ES2312983T3 - Conjugados radiomarcados basados en sustancia p y sus usos. - Google Patents
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Abstract
Un conjugado de un análogo de la sustancia P y una molécula queladora, en el que el conjugado de la sustancia P tiene la abreviatura Quelador-R-Arg 1 -Pro 2 -Lys 3 -Pro 4 -Gln 5 -Gln 6 -Phe 7 -Phe 8 -Gly 9 -Leu 10 -Met 11 -NH2 y comprende los compuestos de fórmula I (Ver fórmula) en la que R es -CH2-C(O)-, -C(CO2H)CH2CH2-C(O)- o -C(CO2H)CH2-C(O)-, se modifica mediante la modificación a) subsiguiente en la secuencia de aminoácidos de la sustancia P: a) sustitución de Met 11 por -NH-CH(CH2CH2-SO2-CH3)-C(O)-(Met(O2)11 ), -NH-CH(CH2CH2-SO-CH3)-C (O)-(Met(O)11 ), o -NH-CH[CH(CH2)CH2CH3)-C(O)-(Ile 11 ), y opcionalmente al menos una de las modificaciones b) a g) subsiguientes: b) sustitución de Leu 10 por -NH-CH[CH(CH2)CH2CH3)-C(O)-(Ile 10 ), c) sustitución de Gly 9 por -N(CH3)-CH2-C(O)-(Sar 9 ), d) sustitución de Phe 7 o Phe 8 o tanto Phe 7 como Phe 8 por un residuo de las fórmulas (Ver fórmulas) e) sustitución de Lys 3 por un residuo de las fórmulas (Ver fórmulas) f) truncamiento de 1 a 5 aminoácidos de la secuencia Arg 1 -Pro 2 -Lys 3 -Pro 4 -Gln 6 , o g) sustitución de 1 a 5 aminoácidos de la secuencia Arg 1 -Pro 2 -Lys 3 -Pro 4 -Gln 5 por -N(CH3)-CH2-C(O)-(Sar), y en el que los conjugados están sin marcar o marcados con un radionucleido seleccionado del grupo que consiste en Actinio-225, Bismuto-212, Bismuto-213, Plomo-203, Cobre-64, Cobre-67, Galio-66, Galio-67, Galio-68, Lutecio-177, Indio-111, Indio-113, Itrio-86 e Itrio-90, Disprosio-162, Disprosio-165, Disprosio-167, Holmio-166, Praseodi-mio- 142, Praseodimio-143, Prometio-149 y Terbio-149.
Description
Conjugados radiomarcados basados en sustancia P
y sus usos.
La presente invención se refiere a una
composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéutico y
una cantidad eficaz de un conjugado de un análogo de la sustancia P
con
1-(1,3-carboxipropil)-4,7,10-(carboximetil)-1,4,7,10-tetraazaciclododecano
(quelador DOTAGA),
1-(1,2-carboxietil)-4,7,10-(carboximetil)-1,4,7,10-tetraazaciclododecano
(quelador DOTASA) o ácido
1,4,7,10-tetraazaciclo-dodecan-1,4,7,10-tetraacético
(quelador DOTA), que están marcados con radionucleidos adecuados;
su uso para la selección como objetivo y para el tratamiento de
tumores cerebrales, o el uso de los conjugados de la sustancia P
marcados correspondientes para la selección como objetivo y el
tratamiento de tumores cerebrales; los conjugados de análogos de la
sustancia P con DOTAGA, DOTASA o DOTA, que están marcados con
radionucleidos adecuados; y los conjugados de análogos de la
sustancia P con DOTAGA, DOTASA o DOTA y sus ésteres de
t-butilo.
La sustancia P es un neuropéptido de 11
aminoácidos que se da de forma natural, y pertenece a la familia de
neuropéptidos bioactivos conocidos como taquicininas [Payan (1989)
Ann. Rev. Med. 40, 341]. La secuencia de aminoácidos de este
undecapéptido se identificó como
H-Arg^{1}-Pro^{2}-Lys^{3}-Pro^{4}-Gln^{5}-Gln^{6}-Phe^{7}-Phe^{8}-Gly^{9}-Leu^{10}-Met^{11}-NH_{2}.
En el documento WO 92/18536 se describe un método para detectar y
localizar tejidos que tienen receptores de neurocinina 1 (NK1),
tales como tumores con receptores NK1 en el organismo de un ser vivo
de sangre caliente, mediante la administración de una composición
que comprende un péptido corto marcado, p. ej. sustancia P y los
derivados análogos que tienen una afinidad selectiva hacia los
receptores de neurocinina 1, y ensayarlos en ese ser vivo. Además,
la invención se refiere a un método para el tratamiento terapéutico
de tumores malignos, p. ej. glioma, cáncer de pulmón de células
pequeñas y otros.
J. Fichna et al. resumen en Bioconjugate
Chem. 2003, páginas 3 a 17, la síntesis de péptidos radiomarcados
específicos del objetivo para el diagnóstico por la imagen y las
posibilidades para su aplicación como productos radiofarmacéuticos.
Se mencionan diversos péptidos y conjugados con diversas moléculas
quelantes, pero no se describe la combinación de la sustancia P y
de sus análogos con DOTA o DOTAGA, y no hay ninguna indicación
sobre el tratamiento de tumores cerebrales con estos conjugados
radiomarcados.
El proquelador (éster) y el quelador (ácido)
DOTA, ácido
1,4,7,10-tetraazaciclo-dodecan-1,4,7-tris(éster
t-butílico de ácido
acético)-10-acético se describe en
Chem. Eur. J. 1999, 5, nº 7, páginas 1974-1981.
Los estudios satisfactorios sobre la selección
como objetivo locorregional de receptores de péptidos reguladores
con un análogo de somatostatina difundible
DOTA^{0}-D-Phe^{1}-Tyr^{3}-octreótido
(DOTATOC) marcado con ^{111}In/^{90}Y, un conjugado basado en
somatostatina radiomarcado, demostraron por primera vez in
vivo en pacientes de tumores cerebrales humanos que DOTATOC
tiene una unión de afinidad elevada a SSTR-2
(receptor de somatostatina del subtipo 2) en el intervalo nanomolar
bajo, lo cual fue informado por A. Merlo et al. (1999) en
Clin. Cancer Res. 5, 1025-1033. Además, S. Hofer
et al. informan en Swiss Med. Weekly 2001, 131:
640-644 del efecto de la braquiterapia difundible
(dBT) mediante el uso del radioconjugado estable inyectado
localmente
DOTA^{0}-D-Phe^{1}-Tyr^{3}-octreótido
(DOTATOC) marcado con ^{90}Y para tratar gliomas de bajo grado
sintomáticos.
El documento
EP-A-1 283 216 se refiere a análogos
de somatostatina que comprenden entre otras alternativas un
quelador basado en DOTA, y el uso de los análogos de somatostatina
en el tratamiento de enfermedades caracterizadas por una
sobreexpresión de los receptores de somatostatina. Además, M.
Laznicek et al. han informado en Cancer Biotherapy and
Radiopharmaceuticals, vol. 17, nº 5, 2002, 527-533
de los perfiles de distribución y las rutas de eliminación de los
derivados de octreotato radiomarcados con itrio.
El documento WO 01/02 021 se refiere a un
análogo del péptido taquicinina radiomarcado y a su uso en la
formación de imágenes de los receptores del péptido taquicinina
in vivo en mamíferos.
En el documento WO 02/24235 se describe la
preparación de
1-(1-carboxi-3-carbo-tert-butoxipropil)-4,7,10-(carbo-tert-butoxi-metil)-1,4,7,10-tetraazaciclododecano
(proquelador DOTAGA), que se usa para preparar conjugados de
moléculas efectoras y
1-(1,3-carboxi-propil)-4,7,10-(carboxi-metil)-1,4,7,10-tetraazaciclododecano
(quelador DOTAGA). Como moléculas efectoras se proponen los
péptidos tales como octreótido o CCK, que se acoplan al extremo
N-terminal de estos péptidos bioactivos. También se
han mencionado los conjugados con la sustancia P, pero no se han
preparado y por lo tanto no se han ejemplificado. Dichos conjugados
se pueden marcar con radionucleidos tanto para aplicaciones
diagnósticas (^{111}In, ^{67/68}Ga) como para aplicaciones
radioterápicas internas (^{90}Y, ^{177}Lu). La publicación se
centra en los conjugados de octreótido y octreotato tales como
DOTATOC, que proporcionan un mejor rendimiento de marcaje y una
estabilidad elevada. No se menciona el tratamiento de tumores
cerebrales, p. ej. gliomas.
Se descubrió sorprendentemente que el receptor
NK-1 se expresa en tumores cerebrales y se puede
aplicar para la unión de conjugados radiomarcados basados en la
sustancia P y sus análogos con los queladores DOTAGA, DOTASA o
DOTA, y dichos conjugados son mucho más eficaces que DOTATOC,
sustancia P radiomarcada, sustancia P y análogos, y saporina, y
otros péptidos pequeños radiomarcados con o sin agente quelante en
la selección como objetivo y el tratamiento de tumores,
especialmente tumores cerebrales, p. ej. gliomas. También se
descubrió sorprendentemente que la formación del complejo metálico
se consigue en poco tiempo y que los complejos poseen una
estabilidad química mayor, por lo que se evita la contaminación del
tejido o de los líquidos corporales con radionucleidos libres. Los
conjugados radiomarcados basados en la sustancia P muestran una
semivida inesperadamente elevada en el suero, que es suficiente
para la aplicación como agentes internos de radiodiagnóstico y
radioterapia. La estabilidad en el suero de los conjugados basados
en los análogos de la sustancia P incluso se incrementa sin
disminuir la afinidad de unión al receptor NK1 en un grado
indeseable. En algunos casos la afinidad de unión incluso mejora
cuando se usan los análogos de la sustancia P. También se descubrió
que la metionina en la posición 11 es sensible a la oxidación
(radiolisis) tras el marcaje (se forma un sulfóxido), y que dicha
oxidación se puede inhibir al sustituir la metionina por
metionina-sulfona, por lo cual la afinidad de unión
se puede mantener sustancialmente o incluso mejorarse con otras
sustituciones de aminoácidos en la secuencia de la sustancia P.
También se descubrió sorprendentemente que los conjugados
radiomarcados basados en la sustancia P son capaces de difundir
tras la administración e infiltrar los nidos de células tumorales o
las lesiones satélites, de forma que se pueden detectar y
tratar.
Un primer objetivo de la invención es un
conjugado de la sustancia P y de una molécula queladora marcada con
un radionucleido, que tiene la abreviatura
Quelador-R-Arg^{1}-Pro^{2}-Lys^{3}-Pro^{4}-Gln^{5}-Gln^{6}-Phe^{7}-Phe^{8}-Gly^{9}-Leu^{10}-Met^{11}-NH_{2}
y que comprende los compuestos de fórmula I
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\vskip1.000000\baselineskip
en la
que
R es -CH_{2}-C(O)-,
-C(CO_{2}H)CH_{2}CH_{2}-C(O)-
o -C(CO_{2}H)CH_{2}-C(O)-,
modificada mediante la modificación a) subsiguiente en la secuencia
de aminoácidos de la sustancia P:
- a)
- sustitución de Met^{11} por -NH-CH(CH_{2}CH_{2}-SO_{2}-CH_{3})-C(O)-(Met(O_{2})^{11}), -NH-CH(CH_{2}CH_{2}-SO-CH_{3})-C(O)-(Met(O)^{11}), o -NH-CH[CH(CH_{3})CH_{2}CH_{3})-C(O)-(Ile^{11}), y opcionalmente al menos una de las modificaciones b) a g) subsiguientes:
- b)
- sustitución de Leu^{10} por -NH-CH[CH(CH_{3})CH_{2}CH_{3})-C(O)-(Ile^{10}),
- c)
- sustitución de Gly^{9} por -N(CH_{3})-CH_{2}C(O)-(Sar^{9}),
- d)
- sustitución de Phe^{7} o Phe^{8} o tanto Phe^{7} como Phe^{8} por un residuo de las fórmulas
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\vskip1.000000\baselineskip
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- e)
- sustitución de Lys^{3} por un residuo de las fórmulas
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- f)
- truncamiento de 1 a 5 aminoácidos de la secuencia Arg^{1}-Pro^{2}-Lys^{3}-Pro^{4}-Gln^{5}, o
- g)
- sustitución de 1 a 5 aminoácidos de la secuencia Arg^{1}-Pro^{2}-Lys^{3}-Pro^{4}-Gln^{5} por -N(CH_{3})-CH_{2}-C(O)-(Sar),
y en el que el conjugado está
marcado con un radionucleido seleccionado del grupo que consiste en
Actinio-225, Bismuto-212,
Bismuto-213, Plomo-203,
Cobre-64, Cobre-67,
Galio-66, Galio-67,
Galio-68, Lutecio-177,
Indio-111, Indio-113,
Itrio-86 e Itrio-90,
Disprosio-162, Disprosio-165,
Disprosio-167, Holmio-166,
Praseodimio-142, Praseodimio-143,
Prometio-149, y Terbio-149, y su uso
como ingrediente activo en formulaciones
radio-farmacéuticas o
radio-diagnósticas para seleccionar como objetivo o
tratar tumores cerebrales, especialmente
gliomas.
Cuando el R de la fórmula I unido al residuo
tetraazamacrocíclico es -CH_{2}-C(O)-, se
abrevia como el quelador DOTA; cuando el R de la fórmula I unido al
residuo tetraazamacrocíclico es
-C(CO_{2}H)CH_{2}CH_{2}-C(O)-,
se abrevia como el quelador DOTAGA; y cuando el R de la fórmula I
unido al residuo tetraazamacrocíclico es
-C(CO_{2}H)CH_{2}-C(O)-, se
abrevia como el quelador DOTASA. Cuando los grupos carboxílicos de
los restos queladores están esterificados, por ejemplo con
t-butanol, los residuos se denominan proquelador.
Los proqueladores se pueden usar para el acoplamiento adecuado a
los péptidos durante la síntesis en fase sólida.
El marcaje en el contexto de esta invención
significa la unión del radionucleido a los grupos carboxílicos y a
los átomos de nitrógeno del residuo quelador, por lo cual los
aniones de las sales de los radionucleidos se sustituyen de acuerdo
con la valencia del ión metálico, que son sustancialmente iones de
metal(III) o metal(II).
Las abreviaturas usadas para modificar los
aminoácidos se explican a continuación: Met(O) es
metionina-sulfóxido; Met(O_{2}) es
metionina-sulfona; Ile es isoleucina; Sar es
sarcosina; 2-Thi es
3-(2-tienil)-alanina;
3-BzThi es
3-(3-benzotienil)-alanina;
2-Nal es
3-(2-naftil)-alanina;
1-Nal es
3-(1-naftil)-alanina; Cha es
ciclohexil-alanina; Arg es arginina; Orn es
ornitina; y Phegly es fenilglicina.
En una realización preferida de la invención, el
residuo R de la fórmula I significa
-CH_{2}-C(O)-. En una realización más
preferida, la secuencia de aminoácidos de la fórmula I corresponde a
las fórmulas
- a)
- Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met(O_{2})-NH_{2},
- b)
- Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Sar-Leu-Met(O_{2})-NH_{2},
- c)
- Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Thi-Gly-Leu-Met(O_{2})-NH_{2},
- d)
- Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Thi-Phe-Gly-Leu-Met(O_{2})-NH_{2},
- e)
- Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Thi-Sar-Leu-Met(O_{2})-NH_{2},
- f)
- Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Thi-Phe-Sar-Leu-Met(O_{2})-NH_{2},
- g)
- Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Thi-Thi-Sar-Leu-Met(O_{2})-NH_{2},
- h)
- Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Thi-Thi-Gly-Leu-Met(O_{2})-NH_{2}.
En otra realización preferida, los compuestos de
fórmula I comprenden en la posición 11 de la secuencia natural de
la sustancia P un residuo de metionina-sulfona de
fórmula
-NH-CH(CH_{2}CH_{2}-SO_{2}-CH_{3})-C(O)-
en lugar de un residuo de metionina. Se descubrió que el residuo de
metionina tiene tendencia a la oxidación/se oxida fácilmente al
aire, y especialmente durante el proceso de marcaje con los
radionucleidos, lo que conduce a productos finales desiguales. La
desigualdad se puede evitar mediante el uso de
metionina-sulfona en vez de metionina.
Otro conjugado preferido de análogo de la
sustancia P de fórmula I es uno en el que el residuo de glicina de
la posición 9 de la secuencia natural de la sustancia P se sustituye
por un residuo de sarcosina de fórmula
-N(CH_{3})-CH_{2}-C(O)-.
Otro conjugado preferido de análogo de la
sustancia P de fórmula I es uno en el que el residuo de fenilalanina
de la posición 7 u 8 o de ambas posiciones de la secuencia natural
de la sustancia P se sustituye por un residuo de
3-(2-tienil)-alanina de fórmula
Otro conjugado preferido de análogo de la
sustancia P de fórmula I es uno en el que el residuo de fenilalanina
de la posición 8 de la secuencia natural de la sustancia P se
sustituye por una
3-(2-tienil)-alanina, y el residuo
de glicina de la posición 9 se sustituye por un residuo de
sarcosina.
Otro conjugado preferido de análogo de la
sustancia P de fórmula I es uno en el que el residuo de metionina
de la posición 11 de la secuencia natural de la sustancia P se
sustituye por un residuo de metionina-sulfona, y el
residuo de fenilalanina de la posición 8 de la secuencia natural de
la sustancia P se sustituye por un residuo de
3-(2-tienil)-alanina, o el residuo
de glicina de la posición 9 se sustituye por un residuo de
sarcosina.
Los conjugados de análogos de la sustancia P de
fórmula I, que están modificados en la posición 8 como se describió
anteriormente, muestran una estabilidad en el suero muy superior o
una sensibilidad inferior a las peptidasas, respectivamente. Los
conjugados de análogos de la sustancia P de fórmula I, que están
modificados en las posiciones 7, 8, 9 y/o 11 como se describió
anteriormente, demuestran también que poseen una afinidad de unión
elevada hacia el receptor NK-1 en comparación con la
sustancia P natural, tal como se puede detectar con una
autorradiografía al medir los valores de CI_{50}, que pueden ser
de 0,1 a 50, preferiblemente de 0,5 a 20 y más preferiblemente de
0,7 a 10.
En una realización más preferida, la secuencia
de aminoácidos de la fórmula I corresponde a las fórmulas
- a)
- Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met(O_{2})-NH_{2},
- b)
- Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Sar-Leu-Met(O_{2})-NH_{2},
- c)
- Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Thi-Gly-Leu-Met(O_{2})-NH_{2},
- d)
- Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Thi-Sar-Leu-Met(O_{2})-NH_{2}.
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En una realización particularmente preferida, la
secuencia de aminoácidos de la fórmula I corresponde a las
fórmulas
- a)
- Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Sar-Leu-Met(O_{2})-NH_{2}, o
- b)
- Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Thi-Gly-Leu-Met(O_{2})-NH_{2},
ya que estos compuestos muestran
una oxidación y una estabilidad en el suero excepcionales, así como
una afinidad de unión muy elevada, que es comparable o incluso
mayor que la de la secuencia natural de la sustancia
P.
Los conjugados de fórmula I y los
radioconjugados preferidos mencionados anteriormente, que tienen los
queladores DOTAGA, DOTASA o DOTA unidos al extremo aminoterminal,
son útiles para las investigaciones de diagnóstico mediante el uso
de gammagrafía con sustancia P o análogos marcados con
Indio-111, o mediante el uso de tomografía de
emisión de positrones con los marcadores Galio-68,
Galio-66, Itrio-86 o
Cobre-64. El vector peptídico de diagnóstico se
puede aplicar de forma locoregional o sistémica.
Para el tratamiento terapéutico, los conjugados
de fórmula I y los conjugados de análogos mencionados anteriormente
con los queladores DOTAGA, DOTASA o DOTA se pueden marcar, por
ejemplo, con isótopos emisores \alpha, p. ej.
Bismuto-213, Actinio-225, y los
emisores \beta Itrio-90 y
Lutecio-177.
Otro aspecto de la invención proporciona una
composición para seleccionar como objetivo tumores cerebrales,
localizar o tratar tumores cerebrales y sus lesiones satélites en un
hospedador que padece tumores cerebrales, p. ej. gliomas, que
comprende al menos un compuesto de fórmula I. La composición es
especialmente útil en la detección y el tratamiento terapéutico de
tumores cerebrales y de sus lesiones satélites.
Un objetivo de la invención es también una
composición terapéutica o diagnóstica para seleccionar como objetivo
tumores cerebrales, localizar o tratar tumores cerebrales y sus
lesiones satélites en un mamífero, que comprende administrar a un
mamífero que necesita tal terapia una cantidad eficaz de un
conjugado de la sustancia P marcado con un radionucleido de fórmula
I.
Otro objetivo de la invención es una composición
para administrar un conjugado de la sustancia P marcado con un
radionucleido de fórmula I a un hospedador, que comprende
administrar a un hospedador un conjugado de la sustancia P marcado
con un radionucleido de fórmula I para diagnosticar o para tratar
tumores cerebrales humanos.
Un objetivo adicional de la invención es el uso
de un conjugado de la sustancia P marcado con un radionucleido de
fórmula I para la fabricación de un medicamento útil para la
detección y para el tratamiento terapéutico de tumores cerebrales y
de sus lesiones satélites en un mamífero, tal como un humano; y un
conjugado de la sustancia P marcado con un radionucleido de fórmula
I para el uso en la terapia médica.
El objetivo de la invención son los conjugados
de análogos de la sustancia P y de una molécula queladora, en los
que el conjugado de la sustancia P tiene la abreviatura
Quelador-R-Arg^{1}-Pro^{2}-Lys^{3}-Pro^{4}-Gln^{5}-Gln^{6}-Phe^{7}-Phe^{8}-Gly^{9}-Leu^{10}-Met^{11}-NH_{2}
y comprende los compuestos de fórmula I
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que
R es -CH_{2}-C(O)-,
-C(CO_{2}H)CH_{2}CH_{2}-C(O)-
o -C(CO_{2}H)CH_{2}-C(O)-,
se modifica mediante la modificación a) subsiguiente en la
secuencia de aminoácidos de la sustancia P:
- a)
- sustitución de Met^{11} por -NH-CH(CH_{2}CH_{2}-SO_{2}CH_{3})-C(O)-(Met(O_{2})^{11}), -NH-CH(CH_{2}CH_{2}-SO-CH_{3})-C(O)-(Met(O)^{11}), o -NH-CH[CH(CH_{3})CH_{2}CH_{3})-C(O)-(Ile^{11}), y opcionalmente al menos una de las modificaciones b) a g) subsiguientes:
- b)
- sustitución de Leu^{10} por -NH-CH[CH(CH_{3})CH_{2}CH_{3})-C(O)-(Ile^{10}),
- c)
- sustitución de Gly^{9} por -N(CH_{3})-CH_{2}C(O)-(Sar^{9}),
- d)
- sustitución de Phe^{7} o Phe^{8} o tanto Phe^{7} como Phe^{8} por un residuo de las fórmulas
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\newpage
- e)
- sustitución de Lys^{3} por un residuo de las fórmulas
- f)
- truncamiento de 1 a 5 aminoácidos de la secuencia Arg^{1}-Pro^{2}-Lys^{3}-Pro^{4}-Gln^{5}, o
- g)
- sustitución de 1 a 5 aminoácidos de la secuencia Arg^{1}-Pro^{2}-Lys^{3}-Pro^{4}-Gln^{5} por -N(CH_{3})-CH_{2}C(O)-(Sar),
y en el que los conjugados están
sin marcar o marcados con un radionucleido seleccionado del grupo
que consiste en Actinio-225,
Bismuto-212, Bismuto-213,
Plomo-203, Cobre-64,
Cobre-67, Galio-66,
Galio-67, Galio-68,
Lutecio-177, Indio-111,
Indio-113, Itrio-86 e
Itrio-90, Disprosio-162,
Disprosio-165, Disprosio-167,
Holmio-166, Praseodimio-142,
Praseodimio-143, Prometio-149 y
Terbio-149; lo que incluye las realizaciones
preferidas de los análogos como se mencionó
anteriormente.
Aún un objetivo adicional de la invención es una
composición que comprende (a) al menos un vehículo farmacéutico y
(b) al menos un conjugado de un análogo de la sustancia P y de una
molécula queladora, en la que el conjugado de la sustancia P tiene
la abreviatura
Quelador-R-Arg^{1}-Pro^{2}-Lys^{3}-Pro^{4}-Gln^{5}-Gln^{6}-Phe^{7}-Phe^{8}-Gly^{9}-Leu^{10}-Met^{11}-NH_{2}
y comprende los compuestos de fórmula I
en la
que
R es -CH_{2}-C(O)-,
-C(CO_{2}H)CH_{2}CH_{2}-C(O)-
o -C(CO_{2}H)CH_{2}C(O)-, se modifica
mediante la modificación a) subsiguiente en la secuencia de
aminoácidos de la sustancia P:
- a)
- sustitución de Met^{11} por -NH-CH(CH_{2}CH_{2}-SO_{2}-CH_{3})-C(O)-(Met(O_{2})^{11}), -NH-CH(CH_{2}CH_{2}-SO-CH_{3})-C(O)-(Met(O)^{11}), o -NH-CH[CH(CH_{3})CH_{2}CH_{3})-C(O)-(Ile^{11}), y opcionalmente al menos una de las modificaciones b) a g) subsiguientes:
- b)
- sustitución de Leu^{10} por -NH-CH[CH(CH_{3})CH_{2}CH_{3})-C(O)-(Ile^{10}),
- c)
- sustitución de Gly^{9} por -N(CH_{3})-CH_{2}C(O)-(Sar^{9}),
- d)
- sustitución de Phe^{7} o Phe^{8} o tanto Phe^{7} como Phe^{8} por un residuo de las fórmulas
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- e)
- sustitución de Lys^{3} por un residuo de las fórmulas
- f)
- truncamiento de 1 a 5 aminoácidos de la secuencia Arg^{1}-Pro^{2}-Lys^{3}-Pro^{4}-Gln^{5}, o
- g)
- sustitución de 1 a 5 aminoácidos de la secuencia Arg^{1}-Pro^{2}-Lys^{3}-Pro^{4}-Gln^{5} por -N(CH_{3})-CH_{2}-C(O)-(Sar),
y en el que los conjugados están
marcados con un radionucleido seleccionado del grupo que consiste en
Actinio-225, Bismuto-212,
Bismuto-213, Plomo-203,
Cobre-64, Cobre-67,
Galio-66, Galio-67,
Galio-68, Lutecio-177,
Indio-111, Indio-113,
Itrio-86 e Itrio-90,
Disprosio-162, Disprosio-165,
Disprosio-167, Holmio-166,
Praseodimio-142, Praseodimio-143,
Prometio-149, y Terbio-149; lo que
incluye las realizaciones preferidas como se mencionó
anteriormente.
La invención incluye las sales y los complejos
farmacéuticamente aceptables de los conjugados marcados con
radionucleidos de fórmula I, y de los conjugados sin marcar de
fórmula I. Las sales se pueden formar a partir de ácidos orgánicos
o inorgánicos. Los ejemplos de ácidos inorgánicos adecuados son
ácido clorhídrico, ácido fluorhídrico, ácido bromhídrico, ácido
yodhídrico, ácido sulfúrico y ácido bórico. Los ejemplos de ácidos
orgánicos adecuados son ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido
fórmico, ácido oxálico, ácido malónico, ácido succínico, ácido
tartárico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido metanosulfónico,
ácido trifluorometanosulfónico, ácido benzoico, ácido glicólico,
ácido láctico, ácido cítrico y ácido mandélico. Las sales se pueden
formar a partir de bases orgánicas o inorgánicas, tales como
hidróxidos de metales alcalinos, e hidróxidos de amoníaco,
hidroxietilamina, hidrazina, metilamina, etilamina, trimetilamina,
trietilamina, etilendiamina, hidroxietilamina, morfolina,
piperazina y guanidina.
Los conjugados marcados con radionucleidos se
pueden usar en formulaciones farmacéuticas en forma de polvos
(partículas micronizadas), gránulos, suspensiones o soluciones, o se
pueden combinar junto con otros ingredientes farmacéuticamente
aceptables mediante la mezcla de los componentes y opcionalmente la
división fina de los mismos, y después mediante el relleno de
cápsulas, compuestas por ejemplo de gelatina dura o blanda, la
preparación de parches transdérmicos, la compresión en comprimidos,
píldoras o trociscos, o la suspensión o la disolución de los mismos
en vehículos para soluciones, suspensiones, elixires y jarabes. Se
pueden aplicar revestimientos tras la compresión para formar
píldoras.
Los ingredientes farmacéuticamente aceptables se
conocen bien para los diversos tipos de formulaciones, y pueden
ser, por ejemplo, aglutinantes tales como polímeros naturales o
sintéticos, disolventes, excipientes, lubricantes, tensoactivos,
agentes edulcorantes y aromatizantes, materiales de revestimiento,
conservantes, colorantes, espesantes, adyuvantes, agentes
antimicrobianos, estabilizantes, osmorreguladores, y otros vehículos
para los diversos tipos de formulaciones.
Los conjugados de la sustancia P marcados con
radionucleidos de fórmula I para la selección como objetivo y el
tratamiento de tumores cerebrales se pueden administrar mediante
todas las vías conocidas, y se pueden seleccionar del grupo que
consiste en la vía intravenosa, la vía intraarterial, la vía
intracutánea, la vía subcutánea, la vía oral, la vía bucal, la vía
intramuscular, la vía anal, la vía transdérmica, la vía
intradérmica, la vía intratecal y similares.
En una realización preferida, el vehículo
farmacéutico es un líquido y la composición farmacéutica está en
forma de una suspensión, emulsión y preferiblemente una
solución.
Los ejemplos de vehículos líquidos son el agua,
los alcoholes tales como etanol, glicerol, propilenglicol,
polietilenglicoles líquidos, triacetina y aceites, que se pueden
usar solos o en combinación de al menos dos componentes.
La cantidad de conjugado marcado con
radionucleido en la formulación depende sustancialmente del tipo de
formulación y de las dosis deseadas durante los periodos de tiempo
de administración. La cantidad puede ser del 0,01 al 40 por ciento
en peso, preferiblemente del 0,1 al 25 por ciento en peso, y más
preferiblemente del 0,5 al 15 por ciento en peso, respecto de la
composición farmacéutica.
Las composiciones farmacéuticas líquidas, que
son soluciones o suspensiones estériles, se pueden usar para
inyecciones intramusculares, intratecales, intratraqueales,
epidurales, intraperitoneales y subcutáneas. Las soluciones
estériles se pueden administrar también de forma intravenosa. Los
conjugados se pueden preparar en forma de una composición sólida
estéril que se puede disolver o suspender (difundir) en el momento
de la administración mediante el uso de agua estéril, solución
salina, u otro medio inyectable estéril apropiado.
Se prefiere particularmente la inyección local
de los vectores peptídicos difundibles a usar según la invención
para la aplicación locorregional. El compuesto radiofarmacéutico se
inyecta en un catéter ventricular implantado de forma
estereotáctica o en una cápsula a partir de la cual un catéter
conduce al centro del tumor o a la cavidad de resección (también
denominado dispositivo Port-a-Cath).
Se pueden usar para este fin varias cápsulas y catéteres
diferentes, disponibles comercialmente.
En las masas tumorales principales sin resecar,
la punta del catéter tiene que centrarse en la parte media putativa
del tumor, lo cual se puede conseguir normalmente mediante el uso de
un sistema de planificación estereotáctico tridimensional. Es
importante esperar al menos un día, preferiblemente varios días,
entre la inserción del catéter y la primera aplicación para
controlar el problema del flujo de retorno a lo largo del exterior
del catéter fuera del sitio seleccionado como objetivo, hacia el
espacio subaracnoideo, subdural, epidural o subcutáneo. Este
fenómeno se puede reducir adicionalmente disminuyendo la presión
intracraneal elevada mediante el uso de osmodiuréticos y
dexametasona a dosis elevadas antes de la aplicación del compuesto
radiofarmacéutico. En los casos sólidos sin resecar, se usa una
técnica de infusión lenta aprovechando el uso de una bomba de
infusión que permite la infusión continua de un volumen de
5-10 ml a lo largo de un período de tiempo de
1-2 horas. Esta técnica es distinta de la denominada
"administración mejorada por convección" de macromoléculas en
el parénquima cerebral, que usa velocidades de infusión aún menores
para permitir cierta penetración de las moléculas grandes que no
difunden debido a su tamaño. Los conjugados usados según la
invención son fármacos virtualmente pequeños (1-2
kDaltons), y exhiben propiedades sumamente difusivas. Se ha
observado repetidamente la difusión a través de grandes áreas de un
tumor, incluso a través del cuerpo calloso hacia el otro
hemisferio, dentro de los 30 minutos después de una inyección rápida
de 2-3 ml del compuesto radiofarmacéutico usado
según la invención.
Los conjugados de la sustancia P marcados con
radionucleidos de fórmula I se pueden usar solos o en combinación
con otras sustancias farmacéuticamente activas. En el caso de las
combinaciones con otros compuestos farmacéuticamente activos, se
prepara una combinación fija de dos o más componentes (p. ej.,
equipo de componentes) como ya conoce una persona experta en la
técnica, y dichos conjugados y cualquier otro compuesto activo se
administran a un intervalo que permite un efecto común, adicional o
preferiblemente sinérgico para los tumores cerebrales y/o su
tratamiento, p. ej. para la selección como objetivo y el tratamiento
de gliomas.
En cualquier régimen de tratamiento, las
composiciones farmacéuticas de los conjugados de la sustancia P
marcados con radionucleidos de fórmula I se pueden administrar a un
paciente por separado o en una mezcla que contiene dos o más
toxinas dirigidas al objetivo, otros agentes terapéuticos o
composiciones, lo que incluye, por ejemplo, agentes
inmunosupresores, agentes inductores de tolerancia, potenciadores y
agentes para mitigar los efectos secundarios. Los agentes para
mitigar los efectos secundarios particularmente preferidos son
aquellos útiles para reducir las reacciones alérgicas de un
hospedador. Los agentes inmunosupresores preferidos incluyen
prednisona, DECADRON (Merck, Sharp and Dohme, West Point, Pa.),
ciclofosfamida, ciclosporina, 6-mercaptopurina,
metotrexato, azatioprina y gammaglobulina, o su combinación. Los
potenciadores preferidos incluyen monensina, cloruro amónico,
perhexilina, verapamilo, amantadina y cloroquina. Todos estos
agentes se administran en intervalos de dosis eficaces aceptados
generalmente.
Los expertos en la técnica pueden determinar las
dosis óptimas a administrar, y variarán con el objetivo y el
compuesto particular que se use, la concentración de la preparación,
el modo de administración y el avance del estado de la enfermedad.
Los factores adicionales que dependen del sujeto a tratar, que
incluyen la edad del sujeto, el peso, el sexo, la dieta y el
momento de la administración, darán como resultado la necesidad de
ajustar las dosis para este propósito específico. La administración
de los conjugados y opcionalmente de agentes farmacéuticos
adicionales se puede llevar a cabo de manera continua o
intermitente.
En el tratamiento, el nivel de dosis apropiado
será en general de 0,001 a 50 mg/kg de peso corporal del paciente
por día, que se puede administrar en dosis únicas o múltiples.
Preferiblemente, el nivel de dosis será de 0,005 a 25 mg/kg por
día, más preferiblemente 0,01 a 10 mg/kg por día, e incluso más
preferiblemente de 0,05 a 1 mg/kg por día.
Los conjugados de la sustancia P de fórmula I y
los conjugados de la sustancia P marcados con radionucleidos de
fórmula I se preparan de una manera conocida llevando a cabo una
síntesis en fase sólida estándar (SPPS) de forma habitual con
protección de las cadenas laterales, que es la versión de la
síntesis preferida normalmente.
Se puede llevar a cabo la síntesis peptídica en
fase sólida (SPPS) en un sintetizador de péptidos modelo 431 A o
432 A de Applied Biosystems mediante el uso, por ejemplo, de la
estrategia Fmoc (9-fluorenometoxicarbonilo). Los
principios y métodos generales llevados a cabo se conocen bien en la
técnica. Para una descripción más precisa se hace referencia a
"Fluorenemethoxycarbonyl-polyamide solid phase
synthesis: General Synthesis and Development", capítulo 3 en
"Solid peptide Synthesis: A practical approach", de E. Atherton
y R.C. Sheppard, Information Press Ltd. Oxford, R.U., (1989).
Los undecapéptidos obtenidos (sustancia P o
análogos) se acoplan, por ejemplo, a los proqueladores
DOTAGA(^{t}Bu)_{4},
DOTASA(^{t}Bu)_{4} o
DOTA(^{t}Bu)_{3}. Tras la escisión de la resina y
la desprotección opcional, los productos se pueden purificar
mediante HPLC preparativa hasta una pureza mayor del 99,5%.
Los conjugados de la sustancia P de fórmula I
obtenidos se pueden marcar con los radionucleidos de maneras
conocidas, opcionalmente con o tras la desprotección para formar los
grupos de ácido carboxílico unidos al residuo tetraazacíclico. El
marcaje se puede llevar a cabo en solución acuosa al poner en
contacto el conjugado desprotegido con sales de los radionucleidos
de ácidos orgánicos o inorgánicos, tales como halogenuros (cloruros,
bromuros, yoduros), sulfatos, nitratos, sulfonatos tales como
sulfonato de fenilo o toluilo, formiatos, acetatos, benzoatos u
oxalatos.
La invención se ilustra adicionalmente en los
siguientes ejemplos, en los que se describe con más detalle la
síntesis y la aplicación de los conjugados de la sustancia P de
fórmula I y de los conjugados de la sustancia P marcados con
radionucleidos de fórmula I.
A) Preparación de conjugados de
la sustancia P y conjugados de análogos de la sustancia P (No
obstante, los conjugados de la sustancia P que no se ajustan a la
fórmula general (I) no forman parte de la
invención)
Como ya se mencionó anteriormente, los péptidos
se sintetizan en fase sólida mediante el uso de la estrategia fmoc
(fmoc = 9-Fluorenilmetoxicarbonilo). Para conseguir
amidas N-terminales, se usa la resina Rink
Amide-MBHA. La síntesis se lleva a cabo en un
sintetizador de péptidos semiautomático de RINK Engineering,
Bubendorf, Suiza. Este sintetizador está equipado con uno o hasta
10 recipientes de reacción. Los aminoácidos se adquieren de
Novabiochem AG, Läufelfingen, Suiza. Todos los demás reactivos se
adquieren de Fluka Chemie GmbH, Buchs, Suiza.
En general, se proporciona al reactor 1
equivalente de la resina Rink Amide-MBHA con una
carga teórica de 0,7 mmoles/g de resina. Se añade dimetilformamida
(DMF) al reactor y se agita durante 15 minutos para permitir el
hinchamiento de la resina. Después de eliminar el disolvente, se
añade de nuevo una porción de DMF durante 2 minutos. Se añade una
disolución de un 20% de piperidina en DMF a la resina
pre-hinchada en 5 minutos para eliminar la
protección fmoc de la resina. Esta etapa se repite una vez en 5
minutos y después otra vez, pero en 12 minutos. Después de este
procedimiento, la fase sólida se lava dos veces durante 0,5 minutos
con DMF y de nuevo una vez durante 1 min con DMF. Las disoluciones
de piperidina y las disoluciones de DMF de los últimos tres lavados
se recogen y se completan con etanol (EtOH) hasta 500 ml. De esta
disolución se toma una alícuota para determinar
espectrofotométricamente la cantidad de grupos protectores fmoc
eliminados. Por lo tanto, se determina la absorción de la
disolución a 300 nm y se calcula la cantidad original de fmoc.
Antes de acoplar el derivado
fmoc-aminoácido a la fase sólida, la resina se lavan
dos veces durante 2 minutos con
N-metil-pirrolidinona (NMP).
Mientras tanto, se disuelven en NMP 3 equivalentes del derivado de
aminoácido protegido con fmoc junto con 3,3 equivalentes de
1-hidroxibenzotriazol y 3,3 equivalentes de
N,N'-diisopropilcarbodiimida, y se incuban durante
45 minutos. Después, esta disolución de acoplamiento se añade a la
fase sólida y se ajusta el pH hasta un valor de 7-8
mediante la adición de alrededor de 5 equivalentes de
N,N-diisopropiletilamina (DIPEA). La reacción se
incuba durante 90 minutos con agitación suave. Después de eliminar
la disolución de reacción, la fase sólida se lava dos veces con DMF
durante 1 minuto. La reacción se controla llevando a cabo un
análisis de Kaiser: Alrededor de 10 esferas de la fase sólida se
lavan 5 veces con etanol. Se mezclan 20 g de fenol en 10 ml de
etanol con 1 ml de una disolución de 1 ml de KCN 0,01 M en 49 ml de
piridina. Se añaden 50 \mul de esta mezcla a las esferas, seguido
de 10 \mul de una disolución de 500 g de ninhidrina en 10 ml de
etanol. Las esferas se calientan durante 10 minutos a 95ºC. Las
esferas azules indican la existencia de funciones amino libres.
Tras la unión del primer aminoácido, los
siguientes fmoc-aminoácidos se acoplan de una manera
similar, pero con un programa de tiempos ligeramente diferente. El
sintetizador se programa por tanto como se describe en la siguiente
tabla:
Todos los aminoácidos se usan en forma de
derivados protegidos con fmoc en posición
N-terminal. La lisina se usa con el grupo protector
tert-butoxicarbonilo (Boc) en la función amino de la
cadena lateral. La arginina se usa con protección mediante
2,2,4,6,7-pentametildihidro-benzofuran-5-sulfonilo
(Pbf) de la cadena lateral. Si la síntesis peptídica se lleva a
cabo en un único reactor, el análisis de Kaiser se realiza después
de acoplar cada aminoácido. Si el análisis de Kaiser indica que
existen funciones amino libres, se repite el acoplamiento del
aminoácido.
Después de la construcción de la secuencia
completa del péptido deseado, la fase sólida se lava 5 veces con
isopropanol, seguido de 5 lavados con éter dietílico, cada uno
durante 1 minuto. Durante 5 min, se seca la fase sólida con una
corriente de aire constante.
El proquelador
DOTAGA(^{t}Bu)_{4} se sintetiza como se describe
en el documento WO 02/24235 (H.R. Mäcke et al.).
DOTA(^{t}Bu)_{3} se adquiere de Macrocyclics Inc.,
Dallas, EE.UU. Antes de acoplar el proquelador, se elimina la
protección fmoc aminoterminal de los péptidos unidos a la resina.
Por lo tanto, ésta se hincha durante 15 minutos en DMF, se lava de
nuevo durante 2 minutos con DMF y se trata después dos veces con una
disolución del 20% de piperidina en DMF durante 5 minutos. Después,
la fase sólida se trata otros 12 minutos con esta disolución y se
lava dos veces durante 0,5 minutos con DMF y durante otro minuto de
nuevo con DMF. La disolución procedente de los tratamientos con
piperidina y los siguientes lavados con DMF se recogen para
determinar el contenido de grupos fmoc escindidos. Se disuelven en
DMF 2 equivalentes de Proquelador y 1,2 equivalentes de
hexafluorofosfato de
O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N'N'-tetrametiluronio
(HATU), y se incuba durante 45 minutos. Tras esto, se añaden 2
equivalentes de DIPEA a la disolución. Esta disolución de reacción
se añade después a la fase sólida, y después de 2 minutos se
controla el pH de la reacción y, si es necesario, se ajusta a un
valor entre 7 y 8 añadiendo algo más de DIPEA. La mezcla de reacción
se agita durante la noche. Tras eliminar la disolución, la fase
sólida se lava dos veces con DMF durante 2 minutos, 5 veces con
isopropanol y 5 veces con éter dietílico durante 1 minuto. Después
se seca con una corriente de aire durante 10 minutos.
La fase sólida se transfiere a una jeringa
equipada con una frita. Se añade una disolución de un 91% de ácido
trifluoroacético (TFA), un 5% de tioanisol, un 3% de agua y un 1% de
triisopropilsilano, y la jeringa se agita durante 1 h. La
disolución se vierte después en un tubo de polipropileno. A esta
disolución se le añade una mezcla de un 50% de éter diisopropílico
y un 50% de éter de petróleo. Durante 30 min el tubo se enfría a -20
ºC. La precipitación se recoge mediante centrifugación del tubo a
1006 g durante 5 minutos y se decanta el disolvente. Mientras
tanto, la fase sólida de la jeringa se trata de nuevo con la
disolución de desprotección anterior durante 2 h. La disolución de
desprotección se añade a la precipitación ya conseguida y el sólido
se diluye con ésta. Después de otras 3 h de desprotección, el
producto bruto se precipita de nuevo, se enfría, se centrifuga y se
separa del disolvente mediante decantación. El producto bruto se
mantiene después en vacío (<100 mbares) durante la noche para
eliminar los disolventes restantes. El producto bruto se disuelve en
una mezcla de acetonitrilo : agua = 1 : 1 y se purifica mediante
HPLC preparativa en una columna VP Nucleosil
100-5C18 de Macherey-Nagel de 21x250
mm. El gradiente de eluyentes llevado a cabo es el siguiente: A =
acetonitrilo, B = 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA) en agua;
caudal = 15 ml/min; 0 min, 15% de A; 25 min, 50% de A; 26 min, 100%
de A; 28 min, 100% de A; 30 min, 15% de A. El pico principal se
recoge y se evapora hasta sequedad. Se analiza mediante HPLC
analítica y espectroscopía de masas
(MALDI-TOF-MS). Se usa una columna
CC250/4 Nucleosil 120-3C18 de
Macherey-Nagel para la separación analítica mediante
el uso del siguiente gradiente de eluyentes: A = acetonitrilo, B =
0,1% de TFA en agua; caudal = 0,75 ml/min; 0 min, 90% de A; 20 min,
40% de A; 23 min, 0% de A; 24 min, 0% de A; 27 min, 90% de A.
Se preparan los siguientes conjugados:
DOTAGA significa un residuo
y
DOTA significa un residuo
Ejemplo
A1
DOTAGA-Arg^{1}-Pro^{2}-Lys^{3}-Pro^{4}-Gln^{5}-Gln^{9}-Phe^{7}-Phe^{8}-Gly^{9}-Leu^{10}-Met^{11}-NH_{2}
DOTAGA-Sustancia P:
C_{82}H_{128}N_{22}O_{22}S, calculado (m/z): 1806,1, hallado
1807,2; R_{f}: 29,8.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
A2
DOTA-Arg^{1}-Pro^{2}-Lys^{3}-Pro^{4}-Gln^{5}-Gln^{6}-Phe^{7}-Phe^{8}-Gly^{9}-Leu^{10}-Met(O_{2})^{11}-NH_{2}
DOTA-[Met(O_{2})^{11}]-Sustancia
P: C_{79}H_{126}N_{22}O_{22}S, calculado (m/z): 1766,9,
hallado 1766,2; R_{f}: 26,0.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
A3
DOTA-Arg^{1}-Pro^{2}-Lys^{3}-Pro^{4}-Gln^{5}-Gln^{6}-Phe^{7}-Phe^{8}-Sar^{9}-Leu^{10}-Met^{11}-NH_{2}
DOTA-[Sar^{9}]-Sustancia P:
C_{80}H_{128}N_{22}O_{22}S, calculado (m/z): 1748,9, hallado
1748,5; R_{f}: 28,03.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
A4
DOTA-Arg^{1}-Pro^{2}-Lys^{3}-Pro^{4}-Gln^{5}-Gln^{6}-Phe^{7}-Thi^{8}-Gly^{9}-Leu^{10}-Met^{11}-NH_{2}
DOTA-[Thi^{8}]-Sustancia P:
C_{77}H_{124}N_{22}O_{20}S_{2}, calculado (m/z): 1740,9,
hallado 1740,7; Rf: 27,87.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
A5
DOTA-Arg^{1}-Pro^{2}-Lys^{3}-Pro^{4}-Gln^{5}-Gln^{6}-Thi^{7}-Phe^{8}-Gly^{9}-Leu^{10}-Met^{11}-NH_{2}
DOTA-[Thi^{8}]-Sustancia P:
C_{77}H_{124}N_{22}O_{20}S_{2}, calculado (m/z): 1740,9,
hallado 1740,6; R_{f}: 27,66.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
A6
DOTA-Arg^{1}-Pro^{2}-Lys^{3}-Pro^{4}-Gln^{5}-Gln^{6}-Phe^{7}-Phe^{8}-Sar^{9}-Leu^{10}-Met(O_{2})^{11}-NH_{2}
DOTA-[Sar^{9},
Met(O_{2})^{11}]-Sustancia P:
C_{80}H_{128}N_{22}O_{22}S, calculado (m/z): 1780,9,
hallado 1780,1; R_{f}: 25,34.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
A7
DOTA-Arg^{1}-Pro^{2}-Lys^{3}-Pro^{4}-Gln^{5}-Gln^{6}-Phe^{7}-Thi^{8}-Gly^{9}-Leu^{10}-Met(O_{2})^{11}-NH_{2}
DOTA-[Thi^{8},
Met(O_{2})^{11}]-Sustancia P:
C_{77}H_{124}N_{22}O_{22}S_{2}, calculado (m/z): 1772,9,
hallado 1772,7; R_{f}: 25,34.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
A8
DOTA-Arg^{1}-Pro^{2}-Lys^{3}-Pro^{4}-Gln^{5}-Gln^{6}-Phe^{7}-Thi^{8}-Sar^{9}-Leu^{10}-Met^{11}-NH_{2}
DOTA-[Thi^{8},
Sar^{9}]-Sustancia P:
C_{78}H_{126}N_{22}O_{20}S_{2}, calculado (m/z): 1754,9,
hallado 1754,9; R_{f}: 26,70.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
A9
DOTA-Arg^{1}-Pro^{2}-Lys^{3}-Pro^{4}-Gln^{5}-Gln^{6}-Thi^{7}-Thi^{8}-Gly^{9}-Leu^{10}-Met^{11}-NH_{2}
DOTA-[Thi^{7},
Thi^{8}]-Sustancia P:
C_{75}H_{122}N_{22}O_{20}S_{3}, calculado (m/z): 1746,8,
hallado 1746,4; R_{f}: 27,29.
\newpage
Para
^{90}Y-/^{111}In-DOTAGA-Sustancia
P: A una alícuota estéril de 30 \mug del conjugado
quelador-péptido en agua se le añade una disolución
acuosa de ^{90}YCI_{3} de 330 mCi o una disolución acuosa de
^{111}InCl_{3} de 0,5 mCi y se completa hasta 500 \mul con
tampón estéril de NaOAc 0,4 M (pH 5). Esta disolución se calienta
durante 30 minutos a 95ºC y se enfría a temperatura ambiente durante
15 minutos. La disolución se diluye hasta 1 ml con solución
fisiológica de NaCI. Una muestra de ella se controla mediante
radio-HPLC para determinar el contenido de
radionucleido sin unir. Mediante el uso de
^{90}Y-DOTAGA-Sustancia P, se
descubrió que se forma una cantidad menor del producto de oxidación
^{90}Y-DOTAGA-[Met(O)^{11}]-Sustancia
P. Se lleva a cabo una HPLC analítica como se describió en
el
ejemplo A(c).
ejemplo A(c).
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparan los siguientes conjugados marcados
con radionucleidos:
Ejemplo
B1:
^{111}In-DOTAGA-Arg^{1}-Pro^{2}-Lys^{3}-Pro^{4}-Gln^{5}-Gln^{6}-Phe^{7}-Phe^{8}-Gly^{9}-Leu^{10}-Met^{11}-NH_{2}
^{111}In-DOTAGA-Sustancia
P: C_{82}H_{125}InN_{22}O_{22}S, calculado (m/z): 1916,81,
hallado: 1917,6 (M+H)^{+}, R_{f}: 29,80.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
B2
^{90}Y-DOTAGA-Arg^{1}-Pro^{2}-Lys^{3}-Pro^{4}-Gln^{5}-Gln^{6}-Phe^{7}-Phe^{8}-Gly^{9}-Leu^{10}-Met^{11}-NH_{2}
^{90}Y-DOTAGA-Sustancia
P
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
B3
^{111}In-DOTA-Arg^{1}-Pro^{2}-Lys^{3}-Pro^{4}-Gln^{5}-Gln^{6}-Phe^{7}-Phe^{8}-Gly^{9}-Leu^{10}-Met(O_{2})^{11}-NH_{2}
^{111}In-DOTA-[Met(O_{2})^{11}]-Sustancia
P
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
B4
^{111}In-DOTA-Arg^{1}-Pro^{2}-Lys^{3}-Pro^{4}-Gln^{5}-Gln^{6}-Phe^{7}-Phe^{8}-Sar^{9}-Leu^{10}-Met^{11}-NH_{2}
^{111}In-DOTA-[Sar^{9}]-Sustancia
P
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
B5
^{111}In-DOTA-Arg^{1}-Pro^{2}-Lys^{3}-Pro^{4}-Gln^{5}-Gln^{6}-Phe^{7}-Thi^{8}-Gly^{9}-Leu^{10}-Met^{11}-NH_{2}
^{111}In-DOTA-[Thi^{8}]-Sustancia
P
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
B6
^{111}In-DOTA-Arg^{1}-Pro^{2}-Lys^{3}-Pro^{4}-Gln^{5}-Gln^{6}-Thi^{7}-Phe^{8}-Gly^{9}-Leu^{10}-Met^{11}-NH_{2}
^{111}In-DOTA-[Thi^{8}]-Sustancia
P
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
B7
^{111}In-DOTA-Arg^{1}-Pro^{2}-Lys^{3}-Pro^{4}-Gln^{5}-Gln^{6}-Phe^{7}-Phe^{8}-Sar^{9}-Leu^{10}-Met(O_{2})^{11}-NH_{2}
^{111}In-DOTA-[Sar^{9},
Met(O_{2})^{11}]-Sustancia P
\newpage
Ejemplo
B8
^{111}In-DOTA-Arg^{1}-Pro^{2}-Lys^{3}-Pro^{4}-Gln^{5}-Gln^{6}-Phe^{7}-Thi^{8}-Gly^{9}-Leu^{10}-Met(O_{2})11-NH_{2}
^{111}In-DOTA-[Thi^{8},
Met(O_{2})^{11}]-Sustancia P
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
B9
^{111}In-DOTA-Arg^{1}-Pro^{2}-Lys^{3}-Pro^{4}-Gln^{5}-Gln^{6}-Phe^{7}-Thi^{8}-Sar^{9}-Leu^{10}-Met^{11}-NH_{2}
^{111}In-DOTA-[Thi^{8},
Sar^{9}]-Sustancia P
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
B10
^{111}In-DOTA-Arg^{1}-Pro^{2}-Lys^{3}-Pro^{4}-Gln^{5}-Gln^{6}-Thi^{7}-Thi^{8}-Gly^{9}-Leu^{10}-Met^{11}-NH_{2}
^{111}In-DOTA-[Thi^{7},
Thi^{8}]-Sustancia P
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
B11
El procedimiento general descrito en B) se
repite a 50ºC y se detecta la unión de ^{90}YCI_{3} después de
los tiempos de reacción definidos. A partir del resultado de la
siguiente tabla se puede observar que la reacción se puede
considerar completa después de alrededor de 15 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
C1
Los conjugados de la sustancia P y
radionucleidos y sus análogos que son
undeca-péptidos se preparan mediante la aplicación
de la síntesis en fase sólida estándar (SPPS) de forma habitual con
protección de las cadenas laterales, y el péptido obtenido se
acopla al proquelador DOTAGA(^{t}Bu)_{4}. Después
de la escisión y tras la desprotección,
DOTAGA-Sustancia P y los análogos se purifican
mediante HPLC preparativa hasta una pureza mayor del 95%. Los
conjugados de la sustancia P y de los análogos obtenidos se
esterilizan y posteriormente se marcan con una sal de radionucleido
como se mencionó anteriormente, p. ej. ^{111}InCl_{3} (18 MBq
por aplicación) para la formación de imágenes y ^{90}YCI_{3}
(37 MBq/\mug de DOTAGA-Sustancia P) mediante el
uso, por ejemplo, de tampón de acetato sódico 0,4 M ajustado a pH
5,0 que contiene ácido ascórbico (2 g/10 ml) y ácido
2,5-dihidroxi-benzoico (370 mg/19
ml).
El marcaje también se puede llevar a cabo con
^{213}Bi, un emisor \alpha muy prometedor disponible de un
generador de Ac-225/Bi-213. Los
rendimientos de marcaje están en el mismo intervalo para
Y-90 e In-111 (>95%), pero
Bi-213 tiene un periodo de semidesintegración corto
de solamente 47 min.
Durante el proceso de marcaje se identifica un
segundo pico en el cromatograma de HPLC que se identifica como
^{90}Y/^{111}In-DOTAGA-[Met(O)^{11}]-Sustancia
P, como producto de la radiolisis durante el proceso de marcaje.
Desafortunadamente, este derivado muestra una afinidad de unión
hacia los receptores NK1 inferior en un factor de 11 respecto de la
sustancia sin oxidar. Incluso mediante la adición al tampón de una
gran cantidad de un agente reductor, p. ej. ácido ascórbico, no se
puede inhibir completamente esta oxidación indeseada. Por otra
parte, el derivado sintetizado
^{90}Y/^{111}In-DOTAGA- o DOTA-[Sar^{9}
Met(O_{2})^{11}]-Sustancia P
muestra una afinidad muy superior a la de los derivados de sulfóxido
(menor de un factor de 2 más baja que la secuencia nativa). Así, se
subraya que se puede introducir Met(O_{2}) en la posición
11 de la secuencia peptídica sin una pérdida significativa de
afinidad, y elimina los problemas de oxidación que acaban
apareciendo.
Se llevan a cabo análisis de estabilidad
adicionales mediante experimentos in vitro con la incubación
de ^{90}Y-DOTAGA-Sustancia P en
diferentes aspirados de LCR (líquido cefalorraquídeo) de pacientes.
Se puede demostrar una diferencia significativa en la degradación
del radiopéptido que tiene correlación con la "calidad" de la
muestra de LCR. Si el aspirado es incoloro y de aspecto claro (no
contiene sangre), el conjugado marcado es estable durante varias
horas, mientras en aspirados con una contaminación de suero
sanguíneo visible, la sustancia se degrada completamente en 5
h.
Esta degradación enzimática tiene también un
gran impacto en los pacientes, como se observa en diferentes
muestras de orina de 0 a 24 h p.i., y de aspirados de LCR de 1
semana p.i. Todas las muestras exhiben los mismos dos metabolitos
radiactivos que en el experimento in vitro con muestras de
LCR contaminadas con suero. La cuantificación de la radiactividad
en la orina también indica una eliminación muy rápida del ^{90}Y
aplicado unido a metabolitos de DOTAGA-Sustancia
P.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
C2
Se disuelve
^{90}Y-DOTAGA-Sustancia P en agua
a pH 7 y se mezcla con un exceso de 10^{5} de ácido
dietilentriamino-pentaacético (DTPA). La cantidad
de radionucleido intacto se determina tras ciertos períodos de
tiempo. Los resultados, que indican una estabilidad elevada, se
proporcionan en la siguiente tabla.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
C3
Los compuestos marcados con ^{111}Y como se
menciona en la tabla se ponen en contacto con suero sanguíneo y se
determina la cantidad de partes intactas después de ciertos períodos
de tiempo. Los resultados, que indican la estabilidad superior del
conjugado de la sustancia P modificada, se proporcionan en la
siguiente tabla.
Ejemplo
C4
Se lleva a cabo una autorradiografía in
vitro con tejido tumoral que expresa receptores NK1. El
radioligando usado es
^{125}I-Bolton-Hunter-SP.
Los experimentos de desplazamiento se llevan a cabo en secciones
sucesivas con los diversos compuestos enumerados en la tabla,
administrados a concentraciones que oscilan de 0,1 nM a 1000 nM.
Los valores de CI_{50} se calculan a partir de 10 análogos de la
sustancia P distintos radiomarcados y se comparan con la SP
natural. Los resultados se proporcionan en la siguiente tabla.
Ejemplo
C5
Un estudio inmunohistoquímico de casos
representativos de gliomas primarios llevado a cabo demostró que la
distinción entre el tejido cerebral infiltrado por el tumor y el
cerebro normal es, en muchos casos, prácticamente imposible debido
a la expresión de fondo de receptores de somatostatina en el tejido
cerebral normal. A pesar de esta observación, las gammagrafías de
In-111 DOTATOC muestran el confinamiento del
radiofármaco inyectado en el compartimento tumoral tal como se
visualiza mediante MRI. Esto se podría explicar mejor por la
estructura caótica de la arquitectura del tejido extracelular
dentro del tumor y en el cerebro infiltrado en comparación con el
tejido cerebral sin infiltrar. Bakay ha demostrado en su publicación
(Brain 1970, 93, 693-698) que el espacio
extracelular puede constituir hasta el 20-40% de un
volumen dado de tejido tumoral cerebral, en comparación con el
cerebro normal, que contiene alrededor del 5% de espacio
extracelular. Físicamente, un tumor utiliza la energía disponible
para proliferar e infiltrarse, y no para maximizar el orden de la
arquitectura molecular como hace el tejido cerebral normal (ley de
la entropía). Se ha descrito la expresión uniforme y elevada de
receptores de neurocinina-1 en glioblastomas, pero
también en gliomas de grado bajo e intermedio. Por lo tanto, se ha
llevado a cabo un estudio autorradiográfico comparativo entre el
sistema de la somatostatina/DOTATOC y el sistema de la sustancia
P/NK-1 para definir los mejores compuestos de
selección de objetivo para la terapia locorregional en tumores
cerebrales. Con la única excepción de un ependimoma, la expresión de
receptores NK-1 es al menos equivalente o superior
en la mayoría de gliomas de grados II-IV. Los
resultados demuestran que el sistema de la sustancia
P/NK-1 puede sustituir al sistema de
somatostatina/DOTATOC fácilmente, al producir respuestas superiores
debido a una proporción claramente más favorable de señal del tumor
respecto de la señal de fondo del cerebro.
Ejemplo
C6
En el siguiente estudio piloto con sustancia P
se incluyen 4 casos de biopsia sola seguida de
^{90}Y-DOTAGA-Sustancia P
(tratamiento); todos los casos corresponden a tumores profundos o
localizados de manera elocuente, en los que la cirugía abierta no
se considera conveniente como primera opción de tratamiento, y 5
casos con resección total macroscópica abierta y braquiterapia
subsiguiente con conjugado de radionucleido. Como tercer grupo que
puede servir como control, se incluyeron 5 casos avanzados que se
habían tratado mediante los denominados regímenes estándar,
prácticamente sin opción terapéutica. Ya que este es un estudio
piloto no controlado, tuvo que depender de los resultados del único
gran ensayo aleatorizado de gliomas llevado a cabo y publicado hace
más de 20 años (Walker et al., 1980, N Engl J Med). En casos
de biopsia sola, la supervivencia media es de alrededor de 9
semanas sin tratamiento adicional. En los 4 casos de este estudio
piloto, todos los pacientes sobrevivieron al menos 2 meses y hasta
9 meses, y un caso especial incluso mostró una respuesta parcial
notable. En los 5 casos resecados seguido por la braquiterapia
interna con conjugado de radionucleido, la supervivencia total
pareció ser más larga de lo esperado, que está en el intervalo entre
14 y 26 meses. Según el único gran ensayo aleatorizado de los años
70, que sirve como control histórico, la resección sola habría
llevado a una supervivencia esperada de alrededor de 4 meses, y la
resección más una radioterapia externa habría llevado a una
supervivencia de alrededor de 9,5 meses. De forma bastante notable,
todas las cifras de supervivencia media están localizadas a la
derecha de estos valores esperados en el eje de tiempo, lo que se
puede considerar como una indicación sólida de que el conjugado
Y-90-DOTAGA-sustancia
P es ciertamente más eficaz que una solución de agua pura.
Esta interpretación de los datos está apoyada
adicionalmente por una respuesta parcial impresionante (caso W.M.),
que se obtiene en un glioblastoma talámico izquierdo no resecable
mediante el uso de monoterapia con
^{90}Y-DOTAGA-Sustancia P, y en el
que se observó una reducción del volumen de más del 80% del
glioblastoma. Una cuestión clave en la terapia local de gliomas es
si se puede llegar a alcanzar los nidos de células tumorales
infiltradas o la lesión satélite. En un caso instructivo con
^{111}In-DOTAGA-Sustancia P, se
demuestra la difusibilidad en una lesión satélite distante 4 cm que
se hace visible tras la inyección intracavitaria en la cavidad de
resección. A pesar de haberse marcado bien, la lesión satélite no se
pudo controlar con Y-90-sustancia
P. Este caso demuestra que incluso si el objetivo se puede marcar,
hubiera sido mucho más probable que un radionucleido con un alcance
más reducido erradicase esta lesión. En contraste, los actuales
emisores \alpha (alcance de \mum) y los emisores \beta de
alcance reducido (p. ej., Lu-177,
1-2 mm) deberían demostrar que son superiores en el
tratamiento de grupos de células tumorales invasivas. El
Y-90 (alcance de 3-6 mm)
actualmente utilizado es más adecuado para lesiones voluminosas.
Claims (7)
1. Un conjugado de un análogo de la sustancia P
y una molécula queladora, en el que el conjugado de la sustancia P
tiene la abreviatura
Quelador-R-Arg^{1}-Pro^{2}-Lys^{3}-Pro^{4}-Gln^{5}-Gln^{6}-Phe^{7}-Phe^{8}-Gly^{9}-Leu^{10}-Met^{11}-NH_{2}
y comprende los compuestos de fórmula I
en la
que
R es -CH_{2}-C(O)-,
-C(CO_{2}H)CH_{2}CH_{2}-C(O)-
o -C(CO_{2}H)CH_{2}-C(O)-,
se modifica mediante la modificación a) subsiguiente en la
secuencia de aminoácidos de la sustancia P:
- a)
- sustitución de Met^{11} por -NH-CH(CH_{2}CH_{2}-SO_{2}-CH_{3})-C(O)-(Met(O_{2})^{11}), -NH-CH(CH_{2}CH_{2}-SO-CH_{3})-C(O)-(Met(O)^{11}), o -NH-CH[CH(CH_{2})CH_{2}CH_{3})-C(O)-(Ile^{11}), y opcionalmente al menos una de las modificaciones b) a g) subsiguientes:
- b)
- sustitución de Leu^{10} por -NH-CH[CH(CH_{2})CH_{2}CH_{3})-C(O)-(Ile^{10}),
- c)
- sustitución de Gly^{9} por -N(CH_{3})-CH_{2}-C(O)-(Sar^{9}),
- d)
- sustitución de Phe^{7} o Phe^{8} o tanto Phe^{7} como Phe^{8} por un residuo de las fórmulas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- e)
- sustitución de Lys^{3} por un residuo de las fórmulas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- f)
- truncamiento de 1 a 5 aminoácidos de la secuencia Arg^{1}-Pro^{2}-Lys^{3}-Pro^{4}-Gln^{6}, o
- g)
- sustitución de 1 a 5 aminoácidos de la secuencia Arg^{1}-Pro^{2}-Lys^{3}-Pro^{4}-Gln^{5} por -N(CH_{3})-CH_{2}-C(O)-(Sar),
y en el que los conjugados están
sin marcar o marcados con un radionucleido seleccionado del grupo
que consiste en Actinio-225,
Bismuto-212, Bismuto-213,
Plomo-203, Cobre-64,
Cobre-67, Galio-66,
Galio-67, Galio-68,
Lutecio-177, Indio-111,
Indio-113, Itrio-86 e
Itrio-90, Disprosio-162,
Disprosio-165, Disprosio-167,
Holmio-166, Praseodimio-142,
Praseodimio-143, Prometio-149 y
Terbio-149.
2. El conjugado de la reivindicación 1, en el
que en la secuencia de aminoácidos de la sustancia P, Met^{11} se
sustituye por
-NH-CH(CH_{2}CH_{2}-SO_{2}-CH_{3})-C(O)-(Met(O_{2})^{11}).
3. Una composición que comprende (a) al menos un
vehículo farmacéutico y (b) al menos uno de los conjugados marcados
según la reivindicación 1 ó 2.
4. El conjugado marcado de la reivindicación 1 ó
2 para el uso en la terapia médica.
5. El conjugado marcado de la reivindicación 1 ó
2 para seleccionar como objetivo o para tratar tumores cerebrales,
especialmente gliomas.
6. El conjugado marcado de la reivindicación 1 ó
2 para su aplicación locorregional mediante inyección en un catéter
ventricular implantado de forma estereotáctica o en una cápsula a
partir de la cual un catéter conduce al centro del tumor o a la
cavidad de resección de un hospedador.
7. El uso de un conjugado marcado según la
reivindicación 1 ó 2 para la fabricación de formulaciones
radiofarmacéuticas o radiodiagnósticas para seleccionar como
objetivo o tratar tumores cerebrales, especialmente gliomas.
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