ES2313725T3 - Nuevas moleculas de adn. - Google Patents
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- C07K14/35—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Mycobacteriaceae (F)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA NUEVAS MOLECULAS DE ACIDO NUCLEICO QUE CODIFICAN SUBUNIDADES SIGMA DE RNA POLIMERASA DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS. SE REFIERE TAMBIEN A POLIPEPTIDOS, DENOMINADOS COMO SIGA Y SIGB, CODIFICADOS POR DICHAS MOLECULAS DE ACIDO NUCLEICO, ASI COMO A VECTORES Y CELULAS HUESPED TRANSFORMADAS CON DICHAS MOLECULAS DE ACIDO NUCLEICO. LA INVENCION PROPORCIONA ADICIONALMENTE ENSAYOS DE ESCRUTINIO PARA COMPUESTOS QUE INHIBEN LA INTERACCION ENTRE UNA SUBUNIDAD SIGMA Y UNA POLIMERASA DE RNA NUCLEO.
Description
Nuevas moléculas de ADN.
La presente invención proporciona nuevas
moléculas de ácido nucleico que codifican subunidades sigma de ARN
polimerasa de Mycobacterium tuberculosis. También se refiere
a polipéptidos, denominados SigB, codificados por tales moléculas
de ácido nucleico, así como a vectores y células huésped
transformadas con dichas moléculas de ácido nucleico. La invención
además proporciona ensayos de rastreo para compuestos que inhiben la
interacción entre una subunidad sigma y un núcleo de la ARN
polimerasa.
La transcripción de genes a las correspondientes
moléculas de ARN es un complejo proceso que se cataliza por la ARN
polimerasa dependiente de ADN, y que implica a muchos factores
proteicos diferentes. En eubacterias, el núcleo de la ARN
polimerasa está compuesto de las subunidades \alpha, \beta y
\beta' en la relación 2:1:1. Para dirigir la ARN polimerasa a los
promotores de los genes específicos que se transcriben, las
bacterias producen muchas proteínas, conocidas como factores sigma
(\sigma), que interaccionan con la ARN polimerasa para formar una
holoenzima activa. Los complejos resultantes son capaces de
reconocer y unirse a las secuencias de nucleótidos seleccionadas en
los promotores.
Las medidas físicas han mostrado que la
subunidad sigma induce una transición conformacional en la unión al
núcleo de la ARN polimerasa. La unión de la subunidad sigma al
núcleo enzimático aumenta la constante de unión del núcleo
enzimático para el ADN en varios órdenes de magnitud (Chamberlin, M.
J. (1974) Ann. Rev. Biochem. 43, 721-).
La caracterización de las subunidades sigma,
identificadas y secuenciadas a partir de varios organismos, permite
que se las clasifique en dos amplias categorías; Grupo I y Grupo II.
La sigma del Grupo I también se ha denominado la clase
sigma^{70}, o el grupo sigma "de servicio". Las subunidades
sigma que pertenecen a este grupo reconocen a las secuencias del
promotor similares en la célula. Estas propiedades están reflejadas
en ciertas regiones de la proteínas que están altamente conservadas
entre especies.
Los factores sigma bacterianos no tienen ninguna
homología con los factores de transcripción eucariotas, y
consecuentemente son una diana potencial para los compuestos
antibacterianos. Las mutaciones en la subunidad sigma, que realizan
su asociación y que tienen la capacidad de conferir especificidad de
secuencia de ADN a la enzima, se sabe que son letales para la
célula.
Mycobacterium tuberculosis es un
principal patógeno pulmonar que se caracteriza por su lentísima
velocidad de crecimiento. Como patógeno gana acceso a macrófagos
alveolares donde se multiplica dentro del fagosoma, rompiendo
finalmente las células y siendo diseminado a través del flujo
sanguíneo, no sólo a otras áreas del pulmón, sino que también a los
tejidos extrapulmonares. Así el patógeno se multiplica en al menos
dos ambientes totalmente diferentes, lo que implicaría la
utilización de diferentes nutrientes y una variedad de posibles
factores del huésped; una infección con éxito implicaría por lo
tanto la expresión coordinada de nuevos grupo de genes. Esta
regulación imitaría diferentes estados fisiológicos, como se ha
ilustrado de modo ejemplar en Bacillus, en el que la
expresión de los genes específicos para los diferentes estados se
transcribe mediante las ARN polimerasas que se asocian con los
diferentes factores sigma. Esto proporciona la posibilidad de
actuar no solo sobre el sigma de servicio de M. tuberculosis,
sino que también sobre subunidades sigma específicas para los
diferentes estados de infección y diseminación.
El documento WO-95/17511
describe polipéptidos sigma A y ácidos nucleicos de M.
tuberculosis
Fig. 1: Mapa del plásmido pARC 8175
Fig. 2: Mapa del plásmido pARC 8176.
Ya que la asociación a una específica subunidad
sigma es esencial para la especificidad de la ARN polimerasa, este
proceso de asociación es un objeto adecuado para el diseño de
fármacos. Para identificar los compuestos capaces de inhibir dicho
proceso de asociación, es deseable la identificación de estructuras
primarias de subunidades sigma.
Por eso, el propósito de la invención es
proporcionar información sobre las secuencias y la estructura de
las subunidades sigma, cuya información permitirá el rastreo, la
identificación y el diseño de compuestos que compiten con la
subunidad sigma por su unión al núcleo de la ARN polimerasa, cuyos
compuestos pueden ser desarrollados como agentes terapéuticos
eficaces.
En toda esta descripción y, en particular, en
los siguientes ejemplos, las expresiones "protocolos estándar"
y "procedimientos estándar", cuando se usan en el contexto de
técnicas de clonación molecular, se entienden como los protocolos y
procedimientos encontrados en un manual de laboratorio corriente tal
como: Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. (1989)
"Molecular Cloning: A laboratory manual", 2ª Ed., Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
Los inventores proporcionan un polipéptido
aislado que es una subunidad sigma del Grupo I de ARN polimerasa de
Mycobacterium tuberculosis, o una forma modificada
funcionalmente equivalente de ésta.
Los polipéptidos que tienen secuencias de
aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 2 ó 4 del Listado de
Secuencia han sido obtenidos mediante técnicas de ADN recombinante y
se denominan de aquí en adelante en este documento polipéptidos
SigA y SigB. Sin embargo, se sobrentiende que los polipéptidos de
acuerdo con la invención no están limitados estrictamente a
polipéptidos con una secuencia de aminoácidos idéntica con SEQ ID
NO: 4 en el Listado de Secuencia. Más bien la invención abarca
adicionalmente formas modificadas de estos polipéptidos naturales
que llevan a cabo modificaciones como sustituciones, pequeñas
deleciones, inserciones o inversiones, cuyos polipéptidos no
obstante tienen sustancialmente las actividades biológicas de una
subunidad sigma de M. tuberculosis. Tales actividades
biológicas comprenden la capacidad de asociarse con el núcleo
enzimático y/o conferir la propiedad del reconocimiento de la
secuencia del promotor y la iniciación de la transcripción. Por lo
tanto en la invención se incluyen polipéptidos, cuya secuencia de
aminoácidos sea al menos un 90% homóloga, preferiblemente al menos
un 95% homóloga, con la secuencia de aminoácidos mostrada en
SEQ ID NO: 4 en el Listado de Secuencia.
En otro aspecto, la invención proporciona
moléculas de ácido nucleico aisladas y purificadas que tienen una
secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la
invención, por ejemplo el polipéptido SigB. En una forma preferida
de la invención, dichas moléculas de ácido nucleico son moléculas de
ADN que tienen una secuencia de nucleótidos idéntica a SEQ ID NO: 3
del Listado de Secuencia. Sin embargo, las moléculas de ácido
nucleico de acuerdo con la invención no deben limitarse
estrictamente a las moléculas de ADN con la secuencia mostrada en
SEQ ID NO: 3 Más bien la invención abarca a moléculas de ácido
nucleico que tienen modificaciones como sustituciones, pequeñas
deleciones, inserciones o inversiones, que no obstante codifican
proteínas que tienen sustancialmente la actividad bioquímica de los
polipéptidos de acuerdo con la invención. Por lo tanto en la
invención se incluyen moléculas de ADN, cuyas secuencias de
nucleótidos son al menos un 90% homóloga, preferiblemente al menos
un 95% homóloga, con la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID
NO: 3 en el Listado de Secuencia.
También se incluyen en la invención las
moléculas de ADN cuyas secuencias de nucleótidos son degeneradas,
debido al código genético, respecto a las secuencias de nucleótidos
mostradas en SEQ ID NO:3. Un grupo secuencial de tres nucleótidos,
un "codon", codifica para un aminoácido. Ya que existen 64
posibles codones, pero solo hay 20 aminoácidos naturales, la mayor
parte de los aminoácidos se codifican para más de un codon. Esta
"degeneración" natural, o "redundancia", del código
genético es bien conocida en la técnica. Será así apreciado que la
secuencia de ADN mostrada en el Listado de Secuencia es sólo un
ejemplo dentro de un gran pero finito grupo de secuencias de ADN
que codificarán el polipéptido como se describe anteriormente.
Por consiguiente, se incluyen en la invención
moléculas de ácidos nucleicos aislados seleccionados de:
- (a)
- moléculas de ADN que comprenden una secuencia de nucleótidos como se muestra en SEQ ID NO: 3 que codifican una subunidad sigma del Grupo I de ARN polimerasa de Mycobacterium tuberculosis; y
- (b)
- moléculas de ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de ácidos nucleicos que es degenerada, como resultado del código genético, en una secuencia de nucleótidos como se define en (a) o (h) y que codifica para un polipéptido que es una subunidad sigma del Grupo I de Mycobacterium tuberculosis o una forma modificada funcionalmente equivalente de ésta.
La expresión "hibridar a una secuencia de
nucleótidos" debe entenderse como hibridar a una secuencia de
nucleótidos, o una parte específica de ésta, bajo condiciones de
hibridación astringentes que son conocidas para cualquier persona
experta en la técnica.
Las moléculas de ADN de la invención pueden
estar en la forma de un vector, por ejemplo un vector de expresión
replicable que lleva y es capaz de mediar la expresión de una
molécula de ADN de acuerdo con la invención. En el presente
contexto, el término "replicable" significa que el vector es
capaz de replicarse en un tipo dado de célula huésped en la que ha
sido introducido. Los ejemplos de vectores son virus tales como
bacteriófagos, cósmidos, plásmidos y otros vectores de
recombinación. Las moléculas de ácido nucleico se insertan en los
genomas del vector por métodos bien conocidos en la técnica. Los
vectores de acuerdo con la invención pueden incluir el vector del
plásmido pARC 8176 (NCIMB 40739) que contiene la secuencia de
codificación del gen sigB.
También se incluye en la invención una célula
huésped que alberga a un vector de acuerdo con la invención. Tal
célula huésped puede ser una célula procariota, una célula eucariota
unicelular o una célula derivada de un organismo multicelular. La
célula huésped puede así ser, por ejemplo, una célula bacteriana tal
como una célula E. coli; una célula de una levadura tal como
Saccharomyces cervisiae o Pichia
pastoris, o una célula de mamífero. Los métodos empleados para
realizar la introducción del vector en la célula huésped son
métodos estándar bien conocidos para cualquier persona familiarizada
con los métodos de ADN recombinante.
Un aspecto más de la invención es un
procedimiento para la producción de un polipéptido de la invención,
que comprende cultivar células huésped transformadas con un vector
de expresión de acuerdo con la invención bajo condiciones mediante
las cuales dicho polipéptido se produce, y recuperar a dicho
polipéptido.
El medio usado para cultivar las células puede
ser cualquier medio convencional adecuado para el fin. Un vector
adecuado puede ser cualquiera de los vectores descritos
anteriormente, y una célula huésped apropiada puede ser cualquier
de los tipos de células nombradas anteriormente. El método empleado
para construir el vector y realizar la introducción de éste en la
célula huésped puede ser cualquier método conocido para tales
propósitos dentro del campo del ADN recombinante. El
polipéptido recombinante expresado por las células puede ser
secretado, es decir exportado a través de la membrana celular,
dependiendo del tipo de célula y de la composición del vector.
Si se produce el polipéptido intracelularmente
por el huésped recombinante, es decir no se secreta por la célula,
puede recuperarse mediante procedimientos estándar que comprenden la
ruptura de la célula mediante medios mecánicos, por ejemplo,
sonicación u homogenización, o por medios enzimáticos o químicos
para una menor purificación.
Para que se secrete, la secuencia de ADN que
codifica el polipéptido debe estar precedida por una secuencia que
codifica un péptido señal, cuya presencia asegura la secreción del
polipéptido a partir de las células de modo que al menos una
proporción significativa del polipéptido expresado es secretado en
el medio de cultivo y recuperado.
Otro importante aspecto de la invención es un
método para analizar compuestos que tienen la capacidad de inhibir
la asociación de una subunidad sigma a una ADN polimerasa de
Mycobacterium tuberculosis, comprendiendo dicho método el
uso de un polipéptido SigB recombinante o una molécula de ácido
nucleico como se define más arriba. Tal método comprenderá
preferiblemente (i) poner en contacto un compuesto que se analiza
por dicha capacidad de inhibición con un polipéptido rSigB
como se describe anteriormente y un núcleo de la ARN polimerasa de
Mycobacterium tuberculosis; y (ii) detectar si dicho
polipéptido se asocia con dicho núcleo de la ARN polimerasa para
formar la holoenzima de ARN polimerasa. La expresión "núcleo de la
ARN polimerasa" se entiende como una ARN polimerasa que
comprende al menos las subunidades \alpha, \beta y \beta',
pero no la subunidad sigma. La expresión "holoenzima de ARN
polimerasa" se entiende como una ARN polimerasa que comprende al
menos las subunidades \alpha, \beta, \beta' y sigma. Si fuera
deseable, el polipéptido de la subunidad sigma puede marcarse, por
ejemplo con una molécula radioactiva adecuada, por ejemplo ^{35}S
o ^{125}I.
Los métodos adecuados para determinar si un
polipéptido sigma se ha asociado al núcleo de la ARN polimerasa se
describen en Lesley et al. (Biochemistry 28,
7728-7734, 1989). Tal método puede así estar basado
en la diferencia de tamaños entre el polipéptido sigma unido al
núcleo de la ARN polimerasa, versus los polipéptidos no
unidos. Esta diferencia de tamaños permite que las dos formas sean
separadas por cromatografía, por ejemplo, en una columna de
filtración de gel, tal como una columna por tamaños Protein Pak®
300SW de Waters. Las dos formas descargadas de la columna pueden
ser detectadas y cuantificadas por métodos conocidos, tal como el
recuento de centelleo o SDS-PAGE seguido por
inmunotransferencia.
De acuerdo con otro método también descrito por
Lesley et al. (supra), la holoenzima de ARN polimerasa
se detecta por inmunoprecipitación usando un anticuerpo que se une
a la holoenzima de ARN polimerasa. El núcleo de la ADN polimerasa
de un organismo tal como E. coli., M.
tuberculosis o M. smegmatis puede hacerse reaccionar con
un polipéptido SigA o SigB radiomarcado. La mezcla de reacción se
trata con una suspensión celular de Staphylococcus aureus
tratada con formalina, pretratada con un anticuerpo
anti-ARN polimerasa. La suspensión celular se lava
para eliminar las proteínas no unidas, se resuspende en tampón de
muestra de SDS-PAGE y se separa en
SDS-PAGE. Los polipéptidos SigB unidos se
monitorizan mediante autoradiografía seguido de recuento de
centelleo.
Otro método de evaluación para compuestos que
tienen la capacidad de inhibir la transcripción dependiente de la
subunidad sigma mediante una ARN polimerasa de Mycobacterium
tuberculosis puede comprender (i) poner en contacto un
compuesto que se analiza por dicha capacidad de inhibición con un
polipéptido de la invención, un núcleo de la ARN polimerasa de
Mycobacterium tuberculosis, y un ADN que tiene una secuencia
codificante operativamente unida a una secuencia de promotor capaz
de reconocer a dicho núcleo de la ARN polimerasa cuando se une a
dicho polipéptido, siendo llevado a cabo dicho poner en contacto en
condiciones adecuadas para la transcripción de dicha secuencia
codificante cuando la ARN polimerasa de Mycobacterium
tuberculosis se une a dicho promotor; y (ii) detectar la
formación de mARN correspondiente a dicha secuencia codificante.
Tal ensayo se basa en el hecho de que las
secuencias del promotor consenso de E. coli no son
transcribibles mediante el núcleo de la ARN polimerasa que carece
de la subunidad sigma. Sin embargo, la adición de una proteína
sigma^{70} permitirá que el complejo reconozca a los promotores
específicos e inicie la transcripción. El rastreo de compuestos que
tienen la capacidad de inhibir la transcripción dependiente de sigma
puede ser así realizado, usando el ADN que contenga un promotor
adecuado como una plantilla, monitorizando la formación de mARN de
longitud específica. La transcripción puede ser monitorizada
midiendo la incorporación de ^{3}H-UTP en
recuentos precipitables de TCA (Ashok Kumar et al. (1994)
J. Mol. Biol. 235, 405-413;
Kajitani, M. e Ishihama, A. (1983) Nucleic Acids Res.
11, 671-686 y 3873-3888) y
determinando la longitud del transcrito específico. Los compuestos
que se identifican mediante tal ensayo pueden inhibir la
transcripción mediante diversos mecanismos, tales como (a) la unión
a una proteína sigma y la prevención de su asociación con el núcleo
de la ARN polimerasa; (b) la unión al núcleo de la ARN polimerasa y
la inhibición estérica de la unión de una proteína sigma; o (c) la
inhibición de las etapas intermediad implicadas en la iniciación o
elongación durante la transcripción.
Un aspecto más de la invención es un método para
determinar la estructura proteica de una subunidad sigma de ARN
polimerasa de Mycobacterium tuberculosis, caracterizado
porque un polipéptido SigB se utiliza en cristalografía de rayos X.
El uso del polipéptido rSigB en la cristalización facilitará un
diseño racional, basado en cristalografía de rayos X, de compuestos
terapéuticos que inhiben la interacción de una proteína
sigma^{70} con el núcleo de la ARN polimerasa, inhibiendo
alternativamente la unión de una proteína sigma^{70}, en
asociación con un núcleo de la ARN polimerasa, al ARN durante el
transcurso de la transcripción del gen.
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes cebadores de la PCR fueron
designados, basado en las secuencias de aminoácidos conservadas de
sigma^{45} (un homólogo de sigma^{70}) de Bacillus
subtilis y sigma^{70} de E. coli (Gitt, M.A.
et al. (1985) J. Biol. Chem. 260,
7178-7185):
cebador directo (SEQ ID NO: 5):
cebador inverso (SEQ ID NO: 6):
Los nucleótidos alternativos indicados en
ciertas posiciones indican que los cebadores son cebadores
regenerados adecuados para la amplificación del gen no
identificado, analizados por dicha capacidad de inhibición con un
polipéptido de la invención, un núcleo de la ARN polimerasa de
Mycobacterium tuberculosis, y un ADN que tiene una secuencia
codificante operativamente unida a una secuencia del promotor capaz
del reconocimiento por dicho núcleo de la ARN polimerasa cuando se
une a dicho polipéptido, siendo llevado a cabo dicho poner en
contacto en condiciones adecuadas para la transcripción de dicha
secuencia codificante cuando la ARN polimerasa de Mycobacterium
tuberculosis se une a dicho promotor; y (ii) detectar la
formación de mARN correspondiente a dicha secuencia codificante.
Tal ensayo se basa en el hecho de que las
secuencias del promotor consenso de E. coli no son
transcribibles por el núcleo de la ARN polimerasa que carece de la
subunidad sigma. Sin embargo, la adición de una proteína
sigma^{70} permitirá que el complejo reconozca a los promotores
específicos e inicie la transcripción. El rastreo de compuestos que
tienen la capacidad de inhibir la transcripción dependiente de sigma
puede ser así realizado, usando el ADN que contenga un promotor
adecuado como una plantilla, monitorizando la formación de mARN de
longitudes específicas. La transcripción puede ser monitorizada
midiendo la incorporación de ^{3}H-UTP en
recuentos precipitables de TCA (Ashok Kumar et al. (1994)
J. Mol. Biol. 235, 405-413;
Kajitani, M. e Ishihama, A. (1983) Nucleic Acids Res.
11, 671-686 y 3873-3888) y
determinando la longitud del transcrito específico. Los compuestos
que se identifican mediante tal ensayo pueden inhibir la
transcripción mediante diversos mecanismos, tales como (a) la unión
a una proteína sigma y la prevención de su asociación con el núcleo
de la ARN polimerasa; (b) la unión al núcleo de la ARN polimerasa y
la inhibición estérica de la unión de una proteína sigma; o (c) la
inhibición de las etapas intermedias implicadas en la iniciación o
elongación durante la transcripción.
Un aspecto más de la invención es un método para
determinar la estructura proteica de una subunidad sigma de ARN
polimerasa de Mycobacterium tuberculosis, caracterizado
porque un polipéptido SigA o SigB se utiliza en cristalografía de
rayos X. El uso del polipéptido SigA o SigB en cristalización
facilitará un diseño racional, basado en cristalografía de rayos X,
de compuestos terapéuticos que inhiben la interacción de una
proteína sigma^{70} con el núcleo de la ARN polimerasa,
inhibiendo alternativamente la unión de una proteína sigma^{70},
en asociación con un núcleo de la ARN polimerasa, al ARN durante el
transcurso de la transcripción del gen.
Los siguientes cebadores de la PCR fueron
designados, basado en las secuencias de aminoácidos conservadas de
sigma^{45} (un homólogo de sigma^{70}) de Bacillus
subtilis y sigma^{70} de E. coli (Gitt, M.A.
et al. (1985) J. Biol. Chem. 260,
7178-7185):
cebador directo (SEQ ID NO: 5):
\vskip1.000000\baselineskip
cebador inverso (SEQ ID NO: 6):
Los nucleótidos alternativos indicados en
ciertas posiciones indican que los cebadores son cebadores
degenerados adecuados para la amplificación del gen no
identificado.
El ADN cromosómico de H37RV (ATCC 27294) de
M. tuberculosis fue preparado siguiendo los protocolos
estándar. La amplificación por PCR de un fragmento de ADN de
aproximadamente 500 bp fue llevada a cabo usando las siguientes
condiciones:
\vskip1.000000\baselineskip
El ADN cromosómico de H37RV (ATCC 27294) de
M. tuberculosis, H37RA de M. tuberculosis y
Mycobacterium smegmatis fue preparado siguiendo protocolos
estándar y restringido con la enzima de restricción SalI.
Los fragmentos de ADN fueron resueltos en un gel de agarosa al 1%
por electroforesis y fueron transferidos sobre membranas de nylon
que fueron sometidas a análisis de "inmunotransferencia
Southern" siguiendo procedimientos estándar. Para detectar
fragmentos homólogos, las membranas fueron sondadas con un fragmento
de ADN de 500 bp radiactivamente marcado, generados por PCR como se
describe anteriormente.
El análisis del experimento de hibridación
Southern reveló la presencia de al menos tres fragmentos hibridantes
de aproximadamente 4,2, 2,2 y 0,9 kb, respectivamente, en el ADN
digerido por SalI de ambas cepas de M. tuberculosis.
En M. smegmatis, fueron detectados dos fragmentos hibridantes
de 4,2 y 2,2 kb, respectivamente. Pudo ser concluido que había
múltiples fragmentos de ADN con homología frente a los conocidos
genes de sigma^{70}.
Similares experimentos de hibridación Southern,
realizados con cuatro diferentes aislados clínicos de M.
tuberculosis, revelaron modelos idénticos, indicando la
presencia de genes similares también en otros aislados virulentos
de M. tuberculosis.
Una genoteca lambda gt11 (obtenida de WHO) del
ADN cromosómico de la cepa Erdman de M. tuberculosis fue
rastreada, usando la sonda PCR de 500 bp como se describe
anteriormente, siguiendo procedimientos estándar. Un fago lambda
gt11 con un inserto EcoRI de 4,7 kb fue identificado y fue
confirmado que se hibridaba con la sonda PCR. El análisis de
restricción de este inserto de 4,7 kb reveló que tenía un fragmento
SalI de 2,2 kb interno que hibridaba con la sonda PCR.
El fragmento de 4,7 kb fue escindido a partir
del ADN de lambda gt 11 por restricción de EcoRI, y fue
subclonado en el vector de clonación pBR322, para obtener el
plásmido recombinante pARC 8175 (Fig. 1) (NCIMB 40738).
El homólogo de sigma^{70} putativo en el
fragmento SalI de 2,2 kb fue denominado sigA de M.
tuberculosis. La secuencia codificante del gen de sigA
fue encontrada que tenía un sitio SalI interno, lo que podía
explicar la hibridación del fragmento de 0,9 kb en los experimentos
Southern.
\vskip1.000000\baselineskip
El ADN de H37Rv de M. tuberculosis fue
restringido con SalI y los fragmentos de ADN fueron resueltos
mediante electroforesis de gel de agarosa preparativa. El trozo de
gel agarosa correspondiente a la región de tamaño de 4,0 a 5,0 kb
fue cortado, y el ADN de este pedazo de gel fue extraído siguiendo
protocolos estándar. Este ADN fue ligado al vector de clonación
pBR329 en su sitio SalI, y el ADN ligado fue transformado en
DH5\alpha de E. coli para obtener una
sub-genoteca. Los transformantes de esta
sub-genoteca fueron identificados por
inmunotransferencia de colonia, usando la sonda de 500 bp derivada
de la PCR, siguiendo protocolos estándar. Las colonias del
transformante individual fueron analizadas por su perfil del
plásmido. Uno de los plásmidos recombinantes que retienen el tamaño
del plásmido esperado, fue analizado con detalle por mapeo de
restricción y fue encontrado que albergaba el fragmento de ADN de
4,2 kb SalI esperado. Este plásmido con el gen sigB
en el inserto de 4,2 kb fue denominado pARC 8176 (Fig. 2) (NCIMB
40739).
El fragmento de ADN EcoRV - EcoRI
esperado que abarca el gen entero de sigA fue subclonado en
los vectores M13 apropiados y ambas cepas del gen fueron
secuenciadas por el método didesoxi. La secuencia obtenida se
muestra como SEQ ID NO: 1 en el Listado de Secuencia. Un
marco de lectura abierto (ORF) de 1580 nucleótidos (posiciones
70 a 1650 en SEQ ID NO: 1) que codifica para una proteína de 526
aminoácidos fue predicha a partir de la secuencia de ADN. El
aminoácido N-terminal ha sido asignado
tentativamente basado en el primer GTG (codon de
iniciación) del ORF.
La secuencia de aminoácidos derivada del
producto génico SigA (SEQ ID NO: 2) mostró un 60% de identidad con
sigma^{70} de E. coli y un 70% de identidad con la
secuencia HrdB de Streptomyces coelicolor. La anatomía
global de la secuencia SigA es compatible con la vista
entre proteínas sigma^{70} de varios organismos. Esta anatomía
comprende una mitad del C-terminal altamente
conservada, mientras que la mitad del N-terminal
generalmente muestra una menor homología. Las dos regiones están
unidas por una línea de aminoácidos que varía en longitud y que se
encuentra que es generalmente única para la proteína. La secuencia
SigA tiene estructuras similares en las que la línea central no
conservada corresponde a los aminoácidos de 270 a 306 en SEQ ID NO:
2.
La mitad N-terminal tiene una
homología limitada a sigma^{70} de E. coli, pero muestra
similitud con la del homólogo de sigma^{70} HrdB de S.
coelicolor. Los motivos altamente conservados de las regiones
3.1, 3.2, 4.1 y 4.2 de S. coelicolor los cuales fueron
propuestos que estaban implicados en la unión de ADN (Lonetto, M.
et al. (1992) J. Bacteriol. 174,
3843-3849) se encontraban que eran casi idénticos
también en la secuencia SigA de M. tuberculosis. El comienzo
del N-terminal de la proteína ha sido tentativamente
asignado, basado en los motivos homólogos de la secuencia HrdB de
S. coelicolor.
La similitud de la secuencia global de las
secuencias de aminoácidos SigA y SigB frente a las secuencias
sigma^{70} conocidas sugiere la asignación del SigA de
M. tuberculosis a las proteínas sigma^{70} del Grupo I.
Sin embargo, SigA también muestra diferencias distintas con las
proteínas sigma^{70} conocidas, en particular una línea única y
voluminosa N-terminal de aminoácidos (posiciones de
24 a 263 en SEQ ID NO: 2), que puede ser esencial para el
reconocimiento y la iniciación de la transcripción a partir de las
secuencias del promotor de M. tuberculosis.
La secuencia de nucleótidos del gen sigB
(SEQ ID NO: 3) codifica una proteína de 323 aminoácidos (SEQ ID NO:
4). El comienzo del N-terminal de la proteína ha
sido tentativamente identificado basado en la presencia de la
primera metionina del ORF. El ORF es así estimado que
comienza en la posición 325 y acaba en 1293 en SEQ ID NO: 3 El
alineamiento de la secuencia de aminoácidos del gen sigB con
otras proteínas sigma^{70} sitúa al gen sigB en la familia
del Grupo I de proteínas sigma^{70}. La estructura global del
producto génico SigB sigue el mismo modelo que se describe para
SigA. Sin embargo, la secuencia SigB tiene sólo un 60% de homología
con la secuencia SigA, ya que hay considerables diferencias no sólo
dentro de las regiones no conservadas de la proteína, sino que
también dentro de las regiones de unión de ADN putativas de la
proteína sigB. Estas características sugieren que la proteína
SigB puede desempeñar una función distinta en la fisiología del
organismo.
\vskip1.000000\baselineskip
La porción N-terminal del gen de
sigA fue amplificada por PCR usando los siguientes
cebadores:
Cebador directo (SEQ ID NO: 7), que comprende un
sitio NcoI:
-
6
Cebador inverso (SEQ ID NO: 8):
- 5'-GTA CAG GCC AGC CTC GAT CCG CTT GGC-3'
- (a)
- Un fragmento de aproximadamente 750 bp fue amplificado a partir del constructo del gen sigA pARC 8175. El producto amplificado fue restringido con NcoI y BamHI para obtener un fragmento de 163 bp.
- (b)
- Un fragmento de ADN de 1400 bp fue obtenido por digestión de pARC 8175 con BamHI y EcoRV.
- (c)
- El plásmido de expresión pET 8ck, que es un derivado de pET 8c (Studier, F.W. et al. (1990) Methods Enzymol. 185, 61-89) en el que el gen de \beta-lactamasa ha sido sustituido por el gen que confiere resistencia de kanamicina, fue digerido con NcoI y EcoRV y fue purificado un fragmento de aproximadamente 4,2 kb.
Estos tres fragmentos (a), (b) y (c) fueron
ligados mediante métodos estándar y el producto fue transformado en
DH5\alpha de E. coli. Los transformantes individuales
fueron rastreados por el perfil del plásmido siguiendo protocolos
estándar. El transformante fue identificado basado en el tamaño del
plásmido esperado (aproximadamente 6,35 kb) y en el mapeo de
restricción del plásmido. El plásmido recombinante que alberga el
fragmento codificante de sigA fue denominado
pARC 8171.
El plásmido pARC 8171 fue transformado en el
huésped de expresión de T_{7} BL21 (DE3) de E.
coli. Los transformantes individuales fueron rastreados para
detectar la presencia del plásmido de 6,35 kb y fue confirmado
mediante el análisis de restricción. Uno de los transformantes fue
cultivado a 37ºC y fue inducido con
isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosido
(IPTG) 1 mM usando protocolos estándar. Una proteína de 90 kDa
específica fue inducida en la expresión. Las células fueron
recuperadas mediante centrifugación a baja velocidad y fueron
lisadas por sonicación en solución salina tamponada de fosfato, pH
7,4. El lisado fue centrifugado a 100.000 x g para
fraccionarlo en el sobrenadante y el pelete. La mayoría del producto
de 70 kDa obtenido después de la inducción con IPTG estaba presente
en la fracción del pelete, indicando que la proteína formaba cuerpos
de inclusión.
Para purificar el producto génico de sigA
inducido, el lisado de células según se obtuvo antes fue clarificado
por centrifugación a 1000 rpm en un rotor JA 21 de Beckman durante
15 min. El sobrenadante clarificado fue dividido en capas con un
gradiente de sacarosa del 15-60% y fue centrifugado
a 100.000 x g durante 60 min. Los cuerpos de inclusión sedimentaron
como un pelete a través de relleno de sacarosa al 60%. Este pelete
fue solubilizado en hidrocloruro de guanidina 6 M que fue eliminado
por diálisis secuencial contra tampón que contenía una
concentración decreciente de hidrocloruro de guanidina. El dializado
estaba un 75% enriquecido para la proteína SigA que fue purificada
esencialmente siguiendo el protocolo para la purificación de
sigma^{70} de E. coli que se describe en Brokhov, S. y
Goldfarb, A. (1993) "Protein expression and purification",
vol. 4, 503-511.
El producto génico de sigB fue expresado
y purificado a partir de los cuerpos de inclusión. La secuencia
codificante del gen sigB fue amplificada por PCR usando los
siguientes cebadores:
Cebador directo (SEQ ID NO: 9), que comprende un
sitio de restricción NcoI:
-
7
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador inverso (SEQ ID NO: 10), que comprende
un sitio de restricción EcoRI:
- 5'- CTT GAA TTC AGC TGG CGT ACG ACC GCA-3'
\vskip1.000000\baselineskip
El fragmento de 920 bp amplificado fue digerido
con EcoRI y NcoI y fue ligado al pRSET B digerido con
EcoRI y NcoI (Kroll et al. (1993) DNA and
Cell Biology 12, 441). La mezcla de ligación
fue transformada en DH5\alpha de E. coli. Los
transformantes individuales fueron rastreados según el perfil del
plásmido y el análisis de restricción. El plásmido recombinante que
tiene el perfil del plásmido esperado fue denominado pARC 8193.
Fue cultivado DH5\alpha de E. coli que
alberga pARC 8193 en LB que contenía en 50 \mug/ml de ampicilina
hasta una OD de 0,5, y fue inducido con IPTG 1 mM a 37ºC, siguiendo
protocolos estándar. La proteína SigB inducida fue obtenida como
cuerpos de inclusión que fueron desnaturalizados y renaturalizados
siguiendo el mismo protocolo que el descrito para la proteína SigA.
La proteína SigB purificada fue >90% homogénea y adecuada para
los ensayos de transcripción.
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes plásmidos han sido depositados
según el Tratado de Budapest en las Colecciones Nacionales de
Bacterias Industriales y Marinas (NCIMB), Aberdeen, Escocia, Reino
Unido.
\vskip1.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Astra AB
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Västra Mälarehamnen 9
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Södertälje
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Suecia
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): S-151 85
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: +46-8-553 260 00
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- FAX: +46-8-553 288 20
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- TÉLEX: 19237 astra s
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Nuevas moléculas de ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 10
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMATO LEGIBLE DE ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible de IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1724 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: cepa Erdman
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: pARC 8175
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN:70..1653
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 528 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1508 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: atcc27294
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: pARC 8176
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN:325..1293
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 323 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador PCR"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAGTTCAGCA CSTACGCSAC STGGTGGATC
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador PCR"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTTSGCCTCG ATCTGSCGGA TSCGCTC
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador PCR"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTCCATGGGG TATGTGGCAG CGACC
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador PCR"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTACAGGCCA CCCTCCATCC GCTTGCC
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador PCR"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTTCATGGCC GATGCACCCA CAAGGGCC
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador PCR"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTTGAATTCA CCTCGCCTAC GACCGCA
\hfill27
Claims (12)
1. Un polipéptido aislado que es una subunidad
sigma del Grupo I de la ARN polimerasa de Mycobacterium
tuberculosis, cuya secuencia de aminoácidos es idéntica a, o al
menos 95% homóloga con SEQ ID NO: 4 en el Listado de Secuencia.
2. Una molécula aislada de ácido nucleico que
tiene una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido
como se reivindica en la reivindicación 1 y cuya molécula se
selecciona a partir de:
- (a)
- moléculas de ADN que comprenden una secuencia de nucleótidos como se muestra en SEQ ID NO: 3 que codifica una subunidad sigma del Grupo I de ARN polimerasa de Mycobacterium tuberculosis; y
- (b)
- moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de ácidos nucleicos que es degenerada, como resultado del código genético, respecto a una secuencia de nucleótidos como se define en (a) y que codifica para un polipéptido que es una subunidad sigma del Grupo I de la ARN polimerasa de Mycobacterium tuberculosis.
3. Un vector que comprende una molécula de ácido
nucleico de acuerdo con la reivindicación 2.
4. Un vector de acuerdo con la reivindicación 3
que es el vector del plásmido pARC 8176 (NCIMB 40739).
5. Un vector de acuerdo con la reivindicación 3
que es un vector de expresión capaz de mediar la expresión de un
polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1.
6. Una célula huésped que alberga a un vector de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5.
7. Un proceso para la producción de un
polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende
cultivar una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 6
transformada con un vector de expresión de acuerdo con la
reivindicación 5 bajo condiciones mediante las cuales dicho
polipéptido se produce y recuperar dicho polipéptido.
8. Un método para evaluar compuestos que tienen
la capacidad de inhibir la asociación de una subunidad sigma con un
núcleo de la ARN polimerasa de Mycobacterium tuberculosis,
comprendiendo dicho método (i) poner en contacto un compuesto que
se analiza por dicha capacidad de inhibición con un polipéptido de
acuerdo con la reivindicación 1 y un núcleo de la ARN polimerasa de
Mycobacterium tuberculosis; y (ii) detectar si dicho
polipéptido se asocia con dicho núcleo de la ARN polimerasa
para formar la holoenzima de ARN polimerasa.
9. Un método de acuerdo con la reivindicación 8
en el que los polipéptidos que están asociados al núcleo de la ARN
polimerasa y/o polipéptidos que no están asociados al núcleo de la
ARN polimerasa son detectados por cromatografía tal como filtración
de gel.
10. Un método de acuerdo con la reivindicación
8, en el que la holoenzima de ARN polimerasa se detecta por
inmunoprecipitación, usando un anticuerpo que se une a la holoenzima
de ARN polimerasa.
11. Un método de evaluación para compuestos que
tienen la capacidad de inhibir la transcripción dependiente de la
subunidad sigma mediante una ARN polimerasa de
Mycobacterium tuberculosis, comprendiendo dicho método (i)
poner en contacto un compuesto que se analiza por dicha capacidad de
inhibición con un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1,
un núcleo de la ARN polimerasa de Mycobacterium tuberculosis,
y un ADN que tiene una secuencia codificante operativamente unida a
una secuencia de promotor capaz de reconocer a dicho núcleo de la
ARN polimerasa cuando se une a dicho polipéptido, siendo llevado a
cabo dicho poner en contacto en condiciones adecuadas para la
transcripción de dicha secuencia codificante cuando la ARN
polimerasa de Mycobacterium tuberculosis se une a dicho
promotor; y (ii) detectar la formación de mARN correspondiente a
dicha secuencia codificante.
12. Un método para determinar la estructura
proteica de una subunidad sigma de ARN polimerasa de
Mycobacterium tuberculosis, caracterizado porque un
polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 es utilizado en
cristalografía de rayos X.
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|---|---|---|---|
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| SE9501976A SE9501976D0 (sv) | 1995-05-30 | 1995-05-30 | New DNA molecules |
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1996
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