ES2337260T3 - Metodos de induccion de la produccion de il-10. - Google Patents

Abstract

Método ex vivo para inducir la producción de IL-10 en una célula, que comprende poner en contacto dicha célula con una composición que comprende un polipéptido galectina-1 multimérico, en el que dicha célula es un linfocito, una célula dendrítica, un monocito o un macrófago.

Description

Métodos de inducción de la producción de IL-10.

Campo de la invención

La invención se refiere a métodos de inducción de la producción de interleuquina-10 en una célula.

Antecedentes de la invención

LGALS1 pertenece a la familia de las lectinas animales, las cuales se encuentran altamente conservadas evolutivamente. Las galectinas comparten similitudes de secuencia notables en el dominio de reconocimiento de carbohidrato y presentan afinidad para los glucoconjugados enriquecidos en polilactosamina (1, 2). LGALS1 codifica una proteína ligante de \beta-galactósido (\beta-GBP) y es conocida su unión a antígenos membranales de leucocitos como CD45, CD43 y CD7 (3-5). La proteína puede encontrarse tanto en forma de un monómero (\sim14,5 kDa, \beta-GBP) como de un homodímero (\sim29 kDa, galectina-1) (2,6). En su forma monomérica, la \beta-GBP inhibe la proliferación de las células T bloqueando a las células en las etapas S y G2/M (7). Como homodímero, la galectina-1 presenta diversos efectos sobre las interacciones célula-célula y célula-matriz (8, 9). Mediante el entrecruzamiento de las proteínas de superficie de las células T, la galectina 1 induce la apoptosis de células T activadas pero no de las células T en reposo (10). Este proceso está mediado por la activación de los factores de transcripción NFAT y AP-1 y mediante la regulación negativa de la proteína Bcl-2 (11, 12). La susceptibilidad de los timocitos inmaduros frente a la apoptosis inducida por galectina-1 sugiere un papel para la proteína durante la selección tímica (13).

Una de las funciones más intrigantes de la proteína galectina-1 es su papel en la inmunomodulación. La investigación durante las últimas décadas ha identificado un papel beneficioso para la galectina-1 en varios modelos de enfermedad autoinmunológica (14-16). Recientemente se ha demostrado que la galectina-1 inhibe la respuesta de células T alogénicas de una manera dependiente de la dosis y de los carbohidratos. La regulación negativa de la respuesta inmunológica aparentemente incluía tanto la apoptosis de las células T activadas como mecanismos no apoptóticos (17). La galectina-1 puede desempeñar un papel en la regulación negativa de la respuesta inmunológica mediante la modulación de la producción de citoquinas. En un modelo de ratón de la artritis reumatoide, el tratamiento con proteína galectina-1 resultó en un cambio de una respuesta de células T ayudante 1 (TH1) a una de células T ayudante 2 (TH2), que se vio acompañada por la regulación negativa del interferón (IFN)-\gamma y la regulación positiva de la interleuquina (IL)-5 en el drenaje de los nódulos linfáticos (16). Además, el tratamiento de galectina-1 indujo una reducción de la producción de IFN-\gamma y de factor de necrosis tumoral (TNF)-\alpha en hepatitis inducida por con-A en ratones (18) y en células T activadas por IL-2 (9). Recientemente, se ha descrito que la galectina-1 también suprime la colitis experimental en ratones (19). En este modelo, se observó una reducción de la producción de citoquinas inflamatorias, conjuntamente con apoptosis de células mononucleares.

Descripción resumida de la invención

La invención se basa en el descubrimiento de que la galectina-1 homodimérica induce niveles elevados de producción de IL-10 y de IL-1 \beta en células T tanto activadas como en reposo. De acuerdo con ello, la invención proporciona métodos para inducir la producción de IL-10 en una célula o en un tejido corporal. La producción de IL-10 resulta inducida por el contacto de una célula o de un tejido con un polipéptido galectina-1 multimérica. El polipéptido galectina-1 multimérica es un dímero. El polipéptido galectina-1 multimérico es estable. El término "estable" se refiere a que el multímero no se disocia en la forma monomérica a concentraciones bajas (por ejemplo inferiores a 7 \muM). Entre los polipéptidos galectina-1 ejemplares se incluyen la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 1 o SEC ID nº 2. La célula es cualquier célula que resulte capaz de expresar IL-10, por ejemplo, un linfocito tal como una célula T, una célula B o un monocito. La célula T se encuentra activada. Alternativamente, la célula T no se encuentra activada. Opcionalmente la célula T es CD4 y/o CD8-positiva. La célula establece contacto in vitro o ex vivo.

La invención también proporciona el polipéptido galectina-1 multimérico estable para la utilización como medicamento. La invención también proporciona la utilización de un polipéptido galectina-1 multimérico estable en la preparación de un medicamento para prevenir o aliviar un síntoma de un trastorno mediado inmunológicamente en un sujeto. El trastorno mediado inmunológicamente es, por ejemplo, asma, una enfermedad intestinal inflamatoria tal como la enfermedad de Crohn o la colitis ulcerosa o una enfermedad autoinmunológica tal como la esclerosis múltiple, la diabetes, la artritis reumatoide o el lupus eritematoso sistémico, el rechazo del trasplante o las alergias de tipo alimentario.

La inflamación resulta inhibida mediante la administración en un tejido inflamado (o en un tejido que presenta un riesgo de inflamación) de un polipéptido galectina-1 multimérico. Un tejido inflamado se caracteriza por enrojecimiento, dolor e hinchazón del tejido. Entre los tejidos se incluyen tejido epitelial, tejido pulmonar, tejido nervioso, tejido pancreático o tejido hepático. Por ejemplo, el tejido epitelial es tejido intestinal o piel.

El sujeto sufre o presenta un riesgo de desarrollar un trastorno inflamatorio. Entre los trastornos inflamatorios se incluyen, por ejemplo, la inflamación cardiovascular, la inflamación gastrointestinal, la inflamación hepática, la inflamación pulmonar, los trastornos autoinmunológicos, la alergia o la inflamación esquelética. Un sujeto que sufre o que presenta un riesgo de desarrollar un trastorno inflamatorio se identifica mediante métodos conocidos de la técnica, por ejemplo el examen macroscópico de tejido o la detección de marcadores asociados a inflamación en tejido o sangre. Entre los síntomas de la inflamación se incluyen dolor, enrojecimiento e hinchazón del tejido afectado. Un sujeto que sufre de inflamación gastrointestinal, tal como colitis, se identifica histológicamente a partir de la presencia de necrosis mucosal o lesiones hemorrágicas en el colon, diarrea frecuente o sangre y pus en las heces.

La invención proporciona además la utilización de un polipéptido galectina-1 multimérico estable en la preparación de un medicamento para incrementar la supervivencia de un injerto, por ejemplo un aloinjerto. La composición se administra en el sujeto antes, concomitantemente o después de que el sujeto reciba el trasplante. Opcionalmente la composición se administra durante un periodo de tiempo preseleccionado, tal como 1 a 2 semanas.

También se encuentra comprendida en la invención una composición purificada de vacuna que contiene un polipéptido galectina-1 y un antígeno. También se proporciona la utilización de las composiciones de vacuna de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de una enfermedad infecciosa o cáncer. Se vacuna un sujeto mediante la administración en el sujeto de una primera composición que contiene un polipéptido galectina-1 y una segunda composición que contiene un antígeno. La primera composición se administra concomitantemente a la segunda composición. Alternativamente, la primera composición se administra antes o después de la segunda composición.

El sujeto es un mamífero, tal como un ser humano, un primate, un ratón, una rata, un perro, un gato, una vaca, un caballo o un cerdo.

A menos que se indique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente invención presentan el mismo significado entendido comúnmente por un experto ordinario en la materia a la que se refiere la presente invención. Aunque pueden utilizarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria en la práctica o el ensayo de la presente invención, se describen posteriormente métodos y materiales adecuados. En caso de conflicto, prevalecerá la presente memoria, incluyendo las definiciones en la misma. Además, los materiales, métodos y ejemplos son meramente ilustrativos y no pretenden ser limitativos.

Otras características y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de la descripción detallada siguiente y de las reivindicaciones.

Breve descripción del dibujo

La figura 1 son gráficos de columnas que ilustran que la estimulación por galectina-1 induce fuertemente la producción de IL-10 y reduce la producción de IFN-\gamma en células mononucleares sanguíneas periféricas humanas y en linfocitos T CD4^{+} y CD8^{+}. A, producción de proteína IL-10 en PBMCs activadas anti-CD3 utilizando diferentes concentraciones de proteína galectina-1 (20 \muM, 2 \muM y 0,2 \muM) y efecto de inhibidores (lactosa 0,1 M o anticuerpos anti-galectina-1). B, producción de proteína IL-10 en linfocitos T CD4^{+} y CD8^{+}. Se muestra el resultado de un donante representativo (donante nº 1) de entre cuatro. C, producción de proteína IFN-\gamma en linfocitos T CD4^{+} y CD8^{+}. Se muestra la producción relativa de IFN-\gamma (anti-CD3/CD28 frente a anti-CD3/CD28 más galectina-1) como media \pm S.D. de cuatro donantes independientes. D, producción de ARNm de IL-10 en linfocitos T CD4^{+} y CD8+ según mediciones mediante análisis de PCR en tiempo real. Se muestra el resultado de uno de entre cuatro donantes (donante nº 1) como el factor de diferencia respecto a un calibrador común, tras la normalización respecto a un gen control endógeno. Se proporcionan los resultados de los cuatro donantes en la Tabla 1. E, expresión de CD25 y de CD69 según determinación mediante análisis FACS. Las PBMCs totales se dejaron en reposo o se estimularon durante 24 horas tal como se indica, antes de analizar la expresión de CD25 y de CD69.

La figura 2A es una fotografía de un gel que muestra el análisis de RT-PCR semicuantitativa para LGALS1, IL-10, IFN-\gamma y GAPDH. Los números de caso son los informados anteriormente (21) y el número de ciclos de PCR utilizados para la amplificación se muestra entre paréntesis.

La figura 2B es un gráfico de columnas que muestra el análisis de PCR en tiempo real para LGALS1, IL-10 e IFN-\gamma. Los números de casos son los mismos mostrados en la Tabla 1. Eje y izquierdo: cantidad relativa de ARNm de LGALS1; eje y derecho: cantidad relativa de ARNm de IL10 y de IFN-\gamma.

La figura 3 son fotografías que muestran la expresión de proteína galectina-1 en aloinjertos de riñón rechazados y en tejido de control normal. En el riñón normal, se encuentra galectina-1 en células epiteliales mesangiales glomerulares (A), las células musculares lisas de vasos grandes (B) y ocasionalmente las células en el intersticio son positivas para galectina-1 (C), mientras que no se observa galectina-1 en células endoteliales de capilares peritubulares (C). En aloinjertos de riñón rechazados (D-F), la galectina-1 se encuentra fuertemente regulada positivamente en células endoteliales de vasos grandes (D, E) y en células endoteliales de capilares peritubulares en el intersticio (F). Magnificaciones originales A-D: 400x, E: 630x, F: 400x.

La figura 4 es un gráfico de columnas que compara la inducción de IL-10 por parte de dímeros estables de galectina-1 en comparación con galectina-1 de tipo salvaje. Las concentraciones bajas de homodímeros estables de galectina-1 inducen fuertemente la producción de IL-10 en PBMCs totales. Se sometió a ensayo la galectina-1 de tipo salvaje a cuatro concentraciones diferentes (20, 10, 1 y 0,1 \muM). Se sometieron a ensayo homodímeros estables de galectina-1 (constructos 1 y 2) a concentraciones bajas (1 \muM y 0,1 \muM), que no resultaban efectivas para la galectina-1 de tipo salvaje. Los homodímeros estables de galectina-1 inducían una producción elevada de IL-10 a concentraciones hasta 200 veces inferiores a las de la galectina de tipo salvaje.

La figura 5 es un gráfico de columnas que muestra una comparación entre la producción de IL-10 por parte de una galectina-1 de tipo salvaje (mGal) a 3 concentraciones (20, 2 y 0,2 \muM) y una galectina-1 dimérica (dGal) a 3 concentraciones (2, 1 y 0,2 \muM) en linfocitos activados por CD3 de un donante representativo.

La figura 6 es un gráfico de columnas que muestra que la producción de IL-10 por parte de linfocitos tras la incubación con galectina-1 dimérica (1 \muM) resulta bloqueada mediante la preincubación con lactosa (0,1 M).

La figura 7 es un gráfico de columnas que muestra el efecto de la galectina-1 de tipo salvaje y de homodímeros estables de galectina-1 sobre la inducción de la apoptosis en células T MOLT-4. Los resultados se muestran como porcentaje de las células positivas para anexina V menos el porcentaje de células positivas para anexina V en células de control no estimuladas. Las barras de error representan desviaciones estándar de cuatro experimentos independientes.

La figura 8 es un gráfico de columnas que muestra la producción de IL-10 por parte de linfocitos de 5 voluntarios diferentes tras 24 horas de incubación con CD3 (1 ng/ml) y 3 concentraciones diferentes de galectina-1 dimérica (2, 1, 0,2 \muM).

La figura 9 es un gráfico de columnas que muestra que el ARNm de IL-10 se expresa en los linfocitos de 5 voluntarios diferentes tras 24 horas. Los linfocitos se incubaron con CD3 (1 ng/ml) y bajo 3 concentraciones de galectina-1 dimérica (2, 1 y 0,2 \muM).

La figura 10 es un gráfico de columnas que muestra una comparación entre la producción de IL-1\beta por parte de galectina-1 de tipo salvaje (mGal) a 3 concentraciones (20, 2 y 0,2 \muM) y de galectina-1 dimérica (dGal) a 3 concentraciones (2, 1 y 0,2 \muM) en linfocitos activados por CD3 de un donante representativo.

La figura 11 es un gráfico de columnas que muestra la producción de IL-1\beta por parte de linfocitos en 5 voluntarios diferentes tras 24 horas de incubación con CD3 (1 ng/ml) y bajo 3 concentraciones diferentes de galectina-1 dimérica (2, 1 y 0,2 \muM).

La figura 12 es un gráfico de columnas que muestra que la producción de IL-1 beta por parte de linfocitos tras la incubación con galectina-1 dimérica (1 \muM) resulta bloqueada específicamente mediante la preincubación con lactosa (0,1 M).

La figura 13 es un gráfico de columnas que muestra el ARNm de IL-10 expresado en biopsias de un paciente con colitis. Las biopsias se obtuvieron de 2 localizaciones, tejido de control (no inflamado) y tejido inflamado se incubaron en medio de cultivo de tejido durante 8 horas con o sin 2 concentraciones diferentes de galectina-1 dimérica (2,5 y 0,5 \muM).

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Descripción detallada

La invención se basa en parte en el inesperado descubrimiento de que una galectina-1 homodimérica estable induce niveles elevados de producción de IL-10 en células T tanto activadas como en reposo. En contraste, la galectina-1 monomérica (es decir, la proteína ligante de B-galactósido) no induce la producción de IL-10.

Polipéptidos de galectina-1

Las galectinas se definen como lectinas que presentan tanto capacidad de unión a galactósido como una secuencia de aminoácidos característica. La galectina-1 es una lectina homodimérica con especificidad para los beta-galactósidos. La lectina se sintetiza en el citosol de las células de mamífero, donde se acumula en forma monomérica, secretándose hacia el exterior de la célula, donde forma homodímeros. Típicamente, las lectinas funcionales existen en equilibrio monómero-dímero con una K de 7 \muM y la tasa de equilibrio es bastante lenta (t_{1/2}=10 horas).

La presente invención proporciona multímeros de galactina-1 (por ejemplo dímeros, trímeros, etc.). Preferentemente, el multímero galectina-1 es un homodímero. Los multímeros de galectina-1 son más estables que la galectina-1 de tipo salvaje e inducen la producción de IL-10. El multímero de galectina-1 además induce la producción de IL-1\beta. El término "estable" se refiere a que los multímeros de galectina-1 no se disocian para formar monómeros a concentraciones bajas. Por ejemplo, los polipéptidos de galectina-1 de la invención son multímeros a concentraciones inferiores a 7 \muM, 6 \muM, 5 \muM, 4 \muM, 3 \muM, 2 \muM, 1 \muM, 0,1 \muM ó 0,001 \muM. Los multímeros de galectina resultan eficaces en la inducción de la producción de IL-10 y de IL-1\beta a concentraciones más bajas que la galectina de tipo salvaje. Los dímeros estables de galectina inducen la producción de IL-10 a concentraciones 10, 50, 100, 150, 200, 250 ó 300 veces inferiores que la galectina de tipo salvaje. De esta manera, los polipéptidos de galectina-1 de la invención presentan ventajas sobre la galectina de tipo salvaje debido a que pueden administrarse a concentración más baja y por lo tanto evitan el desarrollo de efectos secundarios no deseados. Los multímeros de galectina-1 también inducen la apoptosis, es decir, la muerte celular programada. En comparación con los tratamientos directos con IL-10 y con monómero de galectina-1, los homodímeros estables de galectina-1 presentan la ventaja de eliminar efectivamente las células T activadas mediante inducción de apoptosis. Los multímeros de galectina-1 también regulan negativamente, es decir, inhiben la producción de IFN\gamma.

Los multímeros estables de galectina-1 se producen mediante la construcción de un monómero recombinante de galectina-1 con un grupo cremallera de leucinas en el extremo N-terminal y/o C-terminal de un polipéptido galectina de tipo salvaje (normal), o una variante o fragmento del mismo. Opcionalmente, una región bisagra une el grupo galactina-1 de tipo salvaje y el grupo cremallera de leucinas. Los multímeros estables de galectina se preparan fácilmente mediante técnicas de clonación modernas, o pueden sintetizarse mediante métodos de estado sólido. Alternativamente a la expresión recombinante, los péptidos multímeros de galectina pueden sintetizarse químicamente mediante técnicas estándares de síntesis de péptidos. Los dímeros estables también se construyen mediante técnicas conocidas de manipulación de proteínas, tales como el diseño racional asistido por ordenador.

Entre las fuentes adecuadas de ácidos nucleicos codificantes de polipéptido galectina-1 de tipo salvaje se incluyen, por ejemplo, los ácidos nucleicos de galectina-1 humana (y las secuencias proteicas codificadas), disponible de GenBank nº de acceso BT006775 y AAP35421, respectivamente, y de GenBank nº de acceso BT007914 y AAP36586, respectivamente.

Entre los monómeros de galectina-1 recombinante ejemplares que resultan útiles para producir el multímero estable se incluyen la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 1 ó 2, o variantes o fragmentos de la misma, tal como se muestra posteriormente. La SEC ID nº 1 se construyó con un grupo cremallera de leucinas (en cursiva) etiquetado con histidinas unido al extremo amino-terminal de un grupo galectina-1 de tipo salvaje (subrayado) mediante un grupo espaciador bisagra (en negrita). Los residuos de leucina en la cremallera FOS se indican en negrita, la SEC ID nº 2 se construyó con un grupo cremallera de leucinas (en cursiva) etiquetado con histidinas unido al extremo carboxilo-terminal de un grupo galectina-1 de tipo salvaje (subrayado) mediante un grupo espaciador bisagra (en negrita).

1

2

El multímero de galectina-1 son polímeros de L-aminoácidos, D-aminoácidos o una combinación de ambos tipos. Por ejemplo, en diversas realizaciones, los péptidos son péptidos D retro-inversos. El término "isómero retro-inverso" se refiere a un isómero de un péptido lineal en el que la orientación de la secuencia se encuentra invertida, y la quiralidad de cada residuo aminoácido se encuentra invertida (ver, por ejemplo, Jameson et al., Nature 368:744-746, 1994; Brady et al., Nature 368:692-693, 1994). El resultado neto de combinar enantiómeros D y la síntesis inversa es que las posiciones de los grupos carbonilo y amino en cada enlace amida se encuentran intercambiados, mientras que la posición de los grupos de cadena lateral en cada carbono alfa se conservan. A menos que se indique específicamente lo contrario, se supone que cualquier secuencia de L-aminoácido dado del a invención puede convertirse en un péptido D retro-inverso mediante la síntesis de un inverso de la secuencia para la secuencia de L-aminoácido nativo correspondiente.

Los monómeros de galectina-1 recombinante o las variantes de galectina-1 se utilizan para producir proteínas quiméricas o de fusión. Tal como se utiliza en la presente memoria, una galectina-1 "proteína quimérica" o "proteína de fusión" comprende un monómero de galectina-1 recombinante (por ejemplo SEC ID nº 1 o SEC ID nº 2) operablemente ligado a un segundo polipéptido. Opcionalmente, las proteínas de fusión se utilizan para formar multímeros estables, tales como dímeros.

Por ejemplo, en la presente invención se describe un péptido quimérico que incluye un primer dominio que contiene monómero de galectina-1 recombinante operablemente unido a un segundo dominio que contiene una secuencia de traslocación.

Una "secuencia de traslocación" se refiere a cualquier secuencia de aminoácidos que dirige un péptido en el que se encuentra presente hasta una destinación celular deseada. Por ejemplo, la secuencia de traslocación es poliarginina. De esta manera, la secuencia de traslocación puede dirigir o facilitar la penetración del péptido en una membrana biológica, por ejemplo una membrana fosfolipídica, una membrana mitocondrial o una membrana nuclear. Por ejemplo, la secuencia de traslocación dirige el péptido desde el exterior de la célula a través de la membrana plasmática y hacia el interior del citoplasma o hasta una localización deseada dentro de la célula, por ejemplo el núcleo, el ribosoma, la mitocondria, el RE, un lisosoma o un peroxisoma. Alternativamente, o adicionalmente, la secuencia de traslocación puede dirigir el péptido a través de una barrera fisiológica, tal como la barrera hematocefálica, la barrera transmucosal o las barreras hematoencefálica, hematoretinal, gastrointestinal y pulmonar.

La proteína de fusión puede ser una proteína de fusión de GST-péptido monómero de galectina-1 recombinante, en la que la secuencia del monómero de galectina-1 recombinante se fusiona con el extremo C-terminal de la secuencia de la GST (es decir, la glutatión-S-transferasa). Estas proteínas de fusión pueden facilitar la purificación del péptido galectina-1 recombinante.

La proteína de fusión también puede ser una proteína de fusión de monómero de galectina-1 recombinante-inmunoglobulina, en la que las secuencias de monómero de galectina-1 recombinante se fusionan con secuencias derivadas de un miembro de la familia de proteínas inmunoglobulinas.

También se dan a conocer derivados, fragmentos, homólogos, análogos y variantes del polipéptido multímero de galectina-1 y de los ácidos nucleicos codificantes de dichos polipéptidos. Para los ácidos nucleicos, los derivados, fragmentos y análogos indicados en la presente invención se definen como secuencias de por lo menos 6 ácidos nucleicos (contiguos), y que presentan una longitud suficiente para permitir la hibridación específica. Para los aminoácidos, los derivados, fragmentos y análogos descritos en la presente invención se definen como secuencias de por lo menos 4 aminoácidos (contiguos), una longitud suficiente para permitir el reconocimiento específico de un epítopo.

La longitud de los fragmentos es inferior a la longitud del ácido nucleico o del polipéptido de longitud completa correspondiente a partir del que se deriva el polipéptido multímero de galectina-1 o el ácido nucleico codificante del mismo. Los derivados y análogos pueden ser de longitud completa o de una longitud diferente de la completa, en el caso de que el derivado o análogo contenga un ácido nucleico o aminoácido modificado. Entre los derivados o análogos del polipéptido multímero de galectina-1 se incluyen, por ejemplo, moléculas que incluyen regiones que son sustancialmente homólogas a los péptidos, en diversas realizaciones, que presentan una identidad de por lo menos aproximadamente 30%, 50%, 70%, 80% o 95%, o incluso 99%, respecto a una secuencia de aminoácidos de tamaño idéntico, o en comparación con una secuencia alineada en la que la alineación se lleva a cabo utilizando un programa informático de homologías conocido de la técnica. Por ejemplo, la identidad de secuencias puede medirse utilizando software de análisis de secuencias (paquete informático de análisis de secuencias del Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705), con los parámetros por defecto del mismo.

En el caso de secuencias polipeptídicas, que presentan una identidad inferior al 100% respecto a una secuencia de referencia, las posiciones no idénticas preferentemente, aunque no necesariamente, son sustituciones conservadoras para la secuencia de referencia. Las sustituciones conservadoras típicamente incluyen sustituciones dentro de los grupos siguientes: glicina y alanina, valina, isoleucina y leucina; ácido aspártico y ácido glutámico; asparagina y glutamina; serina y treonina; lisina y arginina; y fenilalanina y tirosina. En la presente invención se dan a conocer péptidos que presentan secuencias mutadas de manera que siguen siendo homólogos, por ejemplo en la secuencia, en la función y en el carácter antigénico u otra función, con una proteína que presenta la secuencia parental correspondiente. Estas mutaciones pueden ser, por ejemplo, mutaciones que implican cambios conservadores de aminoácidos, por ejemplo cambios entre aminoácidos de propiedades moleculares globalmente similares. Por ejemplo, los intercambios en el grupo alifático alanina, valina, leucina e isoleucina pueden considerarse conservadores. En ocasiones, la sustitución de la glicina por uno de dichos grupos puede considerarse conservadora. Entre otros intercambios conservadores se incluyen aquellos dentro del grupo alifático aspartato y glutamato; dentro del grupo amida asparagina y glutamina; dentro del grupo hidroxilo serina y treonina; dentro del grupo aromático fenilalanina, tirosina y triptófano; dentro del grupo básico lisina, arginina e histidina; y dentro del grupo que contiene azufre, metionina y cisteína. En ocasiones la sustitución dentro del grupo metionina y leucina también puede considerarse conservadora. Los grupos de sustitución conservadora preferentes son aspartato-glutamato, asparagina-glutamina, valina-leucina-isoleucina, alanina-valina, fenilalanina-tirosina y lisina-arginina.

En el caso de que se haga referencia a que un polipéptido particular presenta una identidad de secuencia específica respecto a un polipéptido de referencia de una longitud definida, el porcentaje de identidad se refiere al péptido de referencia. De esta manera, un péptido que es idéntico al 50% respecto a un polipéptido de referencia que presenta una longitud de 100 aminoácido puede ser un polipéptido de 50 aminoácidos que es completamente idéntico a una porción de 50 aminoácidos de longitud del polipéptido de referencia. También puede ser un polipéptido de 100 aminoácidos de longitud que es idéntico al 50% respecto al polipéptido de referencia a lo largo de su longitud completa. Evidentemente otros polipéptidos satisfarán los mismos criterios.

También se dan a conocer variantes alélicas de los polipéptidos o péptidos dados a conocer; es decir, formas alternativas naturales del polinucleótido aislado que también codifican péptidos que son idénticos, homólogos o relacionados con el codificado por los polinucleótidos. Alternativamente, pueden producirse variantes no naturales mediante técnicas de mutagénesis o mediante síntesis directa.

También se describen en la presente memoria especies homólogas de los polinucleótidos y péptidos dados a conocer. El término "variante" se refiere a un polinucleótido o polipéptido diferente del polinucleótido o polipéptido descrito en la presente memoria, pero que conserva propiedades esenciales de los mismos. Generalmente, las variantes globalmente son muy similares, y en muchas regiones, idénticas al polinucleótido o polipéptido descritos en la presente invención. Las variantes pueden contener alteraciones de las regiones codificantes, regiones no codificantes, o ambas.

Entre las secuencias alteradas se incluyen inserciones de manera que la secuencia de aminoácidos global se alargue, conservando la proteína las propiedades de inducción de IL-10. Además, las secuencias alteradas pueden incluir deleciones internas aleatorias o diseñadas que acortan la secuencia de aminoácidos global, conservando la proteína las propiedades de transporte. Las secuencias alteradas adicional o alternativamente pueden encontrarse codificadas por polinucleótidos que se hibridan bajo condiciones astringentes con la cadena apropiadas del polinucleótido natural codificante de un polipéptido o péptido a partir del que se deriva el multímero de galectina-1. El péptido variante puede someterse a ensayo para la inducción de IL-10 utilizando los ensayos descritos en la presente invención. Las "condiciones astringentes" dependen de la secuencia y serán diferentes bajo circunstancias diferentes. Generalmente, las condiciones astringentes pueden seleccionarse que sean aproximadamente 5ºC menos que el punto de fusión térmica (T_{M}) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. La T_{M} es la temperatura (bajo la fuerza iónica y pH definidos) a la que 50% de la secuencia diana se hibrida a una sonda perfectamente correspondiente. Típicamente, las condiciones astringentes serán aquéllas en las que la concentración salina es por lo menos aproximadamente 0,02 molar a pH 7 y la temperatura sea de por lo menos aproximadamente 60ºC. Debido a que otros factores pueden afectar a la astringencia de la hibridación (incluyendo, entre otros, la composición de bases y el tamaño de las cadenas complementarias), la presencia de solventes orgánicos y el grado de desapareamiento de las bases, es más importante la combinación de los parámetros que la magnitud absoluta de cualquiera de los mismos.

La astringencia elevada puede incluir, por ejemplo, lo siguiente. Etapa 1: los filtros que contienen ADN se pretratan durante un periodo de entre 8 horas y toda la noche, a 65ºC en tampón compuesto de 6X SSC, Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM, PVP al 0,02%, Ficoll al 0,02%, BSA al 0,02% y 500 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Etapa 2: los filtros se hibridan durante 48 horas a 65ºC en la mezcla de prehibridación anterior a la que se añaden 100 mg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y 5-20x10^{6} cpm de sonda marcada con ^{32}P. Etapa 3: los filtros se lavan durante 1 hora a 37ºC en una solución que contiene 2X SSC, PVP al 0,01%, Ficoll al 0,01% y BSA al 0,01%. A continuación, se realiza un lavado en 0,1XSSC a 50ºC durante 45 minutos. Etapa 4: se autorradiografían los filtros. Otras condiciones de elevada astringencia que pueden utilizarse son bien conocidas de la técnica (ver, por ejemplo, Ausubel et al. (editores), 1993, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley and Sons, NY; y Kriegler, 1990, GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, John Wiley and Sons, Stockton Press, NY.

Entre las condiciones de astringencia moderadas se incluyen las siguientes: etapa 1: los filtros que contienen ADN se pretratan durante 6 horas a 55ºC en una solución que contiene 6X SSC, 5X solución de Denhardt, SDS al 0,5% y 100 mg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Etapa 2: los filtros se hibridan durante 18 a 20 horas a 55ºC en la misma solución, añadiendo 5-20x10^{6} cpm de sonda marcada con ^{32}P. Etapa 3: los filtros se lavan a 37ºC durante 1 hora en una solución que contiene 2X SSC, SDS al 0,1%, después se lavan dos veces durante 30 minutos a 60ºC en una solución que contiene 1X SSC y SDS al 0,1%. Etapa 4: los filtros se secan con papel de filtro y se exponen para la autorradiografía. Otras condiciones de astringencia moderada que pueden utilizarse son bien conocidas de la técnica (ver, por ejemplo, Ausubel et al. (editores), 1993, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley and Sons, NY; y Kriegler, 1990, GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY.

La astringencia baja puede incluir: etapa 1: los filtros que contienen ADN se pretratan durante 6 horas a 40ºC en una solución que contiene formamida al 35%, 5X SSC, Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), EDTA 5 mM, PVP al 0,1%, Ficoll al 0,1%, BSA al 1% y 500 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Etapa 2: los filtros se hibridan durante 18 a 20 horas a 40ºC en la misma solución con la adición de PVP al 0,02%, Ficoll al 0,02%, BSA al 0,2%, 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón, dextrán sulfato al 10% (p/v) y 5-20x10^{6} cpm de sonda marcada con 32P. Etapa 3: los filtros se lavan durante 1,5 horas a 55ºC en una solución que contiene 2X SSC, Tris-HCl 25 mM (pH 7,4), EDTA 5 mM y SDS al 0,1%. La solución de lavado se sustituye con solución fresca y se incuba durante 1,5 horas adicionales a 60ºC. Etapa 4: los filtros se secan con papel de filtro y se exponen para la autorradiografía. En caso necesario, los filtros se lavan una tercera vez a una temperatura de entre 65ºC y 68ºC y se reexponen a película. Otras condiciones de astringencia reducida que pueden utilizarse son bien conocidas de la técnica (por ejemplo las utilizadas para las hibridaciones entre especies) (ver, por ejemplo, Ausubel et al., editores, 1993, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley and Sons, NY; y Kriegler, 1990, GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY.

Métodos para inducir la producción de IL-10

La interleuquina-10 (IL-10) es un regulador negativo esencial de la respuesta inflamatoria. IL-10 inhibe la activación y la función efectora de las células T, monocitos y macrófagos. IL-10 es una citoquina multifuncional con diversos efectos sobre la mayoría de tipos celulares hematopoyéticos. La función principal de IL-10 es limitar y en última instancia terminar las respuestas inflamatorias. Además de dichas actividades, IL-10 regula el crecimiento y/o la diferenciación de las células B, células NK, células T citotóxicas y ayudantes, mastocitos, granulocitos, células dendríticas, queratinocitos y células endoteliales. IL-10 desempeña un papel crucial en la diferenciación y funcionamiento de un tipo nuevamente apreciado de célula T, la célula T reguladora, que puede controlar las respuestas inmunológicas y la tolerancia in vivo.

La invención proporciona métodos para inducir o intensificar la producción de IL-10. Se pone en contacto una célula o tejido con un polipéptido galectina-1 en una cantidad suficiente para inducir la producción de IL-10. Un tejido es, por ejemplo, un tejido del sistema inmunológico, tal como el tejido de nódulo linfático. Opcionalmente, el tejido se encuentra inflamado. La célula es cualquier célula capaz de producir IL-10. La célula es una célula no cancerosa. Alternativamente, la célula es una célula cancerosa. Preferentemente, la célula es una célula inmunológica. Por ejemplo, la célula es un linfocito, tal como una célula B, o una célula T, una célula dendríticas, un monocito o un macrófago. La célula se encuentra activada. Alternativamente, la célula no se encuentra activada. La célula es CD4 y/o CD8-positiva. La célula se pone en contacto in vitro o ex vivo.

La célula que entra en contacto con las composiciones incrementa la producción de IL-10 en comparación con una célula de referencia. La célula o población celular de referencia no ha sido expuesta a la composición. Preferentemente, la célula de referencia es similar a la célula expuesta a la composición. Por ejemplo, en el caso de que la célula expuesta a la composición sea una célula T no activada, la población celular de referencia comprende células T no activadas. Alternativamente, la población celular de referencia se deriva de una base de datos de información molecular derivada de células para las que el parámetro o condición sometida a ensayo es conocida.

Se define la inducción de la producción de IL-10 a partir de un incremento de la expresión o actividad de IL-10. La intensificación de la producción de IL-10 se refiere a un incremento de la producción de IL-10 en comparación con los niveles normales de producción de IL-10. La expresión de IL-10 se determina al nivel del ARN mediante cualquier método conocido de la técnica. Por ejemplo, el análisis de hibridación northern utilizando sondas que reconocen específicamente un gel IL-10 puede utilizarse para determinar la expresión génica.

Alternativamente, la expresión se mide utilizando un ensayo de PCR cuantitativa basada en la transcripción inversa, por ejemplo utilizando cebadores específicos para IL-10. La expresión de IL-10 también se determina al nivel de las proteínas, es decir, mediante la medición de los niveles de proteína IL-10. Estos métodos son bien conocidos de la técnica y entre ellos se incluyen, por ejemplo, los inmunoensayos basados en anticuerpos contra IL-10 y los ensayos de cribado de IL-10 disponibles comercialmente.

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Métodos para reducir la inflamación

La inflamación se inhibe mediante la administración en el tejido de polipéptido galectina-1. Entre los tejidos que pueden tratarse se incluyen un tejido intestinal, un tejido cardiaco, un tejido pulmonar, un tejido dérmico o un tejido hepático. Por ejemplo, el tejido es un tejido epitelial, tal como un tejido epitelial intestinal, tejido epitelial pulmonar, tejido dérmico (es decir, piel) o tejido epitelial hepático.

La inflamación resulta inhibida al reducir uno o más indicios o síntomas de la inflamación en comparación con un tejido que no ha entrado en contacto con un polipéptido galectina-1. Entre los indicios y síntomas de la inflamación se incluye, por ejemplo enrojecimiento, dolor, calor local y/o hinchazón del tejido tratado. Los tejidos se ponen en contacto directo con los polipéptidos. Alternativamente, el polipéptido se administra sistémicamente. Los polipéptidos galectina-1 se administran en una cantidad suficiente para reducir (por ejemplo inhibir) la producción de citoquina inmunosupresora. Una citoquina inmunosupresora es una citoquina que reduce una respuesta inflamatoria. Por ejemplo, la citoquina inmunosupresora es IL-10. Una respuesta inflamatoria se evalúa morfológicamente mediante la observación del daño a los tejidos, el enrojecimiento localizado, la temperatura incrementa y el hinchazón del área afectada. Alternativamente, se evalúa una respuesta inflamatoria mediante la medición de las proteínas c-reactivas, diversas citoquinas (por ejemplo IL-1 en el tejido o en el suero o plasma) o la presencia de células inflamatorias. Una reducción del recuento de glóbulos blancos generalmente indica una reducción de la inflamación.

La eficacia del tratamiento se determina en relación a cualquier método conocido para el diagnóstico o tratamiento del trastorno de tipo inmunológico. El alivio de uno o más síntomas del trastorno de tipo inmunológico indica que el compuesto proporciona un beneficio clínico.

Los métodos resultan útiles para aliviar los síntomas de una diversidad de trastornos de tipo inmunológico, tales como un trastorno inflamatorio. El trastorno inflamatorio es agudo o crónico. Entre los trastornos inflamatorios se incluyen la inflamación cardiovascular, la inflamación gastrointestinal, los trastornos inflamatorios hepáticos, la inflamación pulmonar, la enfermedad autoinmunológica (por ejemplo el lupus eritematoso sistémico, la esclerosis múltiple, la diabetes, la dermatomiositis, la polimiositis, las neuropatías inflamatorias (Guillain Barré, polineuropatías inflamatorias), la vasculitis (granulomatosis de Wegener, poliarteritis nodosa), la polimialgia reumática, la artritis temporal, el síndrome de Sjögren, la enfermedad de Bechet, el síndrome de Churg-Strauss, la arteritis de Takayasu), los trastornos neuroinflamatorios (por ejemplo la esclerosis múltiple), la alergia (por ejemplo la rinitis alérgica/sinusitis, las alergias y trastornos de la piel (por ejemplo la urticaria y el prurito, el angioedema, la dermatitis atópica, la dermatitis por contacto, la soriasis), las alergias alimentarias, las alergias farmacológicas, las alergias a insectos, la mastocitosis, la inflamación esquelética (por ejemplo la artritis, la osteoartritis, la artritis reumatoide, la espondiloartropatías) y el rechazo crónico o agudo del trasplante.

Los métodos descritos en la presente memoria conducen a una reducción de la severidad o el alivio de uno o más síntomas de un trastorno inflamatorio tal como los indicados en la presente memoria. Los trastornos inflamatorios son diagnosticados y/o monitorizados por un médico mediante metodologías estándares.

Trastornos inflamatorios gastrointestinales

Entre los trastornos inflamatorios gastrointestinales se incluyen, por ejemplo, la enfermedad intestinal inflamatoria, la enfermedad de Crohn, la colitis (ulcerosa, ileitis o proctitis).

La colitis ulcerosa es una enfermedad intestinal inflamatoria que causa inflamación y lesiones, denominadas úlceras, en las capas superiores del revestimiento del intestino grueso. La inflamación habitualmente se produce en el recto y parte inferior del colon, pero puede afectar a la totalidad del colon. La colitis ulcerosa raramente afecta al intestino delgado, excepto en su sección inferior, denominada ileo. La colitis ulcerosa aparece más frecuentemente en personas de edades comprendidas entre 15 y 40, aunque niños y personas de mayor edad pueden desarrollar la enfermedad. La colitis ulcerosa afecta a hombres y mujeres igualmente y aparentemente es hereditaria. La enfermedad de Crohn causa inflamación más profundamente dentro de la pared intestinal. La enfermedad de Crohn habitualmente aparece en el intestino delgado, pero también puede aparecer en la boca, esófago, estómago, duodeno, intestino grueso, apéndice y ano.

Los síntomas de un trastorno inflamatorio gastrointestinal son el dolor abdominal y la diarrea sanguinolenta. Entre otros síntomas se incluyen fatiga, pérdida de peso, pérdida del apetito, sangrado rectal y pérdida de líquidos y nutrientes corporales. La inflamación gastrointestinal también puede provocar problemas tales como artritis, inflamación ocular, enfermedad hepática (hígado graso, hepatitis, cirrosis y colangitis esclerosante primaria), osteoporosis, erupciones en la piel, anemia y cálculos renales.

La inflamación gastrointestinal se diagnostica utilizando ensayos para comprobar la existencia de anemia, que puede indicar sangrado en el colon o el recto. Además, puede obtenerse una muestra de las heces para determinar la existencia de sangrado o infección en el colon o el recto. Alternativamente, se lleva a cabo una colonoscopia para detectar inflamación, sangrado o úlceras en la pared del colon.

Trastornos inflamatorios pulmonares

Entre los trastornos inflamatorios pulmonares se incluye, por ejemplo, la sinusitis, el síndrome del distrés respiratorio agudo, el asma, la displasia broncopulmonar (BPD), el enfisema, las enfermedades pulmonares intersticiales, el daño pulmonar y la hipertensión pulmonar.

El asma es una condición pulmonar crónica que puede desarrollarse a cualquier edad. Es más común en la infancia y se presenta en aproximadamente 7% a 10% de la población pediátrica. El asma afecta a dos veces más niños que niñas durante la infancia; más niñas que niños desarrollan asma durante la adolescencia, y en la adultez, la proporción de varones a hembras se convierte en 1:1. Entre los síntomas del asma se incluyen la falta de aliento, la respiración ruidosa, la constricción de los músculos pectorales, la tos, la producción de esputo, la respiración/jadeo rápida excesiva, la taquicardia y la fatiga extrema. El asma se diagnostica mediante el examen físico, es decir escuchando los pulmones con un estetoscopio, examinando las vías nasales, rayos X del pecho, análisis sanguíneos o espirometría.

Trastornos neuroinflamatorios

Entre los trastornos neuroinflamatorios se incluyen, por ejemplo, la esclerosis múltiple, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer y el ictus isquémico.

La esclerosis múltiple (MS) es una enfermedad desmielinizante inflamatoria del sistema nervioso central que se cree que presenta una patogénesis autoinmunológica. La MS se clasifica según su curso clínico en varias categorías: benigna, recidivante-remitente (la variante más común), progresiva-recidivante, progresiva primaria y progresiva secundaria.

Patológicamente, la MS se caracteriza por la presencia de áreas de desmielinización e inflamación perivascular con predominio de células T en la materia blanca del cerebro. Algunos axones pueden salvarse de estos procesos patológicos. La enfermedad se inicia más comúnmente con la aparición aguda o subaguda de anormalidades neurológicas. Los síntomas iniciales y posteriores pueden variar drásticamente en su expresión y severidad durante el curso de la enfermedad, que habitualmente se prolonga durante muchos años. Entre los síntomas tempranos pueden incluirse la insensibilidad y/o parestesia, la monoparesis o paraparesis, la visión doble, la neuritis óptica, la ataxia y problemas con el control de la vejiga. Entre los síntomas posteriores también se incluyen indicios más prominentes en las neuronas motoras superiores, es decir espasticidad incrementada, paraparesis o cuadriparesis creciente, vértigo, descoordinación y otros problemas cerebelares, depresión, inestabilidad emocional, anormalidades de la marcha, disartria, fatiga y dolor.

La base del diagnóstico está constituida por la observación clínica, los resultados de la obtención de imágenes de resonancia magnética (presencia de áreas de desmielinización en el SNC), examen del líquido espinal (presencia de bandas oligoclonales y/o un índice IgG incrementado) y en ocasiones ensayos de potenciales inducidos. El diagnóstico diferencial de la MS incluye otras enfermedades desmielinizantes del sistema nervioso, con frecuencia de un origen vírico o postinfeccioso. Entre ellas se encuentran la encefalomielitis, la mielitis transversa, así como otras condiciones de tipo inmunológico que afectan al SNC, tales como la sarcoidosis, el lupus eritematoso sistémico, la deficiencia de vitamina B-12, etc.

Trastornos inflamatorios esqueléticos

Entre los trastornos inflamatorios esqueléticos se incluyen, por ejemplo, la artritis, la osteoartritis, la artritis reumatoide y las espondiloartropatías. La artritis es la inflamación de una o más articulaciones, caracterizada por hinchazón, calor y enrojecimiento de la piel contigua, dolor y restricción del movimiento. Existen más de 200 enfermedades que pueden causar artritis. La artritis puede dividirse en dos categorías principales: (1) artritis no inflamatoria, y (2) artritis inflamatoria. La artritis puede desarrollarse como resultado de una infección, tal como la gonorrea o la enfermedad de Lyme.

La artritis osteoartritis (OA), también denominada artritis degenerativa, se produce al descomponerse el cartílago amortiguador en una articulación. Las articulaciones que soportan peso, incluyendo la zona lumbar, las caderas, las rodillas y los pies, son las afectadas más comúnmente. Entre los síntomas se incluyen dolor y rigidez que resultan influenciados por los cambios meteorológicos, habitualmente empeorando en tiempo húmedo, frío y lluvioso, e inestabilidad o combamiento de las rodillas, especialmente al bajar escaleras. La OA se diagnostica mediante examen físico, análisis de sangre y rayos X.

La artritis espondilitis anquilosante es una enfermedad inflamatoria crónica de la columna que puede resultar en la fusión de vértebras y en una columna rígida. Los síntomas de la espondilitis anquilosante generalmente aparecen en adultos jóvenes como hinchazón y dolor en la zona lumbar. Los niños, generalmente de sexo masculino, ocasionalmente también desarrollan síntomas en caderas y rodillas. Aunque se inicia en la zona lumbar, el dolor y la rigidez sube gradualmente por la columna, entrando en el cuello. Los pacientes con espondilitis anquilosante típicamente muestran cinco de entre los seis síntomas siguientes, aunque la severidad de los síntomas varía mucho entre pacientes: aparición de dolor antes de los 35 años de edad, dolor y rigidez matutina de la columna, mejora con el movimiento, aparición gradual de los síntomas, los síntomas se prolongan durante más de tres meses, la respiración profunda puede encontrarse restringida. Además, la mayor parte de las personas con esta enfermedad también presenta un marcador genético conocido como HLA-B27.

Trastornos autoinmunológicos

La expresión "enfermedad autoinmunológica" se refiere a un grupo variado de más de 80 enfermedades crónicas que implican prácticamente todos los sistemas orgánicos del ser humano. En todas estas enfermedades, el problema subyacente es similar: el sistema inmunológico del cuerpo se desorienta, atacando los órganos mismos para cuya protección estaba diseñada. Las enfermedades autoinmunológicas afectan a tejido conectivo, nervios, músculos, el sistema endocrino, y el sistema gastrointestinal. Entre los trastornos autoinmunológicos se incluyen, por ejemplo, el lupus, la artritis reumatoide, la esclerosis múltiple, la miastenia gravis y la diabetes de tipo 1.

La diabetes de tipo 1 (también denominada "diabetes mellitus insulino-dependiente" o "diabetes juvenil") es la forma severa que requiere insulina de la diabetes. Habitualmente afecta a adolescentes y adultos jóvenes, de menos de 30 años, aunque puede afectar a bebés o a niños). Los síntomas de la diabetes de tipo 1 habitualmente son bastante severos, y surgen rápidamente, en semanas o meses. Entre los síntomas comunes se incluyen sed, micción excesiva, hambre, pérdida de peso e irritabilidad.

El lupus incluye el lupus eritematoso sistémico (SLE), el lupus eritematoso discoide (DLE), el lupus inducido farmacológicamente y el lupus neonatal.

El SLE es el tipo más común de lupus y afecta a muchas partes del cuerpo, incluyendo articulaciones, piel, riñones, pulmones, corazón, vasos sanguíneos, sistema nervioso, sangre y cerebro. El SLE habitualmente se desarrolla en personas de entre 15 y 44 años de edad, puede aparecer en la infancia o más tarde. Los indicios de SLE varían y habitualmente hay periodos de tanto enfermedad como de salud (también denominada remisión o carencia de síntomas). Algunas personas sólo presentan algunos indicios de la enfermedad, mientras que otros presentan más. Entre los síntomas pueden incluirse, la erupción "de mariposa" en nariz y mejillas, erupciones en la piel en partes del cuerpo expuestas al sol, úlceras en boca o nariz, articulaciones dolorosas o hinchadas, fiebre, pérdida de peso, pérdida de pelo, fatiga, dolor pectoral al respirar profundamente, dedos de manos o pies de color violeta o pálido debido al frío o al estrés, dolor abdominal, inflamación renal, cefaleas y paranoia.

El lupus se diagnostica a partir del historial médico, conjuntamente con un examen físico y ensayos especiales que ayudan al médico a descartar otras enfermedades que pueden confundirse con el lupus, que presentan 4 (o más) de los 11 síntomas del lupus, según la definición de la American College of Rheumatology y mediante ensayos de laboratorio tales como el del anticuerpo antinuclear (ANA).

El DLE únicamente afecta a la piel. Entre los síntomas del mismo se incluyen una erupción roja elevada en la cara, cuero cabelludo u otras partes del cuerpo y úlceras en boca o nariz. La erupción puede presentar una apariencia gruesa y escamosa y puede durar días o años. El DLE se diagnostica mediante el examen histológico de biopsias de la piel. El lupus inducido farmacológicamente es una reacción contra algunos medicamentos de prescripción. Los síntomas del DLE son similares a los del SLE, excepto en que no se presentan problemas renales ni del sistema nervioso central. Los síntomas pueden no aparecer hasta transcurridos meses o años de administración del medicamento. Tras detener la administración del fármaco, puede tardar días, semanas o meses antes de que desaparezcan los síntomas.

El lupus neonatal, aunque raro, afecta a algunos bebés neonatos de mujeres que presentan SLE u otros trastornos del sistema inmunológico. Los bebés con lupus neonatal pueden presentar un defecto cardíaco grave. Aproximadamente la mitad de los bebés con lupus neonatal nacen con una enfermedad cardiaca.

La artritis reumatoide (RA) es una enfermedad crónica que causa dolor, rigidez, hinchazón y limitaciones del movimiento y de la función de múltiples articulaciones. Si se deja sin tratar, o se trata incorrectamente, la RA puede producir una destrucción grave de una o más articulaciones, conduciendo con frecuencia a una discapacidad permanente. Aunque las articulaciones son las partes corporales principales afectadas por la RA, también pueden inflamarse otros órganos corporales.

Entre los síntomas de la RA se incluyen dolor, rigidez, hinchazón, enrojecimiento y dificultad para mover las articulaciones en el rango completo de movimientos. La rigidez observada en la RA activa típicamente es mayor por la mañana y dura entre 1-2 horas y todo el día. Aunque la RA puede afectar a cualquier articulación, algunas articulaciones, especialmente aquéllas de las manos y pies, tienden a resultar afectadas más frecuentemente que otras. Entre otros síntomas que pueden producirse en la RA se incluyen la pérdida de energía, la fiebre leve, la pérdida del apetito, la sequedad de ojos y boca, produciendo una condición conocida como de Sjögren y bultos blandos en la piel en áreas tales como el codo y las manos denominados nódulos reumatoides.

La RA es difícil de diagnosticar debido a que puede iniciarse gradualmente con síntomas sutiles. Muchas enfermedades, especialmente al inicio, pueden manifestarse de manera similar a la RA. El diagnóstico de la RA se basa en los síntomas descritos y en los resultados del examen físico típico, caracterizados por calor, hinchazón y dolor en las articulaciones. Además, en la RA comúnmente se observan determinadas anormalidades en laboratorio, tales como la anemia (recuento bajo de glóbulos rojos), un factor reumatoide positivo (un anticuerpo presente en aproximadamente 80% de los pacientes de RA) y una tasa de sedimentación de eritrocitos elevada o "tasa de sed." (un análisis de sangre que en la mayoría de pacientes con RA tiende a correlacionarse con la magnitud de la inflamación de las articulaciones).

Trastornos inflamatorios hepáticos

Entre los trastornos inflamatorios hepáticos se incluyen, por ejemplo, la hepatitis, tal como la hepatitis vírica, la hepatitis bacteriana, la hepatitis autoinmunológica, la hepatitis inducida farmacológicamente o la hepatitis alcohólica. La incidencia y severidad de la hepatitis varía dependiendo de muchos factores, incluyendo la causa del daño hepático y cualquier enfermedad subyacente en el paciente. Entre los factores de riesgo comunes se incluyen la utilización de fármacos por vía intravenosa, la sobredosis de tilenol (la dosis necesaria para causar un daño es bastante próxima a la dosis eficaz, de manera que debe procurarse la utilización del tilenol únicamente según las instrucciones), los comportamientos sexuales de riesgo, la ingestión de alimentos contaminados y el abuso del alcohol.

Entre los síntomas de la hepatitis se incluyen la orina oscura, la pérdida de apetito, la fatiga, la ictericia, el dolor abdominal y las heces negras. La hepatitis se diagnostica mediante un examen físico, el ensayo de la función hepática, un marcador autoinmunológico y la serología.

Trastornos cardíacos

Entre los trastornos inflamatorios cardíacos se incluyen, por ejemplo, la pericarditis, la endocarditis y la miocarditis. La inflamación cardiaca también incluye una inflamación que resulta de un suceso cardiaco agudo, tal como un infarto de miocardio. La inflamación cardiaca se distingue de otros trastornos cardíacos en que la inflamación típicamente es aguda, mientras que otros trastornos tales como las inflamaciones por ateroesclerosis son crónicas. La ateroesclerosis resulta en la acumulación de depósitos de sustancias grasas, colesterol, productos residuales celulares y calcio en el revestimiento interno de una arteria (es decir, una placa). En contraste, la inflamación cardiaca afecta al tejido muscular del corazón.

La pericarditis es la inflamación del pericardio y se caracteriza por dolor pectoral. Los pacientes que han sufrido un infarto de miocardio con frecuencia desarrollan pericarditis durante los días o semanas posteriores. La pericarditis se diagnostica a partir de segmentos ST elevados en un electrocardiograma.

La endocarditis es la inflamación del endocardio y causa una amplia diversidad de síntomas, particularmente en las etapas tempranas de la infección. Entre los síntomas se incluyen fiebres, escalofríos, fatiga, pérdida de peso, dolores musculares y sudoración. La endocarditis se diagnostica a partir de la presencia de un murmullo cardiaco o un ecocardiograma.

La miocarditis es la inflamación del músculo cardíaco. Entre los síntomas de la miocarditis se incluyen fiebre, dolor pectoral, latidos cardíacos anormales, fatiga y falta de aliento. La miocarditis típicamente se diagnostica mediante una biopsia endomiocárdica.

Alergias alimentarias

Entre las alergias alimentarias se incluyen, por ejemplo, las de los cacahuetes, nueces, leche de vaca y productos lácteos, pescado y marisco, determinadas frutas y hortalizas, chocolate, cerveza o vino, níquel y trigo, y también la alergia alimentaria asociada al polen. Una categoría especial es la alergia al huevo, debido a que los efectos de esta alergia alimentaria específica se extienden a la vacunación en el caso de que se apliquen vacunas cultivadas en huevos de pollo en personas alérgicas al huevo o al pollo.

Los síntomas de la alergia alimentaria incluyen manifestaciones en la piel (por ejemplo dermatitis atópica, dermatitis alérgica por contacto, eccema), gastrointestinales y respiratorias, y también la anafilaxis. La medicación con frecuencia incluye antihistamínicos, corticoesteroides sistémicos, epinefrina o tratamientos respiratorios tales como el albuterol inhalado.

Los síntomas con frecuencia se asocian a incrementos de IgE específicos de alérgeno. Está creciendo la incidencia y severidad de los incidentes informados, al igual que el número de alimentos implicados.

Métodos para incrementar la supervivencia del trasplante

El sistema inmunológico responde a un trasplante con anticuerpos de células B y linfocitos células T que pueden atacar al nuevo órgano. Además, las quimoquinas desempeñan un papel esencial en la regulación y coordinación de la infiltración de los leucocitos en los injertos. Las quimoquinas se expresan en injertos de piel, hígado, corazón y riñón tras la injertación inicial, daño isquémico, infección vírica y rechazo agudo o crónico.

La supervivencia del trasplante (es decir, del injerto) se incrementa mediante la administración en el sujeto de una composición que comprende un polipéptido galectina-1. Opcionalmente se administra además una composición que incluye otros compuestos inmunosupresores tales como, por ejemplo, azatioprina, corticoesteroides, ciclosporina (y ciclosporina A) y FK506, o una combinación de cualquiera de los anteriores. Alternativamente, la supervivencia del trasplante se incrementa mediante el contacto de un órgano con una composición que comprende un polipéptido galectina-1. Por ejemplo, antes del trasplante el órgano se perfunde con un polipéptido galectina-1.

El trasplante es un aloinjerto. Alternativamente, el trasplante es un xenoinjerto. Entre estos trasplantes se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, riñón, hígado, piel, páncreas, córnea o corazón. El sujeto puede ser cualquier animal, por ejemplo un ser humano, un primate, ratón, rata, perro, gato, vaca, caballo o cerdo.

Se administra un polipéptido galectina-1 en un régimen de dosificación terapéuticamente eficaz con el fin de reducir, prevenir o retrasar la incidencia del rechazo del injerto tras el trasplante. El tratamiento se administra antes de que el sujeto reciba un trasplante. Alternativamente, el tratamiento se administra tras recibir el sujeto un trasplante. Opcionalmente, el tratamiento se administra concomitantemente en el sujeto que recibe el trasplante. El tratamiento se administra durante un periodo de tiempo seleccionado. Por ejemplo, el tratamiento se administra 1, 2, 3, 4, 5, 6 ó más días. Preferentemente el tratamiento se administra durante 1, 2, 3, 4 ó más semanas. En algunos métodos se administra una única dosis de aproximadamente 1 mg/kg de un polipéptido galectina-1 aproximadamente cada dos semanas, iniciándose inmediatamente antes del trasplante, y continuado hasta por lo menos 8 semanas después del mismo. En otros métodos, la dosis es de entre 0,25 y 0,5 mg/kg, 1,5 mg/kg o una dosis unitaria fija de, por ejemplo, 5 mg, 10 mg o 20 mg. Habitualmente se administran entre 2 y 5 dosis (por ejemplo 2, 3, 4 ó 5) durante un periodo de aproximadamente 2 semanas a 2 meses con el fin de evitar (es decir, reducir la incidencia de episodios de rechazo durante un periodo de por lo menos 2 ó 3, aunque preferentemente 6 ó 12, meses tras el trasplante). Alternativamente puede administrarse el polipéptido galectina-1 diariamente, dos veces por semana, semanalmente, quincenalmente, mensualmente o en algún otro intervalo durante 1 semana, 2 semanas, 4 semanas, 8 semanas, 3 a 6 meses o más. Opcionalmente, el polipéptido galectina-1 se administra tras la sospecha del médico de rechazo del órgano. El rechazo del órgano se determina mediante métodos conocidos de la técnica. Por ejemplo, se sugiere rechazo del órgano en el caso de que la creatinina sanguínea del sujeto empiece a incrementarse lentamente tras un cierto periodo de estabilidad.

La supervivencia del trasplante se incrementa mediante la reducción, prevención o retraso del rechazo del órgano. El rechazo se refiere a que el sistema inmunológico del sujeto reconoce el trasplante como foráneo. El rechazo es agudo, por ejemplo un rechazo hiperagudo. Alternativamente el rechazo es crónico. El rechazo agudo de un órgano trasplantado puede producirse tras segundos o minutos de exponer el órgano a la circulación del receptor. El rechazo agudo se produce en los primeros pocos días (particularmente en las primeras pocas semanas) posteriores al trasplante. En contraste, el rechazo crónico se produce a largo plazo y se inicia lentamente. El sistema inmunológico del paciente ataca y rechaza el trasplante, pero de una manera diferente que en el rechazo agudo. El rechazo crónico se asemeja a un envejecimiento lento del órgano trasplantado. El rechazo crónico habitualmente se produce más de un año después de la operación de trasplante.

La expresión "tasa de supervivencia" del trasplante se refiere al periodo anterior al rechazo del trasplante por parte del sujeto. Por ejemplo, la supervivencia se incrementa cuando el trasplante sobrevive por lo menos 1, 2, 4 ó 8 semanas al trasplante. Preferentemente el trasplante sobrevive, por ejemplo, 3, 6 ó 13 meses. Más preferentemente el trasplante sobrevive 2, 3, 5 ó más años.

Métodos de vacunación

La invención proporciona una composición purificada de vacuna que comprende el multímero estable de galectina-1 y un antígeno. Específicamente, la respuesta inmunológica frente a un antígeno mejora tras la vacunación de un sujeto con una composición que contiene un polipéptido galectina-1. El tratamiento con galectina-1 proporciona un estímulo positivo para una reacción inmunológica. Se inmuniza un sujeto mediante la administración en el sujeto de una composición que contiene un polipéptido galectina-1. El tratamiento de galectina-1 proporciona un estímulo positivo a una reacción inmunológica. Se inmuniza un sujeto mediante la administración en el sujeto de una composición que contiene un polipéptido galectina-1 y una composición que contiene un antígeno. Un antígeno es cualquier compuesto contra el que se desea una respuesta inmunológica. Por ejemplo, un antígeno es una proteína, una glucoproteína, una lipoproteína, un polisacárido, un lipopolisacárido, un lípido, un glucolípido, un polinucleótido o una molécula pequeña (por ejemplo un hapteno). Opcionalmente, el antígeno se une, por ejemplo covalentemente, a una proteína portadora. El sujeto presenta un riesgo de desarrollar o sufrir una infección, por ejemplo bacteriana, vírica o fúngica. Entre las infecciones se incluyen la hepatitis C, el VIH, la hepatitis B, el virus del papiloma, la malaria, la tuberculosis, el virus del herpes simplex, el virus Epstein-Barr, la clamidia o la influenza. Alternativamente, el sujeto presenta un riesgo de desarrollar o sufrir un cáncer. El cáncer es de, por ejemplo, mama, pulmón, colon, próstata, páncreas, cérvix, linfoma o melanoma.

La vacuna se lleva a cabo mediante métodos convencionales. Por ejemplo, la composición puede utilizarse en un diluyente adecuado, tal como solución salina o agua, o adyuvantes completos o incompletos. La vacuna puede administrarse por cualquier vía apropiada para inducir una respuesta inmunológica, tal como una vía intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea o similar. La vacuna puede administrarse una vez o a intervalos periódicos hasta la inducción de una respuesta inmunológica. Puede detectarse una respuesta inmunológica mediante una diversidad de métodos conocidos por el experto en la materia, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, la detección de anticuerpos específicos de antígeno, el ensayo de citotoxicidad, el ensayo de proliferación y los ensayos de liberación de citoquinas.

La dosis exacta que debe utilizarse en la formulación también dependerá de la vía de administración y la gravedad global de la enfermedad o trastorno, y debe decidirse de acuerdo con el criterio del médico y las circunstancias de cada paciente. En última instancia el médico responsable decidirá la cantidad de proteína de la presente invención con la que tratar cada paciente individual.

Métodos para inducir apoptosis

También se dan a conocer métodos para inducir apoptosis. Puede inducirse apoptosis en un sujeto que lo necesita mediante la administración de un polipéptido galectina-1 multimérico en una cantidad suficiente para inducir apoptosis. El sujeto puede ser, por ejemplo, cualquier mamífero, por ejemplo un ser humano, un primate, ratón, rata, perro, gato, vaca, caballo o cerdo. El sujeto puede ser susceptible al cáncer o a un trastorno autoinmunológico.

La apoptosis, también conocida como muerte celular programada, desempeña un papel en el desarrollo, el envejecimiento y en diversas condiciones patológicas. En los organismos en desarrollo, tanto vertebrados como invertebrados, las células mueren en posiciones particulares en tiempos particulares como parte del proceso morfogenético normal. El proceso de la apoptosis se caracteriza, aunque sin limitarse a los mismos, por varios sucesos. Las células pierden sus uniones celulares y microvilli, el citoplasma se condensa y la cromatina nuclear se agrega en varias masas discretas. A medida que se fragmenta el núcleo, el citoplasma se contrae y las mitocondrias y los ribosomas se compactan densamente. Tras la dilatación del retículo endoplasmático y su fusión con la membrana plasmática, la célula se rompe en varias vesículas unidas a membrana, los cuerpos apoptóticos, que habitualmente resultan fagocitados por cuerpos vecinos. Debido a que la fragmentación de la cromatina en fragmentos oligonucleótidos es característica de las etapas finales de la apoptosis, los patrones de corte del ADN pueden utilizarse en ensayo in vitro para la detección de su aparición (Cory, Nature 367:317-18, 1994).

Puede administrarse un polipéptido galectina-1 multimérico con un compuesto antiangiogénico. Entre los ejemplos de un compuesto antiangiogénico se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, un inhibidor de tirosina quinasa, un inhibidor del factor de crecimiento derivado de la epidermis, un inhibidor de factor de crecimiento derivado de fibroblastos, un inhibidor de factor de crecimiento derivado de plaquetas, un inhibidor de metaloproteasa matricial (MMP), un bloqueante de integrina, interferón alfa, proteína 10 inducible con interferón, interleuquina 12, polisulfato de pentosán, un inhibidor de ciclooxigenasa, un antiinflamatorio no esteroideo (NSAID), un inhibidor de ciclooxigenasa 2, carboxiamidotriazol, tetrahidrocortizol, combretastatina A-4, escualamina, 6-O-cloroacetil-carbonil)-fumagilol, talidomida, angiostatina, endostatina, troponina-1, un anticuerpo contra VEGF, factor plaquetario 4 ó tromboespondina.

El polipéptido galectina-1 multimérico puede administrarse además con un compuesto quimioterapéutico. Entre los ejemplos de compuestos quimioterapéuticos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, paclitaxel, taxol, lovastatina, minosina, tamoxifeno, gemcitabina, 5-fluorouracilo (5-FU), metotrexato (MTX), docetaxel, vincristina, vinblastina, nocodazol, tenipósido, etopósido, adriamicina, epotilón, navelbina, camptotecina, daunonibicina, dactinomicina, mitoxantrona, amsacrina, epirubicina o idarubicina.

La apoptosis puede inducirse en una célula poniendo en contacto la célula con un polipéptido galectina-1 multimérico en una cantidad suficiente para inducir apoptosis. El polipéptido galectina-1 multimérico es estable. La población celular que se expone, es decir, que se ponen en contacto con el polipéptido galectina-1 multimérico puede presentar cualquier número de células, es decir una o más células, y puede proporcionarse in vitro, in vivo o ex vivo.

La cantidad del polipéptido galectina-1 multimérico para inducir apoptosis se encuentra en una cantidad inferior a la del polipéptido de tipo salvaje, por ejemplo polipéptido galectina monomérico. Por ejemplo, la célula se pone en contacto con el polipéptido galectina-1 multimérico estable, o se administra en el sujeto, a una concentración inferior a 20 \muM, 15 mM, 10 \muM, 5 \muM, 1 mM, 0,1 \muM ó 0,001 \muM.

Algunas condiciones de enfermedad se relacionan con el desarrollo de una regulación negativa defectuosa de la apoptosis en las células afectadas. Por ejemplo, las neoplasias resultan, por lo menos en parte, de un estado resistente a la apoptosis en el que las señales de la proliferación celular exceden inapropiadamente las señales de muerte celular. Además, algunos virus ADN, tales como el virus Epstein-Barr, el virus de la fiebre porcina africana y los adenovirus, parasitan la maquinaria celular del huésped para llevar a cabo su propia replicación. Simultáneamente, modulan la apoptosis para reprimir la muerte celular y permitir que la célula diana reproduzca el virus. Además, determinadas condiciones de enfermedad, tales como las condiciones linfoproliferativas, el cáncer, incluyendo el cáncer resistente a fármacos, la artritis, la inflamación, las enfermedades autoinmunológicas y similares, pueden resultar de una regulación negativa de la regulación de la muerte celular. En este tipo de condiciones de enfermedad resultaría deseable estimular los mecanismos apoptóticos.

Administración terapéutica

La invención incluye un polipéptido galectina-1 multimérico estable (denominado en la presente invención "compuesto terapéutico") para el uso médico.

Una cantidad eficaz de un compuesto terapéutico preferentemente se encuentra comprendida entre aproximadamente 0,1 mg/kg y aproximadamente 150 mg/kg. Las dosis eficaces varían, según reconocerá el experto en la materia, dependiendo de la vía de administración, el uso de excipientes y la coadministración con otros tratamientos terapéuticos, incluyendo la utilización de otros agentes antiinflamatorios o agentes terapéuticos para tratar, prevenir o aliviar un síntoma de un trastorno inflamatorio particular. Se lleva a cabo un régimen terapéutico a partir de la identificación de un mamífero, por ejemplo un ser humano, que sufre un trastorno inflamatorio (o presenta el riesgo de desarrollarlo), utilizando métodos estándares.

El compuesto farmacéutico se administra a dicho individuo utilizando métodos conocidos de la técnica. Preferentemente el compuesto se administra por vía oral, rectal, nasal, tópica o parenteral, por ejemplo subcutáneamente, intraperitonealmente, intramuscularmente e intravenosamente. El compuesto se administra profilácticamente, o tras la detección de un suceso inflamatorio, tal como un ataque de asma o una reacción alérgica. El compuesto opcionalmente se formula como componente de una combinación de fármacos terapéuticos para tratar trastornos inflamatorios. Entre los ejemplos de formulaciones adecuadas para la administración parenteral se incluyen soluciones acuosas del agente activo en una solución salina isotónica, en una solución de glucosa al 5% o en otro excipiente estándar farmacéuticamente aceptable. Los agentes solubilizantes estándares, tales como PVP o ciclodextrinas, también se utilizan como excipientes farmacéuticos para la administración de los compuestos terapéuticos.

Los compuestos terapéuticos indicados en la presente invención se formulan en composiciones para otras vías de administración mediante métodos convencionales. Por ejemplo, se formula un polipéptido galectina multimérico en una cápsula o una tableta para la administración oral. Las cápsulas pueden contener cualquier material estándar farmacéuticamente aceptable, tal como gelatina o celulosa. Las tabletas pueden formularse según procedimientos convencionales mediante la compresión de mezclas de un compuesto terapéutico con un portador sólido y un lubricante. Entre los ejemplos de portadores sólidos se incluyen almidón y bentonita sacárida. El compuesto se administra en forma de una tableta de cubierta dura o de una cápsula que contiene un ligante, por ejemplo lactosa o manitol, un relleno convencional y un agente de tableteo. Entre otras formulaciones se incluyen una pomada, un supositorio, una pasta, un pulverizador, un parche, una crema, un gel, una esponja reabsorbible o una espuma. Dichas formulaciones se producen mediante métodos bien conocidos de la técnica.

Los compuestos terapéuticos resultan eficaces al entrar en contacto directo el compuesto con el tejido afectado. Por consiguiente, el compuesto se administra tópicamente. Por ejemplo, para tratar la dermatitis por contacto, el compuesto se aplica en el área de piel afectada. Alternativamente, los compuestos terapéuticos se administran sistémicamente. Además, los compuestos se administran mediante la implantación (directamente en un órgano tal como el intestino o el hígado, o subcutáneamente) de una matriz sólida o reabsorbible que libera lentamente el compuesto en tejidos contiguos y circundantes del sujeto.

Por ejemplo, para el tratamiento de los trastornos inflamatorios gastrointestinales, el compuesto se administra sistémicamente o localmente directamente en el tejido gástrico. Par ala administración sistémica, el compuesto se administra por vía intravenosa, rectal u oral. Para la administración local, se pone en contacto directo con el tejido gástrico una oblea o esponja reabsorbible impregnada con el compuesto. El compuesto o mezcla de compuestos se liberan lentamente in vivo mediante difusión del fármaco a partir de la oblea y por la erosión de la matriz de polímero.

La inflamación del hígado (es decir, la hepatitis) se trata, por ejemplo, mediante la infusión en la vasculatura hepática de una solución que contiene el compuesto. La infusión o lavado intraperitoneal resulta útil para reducir la inflamación intraperitoneal generalizada o para prevenir la inflamación posteriores a una operación quirúrgica.

Para el tratamiento de la inflamación neurológica, el compuesto se administra por vía intravenosa o intratecal (es decir, mediante infusión directa en el líquido cerebroespinal). Para la administración local, se pone en contacto directo con el tejido del SNC una oblea o esponja reabsorbible impregnada con el compuesto. El compuesto o mezcla de compuestos se liberan lentamente in vivo mediante difusión del fármaco a partir de la oblea y por la erosión de la matriz de polímero. Alternativamente, el compuesto se infusiona en el cerebro o en el líquido cerebroespinal mediante métodos conocidos. Por ejemplo, un anillo de catéter en un orificio de trépano para la utilización como puerto de inyección se sitúa para que se fije al cráneo en el orificio de trépano perforado en el cráneo. Se accede a un reservorio de fluido conectado al catéter mediante una aguja o estilete insertado a través de un septo situado en la parte superior del anillo del orificio de trépano. Un conjunto de catéter (por ejemplo un conjunto descrito en la patente US nº 5.954.687) proporciona un paso de flujo de fluido adecuado para la transferencia de fluidos hacia o desde la localización deseada en, cerca o dentro del cerebro, para permitir la administración del fármaco durante un periodo de tiempo.

Para el tratamiento de la inflamación cardiaca, el compuesto se administra por ejemplo en el tejido cardiaco (es decir, el miocardio, el pericardio o el endocardio) mediante inyección intracoronaria directa a través de la pared torácica o utilizando métodos basados en un catéter percutáneo estándar con guía fluoroscópica para la inyección directa en un tejido, tal como el miocardio, o la infusión de un inhibidor a partir de un stent o catéter que se inserta en un lumen corporal. Para administrar el compuesto se utiliza cualquiera de entre una diversidad de catéteres coronarios , o un catéter de perfusión. Alternativamente se recubre o se impregna con el compuesto un stent que se coloca en un vaso coronario.

La inflamación pulmonar se trata, por ejemplo, mediante la administración del compuesto mediante inhalación. Los compuestos se administran en forma de una pulverización de aerosol a partir de un recipiente o dispensador presurizado que contiene un propelente adecuado, por ejemplo un gas, tal como dióxido de carbono, o de un nebulizador.

A continuación se ilustra la invención mediante los ejemplos no limitativos siguientes.

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Ejemplo 1 Métodos generales Medio de cultivo

El medio de cultivo utilizado durante los experimentos fue RPMI 1640 suplementado con L-glutamina 2 mM, FCS al 10% inactivado por calor, 100 U/ml de penicilina y 100 \mug/ml de estreptomicina. En experimentos de cultivo con la proteína galectina-1, el medio de cultivo se suplementó adicionalmente con DTT 1,2 mM.

Preparación de galectina-1 humana recombinante

Se preparó proteína galectina-1 humana recombinante de la manera siguiente. Se amplificó ADN de LGALS1 humano a partir de ADNc de sangre humana, utilizando cebadores que contenían el sitio de restricción NdeI o BamHI (GAL-1F: 5'-ggcatatggcttgtggtctggtcg-3' (SEC ID nº 3), GAL-1R: 5'-ggggatcctcatcagtcaaaggcc-3' (SEC ID nº 4)). Tras la amplificación, el producto de PCR se digirió y se ligó en los sitios NdeI y BamHI del vector plásmido pET15b (Novagen, Madison, USA). La mezcla de ligación se transformó en células de Escherichia coli (E. coli) JM101 siguiendo las instrucciones del fabricante. El plásmido de ADN procedente de un clon que contenía una inserción del tamaño esperado según se determinó mediante análisis de restricción se aisló, se secuenció y se transformó en células de E. coli competentes para BL21 Star (DE3) (Invitrogen, Paisley, Reino Unido) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Para la construcción de homodímeros estables de galectina-1, los presentes inventores decidieron utilizar un constructo basado en una cremallera de leucinas FOS. Entre la cremallera de leucinas FOS y la galectina-1 se introdujo una región bisagra que funcionaba como línker flexible. La cremallera de leucinas FOS se encontraba flanqueada por los aminoácidos CGG y GGC en los extremos N-terminal y C-terminal, respectivamente, para unir covalentemente las cremalleras mediante enlaces disulfuro entre los residuos cisteína (ver anteriormente, SEC ID nº 1).

Para la producción de galectina-1, las células transfectadas de E. coli se cultivaron en medio 2xTY que contenía ampicilina en un incubador bajo agitación a 37ºC hasta alcanzar una DO_{600}\sim0,8-1,0. Se añadió IPTG (1 mM) y se indujo la producción de galectina-1 durante 3 horas. Se recogieron las células (15 minutos a 7.500xg a 4ºC), se lisaron con tampón de extracción que contenía 1 mg/ml de lisozima y se sonicaron extensivamente. Se centrifugó el lisado y se purificó la proteína galectina-1 recombinante que contenía una etiqueta His, utilizando perlas TALON (Clontech, Becton Dickinson Biosciences, Heidelberg, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se almacenó la proteína galectina-1 en tampón que contenía Tris 20 mM (pH 8,0), NaCl 150 mM, glicerol al 10% a -80ºC, y se utilizó en todos los experimentos de cultivo en medio RPMI suplementado con DTT 1,2 mM. La proteína galectina-1 humana recombinante se sometió a ensayo rutinario para micoplasmas y endotoxinas y estos ensayos fueron consistentemente negativos.

Aislamiento de ARN y RT-PCR semicuantitativa

Se aisló el ARN total de pellets celulares o de secciones congeladas de tejido utilizando los kits Absolutely RNA RT-PCR o Microprep (Stratagene, La Jolla, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se transcribieron inversamente 1 a 3 \mug de ARN en volumen de 20 \mul utilizando hexámeros aleatorios (300 ng) y transcriptasa inversa Superscript II (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se llevó a cabo PCR en 60 \mul con 1 unidad de ADN polimerasa Taq (Amersham Pharmacia Biotech), el tampón de reacción proporcionado por el fabricante y 1 \mul de ADNc. La PCR consistía de 20 a 40 ciclos de 30 s a 94ºC, 30 s a 55ºC y 30 s a 72ºC. La etapa de extensión final consistía de 7 minutos a 72ºC. Se analizaron muestras de PCR en un gel de 1,5% de agarosa tras un número creciente de ciclos de PCR. El cebador utilizado fue: LGALS1F 5'-cttgtggtctggtcgcca-3' (SEC ID nº 5), LGALS1R 5'-tcgaaggtgatgcacacctc-3' (SEC ID nº 6); GAPDHF 5'-ccatcactgccactcagaagact-3' (SEC ID nº 7), GAPDH R 5'-ttactccttggaggccatgtagg-3' (SEC ID nº 8). Se utilizó GAPDH como control de la carga de ARN. En cada experimento, se incluyeron controles positivos y negativos. Se prepararon imágenes utilizando el programa Geldoc (Bio-Rad, Veenendall, Países Bajos) y en cada caso se muestran imágenes invertidas.

Análisis de PCR en tiempo real para IL-10, IFN-\gamma y HPRT

Los cebadores (Invitrogen, Paisley, Reino Unido) y sondas (Eurogentec, Seraing, Bélgica) utilizados para el análisis de PCR en tiempo real se desarrollaron utilizando software de diseño de cebadores. Los cebadores (5' a 3') utilizados fueron: IL-10F 5'-atgaaggatcagctggacaactt-3' (SEC ID nº 9), IL-10R 5'-ccttgatgtctgggtcttggt-3' (SEC ID nº 10), IFN-\gammaF 5'-gaaacgagatgacttcgaaaagc-3' (SEC ID nº 11), IFN-\gamma R 5'-cgacctcgaaacagcatctg-3' (SEC ID nº 12), HPRTF 5'-ggcagtataatccaaagatggtcaa-3' (SEC ID nº 13), HPRT R 5'-gtctggcttatatccaacacttcgt-3' (SEC ID nº 14). Las secuencias de las sondas marcadas en 5' con el pigmento informador FAM y en 3' con las moléculas de pigmento aceptor ("quencher") fueron: IL-10 5'-acctgggttgccaagccttgtctg-3', IFN-\gamma 5'-CCAAGTGATGGCTGAACTGTCGCC-3', HPRT 5'-caagcttgctggtgaaaaggacccc-3' (SEC ID nº 15). Se llevaron a cabo reacciones en placas de 384 pocillos (Applied Biosystems, Países Bajos) en un volumen de 20 \mul que contenía mezcla madre de PCR en tiempo real (Eurogentec), 900 nM de cada cebador y 200 nM de una sonda individual. Se llevaron a cabo amplificaciones por PCR utilizando el sistema de detección de secuencias ABI prism 7900HT (Applied Biosystems). Se utilizaron condiciones de ciclado estándares, incluyendo una etapa de preamplificación de 50ºC durante 2 minutos, 95ºC durante 10 minutos, seguido de una amplificación de 45 ciclos de 95ºC durante 15 segundos y 60ºC durante 1 minuto. Todas las muestras se analizaron por triplicado. Se calcularon los valores umbral de ciclo medios (Ct) y las desviaciones estándar (SD) para los genes de citoquina y de control interno ("housekeeping") (\DeltaCt=Ct_{gen} - Ct_{HPRT}) y se calcularon las SD de \DeltaCt(SD(\DeltaCt)), (SD(\DeltaCt)=\surd((SD_{gen})^{2}+(SD_{HPRT})^{2}). Se midió la cantidad relativa de citoquinas mediante la determinación de \Delta\DeltaCt(\Delta\DeltaCt=\DeltaCt_{muestra \ de \ ensayo} - \DeltaCt_{calibrador}) y se calculó el factor de diferencia (2^{-\Delta\Delta Ct}). Se proporciona el intervalo como 2^{-(\Delta\Delta Ct+SD\Delta Ct)} y 2^{-(\Delta\Delta Ct-SD\Delta Ct)}.

Selección de los pacientes e inmunohistoquímica

Se seleccionó material de injertación renal de pacientes con rechazo crónico (n=8) y agudo (n=7) del banco de tejidos del Department of Pathology (Groningen, Países Bajos) (21). Se obtuvo tejido de control de la parte no afectada de riñones nefrectomizados de pacientes que presentaban carcinoma de células renales (n=4) y de riñones de donante no utilizados (n=2).

3

Se llevó a cabo inmunohistoquímica según procedimientos estándares en secciones de tejido de 4 \mum incluidas en parafina utilizando un anticuerpo monoclonal contra galectina-1 (cln 25C1, Novocastra, Newcastle upon Tyne, Reino Unido).

Tratamiento con galectina-1 y ELISA

Se obtuvieron células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC) de voluntarios sanos y se utilizaron directamente para los experimentos de galectina-1 o se utilizaron para el aislamiento de células CD4^{+} y CD8^{+}. Se aislaron linfocitos T CD4^{+} y CD8^{+} mediante tinción con anticuerpos marcados con fluorocromo contra CD3 (anti-CD3-CyQ), CD4 (anti-CD4-F) y CD8 (anti-CD8-PE) (IQP, Groningen, Países Bajos) y las células se separaron en el citómetro MoFlo (Cytomation, Fort Collins, CO). Las PBMC y las células T separadas se estimularon durante 24 horas (1x10^{6} células/ml) con anti-CD3 (10 ng/ml) o anti-CD3 más anti-CD28, con o sin concentraciones diferentes de proteína galectina-1 o con proteína galectina-1 sola. Para los ensayos de inhibición, se preincubó proteína galectina-1 durante 30 minutos a temperatura ambiente con lactona 0,1 M o con suero policlonal anti-galectina-1 de conejo (IQP, Groningen, Países Bajos) antes de la adición a las células. Se determinaron las producciones de proteína IL-10 e IFN-\gamma en sobrenadantes de cultivo libres de células recogidos tras la estimulación durante 24 horas utilizando ELISA (R&D Systems, Oxon, Reino Unido) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se analizaron múltiples donantes para confirmar los resultados.

Alternativamente, se obtuvieron células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC) de voluntarios sanos y se aislaron células mediante centrifugación Ficoll-Hypaque. Las PBMC aisladas se estimularon durante 6 ó 24 horas en presencia o en ausencia de proteína galectina-1, con o sin activación con \alphaCD3. Para los ensayos de inhibición, se preincubó proteína galectina-1 durante 30 minutos a temperatura ambiente con lactosa 0,1 M antes de la adición de las células. Se determinaron las producciones de proteínas IL-10 e IL-1\beta en sobrenadantes de cultivo libres de células tras estimular durante 24 horas, utilizando kits ELISA disponibles comercialmente (R&D Systems, Oxon, Reino Unido) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se llevó a cabo una ELISA multiplex para 6 citoquinas (IFN-\gamma, IL-1\beta, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12 e IL-13) siguiendo las instrucciones del fabricante (Biosource, Etten-Leur, Países Bajos). Se utilizó el ensayo de rangos con signo de Wilcoxon para determinar la significancia de las diferencias.

Medición de la apoptosis

Se midió la apoptosis utilizando el kit de detección de fosfatidilserina (IQP, Groningen, Países Bajos). Se cultivaron células T MOLT-4 durante 3 horas a 37ºC (1x10^{6}/ml en RPMI/FCS al 10%/DTT 1,2 mM) en presencia o en ausencia de proteína galectina-1. A continuación, se ajustaron las células a lactosa 0,1 M/PBS y se agitaron suavemente durante 10 minutos a temperatura ambiente para disociar la galectina-1 de la membrana celular. Las células se lavaron con PBS y se resuspendieron en 110 \mul de tampón de calcio (HEPES 10 mM, NaCl 140 mM, CaCl_{2} 2,5 mM, pH 7,4) que contenía 2,5 \mul de anexina V-FITC. Las células se incubaron durante 20 minutos sobre hielo y se lavaron una vez con tampón de calcio. Las células se suspendieron en 160 \mul de tampón de calcio que contenía 1 \mul de yoduro de propidio (PI), se incubaron durante 10 minutos sobre hielo y se analizaron inmediatamente mediante citometría de flujo. Para cada muestra se analizaron 10.000 sucesos en un citómetro de flujo Coulter Epics-Elite (Coulter Corporation, Hialeah, FL, USA). Los datos se analizaron utilizando el programa WinList 4.0 (Verity Software House Inc., Topsham, ME, USA).

Tratamiento ex vivo de biopsias de tejido con galectina-1

Se obtuvieron biopsias según procedimientos estándares del colon de un paciente con colitis en 2 localizaciones diferentes (control (no inflamado) y tejido inflamado). Las biopsias se incubaron en medio de cultivo y se incubaron durante 8 horas a 37ºC con (0,5 y 2,5 \muM) o sin proteína galectina-1 estable. Las biopsias se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido tras 8 horas y se almacenaron a -80ºC. Se utilizaron secciones congeladas para aislar ARN para medir los niveles de IL-10 mediante qRT-PCR, y para inmunohistología para células T (CD3) y receptor IL2 (activación de células T) según procedimientos estándares. Se midió la apoptosis mediante el método TUNEL siguiendo las instrucciones del fabricante (Roche Diagnostics, Almere, Países Bajos).

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Ejemplo 2 La galectina-1 regula positivamente la producción de IL-10 en células T

Para estudiar los efectos inmunomoduladores de la galectina-1, se produjo galectina-1 recombinante en E. coli y se utilizó en experimentos in vitro. La galectina-1 existe en un equilibrio reversible de monómero-dímero y, basándose en la constante de disociación, de 7 \muM [6], la proteína se encuentra predominantemente presente en forma de un monómero a una concentración <7 \muM, o en forma de un dímero a concentraciones >7 \muM. Debido a que es conocido que la forma de la proteína resulta importante para su función, se estudió el efecto de diferentes concentraciones de proteína galectina-1 sobre la producción de diferentes citoquinas. En cultivos de PBMCs totales, el tratamiento de galectina-1 causó una regulación negativa dosis-dependiente de la producción de IFN-\gamma inducida por \alphaCD3 (figura 1A). La regulación negativa más fuerte de la producción de IFN-\gamma se observó utilizando las concentraciones más altas de galectina-1, que contiene la concentración más alta de proteína dimérica. Aparte de la regulación negativa de IFN-\gamma, se observó un incremento marcado y dependiente de la dosis de la producción de IL-10 al cultivar las PBMCs en presencia de concentraciones altas de proteína galectina-1 (figura 1B). Esta producción de IL-10 inducida por galectina-1 pudo inhibirse mediante la preincubación con lactosa o con anticuerpos anti-galectina-1 (policlonal de conejo, IQP), con niveles de inhibición de 62% y 41%, respectivamente (figura 1C).

La galectina-1 puede unirse a diversas glucoproteínas de superficie de las células T, tales como CD2, CD3, CD7, CD45 y CD43 [3-5,21]. Para estudiar si subconjuntos específicos de células T eran responsables de la producción de la IL-10 tras el tratamiento de galectina-1, se estimularon células T CD4^{+} y CD8^{+} separadas mediante FACS procedentes de cinco donantes independientes con anticuerpos \alphaCD3/\alphaCD28, con \alphaCD3/\alphaCD28 en combinación con 20 \muM de proteína galectina-1, o con galectina-1 (20 \muM) sola. Tal como se muestra en la figura 1D, las células T CD4^{+} y CD8^{+} indujeron fuertemente la producción de IL-10 tras la estimulación con \alphaCD3/\alphaCD28 en combinación con la forma dimérica (20 \muM) de la proteína galectina-1. No se detectó IL-10 en células T CD4^{+} y CD8^{+} no activadas (no mostradas), mientras que la incubación de las células con galectina-1 sola también resultó en la regulación positiva de la producción de IL-10 (figura 1D y Tabla 2). En general, la producción de IL-10 inducida por galectina-1 fue menor en células no activadas que en células activadas por \alphaCD3/\alphaCD28, aunque no significativamente. En los linfocitos T CD8^{+}, el tratamiento con galectina-1 también resultó en la regulación positiva de la proteína IL-10, aunque los niveles eran inferiores que en los linfocitos T CD4^{+}. El análisis de la producción de IL-10 inducida por galectina-1 en células T CD4^{+}/CD25^{+} separadas reveló que estas células únicamente explicaban 0,15% de la producción de IL-10 observada en las PBMCs totales.

Aparte de la regulación positiva consistente de IL-10 tras el tratamiento con galectina-1 dimérica, la producción de IFN-\gamma resultó regulada negativamente en subconjuntos de células T CD4^{+} y CD8^{+} tras la estimulación con \alphaCD3/\alphaCD28 en presencia de concentraciones elevadas de galectina-1 en comparación con la estimulación con únicamente \alphaCD3/\alphaCD28 (p=0,043, figura 1E). La reducción media de la producción de IFN-\gamma fue de 36% en células T CD4^{+} y de 49% en las células T CD8^{+}.

Debido a que el tratamiento de galectina-1 sola resultó en la regulación positiva de la producción de IL-10, se investigó la expresión de los marcadores de activación CD25 y CD69 mediante FACS. Tal como se muestra en la figura 1F, el tratamiento de galectina-1 resultó en una fuerte reducción de los leucocitos positivos para CD25 y CD69.

La Tabla 3 resume los resultados obtenidos para los niveles de ARNm de IL-10 e IFN-\gamma para cinco donantes independientes. En general, se observó la regulación positiva de los niveles de ARNm de IL-10 y niveles variables de ARNm de IFN-\gamma. El ARNm de IL-10 resultó regulado positivamente en células T tanto CD4^{+} como CD8^{+} tras el tratamiento con galectina-1, lo que es consistente con los resultados del ensayo ELISA. Los niveles de ARNm de IFN-\gamma fueron similares o resultaron regulados negativamente en células T CD4^{+} y fueron similares o resultaron regulados positivamente en células T CD8^{+}. Las inconsistencias entre la proteína IFN-\gamma y los niveles de ARN (Tablas 2 y 3) pueden ser causadas por la medición de proteína y ARNm en el mismo punto temporal.

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TABLA 2 Vista general de la producción de proteína IL-10 en células T CD4^{+} y CD8^{+} de 5 donantes

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TABLA 3 ARNm de IL-10 y de IFN-\gamma en linfocitos T CD4^{+} y CD8^{+} de 5 donantes tras el tratamiento de galectina-1

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Ejemplo 3 LGALS1 se expresa a nivel elevado en el rechazo del aloinjerto renal

Durante el rechazo del aloinjerto, las respuestas de células T desempeñan un papel importante. Para someter a ensayo que LGALS1 desempeña un papel en la regulación de la respuesta inmunológica durante el rechazo del aloinjerto, los presentes inventores sometieron a ensayo la expresión de LGALS1 en muestras de rechazo agudo y crónico del aloinjerto renal. En todos los riñones de control excepto en uno la expresión del ARNm de LGALS1 era muy débil o se encontraba ausente, mientras que en la mayoría de los riñones con rechazo crónico o agudo del aloinjerto, la expresión del ARNm de LGALS1 se encontraba altamente regulada positivamente (figura 2). El ARNm de IL-10 se encontraba presente en 3/8 casos de rechazo crónico y no en los otros casos de rechazo del aloinjerto renal. Se observó la expresión de ARNm de IFN-\gamma en tres casos con rechazo crónico y se observó una señal débil en tres otros casos de rechazo crónico. No se observó expresión de ARNm de IFN-\gamma en los casos con rechazo agudo y en los casos de riñón normal (figura 2). Sin embargo, la abundancia relativa de ambas citoquinas era muy baja en comparación con los niveles de ARNm de LGALS1 (figura 2B).

La tinción inmunohistoquímica para la galectina-1 en muestras de riñón normal demostró que la expresión se encontraba principalmente confinada a las células epiteliales mesangiales glomerulares y a células de músculo liso de vasos grandes (figuras 3A-3B). Ocasionalmente, células en el intersticio mostraban tinción positiva para la galectina-1 (figura 3C), mientras que en general no se observó expresión en células endoteliales de riñones de control. Durante el rechazo del aloinjerto, la expresión en células epiteliales mesangiales glomerulares y en células de músculo liso era similar a la de los riñones de control (no mostrados). Además, la expresión de proteína galectina-1 presentaba una regulación fuertemente positiva en células endoteliales de los capilares peritubulares en el intersticio y en células endoteliales de vasos grandes en regiones inflamadas (figuras 3D-F).

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Ejemplo 4 Evaluación del efecto del homodímero estable de galectina-1

Para someter a ensayo la eficiencia de la inducción de IL-10 de los homodímeros estables de galectina-1 (dGAL) en comparación con la proteína galectina-1 de tipo salvaje (mGAL), los presentes inventores incubaron PBMCs con diversas concentraciones de ambas proteínas. La figura 5 demuestra que los dímeros estables de galectina-1 pueden inducir la producción de IL-10 en células activadas a una concentración hasta 100 veces inferior a la de la proteína galectina-1 de tipo salvaje. Se obtuvieron los mismos resultados con PBMCs en reposo (resultados no mostrados). La preincubación de la proteína galectina-1 con lactosa (inhibidor de la galectina-1) en efecto resultó en niveles fuertemente reducidos de producción de IL-10 (figura 6). Estos datos demuestran que los dímeros estables de galectina-1 muestran una actividad incrementada en 100 veces en la inducción de la producción de IL-10.

Para someter a ensayo la eficiencia de la inducción de apoptosis de dímeros estables de galectina-1 (dGAL) en comparación con proteína galectina-1 de tipo salvaje (mGAL) los presentes inventores trataron células T MOLT-4 con diversas concentraciones comprendidas entre 0,1 y 20 \muM para mGAL y concentraciones comprendidas entre 0,1 y 5 \muM para dGAL. La figura 7 muestra que mGAL indujo apoptosis únicamente a la concentración más alta, de 20 \muM, tal como demuestra el porcentaje de células positivas para anexina V en comparación con las células de control sin tratar. dGAL resultó 4 a 8 veces más eficaz en la inducción de la apoptosis que mGAL. Estos datos demuestran que los homodímeros estables de galectina-1 también presentan una actividad incrementada con respecto a la inducción de la apoptosis.

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Ejemplo 5 Evaluación del efecto de los homodímeros estables de galectina sobre las citoquinas

Con el fin de someter a ensayo el potencial de los homodímeros estables de galectina-1 de modulación de la producción de otras citoquinas, se llevó a cabo un ensayo ELISA multiplex en células tratadas con galectina-1 (24 horas) de 5 donantes independientes para citoquinas que se ha informado que son moduladas por el tratamiento de galectina-1. Estos análisis no revelaron para dGAL cambios consistentes para IFN-\gamma e IL-2 y la falta de inducción de IL-4, IL-5, IL-12 e IL-13. Estos resultados fueron similares a los efectos observados con concentraciones altas de tratamiento de mGAL. Para IL-10, se observó una inducción fuerte en los cinco donantes (figura 8). El análisis de los niveles de ARNm de IL-10 confirmó la inducción de niveles elevados de ARNm de IL-10 a las tres concentraciones de dGAL sometidas a ensayo (figura 9). Para IL-1\beta se observó una fuerte inducción que resultó más pronunciada a la concentración más alta de dGAL, mientras que sólo se detectó una inducción débil a la concentración de 20 mM de la proteína mGAL (figura 10). Esta inducción de IL-1\beta se encontraba consistentemente presente en los 5 donantes (figura 11). La preincubación con lactosa podría bloquear eficientemente la inducción de la producción de IL-1\beta (figura 12). Estos demuestran que puede conseguirse una inducción más eficaz de IL-1\beta con 0,2 mM de dGAL, en comparación con la concentración más alta de mGAL (20 mM). Estos datos indican que los homodímeros estables de galectina-1 son mucho más potentes que la proteína galectina-1 de tipo salvaje.

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Ejemplo 6 Evaluación del tratamiento ex-vivo de biopsias con galectina-1

Se trataron ex vivo biopsias de un paciente con IBD con dos concentraciones de dGAL. El efecto de la galectina-1 sobre las biopsias de control no inflamadas fue mínimo respecto a los niveles de ARNm de IL-10 (figura 13), mientras que el efecto sobre el tejido inflamado fue más pronunciado. Una observación notable fue que el efecto de dGAL fue más pronunciado a la concentración más baja, indicando que resulta esencial optimizar la concentración de dGAL más eficaz.

La inmunohistoquímica no reveló cambios de la cantidad de células T infiltrantes y su patrón de activación en las biopsias tratadas y no tratadas (resultados no mostrados). La figura 11 muestra una imagen representativa de una tinción TUNEL en biopsias de tejido inflamado tratado y no tratado. No se produjo ningún incremento significativo de la cantidad de células apoptóticas en las biopsias inflamadas tras la incubación con la galectina-1 dimérica. En los tejidos de control no se produjo ningún incremento de la cantidad de células apoptóticas en comparación con los tejidos no tratados (resultados no mostrados).

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Ejemplo 7 Evaluación del efecto del homodímero estable de galectina-1 in vivo

Se determinó el efecto de diferentes concentraciones de homodímero estable de galectina-1 intravenosa en ratones sanos (se utilizaron las mismas cepas de ratón que para los modelos de enfermedad). Se analizaron la composición y activación de suspensiones de células sanguíneas periféricas y células de bazo para determinar el efecto del tratamiento de galectina-1. Se utilizaron tres sistemas modelo de ratón: los modelos de IBD, de soriasis y de asma.

Para los tres modelos, se administraron homodímeros estables de galectina-1 en dos puntos temporales, es decir, durante la inducción de la enfermedad y al presentarse los primeros síntomas de enfermedad establecida. En los primeros experimentos animales, se administraron por vía intravenosa dos concentraciones diferentes de galectina-1 estable. Se comparó la eficiencia del tratamiento con animales tratados con solución salina y animales tratados con IL-10. Esto reveló los efectos favorables adicionales del tratamiento de galectina-1 en comparación con el tratamiento de IL-10. Para corroborar los efectos adicionales de los homodímeros estables de galectina-1, se llevó a cabo el tratamiento de galectina-1 con y sin anticuerpos neutralizadores anti-IL-10. La comparación de estos dos grupos de animales proporcionó información sobre los efectos de la galectina-1 misma y sobre los efectos secundarios inducidos por las grandes cantidades de IL-10 presentes en el tejido afectado.

Los experimentos finales se centraron en la comparación entre la administración intravenosa de homodímeros estables de galectina-1 y la administración local de homodímeros estables de galectina-1. Esto se consiguió, para el modelo de IBD, con tabletas de galectina-1 que se disuelven en el intestino delgado; con crema de galectina-1 para el modelo de soriasis; y con un aerosol de galectina-1 para el modelo de asma. Nuevamente se administraron dos concentraciones diferentes en dos puntos temporales diferentes para someter a ensayo la eficiencia en los puntos temporales de inducción de la enfermedad y de enfermedad establecida.

Procedimiento general: modelo de IBD

La transferencia adoptiva de células CD4^{+} CD45RB^{hi} no expuestas a ratones inmunodeficientes condujo al desarrollo de una enfermedad debilitante letal en los receptores, con infiltración severa de leucocitos en el colon, acompañada de hiperplasia epitelial marcada (Powrie). El tratamiento de los ratones con células CD4^{+} CD45RB^{low} puede inhibir la enfermedad e IL-10 desempeña un papel esencial en este proceso (Asseman).

Se inyectaron por vía intravenosa (4x10^{5} células por ratón) células de bazo CD4+ CD45RB^{hi} separadas procedentes de ratones BALB/C en ratones C.B.-17 scid y se evaluaron ratones regularmente para la pérdida de peso y condición de las heces. Tres a cinco semanas después de la transferencia de las células T, los ratones empezaron a perder peso y las heces adquirieron una consistencia blanda. Tras 10 a 12 semanas habían perdido 15% a 20% de su peso corporal y algunos animales debieron sacrificarse debido a su mala condición. En el modelo de los presentes inventores, los animales se sacrificaron a las 8 semanas. Se midieron los colones y se llevó a cabo un estudio histológico para evaluar el grado de la colitis y el efecto del tratamiento (Leach). Se aislaron linfocitos de la lámina propia y se sometieron a ensayo para la producción de citoquinas (IL-2, IFN-\gamma, TNF-\alpha, IL-4 e IL-10) en ensayos ELISA, subpoblaciones mediante citometría de flujo, y ARNm para citoquinas y factores de transcripción mediante PCR cuantitativa (Davenport). Se utilizaron técnicas inmunohistológicas y moleculares para evaluar el grado de apoptosis.

Se administró tratamiento de galectina-1 diariamente desde el día 0 para someter a ensayo la eficiencia de los homodímeros estables de galectina-1 para evitar la enfermedad o, desde las 3 semanas, para someter a ensayo la eficiencia del tratamiento de homodímero de galectina-1 para reducir los síntomas de la enfermedad establecida.

Procedimiento general: modelo de soriasis

El modelo de IBD puede expandirse a un modelo de soriasis si el día 1 después de la transferencia de células T, los ratones reciben inyecciones de enterotoxina B estafilocócica (Davenport). Éste es un modelo animal de soriasis de tipo Th1 comparable a las células T de tipo Th1 que se encuentran en los pacientes de soriasis (Schlaak).

Se inyectaron en ratones C.B.-17 scid por vía intravenosa células de bazo CD4^{+}CD45RBhi separadas (4x10^{5} células por ratón) procedentes de ratones BALB/C. Tras 1 día, los ratones recibieron inyecciones intraperitoneales con 10 \mug de enterotoxina B estafilocócica. Se evaluaron los ratones para la presencia y severidad de las lesiones en la piel, además del peso y las heces. Las lesiones en la piel empezaron a desarrollarse tras 3 a 4 semanas, y tras 7 semanas los ratones presentaban un 100% de incidencia de lesiones en la piel. Tras 8 semanas, se sacrificaron los animales y se llevaron a cabo estudios histológicos. Se llevó a cabo un estudio inmunohistoquímico para detectar células apoptóticas y otros cambios en el tejido afectado. Se aislaron linfocitos que infiltraban la piel mediante digestión enzimática. Los linfocitos aislados se estimularon in vitro y se midieron las producciones de citoquinas (IL-2, IFN-\gamma, TNF-\alpha, IL-4 e IL-10) (Davenport).

El tratamiento de galectina-1 se proporcionó el día 0 para someter a ensayo la eficiencia de los homodímeros estables de galectina-1 para prevenir la enfermedad, y tras 3 semanas, para someter a ensayo la eficiencia del tratamiento de homodímero de galectina-1 para reducir los síntomas de la enfermedad establecida.

Procedimiento general: modelo de asma

Se estudiaron los efectos in vivo del tratamiento de galectina-1 en un modelo de ratón en el que se han descrito efectos de regulación negativa de la IL-10 endógena sobre la inflamación alérgica de las vías respiratorias (mr Stampfli, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 1999). Se indujo asma en ratones Balb/c hembra, de 8 a 10 semanas de edad, mediante la exposición diaria a ovoalbúmina aerosolizada (al 1% p/v en solución salina al 0,9%) durante 20 minutos durante un periodo de 10 días consecutivos. A modo de control se utilizó solución salina tamponada con fosfato (PBS). El aerosol se administró en una cámara de exposición de pérspex (9 litros) con un "nebulizador De Vilbiss" (tipo 646, De Vilbiss, Somerset, PA, USA) controlado por un flujo de aire de 8 litros/min, proporcionando aerosol con una salida de 0,33 ml/minuto.

Veinticuatro horas después del último aerosol, se evaluó la obstrucción aguda de las vías respiratorias tras el aerosol OVA o PBS y la hipersensibilidad de las vías respiratorias a la metacolina, en animales conscientes con respiración espontánea, utilizando un sistema pletismográfico de cuerpo completo (Buxco Electronics, Petersfield, Reino Unido). Veinticuatro horas después de la evaluación de la hiperreactividad bronquial y la obstrucción de las vías respiratorias inducida por ovoalbúmina, se sacrificaron los ratones. Se utilizó el líquido de lavado broncoalveolar para la evaluación de las citoquinas (IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13) y se aislaron del tejido pulmonar las células inflamatorias infiltrantes para determinar la inflamación de las vías respiratorias mediante citometría de flujo (células T, células B, neutrófilos, eosinófilos y macrófagos). Además, se sacrificó un grupo de ratones para el análisis inmunohistoquímico de la inflamación de las vías respiratorias en el pulmón. Se evaluó el porcentaje de células apoptóticas en el tejido pulmonar. Durante el procedimiento de inducción de asma, se administró suero los días 0, 5 y 11 para la determinación de los niveles de IgE específicos para OVA o totales séricos.

Se administró tratamiento de galectina-1 el día 0 para someter a ensayo la eficiencia de los homodímeros estables de galectina-1 para prevenir la enfermedad, y el día 4 para someter a ensayo la eficiencia del tratamiento de homodímero de galectina-1 para reducir los síntomas de la enfermedad establecida. La eficiencia del tratamiento de galectina-1 se basa en la reducción de la obstrucción aguda de las vías respiratorias, de la hiperreactividad bronquial y de los niveles séricos de IgE. Además, los presentes inventores estudiaron la inducción de la producción de IL-10 en las células infiltrantes y el porcentaje de células apoptóticas en el tejido afectado.

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Otras realizaciones se encuentran comprendidas en las reivindicaciones siguientes.

Claims (32)

1. Método ex vivo para inducir la producción de IL-10 en una célula, que comprende poner en contacto dicha célula con una composición que comprende un polipéptido galectina-1 multimérico, en el que dicha célula es un linfocito, una célula dendrítica, un monocito o un macrófago.

2. Método según la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido galectina-1 es un dímero.

3. Método según la reivindicación 2, en el que dicho dímero es estable.

4. Método según la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido galectina-1 es un dímero estable a una concentración inferior a 7 \muM.

5. Método según la reivindicación 1, en el que dicha célula es una célula T, una célula B o un monocito.

6. Método según la reivindicación 5, en el que dicha célula T es CD4 y CD8 positiva.

7. Método según la reivindicación 5, en el que dicha célula T es una célula T activada o una célula T no activada.

8. Método según la reivindicación 5, en el que dicho polipéptido galectina-1 induce la producción de IL-10 a una concentración inferior a la de la galectina de tipo salvaje.

9. Polipéptido galectina-1 multimérico estable que no se disocia en monómeros a una concentración inferior a 7 \muM.

10. Polipéptido galectina-1 según la reivindicación 9, en el que el polipéptido es un dímero.

11. Polipéptido galectina-1 según la reivindicación 9 ó 10 para la utilización como medicamento.

12. Utilización del polipéptido galectina-1 según la reivindicación 9 ó 10 para la preparación de un medicamento para prevenir o aliviar un síntoma de un trastorno de tipo inmunológico.

13. Utilización según la reivindicación 12, en la que dicho trastorno de tipo inmunológico es una enfermedad intestinal inflamatoria, una enfermedad autoinmunológica, alergias alimentarias o asma.

14. Utilización según la reivindicación 13, en la que dicha enfermedad intestinal inflamatoria es la enfermedad de Crohn o la colitis ulcerosa.

15. Utilización según la reivindicación 13, en la que dicha enfermedad autoinmunológica es la esclerosis múltiple, la diabetes, la artritis reumatoide o el lupus eritematoso sistémico.

16. Utilización del polipéptido galectina-1 según la reivindicación 9 ó 10 para la preparación de un medicamento para reducir la inflamación de un tejido.

17. Utilización según la reivindicación 16, en la que dicha inflamación es crónica o aguda.

18. Utilización según la reivindicación 16, en la que dicho tejido es tejido pulmonar, tejido hepático, tejido intestinal, tejido pancreático, tejido linfoide o tejido dérmico.

19. Utilización según la reivindicación 16, en la que dicho tejido intestinal es tejido intestinal epitelial.

20. Utilización según la reivindicación 16, en la que dicha inflamación es inflamación esquelética, inflamación gastrointestinal, inflamación cardiovascular, inflamación pulmonar o inflamación neurológica.

21. Utilización según la reivindicación 20, en la que dicha inflamación gastrointestinal es colitis.

22. Utilización del polipéptido galectina-1 según la reivindicación 9 ó 10 para la preparación de un medicamento para incrementar la supervivencia del aloinjerto.

23. Utilización según la reivindicación 22, en la que dicho medicamento se administra antes, simultáneamente o después de que un sujeto reciba un trasplante.

24. Utilización según la reivindicación 22, en la que dicho medicamento se administra durante un periodo preseleccionado de tiempo.

25. Utilización según la reivindicación 24, en la que dicho periodo preseleccionado de tiempo es de entre aproximadamente 1 y 2 semanas.

26. Utilización según la reivindicación 22, en la que dicho medicamento está destinado a ponerse en contacto con un órgano antes del trasplante con el fin de incrementar la supervivencia del aloinjerto.

27. Composición de vacuna purificada que comprende el polipéptido galectina-1 según la reivindicación 9 ó 10 y un antígeno.

28. Vacuna que comprende una primera composición que comprende el polipéptido galectina-1 según la reivindicación 9 ó 10, y una segunda composición que comprende un antígeno.

29. Utilización de la vacuna según la reivindicación 28 en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de una enfermedad infecciosa o de cáncer.

30. Utilización según la reivindicación 29, en la que dicha primera composición se administra conjuntamente con dicha segunda composición.

31. Utilización según la reivindicación 29, en la que dicha primera composición se administra antes que dicha segunda composición.

32. Utilización según la reivindicación 29, en la que dicha primera composición se administra después de dicha segunda composición.