ES2312966T3

ES2312966T3 - Uso del cd14 soluble para el tratamiento de enfermedades.

Info

Publication number: ES2312966T3
Application number: ES04713556T
Authority: ES
Inventors: Jose Fernandez-Real; Wilfredo Ricart Engel
Original assignee: Bridge Bioresearch Ltd
Current assignee: Bridge Bioresearch Ltd
Priority date: 2003-03-21
Filing date: 2004-02-23
Publication date: 2009-03-01
Anticipated expiration: 2024-02-23
Also published as: DE602004016128D1; US20070172477A1; EP1608396A2; WO2004082578A2; WO2004082578A3; US7655237B2; EP1608396B1; ATE406172T1

Abstract

Uso de CD 14 soluble (sCD 14) para la fabricación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o preventivo de una enfermedad que implica tanto una afección inflamatoria crónica como un desorden clínico asociados a la resistencia a la insulina en un animal o un humano, en el que la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en diabetes mellitus de tipo 2, obesidad, síndrome metabólico, enfermedad arteriosclerótica, hipertensión arterial e hiperandrogenismo ovárico funcional y en el que, cuando el tratamiento terapéutico es un tratamiento terapéutico de la enfermedad, el tratamiento terapéutico mejora la resistencia a la insulina en el animal o el humano y cuando el tratamiento es un tratamiento preventivo de la enfermedad, el tratamiento preventivo está protegiendo ante el desarrollo negativo de resistencia a la insulina.

Description

Uso del CD14 soluble para el tratamiento de enfermedades.

Campo de la invención

La presente invención está relacionada con el uso de CD14 (sCD14) para la fabricación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o preventivo de una enfermedad que implica una afección inflamatoria crónica y un desorden clínico asociados a la resistencia a la insulina en un animal o un humano.

Antecedentes de la invención

La proteína, CD14, es una glucoproteína mieloide de la superficie celular que actúa como receptor del lipopolisacárido bacteriano (LPS). Está bien documentado que la activación de monocitos/macrófagos por lipopolisacáridos a través del CD14 de membrana (mCD14) provoca la liberación de una variedad de moléculas pro-inflamatorias, inmunoreguladoras y citotóxicas tales como TNF-\alpha, IL-1, IL-6, IL-8, productos con radicales de oxígeno y óxido nítrico. El mCD14 está anclado a la membrana celular mediante un enlace glicosil-fosfatidilinositol.

Además de la forma unida a membrana, se ha identificado CD14 soluble (sCD 14) en suero humano normal, de aquí en adelante referido como sCD14. El sCD14 existe en dos formas, sCD14a (49 kDa) y sCD14p (55 kDa). Se ha demostrado que el sCD14 se une al LPS y logra la activación inducida por LSP de las células que carecen de mCD14, incluyendo células epiteliales y endoteliales y astrocitos, así como células que expresan mCD14, tales como monocitos y neutrófilos. La fuente principal de sCD14 en el plasma humano normal es el monocito. En el plasma humano normal se encuentra una concentración sustancial de sCD14, 2-4 \mug/ml.

Se cree que el LPS es la causa principal de muerte en humanos afectados por sepsis por bacterias gram negativas. Se puede definir la sepsis como una condición tóxica que resulta de la propagación de bacterias o sus productos a partir de un foco de infección.

Numerosos documentos del estado de la técnica describen el uso de sCD14 o variantes/fragmentos de sCD14 en el tratamiento de la sepsis, bacteremia por bacterias gram negativas u otras enfermedades relacionadas que se pueden caracterizar como enfermedades que implican afecciones de inflamación aguda. Véase, por ejemplo, WO9101639, WO92204908, WO9319772, US5804189, WO9620957 y US5869055.

De acuerdo con el estado de la técnica se puede definir una afección aguda como afecciones que son severas y repentinas en su aparición. Los síntomas aparecen, cambian y empeoran rápidamente. Una afección crónica, por definición, es continua o persistente/mantenida a lo largo de un periodo de tiempo prolongado. Una afección crónica es una que es duradera, no resuelta fácil o rápidamente.

Se han publicado algunos estudios relativos a la implicación de sCD14 en enfermedades que implican una inflamación crónica.

Un polimorfismo del gen de CD14, una transición de C a T en la pb -159 del sitio de inicio principal de la transcripción, parece ejercer una función en la regulación de los niveles de sCD14 en el suero.

El artículo (Wolfgang K, y co., Journal of the American College of Cardiology, United States- 3 Jul 2002, Vol 40, Nr 1, página 34 - 42) investigó este polimorfismo. Investigaron la asociación del genotipo de CD14 y los niveles en plasma de sCD14 soluble con el riesgo de enfermedad de la arteria coronaria estable (CAD), infecciones crónicas y marcadores sensibles de inflamación sistémica. Encontraron que "los niveles de sCD14 en plasma eran superiores en sujetos con genotipo TT en comparación con aquellos con genotipo CT o CC (p = 0.005)". En base al análisis de los datos individuales encontrados, el resumen concluye que "Estos resultados no confirman una relación independiente entre genotipos CD14 o niveles en plasma de sCD14 y el riesgo de CDA estable en esta población".

Fernandez-Real JM et al publicaron un póster el 12 de septiembre de 2001 en el encuentro EASD en Glasgow. El título era "Un polimorfismo del gen del receptor CD14 monocítico involucrado en la cascada inflamatoria, está asociado a la sensibilidad a la insulina". El resumen dice que "Pacientes diabéticos de tipo 2 homocigóticos C/C también mostraron un índice de sensibilidad a la insulina significativamente menor que los portadores del alelo T".

Resumen de la invención

El problema a solucionar por la presente invención es proporcionar un uso médico alternativo para sCD14.

La solución se basa en la hipótesis de que el LPS produce resistencia a la insulina en humanos mediante un mecanismo que implica la activación de la cascada inflamatoria. Debido a que el sCD14 puede bloquear la actividad del LPS, los presentes inventores investigaron si el sCD14 puede o no puede ser usado para el tratamiento terapéutico o preventivo de enfermedades que implican afecciones inflamatorias crónicas y resistencia a la insulina.

En base a un detallado trabajo (véanse los ejemplos de realización del presente documento), los presentes inventores encontraron que mediante la administración de sCD14 era posible mejorar la resistencia a la insulina en individuos que tienen estas enfermedades. Cuando se mejora la resistencia a la insulina el individuo puede utilizarla mejor y los niveles de glucosa en sangre pueden normalizarse mejor. Por ejemplo, en el ejemplo 1 esto se demuestra en individuos con diabetes de tipo 2 (ratones diabéticos) y en el ejemplo 4 esto se demuestra en individuos (ratones) con obesidad. Está bien establecido que los ratones son un buen modelo animal para los correspondientes efectos en humanos.

Por lo tanto, un primer aspecto de la invención está relacionado con el uso de sCD14 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o preventivo de una enfermedad que implica una afección inflamatoria crónica y un desorden clínico asociados a la resistencia a la insulina en un animal o un humano tal y como se define en la reivindicación 1.

Este primer aspecto proporciona un método para el tratamiento terapéutico o preventivo de una enfermedad que implica una afección inflamatoria crónica y un desorden clínico asociados a la resistencia a la insulina en un animal o un humano que comprende administrar cantidades efectivas de sCD14 a un animal o un humano que lo necesite.

Una ventaja de usar sCD14 es que mejora la resistencia a la insulina y, por lo tanto, normaliza los niveles de glucosa en sangre. Por el contrario, si se da insulina, por ejemplo, a pacientes de diabetes de tipo 2, los niveles de glucosa descienden de manera más incontrolada. Dicho de otra forma, se debe controlar continua y precisamente la cantidad de insulina administrada y monitorizar continuamente los niveles de glucosa para no llegar a niveles de glucosa demasiado bajos. Debido a que el sCD14 simplemente normaliza el nivel de glucosa, no existe el riesgo de niveles de glucosa demasiado bajos. Esto ofrece la posibilidad de, por ejemplo, administrar el sCD14 al paciente como un depósito (en inglés "depot") (por ejemplo, un depósito inyectable). El depósito se puede hacer con un perfil de liberación adecuado de sCD14 y, por tanto, el paciente puede conseguir una mejora de resistencia a la insulina continuada, de forma fácil y cómoda y, por tanto, unos niveles de glucosa en sangre normalizados de manera continuada. Véanse más detalles a continuación.

A continuación se describen, sólo a modo de ejemplo(s), realización(es) particular(es) de la presente invención.

Descripción detallada de la invención Discusión de la teoría subyacente al uso de sCD14

Los estudios realizados por los presentes inventores demuestran que existe una correlación negativa entre las concentraciones de sCD14 en suero y parámetros relacionados con la resistencia a la insulina, la obesidad y la hipertensión en hombres sanos. Los estudios indican, además, que las personas con obesidad tienen concentraciones de sCD14 en suero relativamente más bajas y que, en personas con diabetes de tipo 2, las concentraciones de sCD14 circulante están inversamente relacionadas con el grado de disfunción vascular.

Estudios con animales de experimentación muestran que la administración de sCD14 recombinante humana a ratones diabéticos (ob/ob) disminuye la glicemia basal (la presencia de glucosa en sangre) sin provocar cambios en el peso corporal, el peso de los músculos sóleos, el peso del tejido adiposo epidérmico o en la ingestión de comida. Se han observado resultados positivos similares después de la administración de sCD14 recombinante humana a ratones con obesidad (véase ejemplo 4).

En resumen, los descubrimientos de los presentes inventores demuestran que las concentraciones de sCD14 en suero es más baja en personas con obesidad, es directamente proporcional a la sensibilidad a la insulina en personas sanas e inversamente proporcional al grado de disfunción vascular en pacientes diabéticos de tipo 2. Esto indica claramente que el sCD14 es una proteína capaz de proteger frente al desarrollo negativo de resistencia a la insulina y las alteraciones vasculares asociadas a ello. Esta conclusión está soportada por el efecto en la reducción/normalización de los niveles de glucosa en sangre (sin modificación del peso y la ingestión de comida) que se ha observado después de la administración de sCD14 recombinante humana en ratones diabéticos (véase ejemplo 1) y ratones con obesidad (véase ejemplo 4).

sCD14 apropiada

La sCD14 apropiada que se puede usar de acuerdo con la invención puede ser sCD14 soluble procedente de un mamífero, en particular, sCD14 recombinante humana o cualquier proteína o sustancia que comprenda la siguiente secuencia de aminoácidos (SEC ID NO 1)

AELQQWLKPGLKVLSIAQAHSLNFSC

Esta secuencia de aminoácidos es un fragmento de la sCD14 recombinante humana. Comprende los aminoácidos 143 a 168 de la secuencia de la sCD14 humana. Para más información, véase la US5804189, columna 18.

Expresado de otro modo, la sCD14 apropiada que se puede usar de acuerdo con la invención puede ser sCD14 recombinante humana o un fragmento, una variante u homólogo del mismo de la sCD14 procedente de mamífero, en la que el fragmento, variante u homólogo procedente de mamífero tienen propiedades de unión al LPS que se corresponden con la sCD14 recombinante humana.

El estado de la técnica describe la clonación de varias sCD14 de mamífero. La producción recombinante de sCD14 humana también se conoce en el estado de la técnica. Véase, por ejemplo, la US5804189.

Los fragmentos de sCD14 apropiados están descritos, por ejemplo, en la US5804189 y la US5869055. La
US5869055 describe variantes de sCD14 que comprenden una secuencia de aminoácidos que empieza con uno de los aminoácidos 1 a 6 y terminan con uno de los aminoácidos 152 a 348 de la SEC m NO:38 [CD 14 humana soluble que tiene 348 aminoácidos], en las que cada uno de los Xaa Xaa Xaa Xaa están seleccionados independientemente del grupo que consiste en Gly, Ala, Val, Leu, Ile y Pro.

Con el fin de probar las propiedades de unión de LPS se prefiere usar un ensayo de unión competitivo para LPS. Un ensayo apropiado se describe en la US5804189, columna 18. Brevemente, se añade sCD14 (100 \mul/pocillo, 16 \mug/ml) a las placas de ELISA. Los pocillos se bloquean con gelatina al 0,5% diluida en PBS. Se hacen diluciones en serie de sCD14 en PBS que contiene un 0,1% de gelatina y se añaden al LPS biotinilado (concentración final, 1 \mug/ml). También se añade LBP purificado de conejo (concentración final 1 \mug/ml). Las muestras se incuban a 37ºC durante 30 min y después se añaden a los pocillos recubiertos con sCdl4 y las placas se incuban a 37ºC durante 4 h. El LPS unido se detecta usando un sistema de detección de estreptavidina-fosfatasa alcalina. Para mayor información véase la US5804189.

Preferentemente, en tal ensayo de unión competitivo para LPS, se considera que un fragmento, variante u homólogo de mamífero de sCD14 tiene propiedades de unión al LPS que se corresponden con la sCD14 recombinante humana si tiene propiedades de unión al LPS que corresponden, al menos, a un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos arriba indicada. Datos de las propiedades de unión de dicho péptido se dan en la figura 8 de la US5804189.

Más preferentemente, se considera que un fragmento, variante u homólogo de mamífero de sCD14 tiene propiedades de unión LPS sCD14 que se corresponden con la sCD14 recombinante humana si tiene propiedades de unión al LPS que se corresponden, al menos, con la sCD14 recombinante humana. Datos de las propiedades de enlace de la sCD14 recombinante humana se dan en la figura 8 de la US5804189.

En definitiva, los datos mostrados en la figura 8 de la US5804189 son los siguientes. Los datos están representados como el % de respuesta máxima. La sCD14 recombinante humana parece inhibir más eficazmente a concentraciones más bajas, sin embargo, a las concentraciones más elevadas (1,7 \muM), el péptido inhibe casi tan bien (72%) como la sCD14 recombinante humana (84%). Cuando el péptido se usa a una concentración de 7 \muM, la cantidad de inhibición (84%) es la misma que la alcanzada con 1,7 \muM de sCD14 recombinante humana.

Como es sabido por la persona experta en la materia, puede ser preferible administrar un ingrediente activo en forma de sales fisiológicamente aceptables. Por consiguiente, dentro del término sCD14 también se incluyen sales fisiológicamente aceptables de sCD14.

Enfermedad que implica una inflamación crónica

Las enfermedades que implican una afección inflamatoria crónica son la diabetes mellitus de tipo 2, la obesidad, el síndrome metabólico (un grupo de manifestaciones caracterizadas por uno o varios de los siguientes síntomas: resistencia a la insulina, dislipidemia, obesidad, hipertensión arterial, alteraciones de la coagulación e hiperuricemia), enfermedad arteriosclerótica, hipertensión arterial, hiperandrogenismo ovárico funcional.

Se sabe que los síntomas clínicos de todas las enfermedades mencionadas están asociados, de una u otra forma, con alguna clase de resistencia a la insulina.

Forma parte del conocimiento general del experto en la materia identificar si, por ejemplo, un humano tiene una de las enfermedades anteriores. Se hace referencia, por ejemplo, a la Librería Nacional de Medicina ("National Library of Medicine"), USA (NLM) página web: (http://www.nIm.nih.gov), en la cual se describen detalles de estas enfermedades.

En esta página se encuentra descrito, por ejemplo, el síndrome metabólico como "una colección de riesgos para la salud que incrementan tus posibilidades de desarrollar enfermedad cardiaca, infarto, y diabetes. La afección también se conoce con otros nombres incluyendo Síndrome No, síndrome de resistencia a la insulina, y síndrome dismetabólico. De acuerdo con un estudio nacional de salud, más de uno de cada cinco americanos tiene síndrome metabólico. El número de personas con síndrome metabólico aumenta con la edad, afectando a más del 40 por ciento de personas en los 60 ó 70 años".

Administración de sCD14

De acuerdo con las enseñanzas de la presente invención, se puede administrar sCD14 a animales y humanos para el tratamiento terapéutico o preventivo de una enfermedad que implica una afección inflamatoria crónica. El propósito de la administración de sCD14 puede ser preventivo (para evitar el desarrollo de estas enfermedades) y/o terapéutico (para tratar estas enfermedades una vez se han desarrollado/instalado). Preferentemente la sCD14 se administra a un humano. Si se administra a un animal se prefiere que el animal sea un ratón.

Preferentemente, la sCD14 se administra en dosis de aproximadamente 0,1 a 100 \mug/kg de peso corporal, preferentemente a un nivel de aproximadamente 1 a 50 \mug/kg de peso corporal, y la cantidad se puede administrar, por ejemplo, dividida en dosis diarias. La dosis particular se puede modificar dentro o fuera del rango aquí especificado dependiendo de la aplicación particular o la severidad de una enfermedad. Aquellos expertos en la materia pueden averiguar cuál es la dosis apropiada usando procedimientos estándar. Se entiende que la dosis debería ser una cantidad efectiva de sCD14 en el sentido de que se observa una mejora de la resistencia a la insulina en el sujeto tratado. La persona experta en la materia conoce el ensayo apropiado para analizar la mejora en la resistencia a la insulina y se puede encontrar orientación en los ejemplos de realización del presente documento.

De acuerdo con el conocimiento general se entiende que el medicamento puede estar en forma de una composición farmacéutica aceptable. Esta composición farmacéutica/medicamento se puede administrar de cualquier modo en el que se logre el propósito buscado. Por ejemplo, la administración puede llevarse a cabo por vía parenteral, incluyendo subcutánea, intravenosa, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intratecal, transdérmica o vías bucales. Alternativamente, o concurrentemente, la administración puede ser por vía oral o rectal. Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse de manera parenteral por inyección en el bolo o mediante liberación gradual a lo largo del tiempo.

Tal y como se ha explicado, Puesto que la sCD14 tan sólo normaliza el nivel de glucosa, no existe riesgo de niveles de glucosa demasiado bajos. Esto ofrece la posibilidad de, por ejemplo, administrar la sCD14 al paciente como un depósito (por ejemplo una composición de depósito inyectable). El depósito se puede fabricar con un perfil de liberación adecuado de sCD14 y el paciente puede con ello conseguir de manera fácil y cómoda una mejora continua de la resistencia a la insulina y, por tanto, unos niveles de glucosa en sangre normalizados de forma
continuada.

Por lo tanto, en una realización preferida de esta invención el medicamento comprende una composición de depósito, preferentemente una composición de depósito inyectable. Tras la introducción en el paciente (animal o humano), el depósito tendrá preferentemente un perfil de liberación adecuado para sCD14. El experto en la materia conoce numerosas composiciones de depósito apropiadas y estas se pueden fabricar con varios perfiles de liberación adecuados. Para más información relacionada con composiciones de depósito adecuadas véase, por ejemplo, la US6331311 con el título "Composición de depósito en gel inyectable y método para preparar la composición". Preferentemente la composición de depósito inyectable es una composición de depósito en gel inyectable.

Preferiblemente, la composición de depósito se administra mediante implante de un dispositivo adecuado, preferentemente subcutáneo. Un ejemplo de tal dispositivo adecuado son las llamadas bombas. Un ejemplo apropiado de esto es la comercialmente disponible Bomba Osmótica ALZET® de la empresa DURECT Corporation, Estados Unidos. El experto en la materia conoce las bombas adecuadas y estas proporcionan la posibilidad de una liberación continua (preferentemente por implantación subcutánea), eliminando con ello la necesidad de inyecciones frecuentes a lo largo de todo el día.

Un perfil de liberación adecuado podría ser, por ejemplo, un perfil de liberación que permita administrar el depósito en un intervalo periódico de cada 14 días a cada 3 meses.

Además de sCD14, las composiciones farmacéuticas pueden contener vehículos adecuados farmacéuticamente aceptables que comprenden excipientes y auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos que se pueden usar farmacéuticamente. Preferentemente, las preparaciones, particularmente aquellas que pueden administrarse oralmente y que se pueden usar para el tipo de administración preferida, tales como pastillas, grajeas y cápsulas, y también preparaciones que pueden administrarse por vía rectal, tales como supositorios, así como soluciones apropiadas para la administración por inyección o vía oral, contienen de 0,1 a aproximadamente 99 por ciento, preferentemente aproximadamente de 25-85 por ciento, de compuesto(s) activo(s) junto con el excipiente.

Excipientes apropiados son, en particular, rellenos tales como azúcares, tales como lactosa, sacarosa, manitol, o sorbitol; preparaciones de celulosa y/o fosfatos cálcicos, tales como fosfato tricálcico o hidrógeno fosfato de calcio; así como aglutinantes tales como pasta de almidón fabricada usando, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma de tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio, y/o polivinilpirrolidona. Si se desea, también se pueden añadir agentes desintegrantes, tales como los almidones ya mencionados, así como carboximetil almidón, polivinilpirrolidona reticulada, agar, ácido algínico o una sal derivada de este, tal como alginato sódico. Los auxiliares que se pueden usar en las composiciones de acuerdo con esta invención incluyen agentes reguladores del flujo y lubricantes como sílice, talco, ácido esteárico o sales derivadas del mismo, un detergente tal como Tritón, y/o polietilenglicol.

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Ejemplos

Ejemplo 1

Tratamiento de ratones C57BL/6J ob/ob diabéticos resistentes a la insulina con CD14 recombinante humana soluble

El objetivo de este experimento fue estudiar el efecto de la administración sistémica de sCD14 recombinante humana (rhCD14) con respecto a parámetros relevantes de resistencia a la insulina en ratones experimentales (ratones C57BL/6J ob/ob).

Materiales y métodos

Animales experimentales: ratones de raza C57BL/6J ob/ob (The Jackson lab.). Machos de 10 semanas de edad. Estos animales tenían obesidad con hiperfagia, hiperinsulinemia (la presencia de un exceso de insulina en 5 la sangre), resistencia a la insulina e hiperglucemia moderada (un exceso de azúcar en la sangre). Tratamiento de los ratones con rhCD14: se infundió rhCD14 de forma continua durante 12 días mediante el uso de bombas Alzet® (bomba 1002, 100 \mul) implantadas de forma subcutánea en la espalda de los animales. Se usaron 20 ratones. 10 con rhCD14 y 10 con suero salino (control). La dosis fue 1 \mug/g de peso de ratón/día y se administró de forma subcutánea durante
12 días.

Ensayo de tolerancia a la glucosa: Finalizados los 12 días y después de 16 horas de ayuno se realizó un ensayo intraperitoneal de tolerancia a la glucosa (GGT). Se inyectaron de forma intraperitoneal 2 g/kg de glucosa (Glucosmon, 50%). Se tomaron muestras de sangre (20 \mul) de la cola de los ratones a 0, 15, 30, 60, 120 y 180 minutos después de la administración de glucosa. Los niveles de glucosa en sangre se midieron usando un glucómetro convencional (Menarini) y los niveles de insulina se midieron por ELISA (Mercodia Ultrasensitive Mouse Insulin
ELISA).

Resultados

Se obtuvieron los siguientes resultados:

-: El tratamiento con rhCD14 no produjo cambios significativos entre controles y tratados en peso corporal, el peso de los músculos sóleos, el peso del tejido adiposo epidérmico o en la ingestión de comida.

-: El tratamiento con rhCD14 disminuyó los niveles basales de glucosa en suero en comparación con el grupo control. Los valores representan la media \pm SEM. Un análisis ANOVA de dos vías indicó una diferencia significativa (P < 0,02) entre las curvas de glucosa de los ratones control y los tratados con hCD14. Los valores de glucosa en sangre en ayunas fueron estadísticamente diferentes: 242 \pm 30 mg/dL en el control frente a 153 \pm 14 mg/dL en ratones tratados con hCD14, P =0,02.

-: Las concentraciones de insulina en suero también disminuyeron concomitantemente con el descenso de la glucosa en suero en ratones tratados con rhCD14. Sin embargo, este no disminuyó tan significativamente como lo hizo la glucosa. Un análisis ANOVA de dos vías indicó una diferencia significativa (P <0,0001) entre las curvas de insulina de ratones control y tratados con rhCD14.

En resumen, estos resultados hacen posible concluir que la rhCD14 tiene un efecto positivo con respecto a la normalización de los niveles de glucosa en sangre en ratones diabéticos C57BL/6J ob/ob. Debido a que los niveles de glucosa disminuyen significativamente y los niveles de insulina no se incrementaron (descenso relativamente menor que para la glucosa) es muy probable que sea debido a una mejora en la sensibilidad a la insulina (por ejemplo, menos resistencia a la insulina).

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Ejemplo 2

Relación entre las concentraciones de sCD14 en suero y la obesidad

El objetivo de este ejemplo fue estudiar las concentraciones de sCD14 en suero en relación al grado de obesidad y de parámetros de inflamación en individuos sanos. La hipótesis básica fue que la sCD14, la cual circula a elevadas concentraciones de manera constitutiva en el plasma, cumple una función importante en la neutralización del LPS. El mRNA de CD14 se ha encontrado en el tejido adiposo y en las células del sistema inmune.

Método

Se midieron las concentraciones de scud14 (EASIA, análisis sólido inmunoenzimático de sensibilidad amplificada) en relación con las medidas antropométricas y parámetros inflamatorios (fracciones solubles de los receptores 1 y 2 del factor de necrosis tumoral alfa, TNFR1s y TNFR2s, EASIA) en individuos sanos.

Resultados

Las concentraciones en suero de sCD14 no se correlacionaron significativamente con el índice de masa corporal (BMI) en el análisis global de los individuos (r = 0,06, p = 0,30, n = 229). Sin embargo, en pacientes delgados (BMI <25, n = 100), la sCD14 estaba asociada significativamente con el BMI (r = 0,36, p < 0,0001). Estas observaciones no se encontraron en pacientes obesos (r = 0,03, p = 0,67). Se observaron resultados impresionantes entre las concentraciones de sCD14 y TNFR2 en individuos obesos pero no en individuos delgados. Se encontró una asociación inversa entre ambos parámetros (r = -0,26, p <0,01, y r = 0,01, p = 0,87, respectivamente). Los individuos con BMI mayor de 30 kg/m^{2} tuvieron concentraciones de sCD14 más bajas (4,41 \pm 1,5 comparado con 4,83 \pm 1,2; p = 0,01).

Las menores concentraciones de sCD14 en individuos obesos podrían indicar un aumento de la actividad inflamatoria debido a su importancia crucial con respecto a la neutralización de LPS.

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Ejemplo 3

Relación entre las concentraciones en suero de sCD14 y la resistencia a la insulina

El objetivo de este estudio fue analizar la sCD14 en plasma y el polimorfismo C-159T en relación a parámetros de resistencia a la insulina en individuos sanos y pacientes con diabetes mellitus de tipo 2. La hipótesis básica era que la scud14, la cual circula a elevadas concentraciones de forma constitutiva en el plasma, ejerce una función importante en la neutralización de LPS. Un polimorfismo en el gen de la CD14 (una transición C-T en la posición -159), podría ejercer una función importante en la regulación de las concentraciones de sCD14 circulante.

Métodos

Se midieron las concentraciones de sCD14 en suero (usando EASIA) y el polimorfismo del gen de la CD14 en 123 individuos sanos y 32 pacientes con diabetes de tipo 2. En el subgrupo de los 32 pacientes también se realizaron un ensayo oral de tolerancia a la glucosa (OGTT) y un ensayo intravenoso de tolerancia a la glucosa con muestreos frecuentes.

Resultados

En la siguiente tabla se muestran los datos correspondientes a las antropometrías y variables analíticas de los individuos control.

En varones, las concentraciones de sCD14 en suero, ajustadas con respecto a las concentraciones de triglicéridos, se correlacionaron significativamente con la insulinemia basal (r = -0,25, p = 0,029), el índice basal para resistencia a la insulina (FIRI, r = -0,28, p = 0,014) y el ácido úrico circulante (r = -0,30, p = 0,006). En varones no fumadores (n = 44), la sCD14 se correlacionó significativamente con el perímetro abdominal (r = -0,30, p = 0,03), el FIRI (r = -0,30, p = 0,03), la presión arterial sistólica (r = -0,32, p = 0,029) y la presión arterial diastólica (r = 0,34, p = 0,022). También se realizó un análisis de regresión lineal múltiple para predecir el FIRI. En este análisis, el BMI (p <0,00001), las concentraciones basales de triglicéridos (p = 0,003) y la sCD14 (p = 0,04), pero no la edad, sexo, perímetro abdominal ni estatus de fumador, contribuyeron de manera independiente al 26% de la varianza del FIRI.

Los individuos sanos homocigotos C/C tuvieron una distribución similar de edad, sexo, BMI, masa grasa, índice cintura-cadera, presión arterial, glucemia basal e insulinemia basal, en relación a los individuos portadores de un alelo T. No obstante, los individuos C/C tuvieron mayores concentraciones integradas de glucosa durante el OGTT (ABC glucosa; p = 0,02) y un índice menor de sensibilidad a la insulina en comparación con los individuos portadores de un alelo T.

Los pacientes diabéticos homocigotos C/C tuvieron un menor índice de sensibilidad a la insulina (p=0,03) y mayores concentraciones de proteína C reactiva e ICAM-1 (p=0,01) en comparación con los portadores diabéticos del alelo T.

En consecuencia, se observó una asociación entre las concentraciones circulantes de sCD14, y una variante alélica de su gen, con parámetros de resistencia a la insulina en individuos sanos y en pacientes de diabetes de tipo 2. Se observó, además, un efecto del polimorfismo genético en la sensibilidad a la insulina y en la función endotelial (ICAM-1 s) en pacientes con diabetes mellitus de tipo 2.

TABLA Antropometrías y variables analíticas de los individuos control

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Ejemplo 4

Tratamiento de ratones obesos resistentes a la insulina C57BL/6J (ratones HF) con CD14 soluble recombinante humana

El objetivo de este experimento fue estudiar el efecto de la administración sistémica de sCD14 recombinante humana (rhCD14) con respecto a parámetros relevantes de resistencia a la insulina en ratones experimentales (ratones C57BL/6J (ratones HF).

Materiales y métodos

Animales experimentales: ratones macho de raza C57BL/6J (ratones HF) (The Jackson lab.). Estos animales tenían obesidad. Tratamiento de los ratones con rhCD14: Ratones macho C57BL/6J se alimentaron durante 26-28 semanas con una dieta HF (Harlan Teklad No. 88137: 21% en peso y 42% kcal de grasa). Los últimos 12 días, los ratones recibieron una dosis de 1 \mug/g en peso por día de hCD14 en dos inyecciones (0,5 \mug/g cada una) cada 12 horas. El grupo control se trató con vehículo (suero salino) solo. Cada grupo contenía 9 ratones.

Análisis de tolerancia a la glucosa: igual que en el ejemplo 1.

Resultados

Se obtuvieron los siguientes resultados:

-: El tratamiento con rhCD14 no produjo diferencias significativas entre tratados y controles en peso corporal, el peso de los músculos sóleos, el peso del tejido adiposo epidermal o en la ingestión de comida.

-: El tratamiento con rhCD14 disminuyó los niveles basales de glucosa en suero en comparación con el grupo control. Un análisis ANOVA de dos vías indicó una diferencia significativa (P < 0,002) entre las curvas de glucosa del control y de los ratones tratados con rhCD14.

-: Las concentraciones de insulina en suero aumentaron concomitantemente con el descenso de la glucosa en suero en ratones tratados con rhCD14. Sin embargo, esta no aumentó de manera tan significativa como descendió la glucosa. Un análisis ANOVA de dos vías indicó una diferencia significativa (P < 0,0001) entre las curvas de insulina de ratones control y tratados con hCD14.

En resumen, estos resultados hacen posible concluir que la rhCD14 tiene un efecto positivo con respecto a la normalización de los niveles de glucosa en sangre en los ratones obesos C57BL/6J HF tratados con hCD14. Debido a que los niveles de glucosa disminuyen significativamente y los niveles de insulina sólo se incrementan ligeramente, es muy probable que sea debido a una mejora de la sensibilidad a la insulina (por ejemplo menos resistencia a la insulina).

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Referencias citadas en la descripción Esta lista de referencias citadas por el solicitante únicamente es para comodidad del lector. Dicha lista no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO rechaza toda responsabilidad a este respecto. Documentos de patente citados en la descripción

\bullet WO 9101639 A [0005]

\bullet WO 92204908 A [0005]

\bullet WO 9319772 A [0005]

\bullet US 5804189 A [0005] [0022] [0024] [0025] [0026] [0026] [0027] [0028] [0029]

\bullet WO 9620957 A [0005]

\bullet US 5869055 A [0005] [0025] [0025]

\bullet US 6331311 B [0039]

Bibliografía no relativa a patentes citada en la descripción

\bulletWOLFGANG K et al@. Journal of the American College of Cardiology, United States, 03 July 2002, vol. 40 (1), 34-42 [0009]

<110> Mellitus S.L.

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<120> Uso de CD14 soluble para el tratamiento de enfermedades

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<130> P1075PC00

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<160> 1

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<170> PatentIn version 3.1

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<210> 1

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<211> 26

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<212> PRT

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<213> mamífero

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<400> 1

3

Claims

1. Uso de CD 14 soluble (sCD 14) para la fabricación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o preventivo de una enfermedad que implica tanto una afección inflamatoria crónica como un desorden clínico asociados a la resistencia a la insulina en un animal o un humano, en el que la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en diabetes mellitus de tipo 2, obesidad, síndrome metabólico, enfermedad arteriosclerótica, hipertensión arterial e hiperandrogenismo ovárico funcional y en el que,

cuando el tratamiento terapéutico es un tratamiento terapéutico de la enfermedad, el tratamiento terapéutico mejora la resistencia a la insulina en el animal o el humano y

cuando el tratamiento es un tratamiento preventivo de la enfermedad, el tratamiento preventivo está protegiendo ante el desarrollo negativo de resistencia a la insulina.

2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la enfermedad es diabetes mellitus de tipo 2.

3. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la enfermedad es obesidad.

4. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la enfermedad es síndrome metabólico.

5. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la enfermedad es enfermedad arteriosclerótica.

6. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la enfermedad es hipertensión arterial.

7. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la enfermedad es hiperandrogenismo ovárico funcional.

8. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el sCD 14 es sCD 14 humano.

9. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el sCD14 es una proteína o una sustancia que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos (SEC ID NO 1):

AELQQWLKPGLKVLSIAQAHSLNFSC

10. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el medicamento comprende una composición de depósito inyectable, la cual tiene un perfil de liberación adecuado de sCD14 después de la introducción en el animal o el humano.

11. Uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la composición de depósito ha de administrarse mediante implantación, preferentemente de forma subcutánea, en el animal o el humano de un dispositivo adecuado, preferentemente el dispositivo adecuado es una bomba.

12. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el medicamento es un medicamento para administrar a un humano.