ES2312963T3

ES2312963T3 - Plantas que tienen caracteristicas de crecimiento modificado y metodo para de fabricacion de las mismas.

Info

Publication number: ES2312963T3
Application number: ES04711376T
Authority: ES
Inventors: Yves Hatzfeld; Valerie Frankard
Original assignee: CropDesign NV
Current assignee: CropDesign NV
Priority date: 2003-04-01
Filing date: 2004-02-16
Publication date: 2009-03-01
Anticipated expiration: 2024-02-16
Also published as: BRPI0408576A; DE602004015751D1; AR043957A1; CN101935664A; EP1608758A1; CN1768144B; AR077315A2; ATE404682T1; US20060253932A1; WO2004087927A1; US7459603B2; EP1608758B1; CN1768144A; US20100050297A1

Abstract

Método para incrementar el rendimiento de una planta comparado con las correspondientes plantas tipos silvestre, que comprende la introducción y expresión en una planta de una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica una proteína TAD, o un fragmento activo de ésta, en donde dicha proteína TAD es un dominio ATPasa similar a TOB3 que tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2, y en donde dicho fragmento activo es un fragmento activo de un dominio ATPasa similar a TOB3 que tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2, y en donde dicha proteína TAD, o fragmento activo de ésta incrementa el rendimiento de la planta cuando se sobre expresa en una semilla o plántula de la planta.

Description

Plantas que tienen características de crecimiento modificado y método para fabricación de las mismas.

Campo de la invención

La presente invención se relaciona con un método para modificar las características de crecimiento de una planta. Más específicamente, la presente invención se relaciona con un método para incrementar el rendimiento al modular la expresión de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína TAD y/o la actividad de una proteína TAD en una planta.

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Antecedentes de la invención

La familia de la proteína AAA (ATPasas Asociadas con varias Actividades celulares, Kunau et al., Biochimie 75, 209-224, 1993) representa un gran grupo de proteínas que comparten todos un dominio de unión ATP altamente conservado de aproximadamente 230 amino ácidos, que exhiben actividad ATPasa (Neuwald et al., Genome Research 9, 27-43, 1999; Vale, J. Cell Biol. 150, F13-F19, 2000). Las proteínas AAA están ampliamente esparcidas y se han caracterizado en Archaea, Eubacteria y en todos los reinos eucarióticos. Los dominios AAA se requieren para el funcionamiento de la proteína y están organizados en anillos hexaméricos que sufren de cambios conformacionales luego de la hidrólisis del ATP. Este cambio en conformación, que depende de la hidrólisis del ATP, pone tensión sobre las proteínas unidas, y esta actividad mecánica permite el desdoblamiento de las proteínas asociadas, la disociación proteína-proteína etc. Como resultado, las proteínas AAA juegan un papel en diferentes procesos celulares, que incluyen el ciclo celular, la síntesis de organelos, el funcionamiento mitocondrial, el transporte de vesícula, el cambio de proteína, la regulación del citoesqueleto y la motilidad intracelular. Así, las proteínas AAA pueden representar una amplia clase de mecanoenzimas que tienen vías únicas evolucionadas de utilizar un cambio conformacional fundamentalmente similar en muchas diferentes configuraciones biológicas, pero la base de la interacción con sus proteínas objetivo es aún materia de especulación (Vale, 2000). Hasta ahora, los mayores esfuerzos en investigación se enfocan en resolver la estructura molecular y la función de las ATPasas AAA, y consecuentemente no se conoce nada a cerca de su papel a nivel macroscópico, tal como crecimiento o rendimiento de
plantas.

Dada la población mundial siempre creciente, permanece como una meta principal de la investigación agrícola mejorar la eficiencia de la agricultura e incrementar la diversidad de las plantas en horticultura. Los medios convencionales para las mejoras a los cultivos y las hortícolas utilizan técnicas de reproducción selectivas para identificar las plantas que tienen características deseables. Sin embargo, tales técnicas de reproducción selectivas tienen varios inconvenientes, a saber que esas técnicas son típicamente intensivas en trabajo y dan como resultado plantas que a menudo contienen complementos genéticos heterogéneos que pueden no siempre dar como resultado que un rasgo deseable se pase de las plantas padre. Los avances en biología molecular le han permitido al hombre manipular el germoplasma de animales y plantas. La ingeniería genética de plantas implica el aislamiento y la manipulación del material genético (típicamente en la forma de ADN o ARN) y la introducción posterior de ese material genético en una planta. Tal tecnología ha conducido al desarrollo de plantas que tienen varios rasgos económicos, agronómicos u hortícolas mejorados. Un rasgo de interés económico particular es la alta
producción.

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Descripción detallada

De manera sorprendente, los inventores han encontrado que modular la expresión en una planta de una secuencia de ácido nucleico que codifica el domino ATPasa derivado de una proteína similar a TOB3 (en lo sucesivo denominada TOB3 ATPase Domain, TAD) que resulta en un rendimiento creciente cuando se compara con las plantas tipo silvestre correspondientes.

Por lo tanto de acuerdo a una primera modalidad de la presente invención se suministra un método para incrementar el rendimiento de una planta comparado con las correspondientes plantas tipo silvestre, que comprenden modular la expresión en una planta en una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica una proteína TAD, o un homólogo, derivado o fragmento activo de ésta y/o modular la actividad de un TAD, un homólogo, derivado o fragmento activo de ésta.

El término TAD que codifica el ácido nucleico/gen, como se define aquí, se refiere a cualquier ácido nucleico que codifica un dominio de ATPasa derivado de una proteína similar a TOB3, o el complemento de ésta. El ácido nucleico se puede derivar (sea directa o indirectamente (si se modifica posteriormente)) de cualquier fuente siempre y cuando el ácido nucleico, cuando se expresa en una planta, conduzca a la expresión modulada de un ácido nucleico/gen TAD. El ácido nucleico se puede aislar de una fuente microbiana, tal como bacterias, archaea, levaduras u hongos, o de una fuente de plantas, algas o animales. Este ácido nucleico se puede modificar sustancialmente de su forma nativa en composición y/o ambiente genómico a través de manipulación humana deliberada. La molécula de ácido nucleico es preferiblemente una molécula de ácido nucleico homóloga, es decir, una molécula de ácido nucleico estructural y/o funcionalmente relacionada, preferiblemente obtenida de una planta, sea de la misma especie o diferente. La molécula de ácido nucleico se puede aislar de especies de dicotiledóneas, preferiblemente de la familia Solanaceae, preferiblemente además de Nicotiana tabacum. Más preferiblemente, el ácido nucleico es como se representa por la SEQ ID NO: 1 o una porción de ésta o es una molécula de ácido nucleico capaz de hibridar con ésta, la cual hidridiza moléculas que codifican proteínas que tienen actividad TAD (unión de ATP y/o hidrolización de ATP), es decir, actividad biológica similar a aquella de la SEQ ID NO: 1; o el ácido nucleico, que codifica el amino ácido representado por la SEQ ID NO: 2 o que codifica un homólogo, derivado o fragmento activo de éste. El término ácido nucleico/gen que codifica TAD también comprende variantes del ácido nucleico que codifican un TAD debido a la degeneración del código genético; a las variantes alélicas del ácido nucleico que codifican un TAD; diferentes variantes de empalme del ácido nucleico que codifica un TAD y variantes que se interrumpen por una o más secuencias
intercaladas.

El término proteína TAD, como se definió aquí, se refiere a proteínas que comprenden un dominio ATPasa derivado de cualquier proteína similar a TOB3. Preferiblemente el TAD es de Nicotiana tabacum, más preferiblemente la proteína TAD es una proteína como se representa por la SEQ ID NO: 2, o es un homólogo, derivado o fragmento activo de ésta, cuyos homólogos, derivados o fragmentos activos tienen actividad biológica similar a aquella de la SEQ ID NO: 2. Se conocen bien en la técnica los métodos para medir la unión del ATP o para medir la actividad de la ATPasa.

De manera ventajosa, el método de acuerdo con la presente invención también se puede practicar utilizando porciones de una secuencia representada por la SEQ ID NO: 1 o al utilizar secuencias que hibridan (preferiblemente bajo condiciones estrictas) a la SEQ ID NO: 1, cuyas secuencias hibridantes desempeñan la misma función biológica que la SEQ ID NO 1 (esto es: codificar proteínas que tiene actividad TAD), o al utilizar ácidos nucleicos que codifican homólogos, derivados o fragmentos activos de una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO 2.

Los homólogos de la SEQ ID NO 2 se pueden encontrar en varios organismos procarióticos y eucarióticos. Los homólogos más cercanos sin embrago se encuentran generalmente en el reino vegetal. Los homólogos adecuados de la SEQ ID NO: 2 incluyen otros dominios TAD presentes en proteínas tales como las representadas en los NP de Acceso del GenBank NP _565435, NP_195376, AAL87170. BAD08048, NP_186956, BAD07862, NP_197195 o los accesos PIR A84563 o T51548.

Los métodos para la búsqueda e identificación de los homólogos TAD son del ámbito de las personas expertas en la técnica. Tales métodos comprenden la comparación de las secuencias representadas por la SEQ ID NO 1 o 2 en un formato leíble por computadora con secuencias que están disponibles en las bases de datos públicas tales como el MIPS (http://mips.gsf.de/), GenBank (http://www.ncbi.nim.nih.gov/Genbank/index.html) o la Base de Datos de Secuencia de Nucleótido EMBL (http://www.ebi.ac.uk/embl/index.html), utilizando algoritmos bien conocidos en la técnica para el alineamiento o comparación de las secuencias, tales como GAP (Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48, 443-453 (1972)), BESTFIT (utilizando el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (Advances in Applied Mathematics 2, 482-489 (1981))), BLAST (Altschul, S.F. Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J., J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990)), FASTA y TFASTA (W. R. Pearson y D. J. Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444-2448 (1988)). El software para desarrollar el análisis BLAST está públicamente disponible en el Centro nacional de Información de Biotecnología.

Estos análisis anteriormente mencionados para la homología de secuencia se pueden hacer con una secuencia de consulta de longitud completa o con ciertas regiones de tal secuencia, por ejemplo con dominios conservados. También la identificación de los miembros de la familia del TAD (como se definen adelante) o la determinación del porcentaje de identidad de secuencia entre el TAD y un homólogo (como se define adelante) se pueden desarrollar al utilizar estas secuencias conservadas. La identificación de tales dominios en una secuencia de proteína también es del alcance de la persona experta en la técnica e involucran un formato legible por computadora de ácidos nucleicos utilizados en la presente invención, el uso de programas de software de alineamiento y el uso de información públicamente disponible sobre dominios de proteína, motivos y cajas conservadas. Una búsqueda integrada se puede hacer utilizando la base de datos INTERPRO (Mulder et al., (2003) Nucl. Acids Res. 31, 315-318, htpp://www.ebi.ac.uk/interpro/scan.html) que combina varias bases de datos sobre familias de proteínas, dominios y sitios funcionales, tales como la base de datos PRODOM (Servant et al., (2002) Briefings in Bioinformatics 3, 246-251, http://prodes.toulouse.inra.fr/prodom/2002.1/html/home.php), PIR (Huang et al. (2003) Nucl. Acids Res. 31, 390-392, http://pir.georgetown.edu/) o Pfam (Bateman et al. (2002) Nucl. Acids Res. 30, 276-28, http://pfam.wustl.edu/). Los programas de análisis de secuencia diseñados para la investigación de motivo se pueden utilizar para la identificación de fragmentos, regiones y dominios conservados como se mencionó anteriormente. Los programas de computadora adecuados para este fin incluyen por ejemplo el MEME (Bailey y Elkan (1994) Proceedings of the Second International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology, pp. 28-36, AAAI Press, Menlo Park, California, http://meme.sdsc.edu/meme/website/intro.html).

El término TAD incluye homólogos de proteína a una proteína como se presenta en la SEQ ID NO 2. Los "homólogos" de una proteína TAD comprenden péptidos, oligopéptidos, proteínas y enzimas que tienen sustituciones de amino ácido, supresiones y/o inserciones con relación a la proteína no modificada en cuestión y que tienen actividad biológica y funcional similar a la proteína no modificada de la cual ellas se derivan. Para producir tales homólogos, los amino ácidos de la proteína se pueden reemplazar por otros amino ácidos que tienen propiedades similares (tal como hidrofobicidad, hidrofilicidad, antigenicidad similar, propensión a formar o romper estructuras helicoidales \alpha o estructuras de lámina \beta). Las tablas de sustitución conservadoras se conocen bien en la técnica (ver por ejemplo Creighton (1984) Proteins. W.H. Freeman and Company).

Cuando se utiliza un programa de alineamiento tal como GAP, con una penalidad de especio de 10, una penalidad extendida de 0.5 y la matriz BLOSUM 62, los homólogos útiles en los métodos de acuerdo con la invención tienen por lo menos 70% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO 2 en esa parte de su secuencia de proteína corresponde a la SEQ ID NO 2. Típicamente, los homólogos tienen por lo menos 80% de identidad o similitud de secuencia con la SEQ ID NO 2, preferiblemente por lo menos 85% de identidad o similitud de scuencia, adicionalmente preferiblemente por lo menos 90% de identidad o similitud de secuencia con la SEQ ID NO 2, más preferiblemente por lo menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad o similitud de secuencia con la SEQ ID NO 2. El porcentaje de similitud también se puede calcular utilizando programas de alineamiento tal como el GAP.

Los homólogos útiles en el método de acuerdo con la invención pueden ser alternativamente definidos por tener actividad de unión ATP y/o actividad ATPasa, y que comprenden una secuencia de 22 residuos de amino ácido consecutivos, cuya secuencia es por lo menos 90% idéntica con la secuencia correspondiente en la SEQ ID
NO 2.

Las proteínas homólogas se pueden agrupar en "familias de proteína". Una familia de proteína se puede definir por el análisis de similitud funcional y de secuencia, utilizando programas tales como, por ejemplo, Clustal W. El árbol de unión de vecinos de proteínas homólogas con la SEQ ID NO 2, generado por el programa Clustal W da una buena revisión de sus relaciones estructurales y ancestrales. Ventajosamente también estos miembros de familia son útiles en los métodos de la presente invención.

Dos formas especiales de homología, homología ortóloga y paráloga, son conceptos evolucionarios utilizados para describir relaciones ancestrales de genes. El término "parálogo" se relaciona con genes homólogos que resultan de una o más duplicaciones de genes dentro del genoma de las especies. El término "ortólogo" se relaciona con genes homólogos en diferentes organismos debido a la relación ancestral de estos genes. El término "homólogos" como se utiliza aquí también comprende parálogos y ortólogos de las proteínas útiles en los métodos de acuerdo con la invención. Los genes ortólogos se pueden identificar al consular una o más bases de datos de genes con un gen de interés de consulta, utilizando por ejemplo el programa BLAST. Los genes objeto de más alto rango que resultan de la investigación se someten de nuevo a un análisis BLAST, y solamente aquellos genes objeto que coinciden de nuevo con el gen de consulta se retienen como genes ortólogos reales. Por ejemplo, para encontrar un ortólogo de arroz de un gen de Arabidopsis thaliana, uno puede desarrollar un análisis BLASTN o TBLASTX en una base de datos de arroz (tal como (pero no se limita a) la base de datos Nipponbare de Oryza sativa disponible en el NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) o las secuencias genómicas de arroz (cultivadores índica o japónica)). En la siguiente etapa, las secuencias de arroz obtenidas se utilizan en un análisis BLAST inverso que utiliza una base de datos de Arabidopsis. Los resultados se pueden adicionalmente refinar cuando las secuencias resultantes se analizan con ClustalW y se visualizan en un árbol de unión vecino. El método se puede utilizar para identificar los ortólogos de muchas diferentes especies.

Las "variantes sustitucionales" de una proteína son aquellas en las cuales por lo menos un residuo de una secuencia de amino ácido se ha removido y se ha insertado un diferente residuo en su lugar. Las sustituciones de amino ácido son típicamente de residuos únicos, pero se pueden agrupar dependiendo de las restricciones funcionales colocadas en el polipéptido. Preferiblemente, las sustituciones del amino ácido comprenden sustituciones de amino ácido conservadoras. Las "variantes de inserción" de una proteína son aquellas en las cuales uno o más residuos de amino ácido se introducen en un sitio predeterminado en una proteína. Las inserciones pueden comprender fusiones amino-terminales y/o carboxiterminales así como también las inserciones intrasecuencia de amino ácidos únicos o múltiples. En general, las inserciones dentro de la secuencia de amino ácido serán más pequeñas que las fusiones amino o carboxiterminales, del orden de aproximadamente 1 a 10 residuos. Ejemplos de proteínas o péptidos de fusión amino o carboxiterminales incluyen el dominio de unión o el dominio de activación de un activador transcripcional como se utiliza en el sistema bi-hibrido de levadura, las proteínas de recubrimiento de fago, (histidina)_{6}-tag, glutation S-transferasa-tag, la proteína A, la proteína de unión de maltosa, la reductasa de hidrofolato, el epítopo Tag-100, el epítopo c-myc, el epítopo FLAG®, lacZ, CMP (péptido de unión de almodulina), el epítopo HA, el epítopo de la proteína C y el epítopo VSV. Las "variantes de supresión" de una proteína se caracterizan mediante la remoción de uno o más amino ácidos de la proteína, las supresiones generalmente variarán desde aproximadamente 1 a 20 residuos. Las variantes del amino ácido de una proteína se pueden hacer fácilmente utilizando técnicas sintéticas de péptido bien conocidas en el arte tal como la síntesis de péptido de fase sólida y similares, o mediante manipulaciones de ADN recombinante. Los métodos para la manipulación de las secuencias de ADN para producir la sustitución, inserción o supresión de variantes de una proteína son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, las técnicas para elaborar mutaciones de sustitución en sitios predeterminados en el ADN son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica e incluyen la mutagénesis M13, el gen T7 en mutagénesis in vitro (USB, Cleveland, OH), la mutagénesis Dirigida al Sitio QuickChange (Stratagene, San Diego, CA), la mutagénesis dirigida al sitio mediada por PCR u otros protocolos de mutagénesis dirigida al
sitio.

El término "derivados" se refiere a péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que pueden comprender sustituciones, supresiones o adiciones de residuos de amino ácido de ocurrencia natural y no natural comparados con la secuencia de amino ácido de una forma de ocurrencia natural de la proteína, por ejemplo, como se representa en la SEQ ID NO: 2. Los "derivados" de un TAD comprende péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que pueden comprender residuos de amino ácido de ocurrencia natural, alterada, glicosilada, acilada o no natural comparados con la secuencia de amino ácido de la forma de ocurrencia natural del polipéptido. Un derivado también puede comprender uno o más sustituyentes no amino ácido comparado con la secuencia de amino ácido de la cual se deriva, por ejemplo una molécula reportero u otro ligando, covalente o no covalentemente unido a la secuencia de amino ácido para facilitar su detección, y los residuos de amino ácido de ocurrencia no natural con relación a la secuencia de amino ácido de la proteína de ocurrencia natural. Los "fragmentos activos" de una proteína TAD comprenden por lo menos cinco residuos de amino ácido contiguos de una proteína, cuyos residuos retienen actividad biológica y/o funcional similar a la proteína de ocurrencia natural.

Ventajosamente, los métodos de acuerdo con la presente invención también se pueden practicar utilizando porciones de una molécula de ADN o ácido nucleico, cuyas porciones retienen la actividad TAD, es decir, una función biológica similar a aquella de la SEQ ID NO: 2. Las porciones de una molécula de ADN se refieren a una pieza de ADN derivada o preparada de una molécula de ADN original (mayor), cuya porción de ADN, cuando se expresa en una planta, da origen a plantas que tienen características de crecimiento modificadas. La porción puede comprender muchos genes, con o sin los elementos de control adicionales, o pueden contener solo las secuencias
espaciadoras.

La presente invención también comprende utilizar moléculas de ácido nucleico capaces de hibridar con una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína TAD, cuyas moléculas de ácido nucleico también pueden ser útiles para practicar los métodos de acuerdo con la invención. El término "hibridación" como se define aquí es un proceso en donde las secuencias de nucleótido complementarias sustancialmente homólogas se hibridan una a la otra. El proceso de hibridación puede ocurrir completamente en solución, es decir, ambos ácidos nucleicos complementarios están en solución. Las herramientas en biología molecular confían en tal proceso incluyendo la reacción de cadena de polimerasa (PCR; y todos los métodos basados en ésta), la hibridación sustractiva, la extensión del cebador aleatorio, el mapeo S1 de nucleasa, la extensión del cebador, la trascripción inversa, la síntesis de cADN, diferentes despliegues de los ARN, y la determinación de secuencia de ADN. El proceso de hibridación también puede ocurrir con uno de los ácidos nucleicos complementarios inmovilizados a una matriz tal como microesferas magnéticas, microesferas de Sefarosa o cualquier otra resina. Las herramientas en biología molecular que confían en tal proceso incluyen el aislamiento de poli (A^{+}) mARN. El proceso de hibridación puede además ocurrir con uno de los ácidos nucleicos complementarios inmovilizados en un soporte sólido tal como una nitro-celulosa o una membrana de nylon o inmovilizado mediante, por ejemplo, fotolitografía en, por ejemplo, un soporte de vidrio silíceo (el último conocido como arreglos o microarreglos de ácido nucleico o como pedazos de ácido nucleico). Las herramientas en biología molecular que confían en tal proceso incluye análisis de electrotransferencia de gel de ARN y ADN, hibridación de colonia, hibridación de placa, hibridación in situ e hibridación de micro-arreglo. Con el fin de permitir que ocurra la hibridación, las moléculas de ácido nucleico son generalmente térmica o químicamente desnaturalizadas para fundir una doble cadena en dos cadenas únicas y/o remover horquillas u otras estructuras secundarias de ácidos nucleicos de cadena única. La exigencia de hibridación está influenciada por condiciones tales como la temperatura, la concentración de sal y la composición de amortiguador de hibridación.

Para aplicaciones que requieran alta selectividad, uno típicamente deseará emplear condiciones relativamente estrictas para formar los híbridos, por ejemplo, uno seleccionará condiciones de sal relativamente bajas y/o de temperatura altas, tales como se suministran por aproximadamente 0.02 M a aproximadamente 0.15 M de NaCl a temperaturas de aproximadamente 50ºC a aproximadamente 70ºC. Las condiciones de alta exigencia para la hibridación incluyen así alta temperatura y/o baja concentración de sal (las sales incluyen NaCl y Citrato de Na_{3}) pero también se pueden influenciar mediante la inclusión de formamida en el amortiguador de hibridación y/o disminución de la concentración de los compuestos tales como SDS (dodecil sulfato de sodio) en el amortiguador de hibridación y/o la exclusión de compuestos tales como sulfato de dextrano o polietilenglicol (que promueve la aglomeración molecular) del amortiguador de hibridación. Las condiciones de hibridación con exigencia suficientemente baja son particularmente preferidas para el aislamiento de los homólogos de ácido nucleico a las secuencias de ADN de la invención definida arriba. Los elementos que contribuyen a la homología incluyen el alelismo, la degeneración del código genético y las diferencias en el uso del codón preferido.

Las "condiciones de hibridación exigentes" y "condiciones de lavado de hibridación exigentes" en el contexto de los experimentos de hibridación de ácido nucleico tal como las hibridaciones Southern y Northern son secuencias dependientes y son diferentes bajo parámetros ambientales diferentes. Por ejemplo, secuencias mayores se hibridan específicamente a temperaturas mayores. El T_{m} es la temperatura bajo concentración iónica y pH definidos, en el cual el 50% de la secuencia objetivo hibrida a una sonda perfectamente coincidente. La especificidad es típicamente la función de los lavados post-hibridación. Los factores críticos de tales lavados incluyen la concentración iónica y la temperatura de la solución de lavado final. En general, las condiciones estrictas se seleccionan para ser de aproximadamente 50ºC menos que el punto de fusión térmico (T_{m}) para la secuencia específica a una concentración iónica y pH definidos. La T_{m} es la temperatura bajo la concentración iónica y pH definidos, en la cual el 50% de la secuencia objetivo hibrida a una sonda perfectamente coincidente. La T_{m} es dependiente de las condiciones de solución y de la composición base de la sonda, y se puede calcular utilizando la siguiente ecuación:

T_{m}= 79.8ºC+(18.5xlog[Na^{+}])+(58.4ºCx%[G+C])-(820x(#bp en dúplex)^{-1})-(0.5x% formamida)

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Las condiciones estrictas más preferidas se dan cuando la temperatura es 20ºC por debajo de T_{m}, y las condiciones estrictas más preferidas se dan cuando la temperatura es 10ºC por debajo de T_{m}. La unión no específica también se puede controlar utilizando cualquier número de técnicas conocidas tales como, por ejemplo, bloquear la membrana con soluciones que contienen proteína, adiciones de ARN heterólogo, ADN, y SDS al amortiguador de hibridación, y tratamiento con Rnasa. Las condiciones de lavado se desarrollan típicamente en o por debajo de la exigencia de hibridación. Generalmente, condiciones exigentes adecuadas para los ensayos de hibridación de ácido nucleico o procedimientos de detección de amplificación de gen se establecieron anteriormente. Las condiciones más o menos exigentes también se pueden seleccionar.

Para los propósitos de definir el nivel de exigencia, se puede hacer referencia de manera conveniente a Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York o a Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989). Un ejemplo de condiciones de baja exigencia es el 4-6x SSC/0.1-0.5% p/v SDS a 37-45ºC durante 2-3 horas. Dependiendo de la fuente y la concentración del ácido nucleico involucrado en la hibridación, se pueden emplear condiciones alternativas de exigencia tal como condiciones de exigencia media. Ejemplos de condiciones de exigencia media incluyen 1-4x SSC/0.25% p/v SDS a \geq 45ºC durante 2-3 horas. Un ejemplo de condiciones de alta exigencia incluyen 0.1-1 x SSC/0.1% p/v SDS a 60ºC durante 1-3 horas. La persona experta está enterada de los varios parámetros que se pueden alterar durante la hibridación y lavado y que mantendrán o cambiarán las condiciones de exigencia. Por ejemplo, otra condición de hibridación exigente es la hibridación a 4x SSC a 65ºC, seguido por un lavado en 0.1 x SSC, a 65ºC durante aproximadamente una hora. Alternativamente, una condición de hibridación exigente de ejemplo está en 50% de formamida, 4x SSC a 42ºC. Aún otro ejemplo de condiciones exigentes incluye la hibridación a 62ºC en 6x SSC, 0.05x BLOTTO y lavado a 2x SSC, 0.1% p/v SDS a 62ºC.

Los métodos de acuerdo con la presente invención también se pueden practicar utilizando variantes de empalme alternativas de una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína TAD. El término "variante de empalme alternativa" como se utiliza aquí comprende variantes de una molécula de ácido nucleico en la cual intrones y/o exones seleccionados se han escindido, reemplazado o agregado. Tales variantes serán aquellas en las cuales la actividad biológica de la proteína permanece no afectada, que se puede lograr al retener selectivamente los segmentos funcionales de la proteína. Tales variantes de empalme se pueden encontrar en la naturaleza o se pueden hacer por el hombre. Los métodos para elaborar tales variantes de empalme son bien conocidos en la técnica. Así la invención también comprende métodos para modificar las características de crecimiento de las plantas, en particular para incrementar el rendimiento, que comprende modular la expresión en una planta de una variante de empalme alternativa de una molécula de ácido nucleico que codifica un TAD y/o al modular la actividad y/o los niveles de un TAD codificado por la variante de empalme alternativo. Preferiblemente, la variante de empalme es una variante de empalme de la secuencia representada por la SEQ ID NO: 1.

De manera ventajosa, los métodos de acuerdo con la presente invención también se pueden practicar utilizando variantes alélicas de una molécula de ácido nucleico que codifica un TAD, preferiblemente una variante alélica de una secuencia representada por la SEQ ID NO: 1. Las variantes alélicas existen en la naturaleza y comprendido dentro de los métodos de la presente invención está el uso de estos alelos naturales. Las variantes alélicas se definen además como comprender polimorfismos de nucleótido único (SNP) así como también polimorfismos de inserción/supresión pequeña (INDEL; el tamaño de los INDEL es usualmente menos de 100 bp). Los SNP y los INDEL forman el conjuntsuprao más largo de variantes de secuencia en cepas polimórficas de ocurrencia natural de la mayoría de los organismos. Ellas ayudan a mapear genes y a descubrir los genes y las funciones de los genes. Ellas además ayudan en la identificación de los locus genéticos, por ejemplo, genes vegetales, involucrados en procesos determinantes tales como la tasa de crecimiento, el tamaño de la planta y el rendimiento vegetal, el vigor de la planta, la resistencia a enfermedades, tolerancia al estrés, etc. Muchas técnicas actualmente disponibles para identificar los SNP y/o los INDEL incluyen (i) PCR seguido por la desnaturalización de la cromatografía líquida de alto desempeño (DHPLC; por ejemplo, Cho et al. (1999) Nature Genet. 23, 203-207); (ii) electroforesis capilar de desnaturalización constante (CDCE) combinada con PCR de alta fidelidad (por ejemplo, Li-Sucholeiki et al. (1999) Electrophoresis 20, 1224-1232); (iii) electroforesis de gel de gradiente de desnatualización (Fischer y Lerman (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 1579-1583); (iv) espectrometría de masa de desorción/ionización láser asistida por matriz con analizador de tiempo de vuelo (MALDI-TOF MS; por ejemplo, Ross et al. (2000) Biotechniques 29, 620-629); (v) ensayos PCR que monitorean la fluorescencia en tiempo real (Tapp et al. (2000) Biotechniques 28, 732-738; (vi) tecnología de gel Acrydite TM (Kenney et al. (1998) Biotechniques 25, 516-521); (vii) huella genética didesoxi de ciclo (CddF; Langemeier et al. (1994) Biotechniques 17, 484-490); (viii) análisis de polimorfismo de conformación de cadena sencilla (SSCP) (Vidal-Puig y Moller (1994) Biotechniques 17, 490-496) y (ix) reacción de extensión de cebador de mini-secuenciación (Syvanen) (1999) Hum. Mutat. 13, 1-10). La técnica de "Lesiones Locales Dirigidas Inducidas en el Genoma" (TILLING; McCallum et al. (2000) Nat. Biotechnol. 18, 455-457; Plant Physiol. 123, 439-442), la cual es una variante de (i) supra, que se puede aplicar para identificar rápidamente un gen alterado en por ejemplo, plantas individuales químicamente mutagenizadas que muestran fenotipos de
interés.

Los métodos de acuerdo con la presente invención también se pueden practicar al introducir en una planta por lo menos una parte de un cromosoma (natural o artificial) (tal como un Cromosoma Artificial Bacteriano (BAC)), cuyo cromosoma contiene por lo menos una molécula de gen/ácido nucleico que codifica un TAD (tal como la SEQ ID NO: 1), preferiblemente junto con uno o más genes relacionados de la misma especie o de la misma familia de genes, y/o la o las moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas regulatorias para la expresión y/o actividad TAD. La presente invención también comprende así un método para modificar las características de crecimiento de las plantas, en particular para incrementar el rendimiento, al introducir en una planta una parte de un cromosoma que comprende por lo menos un gen/ácido nucleico que codifica un TAD, cuyo gen/ácido nucleico codifica un TAD está bajo control de un promotor preferido de semilla y cuyo cromosoma artificial comprende también preferiblemente uno o más genes relacionados de la misma especie, y/o la o las secuencias de ácido nucelcio que codifican las proteínas regulatorias para la expresión y/o actividad TAD.

De acuerdo con un aspecto preferido de la presente invención, la sobre expresión (o el incremento de expresión) de un ácido nucleico se prevé comparado con las plantas tipos silvestre correspondientes. Incrementar o disminuir la expresión (o modular la expresión) de un ácido nucleico que codifica una proteína TAD comprende la expresión alterada de este gen en el organismo completo o en células o tejidos específicos. La expresión alterada del gen se puede efectuar, por ejemplo por medios químicos y/o medios recombinantes. La expresión modulante de un gen TAD se puede efectuar directamente (es decir, a través de la modulación de la expresión del gen codificante TAD de interés mismo). En la aproximación directa, la expresión modulada puede dar como resultado de los niveles de expresión alterados de un gen TAD endógeno y/o pueden resultar de la expresión alterada de un TAD que codifica el ácido nucleico que se introdujo previamente en una planta. Adicionalmente o alternativamente, la modulación de la expresión como se mencionó anteriormente se efectúa de una manera indirecta, por ejemplo como resultado de niveles decrecientes o crecientes y/o la actividad de factores que controlan la expresión del gen TAD. La expresión alterada se debe entender como alterada cuando se compara con la expresión de una proteína TAD correspondiente en las correspondientes plantas tipo silvestre.

Adicional o alternativamente, y de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, la modulación de la expresión de un ácido nucleico que codifica un TAD y/o la modulación de la actividad y/o los niveles de la proteína TAD misma se pueden afectar por los medios recombinantes. Tales medios recombinantes pueden comprender una aproximación directa y/o indirecta para la modulación de la expresión de un ácido nucleico.

Por ejemplo, una aproximación recombinante indirecta puede comprender la introducción en una planta de un ácido nucleico capaz de modular la actividad y/o los niveles de la proteína en cuestión (una proteína TAD) y/o capaz de modular la expresión del gen en cuestión (un gen que codifica una proteína TAD). Ejemplos de tales ácidos nucleicos a ser introducidos en una planta son ácidos nucleicos que codifican los factores de trascripción, los activadores, inhibidores u otros ligandos que se unen al promotor del gen TAD o que interactúan con la proteína TAD. Los métodos para probar estas clases de interacción y para aislar los ácidos nucleicos que codifican estos interactuadores son por ejemplo la selección de un mono-híbrido de levadura o de un bi-híbrido de levadura. El gen TAD o la proteína TAD puede ser tipo silvestre, es decir, el ácido nucleico o polipéptido nativo o endógeno. Alternativamente, éste puede ser un ácido nucleico derivado de la misma u otra especie, cuyo gen se introduce como un transgen, por ejemplo mediante la transformación. Este transgen se puede modificar sustancialmente de su forma nativa en composición y/o ambiente genómico a través de manipulación humana deliberada. También comprendida por una aproximación indirecta para modular la expresión de un gen TAD es la inhibición o la estimulación de las secuencias regulatorias, o el suministro de nuevas secuencias regulatorias, que manejan la expresión del gen nativo que codifica un TAD o el transgen que codifica un TAD. Tales secuencias regulatorias se pueden introducir en una planta. Por ejemplo, la secuencia regulatoria introducida en la planta es un promotor, capaz de manejar la expresión de un gen TAD
endógeno.

Una aproximación directa y preferida para modular la expresión de un gen TAD comprende la introducción en una planta de una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína TAD o un homólogo, derivado o fragmento activo de éste. El ácido nucleico se puede introducir en una planta mediante, por ejemplo, transformación.

Una manera más preferida comprende la introducción en una planta de un gen TAD como se presenta en la SEQ ID NO: 1. Una manera más preferida comprende la introducción en una planta de un gen que codifica el TAD acoplado en la dirección con sentido a un promotor preferido de semilla.

Los métodos para obtener la expresión mejorada o creciente de los genes o los productos de gene están bien documentadas en la técnica e incluyen la sobre expresión manejada por un promotor adecuado y el uso de los mejoradores de trascripción o los mejoradores de traducción. El término sobre expresión como se utiliza aquí significa cualquier forma de expresión que es adicional al nivel de expresión tipo silvestre original. Preferiblemente el ácido nucleico a ser introducido en la planta y/o a ser sobre expresado, está en una dirección con sentido con respecto al promotor al cual está operablemente ligado. El ácido nucleico a ser sobre expresado codifica preferiblemente la proteína TAD, además preferiblemente una proteína TAD de origen vegetal. Más preferiblemente, la molécula de ácido nucleico que codifica la proteína TAD se aísla de una planta dicotiledónea, preferiblemente de la familia Solanaceae, preferiblemente adicionalmente la secuencia se aísla de Nicotiana tabacum. Más preferiblemente la secuencia de ácido nucleico es como se representa por la SEQ ID NO: 1 o una porción de ésta, o codifica una secuencia de amino ácido como se representa por la SEQ ID NO: 2 o codifica un homólogo, derivado o fragmento activo de ésta. Sin embargo, se debe notar que la aplicabilidad de la invención no descansa en el uso del ácido nucleico representado por la SEQ ID NO: 1, ni en la molécula de ácido nucleico que codifica la secuencia de amino ácido de la SEQ ID NO: 2, sino que las otras moléculas de ácido nucleico que codifican los homólogos, derivados o fragmentos activos de la SEQ ID NO: 2, o porciones de la SEQ ID NO: 1, o secuencias que hibridan con la SEQ ID NO: 1 se pueden utilizar en los métodos de la presente invención.

Preferiblemente la sobre expresión de una proteína TAD se afecta principalmente en la semilla de una planta, más preferiblemente en el endoesperma de la semilla. Alternativamente, la sobre expresión se efectúa en las plántulas de la planta. De manera ventajosa, el desempeño de los métodos de acuerdo con la presente invención da como resultado plantas que tienen una variedad de características de crecimiento modificadas, tales características de crecimiento modificadas incluyen rendimiento o biomasa modificada, con relación a las correspondientes plantas tipo silvestre. Preferiblemente, las características de crecimiento modificadas son características de crecimiento mejoradas e incluyen rendimiento o biomasa creciente, con relación a las correspondientes plantas tipo
silvestre.

Por "rendimiento" se significa la cantidad de material cosechado por área de producción. El término "rendimiento creciente" comprende un incremento en la biomasa en una o más partes de la planta con relación a la biomasa de las correspondientes plantas tipo silvestre. Dependiendo del cultivo, la parte cosechada de la planta puede ser una parte o tejido diferente de la planta, tal como la semilla (por ejemplo, arroz, sorgo o maíz cuando crece para semilla); la biomasa molida por encima del total (por ejemplo, maíz, cuando se utiliza para ensilaje, caña de azúcar), raíces (por ejemplo, remolacha), frutas (por ejemplo, tomate), fibras de algodón, o cualquier otra parte de la planta que sea de valor económico. Por ejemplo, los métodos de la presente invención se utilizan para incrementar el rendimiento de la semilla del arroz y del maíz, o también incrementar el rendimiento del maíz de ensilaje en términos del total por encima de la biomasa molida y el contenido de energía. El incremento en el rendimiento comprende un incremento en el rendimiento de la semilla, que incluye un incremento en la biomasa total de la semilla (peso de semilla total) y/o un incremento en el número de semillas rellenadas y/o un incremento en el número total de semillas. El incremento en el rendimiento también se refleja en un incremento del índice de cosecha, que se expresa como una proporción del rendimiento de las partes cosechables, tales como semillas, sobre la biomasa
total.

Por lo tanto, se suministra un método para incrementar el rendimiento de una planta, y en particular el rendimiento de la semilla, que comprende introducir y sobre expresar principalmente en la semilla de esta planta una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína TAD, un homólogo, un derivado o un fragmento activo de ésta comparado con las correspondientes plantas tipo silvestre, y en donde el incremento del rendimiento comprende por lo menos uno del peso total creciente de semillas, número creciente de semillas rellenas, o un índice de cosecha creciente, cada uno con relación a las correspondientes plantas tipo silvestre.

El rendimiento es por su naturaleza un parámetro complejo por medio del cual el rendimiento total depende de un número de componentes de rendimiento. Los parámetros para incrementar el rendimiento de un cultivo son bien conocidos por la persona experta. Por vía de ejemplo, los componentes de rendimiento clave para el maíz incluyen el número de plantas por hectárea o acre, el número de orejas por planta, el número de hileras (de semillas) por oreja, el número de kernels por hilera, y el Peso de Mil Kernel. El mejoramiento en el rendimiento se obtiene de acuerdo con el método de la invención, se puede obtener como resultado en uno o más de esos componentes de rendimiento. Por vía de ejemplo, los componentes con rendimiento clave para el arroz incluyen el número de plantas por hectárea o acre, el número de panículas por planta, el número de espigas por panícula, la tasa de llenado de semilla y el peso de mil kernel. La mejora en el rendimiento como se obtiene de acuerdo con el método de la invención se puede obtener como resultado de uno o más de estos componentes de rendimiento, preferiblemente la mejora en el rendimiento se obtiene principalmente sobre la base de un número creciente de flores por panícula y una tasa de relleno de semilla incrementada.

De acuerdo con una característica preferida de la presente invención, el desempeño de los métodos de acuerdo con la presente invención da como resultado plantas que tienen producción modificada. Preferiblemente, la producción modificada es la producción de semilla creciente e incluye por lo menos un incremento en uno cualquiera o más del número de panículas, el número de espigas por panícula, el número total de semillas, el número de semillas llenas, el peso total de la semilla, el Peso de Mil Kernel y el índice de cosecha, cada uno con relación a las plantas de control. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se suministra un método para incrementar el peso total de las semillas, el número de semillas llenas y/o el índice de cosecha de las plantas, cuyo método comprende modular la expresión de una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína TAD y/o modular la actividad del TAD misma en una planta de una manera preferida para la semilla, preferiblemente en donde la proteína TAD se codifica por una secuencia de ácido nucleico representada por la SEQ ID NO: 1 o una porción de ésta o por secuencias capaces de hibridar con ésta o en donde el TAD está representado por la SEQ ID NO: 2 o un homólogo, derivado o fragmento activo de
ésta.

Las construcciones útiles en los métodos de acuerdo con la presente invención se pueden crear utilizando tecnología de ADN recombinante bien conocida por el experto en la técnica. Las construcciones genéticas se pueden insertar en los vectores, que están comercialmente disponibles, adecuadas para transformarlas en plantas y adecuada para la expresión del gen de interés en las células transformadas. La construcción genética puede ser un vector de expresión en donde la molécula de ácido nucleico está operablemente ligada a una o más secuencias de control que permiten la expresión en las células huéspedes procarióticas y/o eucarióticas.

Preferiblemente, la construcción genética es un vector de expresión diseñado para sobre expresar la molécula de ácido nucleico; en particular la sobre expresión principalmente obtenida en la semilla, más particular en el endoesperma de la semilla de la planta que es el objetivo. Adicionalmente y/o alternativamente, el vector de expresión se diseña para sobre expresar el ácido nucleico en la etapa de plántula. La molécula de ácido nucleico capaz de modular la expresión de un ácido nucleico que codifica una proteína TAD es preferiblemente una molécula de ácido nucleico que codifica un TAD o un homólogo, derivado o fragmento activo de ésta, tal como cualquiera de las moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente. Una molécula de ácido nucleico preferida es la secuencia representada por la SEQ ID NO: 1 o una porción de ésta o secuencias capaces de hibridar con ésta o una molécula de ácido nucleico que codifica una secuencia representada por la SEQ ID NO: 2 o que codifica un homólogo, derivado o fragmento activo de ésta. Preferiblemente, este ácido nucleico es clonado en orientación con sentido en relación con la secuencia de control a la cual está operablemente ligada.

Las plantas se transforman con un vector que comprende la secuencia de interés (es decir, la molécula de ácido nucleico que codifica una proteína TAD), cuya secuencia está operablemente ligada a una o más secuencias de control (por lo menos un promotor). Los términos "elementos regulatorios", "secuencia regulatoria", "secuencia de control" y "promotor" se utilizan todas aquí intercambiablemente y se deben tomar en su contexto más amplio para referirse a las secuencias de ácido nucleico regulatorias capaces de efectuar la expresión de las secuencias a las cuales ellas están ligadas. Comprendidas por los términos anteriormente mencionados están las secuencias regulatorias trascripcionales derivadas de un gen genómico eucariótico clásico (que incluye la caja TATA que se requiere para la iniciación de la trascripción precisa, con o sin la secuencia de caja CCAAT( y los elementos regulatorios adicionales (es decir, las secuencias activantes corriente arriba, mejoradores y silenciadores) que alteran la expresión genética en respuesta al desarrollo y/o estímulos externos, o de una manera específica al tejido. También incluida dentro del término está una secuencia regulatoria trascripcional de un gen procariótico clásico, en cuyo caso éste puede incluir una secuencia de caja -35 y/o secuencias regulatorias trascripcionales de caja -10. El término "elemento regulatorio" también comprende una molécula de fusión sintética o derivado que confiere, activa o mejora la expresión de una molécula de ácido nucleico en una célula, tejido u órgano. El término "operablemente ligado" como se utiliza aquí se refiere a un enlace funcional entre la secuencia promotora y el gen de interés, de tal forma que la secuencia promotora es capaz de iniciar la trascripción del gen de interés.

Con el fin de obtener las características de crecimiento modificadas deseadas, es importante que el gen de interés se exprese a un nivel adecuado y en un patrón adecuado de espacialidad y de desarrollo. Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico que codifica la proteína TAD está operablemente ligada a un promotor preferido de semilla. El término promotor "preferido de semilla" como se define aquí se refiere a un promotor que se expresa predominantemente en uno o más tejido(s) de semilla. Preferiblemente el promotor preferido de semilla es un promotor preferido de endosperma, más preferiblemente un promotor como el presentado en el GenBank bajo el número de acceso X65064 (secuencia desde el nucleótido 1 al 672, posteriormente denominado PRO0090), o un promotor de resistencia similar y/o patrón de expresión similar. Por lo tanto, la invención también suministra un método para modificar las características de crecimiento de una planta, en particular el rendimiento, que comprende la expresión creciente en una planta de un ácido nucleico que codifica una proteína TAD, en donde la expresión creciente se obtiene principalmente en la semilla. Preferiblemente, esta expresión se efectúa bajo el control de un promotor preferido de semilla, más preferiblemente el promotor preferido de semilla es un promotor preferido de endoesperma, más preferiblemente el promotor preferido de semilla es el PRO0090. Se debe notar sin embargo que este promotor PRO0090 también es activo en las plántulas, de esta manera los métodos de la invención también se pueden practicar con el uso de un promotor preferido de plántula. Por lo tanto, la invención también suministra un método para modificar las características de crecimiento de una planta, en particular el rendimiento, que comprende la expresión creciente en una planta de un ácido nucleico que codifica una proteína TAD, en donde la expresión creciente se obtiene principalmente en la
plántula.

La resistencia del promotor y/o el patrón de expresión se pueden analizar por ejemplo al acoplar el promotor a un gen reportero y ensayar la expresión del gen reportero en varios tejidos de la planta. Un gen reportero adecuado bien conocido por el experto en la técnica es la beta-glucuronidasa. La resistencia del promotor y/o el patrón de expresión se pueden entonces comparar con aquel del promotor de referencia bien caracterizado, tal como el promotor CaMV 35S o el promotor NRP33 de prolamina de arroz preferido de semilla. Una lista no limitante de ejemplos de otros promotores preferidos de semilla se presenta en la Tabla 1, estos promotores o derivados de éstos también son útiles en los métodos de la presente invención.

TABLA 1 Promotores preferidos de semilla de ejemplo para uso en el desempeño de la presente invención

1

2

Opcionalmente, una o más secuencias terminadoras también se pueden utilizar en la construcción introducida en una planta. El término "terminador" comprende una secuencia de control que es una secuencia de ADN al final de la unidad transcripcional que señala el procesamiento 3' y la poliadenilación de un trascripto primario y la terminación de la trascripción. Los elementos regulatorios adicionales pueden incluir mejoradores trascripcionales así como también transduccionales. Aquellos expertos en la técnica estarán enterados de las secuencias terminadoras y mejoradoras que pueden ser adecuadas para el uso en desarrollar la invención. Tales secuencias serían conocidas o podrían ser fácilmente obtenidas por una persona experta en la técnica.

Las construcciones genéticas pueden incluir además un origen de secuencia de replicación que se requiere para mantenimiento y/o replicación en un tipo de célula específico. Un ejemplo es cuando se requiera una construcción genética para ser mantenida en una célula bacteriana como un elemento genético episomal (por ejemplo, plásmido o molécula cósmido). Los orígenes preferidos de la replicación incluyen, pero no se limitan a, el f1-ori y el colE1.

La construcción genética puede comprender opcionalmente un gen marcador seleccionable. Como se utiliza aquí, el término "gen marcador seleccionable" incluye cualquier gen que confiere un fenotipo sobre una célula en la cual éste se expresa para facilitar la identificación y/o selección de las células que se transfectan o transforman con una construcción de ácido nucleico de la invención. Los marcadores adecuados se pueden seleccionar de los marcadores que confieren la resistencia antibiótica o herbicida, que introducen un nuevo rasgo metabólico o que permiten la selección visual. Ejemplos de proteínas marcadoras seleccionables incluyen proteínas que confieren resistencia a los antibióticos (tales como nptll que fosforilizan la neomicina y la canamicina, o hpt, que fosforiliza la higromicina), a herbicidas (por ejemplo, barra que suministra resistencia a Basta; aroA o gox que suministra resistencia contra glifosato), o genes que suministran un rasgo metabólico (tal como manA que permite que las plantas utilicen manosa como la única fuente de carbono). Los genes marcadores visuales dan como resultado la formación de color (por ejemplo \beta-glucuronidasa, GUS), luminiscencia (tal como luciferasa) o fluorescencia (Proteína Fluorescente Verde, GFP, y derivados de ésta).

En una modalidad preferida, la construcción genética como se mencionó anteriormente, comprende un TAD en orientación de la hebra acoplada a un promotor que es preferiblemente un promotor preferido de semilla y/o preferido de plántula, tal como por ejemplo el promotor PRO0090. Preferiblemente, la construcción genética comprende un casete de expresión esencialmente similar a la SEQ ID NO: 3, que comprende el promotor PRO0090, el gen TAD de tabaco y la secuencia terminadora de trascripción T-zein + T-rubisco. Una secuencia esencialmente similar a la SEQ ID NO 3 comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína homóloga a la SEQ ID NO 2 o hibrida la SEQ ID NO 1, cuyo primer ácido nucleico está operablemente ligado al promotor PRO0090, o a un promotor con un patrón y nivel de expresión similar, y cuyo primer ácido nucleico está opcionalmente ligado a una secuencia de terminación de transcripción.

La proteína misma y/o el ácido nucleico mismo se pueden introducir directamente en una célula vegetal o en la planta misma (que incluye la introducción en un tejido, órgano o en cualquier otra parte de la planta). De acuerdo con una característica preferida de la presente invención, el ácido nucleico se introduce preferiblemente en una planta mediante transformación. El ácido nucleico es preferiblemente como se representa por la SEQ ID NO: 1 o una porción de ésta o secuencias capaces de hibridar con ésta, o es un ácido nucleico que codifica una secuencia de amino ácido representada por la SEQ ID NO: 2 o un homólogo, derivado o fragmento activo de ésta. La secuencia de ácido nucleico está preferiblemente bajo control de un promotor preferido de semilla/plántula, más preferiblemente el promotor PRO0090.

El término "transformación" como se denomina aquí comprende la transferencia de un polinucleótido exógeno en una célula huésped, sin importar el método utilizado para transferencia. El tejido vegetal capaz de la propagación clónica posterior, sea mediante organogénesis o embriogénesis, se puede transformar con una construcción genética de la presente invención y con una planta completa regenerada de ésta. El tejido particular escogido variará dependiendo de los sistemas de propagación clónica disponibles para, y que mejora se adecuen a, las especies particulares que se están transformado. Los objetivos de tejido de ejemplo incluyen discos de hoja, polen, embriones, cotiledones, hipocotilos, megagametofitos, tejidos de callo, tejido meristemático existente (por ejemplo, meristema apical, yemas axilares, y meristemas radicales), y tejido meristemático inducido (por ejemplo, meristema de cotiledón y meristema de hipocotilo). El polinucleótido se puede introducir transitoria o establemente en una célula huésped y se puede mantener no integrado, por ejemplo, como un plásmido. Alternativamente, éste se puede integrar en el genoma huésped. La célula vegetal transformada resultante se puede utilizar entonces para regenerar una planta transformada de manera conocida por las personas expertas en la técnica.

La transformación de especies de la planta es ahora una técnica de rutina adecuada. Ventajosamente, cualquiera de los varios métodos de transformación se puede utilizar para introducir el gen de interés en una célula de ancestro adecuada. Los métodos de transformación incluyen el uso de liposomas, electroporación, químicos que incrementan la toma de ADN libre, inyección del ADN directamente a la planta, bombardeo con pistola de partículas, transformación que utiliza virus o polen y micro-proyección. Los métodos se pueden seleccionar del método de calcio/polietilenglicol para protoplastos (Krens, F.A. et al., 1882, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373); electroporación de protoplastos (Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol 3, 1099-1102); microinyección en el material vegetal (Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen Genet 202, 179-185); bombardeo de partícula recubierta con ADN o ARN (Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70) infección con virus (no integrativos) y similares. Un método preferido para la transformación del arroz de acuerdo con la presente invención es el protocolo de Hiei et al. (Plant J. 6, 271-282, 1994). Los métodos preferidos para transformar el maíz con una alta eficiencia son los protocolos descritos en Ishida et al. (1996, Nat Biotechnol. 14, 745-50), y en Frame et al. (2002, Plant Physiol. 129, 13-22), cuyas descripciones se incorporan aquí mediante referencia y se establecen completamente.

Generalmente después de la transformación, las células vegetales o el agrupamiento de las células se selecciona para la presencia de uno o más marcadores que se codifican por los genes expresables en plantas co-transfectados con el gen de interés, luego de lo cual el material transformado se regenera en una planta total.

Luego de la transferencia y la regeneración del ADN, la plantas transformadas putativas se pueden evaluar, por ejemplo utilizando análisis Southern, para la presencia del gen de interés, el número de copia y/o la organización genómica. Alternativamente o adicionalmente, los niveles de expresión del ADN nuevamente introducido se puede monitorear utilizando análisis Northern y/o Western, ambas técnicas se conocen bien por las personas expertas.

En una siguiente etapa de selección, las plantas transformadas se evalúan para los fenotipos deseados. Es bien conocido para las personas expertas en la técnica, como para los biólogos moleculares vegetales, que la expresión de transgenes en plantas, y de esta manera también el efecto fenotípico debido a la expresión de tal transgen, puede diferir entre diferentes líneas transgénicas independientemente obtenidas y la progenie de éstas. Los transgenes presentes en diferentes plantas transgénicas independientemente obtenidas difieren una de la otra por el locus de inserción cromosómico así como también por el número de copias transgénicas insertadas en el locus y la configuración de aquellas copias transgénicas en ese locus. Las diferencias en los niveles de expresión se pueden adscribir para influenciar desde el contexto cromosómico del transgen (el así llamado efecto de posición) o desde los mecanismos de silenciamiento disparados por ciertas configuraciones de transgen (por ejemplo, inserciones en tándem enfrentadas hacia adentro de transgenes que son propensos a silenciarse al nivel trascripcional o post-trascripcional).

Las plantas transformadas generadas se puede propagar mediante una variedad de medios, tal como mediante propagación clónico o técnicas de reproducción clásicas. Por ejemplo, una planta transformada de primera generación (o T1) se puede auto-fertilizar para dar transformantes homocigotos de segunda generación (o T2), y las plantas T2 además propagadas a través de técnicas de reproducción clásicas.

Los organismos transformados generados pueden tomar una variedad de formas. Por ejemplo, ellos pueden ser quimeras de células transformadas y células no transformadas; transformantes clónico es (por ejemplo, todas las células transformadas para contener el cassette de expresión); injertos de tejidos transformados y no transformados (por ejemplo, en plantas, material radicular transformado injertado a un esción no transformado).

El término "planta" como se utiliza aquí comprende plantas completas, ancestros y progenies de plantas y partes de plantas, que incluyen semillas, frutos, flores, brotes, hojas, tallos, raíces (que incluyen tubérculos), y células vegetales, tejidos y órganos. El término "planta" también comprende por lo tanto cultivos en suspensión, embriones, regiones meristemáticas, tejido de callo, gametofitos, esporofitos, polen, y microesporas. Las plantas que son particularmente útiles en los métodos de la invención incluyen algas, helechos, y todas las plantas que pertenecen a la super-familia Viridiplantae, en particular plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas, que incluyen legumbres de forraje, plantas ornamentales, cultivos alimenticios, árboles, o malezas seleccionadas de la lista que comprende Abelmoschus spp., Acer spp., Actinidia spp., Agropyron spp., Allium spp., Amaranthus spp., Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arabidopsis thaliana, Arachis spp, Artocarpus spp., Asparagus officinalis, Avena sativa, Averrhoa carambola, Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp., Cadaba farinos, Camellia sinensis, Canna indica, Capsicum spp., Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carthamus tinctorius, Carya spp., Castanea spp., Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp. Coffea spp., Cola spp., Colocasia esculenta, Corylus spp., Crataegus spp., Cucumis spp., Cucurbita spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus longan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp. Eleusine coracana, Eriobotrya japonica, Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginko biloba, Glycine spp., Gossypium hirsutum, Helianthus spp., Hibiscus spp., Hordeum spp., Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp. Lemna spp., Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangula, Lupinus spp., Macrotyloma spp., Malpighia emarginata, Malus spp., Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp., Panicum miliaceum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Persea spp., Petroselinum crispum, Phaseolus spp., Phoenix spp., Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Punica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Rubus spp., Saccharum spp., Sambucus spp., Secale cereale, Sesamum spp., Solanum spp., Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Triticosecale rimpaui, Triticum spp., Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp., entre otros.

Los métodos de la presente invención son favorables para aplicar a plantas de cultivo porque los métodos de la presente invención se utilizan para incrementar el rendimiento, en particular el rendimiento de la semilla, más particular el peso total de las semillas, el número de semillas llenas y el índice de cultivo de una planta. Por lo tanto, los métodos de la presente invención son particularmente útiles para las plantas de cultivo cultivadas para sus semillas, tales como cereales, girasol, soya, algodón, alverja, lino, lupions, canola, etc., pero también son útiles para cultivos que se cultivan por su biomasa. De acuerdo con una característica preferida de la presente invención, la planta es una planta de cultivo que comprende soya, girasol, canola, alfalfa, colza o algodón. Además preferiblemente, la planta de acuerdo con la presente invención es una planta monocotiledónea, que incluye miembros de las Poaceae, tales como caña de azúcar, más preferiblemente un cereal, tal como arroz, maíz, trigo, mijo, cebada y sorgo. De acuerdo con esto, una modalidad particular de la presente invención se relaciona con un método para incrementar el rendimiento, en particular el peso total de las semillas, el número de semillas llenas, el número total de semillas y/o el índice de cosecha de un cereal.

La presente invención también se relaciona con el uso de un ácido nucleico aislado que codifica una proteína TAD y con el uso de porciones de ésta o ácidos nucleicos que hibridan con ésta para modificar las características de crecimiento de las plantas, preferiblemente al incrementar el rendimiento de una planta, más preferiblemente el rendimiento de la semilla, en particular el peso total de las semillas, el número de las semillas llenas, el número total de semillas y/o el índice de cosecha de una planta, y en donde el ácido nucleico que codifica una proteína TAD, las porciones de ésta o los ácidos nucleicos que hibridan con ésta se expresan de una manera preferida en la semilla. La presente invención también se relaciona con el uso de una proteína TAD y con el uso de homólogos, derivados y fragmentos activos de éstos para modificar el rendimiento de las plantas, en particular el uso para incrementar el peso total de las semillas, el número de semillas llenas, el número total de semillas y/o el índice de cosecha de las plantas. La secuencia de ácido nucleico está preferiblemente representada por la SEQ ID NO: 1 o una porción de ésta o secuencias capaces de hibridar con ésta o que codifica una secuencia amino ácido representada por la SEQ ID NO: 2 o un homólogo, derivado o fragmento activo de ésta.

Los métodos de acuerdo con la presente invención dan como resultado plantas que tienen características de crecimiento modificadas, como se describió anteriormente. Estas características de crecimiento ventajosas también se pueden combinar con otros rasgos económicamente ventajosos, tal como rasgos de mejoramiento de producción adicionales, tolerancia a varios problemas, rasgos que modifican varias características arquitectónicas y/o bioquímicas y/o características fisiológicas. De acuerdo con esto, los métodos de la presente invención también se pueden utilizar para los procedimientos así llamados "de apilado de gen".

La presente invención se describirá ahora con referencia a las siguientes figuras en las cuales:

Figura 1: Presentación esquemática del clon de entrada p69, que contiene CDS0671 dentro de los sitios AttL1 y AttL2 para clonación Gateway® en la estructura pDONR201. El CDS0671 es el código interno para la secuencia codificante del dominio AAA-ATPasa similar a TOB3 de las células de Nicotiana tabacum BY2. Este vector contiene también un cassette de resistencia a canamicina bacteriano y un origen bacteriano de replicación.

Figura 2: El vector binario para la expresión en Oryza sativa del gen de dominio AAA-ATPasa similar a TOB3 de las células BY2 de Nicotiana tabacum (CDS0671) bajo el control del promotor preferido del endoesperma/plántula PRO0090. Este vector contiene un T-ADN derivado del Plásmido Ti, limitado por el límite izquierdo (LB repetido, LB Ti C58) y un límite derecho (RB repetido, RB Ti C58)). Del límite izquierdo al límite derecho, este T-ADN contiene: un marcador seleccionable de planta y un marcador seleccionable para la selección y escogencia de plantas transformadas; el cassette terminador doble de PRO0090 - CDS0671 - zein y rbcS-deltaGA para la expresión del gen de dominio AAA-ATPasa similar a TOB3 de las células BY2 de Nicotiana tabacum. Este vector también contiene un origen de replicación del pBR322 para la replicación bacteriana y un marcador seleccionable (Spe/SmeR) para la selección bacteriana con espectinomicina y estreptomicina.

Figura 3: Lista de secuencias.

Ejemplos

La presente invención se describirá ahora con referencia a los siguientes ejemplos, que están solo por vía de ilustración.

Manipulación de ADN: a menos que se establezca otra cosa, las técnicas de ADN recombinante se desarrollan de acuerdo a protocolos estándar descritos en (Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York) o en los Volúmenes 1 y 2 de Ausubel et al. (1984), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols. Los materiales y los métodos estándar para el trabajo molecular vegetal se describen en Plant Molecular Biology Labfase (1993) por R.D.D. Croy, publicado por BIOS Scientific Publications Ltd (UK) y Blackwell Scientific Publications (UK).

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Ejemplo 1

Clonación de CDS0671 Clonación del fragmento del gen TAD de tabaco

Se desarrolló un experimento de cADN-AFLP sobre un cultivo sincronizado de células BY2 de tabaco (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow-2), y las etiquetas de secuencia expresadas BY2 que fueron modulados por ciclo celular se eligieron para clonación adicional. Las etiquetas de secuencia expresadas se utilizaron para seleccionar una colección de cADN de tabaco y para aislar un cADN de interés, a saber un código para el gen de dominio AAA-ATPasa similar a TOB3 (CDS0671).

Sincronización de las células BY2

Una suspensión de células cultivadas BY2 de tabaco (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow-2) se sincronizó mediante células de bloqueo en una fase S temprana con afidicolina como sigue. La suspensión de la célula de Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2 se mantuvo como se describió (Nagata et al. Int. Rev: Cytol. 132, 130, 1992). Para la sincronización, se diluyó 10 veces un cultivo estacionario de 7 días en un medio fresco suplementado con afidicolina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO; 5 mg/l), una polimerasa \alpha de ADN que inhibe el fármaco. Después de 24 h, las células se liberaron del bloque mediante varios lavados con medio fresco después de lo cual su progresión del ciclo celular reasumió.

Extracción de ARN y síntesis de cADN

El ARN total se preparó utilizando precipitación LiCl (Sambrook et al, 2001) y el ARN poli(A^{+}) se extrajo de 500 \mug del ARN total utilizando columnas de Oligotex (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Partiendo de 1 \mug de poli(A^{+}) ARN, el cADN de la primera cadena se sintetizó mediante trascripción inversa con un cebador oligo-dT25 biotinilado (Genset, Paris, Francia) y Superscript II (Life Technologies, Gaithersburg, MD). La segunda síntesis de cadena se hizo mediante desplazamiento de cadena con ligasa de Escherichia coli (Life Technologies), ADN polimerasa (USB, Cleveland, OH) y ARNasa-H (USB).

Análisis cADN-AFLP

Se utilizaron quinientos cADN de cadena doble ng para el análisis AFLP como se describe (Vos et al., Nucleic Acids Res. 23 (21) 4407-4414, 1995; Bachem et al., Plant J. 9 (5) 745-53, 1996) con modificaciones. Las enzimas de restricción utilizadas fueron BstYI y MseI (Biolabs) y la digestión se hizo en dos etapas separadas. Después de la primera digestión de restricción con una de las enzimas, los fragmentos de extremo 3' se atraparon sobre microesferas Dyna (Dynal, Oslo, Noruega) por medio de su cola biotinilada, aunque los otros fragmentos se lavaron. Después de la digestión con la segunda enzima, los fragmentos de restricción liberados se recolectaron y se utilizaron como plantilas en las etapas AFLP posteriores. Para las pre-amplificaciones, se combinó un cebador MseI sin nucleótidos selectivos con un cebador BstYI que contiene un T o un C como la mayoría de los nucleótidos 3'. Las condiciones PCR fueron como se describió (Vos et al., 1995). Las mezclas de amplificación obtenidas se diluyeron 600 veces y se utilizaron 5 \mul para las amplificaciones selectivas utilizando un cebador BstYI marcado P33 y la polimerasa Amplitaq-Gold (Roche Diagnostics, Bruselas, Bélgica). Los productos de amplificación se separaron sobre 5% de geles de poliacrilamida utilizando el sistema Sequigel (Biorad). Los geles secos se expusieron a películas Kodak Biomax así como también explorados en un Phosphorlmager (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, UK).

Caracterización de los fragmentos AFLP

Las bandas que corresponden a trascriptos diferentemente expresados, entre los cuales el trascripto (parcial) que corresponde a la SEQ ID NO: 1 (o CDS0671), se aislaron del gel y eluidos. El ADN se reamplificó bajo las mismas condiciones que para la amplificación selectiva. La información de secuencia se obtuvo mediante secuenciación directa del producto de reacción de cadena de polimerasa reamplificada con el cebador BstYI selectivo o después de clonar los fragmentos en pGEM-T easy (Promega, Madison, WI) y secuenciar los clones individuales. Las secuencias obtenidas se compararon contra las secuencias de nucleótido y proteína presentes en las bases de datos públicamente disponibles mediante los alineamientos de secuencia BLAST (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25 (17) 3389-3402 1997). Cuando están disponibles, las secuencias tag se reemplazan con EST más largos o secuencias de cADN aisladas para incrementar el cambio de hallazgo de homología significativa. El clon de cADN físico que corresponde a la SEQ ID NO: 1 (CDS0671) se amplificó posteriormente desde una colección de cADN de Tabaco comercial como sigue.

Clonación del fragmento del gen TAD (CDS0671)

Una colección de cADN con un tamaño promedio de insertos de 1,400 bp se preparó del poli(A^{+}) ARN aislado de las células de tabaco BY2 no sincronizadas, activamente divididas. Estos insertos de colección se clonaron en el vector pCMVSPORT6.0, que comprende un cassette attB Gateway (Life Technologies). De esta colección, se seleccionaron 46,000 clones, dispuestos en placas microtítulo de 384 pozos, y posteriormente manchados en duplicado sobre filtros de nylon. Los clones dispuestos se seleccionaron utilizando grupos de varios cientos de etiquetas radioactivamente marcadas como sonda (incluyendo la etiqueta BY2 que corresponde a la secuencia CDS0671, SEQ ID NO 1). Los clones positivos se aislaron (entre los cuales estuvo el clon que corresponde a CDS0671, SEQ ID NO 1), secuenciado, y alineado con la secuencia de etiqueta. En casos donde la hibridación con el tag falló, el cADN de longitud completa que corresponde a la etiqueta se seleccionó mediante amplificación de PCR: cebadores específicos de tag se designaron utilizando el programa primer3 (http://www.genome.wi.mit.edu/genome_software/other/primer3.html) y utilizado en combinación con un cebador de vector común para amplificar los insertos de cADN parciales. Los grupos de ADN de 50,000, 100,000, 150,000, y 300,000 clones de cADN se utilizaron como plantillas en las amplificaciones PCR. Los productos de amplificación se aislaron entonces de geles de agarosa, clonados, secuenciados y su secuencia alineada con aquellas de las etiquetas.

Luego, el cADN de longitud completa que corresponde a la secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO 1 se clonó del vector de colección pCMVsport6.0 en pDONR201, un vector donador Gateway® (Invitrogen, Paisley, UK) por vía de la reacción LR, que resulta en el clon de entrada p69 (Figura 1).

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Ejemplo 2

Construcción del vector para la transformación con el cassette PRO0090-CDS0671

El clon de entrada p69 se utilizó posteriormente en la reacción LR con p0830, un vector de destino utilizado para transformación de Oryza sativa. Este vector contiene como elementos funcionales dentro de los límites del T-ADN: un marcador seleccionable de planta; un marcador escribable; y un cassette Gateway destinado para la recombinación LR in vivo con la secuencia de interés ya clonada en el clon de entrada. El promotor PRO0090 se localizó corriente arriba de este cassette Gateway.

Después de la etapa de recombinación LR, el vector de expresión resultante p74 (Figura 2) se transformó en una cepa de Agrobacterium LBA4044 y posteriormente en plantas de Oryza sativa.

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Ejemplo 3

Transformación de arroz con PRO0129 arriba del CDS0716

Las semillas secas maduras de Oryza sativa japonica del cultivar Nipponbare se descascararon. La esterilización se hizo al incubar las semillas durante un minuto en 70% de etanol, seguido por 30 minutos en 0.2% de HgCl_{2} y por 6 lavados de 15 minutos con agua destilada estéril. Las semillas estériles se germinaron entonces en un medio que contiene 2,4-D (medio de inducción de callo). Después de una incubación de 4 semanas en la oscuridad, los callos derivados de escutelo embriogénico se escindieron y se propagaron sobre el mismo medio. Dos semanas después, los callos se multiplicaron o se propagaron mediante sub-cultivo en el mismo medio durante otras 2 semanas. 3 días antes del co-cultivo, las piezas de callo embriogénico se sub-cultivaron sobre medio fresco para reforzar la actividad de división celular. El vector binario p3076 que habita la cepa de Agrobacterium LBA4404 se utiliza para el co-cultivo. La cepa de Agrobacterium se cultivó durante 3 días a 28ºC sobre un medio AB con los antibióticos apropiados. Las bacterias se recolectaron y suspendieron en un medio de co-cultivo líquido a un OD_{600} de aproximadamente 1. La suspensión se transfirió a una caja petri y los callos se sumergieron en la suspensión durante 15 minutos. Los tejidos de callo se electro-transfirieron entonces secos sobre un papel de filtro, transferidos a un medio de co-cultivo solidificado e incubado durante 3 días en la oscuridad a 25ºC.

Los callos co-cultivados crecieron entonces en un medio que contiene 2,4-D durante 4 semanas en la oscuridad a 28ºC en la presencia de un agente selectivo a una concentración adecuada. Durante este período, se desarrollaron islas de callos resistentes de crecimiento rápido. Luego de transferir este material al medio de regeneración e incubación a la luz, se liberó el potencial embriogénico y se desarrollaron brotes en las siguientes cuatro a cinco semanas. Los brotes se escindieron del callo y se incubaron durante 2 a 3 semanas sobre un medio que contiene auxina del cual ellos fueron transferidos al suelo. Los brotes endurecidos crecieron bajo alta humedad y días cortos en un invernadero. Finalmente las semillas se cosecharon tres a cinco meses después de transplantar. El método produjo transformantes de locus únicos a una tasa de más del 50% (Aldemita y Hodges, 1996, Chan et al., 1993, Hiei et al., 1994).

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Ejemplo 4

Evaluación de arroz transgénico transformado con PRO0129-CDS1585

Se generaron aproximadamente 15 a 20 transformantes de arroz T0 independientes. Los transformantes primarios se transfirieron de las cámaras de cultivo de tejido a un invernadero para crecimiento y la cosecha de las semillas T1. 7 eventos, de los cuales la progenie T1 segregada 3:1 para presencia/ausencia del transgen, se retuvieron. Para cada uno de estos eventos, se seleccionaron aproximadamente 10 plántulas T1 que contienen el transgen (hetero y homocigotos) y aproximadamente 10 plántulas T1 a las que les falta el transgen (nulicigotos) mediante monitoreo de la expresión del marcador cribable.

Las plantas T1 seleccionadas se transfirieron a un invernadero. Cada planta recibió una etiqueta de código de barras única para enlazar no ambiguamente los datos del fenotipo a la planta correspondiente. Las plantas T1 seleccionadas crecieron sobre el suelo en macetas de 10 cm de diámetro bajo las siguientes configuraciones ambientales: fotoperíodo = 11.5 h, intensidad de la luz del día = 30,000 lux o más, temperatura en el día = 28ºC o mayor, temperatura durante la noche = 22ºC, humedad relativa = 60-70%. Las plantas transgénicas y los correspondientes nulicigotos crecieron lado a lado en posiciones aleatorias. De la etapa de siembra hasta la etapa de madurez cada planta pasó varias veces a través de un gabinete de imágenes digitales. En cada punto de tiempo, las imágenes digitales (2048x1536 pixeles, 16 millones de colores) se tomaron de cada planta desde por lo menos 6 ángulos diferentes.

Los panículos primarios maduros se cosecharon, embolsaron, marcaron con un código de barras y luego se secaron durante tres días en un horno a 37ºC. Los panículos se trillaron entonces y se recolectaron todas las semillas. Las cascarillas rellenas se separaron de las vacías utilizando un dispositivo de soplado de aire. Después de la separación, ambos lotes de semillas se contaron entonces utilizando una máquina de conteo comercialmente disponible. Se descartaron las cáscaras vacías. Las cáscaras llenas se pesaron sobre una balanza analítica y el área de sección transversal de las semillas se midió utilizando imágenes digitales. El procedimiento resultó en el siguiente conjunto de parámetros relacionados con la semilla:

(i): Número de semillas llenas: se determinó al contar el número de cáscaras llenas que permanecieron después de la etapa de separación.

(ii): Peso total de la semilla por planta: el rendimiento se midió al pesar todas las cáscaras llenas cosechadas de una planta.

(iii): Índice de cosecha de las plantas: el índice de cosecha en la presente invención se define como la proporción entre el peso de semilla total y el área ocupada anterior (mm^{2}), multiplicado por un factor 10^{6}.

Estos parámetros se derivaron de una manera automatizada de imágenes digitales que utilizan un software de análisis de imagen y se analizaron estadísticamente. Un ANOVA de dos factores (análisis de varianza) corregido para el diseño desbalanceado se utilizó como modelo estadístico para la evaluación total de las características fenotípicas de la planta. Una prueba F se llevo a cabo sobre todos los parámetros medidos de todas las plantas de todos los eventos transformados con ese gen. La prueba F se llevo a cabo para revisar el efecto del gen sobre todos los eventos de transformación y verificar los efectos totales del gen, también denominado aquí un "efecto global del gen". Un valor significativo para la prueba F mostró que hay un efecto del "gen", que significa que no es solamente la presencia o la posición del gen la que origina el efecto. El umbral de significancia para un efecto de gen global real se establece en 5% del nivel de la probabilidad para la prueba F.

Para revisar un efecto de genes dentro de un evento, es decir, para un efecto específico de línea, se desarrolló una prueba T entro de cada evento utilizando conjuntos de datos de plantas transgénicas y de las plantas nulas correspondientes. Las "plantas nulas" o "segregados nulos" o "nulicigotos" son las plantas tratadas de la misma manera que la planta transgénica, pero de la cual se ha segregado el transgen. Las plantas nulas también se pueden describir como las plantas transformadas negativas homocigotas. El umbral de significancia para la prueba t se establece con un nivel de probabilidad del 10%. Los resultados para algunos eventos pueden estar por encima o por debajo de este umbral. Esto se basa en la hipótesis de que el gen podría solo tener un efecto en ciertas posiciones en el genoma, y que la ocurrencia de este efecto dependiente de posición no es común. Esta clase de efecto del gen también se denomina aquí un "efecto de línea del gen". El valor p se obtiene al comparar el valor t con la distribución t o alternativamente, al comparar el valor F con la distribución F. El valor p da entonces la prbabilidad de que la hipótesis nula es correcta (es decir, que no haya efecto del transgen).

El crecimiento vegetativo y el rendimiento de la semilla se midieron de acuerdo con los métodos descritos anteriormente. Se encontró que el peso total de las semillas, el número de semillas llenas y el índice de cosecha se incrementaron en las plantas transformadas con la secuencia codificante TAD comparada con las plantas de control sin la secuencia codificante TAD.

Los datos obtenidos en el primer experimento se confirmaron en un segundo experimento con plantas T2. Las tandas de semilla de las plantas positivas (tanto hetero como homocigotas) en T1, se seleccionaron al monitorear la expresión marcadora. Para cada evento escogido, las tandas de semilla heterocigotos se retuvieron entonces durante una evaluación T2. Dentro de cada una de las tandas de semilla crecieron un número igual de plantas positivas y negativas en el invernadero para evaluación. Se seleccionaron tres líneas que tenían el patrón de expresión correcto para análisis adicional.

Se evaluaron un número total de 120 plantas transformadas TAD en la generación T2, esto es 40 plantas por evento de las cuales 20 fueron positivas para el transgen y 20 negativas.

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Ejemplo 5

Resultados de la evaluación de plantas transgénicas transformadas con PRO0090-CDS0671

En la generación T1, 4 de 5 líneas probadas mostraron un incremento en el número de semillas llenas, el peso total de las semillas y el índice de cosecha. Para la mejor línea (línea 21), tal incremento llegó alrededor del 50% para los tres diferentes parámetros de rendimiento de semilla, cada uno con un valor p bajo (Tabla 2).

TABLA 2 Incremento en el rendimiento de semilla para la línea 21

3

El incremento medio calculado de los datos de las cuatro líneas T1 positivas y las tres líneas T2 que se tomaron para confirmación, versus las plantas nulicigotas para los diferentes parámetros de rendimiento de semilla se listan en la Tabla 3.

TABLA 3 Incremento medio en el rendimiento de semilla en la generación T1 y T2

4

Los resultados para las plantas T1 se confirmaron con las plantas T2. Aquí también, hubo un incremento para los varios parámetros (Tabla 3). Cuando los datos para las plantas T1 y T2 se combinaron y se reanalizaron, los efectos positivos para el número de semillas llenas, el peso total de las semillas y el índice de cosecha se encontraron que eran altamente significativos (ver los valores p en la Tabla 3, columna a mano derecha).

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Ejemplo 6

Uso de la invención en maíz

La invención descrita aquí también se puede utilizar en maíz. Para este objetivo, el gen TAD, o el ortólogo de maíz de éste se clona bajo control de un promotor adecuado, preferiblemente una semilla y/o un promotor preferido de plántula en un vector de transformación de planta adecuado para la transformación de maíz mediada por Agrobacterium. Tales vectores y métodos para la transformación de maíz se han descrito en la literatura (EP0604662, EP0672752, EP0971578, EP0955371, EP0558676, Ishida et al. 1996; Frame et al., 2002). Las plantas transgénicas hechas mediante estos métodos crecieron en el invernadero para la producción de semillas T1. La heredabilidad se revisa mediante el análisis de segregación de progenie. El número de copias del transgen se regisa mediante PCR en tiempo real cuantitativo y/o análisis de electrotransferencia Southern. Los niveles de expresión del transgen se determinan mediante PCR inverso y/o análisis Northern. Las líneas transgénicas con inserciones de copia única del trangen y con niveles variantes de expresión del transgen se seleccionan para la producción de semillas T2 a través de auto polinización o para cruce a germoplasma diferente. Las semillas de la progenie germinan y crecen en el campo o en un invernadero en condiciones bien adaptadas para el maíz (16:8 hr de fotoperíodo, 26-28ºC temperatura de día y 22-24ºC temperatura de noche) así como bajo condiciones deficientes en agua, deficientes en nitrógeno, y exceso de NaCl. En el caso de la auto polinización, los segregantes nulos de la misma línea parental, así como también las plantas tipo silvestre del mismo cultivar se utilizan como controles. En el caso de cruce, transgénicos, segregantes nulos y plantas tipo silvestre del mismo cultivar se cruzan a un padre escogido y las plantas F1 del cruce transgénico se comparan con las plantas F1 del segregante nulo y los cruces tipo silvestre. Las plantas de la progenie que resultan de la auto polinización o de los cruces se evalúan sobre diferente biomasa y parámetros de crecimiento, incluyendo la altura de la planta, el grosor de los tallos, el número de hojas, área por encima de la base, verdosidad de la hoja, tiempo de madurez, tiempo de floración, número de orejas, tiempo de cosecha. Las semillas de estas líneas también se revisan sobre varios parámetros, tal como el tamaño del grano, el rendimiento del grano total por planta, y la calidad del grano (contenido de almidón, contenido de proteína y contenido de aceite). Las líneas que son más significativamente mejoradas versus los controles para cualquiera de los parámetros anteriormente mencionados se seleccionan para pruebas de campo adicionales y reproducción asistida por marcador, con el objeto de transferir los rasgos transgénicos validados en el campo en el germoplasma comercial. Los métodos para probar el maíz para crecimiento y los parámetros relacionados con el rendimiento en el campo están bien establecidos en la técnica, como son las técnicas para locus específico de introgresión (tal como los locus que contienen transgen) de un germoplasma en otro.

<110> CropDesign N.V.

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<120> Plantas que tienen características de crecimiento modificadas y el método para elaborar las mismas

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<130> CD-084-PCT

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<150> EP 03075975.7

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<151> 2003-04-01

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<160> 3

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<170> Patentin versión 3.1

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<210> 1

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<211> 1284

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<212> ADN

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<213> Nicotiana tacacum

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<400> 1

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5

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<210> 2

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<211> 248

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<212> PRT

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<213> Nicotiana tabacum

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<400> 2

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6

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<210> 3

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<211> 2538

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Casete de Expresión

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<400> 3

7

Claims

1. Método para incrementar el rendimiento de una planta comparado con las correspondientes plantas tipos silvestre, que comprende la introducción y expresión en una planta de una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica una proteína TAD, o un fragmento activo de ésta, en donde dicha proteína TAD es un dominio ATPasa similar a TOB3 que tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2, y en donde dicho fragmento activo es un fragmento activo de un dominio ATPasa similar a TOB3 que tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2, y en donde dicha proteína TAD, o fragmento activo de ésta incrementa el rendimiento de la planta cuando se sobre expresa en una semilla o plántula de la planta.

2. El método de la reivindicación 1, en donde dicho rendimiento incrementado comprende el rendimiento de semilla incrementado.

3. El método de la reivindicación 2, en donde dicho rendimiento de semilla incrementado comprende por lo menos un incremento en el número de semillas llenas.

4. El método de la reivindicación 2, en donde dicho rendimiento de semilla incrementado comprende por lo menos un incremento en el peso total de la semilla.

5. El método de la reivindicación 2, en donde dicho rendimiento de semilla incrementado comprende por lo menos un incremento en el índice de cosecha.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicha secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína TAD se deriva de una planta.

7. El método o la producción de una planta transgénica que tiene un rendimiento incrementado comparado con las correspondientes plantas tipo silvestre, cuyo método comprende:

a.: ntroducir en una planta o en una célula de una planta una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína TAD o un fragmento activo de ésta, en donde dicha proteína TAD es un dominio ATPasa similar a TOB3 que tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2 y en donde dicho fragmento activo es un fragmento activo de un dominio ATPasa similar a TOB3 que tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2, y en donde dicha proteína TAD, o fragmento activo de éste incrementa el rendimiento de la planta cuando se sobre expresa en una semilla o plántula de la planta;

b.: cultivar la célula de planta bajo condiciones que promuevan la regeneración y el crecimiento de la planta madura.

8. Uso de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína TAD o un fragmento activo de ésta y/o de una proteína TAD o fragmento activo de ésta para incrementar el rendimiento de la planta, en donde dicha proteína TAD e un dominio de ATPasa similar a TOB3 que tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2, y en donde dicho fragmento activo es un fragmento activo de un dominio ATPasa similar a TOB3 que tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2, y en donde dicha proteína TAD o fragmento activo de ésta incrementa el rendimiento de la planta cuando se sobre expresa en una semilla o plántula de planta.

9. Uso de la reivindicación 8, en donde dicho rendimiento creciente comprende un rendimiento de semilla incrementado.

10. Uso de la reivindicación 9, en donde dicho rendimiento de semilla incrementado comprende por lo menos uno del número incrementado de semillas llenas, un peso total incrementado de semillas o un índice de cosecha incrementado.