La inserción a nivel del gen viral TK
tiene por efecto inactivar éste y así facilitar la selección de los
recombinantes. En el marco de un virus de la viruela vacuna de la
cepa MVA, la inserción de los genes de papilomavirus e
inmunoestimulantes puede realizarse en el seno de unas escisiones I
a VI y, preferentemente, la zona de escisión II ó IIII (Meyer et
al., 1991, J. Gen. Virol 72, 1031-1038;
Sutter et al., 1994, Vaccine 12,
1032-1040).
De acuerdo con los objetivos perseguidos por la
presente invención, un vector recombinante puede además comprender
un bloque de expresión de un gen marcador de selección a fin de
facilitar las etapas de aislamiento y de purificación del virus
recombinante. Se puede citar en particular el gen Neo que
confiere la resistencia al antibiótico G418, el gen pac de
resistencia a la puromicina, el gen TK del virus del herpes simplex
del tipo I (HSV-1) que confiere la sensibilidad a
ciertos análogos de nucleósidos tales como el ganciclovir o el
aciclovir, los genes bacterianos LacZ que codifica para la
\beta-galactosidasa y gus A que codifica
para la \beta-glucuronidasa. Estos dos últimos
marcadores enzimáticos permiten detectar los virus recombinantes por
coloración en presencia de los substratos X-Gal
(5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactopiranosido)
y XglcA
(5-bromo-6-cloro-3-indolil-\beta-D-glucuronido)
respectivamente.
respectivamente.
Una composición farmacéutica según la invención
en vista al tratamiento o la prevención de una infección o tumor
por papilomavirus, comprende uno o varios vector(es)
recombinante(s) derivado(s) de un virus de la viruela
vacuna en el(los) cual(es) están insertados:
- (1)
- por lo menos un fragmento de ADN que codifica para por lo menos un polipéptido de la región tardía de un papilomavirus y un fragmento de ADN que codifica para la proteína E6 de un papilomavirus, un fragmento de ADN que codifica para la proteína E7 de un papilomavirus y un fragmento de ADN que codifica para la molécula B7.1,
- (2)
- por lo menos un fragmento de ADN que codifica para por lo menos un polipéptido de la región tardía de un papilomavirus y un fragmento de ADN que codifica para la proteína E6 de un papilomavirus, un fragmento de ADN que codifica para la proteína E7 de un papilomavirus y un fragmento de ADN que codifica para la interleucina-2,
- (3)
- por lo menos un fragmento de ADN que codifica para por lo menos un polipéptido de la región tardía de un papilomavirus y un fragmento de ADN que codifica para la proteína E6 de un papilomavirus, un fragmento de ADN que codifica para la proteína E7 de un papilomavirus, un fragmento de ADN que codifica para la molécula B7.1 y un fragmento de ADN que codifica para la interleucina-2,
- (4)
- un fragmento de ADN que codifica para la proteína E6 de un papilomavirus, un fragmento de ADN que codifica para la proteína E7 de un papilomavirus, un fragmento de ADN que codifica para la proteína L1 de un papilomavirus, un fragmento de ADN que codifica para la proteína L2 de un papilomavirus y un fragmento de ADN que codifica para la molécula B7.1,
- (5)
- un fragmento de ADN que codifica para la proteína E6 de un papilomavirus, un fragmento de ADN que codifica para la proteína E7 de un papilomavirus, un fragmento de ADN que codifica para la proteína L1 de un papilomavirus, un fragmento de ADN que codifica para la proteína L2 de un papilomavirus y un fragmento de ADN que codifica para la interleucina-2, ó
- (6)
- un fragmento de ADN que codifica para la proteína E6 de un papilomavirus, un fragmento de ADN que codifica para la proteína E7 de un papilomavirus, un fragmento de ADN que codifica para la proteína L1 de un papilomavirus, un fragmento de ADN que codifica para la proteína L2 de un papilomavirus, un fragmento de ADN que codifica para la molécula B7.1 y un fragmento de ADN que codifica para la interleucina-2.
En contrapartida, una composición farmacéutica
según la invención más particularmente destinada a fines de
inmunoprofilaxia, comprende uno o varios vector(es)
recombinante(s) derivado(s) de un virus de la viruela
vacuna en el(los) cual(es) están insertados por lo
menos un fragmento de ADN que codifica para por lo menos un
polipéptido originario de la región precoz de un papilomavirus y
- (1)
- un fragmento de ADN que codifica para la proteína L1 de un papilomavirus, un fragmento de ADN que codifica para la proteína L2 de un papilomavirus y un fragmento de ADN que codifica para la molécula B7.1,
- (2)
- un fragmento de ADN que codifica para la proteína L1 de un papilomavirus, un fragmento de ADN que codifica para la proteína L2 de un papilomavirus y un fragmento de ADN que codifica para la interleucina-2, ó
- (3)
- un fragmento de ADN que codifica para la proteína L1 de un papilomavirus, un fragmento de ADN que codifica para la proteína L2 de un papilomavirus, un fragmento de ADN que codifica para la interleucina-2 y un fragmento de ADN que codifica para la molécula B7.1.
Una composición según la invención puede
prepararse según los procedimientos conocidos en el campo de las
vacunas y las dosis aplicables pueden variar en una amplia gama. Las
mismas son funciones en particular de los polipéptidos y del virus
empleados, de la patología a tratar, del estado del paciente y de
otros parámetros que pueden ser evaluados por el clínico. Sin
embargo, en general, la dosis de virus por kilo será de 10^{4} a
10^{11}, ventajosamente de 10^{6} a 10^{10} y, preferentemente
de 10^{7} a 10^{9} unidades que forman unas zonas (ufp) cuando
el agente terapéutico es un vector viral y de 0,05 a 500 mg,
ventajosamente de 0,5 a 200 mg y, preferentemente de 1 a 100 mg
cuando el agente terapéutico es de origen polipeptídico.
Una composición según la invención puede ser
administrada según cualquier vía convencional de administración, en
particular por vía intravenosa, intramuscular, subcutánea o
subepitalial o bien por escarificación. En el caso de un tumor
accesible, es también posible recurrir a una inyección directa en el
lugar o en la proximidad del tumor o a una aplicación tópica. A
título de vacuna, una composición según la invención puede ser
administrada según las prácticas corrientes en el campo, por
ejemplo una dosis única o repetida una o varias veces después de un
cierto plazo de intervalo. Por el contrario en el marco de un
tratamiento curativo, la misma puede ser administrada
frecuentemente durante un periodo suficiente para que el tratamiento
sea eficaz. Cuando el agente terapéutico es un vector viral, este
virus está preferentemente en forma viva. Tratándose de un vector
poxviral, se preferirá emplear una cepa atenuada como la cepa MVA o
la cepa Copenhague timidina kinasa negativa. Finalmente un vector
viral recombinante puede ser atenuado por un tratamiento químico
apropiado conocido por el experto en la materia. Sin embargo, se
puede también prever inyectar un vector recombinante muerto.
Según un modo de realización preferido, una
composición farmacéutica según la invención comprende una cantidad
terapéuticamente eficaz de un vector recombinante en asociación con
un soporte aceptable desde un punto de vista farmacéutico. El
soporte se elige de manera que permita su administración por
inyección al hombre o al animal. La misma puede también comprender
un vehículo, un diluyente y/o un adyuvante y presentarse en forma
líquida o liofilizada.
La presente invención se refiere también a una
composición farmacéutica según la invención, a título de medicamento
para el tratamiento ola prevención del cáncer del cuello del útero,
de una displasia del cuello de bajo grado y de una infección por
papilomavirus.
Finalmente, la presente invención se refiere
también a un procedimiento de tratamiento o de prevención de las
patologías citadas anteriormente, según el cual se administra a un
individuo que tiene necesidad de dicho tratamiento una cantidad
eficaz desde un punto de vista farmacéutico de una mezcla de
polipéptido o de un vector recombinante en uso en la presente
invención.
La presente invención se ilustrará con referencia
a las figuras siguientes.
La Figura 1 es una representación esquemática del
vector pTG5021 que permite la transferencia al lugar TK de la
viruela vacuna Copenhague de los genes tardíos L1 y L2 de
HPV-16 puestos bajo el control del promotor p7,5K,
estando los dos cassettes en orientación opuesta uno con respecto al
otro.
La Figura 2 es una representación esquemática del
vector pTG5065 que permite la transferencia al lugar K1L de la
viruela vacuna Copenhague de los genes precoces E6 y E7 de
HPV-16 puestos bajo el control del promotor pH5R
(estando los dos cassettes en orientación opuesta uno con respecto
al otro), del gen IL-2 humano (IL2h) puesto bajo el
control del promotor p7,5K y del gen marcador LacZ (btaGAL) puesto
bajo el control del promotor pK1L.
La Figura 3 ilustra de forma esquemática la
estrategia que puede ser empleada para introducir los genes tardíos
L1 y L2 de HPV-16 en el seno de la zona de exclusión
II de un virus de la viruela vacuna MVA, estando los brazos de
recombinación izquierdo y derecho indicados (BRG2 y BRD2)
respectivamente.
La presente invención se describe más
completamente, sin en cambio estar limitada, con la ayuda de los
ejemplos siguientes.
Las construcciones descritas a continuación se
realizan según las técnicas generales de ingeniería genética y de
clonado molecular, detalladas en Maniatis et al (1989,
supra) o según las recomendaciones del fabricante cuando se
utiliza un kit comercial. La mutagénesis dirigida in vitro
por oligonucleótidos sintéticos se efectúa con la ayuda del kit
distribuido por Amersham. Las técnicas de amplificación por PCR son
conocidas por el experto en la materia (ver por ejemplo PCR
Protocols-A guide to methods and applications, 1990,
editado por Innis, Gelfand, Sninsky et White, Academic Press Inc).
Tratándose de la reparación de los puestos de restricción, la
técnica empleada consiste en un llenado de los extremos 5'
protuberantes con la ayuda de un gran fragmento de la ADN
polimerasa I de E. coli (Klenow).
Las etapas de clonado, los bacteriofagos M13
recombinantes son multiplicados en la cepa E. coli NM522
(Stratagene) en un medio mínimo gelosado (agar 7,5%) o en un medio
rico LBM líquido. Los plásmidos recombinantes que portan el gen de
resistencia a la ampicilina son replicados en unas cepas E.
coli C600 (Estratagene), BJ 5183 (Hanahan, 1983, J. Mol. Biol.
166, 557-580) y NM522 sobre medio gelosado o
líquido suplementado con 100 \mug/ml de antiobiótico. Se utiliza
preferentemente la cepa BJ5183 cuando el clonado se efectúa por
recombinación homóloga (Bubeck et al., 1993, Nucleic Acid
Res. 21, 3601-3602).
La construcción de los virus de la viruela vacuna
recombinantes se efectúa según la tecnología clásica en el campo
divulgado en los documentos ya citados y en Mackett et al.,
(1982, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 79,
7415-7419) y Mackett et al (1984, J. Virol,
49, 857-864).
Los fragmentos que codifican para las proteínas
L1 y L2 son aislados por PCR a partir de ADN genómico de células
Caski (ATCC 1550) según las técnicas generales. El fragmento de
amplificación que lleva las secuencias L1 es subclonado en el
vector M13TG130 (Kieny et al., 1983, Gene 26,
91-99), para dar la construcción M13TG8171. La
secuencia del gen L1 clonado revela varias mutaciones con respecto a
la secuencia contenida en Genebank (acceso K02718): C en lugar de
una A en posición 248, C en lugar de una A en posición 253, G en
lugar de una A en posición 537, G en lugar de una C en posición
682, G en lugar de una A en posición 874, inserción de un triplete
ACT en posición 1393, deleción de un triplete GAT en posición 1390.
La inserción del fragmento PCR que lleva las secuencias L2 en el
vector M13TG6131 conduce a M13TG9126. Se cuentan 5 mutaciones
puntuales con respecto a la secuencia divulgada en Genebank: C en
lugar de una T en posición 378, A en lugar de una G en posición
691, A en lugar de una G en posición 702, G en lugar de una A en
posición 990 y C en lugar de una A en posición 1092. A título
indicativo, el vector M13TG6131 deriva de M13TG131 (Kieny et
al., 1983, supra) por mutación del lugar
Bg/IIinterno situado fuera de los lugares múltiples de
clonado.
El gen que codifica para la proteína L1 es
modificado por creación de un lugar Bg/II corriente arriba
del ATG iniciador. El gen mutado es escindido del vector precedente
(M13TG8185) por digestión Bg/II-SacI e insertado
entre los lugares BamHI y SacI del
pTG186-poli. La construcción resultante se denomina
pTG4019. El vector de transferencia pTG186-poli se
describe en detalle en la patente francesa 2 583 429. Comprende 10
lugares de restricción para la inserción del gen a transferir y el
promotor p7,5 K para el control de su expresión.
El gen que codifica para la proteína L2 es
aislado de M13TG9126 por digestión BglII-HmdIII
después clonado entre los lugares BamHI y HmdIII en
3' del promotor 7,5 K. Se obtiene M13TG9127 en el cual se introduce
por mutagénesis localizada un lugar Sa/I corriente arriba
del promotor. El bloque de expresión "p7,5K-gen
L2" es aislado del vector mutado M13TG9129 y clonado en el lugar
SacI del vector de transferencia pTG4019 de tal manera que
las dos cassettes p7,5K-L1 y
p7,5K-L2 estén en orientación inversa. La
construcción así obtenida pTG5021 está representada en la figura 1.
Los bloques de expresión son transferidos en el genoma del virus de
la viruela vacuna cepa Copenhague por recombinación homóloga. El
virus recombinante designado VVTG5021 es aislado por selección con
la 5-bromodesoxiuridina (5BUDR).
Los genes E6 y E7 son aislados a partir de la
progenie celular Caski como se ha descrito en los ejemplos 2 y 3 de
la patente europea EP 0 462 187. Se han derivado dos construcciones
del clon M13E7/E6 que contiene los genes E6 y E7 del
HPV-16 a fin de facilitar las etapas ulteriores de
clonado. La primera, designada M13TG8188, resulta de la
introducción por mutagénesis dirigida de lugares PstI y
BamHI respectivamente corriente arriba y corriente abajo del
gen E7 y la segunda, M13TG8189 comprende un lugar PstI
corriente arriba del gen E6. La introducción de mutaciones
puntuales corriente arriba de un ATG iniciador y corriente abajo de
un clon stop están al alcance del experto en la materia.
La asociación de la proteína E7 de
HPV-16 con el producto del gen de retinoblastoma ha
sido demostrada por diversos autores (ver por ejemplo Munger et
al., 1989, EMBO J. 8, 4099-4105) y
correlacionada con su poder transformante. Por razones evidentes de
seguridad, se genera un mutante no oncógeno delecionado de las
secuencias que codifican para los ácidos aminados 21 a 26 de la
proteína E7 nativa implicados en la función de transformación por
mutagénesis dirigida del vector M13TG8188 con la ayuda del
oligonucleótido oTG5118 (SEC ID nº 1). Se obtiene M13TG9104. El gen
E7 mutado se designa a continuación E7*.
Asimismo, se ha demostrado que la proteína E6 de
HPV-16 podía interactuar con el producto de
expresión del gen supresor de tumor p53 (Crook et al., 1991,
Cell 67, 547-556). El campo implicado en esta
interacción ha sido claramente definido y se sitúa entre los
residuos 111 a 115 de la proteína nativa. El vector M13TG9125 es
generado por mutagénesis de M13TG8189 con la ayuda del
oligonucleótido oTG5377 (SEC ID nº2). El gen E6 mutado se designa a
continuación E6*.
El fragmento EcoRI K de 5,2 kb del extremo
izquierdo del genoma del virus de la viruela vacuna Copenhague
(Guillard et al., 1985, J. Virol. 53,
316-318) es clonado en el plásmido pUC8 (Gibco BRL)
linealizado por EcoRI. El vector así obtenido es a
continuación sometido a una digestión controlada por Bg/II
seguida de una ligación a fin de delecionar un fragmento de 855 pb
que codifica para el gen de restricción de huésped K1L (Guillard
et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 83,
5573-5577). El fragmento BglII de 3,4 kb es
aislado de esta construcción intermedia designada pUC8Khr y después
clonado en el lugar BamHI del plásmido pUC7 (Gibco BRL). Se
genera pBAC1 en el cual se introduce un adaptador XhoI a la
izquierda del lugar BglII único. Después de digestión por
XhoI y BglII, se inserta un fragmento
Sa/I-Bg/II que lleva el promotor de la viruela vacuna
p7,5K. Los dos lugares EcoRI son eliminados por digestión
EcoRI seguida de un tratamiento con la Klenow y un religado.
El vector pTG2147 se obtiene por introducción en el lugar único
BglII de un lugar múltiple de clonado aislado del vector p
poli II (Lathe et al., 187, Gene 57,
193-201) aislado en forma de un fragmento
BglII-BamHI. Comprende por tanto los brazos de
recombinación que permiten la inserción en el lugar K1L que encuadra
el promotor p7,5 K seguido de los lugares de restricción.
Los genes E6* y E7* se clonan corriente abajo del
promotor de la viruela vacuna pH5R contenido en el vector
M13TG9132, para dar respectivamente M13TG9138 y M13TG9139. A título
indicativo, el vector M13TG9132 proviene de la inserción del
promotor del gen H5R aislado por PCR del genoma viral en el fago
M13TG6131.
Por otra parte, el ADNc que codifica para la
interleucina-2 humana es aislado del plásmido pTG36
(patente francesa 2 583 770), introducido en un vector intermedio y
extraído de nuevo por digestión SalI-BamHI para ser
insertado en el vector de transferencia pTG2147 que apunta al lugar
K1L. La inserción se realiza a nivel de los puestos PstI y
XbaI situados corriente abajo del promotor p7,5K, con la
ayuda de adaptadores de clonado. Se obtiene pTG5056.
El bloque de expresión pH5R-E6*
es aislado del vector M13TG9139 en forma de un fragmento
BglII-BamHI que se introduce en el lugar BamHI
del vector pTG5056. Se genera el vector pTG5060. El bloque de
expresión pH5R-E7* es purificado de M13TG9138 e
insertado en el lugar BamHI del vector pTG5060, para dar
pTG5062. Se indica que la inserción en el lugar K1L conduce a unos
virus recombinantes que tienen una capacidad de réplica reducida
incluso destruida en ciertos tipos celulares. Por estas razones, se
introduce un marcador de selección positivo para facilitar la
identificación de los virus recombinantes. El vector pTG5065 resulta
del clonado en el lugar BamHI del pTG5062 de un cassette de
expresión "pK1L-gen LacZ" aislado del plásmido
pIV75 (Chen et al., 1993, Virology 196,
682-683) por escisión BglII-BamHI.
Como se ha visualizado en la figura 2, permite la transferencia de
los bloques E6*, E7* e IL-2 en el seno del lugar K1L
del virus de la viruela vacuna.
El virus recombinante de la viruela vacuna,
denominado VVTG5065, es generado por recombinación homóloga después
de transfección del vector pTG5065 en las células embrionarias de
pollo infectadas por la viruela vacuna Copenhague salvaje y
referenciados por coloración bajo gelosa al X-Gal.
Los virus de la viruela vacuna VVTG5021 y VVTG5065 son utilizados
en unos ensayos de infecciones dobles. Los dobles recombinantes son
seleccionados según los dos marcadores, formación de zonas azules
en presencia de X-Gal y deleción del marcador TK.
Estos, denominados VVTG5021&5065, expresan los bloques
p7,5K-IL-2, pH5R-E6*
y pH5R-E7* integrados en el lugar K1L y los bloques
p7,5K-L1 y p7,5K-L2 integrados en el
lugar TK.
La expresión de los genes de HPV puede ser
verificada por análisis en Western blot con la ayuda de anticuerpos
monoclonales o policlonales apropiados o por PCR inversa. La
producción de IL-2 puede ser evaluada por el test
ELISA o test CTL como se describe en la literatura. A título
indicativo, el nivel de expresión in vitro es del orden de 60
ng/ml/10^{6} células infectadas con 1 pfu/célula y 24 h.
El ADNc que codifica para la
interleucina-2 humana es aislado del plásmido pTG36
por digestión PstI e insertado en el lugar PstI del
plásmido pTG186, dando lugar a pTG188. El virus obtenido por
recombinación homóloga se denomina VVTG188.
El gen E6* es aislado de M13TG9125 en forma de un
fragmento PstI-BamHI e insertado corriente abajo del
promotor 7,5K entre los lugares PstI y XbaI de
pTG2147 en presencia de un adaptador BamHI-XbaI,
dando lugar a pTG5057. El gen E7* es puesto bajo el control del
promotor de la viruela vacuna H5R que produce M13TG9138 y el
cassette bordeado por los lugares BamHI-BglII es
subclonado en el lugar BamHI de pTG5057. Se obtiene pTG5059,
en el lugar BamHI del cual se inserta el marcador de
selección LacZ bajo la dependencia del promotor del gen de
la viruela vacuna K1L aislado por digestión
Bg/II-BamHI del vector pIV75. La construcción
resultante se designa pTG5061 y el virus generado por recombinación
homóloga con el genoma de la viruela vacuna VVTG5061.
Un virus de la viruela vacuna recombinante que
expresa los genes E6* y E7* integrados en el lugar K1L y el gen de
la IL-2 humana integrado en el lugar TK se obtiene
por coinfección de células embrionarias del pollo por los virus
VVTG5061 y VVTG188. A título indicativo, este último produce
aproximadamente una cantidad de IL-2 superior a 400
ng para 10^{6} células infectadas con 1 pfu por célula durante 24
h. El virus doblemente recombinante se designa VVTG5061&188.
El ADNc que codifica para B7.1 es aislado de una
preparación de ARNm obtenido de la progenie celular Daudi (ATCC
CCL-213) por PCR inversa utilizando los iniciadores
oTG6353 y oTG6352 (SEC ID nº: 3 y 4). Se indica que la secuencia
del gen es divulgada en Genebank con el número de acceso M27533. El
fragmento amplificado es clonado entre los lugares BglII y
EcoRI del M13TG6131 que conduce al M13TG9149 y es puesto
entre los lugares BamHI y EcoRI del pTG186. La
construcción se denomina pTG5090 y el virus obtenido por
recombinación homóloga VVTG5090. Un virus de la viruela vacuna que
expresa los genes E6* y E7* de HPV-16 integrados en
el lugar K1L y el gen B7.1 humano integrado en el lugar TK puede
ser obtenido por coinfección de células embrionarias del pollo por
los virus VVTG5061 y VVTG5090, el virus recombinante se designa
VVTG5061&5090.
El virus MVA deriva de la cepa del virus de la
viruela vacuna Ankara. No es capaz de generar unas partículas
infecciosas en las células de mamíferos pero se desarrolla
correctamente sobre unos fibroblastos embrionarios de pollo. Su
adaptación a estas células ha provocado la escisión de 6 regiones no
esenciales para su desarrollo y su ciclo infeccioso sobre este tipo
de células (desaparición de aproximadamente 15% del genoma viral;
Meyer et al., 1991, J. Gen. Virol. 72,
1031-1038). La integración de material genético
exógeno puede realizarse a nivel de cualquiera de estas zonas de
escisión. En el marco de la presente invención, se utilizan las
escisiones II y III localizadas a nivel de los fragmentos de
restricción HindIII N y A respectivamente ( Altenburger et
al., 1989, Arch. Virol. 105,
15-27).
15-27).
En un primer tiempo, se construye el vector
pTG6019 que permite la inserción en la zona de escisión III del
virus MVA. Los brazos de recombinación homóloga de una y otra parte
de la zona de escisión III se aíslan por PCR a partir del genoma
viral (ver patente americana US 5 185 146) y de los iniciadores
oTG7637 y oTG7638 (SEC ID n^{os} 5 y 6) para el brazo izquierdo y
oTG7635 y oTG7636 (SEC ID N^{os} 7 y 8) para el brazo derecho.
Los fragmentos amplificados son clonados en el lugar EcoRI del
vector pTG1E, para dar pTG6019. El material genético a transferir
es insertado entre los dos brazos de recombinación. El vector pTG1E
es similar al pTG1H (patente francesa 2 583 429) a parte de la
presencia de un adaptador EcoRI en lugar de los lugares
múltiples de clonado.
Se inserta en primer lugar un cassette de
expresión del gen marcador gus A. El promotor 7,5K es en
principio clonado en el lugar BamHI de pTG6019. Se obtiene
pTG6021 en el lugar BamHI del cual se inserta el gen
gus A generado en forma de un fragmento
BglII-BamHI. Este puede obtenerse a partir de la
secuencia divulgada en la literatura. La construcción resultante se
denomina pTG6022. La presencia del marcador permitirá discriminar
los virus salvajes de los virus recombinantes por detección de la
actividad enzimática GUS por el sustrato XglcA. Una coloración roja
revela la actividad \beta-glucuronidasa. Sin
embargo, en la óptica de una aplicación clínica, puede ser útil ser
capaz de eliminar este marcador bacteriano del producto final
después de la selección de los virus recombinantes. Para ello, se
aprovecha la capacidad de la viruela vacuna para delecionar las
secuencias comprendidas entre dos lugares homólogos. Es por lo que
se inserta un segundo promotor p7,5 K corriente abajo del gen
gus A en una orientación sentido con respecto al que que
dirige la expresión de este último. El vector pTG6022 es modificado
por inserción entre los lugares BamHI y SacI de un
fragmento p7,5K provisto de extremos cohesivos, para dar
pTG6025.
pTG6025.
Éste es completado por la inserción de los
cassettes de expresión de los genes E6* y E7* mutados. Se empieza
por introducir una nueva secuencia promotora p7,5K esta vez en
orientación antisentido con respecto a las precedentes. Esta
construcción denominada pTG6039 comprende por tanto el cassette GUS
lábil "p7,5K \rightarrow gus A-p7,5K
\rightarrow" seguido de p7,5K en la orientación opuesta. En
paralelo, los genes E6* y E7* se aíslan respectivamente de los
vectores M13TG9104 y M13TG9125 por digestión BamHI y
PstI y ensamblados en orientación opuesta uno al otro en el
lugar PstI de M13TG6131. El conjunto es extraído en forma de
un fragmento PstI que es insertado en pTG6039 linealizado
por esta misma enzima. Se obtiene el vector pTG6056 que contiene las
secuencias siguientes "p7,5K \rightarrow gus
A-p7,5K \rightarrow E7*-E6* \leftarrow
p7,5K".
El gen inmunoestimulador B7.1 es integrado en
esta última construcción. Para ello, el vector pTG6056 es escindido
por HindIII y KpnI antes de ser puesto en ligación en
presencia de los oligonucleótidos oTG10451 y oTG10450 (SEC ID Nº: 9
y 10), para generar pTG6070. Estos últimos permitirán el clonado del
cassette de expresión "pH5R-B7.1" por
recombinación homóloga.
A este fin, las secuencias B7.1 aisladas de
M13TG9149 son clonadas corriente abajo del promotor de la viruela
vacuna pH5R, para formar M13TG9184. El fragmento
BglII-EcoRI que lleva el cassette está integrado en el
vector pTG6070 linealizado por XhoI por recombinación
homóloga en E. coli. Se obtiene el vector pTG6079 que en
total comprende el gen marcador gus A en una forma
"lábil" y los cassettes de expresión de los genes precoces de
HPV-16 así como un cassette del gen de
coestimulación B7.1. El virus generado por recombinación homóloga
con el genoma MVA se designa MVATG6079.
Los bloques de expresión de los genes tardíos del
HPV-16 pueden ser insertados en el seno de la zona
de escisión II con la ayuda del vector de transferencia pTG6018.
Este es construido por inserción en el lugar EcoRI del PTG1E
de los brazos de recombinación izquierdo y derecho que bordean la
escisión II, generados por PCR utilizando los iniciadores oTG7665 y
oTG7584 (SEC ID Nº: 11 y 12) y oTG7639 y oTG7640 (SEC ID N^{os} 13
y 14). Como anteriormente, se integra entre los dos brazos un
cassette de expresión de un marcador positivo para facilitar la
detección de los virus recombinantes, pudiendo éste ser eliminado
después de la etapa de selección (Spehner et al, 1990, J.
Virol. 64, 527-533). El vector pTG6020
resulta del clonado del gen LacZ colocado corriente abajo
del promotor p7,5K en el vector pTG6018 linealizado por
BamHI. El pTG6020 es codificado por la inserción de una
secuencia p7,5K entre sus lugares BamHI y SacI
situados corriente bajo del gen LacZ. Se obtiene pTG6024.
Los cassettes L1 y L2 pueden a continuación ser introducidos según
una estrategia tal como la representada en la Figura 3.
Se utiliza la misma estrategia que anteriormente
para introducir el gen IL-2 en el vector pTG6056.
Después de clonado de los oligonucleótidos de recombinación
oTG10503 y oTG10502 (SEC ID Nº: 15 y 16) para producir pTG6076,
este último es escindido por XhoI y el fragmento
BgIII-EcoRI preparado a partir de M13TG9185
(pH5R-IL-2) insertado por
recombinación homóloga. El vector pTG6090 así obtenido comprende el
gen marcador gus A en una forma "lábil", los cassettes
de expresión de los genes precoces de HPV-16 así
como un cassette del gen IL-2 humano. El virus
recombinante obtenido por recombinación homóloga con el genoma MVA
se designa MVAT6090. Los genes tardíos pueden ser integrados en la
zona de escisión II utilizando el pTG6018, como se ha
indicado
anteriormente.
anteriormente.
Unas ratas Nude han recibido 10^{7} pfu de
VVTG5021&5065 o 10^{7} pfu de virus de la viruela vacuna
salvaje por vía intravenosa, intramuscular, subcutánea o
intracraneal. Se constituyen unos lotes de 5 ratas según el tipo de
virus inyectado y la vía de administración y se evalúa 26 días
después de la inyección, el número de animales que presenta
lesiones ligadas con la viruela vacuna. Las ratas que han recibido
el virus recombinante no muestran ninguna lesión cualquiera que sea
la vía de administración utilizada, mientras que la mayoría de los
animales tratados con la viruela vacuna salvaje presentan unas
lesiones con una frecuencia y una gravedad función de la vía de
administración. Además, se han registrado unos decesos en el caso de
una inyección intravenosa e intracraneal. Estos datos muestran que
el VVTG5021&5065 está atenuado con respecto al virus salvaje y
que no provoca lesiones incluso después de una inyección
intracraneal.
Unas ratas C57BL6 han sido vacunadas en tres
veces por vía subcutánea con 10^{7} pfu de VVTG5021&5065. Tres
días después de la última inmunización, estos animales son probados
con 10^{3} células E7W1 implantadas en subcutáneo. A título
indicativo, las células E7W1 provienen de una progenie de linfoma
murino transfectada por un vector que expresa el gen E7 oncógeno de
HPV-16. El porcentaje de supervivencia de los
animales en función del tiempo es comparado con el obtenido con
unas ratas testigo tratadas con 10^{7} pfu de un virus de la
viruela vacuna no recombinante VVTG186 (derivado del vector TG186
descrito anteriormente). El seguimiento de la mortalidad muestra
una diferencia entre los dos grupos. En el grupo testigo, 100% de
los animales están muertos el día 36 mientras que el 40% de los
animales vacunados por VVTG5021&5065 están aún vivos el día 36 y
más del 30% el día 51.
Así los virus recombinantes que expresan unos
antígenos de HPV y un gen inmunoestimulante presentan actividad
antitumoral en contra de las células tumorales que se expresa el
oncógeno E7 de HPV-16.
Unas ratas C57BL6 son inoculadas con 10^{3}
células E7 W1 implantadas en subcutáneo (día 0). 10^{7} pfu de
virus recombinantes, son a continuación administradas también en
subcutáneo al día 3 y después el día 6 y finalmente el día 9 y el
porcentaje de supervivencia de los animales es determinado con
respecto a los animales controles que han recibido un virus no
recombinante. Mientras que 100% de los animales control están
muertos, se observa un incremento notable de la supervivencia de
los animales inyectados con la mezcla de VVTG5061&5021 y de
VVTG188. Se obtienen unos resultados similares después de
administración de VVTG5065&5021 y VVTG188.
Estas experiencias de inmunoterapia han sido
reproducidas utilizando un modelo tumoral diferente, unas células
BMK16 myc que reemplazan las células E7w1. Las células BMK 16 myc
son unas células de riñón de rata neonata transfectadas por el
genoma de HPV-16 y el gen c myc murino. Los animales
son tratados con 10^{7} virus MVA TG6090 que expresa los genes
E6*, E7* de HPV-16 y IL-2 humana.
Con respecto a los controles, las ratas tratadas presentan un
retardo del crecimiento tumoral hasta el día 15.
(1) INFORMACION GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: TRANSGENE SA
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 11 rue de Molsheim
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Strasbourg
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAIS: Francia
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CODIGO POSTAL: 67082
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELEFONO: (33) 88 27 91 00
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: (33) 88 27 91 11
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TITULO DE LA INVENCIÓN: Composición farmacéutica contra los tumores e infecciones por papilomavirus.
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NUMERO DE SECUENCIAS: 16
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE SOPORTE: Cinta
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA DE EXPLOTACION: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- LÓGICA: PatentIn Release # 1,0, Versión # 1,25 (OEB)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NUMERO DE RAMAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACION: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Papilomavirus humano
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: HPV-16
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- INDIVIDUAL AISLADO: oligonucleótido de síntesis oTG5118 (E7 deleción 21 a 26)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCTGAGCTGT CATTTAATTG AGTTGTCTCT GGTTGC
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEC ID Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NUMERO DE RAMAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACION: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Papilomavirus humano
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: HPV-16
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- INDIVIDUAL AISLADO: oligonucleótido de síntesis oTG5377 (E6 delecionado 111 a 115)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGTCCAGATG TCTTTGCAGT GGCTTTTGAC AG
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEC ID Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NUMERO DE RAMAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACION: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- INDIVIDUAL AISLADO: oligonucleótido de síntesis oTG56353 (PCR gen B7.1)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCAGCCCCTG AATTCTGCGG ACACTGTTAT ACAGG
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEC ID Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NUMERO DE RAMAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACION: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- INDIVIDUAL AISLADO: oligonucleótido de síntesis oTG6352 (PCR B7,1)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTGACCCTAA AGATCTGAAG CCATGGGCCA CAC
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEC ID Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NUMERO DE RAMAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACION: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Virus de la viruela vacuna
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Ankara modificada
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- INDIVIDUAL AISLADO: oligonucleótido de síntesis oTG7637 (PCR zona III)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGGGGGAAT TCAGTAAACT TGACTAAATC TT
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEC ID Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NUMERO DE RAMAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACION: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Virus de la viruela vacuna
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Ankara modificada
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- INDIVIDUAL AISLADO: oligonucleótido de síntesis oTG7638 (PCR zona III)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGGGGGGAT CCGAGCTCAC CAGCCACCGA AAGAGCAAT
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEC ID Nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NUMERO DE RAMAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACION: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Virus de la viruela vacuna
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Ankara modificada
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- INDIVIDUAL AISLADO: oligonucleótido de síntesis oTG7635 (PCR zona III)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGGGGGGAT CCGGAAAGTT TTATAGGTAG TT
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEC ID Nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NUMERO DE RAMAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACION: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Virus de la viruela vacuna
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Ankara modificada
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- INDIVIDUAL AISLADO: oligonucleótido de síntesis oTG7636 (PCR zona III)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGGGGGAAT TCTTTGTATT TACGTGAACG
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEC ID Nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 78 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NUMERO DE RAMAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACION: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- INDIVIDUAL AISLADO: oligonucleótido de síntesis oTG10451
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEC ID Nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 86 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NUMERO DE RAMAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACION: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- INDIVIDUAL AISLADO: oligonucleótido de síntesis oTG10450
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEC ID Nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NUMERO DE RAMAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACION: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Virus de la viruela vacuna
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Ankara modificada
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- INDIVIDUAL AISLADO: oligonucleótido de síntesis oTG7665 (PCR zona II)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATGGTACCGA ATTCCATCTA CCAATTCATC CAACAACAT
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEC ID Nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 41 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NUMERO DE RAMAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACION: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Virus de la viruela vacuna
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Ankara modificada
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- INDIVIDUAL AISLADO: oligonucleótido de síntesis oTG7584 (PCR zona II)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCTGCAGGA TCCGAGCTCA TCATGACGTC CTCTGCAATG G
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEC ID Nº: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NUMERO DE RAMAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACION: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Virus de la viruela vacuna
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Ankara modificada
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- INDIVIDUAL AISLADO: oligonucleótido de síntesis oTG7639 (PCR zona II)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGGGGGGAT CCTGTGAATC ATCCATTCCA CT
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEC ID Nº: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NUMERO DE RAMAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACION: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Virus de la viruela vacuna
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Ankara modificada
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- INDIVIDUAL AISLADO: oligonucleótido de síntesis oTG7640 (PCR zona II)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGGGGGAAT TCGTTACTAA ATTGCAAGGA AAT
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEC ID Nº: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 69 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NUMERO DE RAMAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACION: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- INDIVIDUAL AISLADO: oligonucleótido de síntesis oTG10503
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEC ID Nº: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 77 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NUMERO DE RAMAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACION: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- INDIVIDUAL AISLADO: oligonucleótido de síntesis oTG10502
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (18)
1. Composición farmacéutica destinada al
tratamiento o a la prevención una infección o tumor por
papilomavirus que comprende a título de agentes terapéuticos un
polipéptido originario de la región precoz E6, un polipéptido
originario de la región precoz E7, un polipéptido originario de la
región tardía L1, un polipéptido originario de la región tardía L2
de un papilomavirus y al menos un polipéptido que presenta una
actividad inmunoestimuladora seleccionado de entre el grupo
constituido por la interleucina-2, la
interleucina-7 y las moléculas de
co-adhesión B7.1
y B7.2;
y B7.2;
quedando entendido que dicho polipéptido que
presenta una actividad inmunoestimuladora es un polipéptido nativo
y dichos polipéptidos originarios de la región precoz y dichos
polipéptidos originarios de la región tardía son polipéptidos
nativos o variantes caracterizadas al menos por una mutación
de aminoácido. Por mutación se entiende: deleción, inserción y/o
sustitución de un aminoácido.
2. Composición farmacéutica según la
reivindicación 1, caracterizada porque el polipéptido
originario de la región precoz de un papilomavirus es una variante
no oncógena de la proteína E6 y/o E7 de un papilomavirus.
3. Composición farmacéutica según la
reivindicación 1, caracterizada porque el polipéptido que
presenta una actividad inmunoestimuladora deriva de la
interleucina-2.
4. Composición farmacéutica según la
reivindicación 1, caracterizada porque el polipéptido que
presenta una actividad inmunoestimuladora deriva de la molécula
B7.1.
5. Composición farmacéutica según una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque comprende:
- (1)
- un polipéptido originario de la región E6, un polipéptido originario de la región E7, un polipéptido originario de la región L1, un polipéptido originario de la región L2 de un papilomavirus y un polipéptido derivado de la interleucina-2,
- (2)
- un polipéptido originario de la región E6, un polipéptido originario de la región E7, un polipéptido originario de la región L1, un polipéptido originario de la región L2 de un papilomavirus y un polipéptido derivado de la molécula B7.1, o
- (3)
- un polipéptido originario de la región E6, un polipéptido originario de la región E7, un polipéptido originario de la región L1, un polipéptido originario de la región L2 de un papilomavirus, un polipéptido derivado de la molécula B7.1, y un polipéptido derivado de la interleucina-2.
6. Composición farmacéutica según una de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque el papilomavirus
se selecciona de entre los tipos HPV-16,
HPV-18, HPV-31,
HPV-33 y/o HPV-45.
7. Composición farmacéutica destinada al
tratamiento o a la prevención de una infección o tumor por
papilomavirus que comprende a título de agente(s)
terapéutico(s) uno o varios vectore(s)
recombinante(s) que derivan de un poxvirus en el (los)
cual(es) están insertados unos fragmentos de ADN que codifica
para:
- (1)
- un polipéptido originario de la región E6, un polipéptido originario de la región E7, un polipéptido originario de la región L1, un polipéptido originario de la región L2 de un papilomavirus, o
- (2)
- al menos un polipéptido originario de la región precoz de un papilomavirus, al menos un polipéptido originario de la región tardía de un papilomavirus y al menos un polipéptido que presenta una actividad inmunoestimuladora seleccionado de entre el grupo constituido por la interleucina-2, la interleucina-7 y las moléculas de co-adhesión B7.1 y B7.2,
estando dichos fragmentos de ADN dispuestos bajo
el control de los elementos independientes necesarios para su
expresión en una célula o un organismo huésped.
8. Composición farmacéutica según la
reivindicación 7, caracterizada porque dichos polipéptidos
presentan las características definidas en las reivindicaciones 2 a
6.
9. Composición farmacéutica según una de las
reivindicaciones 7 y 8, caracterizada porque el poxvirus se
selecciona de entre el grupo constituido por el virus de la viruela
vacuna, el virus de la viruela del canario y el virus de la viruela
avícola.
10. Composición farmacéutica según la
reivindicación 9, caracterizada porque el vector recombinante
deriva de un virus de la viruela vacuna seleccionado de entre las
cepas Copenhague, Wyeth y Ankara modificado (MVA).
11. Composición farmacéutica según una de las
reivindicaciones 7 a 10, caracterizada porque los elementos
esenciales para la expresión de los fragmentos de ADN que codifican
para dichos polipéptidos comprenden un promotor de un gen de un
virus de la viruela vacuna seleccionado de entre los promotores de
los genes timidina kinasa (TK), 7.5K, H5R y KIL.
12. Composición farmacéutica según la
reivindicación 10 u 11, caracterizada porque el vector
recombinante deriva de un virus de la viruela vacuna de la cepa
Copenhague y porque los fragmentos de ADN que codifican para dichos
polipéptidos están insertados en el lugar TK y/o el lugar KIL de
dicho virus de la viruela vacuna.
13. Composición farmacéutica según la
reivindicación 10 u 11, caracterizada porque el vector
recombinante deriva de un virus de la viruela vacuna de la cepa MVA
y porque los fragmentos de ADN que codifican para dichos
polipéptidos están insertados a nivel de cualquiera de las zonas de
escisión seleccionadas de entre las escisiones I, II, III, IV, V y
VI de dicho virus de la viruela vacuna.
14. Composición farmacéutica según una de las
reivindicaciones 7 a 13, destinada al tratamiento o la prevención
de una infección o tumor por papilomavirus, caracterizada
porque comprende uno o varios vector(es)
recombinante(s) derivado(s) de un virus de la viruela
vacuna en el (los) cual(es) están insertados:
- (1)
- por lo menos un fragmento de ADN que codifica para por lo menos un polipéptido de la región tardía de un papilomavirus y un fragmento de ADN que codifica para la proteína E6 de un papilomavirus, un fragmento de ADN que codifica para la proteína E7 de un papilomavirus y un fragmento de ADN que codifica para la molécula B7.1,
- (2)
- por lo menos un fragmento de ADN que codifica para por lo menos un polipéptido de la región tardía de un papilomavirus y un fragmento de ADN que codifica para la proteína E6 de un papilomavirus, un fragmento de ADN que codifica para la proteína E7 de un papilomavirus y un fragmento de ADN que codifica para la interleucina-2,
- (3)
- por lo menos un fragmento de ADN que codifica para por lo menos un polipéptido de la región tardía de un papilomavirus y un fragmento de ADN que codifica para la proteína E6 de un papilomavirus, un fragmento de ADN que codifica para la proteína E7 de un papilomavirus, un fragmento de ADN que codifica para la molécula B7.1 y un fragmento de ADN que codifica para la interleucina-2,
- (4)
- un fragmento de ADN que codifica para la proteína E6 de un papilomavirus, un fragmento de ADN que codifica para la proteína E7 de un papilomavirus, un fragmento de ADN que codifica para la proteína L1 de un papilomavirus, un fragmento de ADN que codifica para la proteína L2 de un papilomavirus y un fragmento de ADN que codifica para la molécula B7.1,
- (5)
- un fragmento de ADN que codifica para la proteína E6 de un papilomavirus, un fragmento de ADN que codifica para la proteína E7 de un papilomavirus, un fragmento de ADN que codifica para la proteína L1 de un papilomavirus, un fragmento de ADN que codifica para la proteína L2 de un papilomavirus y un fragmento de ADN que codifica para la interleucina-2, o
- (6)
- un fragmento de ADN que codifica para la proteína E6 de un papilomavirus, un fragmento de ADN que codifica para la proteína E7 de un papilomavirus, un fragmento de ADN que codifica para la proteína L1 de un papilomavirus, un fragmento de ADN que codifica para la proteína L2 de un papilomavirus, un fragmento de ADN que codifica para la molécula B7.1 y un fragmento de ADN que codifica para la interleucina-2.
15. Composición farmacéutica según la
reivindicación 7, caracterizada porque comprende, a título de
agentes terapéuticos, un primer vector recombinante en el que
está(n) insertado(s) uno o varios fragmento(s) de ADN
que codifica para dicho(s) polipéptido(s)
originario(s) de la región precoz de un papilomavirus y uno o
varios fragmentos de ADN que codifica para dicho(s)
polipéptido(s) originario(s) de la región tardía de un
papilomavirus y un segundo vector recombinante en el que está(n)
insertado(s) uno o varios fragmento(s) de ADN que
codifican para dicho polipéptido que presenta actividad
inmunoestimuladora.
16. Composición farmacéutica según la
reivindicación 15, caracterizada porque los fragmentos de ADN
insertados en el primer vector codifican para E6, E7, L1 y L2 y
porque el fragmento de ADN insertado en el segundo vector codifica
para IL-2.
17. Composición farmacéutica según una de las
reivindicaciones 1 a 16, caracterizada porque comprende un
soporte farmacológicamente aceptable, que permite su administración
mediante inyección al humano o al animal.
18. Composición farmacéutica según una de las
reivindicaciones 1 a 17, a título de medicamento para el tratamiento
o la prevención del cáncer del cuello del útero, de una displasia
del cuello de grado bajo y de una infección por papilomavirus.
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