ES2372938T3 - Plantas que tienen características de crecimiento modificadas y método para preparar las mismas. - Google Patents

Abstract

Método para mejorar la producción de semillas de una planta con respecto a plantas de tipo natural correspondientes, comprendiendo dicho método: - introducir y sobreexpresar en una planta o célula vegetal una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica para una proteína GRUBX, seleccionándose dicha secuencia de ácido nucleico del grupo: - una secuencia de ácido nucleico tal como se representa por una cualquiera de SEQ ID NO:1, 3, 6; - un ácido nucleico que codifica para un polipéptido tal como se representa por una cualquiera de SEQ ID NO: 2, 4, 7; - un ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene al menos el 80% de identidad de secuencia con una cualquiera de SEQ ID NO: 2, 4, 7, teniendo dicho polipéptido acción reguladora de ubiquitina dentro de la ruta de ubiquitinación - cultivar la planta o célula vegetal en condiciones que promueven el crecimiento de la planta.

Description

Plantas que tienen características de crecimiento modificadas y método para preparar las mismas

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para mejorar las características de crecimiento de plantas. Más específicamente, la presente invención se refiere a un método para mejorar la producción de semillas introduciendo y sobreexpresando un ácido nucleico que codifica para una GRUBX en una planta o célula vegetal y cultivando la planta o célula vegetal en condiciones que promueven el crecimiento de la planta.

Dado el crecimiento constante de la población mundial, y la disminución del área de tierra disponible para la agricultura, sigue siendo un objetivo importante de la investigación agrícola mejorar la eficacia de la agricultura y aumentar la diversidad de plantas en la horticultura. Los medios convencionales para mejoras hortícolas y en cosechas utilizan técnicas de cría selectiva para identificar plantas que tienen características deseadas. Sin embargo, tales técnicas de cría selectiva tienen varios inconvenientes, concretamente que estas técnicas normalmente son laboriosas y dan como resultado plantas que a menudo contienen componentes genéticos heterogéneos que no siempre dan como resultado que se trasmita el rasgo deseado de las plantas originales. Además, las especies donadoras adecuadas para proporcionar un rasgo deseado pueden ser escasas. Los avances en biología molecular han permitido a la humanidad manipular el germoplasma de animales y plantas. La modificación por ingeniería genética de plantas conlleva el aislamiento y la manipulación del material genético (normalmente en forma de ADN o ARN) y la introducción posterior del material genético en una planta. Tal tecnología ha conducido al desarrollo de plantas que tienen diversos rasgos económicos, agronómicos u hortícolas mejorados. Rasgos de interés económico particular son características de crecimiento tales como alta producción. Producción se define normalmente como el producto medible de valor económico de un cultivo. Esto puede definirse en términos de cantidad y/o calidad. La producción de un cultivo se ve influida de manera adversa por el estrés típico al que se ven sometidos las plantas o los cultivos. Tales estreses incluyen estreses abióticos, tales como estreses de temperatura provocados por temperaturas altas o bajas atípicas; estreses provocados por deficiencia de nutrientes; estreses provocados por una falta de o exceso de agua (sequía, inundación), estreses provocados por productos químicos tales como fertilizantes o insecticidas. Los estreses típicos también incluyen estreses bióticos, que pueden imponerse a las plantas por otras plantas (malas hierbas, o los efectos de plantación de alta densidad), por plagas de animales (incluyendo estreses provocados por el pastoreo), y por patógenos. La producción de un cultivo no sólo puede aumentarse combatiendo uno o más de los estreses a los que se ve sometido el cultivo o la planta, sino que también puede aumentarse modificando los mecanismos de crecimiento inherentes de una planta. Los mecanismos de crecimiento inherentes de una planta se controlan a varios niveles y mediante diversos procesos metabólicos. Un proceso de este tipo es el control de los niveles de proteína en una célula mediante la degradación de proteínas mediada por ubiquitina.

Ubiquitinación se refiere a una modificación de proteínas mediante conjugación a moléculas de ubiquitina. El término ubiquitinación a menudo se extiende a procesos que median la unión de proteínas de ubiquitina o de proteínas que imitan la función de la ubiquitina. La ubiquitinación es una herramienta versátil para que las células eucariotas controlen la estabilidad, función y la localización subcelular de las proteínas. Este mecanismo desempeña un papel central en degradación de proteínas, control del ciclo celular, respuestas al estrés, reparación del ADN, transducción de señales, regulación de la transcripción y tráfico vesicular. Puesto que la degradación de proteínas mediada por ubiquitina está en las bases de muchos procesos celulares, está altamente regulada y requiere alta especificidad de sustrato y amplia diversidad en efectores posteriores. Se conocen varias proteínas de unión a ubiquitina. Estas proteínas tienen a menudo una arquitectura de dominios modular. Por ejemplo, las proteínas de unión a ubiquitina combinan normalmente un dominio de unión a ubiquitina con un dominio de efector variable. Luego existen otras que no contienen un dominio de unión a ubiquitina, pero tiene una estructura terciaria similar a ubiquitina y por tanto pueden imitar ciertos aspectos de la ubiquitinación (dominios similares a ubiquitina).

El número de dominios y motivos relacionados con ubiquitina presentes en ubiquitina y proteínas similares a ubiquitina está creciendo a medida que está disponible más información sobre secuencias del genoma. Algunos prototipos de esos dominios son por ejemplo UBA, UBD, UIM y UBX (véase por ejemplo la base de datos Pfam; Bateman et al., Nucleic Acids Research 30(1):276-280 (2002)). El dominio UBX es una secuencia de aproximadamente 80 residuos de aminoácido de longitud, es de función desconocida y está presente en proteínas de diversos organismos. La mayoría de estas proteínas pertenecen a una de cinco familias conservadas en la evolución mostradas a modo de ejemplo por las proteínas humanas FAF1, p47, Y33K, REP8 y UBXD1 (Buchberger et al. (2001) J. Mol. Biol. 307, 17-24; Carim-Todd et al. (2001) Biochim. Biophys. Acta 1517, 298-301). Normalmente, el dominio UBX se sitúa en el extremo C-terminal de una proteína.

Las pruebas estructurales sugieren una función del dominio UBX en procesos relacionados con ubiquitina; en particular el dominio UBX puede estar implicado en interacciones proteína-proteína. Se pronostica habitualmente que proteínas que comprenden dominios UBX están presentes principalmente en el citoplasma, aunque también se han notificado otras localizaciones subcelulares. Por ejemplo, la fosforilación, que es una modificación de proteínas específica usada para regular la actividad de muchas proteínas, se ha mostrado que también influye en el transporte al núcleo de FAF-1 (Olsen et al. (2003) FEBS Lett. 546, 218-222.). En resumen, se ha propuesto que proteínas que contienen UBX animales podrían estar implicadas en el aumento de la expresión de genes relacionados con apoptosis, ciclo celular o direccionamiento de proteínas para degradación.

5 En Arabidopsis, planta cuyo genoma se ha secuenciado completamente, existen al menos 15 proteínas que contienen UBX. Pueden clasificarse según la similitud de secuencia en los grupos FAF1, p47, Y33K y UBXD1, sólo el grupo correspondiente a REP8 parece no estar presente en plantas (véase la figura 1). Como en el reino animal, los dominios UBX en proteínas vegetales están presentes en combinación con otros dominios, como por ejemplo SEP, G6PD, PUG o dedos de zinc. Se han descrito proteínas que contienen UBX y la estructura de dominios de estas proteínas (véase Buchberger (2002) Trends Cell Biol. 12, 216-221) y pueden identificarse mediante busqueda usando bases de datos especializadas tales como SMART (Schultz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857-5864; Letunic et al. (2002) Nucleic Acid Res 30, 242-244).

Los dominios PUG (en Peptide:N-Glicanasas and other supuesta nuclear UBX-domain-containing proteins; Doerks et al. (2002) Genome Research 12, 47-56) se producen conjuntamente en proteínas con dominios que son centrales

15 para proteolisis mediada por ubiquitina, incluyendo dominios UBX (en mamíferos y plantas), UBA (en plantas) y UBC (en Plasmodium). Se cree que las proteínas que contienen PUG tales como PNGasas desempeñan un papel en la respuesta de proteínas no plegadas, un sistema de vigilancia de control de calidad del retículo endoplasmático (RE) que distingue proteínas aberrantes de proteínas correctamente plegadas. En algunos casos, se ha mostrado que estas proteínas mal plegadas y/o no plegdas se degradan mediante un denominado mecanismo de degradación asociado al RE, que implica el sistema ubiquitina-proteasoma (Suzuki et al. (2000) J. Cell Biol. 149, 1039-1052). También están presentes formas divergentes de dominios PUG en cinasas del tipo IRE1p que se sabe que funcionan en los estadios iniciales de la respuesta de proteínas no plegadas (Shamu y Walter (1996) EMBO J. 15, 3028-3039).

Una proteína de Arabidopsis recientemente caracterizada que comprende un dominio UBX es PUX1 (Rancour et al.

25 (2004) J. Biol. Chem., publicación en línea 10.1074/jbc.M405498200). PUX1 es un gen único en Arabidopsis y probablemente se expresa de manera ubicua en plantas. Se mostró que la proteína era un inhibidor no competitivo de la ATPasa CDC48 de tipo AAA. PUX1 se asocia a través de su dominio UBX con la forma no hexamérica de CDC48, pero no con la CDC48 hexamérica. Se postula que PUX1 facilita el desensamblaje de CDC48 hexamérica activa y que se requiere el dominio N-terminal de la proteína para este proceso. Las plantas deficientes en pux1 mostraron un desarrollo más rápido hasta la madurez pero no tenían anomalías morfológicas macroscópicas. Además de PUX1, se mostro que otras dos proteínas que comprenden dominios UBX, PUX2 y PUX3, interaccionan con CDC48 (Rancour et al., 2004). PUX2 (At2g01650) se dio a conocer anteriormente en el documento WO 03/085115 (secuencia de gen y proteína descritas como SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 respectivamente).

Se ha encontrado ahora que introducir y sobreexpresar un ácido nucleico que codifica para una proteína GRUBX

35 (proteína que comprende el dominio UBX relacionado con el crecimiento), y en particular un ácido nucleico que codifica para la proteína GRUBX mostrada a modo de ejemplo por SEQ ID NO: 2, en una planta proporciona plantas que tienen un índice de cosecha mejorado con respecto a plantas de tipo natural correspondientes. Por tanto, según una primera realización de la presente invención se proporciona un método para mejorar la producción de semillas de una planta, que comprende introducir y sobreexpresar en una planta una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína GRUBX, seleccionándose dicha secuencia de ácido nucleico del grupo:

-

una secuencia de ácido nucleico tal como se representa por una cualquiera de SEQ ID NO:1, 3, 6;

-

un ácido nucleico que codifica para un polipéptido tal como se representa por una cualquiera de SEQ ID NO: 2, 4, 7;

-

un ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene al menos el 80% de identidad de secuencia con

45 respecto a una cualquiera de SEQ ID NO: 2, 4, 7, teniendo dicho polipéptido acción reguladora de ubiquitina dentro de la ruta de ubiquitinación y cultivar la planta o célula vegetal en condiciones que promueven el crecimiento de la planta. Opcionalmente, pueden seleccionarse plantas que tienen una producción de semillas mejorada.

La recombinación homóloga permite la introducción en un genoma de un ácido nucleico seleccionado en una posición seleccionada definida. La recombinación homóloga es una tecnología convencional usada de manera rutinaria en las ciencias biológicas para organismos inferiores tales como levadura y el musgo Physcomitrella. Se han descrito métodos para realizar recombinación homóloga en plantas no sólo para plantas modelo (Offringa et al. (1990) EMBO J. 9, 3077-3084) sino también para plantas de cultivo, por ejemplo arroz (Terada et al., (2002) Nature Biotechnol. 20, 1030-1034; o lida y Terada (2004) Curr. Opin. Biotechnol. 15, 132-138). El ácido nucleico que va a 55 dirigirse (que puede ser una molécula de ácido nucleico GRUBX o variante de la misma tal como se definió anteriormente en el presente documento) no necesita dirigirse al locus de un gen GRUBX, sino que puede introducirse en, por ejemplo, regiones de alta expresión. El ácido nucleico que va a dirigirse puede ser un alelo

mejorado usado para sustituir el gen endógeno o puede introducirse en adición al gen endógeno.

El ácido nucleico puede introducirse en una planta mediante, por ejemplo, transformación.

El término proteína GRUBX, tal como se define en el presente documento, se refiere a un ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene al menos el 80% de identidad de secuencia con respecto a una cualquiera de SEQ ID NO: 2, 4, 7, teniendo dicho polipéptido acción reguladora de ubiquitina dentro de la ruta de ubiquitinación, y opcionalmente también un dominio de dedos de zinc. Preferiblemente, la proteína GRUBX está relacionada estructuralmente con la proteína UBXD1 humana (SPTrEMBL AAH07414). Preferiblemente, la proteína GRUBX es de una planta. Preferiblemente de manera adicional, la proteína GRUBX es de la familia de Solanaceae, más preferiblemente la GRUBX es una proteína de Nicotiana tabacum, lo más preferiblemente la GRUBX es una proteína tal como se representa por SEQ ID NO: 2 o un homologo, derivado o fragmento activo de la misma, homólogos, derivados o fragmentos activos que tienen actividad biológica similar a la de SEQ ID NO: 2. Sin embargo, debería entenderse que podría usarse proteínas GRUBX de las plantas monocotiledóneas igualmente bien en los métodos de la presente invención, incluyendo proteínas GRUBX de Zea mays, Saccharum officinarum (SEQ ID NO 4), Oryza sativa (SEQ ID NO 7), Triticum sp., Hordeum sp., y Sorghum sp, puesto que estas secuencias están relacionadas con SEQ ID NO 2 (véase la figura 1b).

Una de las actividades de una proteína GRUBX es aumentar la producción de semillas, en particular aumentar el índice de cosecha, cuando un ácido nucleico que codifica para tal proteína GRUBX se expresa en arroz bajo el control de un promotor de prolamina tal como se usa en la presente invención. Ventajosamente, una proteína GRUBX puede interaccionar con proteínas CDC48 vegetales en condiciones descritas en Rancour et al. (2004).

Se analizaron las proteínas GRUBX de Nicotiana tabacum con la herramienta SMART y se usaron para examinar la base de datos Pfam (versión 11.0, noviembre de 2003; Bateman et al. (2002) Nucl. Acids Res. 30, 276-280) e InterPro (versión 7.0, 22 de julio de 2003; Mulder et al. (2003) Nucl. Acids. Res. 31, 315-318). Las proteínas GRUBX comprenden un dominio UBX (PF00789, SM00166, IPR001012) y un dominio PUG (SM00580, IPR006567). El dominio UBX, tal como se define en InterPro, se encuentra en proteínas reguladoras de ubiquitina, que son miembros de la ruta de ubiquitinación, así como varias otras proteínas incluyendo FAF-1 (factor 1 asociado a FAS), la proteína de reproducción Rep-8 humana y varias proteína hipotéticas de levadura. En Arabidopsis, existen aproximadamente veinte proteínas que se pronostica que comprenden este dominio. El dominio PUG se encuentra en proteínas cinasas, N-glicanasas y otras proteínas nucleares en eucariotas y se postula que está implicado en interacciones proteína-proteína (para una revisión véase Suzuki & Lennarz (2003) Biochem Biophys Res Commun. 302,1-5 y Biochem Biophys Res Commun. 303, 732) y en unión a ARN (Doerks et al., 2002). A menudo se encuentran dominios PUG junto con dominios UBA o UBX en proteínas de Arabidopsis (Doerks et al, 2002). Se proporciona una secuencia consenso para los dominios UBX y PUG, tal como se define en la base de datos SMART (software versión 4.0, actualización de la base de datos de secuencias del 15 de septiembre de 2003) en la figura 2a; la figura 2b muestra los dominios UBX y PUG de respectivamente SEQ ID NO 2 y SPTrEMBL Q9ZU93; la figura 2c muestra una alineación de BLAST de estas 2 proteínas; y las figuras 2d y 2e presentan una alineación entre SEQ ID NO 2 y SEQ ID NO 4, y SEQ ID NO 4 y SEQ ID NO 7, respectivamente. Se indican los dominios PUG y UBX.

Opcionalmente, puede estar presente un dominio de dedos de zinc en la proteína GRUBX. Los dominios de dedos de zinc, tal como se define en InterPro, son estructuras proteicas de unión a ácido nucleico que se identificaron por primera vez en el factor de transcripción de Xenopus laevis TFIIIA. Estos dominios se han encontrado desde entonces en numerosas proteínas de unión a ácido nucleico. Un dominio de dedo de zinc está compuesto por de 25 a 30 residuos de aminoácido incluyendo 2 residuos Cys conservados y 2 His conservados en un motivo de tipo C-2-C-12-H-3-H. Los 12 residuos que separan la segunda Cys y la primera His son principalmente polares y básicos, lo que indica que esta región está implicada en la unión a ácido nucleico. El motivo de dedo de zinc es un dominio de autoplegamiento, inusitadamente pequeño, en el que el Zn es un componente crucial de su estructura terciaria. Todos los dominios de dedos de zinc unen un átomo de Zn en una red tetrahédrica dando como resultado la formación de una proyección similar a un dedo que puede interaccionar con los nucleótidos en el surco mayor del ácido nucleico. El Zn se une a los residuos de Cys y His conservados. Se ha encontrado que los dedos se unen a aproximadamente 5 pares de bases de ácido nucleico que contiene tramos cortos de residuos de guanina, y tienen la capacidad de unirse tanto a ARN como a ADN. El dedo de zinc puede representar por tanto la proteína de unión a ácido nucleico original. También se ha sugerido que un dominio con Zn centrado podría usarse en una interacción de proteínas, por ejemplo en la proteína cinasa C. Muchas clases de dedos de zinc se caracterizan según el número y las posiciones de los residuos de histidina y cisteína implicados en el posicionamiento espacial del átomo de zinc. En la primera clase que va a caracterizarse, denominada C2H2 (IPR007087), el primer par de residuos de coordinación de zinc consiste en cisteínas, mientras que el segundo par son histidinas. Otro dominio de dedos de zinc (IPR006642) puede ser del tipo encontrado en la proteína de Saccharomyces cerevisiae Rad18. En este caso también, el dominio de dedos de zinc es una supuesta secuencia de unión a ácido nucleico. El dominio de dedo de zinc opcional en la proteína GRUBX tal como se define en el presente documento no se limita sin embargo al tipo C2H2 o Rad18, sino que puede ser cualquier tipo de dominio de dedos de zinc.

La expresión gen/ácido nucleico GRUBX, tal como se define en el presente documento, se refiere a cualquier ácido nucleico que codifica para una proteína GRUBX tal como se definió anteriormente, o el complemento de la misma. El ácido nucleico puede derivarse (o bien directa o bien indirectamente (si se modifica posteriormente)) de cualquier fuente natural o artificial siempre que el ácido nucleico, cuando se expresa en una planta, conduzca a la expresión de un gen/ácido nucleico GRUBX aislado. El ácido nucleico puede aislarse de una fuente microbiana, tal como bacterias, levaduras u hongos, o de una fuente vegetal, de algas o animal (incluyendo humana). Preferiblemente el ácido nucleico se deriva de un organismo eucariota. Preferiblemente el ácido nucleico GRUBX es de origen vegetal, preferiblemente de manera adicional de origen de plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas, más preferiblemente el ácido nucleico GRUBX codifica para una proteína GRUBX de la familia de Solanaceae, además preferiblemente el ácido nucleico GRUBX es una secuencia de ácido nucleico de Nicotiana tabacum, lo más preferiblemente el ácido nucleico GRUBX es una secuencia de ácido nucleico tal como se representa por SEQ ID NO: 1, y también abarca ácidos nucleicos que codifican para una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2. Alternativamente, el ácido nucleico que codifica para una proteína GRUBX puede derivarse de la familia de la Poaceae, preferiblemente de Oryza sativa. Este ácido nucleico puede modificarse sustancialmente de su forma nativa en composición y/o entorno genómico a través de manipulación humana deliberada. La secuencia de ácido nucleico preferiblemente es una secuencia de ácido nucleico homóloga, es decir una secuencia de ácido nucleico estructural y/o funcionalmente relacionada, obtenida preferiblemente de una planta, ya sea de las misma especie vegetal o diferente.

La secuencia representada por SEQ ID NO: 6 era hasta la fecha desconocida.

La secuencia representada por SEQ ID NO: 4 se ensambló a partir de 4 secuencias EST (CA154270, CA144028, BQ535511 & CA184742) y era hasta la fecha desconocida. Los métodos según la presente invención también pueden ponerse en práctica introduciendo en una planta al menos una parte de un cromosoma (natural o artificial) (tal como un cromosoma artificial bacteriano (BAC)), cromosoma que contiene al menos una secuencia de ácido nucleico/gen que codifica para una proteína GRUBX tal como se definió anteriormente (tal como SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO 3), preferiblemente junto con uno o más miembros de la familia génica relacionada y/o secuencia(s) de ácido nucleico que codifica(n) para proteínas reguladoras para la expresión y/o actividad de GRUBX. Por tanto, según un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un método para mejorar la producción de semillas de plantas introduciendo en una planta al menos una parte de un cromosoma que comprende al menos un gen/ácido nucleico que codifica para una proteína GRUBX.

Según otro aspecto de la presente invención, puede aprovecharse el ácido nucleico que codifica para una proteína GRUBX en programas de cría. La secuencia de ácido nucleico puede estar en un cromosoma, o una parte del mismo, que comprende al menos la secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína GRUBX y preferiblemente también uno o más miembros de la familia relacionados. En un ejemplo de un programa de cría de este tipo, se identifica un marcador de ADN que puede estar genéticamente ligado a un gen que puede modular la expresión de un ácido nucleico que codifica para una proteína GRUBX en una planta, gen que puede ser un gen que codifica para la propia proteína GRUBX o cualquier otro gen que puede influir directa o indirectamente en la expresión del gen que codifica para una proteína GRUBX y/o actividad de la propia proteína GRUBX. Este marcador de ADN puede usarse entonces en programas de cría para seleccionar plantas que tienen una producción de semillas mejorada.

La presente invención por tanto se extiende al uso de una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína GRUBX en programas de cría.

Según la presente invención, se prevé el aumento o la potenciación de la expresión de un ácido nucleico. Están bien documentados en la técnica métodos para obtener el aumento o la potenciación de la expresión de genes o productos genéticos e incluyen, por ejemplo, sobreexpresión dirigida por un promotor (fuerte), el uso de potenciadores de la transcripción o potenciadores de la traducción. Pueden introducirse ácidos nucleicos aislados que sirven como elementos promotores o potenciadores en una posición apropiada (normalmente en el sentido de 5’) de una forma no hereróloga de un polinucleótido de modo que se regule por incremento la expresión de un ácido nucleico GRUBX tal como se definió anteriormente. Por ejemplo, pueden alterarse promotores endógenos in vivo mediante mutación, deleción, y/o sustitución (véase Kmiec, patente estadounidense n.º 5.565.350; Zarling et al., PCT/US93/03868), o pueden introducirse promotores aislados en una célula vegetal en la orientación y distancia apropiadas de un gen de la presente invención de modo que se controle la expresión del gen. Preferiblemente, los ácidos nucleicos útiles en la presente invención se sobreexpresan en una planta o célula vegetal. El término sobreexpresión tal como se usa en el presente documento significa cualquier forma de expresión que es adicional al nivel de expresión de tipo natural original. Preferiblemente, el ácido nucleico que va a introducirse en la planta y/o el ácido nucleico que va a sobreexpresarse en las plantas está en una dirección sentido con respecto al promotor al que está operativamente unido. Preferiblemente, el ácido nucleico que va a sobreexpresarse codifica para una proteína GRUBX, preferiblemente de manera adicional la secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína GRUBX se aísla de una planta dicotiledónea, preferiblemente de la familia Solanaceae, preferiblemente de manera adicional en la que la secuencia se aísla de Nicotiana tabacum, lo más preferiblemente la secuencia de ácido nucleico es tal como se representa por SEQ ID NO: 1, o codifica para una secuencia de aminoácidos tal como se representa por SEQ ID NO: 2. Alternativamente, la secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína GRUBX es tal como se representa por MIPS No. At2g01650, SEQ ID NO: 3 ó 6, o codifica para una secuencia de aminoácidos tal como se representa por Q9ZU93, SEQ ID NO: 4 ó 7. Debe observarse que la aplicabilidad de la invención no descansa en el uso del ácido nucleico representado por SEQ ID NO: 1, ni sobre la secuencia de ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, sino que pueden usarse otras secuencias

5 de ácido nucleico en los métodos de la presente invención. En particular, los ácidos nucleicos útiles en los métodos de la presente invención codifican para proteínas que tienen al menos el 80% de identidad de secuencia con respecto a una cualquiera de SEQ ID NO: 2, 4, 7, teniendo dicho polipéptido acción reguladora de ubiquitina dentro de la ruta de ubiquitinación, y Opcionalmente también un dominio de dedos de zinc.

Se transforman las plantas con un vector que comprende la secuencia de interés (es decir, la secuencia de ácido

10 nucleico que puede modular la expresión de ácido nucleico que codifica para una proteína GRUBX), secuencia que está operativamente unida a una o más secuencias de control (al menos un promotor). Las expresiones “elemento regulador”, “secuencia de control” y “promotor” se usan todas en el presente documento de manera intercambiable y han de tomarse en un contexto amplio para referirse a secuencias de ácido nucleico reguladoras que pueden efectuar la expresión de las secuencias a las que están ligadas. Se abarcan por las expresiones mencionadas

15 anteriormente secuencias reguladoras de la transcripción derivadas de un gen genómico eucariota clásico (incluyendo la caja de TATA que se requiere para la iniciación precisa de la transcripción, con o sin una secuencia de caja CCAAT) y elementos reguladores adicionales (es decir, silenciadores, potenciadores y secuencias de activación en el sentido de 5’) que alteran la expresión génica en respuesta a estímulos del desarrollo y/o externos, o de una manera específica de tejido. También se incluye dentro de la expresión una secuencia reguladora de la

20 transcripción de un gen procariota clásico, en cuyo caso puede incluir una secuencia de caja -35 y/o secuencias reguladoras de la transcipción de caja -10. La expresión “elemento regulador” también abarca una molécula de fusión sintética o derivado que confiere, activa o potencia la expresión de una molécula de ácido nucleico en una célula, tejido u órgano. La expresión “operativamente unido” tal como se usa en el presente documento se refiere a un ligamiento funcional entre la secuencia promotora y el gen de interés, de modo que la secuencia promotora

25 puede iniciar la transcripción del gen de interés. Ventajosamente, puede usarse cualquier tipo de promotor para dirigir la expresión de la secuencia de ácido nucleico dependiendo del resultado deseado. Los promotores adecuados incluyen promotores que son activos en plantas monocotiledóneas tales como arroz o maíz.

La secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína GRUBX está operativamente unida a un promotor preferido en semillas. La expresión “preferido en semillas” tal como se define en el presente documento se refiere a 30 un promotor que se expresa predominantemente en tejido de semillas, pero no necesariamente de manera exclusiva en este tejido. La expresión “preferido en semillas” abarca todos los promotores que son activos en semillas. Tejido de semillas abarca cualquier parte de la semilla incluyendo el endospermo, aleurona o embrión. Preferiblemente, el promotor preferido en semillas es un promotor de prolamina, o un promotor de potencia similar y/o un promotor con un patrón de expresión similar. Lo más preferiblemente, el promotor de prolamina es tal como se representa por los

35 nucleótidos 1-654 en la casete de expresión de SEQ ID NO: 5. Pueden analizarse la potencia del promotor y/o el patrón de expresión por ejemplo acoplando el promotor a un gen indicador y sometiendo a ensayo la expresión del gen indicador en diversos tejidos de la planta. Un gen indicador adecuado bien conocido por un experto en la técnica es beta-glucuronidasa bacteriana. Se presentan ejemplos de otros promotores preferidos de semillas en la tabla 1, y estos promotores son útiles para los métodos de la presente invención.

40 TABLA 1: Ejemplos de promotores preferidos de semillas para su uso en la realización de la presente invención:

FUENTE DEL GEN

PATRÓN DE EXPRESIÓN REFERENCIA

genes específicos de semillas

semilla Simon, et al., Plant Mol. Biol. 5: 191, 1985; Scofield, et al., J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987.; Baszczynski, et al., Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990.

albúmina de nuez de Brasil

semilla Pearson, et al., Plant Mol. Biol. 18: 235-245, 1992.

legúmina

semilla Ellis, et al., Plant Mol. Biol. 10: 203-214, 1988.

glutelina (arroz)

semilla Takaiwa, et al., Mol. Gen. Genet. 208: 15-22, 1986; Takaiwa, et al., FEBS Letts. 221: 43-47, 1987.

zeína

semilla Matzke et al Plant Mol Biol, 14(3):323-32 1990

napA

semilla Stalberg, et al, Planta 199: 515-519, 1996.

glutenina-1 de APM y BPM de trigo

endospermo Mol Gen Genet 216:81-90, 1989; NAR 17:4612, 1989

SPA de trigo

semilla Albani et al, Plant Cell, 9: 171-184, 1997

(continuación)

FUENTE DEL GEN

PATRÓN DE EXPRESIÓN REFERENCIA

a,1,y-gliadinas de trigo

endospermo EMBO J. 3:1409-15, 1984

promotor de Itr1 de cebada

endospermo

hordeína B1, C, D, de cebada

endospermo Theor Appl Gen 98:1253-62, 1999; Plant J 4:343-55, 1993; Mol Gen Genet 250: 750-60, 1996

DOF de cebada

endospermo Mena et al, The Plant Journal, 116(1): 53-62, 1998

blz2

endospermo Documento EP99106056.7

promotor sintético

endospermo Vicente-Carbajosa et al., Plant J. 13: 629-640, 1998.

prolamina de arroz NRP33

endospermo Wu et al, Plant Cell Physiology 39(8) 885-889, 1998

a-globulina de arroz Glb-1

endospermo Wu et al, Plant Cell Physiology 39(8) 885-889, 1998

OSH1 de arroz

embrión Sato et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117-8122, 1996

a-globulina de arroz REB/OHP-1

endospermo Nakase et al. Plant Mol. Biol. 33: 513-522, 1997

ADP-glucosa de arroz PP

endospermo Trans Res 6:157-68, 1997

familia génica ESR de maíz

endospermo Plant J 12:235-46, 1997

y-kafirina de sorgo

endospermo PMB 32:1029-35, 1996

KNOX

embrión Postma-Haarsma et al, Plant Mol. Biol. 39:25771, 1999

oleosina de arroz

embrión y aleurona Wu et al, J. Biochem., 123:386, 1998

oleosina de girasol

semilla (embrión y semilla seca) Cummins, et al., Plant Mol. Biol. 19: 873-876, 1992

PRO0117, supuesta proteína ribosómica 40S de arroz

débil en endospermo Documento WO2004/070039

PRO0135, alfa-globulina de arroz

fuerte en endospermo

PRO013, alanina aminotransferasa de arroz

débil en endospermo

PRO0147, inhibidor de tripsina ITR1 (cebada)

débil en endospermo

PRO0151, WSI18 de arroz

embrión + estrés Documento WO2004/0700

PRO017, RAB21 de arroz

embrión + estrés Documento WO2004/070039

PRO0218, oleosina de arroz 18kd

aleurona + embrión

También puede añadirse una secuencia de intrón a la región no traducida en 5’ o la secuencia codificante de la

5 secuencia codificante parcial para aumentar la cantidad del mensajero maduro que se acumula en el citosol. La inclusión de un intrón que puede cortarse y empalmarse en la unidad de transcripción en constructos de expresión tanto vegetales como animales ha mostrado que aumenta la expresión génica tanto a los niveles de ARNm como de proteínas hasta 1000 veces (Buchman y Berg, Mol. Cell Biol. 8, 4395-4405 (1988); Callis et al., Genes Dev. 1, 11831200 (1987)). Tal potenciación por intrón de la expresión génica normalmente es máxima cuando se coloca cerca

10 del extremo 5’ de la unidad de transcripción. Se conoce en la técnica el uso de los intrones de maíz intrón Adh1-S 1, 2, y 6, el intrón Bronze-1. Véase generalmente, The Maize Handbook, capítulo 116, Freeling y Walbot, Eds., Springer, N.Y. (1994).

La propia proteína GRUBX y/o el propio ácido nucleico GRUBX puede introducirse directamente en una célula vegetal o en la propia planta (incluyendo introducción en un tejido, órgano o cualquier otra parte de la planta). Según 15 una característica preferida de la presente invención, el ácido nucleico se introduce preferiblemente en una planta

mediante transformación. El ácido nucleico es preferiblemente tal como se representa por SEQ ID NO: 1, o es un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2. Alternativamente, la secuencia de ácido nucleico es tal como se representa por cualquiera de MIPS No. At2g01650, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO 6. La secuencia de aminoácidos puede ser alternativamente una secuencia tal como se representa por cualquiera de SPTrEMBL Q9ZU93, n.º de registro de GenBank AAR01744, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO 7.

El término “transformación” tal como se le hace referencia en el presente documento abarca la transferencia de un polinucleótido exógeno a una célula huésped, independientemente del método usado para la transferencia. El tejido vegetal que puede someterse a la propagación clonal posterior, ya sea por organogénesis o por embriogénesis, puede transformarse con un constructo genético de la presente invención y regenerarse una planta completa a partir del mismo. El tejido particular elegido variará dependiendo de los sistemas de propagación clonal disponibles para, y que mejor se adapten a, la especie particular que está transformándose. Dianas tisulares a modo de ejemplo incluyen discos de hojas, polen, embriones, cotiledones, hipocotilos, megagametofitos, tejido calloso, tejido meristemáticamente existente (por ejemplo, meristemo apical, yemas axilares y meristemos radiculares), y tejido de meristemo inducido (por ejemplo, meristemo de cotiledón y meristemo de hipocótilo). El polinucleótido puede introducirse de manera transitoria o estable en una célula huésped y puede mantenerse sin integrarse, por ejemplo, como un plásmido. Alternativamente, puede integrarse en el genoma del huésped. La célula vegetal transformada resultante puede usarse entonces para regenerar una planta transformada de una manera conocida por los expertos en la técnica.

La transformación de una especie vegetal es ahora una técnica bastante rutinaria. Ventajosamente, puede usarse cualquiera de varios métodos de transformación para introducir el gen de interés en una célula antecesora adecuada. Los métodos de transformación incluyen el uso de liposomas, electroporación, productos químicos que aumentan la captación de ADN libre, inyección del ADN directamente en la planta, bombardeo con pistola de partículas, transformación usando virus o polen y microproyección. Los métodos pueden seleccionarse del método de calcio/polietilenglicol para protoplastos (Krens, F.A. et al., 1882, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., junio de 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373); electroporación de protoplastos (Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol 3, 10991102); microinyección en material vegetal (Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen Genet 202, 179-185); bombardeo con partículas recubiertas con ARN o ADN (Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70) infección con virus (no integrativos) y similares. Se producen preferiblemente plantas de arroz transgénicas que sobreexpresan un gen GRUBX por medio transformación mediada por Agrobacterium usando cualquiera de los métodos bien conocidos para la transformación de arroz, tal como se describe en cualquiera de los siguientes: solicitud de patente europea publicada EP 1198985 A1, Aldemita y Hodges (Planta, 199, 612-617, 1996); Chan et al. (Plant Mol. Biol. 22 (3) 491-506, 1993), Hiei et al. (Plant J. 6 (2) 271-282, 1994). En el caso de transformación de maíz, el método preferido es tal como se describe en

o bien Ishida et al. (Nat. Biotechnol. 1996 Jun; 14(6): 745-50) o bien Frame et al. (Plant Physiol. Mayode 2002; 129(1): 13-22).

Generalmente tras la transformación, se seleccionan células vegetales o agrupaciones celulares para detectar la presencia de uno o más marcadores que se codifican por genes expresables en plantas transferidos conjuntamente con el gen de interés, tras lo que se regenera el material transformado dando una planta completa.

Tras la transferencia y regeneración del ADN, pueden evaluarse las plantas supuestamente transformadas, por ejemplo usando análisis de tipo Southern, para detectar la presencia del gen de interés, el número de copias y/o la organización genómica. Alternativa o adicionalmente, los niveles de expresión del ADN recién introducido pueden monitorizarse usando análisis de tipo Northern y/o Western, siendo ambas técnicas bien conocidas por los expertos habituales en la técnica.

Las plantas transformadas generadas pueden propagarse mediante una variedad de medios, tales como mediante propagación clonal o técnicas de cría clásicas. Por ejemplo, una planta transformada de primera generación (o T1) pueden autofecundarse para dar transformantes de segunda generación (o T2) homocigotos, y las plantas T2 propagarse adicionalmente a través de técnicas de cría clásicas.

Los organismos transformados generados pueden tomar una variedad de formas. Por ejemplo, pueden ser quimeras de células transformadas y células no transformadas; transformantes clonales (por ejemplo, todas las células transformadas para que contengan el casete de expresión); injertos de tejidos transformados y no transformados (por ejemplo, en plantas, un rizoma transformado injertado en un esqueje no transformado). La presente invención se extiende claramente a cualquier célula vegetal o planta producida por cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, y a todas las partes de la planta, propágulos y progenie de la misma. El término “planta” tal como se usa en el presente documento abarca plantas completas, antecesores y progenie de las plantas, partes de la planta, células vegetales, tejidos y órganos. El término “planta” también abarca por tanto cultivos en suspensión, embriones, regiones meristemáticas, tejido calloso, hojas, flores, frutos, semillas, raíces (incluyendo rizomas y tubérculos), brotes, bulbos, tallos, gametofitos, esporofitos, polen y microsporas. Las plantas que son particularmente útiles en los métodos de la invención incluyen algas, helechos y todas las plantas que pertenecen a la superfamilia Viridiplantae, en particular plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas, incluyendo pasto o leguminosas forrajeras, plantas ornamentales, cultivos alimenticios, árboles o arbustos seleccionados de la lista que

comprende Abelmoschus spp., Acer spp., Actinidia spp., Agropyron spp., Allium spp., Amaranthus spp., Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arabidopsis thaliana, Arachis spp, Artocarpus spp., Asparagus officinalis, Avena sativa, Averrhoa carambola, Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp., Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Capsicum spp., Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carthamus 5 tinctorius, Carya spp., Castanea spp., Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Cola spp., Colocasia esculenta, Corylus spp., Crataegus spp., Cucumis spp., Cucurbita spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus longan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., Eleusine coracana, Eriobotrya japonica, Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp., Gossypium hirsutum, Helianthus spp., Hibiscus spp., Hordeum spp., Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lemna spp., Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangula, Lupinus spp., Macrotyloma spp., Malpighia emarginata, Malus spp., Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp., Panicum miliaceum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Persea spp., Petroselinum crispum, Phaseolus spp.,

15 Phoenix spp., Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Punica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Rubus spp., Saccharum spp., Sambucus spp., Secale cereale, Sesamum spp., Solanum spp., Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Triticosecale rimpaui, Triticum spp., Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp., entre otras.

Según una característica preferida de la presente invención, la planta es una planta de cultivo que comprende soja, girasol, canola, alfalfa, colza o algodón. Preferiblemente de manera adicional, la planta según la presente invención es una planta monocotiledónea tal como caña de azúcar, lo más preferiblemente un cereal, tal como arroz, maíz, trigo, mijo, cebada, centeno, sorgo o avena. Sin embargo, se prevé que los métodos de la presente invención

25 pueden aplicarse a una amplia variedad de plantas, puesto que la conservación de dominios entre los homólogos de GRUBX eucariota conocidos sugiere una función igualmente conservada en el metabolismo celular.

Ventajosamente, la realización de los métodos según la presente invención da como resultado plantas que tienen una producción de semillas mejoradas con respecto a plantas de tipo natural correspondientes.

La presente invención se refiere a métodos para mejorar el índice de cosecha.

El índice de cosecha mejorado se expresa como una razón de la biomasa total con respecto a la producción de partes cosechables, tales como semillas; o peso de mil granos. Según la presente invención, la realización de los métodos según la presente invención da como resultado plantas que tienen un aumento en la producción de semillas, con respecto a plantas de control. Por tanto, según la presente invención, se proporciona un método para aumentar la producción de semillas, método que comprende introducir y sobreexpresar una secuencia de ácido

35 nucleico que codifica para una proteína GRUBX tal como se definió anteriormente, preferiblemente en el que la proteína GRUBX se codifica por una secuencia de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 1 o en el que la proteína GRUBX se representa por SEQ ID NO: 2. Alternativamente, la GRUBX puede codificarse por una secuencia de ácido nucleico representada por cualquiera de MIPS No. At2g01650, SEQ ID NO: 3, o en el que la GRUBX se representa por cualquiera de SPTrEMBL Q9ZU93, SEQ ID NO: 4.

Los métodos de la presente invención son favorables para aplicarse a plantas de cultivo debido a que los métodos de la presente invención se usan para aumentar la producción de semillas de una planta. Por tanto, los métodos de la presente invención son particularmente útiles para plantas de cultivo cultivadas por sus semillas, tales como cereales. Por consiguiente, una realización particular de la presente invención se refiere a un método para aumentar la producción de semillas de un cereal.

45 Se produce un aumento en la producción y/o el crecimiento ya esté la planta en condiciones no estresantes o se exponga la planta a diversos estreses en comparación con plantas de control. Las plantas normalmente responden a la exposición al estrés creciendo más lentamente. En condiciones de estrés agudo, la planta puede incluso detener su crecimiento completamente. El estrés leve se define por otro lado en el presente documento como cualquier estrés al que se expone una planta que no da como resultado el cese del crecimiento de la planta completamente sin la capacidad de reanudar el crecimiento. Debido a los avances en las prácticas agrícolas (irrigación, fertilización, tratamientos con pesticidas), no se encuentra a menudo estrés agudo en plantas de cultivo cultivadas. Como consecuencia, el crecimiento comprometido inducido por el estrés leve es a menudo una característica indeseable para la agricultura. El estrés leve son los estreses típicos a los que puede estar expuesta una planta. Este estrés puede ser el estrés biótico y/o abiótico diario (medioambiental) al que está expuesta una planta. Los estreses

55 abióticos o medioambientales típicos incluyen estreses por temperatura provocados por temperaturas frías/de congelación o cálidas atípicas, estrés salino, estrés por agua (sequía o exceso de agua). Los estreses abióticos también pueden provocarse por productos químicos. Estreses bióticos son normalmente los estreses provocados por patógenos, tales como bacterias, virus, hongos o insectos.

La presente invención también se refiere al uso de un ácido nucleico que codifica para una proteína GRUBX en la mejora de la producción de semillas de plantas. La presente invención también se refiere al uso de una proteína GRUBX en la mejora de la producción de semillas de plantas. La secuencia de ácido nucleico es preferiblemente tal como se representa por SEQ ID NO: 1, 3, ó 6, o codifica para una secuencia de aminoácidos representada por SEQ

5 ID NO: 2, 4, 7.

La presente invención se describirá ahora con referencia a las siguientes figuras en las que:

Figura 1a. Árbol filogenético que representa proteínas de Arabidopsis thaliana y proteínas de referencia animales que comprenden un dominio UBX, tal como se reconoce mediante la herramienta SMART. Las proteínas humanas se representan por sus números de registro de GenBank NP_079517 (dominio UBX de Homo sapiens que contiene

10 1 (UBXD1)), AAP97263 (ARNm del factor proteico asociado a Fas FAF1 de Homo sapiens), NP_005662 (reproducción 8 de Homo sapiens (D8S2298E), REP8) y una proteína de rata mediante NP_114187 (proteína p47 de Rattus norvegicus). Los otros identificadores (excepto para SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4 y SEQ ID NO 7) tienen números de registro de GenBank o SPTrEMBL para proteínas de Arabidopsis thaliana.

Figura 1b. Árbol filogenético que representa proteínas vegetales que comprenden un dominio PUG, tal como se

15 reconoce mediante la herramienta SMART. Se comparan SEQ ID NO 2 y SEQ ID NO 4 con proteínas de Arabidopsis thaliana (números de registro de SPTrEMBL Q9ZU93 (proteína expresada), Q9FKI1 (similitud con la metaloproteinasa de zinc), Q9MAT3 (proteína F13M7.16), Q9FKC7 (ADN genómico, cromosoma 5, clon TAC: K24G6), Q9SF12 (proteína hipotética), Q9C5S2 (endorribonucleasa/proteína cinasa IRE1), Q8RX75 (AT5g24360/K16H17_7), Q94lG5 (homologo-1 de Ire1)), y con la proteína de arroz SPTrEMBL Q7XIT1 (Oslre1p).

20 Figura 2a. Definición de los dominios UBX1 y PUG por sus secuencias consenso (base de datos SMART). CONSENSO/50%, respectivamente /65% y /80% son las secuencias de consenso para el 50, 65 y 80% superiores de las secuencias de referencia que comprenden el dominio UBX1 o PUG. Las letras mayúsculas son los códigos de la IUPAC de una única letra convencionales para los diversos aminoácidos, las otras letras simbolizan la naturaleza de los aminoácidos tal como se explica resumidamente a continuación:

Clase Clave Residuos

Alcohol o S,T Alifático I I,L,V Cualquier . A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y Aromático a F,H,W,Y Cargado c D,E,H,K,R Hidrófobo h A,C,F,G,H,I,K,L,M,R,T,V,W,Y Negativo -D,E Polar p C,D,E,H,K,N,Q,R,S,T Positivo + H,K,R Pequeño s A,C,D,G,N,P,S,T,V Diminuto u A,G,S Giro t A,C,D,E,G,H,K,N,Q,R,S,T

25 Figura 2b. Secuencias de los dominios UBX y PUG presentes en SEQ ID NO 2 y en Q9ZU93.

Figura 2c. Alineación de Q9ZU93 y SEQ ID NO 2, dominios PUG subrayados, dominios UBX en negrita.

Figura 2d. Alineación de SEQ ID NO 2 y SEQ ID NO 4, dominios PUG subrayados, dominios UBX en negrita.

Figura 2e. Alineación de SEQ ID NO 4 y SEQ ID NO 7, dominios PUG subrayados, dominios UBX en negrita.

30 Figura 3. Presentación esquemática del clon p77 de entrada, que contiene CDS0669 dentro de los sitios AttL1 y AttL2 para clonación Gateway® en la estructura principal de pDONR201. CDS0669 es el código interno de la secuencia codificante de GRUBX de tabaco. Este vector contiene también un casete de resistencia a kanamicina bacteriano y un origen bacteriano de replicación.

Figura 4. Vector binario para la expresión en Oryza sativa del gen GRUBX de tabaco (CDS0669) bajo el control del 35 promotor de prolamina (PRO0090) Este vector contiene un T-ADN derivado del plásmido Ti, limitado por un borde izquierdo (repetición de LB, LB Ti C58) y un borde derecho (repetición de RB, RB Ti C58)). Del borde izquierdo al

borde derecho, este T-ADN contiene: un casete para la selección por antibióticos de plantas transformadas; un casete para la selección visual de plantas transformadas; el casete terminador doble PRO0090 CDS0669-zeína y rbcS-deltaGA para la expresión del gen GRUBX de tabaco. Este vector también contiene un origen de replicación de pBR322 para la replicación bacteriana y un marcador seleccionable (Spe/SmeR) para la selección bacteriana con espectinomicina y estreptomicina.

Figura 5. Ejemplos de secuencias útiles en la presente invención. SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 son las secuencias del ácido nucleico GRUBX y la proteína GRUBX respectivamente que se usaron en los ejemplos. SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 representan la secuencia codificante y la secuencia de proteína del ortólogo de GRUBX de la caña de azúcar, SEQ ID NO: 5 es la secuencia del casete de expresión que se usó en las plantas de arroz transformadas, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7 representan la secuencia codificante respectivamente y la secuencia de proteína del ortólogo de GRUBX de arroz

Ejemplos

La presente invención se describirá ahora con referencia a los siguientes ejemplos, que son a modo de ilustración solo.

Manipulación del ADN: a menos que se establezca lo contrario, se realizan técnicas de ADN recombinante según protocolos convencionales descritos en (Sambrook (2001) Molecular Clonación: a laboratory manual, 3ª edición Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, Nueva York) o en los volúmenes 1 y 2 de Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology. Nueva York: John Wiley y Sons, 1998). Se describen materiales y métodos convencionales para el trabajo molecular con plantas en Plant Molecular Biology Labfax (1993) por R.D.D. Croy, publicado por BIOS Scientific Publications Ltd (RU) y Blackwell Scientific Publications (RU).

Ejemplo 1: Clonación de la secuencia CDS0669

Clonación del fragmento del gen GRUBX a partir de tabaco

Se realizó un experimento de ADNc-AFLP en un cultivo celular BY2 de tabaco sincronizado (Nicotiana tabacum L.

cv. Bright Yellow-2), y se eligieron etiquetas de secuencia expresada de BY2 que estaban moduladas por el ciclo celular para la clonación adicional. Se usaron las etiquetas de secuencia expresada para seleccionar una biblioteca de ADNc de tabaco y para aislar el ADNc de longitud completa de interés, concretamente uno que codifica para el gen GRUBX (CDS0669).

Sincronización de células BY2.

Se sincronizó una suspensión celular cultivada de BY2 de tabaco (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow-2) mediante células que se bloqueaban en la fase S temprana con afidicolina tal como sigue. Se mantuvo la suspensión celular de Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2 tal como se describió (Nagata et al. Int. Rev. Cytol. 132, 1-30, 1992). Para la sincronización, se diluyó un cultivo estacionario de 7 días de edad 10 veces en medio fresco complementado con afidicolina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO; 5 mg/l), un fármaco inhibidor de ADNpolimerasa a. Tras 24 h, se liberaron las células del bloqueo mediante varios lavados con medio fresco tras lo cual se reanudó su progresión en el ciclo celular.

Extracción de ARN y síntesis de ADNc.

Se preparó ARN total usando precipitación con LiCl (Sambrook et al, 2001) y se extrajo ARN poli(A+) a partir de 500 μg de ARN total usando columnas Oligotex (Qiagen, Hilden, Alemania) según las instrucciones del fabricante. Partiendo de 1 μg de ARN poli(A+), se sintetizó ADNc de primera cadena mediante transcripción inversa con un cebador de oligo-dT25 biotinilado (Genset, Paris, Francia) y Superscript II (Life Technologies, Gaithersburg, MD). Se realizó la síntesis de la segunda de cadena mediante desplazamiento de cadena con ligasa de Escherichia coli (Life Technologies), ADN-polimerasa I*(USB, Cleveland, OH) y ARNasa-H (USB).

Análisis de ADNc-AFLP.

Se usó quinientos ng de ADNc bicatenario para análisis de AFLP tal como se describió (Vos et al., Nucleic Acids Res. 23 (21) 4407-4414, 1995; Bachem et al., Plant J. 9 (5) 745-53, 1996) con modificaciones. Las enzimas de restricción usadas fueron BstYI y MseI (Biolabs) y se realizó la digestión en dos etapas separadas. Tras la primera digestión de restricción con una de las enzimas, se atraparon los fragmentos de extremo 3’ en perlas Dyna (Dynal, Oslo, Noruega) por medio de su cola biotinilada, mientras que los otros fragmentos se eliminaron con el lavado. Tras la digestión con la segunda enzima, se recogieron los fragmentos de restricción liberados y se usaron como moldes en las etapas de AFLP posteriores. Para las amplificaciones previas, se combinó un cebador de MsiI sin nucleótidos selectivos con un cebador de BstYI que contenía o bien una T o bien una C como nucleótido mayoritario en 3’. Las condiciones de PCR fueron tal como se describe (Vos et al., 1995). Se diluyeron las mezclas de amplificación obtenidas 600 veces y se usaron 5 μl para amplificaciones selectivas usando un cebador de BstYI marcado con P33 y la polimerasa Amplitaq-Gold (Roche Diagnostics, Bruselas, Bélgica). Se separaron los productos de amplificación en geles de poliacrilamida al 5% usando el sistema Sequigel (Biorad). Se expusieron los geles secos a películas Kodak Biomax así como se escanearon en un instrumento Phosphorlmager (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, RU).

Caracterización de los fragmentos de AFLP.

Se aislaron del gel bandas que correspondían a transcriptos expresados de manera diferente, entre los que estaba el transcripto (parcial) que correspondía a SEQ ID NO 1 (o CDS0669), y volvió a amplificarse el ADN eluido en las mismas condiciones que para la amplificación selectiva. Se obtuvo la información de secuencia o bien mediante secuenciación directa del producto de reacción en cadena de la polimerasa reamplificado con el cebador de BstYI selectivo o bien tras la clonación de los fragmentos en pGEM-T easy (Promega, Madison, WI) y secuenciación de clones individuales. Se compararon las secuencias obtenidas frente a secuencias de nucleótidos y proteínas presentes en la base de datos públicamente disponible mediante alineaciones de secuencias BLAST (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25 (17) 3389-3402 1997). Cuando estaban disponibles, se reemplazaron las secuencias de etiqueta por EST más largos o secuencias de ADNc aisladas para aumentar la posibilidad de encontrar una homología significativa. El clon de ADNc físico que correspondía a SEQ ID NO 1 (CDS0669) se amplificó posteriormente de una biblioteca de ADNc de tabaco comercial tal como sigue:

Clonación del gen GRUBX (CDS0669)

Se preparó una biblioteca de ADNc con un tamaño promedio de insertos de 1.400 pb de ARN poli(A+) aislado de células de tabaco BY2 no sincronizadas, en división activa. Se clonaron estos insertos de biblioteca en el vector pCMVSPORT6.0, que comprende un casete attB Gateway (Life Technologies). De esta biblioteca, se seleccionaron

46.000 clones, se dispusieron en placas de microtituración de 384 pocillos y se colocaron posteriormente por duplicado en filtros de nailon. Se seleccionaron los clones dispuestos usando conjuntos de varios cientos de etiquetas marcadas radiactivamente como sondas (incluyendo la etiqueta BY2 que corresponde a la secuencia CDS0669, SEQ ID NO 1). Se aislaron clones positivos (entre los que estaba el clon que correspondía a CDS0669, SEQ I NO 1), se secuenciaron y se alinearon con la secuencia de etiqueta. Cuando la hibridización con la etiqueta fallaba, se seleccionó el ADNc de longitud completa que correspondía a la etiqueta mediante amplificación por PCR: se diseñaron cebadores específicos de etiqueta usando el programa primer3 (http://www-genoma.wi.mit.edu/genoma software/other/primer3.html) y se usaron en combinación con un cebador de vector común para amplificar insertos de ADNc parciales. Se usaron conjuntos de ADN de 50.000, 100.000, 150.000 y 300.000 clones de ADNc como moldes en las amplificaciones por PCR. Se aislaron entonces los productos de amplificación de geles de agarosa, se clonaron, se secuenciaron y se alineó su secuencia con las de las etiquetas. A continuación, se clonó el ADNc de longitud completa que correspondía a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 1 del vector de biblioteca pCMVsport6.0 en pDONR201, un vector donador Gateway® (Invitrogen, Paisley, RU) por medio de una reacción LR, dando como resultado el clon de entrada p77 (figura 3).

Ejemplo 2: Construcción del vector

Se usó posteriormente el clon de entrada p77 en una reacción LR con p0830, se usó un vector de destinación para la transformación de Oryza sativa. Este vector contenía como elementos funcionales dentro de los bordes de T-ADN: un marcador seleccionable vegetal; un casete de expresión de marcador visual; y un casete Gateway destinado a recombinación LR in vivo con la secuencia de interés ya clonada en el clon de entrada. Un promotor de prolamina para la expresión preferida en semillas (PRO0090) estaba en el sentido de 5’ de este casete Gateway. Tras la etapa de recombinación LR, se transformó el vector de expresión resultante p72 (figura 4) en la cepa de Agrobacterium LBA4404 y posteriormente en plantas de Oryza sativa.

Ejemplo 3: Transformación de arroz con el constructo PRO0090-CDS0669

Se descascarillaron semillas secas maduras de Oryza sativa japónica cultivar Nipponbare. Se realizó la esterilización incubando las semillas durante un minuto en etanol al 70%, seguido por 30 minutos en HgCl2 al 0,2% y mediante 6 lavados de 15 minutos con agua destilada estéril. Entonces se hicieron germinar las semillas estériles en un medio que contenía 2,4-D (medio de inducción de callos). Tras una incubación de 4 semanas en la oscuridad, se escindieron callos derivados del escutelo, embriogénicos y se propagaron en el mismo medio. Dos semanas después, se multiplicaron los callos o se propagaron mediante subcultivo en el mismo medio durante otras 2 semanas. 3 días antes del cocultivo, se subcultivaron trozos de callos embriogénicos en medio fresco para estimular la actividad de división celular. Se usó la cepa de Agrobacterium LBA4414 que albergaba el vector binario p72 para el cocultivo. Se cultivó la cepa de Agrobacterium durante 3 días a 28ºC en medio AB con los antibióticos apropiados. Se recogieron entonces las bacterias y se suspendieron en medio de cocultivo líquido a una DO600 de aproximadamente 1. Se transfirió la suspensión a una placa de Petri y se sumergieron los callos en la suspensión durante 15 minutos. A continuación, se secaron los tejidos callosos en un papel de filtro, se transfirieron a un medio de cocultivo solidificado y se incubaron durante 3 días en la oscuridad a 25ºC. Después de eso, se hicieron crecer callos cocultivados en medio que contenía 2,4-D durante 4 semanas en la oscuridad a 28ºC en presencia de un agente selectivo a una concentración adecuada. Durante este periodo, se desarrollaron islas callosas resistentes en crecimiento rápido. Tras la transferencia de este material a un medio de regeneración y la incubación en la luz, se liberó el potencial embriogénico y se desarrollaron brotes en las siguientes cuatro a cinco semanas. Se escindieron los brotes de los callos y se incubaron durante de 2 a 3 semanas en un medio que contenía auxina del que se transfieren al suelo. Se hicieron crecer los brotes endurecidos bajo alta humedad y días cortos en un invernadero. Finalmente, se cosecharon las semillas de tres a cinco meses tras el transplante. El método produjo transformantes de locus único a una tasa superior al 50% (Aldemita y Hodges, Plant 199, 612-617, 1996; Chan et al., Plant Mol. Biol. 22(3), 491-506, 1993; Hiei et al., Plant J. 6(2), 271-282, 1994).

Ejemplo 4: Evaluación de arroz transgénico transformado con el constructo PRO0090-CDS0669

Se generaron de aproximadamente 15 a 20 transformantes de arroz T0 independientes. Se transfirieron los transformantes primarios de las cámaras de cultivo de tejido a un invernadero para el crecimiento y la cosecha de semilla T1. Se conservaron 6 acontecimientos, de los que la progenie T1 segregó 3:1 para presencia/ausencia del transgén. Para cada uno de estos acontecimientos, se seleccionaron aproximadamente 10 plántulas T1 que contenían el transgén (hetero y homocigotas), y aproximadamente 10 plántulas T1 que carecían del transgén (nulicigotos), monitorizando la expresión del marcador visual. Se evaluaron varios parámetros relacionados con el crecimiento vegetativo y la producción de semillas y se analizaron estadísticamente todos los datos tal como se explica acontinuación:

Análisis estadístico: prueba de la t y prueba F:

Se usó un ANOVA de dos factores (análisis de variantes) como modelo estadístico para la evaluación global de las características fenotípicas de la planta. Se llevó a cabo una prueba F sobre todos los parámetros medidos de todas las plantas de todos los acontecimientos transformados con el gen de la presente invención. Se lleva a cabo la prueba F para comprobar el efecto del gen sobre todos los acontecimientos de transformación y para verificar el efecto global del gen, también denominado en el presente documento “efecto génico global”. Si el valor de la prueba F muestra que los datos son significativos, entonces se concluye que existe un efecto “génico”, lo que significa que no sólo la presencia o la posición del gen provoca las diferencias en el fenotipo. El umbral para la significación para un efecto génico verdadero global se fija al nivel de probabilidad del 5% para la prueba F.

4.1 Mediciones del crecimiento vegetativo:

Se transfirieron las plantas T1 seleccionadas (aproximadamente 10 con el transgén y aproximadamente 10 sin el transgén) a un invernadero. Cada planta recibió una etiqueta de código de barras única para vincular inequívocamente los datos de fenotipado con la planta correspondiente. Se hicieron crecer en el suelo plantas T1 seleccionadas en macetas de 10 cm de diámetro bajo los siguientes parámetros medioambientales: fotoperiodo = 11,5 h, intensidad de luz diurna = 30.000 lux o más, temperatura diurna = 28ºC o superior, temperatura nocturna = 22ºC, humedad relativa = 60-70%. Se hicieron crecer las plantas transgénicas y los nulicigotos correspondientes lado a lado en posiciones aleatorias. Desde la fase de siembra hasta la fase de madurez cada planta se pasó varias veces a través de una cabina de obtención de imágenes digitales y se obtuvieron imágenes. En cada punto de tiempo, se tomaron imágenes digitales (2048x1536 píxeles, 16 millones de colores) de cada planta desde al menos 6 ángulos diferentes. Pueden deducirse varios parámetros de una forma automatizada a partir de todas las imágenes digitales de todas las plantas, usando software de análisis de imagen.

4.2 Mediciones de parámetros relacionados con las semillas:

Se cosecharon las panículas primarias maduras, se guardaron en bolsas, se marcaron con códigos de barras y entonces se secaron durante tres días en el horno a 37ºC. Entonces se trillaron las panículas y se recogieron todas las semillas y se contaron. Se separaron las cáscaras llenas de las vacías usando un dispositivo de soplado de aire. Se desecharon las cáscaras vacías y se contó de nuevo la fracción restante. Se pesaron las cáscaras llenas en una balanza analítica. Este procedimiento permite deducir un conjunto de parámetros relacionados con las semillas.

Índice de cosecha de plantas

El índice de cosecha en la presente invención se define como la razón entre la producción de semillas total y el área por encima del suelo (mm2), multiplicado por un factor 106. Se midió la producción de semillas total por planta pesando todas las cáscaras llenas cosechadas de una planta tal como se describió anteriormente. Se determinó el área por encima del suelo de la planta contando el número total de píxeles de las imágenes digitales de partes de la planta por encima del suelo diferenciadas del fondo. Se promedió este valor para las fotografías tomadas en el mismo punto de tiempo desde los diferentes ángulos y se convirtió en un valor de superficie expresado en mm cuadrados mediante calibración. Los experimentos mostraron que el área de la planta por encima del suelo medida de esta manera se correlaciona con la biomasa de las partes de la planta por encima del suelo.

Se confirmaron los datos obtenidos en el primer experimento en un segundo experimento con plantas T2. Se seleccionaron tres líneas que tenían el patrón de expresión correcto para análisis adicionales. Se seleccionaron lotes de semillas de las plantas positivas (tanto hetero como homocigotas) en T1, monitorizando la expresión del

5 marcador. Para cada acontecimiento escogido, se conservaron entonces los lotes de semillas heterocigotas para la evaluación T2. En cada lote de semillas se hizo crecer un número igual de plantas positivas y negativas en el invernadero para la evaluación.

Se evaluó un número total de 120 plantas transformadas con GRUBX en la generación T2, es decir, 40 plantas por acontecimiento de las cuales 20 eran positivas para el transgén y 20 negativas.

10 Debido a que se han llevado acabo dos experimentos con acontecimientos solapantes, se realizó un análisis combinado. Esto es útil para comprobar la consistencia de los efectos a lo largo de los dos experimentos, y si este es el caso, para acumular pruebas a partir de ambos experimentos con el fin de aumentar la confianza de la conclusión. El método usado era una aproximación de modelo mixto que tiene en cuenta la estructura multinivel de los datos (es decir experimento – acontecimiento - segregantes). Se obtuvieron valores de P comparando pruebas

15 de razón de probabilidad con distribuciones de chi cuadrado.

En un primer experimento, se evaluaron seis líneas en la generación T1. Hubo un aumento promedio del índice de cosecha y dos líneas tuvieron un aumento significativo del 50% o más en comparación con las líneas nulicigotas (Tabla 2).

Tabla 2: Evaluación de los dos acontecimientos T1 con mejor rendimiento

Índice de cosecha :

Línea

TR nul. dif. % de dif. Valor de p

10

74,9 49,9 24,97 50 0,039

4

35 21,7 13,28 61 0,0656

20 Se facilitan valores absolutos medios de las mediciones del índice de cosecha para las líneas transgénicas (TR) y plantas de control (nul.) en la generación T1 en las columnas 2 y 3, la diferencia absoluta en la columna 4 y la diferencia en % en la columna 5, la significación, expresada como valor de p obtenido en una prueba de la t, se facilita en la columna 6.

25 Se confirmaron los resultados obtenidos para la generación T1 en la generación T2; el aumento promedio para el índice de cosecha era del 13% y una prueba F mostró que este aumento era significativo (valor de p de 0,0447). Además, se volvieron a evaluar estos datos de T2 en un análisis combinado con los resultados para la generación T1, y el valor de p obtenido a partir de una prueba F mostró de nuevo que los efectos observados eran significativos (valor de p 0,0181).

30 LISTA DE SECUENCIAS

<110> CropDesign N.V.

<120> Plantas que tienen características de crecimiento modificadas y método para preparar las mismas

<130> CD-107-PCT 5 <150> documento EP 03104764.0

<151> 17-12-2003

<150> documento US 60/531.866

<151> 22-12-2003

<160> 7 10 <170> PatentIn versión 3.3

<210> 1

<211> 1380

<212> ADN

<213> Nicotiana tabacum 15 <400> 1

<210> 2

<211> 459

<212> PRT 20 <213> Nicotiana tabacum

<400> 2

<210> 3

<211> 1311

<212> ADN 5 <213> Saccharum officinarum

<220>

<221> misc_feature

<222> (277)..(279)

<223> n puede ser cualquier nucleótido 10 <400> 3

<210> 4

<211> 436

<212> PRT 5 <213> Saccharum officinarum

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (93)..(93)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido 10 <400> 4

<210> 5

<211> 3048

<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> casete de expresión que comprende GRUBX (1011-2390) operativamente unido al promotor de prolamina (1654) y al terminador T-Zeína + T-Rubisco deltaG (2615-2808 y 2852-3048)

<400> 5 10

<210> 6

<211> 1302

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 6

<210> 7

<211> 433

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 7

Claims (7)

1. REIVINDICACIONES

   1. Método para mejorar la producción de semillas de una planta con respecto a plantas de tipo natural correspondientes, comprendiendo dicho método:

   -

   introducir y sobreexpresar en una planta o célula vegetal una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica para una proteína GRUBX, seleccionándose dicha secuencia de ácido nucleico del grupo:

   -

   una secuencia de ácido nucleico tal como se representa por una cualquiera de SEQ ID NO:1, 3, 6;

   -

   un ácido nucleico que codifica para un polipéptido tal como se representa por una cualquiera de SEQ ID NO: 2, 4, 7;

   -

   un ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene al menos el 80% de identidad de secuencia con una cualquiera de SEQ ID NO: 2, 4, 7, teniendo dicho polipéptido acción reguladora de ubiquitina dentro de la ruta de ubiquitinación

   -

   cultivar la planta o célula vegetal en condiciones que promueven el crecimiento de la planta.

2. 2.

   Método según la reivindicación 1, en el que dicho ácido nucleico se deriva de un organismo eucariota, preferiblemente de una planta.

3. 3.

   Método según la reivindicación 2, en el que dicho ácido nucleico se deriva de una planta dicotiledónea, preferiblemente de la familia Solanaceae, más preferiblemente de Nicotiana tabacum.

4. 4.

   Método según la reivindicación 2, en el que dicho ácido nucleico se deriva de una planta monocotiledónea, preferiblemente de la familia Poaceae, más preferiblemente de Oryza sativa.

5. 5.

   Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la expresión de dicho ácido nucleico que codifica para una proteína GRUBX esta dirigida por un promotor preferido en semillas, preferiblemente un promotor de prolamina.

6. 6.

   Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho aumento de la producción de semillas comprende uno o más de (i) aumento de la biomasa de semillas, (ii) aumento del número total de semillas, (iii) aumento del número de semillas llenas, (iv) aumento del tamaño de semilla, (v) aumento del volumen de semilla, (vi) aumento del índice de cosecha, y (vii) aumento del peso de mil granos, todo con respecto a plantas de tipo natural correspondientes.

7. 7.

   Uso de una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica para una proteína GRUBX, seleccionándose dicha secuencia de ácido nucleico del grupo:

   -

   una secuencia de ácido nucleico tal como se representa por una cualquiera de SEQ ID NO:1, 3, 6;

   -

   un ácido nucleico que codifica para un polipéptido tal como se representa por una cualquiera de SEQ ID NO: 2, 4, 7;

   -

   un ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene al menos el 80% de identidad de secuencia con respecto a una cualquiera de SEQ ID NO: 2, 4, 7, teniendo dicho polipéptido acción reguladora de ubiquitina dentro de la ruta de ubiquitinación, en el aumento de la producción de semillas de una planta con respecto a plantas de tipo natural correspondientes.