JPH03505670A - 細菌におけるポリペプチドの翻訳後修飾およびそのための遺伝子を誘導するリーダー配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 細菌におけるポリペプチドの翻訳後修飾およびそのための遺伝子を誘導するリー ダー配列侠血公団 本発明は成熟形態に達する前に、アミノ酸配列の翻訳後修飾（Ｐｏｓｔ−ｔｒａ ｎｓｌａｔｉｏｎａｌ　ｍａｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を必要とする蛋白質の形質 発現に関する。この蛋白質は普通の核酸によるために暗号化された（ｃｏｄｅｄ 　）２０個の共通アミノ酸以外のアミノ酸を示している。

特に、前駆体ポリペプチドとの接合において発現した場合に、特異的アミノ酸の 翻訳後修飾を誘導することができるリーダーペプチド配列が確認されている。ま た、このリーダー配列を用いて改良された組成物を形成する方法が提案されてい る。

従来技術の背景 天然、抗生物質活性を有するポリペプチドを含むポリペプチドは、細菌および他 の生物の発現生成物（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ）として、遺伝 暗号により特定された２０個の共通酸以外のアミノ酸を含んでいることが確認さ れている。２種の重要な物質、すなわち、ナイシンおよびスブチリンの構造を第 １図に示していこれらのポリペプチドおよび異常なアミノ酸の他の物質における ランチオエン、β−メチルランチオニエンＤ−アラニン、デヒドロアラニンおよ びデヒドロブチリンの存在は、遺伝暗号によって指示された普通の蛋白質生合成 以外のある物がこれらの自然に生ずるポリペプチドの成熟形態の形質発現に含ま れていることを暗示している。それにもかかわらず、これらポリペプチドの出現 を蛋白質生合成阻害剤によって遮断できることが研究によって確められている（ ヒユースト氏らｒＣａｎａｄｉａｎＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ｏｇｙ　Ｊ　１７．１３７９〜１３８４　（１９７１）　）　ｏまた、成熟形態 の前駆ペプチドは成熟ペプチドに対する抗体により検出できることが知られてい るにジオ氏らｒＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＢｉｏｐｈｙｓｉｃｓ　Ｒｅ５ｅａｒ ｃｈ　ＣｏｍｍｕｎｉｔｙＪ　１１６．７５１〜８５１　（１９８３））。

これらの観察、およびナイシン、スブチリンおよび関連蛋白質に関する他の観察 はリポソーム機構を介する前駆体の一次生合成、引き続く翻訳後修飾を含む機構 を暗示している。

これらの蛋白質およびその潜在的変異体の活性は、異質ＤＮＡ断片を含有し、か つ蛋白質の生成のために暗号化する（ｃｏｄｉｎｇ）誘導微生物の分野における 実質的な活性を生ずるのに一般的に興味がある。ゴンザレズ氏らの米国特許第４ ，７１６，１１５号明細書はかかる誘導微生物に指向されている。しかしながら 、成熟蛋白質のために直接に暗号化する遺伝配列を含有する不可能性、および成 熟蛋白質において生ずるのに必要な翻訳後修飾の性質に関する情報の欠乏が、こ れらの蛋白質について暗号化する特異的遺伝子に関する微生物のクローニングを 妨げ、およびおそらく達成できる高度の活性または他の高められた特性を有する ランダム変異体および部位特異的突然変異蛋白質を生ずるという試みは失敗して いる。

それ故、これらの異常なアミノ酸含有ポリペプチドを生ずる機構の包括的な知識 に達成し、およびこれらのペプチドの生成のために特別に暗号化し、かつ一般に 入手しうる細菌の形質転換に適当な遺伝子を移入する発現ベクターを発生する生 物工学分野の目的が残っている。

＾咀Ω皿丞 本発明者は、ポリペプチドの前駆体を暗号化する（ｅｎｃｏｄ　ｉｎｇ　）遺伝 子と結合した場合に、成熟形態を得るために前駆体の翻訳後修飾において誘導し または関与する遺伝子リーダー配列を確認した。可能なリポソーム結合部位を含 む全遺伝子の構造はこれらのペプチドの製造のための翻訳後修飾モードを確認す ることができる。

前駆体の形質発現、最終的にスブチリンの成熟蛋白質についての遺伝子を第２図 に示す。ナイシンなどのような異常なアミノ酸を含む他の蛋白質の翻訳後修飾を 促進するのに用いることのできるリーダー配列を第３図に示す。また、スブチリ ンと有意な相同性を有する別のリーダー配列を確認し、全遺伝子配列を第３図に 示している。

型皿Ω皿生友脱皿 第１図はグロス氏らｒＰｒａｔｅｉｎ　Ｃｒｏｓｓ−１ｊｎｋｊｎｇｊ１３１〜 １５３ページ（１９７７）において決定されている僅かな抗生物質蛋白質ナイシ ンおよびスブチリンについての高次構造を示している。

第２図は翻訳後修飾の誘導の原因となるリーダー断片を含む適当な前駆体ペプチ ドについて暗号化する遺伝子を含有する完全消化断片（ｅｎｔｉｒｅ　ｄｉｇｅ ｓｔｅｄ　ｆｒａｇｍｅｎｔ）についての遺伝子塩基対配列を示している。推定 リポソーム結合部位をＲ，Ｂ、　Ｓ、標識付けし、リーダー断片の上に星印を付 し、修飾を受ける前駆体のこれらのアミノ酸を肉太活字で示している。

第３図は、ナイシンに対する遺伝暗号についての配列、および同じタイプの標識 を付し、かつ第２図におけると同じ意味を有する相当する前駆体ポリペプチドに ついての例を示している。

発明を実施する好適例 興味ある蛋白質についてのポリペプチド前駆体に対する、それ故、蛋白質の成熟 形態の最終的な形質発現に対する遺伝子に達すると、与えられた蛋白質の推定の アミノ酸前駆体配列に基づく遺伝子プローブ（ｐｅｎｅ　ｐｒｏｂｅ）を生じさ せる必要がある。

説明しやすくするために、同じ方法学を後述するナイシンの前駆体についての全 遺伝子を定めるのに用いることができ、その上に、成熟形態の類似する異常なア ミノ酸を含有する蛋白質を暗号化する付加遺伝子に適用できるけれども、先づス ブチリンについての遺伝子および前駆体に関して記載する。

スブチリン生成菌株をアメリカン　タイプ　カルチャー　コレクション（Ａｍａ ｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）、ロックヴイ ル、λＩＤから得た。この菌株をフィーネイ氏ら（１９４８）による初めに記載 したニシオ氏ら（１９８３）の高スクロース培地Ａで培養した。この培地はリッ トル当り　１１．７ｇのくえん酸、４ｇのＮａｔ３０４．４．２ｇの（ＮＨ４） ２ＨＰＯ４，５ｇの酵母エキス（シフ：）（Ｄｉｒｃｏ））、１００　ｍｌの塩 混合物（７，６２ｇ　ＫＣＬ　４．１８ｇ　　ＭｇＣｌ、−６Ｈ２０，０，５４ ３ｇＭｎＣＩ２−４Ｈ２０、０，４９ｇのＦｅＣ１，・６Ｈ２０および０．２０ ８ｇのＺｎＣＩｔを１０１００ＯＨ２Ｏに混合した）、およびｐＨを６．８〜６ ．９にするのに十分なＮＨ，ＯＨを含有している。供給原料（ｓｔｏｃｋｓ）は １．５％寒天を含有するＬＢ平板（ＬＢ　ｐｌａｔｅｓ）（リットル当り１０ｇ トリプトン、５ｇ酵母エキス、１０ｇ　ＮａＣ１）上に維持した。

クローン　離およびハイブリッド形成手順　スブチリン遺伝子プローブはスブチ リンの推定アミノ酸前駆体配列に基づいて設計した。成熟スブチリン分子は３２ 種のアミノ酸だけを含有し、低コドン縮重（ｌｏｗ　ｃｏｄｏｎ　ｄｅｙｅｎｅ ｒａｃｙ）のいかなる領域を含有しない。それ故、スブチリン前駆体におけるア ミノ酸の短い伸びを暗号化するすべての可能な配列を含有するプローブ混合物を 調製する代りに、単一の長いプローブをラセ氏ｒＪｒｕｒｎａｌ　ｏｆＭｏｌｅ ｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｊ　１８３．１〜１２ページ（１９８５）の方法 に従って合成した。コドン内の不明瞭な部分は、α−アミラーゼについて暗号化 した既知のＢ、スブチリスから構成したコドン頻度慣習表に従い経験的推測によ って選択した（ヤング氏らｒＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＪ 　１１．２３７〜２４９ページ（１９８３）。

プローブと標的遺伝子配列との間の配列相同（ｓｅｑｕｅｎｃｅｈｏｍｏｌｏｇ ｙ）は予言できないため、ハイブリッド形成および洗浄条件を経験的に最適にす る必要がある。９６−ｒｎｅｒｒゲスマー（ｇｕｅｓｓｍｅｒ）　Ｊはハンセン 氏ら（１９８２）により記載されたようにジスルフィド架橋ＢＡＣ上で精製した ポリヌクレオチド　キナーゼを用いて末端標識付けし、６×標準食塩−くえん酸 （ＳＳＣ）塩強さを用い３７〜６０℃の範囲において７℃温度間隔で全ＡＴＣＣ ６６３３ゲノムＤＮＡのＥｃｏＲＩ消化物にハイブリッドした。次いで、別のス トリップを２ｘＳＳＣにおいて４℃の温度増加を用いて洗浄した。信号強さおよ び特異性の最良の組合せを与えるハイブリッド形成および洗浄条件を、ラムダＪ ｌ（ｌａｍｂｄａ　Ｊｌ）に構成したＡＴＣＣ６６３３の部分Ｍｂｏ　ｌライブ ラリの後スクリーニングについて選定した。プローブおよび標的を著しく相同し たハイブリッド形成を上述する同じハイブリッド形成緩衝液で行ったが、しかし ハイブリッド温度を７０℃にし、洗浄を０．　Ｉ　Ｘ　ＳＳＣにおいて５２℃で 行った。ＤＮＡ配列分析をユナイテッド　ステーブ　バイオケミカル　コーポレ ーション（Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　ＢｉｏｃｋｅｍｉｃａｌＣｏｒｐ、　 ）より供給された修飾Ｔ７ポリメラーゼ「シークエナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ）　Ｊ　システムを用いて行った。

ＲＮＡ分離およびＳｌ−マツピング　　全ＲＮＡをウルマネン氏ら（１９８５） の方法を用いて分離した。Ｓｔ−マツピングはダビス氏ら（１９８６）の方法に よって行った。この方法では、合成オリゴヌクレオチドを、鋳型としてクローン 化遺伝子を含有する一本鎖Ｍ１３　ＤＮＡを用いるプライム第二鎖（ｐｒｉｍｅ 　５ｅｃｏｎｄ　５ｔｒａｎｄ）に用いる。標識は〔α−３２ｐ−ｄＡＴＰ］か ら３２ｐとして移入した。短い標識時間（ｌａｂｅｌｉｎｇ　ｔｉｍｅ）後、過 剰の非標識ｄＡＴＰを加え、第二鎖合成を完了するように継続した。適当な制限 酵素を用いて二重鎖生成物をカットし、標識鎖を変性アガロースゲルの電気泳動 、次いで断片を局在化するオートラジオグラフィー、ゲルの切除およびＤＮＡの 電気泳動溶出によって得た。電気泳動溶出後、ＤＮＡをｌ：１クロロホルム対フ エノールで抽出し、エタノールで沈殿させた。標識断片を全ｍＲＮＡに二三の異 なる温度でハイブリッドし、非ハイブリッド一本鎖核酸をヌクレアーゼＳ１を用 いて分解した。生成物を同じ合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて 生成したジデオキシ配列反応（ｄｉｄｅｏｘｙｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｒｅａｃ ｔｉｏｎｓ）のセットに沿って変性配列ゲル上で電気泳動した。配列レーン（ｓ ｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　１ａｎｅｓ）に関して保護標識ＤＮＡ断片の位置はｍＲＮ Ａの端部を示した。

ＲＮＡおよび蛋白　　析、　　ノーザン分析をゼータ−プローブ　ナイロン膜（ Ｂｉｏ−Ｒａｄ）におけるＲＮＡ調製のエレクトロプロツテング（ｅｌｅｃｔｒ ｏｂｂｏｔｔｉｎｇ）アクリルアミドゲルにより行った。蛋白質はスワングーム ンカース（ｓｗａｎｋａｍｄ　Ｍｕｎｋｒｅｓ）　（１９７１）のポリアクリル アミドゲル　システムにおける電気泳動により分析し、パイオーレッド（Ｂｉｏ −Ｒａｄ）試薬を用いて銀染色した。

スブチリン活性をモリス氏ら（１９８４）によりナイシンについて記載されてい るようにして測定した。

上述する材料および方法を用いて、ゲスマーによりハイブリッドする配列を含む 断片をＭ１３にクローン化し、配列した。配列をスブチリス遺伝子プローブに対 する相同性について調べ、また全読取り枠にコンピューター翻訳した。これらを 推定スブチリン前駆体配列について調べた。完全に一致し、３２個の残基の正確 な配列を含有することを確かめた。配列を第３図に示す。

上述すように、この配列は、翻訳後、修飾して異常なアミノ酸を有する成熟蛋白 質を得るセリン、スレオニンおよびシスティンを含有する前駆体ポリペプチドを 暗号化する蛋白質を含んでいる。（−１０）領域は他の細菌に観察されるように 共通（ｃｏｎｓｅｎｓｕｏ）原核プロモーター（ＴＡＴＡＡＴ）に極めてよく一 致する（シエベンリスト氏らｒｃｅＨＪ　２０．２６９〜２８１ページ（１９８ ０）。

推定リポソーム結合部位をＲＢＳとして標識し、ＪｒＤＮＡ　Ｊ　３．１７〜２ １ページ（１９８４）に報告されているようにＢニスブチリス　において観察し た１２塩基対配列を包囲する。翻訳開始は本発明のリーダー配列が開始するＭｅ ｔコドンのすぐ下流で始まるように位置する必要がある。細胞の外側のスブチリ ンの輸送に役割を演するスブチリン前駆体ペプチド　リーダー領域は他の原核輸 出（ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｏｒｔｅｄ）蛋白質の配列に比較して異常 であった。

ナイシン 上述する研究方法は抗生物質ナイシンについても当てはまり、前駆体について暗 号化する生成遺伝子配列を第３図に示す。

細菌株、クローニング　ベクター、および培養条件、　ナイシン生成ストレプト コッカス　ラクチス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　Ｉａｃｔｉｓ）ＡＴＣＣ１ １４５４をアメリカン　タイプ　カルチャー　コレクション（ロックヴイル、Ｍ Ｄ）から得た。菌株は２５％グリセーロルを含有するＡＴＣＣ培地１７　（１０ ０ｇ脱脂乳粉末、１００ｇトマト　ジュース、５ｇ酵母エキス、ｐｔ（７）に− ２０℃で貯蔵した。試験供給材料を１．２％ＬＢ寒天平板（リットル当り　１０ ｇバタトートリプトン、５ｇバクトー酵母エキス、１０ｇ　ＮａＣ１）上に維持 した。リットル当り５ｇのバクトーペプトン（デフコ）、５ｇのバクト・ソイト ン（Ｓｏｙｔｏｎｅ　（デフｍｌ）　）　、２．５ｇの酵母エキス（デフコ）、 ５ｇとビーフ　エキス（デフコ）、０．５ｇのアスコルビン酸、５ｇのラクトー ス（またはグルコース）　、１９ｇのβ−グリセロりん酸二ナトリウム（イース トマン）および０．１２ｇの無水ＭｇＳＯ４からなるＫ（１７培地（８）を用い て、ナイシン生成、ゲノム　ライブラリー構造および全ＲＮＡ分離についてＳ、 ラクチス（Ｓ、　１ａｃｔｉｓ）を培養した。有機体を２％接種物を用い、通気 せずに３２℃で適当量のＮ１１７培地に生長した。

ナイシン生成についての検定に用いるバチルス　セリユースＴ（Ｂａｃｉｌｌｕ ｓ　ｃｅｒｅｕｓ　Ｔ）を調製し、当業技術において記載するように貯蔵した。

抗生物質活性検定をＳ、ラクチス培養上澄液のフラクションを用いて上述するよ うに行った。

竺［分風土Ｓ、　　Ｓ、ラクチスＡＴＣＣ１，１４５４を５００ｍ　ｌのＭ１７ 培地において、通気せず３２℃で３０時間にわたって温置した。細胞を遠心分離 によって採収し、２５ｍＭ　ＰＢＳ　（リットル当り８ｇ　ＮａＣｌ。

１、４ｇ　ＮａＪＰＯ４，１，２ｍ１１Ｎｔ（Ｃ１）で洗浄した。細胞を１５ｍ １の５０　ｍＭＴｒｊｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，６）に懸濁し、次いで３３マイクロ グラム／ｍｌのムッタノリシン（ｍｕｔａ口ｏｌｔｓｉｎ）　（シグマ）でゆる やかに撹拌（１２）Ｌながら３７℃で１５分間にわたり消化した。次いで、５ｍ ｌの５ＴＥＰ溶液（１３）　（０，５％ＳＯ３，０，４Ｍ　ＥＤＴＡにおける５ ０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＭＣＩ、および１ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ）を添加し、 随時撹拌しながら３７℃で３０分間にわたって温置した。混合物を１容量のＣＨ Ｃｌ、、　１容量の（５０：　５０）フェノール：　ＣＨＣｌ、および最後に１ 容量のＣＭＣｌ３で順次抽出した。１０分の一容量の３ＭＮａアセテートおよび ２容量のエタノールを添加し、ＤＮＡをスポールしく５ｐｏｏｌｅｄ）　、２０ ｍ１の５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　、および５０マイクログラム／ｍｌの膵臓 デキシリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）　（シグマ）を含有する４ｍλ４　ＥＤ ＴＡに再懸濁した。溶液を、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩおよび４　ｒｎＭ　Ｅ ＤＴＡの緩衝液に対し１回緩衝液を替え（ｏｎｅ　ｂｕｆｆｅｒ　Ｃｈａｎｇｅ ）で、４℃で１６時間にわたって透析した。ＤＮＡを２．５Ｍ酢酸アンモニウム の存在で２回、エタノール沈殿し、最後に２ｍｌの１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ ｐＨ７，６）に溶解した。

ナイシン遺伝子を調べるために用いた。／％イブリッド形成条件は上述するよう に最適にした（２）。２つのオリゴマー　プローブ（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ　ｐ ｒｏｂｅｓ）をバイオサーチ　モデル（ＢｉｏｓｅａｒｃｈＭｏｄｅｌ）８７０ ０　ＤＮＡシンセサイザーを用いる化学合成によって作った。１つのプローブと しては推定ナイシン前駆体配列内の低コドン縮重の領域に対して設計した２０− ｍｅｒ混合プローブを用いた。

もう１つのプローブとしてはラセ（Ｌａｔｈｅ）法を用いて設計した単一配列１ ０３−ｍｅｒオリゴヌクレオチド　プローブを用いた。また、バチルス　スブチ リスＡＴＣＣ６６３３（２）から予じめクローン化したスブチリン遺伝子を含有 する１、ｌｋｂ制限断片とした天然ＤＮＡプローブを用いた。

ナイシン遺伝子のライブラリー構造および分離、　　ラムダＪ１におけるＳ、ラ クチスＡＴＣＣ１１４５４ＤＮＡの全ゲノム　ライブラリーを構成し、上述する ようにスクリーニングした。陽性クローンを制限分析によって地図を作り、他の 分析のためにｐＬＩｃ９およびｐＴＺ　１９　Ｕプラスミド　ベクターに、およ び配列の決定（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）のためのＭ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍ ｐ１８にサブクローン化した。配列決定はユナイテッド　ステーブ　バイオケミ カルカンパニーから得られたシークエナーゼ　キットの修飾Ｔ７ポリメラーゼお よびプロトコールを用いるジデオキシ　ターミネーション法によって行った。

ＲＮＡ分離およびノーザン　プロット分析、　全ＲＮＡ分離を立ルマネン氏らの 方法により行った。ＲＮＡ分画化を変性アクリルアミド　ゲル上で行い、ゼータ 　プローブ（バイオレット（Ｂｉｏｒａｄ）ナイロン膜上でエレクトロブロッテ ングしくｅｌｅｃｔｒｏ−ｂｌｏｔｔｅｄ）、上述するようにハイブリッド形成 した。

■亘！分析、　蛋白質をスワングームンカースのポリアクリルアミドゲル上で電 気泳動により分析し、パイオーレッド試薬を用いて銀染色した。ナイロン膜上を モリス氏らの方法によりかようにして、スブチリン、ナイシン、および異常アミ ノ酸を含有する他の蛋白質を遺伝暗号により暗号化しないモードを確立した。第 ２および３図に示すスブチリンおよびナイシンについての遺伝子内に暗号化した 特異的リーダー配列は、上述する異常アミノ酸に転化する前駆体残基Ｓｅｒ、　 ＴｈｒおよびＣｙｓを含み、脱水、およびチオエーテル架橋およびＤ−アミノ酸 を生ずる位体転化（ｓｔｅｒｅｏｉｎｖｅｒｓｉｏｎ）を伴うポテンシアル求電 子付加反応を含む反応を受ける特異的アミノ酸の翻訳後修飾のために必要とされ る。リーダーを含む前駆体ポリペプチドについての遺伝暗号化を、通常の科学技 術を介して、例えばナイシンの場合天然生産者（ｎａｔｕｒａｌ　ｐｅｏｄｕｃ ｅｒ）としてストレプトコッカスラクチスおよび例えば米国特許第４．７１６． １１５号明細書に記載する形質発現細菌を含む任意の発現ベクターに挿入するこ とができる。同様の発現ベクターを他の蛋白質について確認することができる。

上述する本発明に伴って、エビデルミン（ｅｐｉｄｅｒｍｉｎ）　、他のランチ オエン含有ポリペプチド抗生物質についての遺伝配列をシネル氏らｒＮａｔｕｒ ｅＪ　３３３．２７６〜２７８ページ（１９８８）に発表した。３種の抗生物質 についてのリーダー配列のアミノ酸残基が共通進化原点（ｃｏｍｍｏｎ　ｅｖｏ ｌｕｔｉｏｎａｒｙ　ｏｒｉｇｉｎ）を示すのに十分な相同を反映するけれども 、この時に、各アミノ酸配列、およびそれらの相当する遺伝配列に有意な差違が あることが明らかにされている。しかしながら、表１に示すように、３つのリー ダーアミノ酸配列のバイトロバシック　インデックス（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ 　１ｎｄｅｘ）は驚くばかりに類似している。特に、構造領域に隣接して、高い 親水性の領域があり、引続いて平均して中性で、しかも構造領域から遠位の親水 性残基と疎水性基と間を交互する領域がある。実際に、同じグラフには、これら の残基に関する驚くべき相互関係がある。これらの相互関係は、各リーダー領域 が親水性残基における中断をいずれの場合でも全く同じ位置において１つの疎水 性残基によりもたらされるまで続く。それ故、本発明は、構造領域における修飾 を達成するのに指向するまたは促進するリーダー領域を暗号化することにより修 飾を達するという認識のみならず、リーダー領域が親水および疎水性残基を完全 中性値にするように交替するより遠位部分によって補足される性質において親水 である構造領域に隣接する部分を有するように特徴を与えることができるという 認識に及ぶことを包含する。経験的に、ここに示す３つの例は、構造領域に隣接 する親水性部分に単一疎水残基が存在することを含んでいる。この出願の出願臼 において、かかる残基の存在が翻訳後修飾を達成するのに本質的に必要であるか 否かは知られていない。

しかしながら、当業技術者によれば、慣例の試験によって、かかる存在の必要性 と共に、修飾効率を完全できる種々の選択手段を定めることができる。

また、利用できる科学技術によって、多くの場合に比較的に簡単な手段、すなわ ち、アミノ酸配列に基づく予言、引続くハイブリッド形成および配列分析により 定めることができる、構造領域のみによる遺伝子から、成熟蛋白質を暗号化する ことができる。また、特異的アミノ酸における本発明のリーダー配列の効果はＤ ＮＡ修飾にたよらず部位〜特異的突然変異誘発を達成する新規な手段を与える。

それ故、例えばシスティンのような種々の残基の欠失または置換が生物活性を改 善することができることが報告されている（例えば、米国特許第４．５１８．５ ８４号明細書参照）。更に、天然に存在するペプチドの新規な変異体はある生物 的機能について高い活性または良い特異性を示すことでかできる。これらは、天 然に存在するポリペプチドの形質発現を暗号化する遺伝子の前に本発明のリーダ ー配列についての遺伝暗号を挿入し、次いでリーダー配列により与えられた残基 を脱離または修飾する翻訳後修飾を付与することによって作ることができる。

八イドａｌｖンッグインヂソグス 前駆体の実質的な形質発現を安定にし、ペプチドそれ自体を安定にする必要がな い場合には、ペプチド前駆体を暗号化する遺伝子からリーダー断片を特異的切除 することによって達成することができる。本発明のリーダー配列を存在しない場 合には、翻訳後修飾を与えず発現する前駆体である。

本発明の他の観点は、「標的蛋白質（ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ）Ｊ 、または異常アミノ酸デヒドロアラニンおよびデヒドロブチリンの存在によって 、［標的（ｔａｒｇｅｔ）Ｊに共有的に付着することのできる蛋白質を設計する 能力にある。それ故、特異的標的について認識し、かつ選択することができる構 造変異型を用いる場合には、リーダー断片を、「結合部位」を誘導するのに、特 異的毒素を中和するのに、特異的材料を選定するのに用いることができる。すべ ての、これらの変更は、通常の従業者技術者および広範囲にわたる生物工学技術 者により知ることができ、ここに開示したリーダー配列の発見を容易に適用する ことができる。

本発明の適用は実在する蛋白質の変更に制限されるものでない。ＤＮＡ配列を合 成する最近の能力を与えることにより、特異的ポリペフチドを人工クローンによ り暗号化でき、特別使用に向けることができる。１例として、異常アミノ酸の架 橋能力を本発明を介して生成する場合には、共有連鎖を形成するように修飾する ことにより生ずる異常アミノ酸の能力により基質にしっかりと結合できる与えら れた基質、例えば炭素繊維について特性を、接着剤により生成することができる 。アミノ酸の有効性は任意所望量の疎水性、親水性などを接着剤として導入して エポキシのような最近使用されている接着剤に遭遇する問題を克服することがで きる。

勿論、特別の適用には本発明のリーダー配列の突然変異および他の特別の変異型 を生ずることができる。これらの変異型が翻訳後修飾において誘導または助けと なる本質的な生物学的機能を保有するかぎり、これらの変異型は本発明の範囲内 に属するものである。

サルミア　バネルジ（Ｓｈａｒｍｉｌａ　Ｂａｎｅｒｊｅｅ）に関連して、本出 願人のリーダー配列の確認についての詳細な発表は１９８８年７月５日発表日に 出したｒＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　 ＪＶｏｌ、　２６３に記載している。

翻訳後修飾を誘導する正確な機構は明らかにされていない。

いかなる理論に制限されないが、スブチリン前駆体は疎水性が強い構造領域近く で親水性が高くなるように親水性と疎水性との間で初めに交替するリーダー配列 に残基を示す。この事は、一般に疎水性領域を有し、塩基性残基を含み、本発明 の酸性残基を含まない原核生物の輸出蛋白質（ｅｘｐｏｒｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉ ｎｓ）についての通常のリーダー領域と著しく異なる。この事は、異常な、リー ダー配列が前駆体に標的する（ｔａｒｇｅｔ　ｉｎｇ）または向ける助けをする 細分化部位（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｚｅｄ　５ｉｔｅ）で、翻訳後修飾 を生ずることを暗示する。他の蛋白質が修飾機能に関与することは予想されてい る。酵素は細胞膜においてまたはその近くに局在化する必須の科学反応を生じさ せるのに必要とされる。

本発明を特別の蛋白質、材料および方法に関して特に詳細に記載した。操作につ いて必要であることを除いて、これらの特別の材料に制限されるものでなく、ま た後述する請求の範囲の制限を越えて理解するのに制限するものでない。特に、 実際上任意の原核発現ベクター、特に細菌に関連して本発明のリーダー配列の使 用をもくろむことができる。

〜　　　　　　　　　　　　　　　　　　　〜ＳｅｒＴｈｒＬｙｓＡｓｐρｈ　 ｅＡｓｎＬｅｕＡｓ　ｐＬｅｕＶａ　ｌ５ｅｒＶａ　Ｉ　Ｓｅ　ｒＬｙｓＬｙ　 ｓＡｓ　ｐｓｅ　ｒＧ　１@ｙＡｌ　ａＳｅ　ｒ ＦＩＧ、３ 国際調査報告 ｌａ＋＋＋＋＋４１１１゛１１″”””””　ＰＣＴ／ＵＳ８９１０２８２０

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．Ｃｙｓ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒからなる群から選択するアミノ酸およびその混合物 の翻訳後修飾を誘導する、配列：【配列があります】 を有する、ペプチド　リーダー配列を暗号化する遺伝子リーダー断片。
2. ２．翻訳後修飾を受ける蛋白質前駆体にリーダーとして付着した場合に、翻訳後 修飾の誘導を助ける、アミノ酸配列：【配列があります】 の生物学的機能を有するポリペプチドを含むポリペプチド配列。
3. ３．配列： 【配列があります】 を有する細菌中のスブチリンのポリペプチド前駆体を暗号化する遺伝配列。
4. ４．細菌において発現した場合に、蛋白質スブチリンに翻訳した後に転化する前 駆体ポリペプチドの調製。
5. ５．前記ポリペプチドが残基配列： 【配列があります】 を有する請求の範囲４記載のポリペプチド。
6. ６．Ｃｙｓ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒからなる群から選択するアミノ酸およびその混合物 の翻訳後修飾を誘導する配列： 【配列があります】 を有するペプチド　リーダー配列を暗号化する遺伝子リーダー断片。
7. ７．翻訳後修飾を受ける蛋白質にリーダーとして付着した場合に、前記修飾を誘 導する助けをする、アミノ酸配列：【配列があります】 の生物学的機能を有するポリペプチドを含むポリペプチド配列：
8. ８．細菌において発現した場合に、蛋白質ナイシンに翻訳後に転化する前駆体ポ リペプチドの調製。
9. ９．翻訳した際に、Ｃｙｓ，ＴｈｒおよびＳｅｒからなる群から選択する少なく とも１種のアミノ酸を有する所望ポリペプチドにおいて部位特異的突然変異を誘 導する方法において、前記所望ポリペプチドおよびこれに付着するリーダー断片 を含む前駆体ポリペプチドを暗号化するＤＮＡ断片を調製し、この場合前記リー ダー断片が主として親水性である前記所望ポリペプチドに隣接する残基領域、お よび全中性ハイドロパシック　インデックスを有するが、しかし実質的にすべて の隣接残基が反対のハイドロパシック　インデックスを存するより遠位の領域を 含み、および 前記断片を発現ベクターのＤＮＡに挿入して前駆体ポリペプチドを発現および修 飾する ことを特徴とする所望ポリペプチドにおける部位特異的突然変異の誘導方法。
10. １０．前記発現ベクターを原核生物とする請求の範囲９記載の方法。
11. １１．前記発現ベクターを細菌とする請求の範囲１０記載の方法。
12. １２．ＤＮＡにより暗号化しない少なくとも１個の残基を含み、前記残基が予定 部位において構造領域近くに高い親水性残基の領域を有するリーダー断片を含み 、前記リーダー断片が実質的に交互のハイドロパシック　インデックスの残基の 第２領域を有し、前記構造領域が前記予定部位に相当するこの部位にＣｙｓ，Ｓ ｅｒまたはＴｈｒ残基を保持し、および前記ポリペプチドがＤＮＡゲノムを自然 に生ずる前記発現ベクターによって暗号化しないポリペプチドである発現ベクタ ーによって発現したポリペプチド。
13. １３．修飾を成熟配列において行い、かつ成熟ペプチドの実質的に交互の生物学 的特性を生ずるナイシンおよびスプチリンまたは類似ペプチドの特定部位の突然 変異体の形質発現方法。
14. １４．ここに与える全構造遺伝子を移入するプラスミドによる形質転換により生 成した組換え微生物によってナイシンおよびスブチリンを形質発現する方法。