ES2313755T3

ES2313755T3 - Ensayo de haptogoblina.

Info

Publication number: ES2313755T3
Application number: ES98952936T
Authority: ES
Inventors: Peter David Eckersall
Original assignee: University of Glasgow
Current assignee: University of Glasgow
Priority date: 1997-11-12
Filing date: 1998-11-12
Publication date: 2009-03-01
Anticipated expiration: 2018-11-12
Also published as: CA2309838A1; JP4392486B2; NZ504941A; WO1999024833A1; DE69839915D1; EP1031035B1; ATE405829T1; AU752413B2; DK1031035T3; EP1031035A1; JP2001523003A; US6451550B1; CA2309838C; AU1047699A; GB9723773D0

Abstract

Ensayo para la determinación del nivel de haptoglobina en una muestra, que comprende las etapas de: a) formación de una mezcla de reacción que comprende la muestra a analizar, un detergente, un inhibidor de la unión a proteínas para la inhibición de la unión de la albúmina y/o cualquier otra(s) proteína(s) presente(s) en la muestra a la hemoglobina o hematina liberada de la hemoglobina, y ya sea un agente reductor efectivo contra los enlaces disulfuro o un agente caotrópico en el que el citado inhibidor de unión a la proteína y el agente reductor o caotrópico no están incluidos en una cantidad que darían lugar a la inhibición de una reacción haptoglobina/hemoglobina: b) dejar reaccionar los componentes de la mezcla, de manera que se permita la formación de un complejo haptoglobina/hemoglobina; y c) determinación del nivel de la actividad de la peroxidasa del citado complejo haptoglobina/hemoglobina usando un substrato cromogénico y medios espectrofotométricos, en donde la determinación se lleva a cabo a un pH ácido suficiente para reducir substancialmente o inactivar substancialmente cualquier actividad peroxidasa de la hemoglobina no complejada.

Description

Ensayo de haptoglobina.

La haptoglobina (Hp) es una proteína que está presente en la sangre de los humanos y de los animales. La concentración de Hp en el plasma o suero, después de la separación de las células de la sangre, varía en cada animal individual y se relaciona con el estado de salud del mismo. La Hp es una proteína de un grupo de proteínas la concentración de la cual aumenta dramáticamente con una infección, inflamación o trauma. Estas proteínas se conocen como proteínas de la fase aguda.

La medida de la concentración de Hp en plasma proporciona una información diagnóstica valiosa a los clínicos en medicina humana y veterinaria. En medicina veterinaria, la medición de Hp resulta particularmente importante para valorar el estado de salud del ganado vacuno y ovino debido a que en estas especies la Hp da lugar a una respuesta particularmente fuerte a la infección, con un aumento de la concentración en circulación por encima de 100 veces. En otras especies, tal como los humanos, perros, gatos y cerdos, la medida de la Hp también es importante ya que la concentración en plasma aumenta de 2 a 3 veces, lo que resulta suficiente para proporcionar información diagnóstica. Adicionalmente, en estas otras especies una caída en la concentración de Hp puede tener valor en el diagnóstico de la hemólisis. Además, la medida de la Hp resulta de igual importancia como marcador de la inflamación o infección en los animales de laboratorio tales como roedores o ratones.

Los ensayos actuales para la Hp se basan ya sea en un inmunoensayo o en la capacidad de la Hp para unirse a la hemoglobina (Hb)

La Hp en plasma humano se mide en los laboratorios de bioquímica clínica, en forma de un ensayo de rutina, como una respuesta de fase aguda en los procedimientos basados en anticuerpos con antisuero específico para Hp humana. La aproximación más común es mediante inmunoturbidometría, en la que se puede medir la formación de un precipitado de un complejo anticuerpo-Hp en solución y se puede relacionar con la concentración de Hp. Sin embargo, los ensayos de inmunoturbidometría son caros cuando se comparan con los ensayos bioquímicos de rutina ya que requieren la preparación de un suministro continuo de antisuero adecuado. Además, para su uso en los laboratorios de diagnóstico veterinario, los ensayos basados en antisuero a una especie se deben validar para cada una de las especies por separado y la validación se debe repetir para cada uno de los lotes nuevos de antisuero usado.

Los ensayos originales basados en la unión Hp-Hb dependían del hecho de que la formación del complejo Hp-Hb altera la absorción espectrofotométrica característica de la Hb en proporción a la concentración de Hp en una muestra de sangre. Pero esto se ha reemplazado haciendo uso de la actividad peroxidasa innata del complejo, que se puede detectar a un pH ligeramente ácido cuando es proporcional al contenido en Hp ya que se inhibe la actividad peroxidasa de la hemoglobina libre, permitiendo que se puedan cuantificar los ensayos mediante calibración con muestras standard de Hp.

Este ensayo es el que se usa en la mayoría de los laboratorios de diagnóstico veterinario que en la actualidad llevan a cabo ensayos de Hp y se prefiere a los sistemas de inmunoensayo ya que se puede efectuar en todas las especies con tan solo un requerimiento modesto para la validación y también resulta considerablemente más barato que los procedimientos basados en anticuerpos debido a que los reactivos no son caros. Sin embargo, la versión automatizada de este ensayo utiliza un reactivo de guayacol que tiene un olor nocivo y no se acepta por parte del personal en muchos laboratorios. En general, este ensayo no se ha adoptado por parte de los suministradores de reactivos comerciales debido probablemente a esta razón. Se han hecho intentos con el fin de usar otros substratos para la reacción de la peroxidasa, y mientras ésto se puede conseguir para procedimientos manuales, usando tetra metil benzidina (TMB), ver Conner J. et al., Research in Vet. Sci. (1988), 44, 82-88, todavía no se ha conseguido un ensayo automatizado con éxito para la Hp. Ello puede ser debido a la sensibilidad de la TMB. Por parte de los presentes inventores se ha observado que las muestras de suero sin nada de heptoglobina (blanco cero) muestran un nivel significativo de actividad de peroxidasa capaz de dar lugar a resultados de falsos positivos con TMB. Se aprecia que dicha actividad de peroxidasa falsa no resulta deseable cuando se lleva a cabo un ensayo automatizado o semi automa-
tizado.

La patente US 4695552 describe un procedimiento para la determinación del complejo Hp-Hb similar a los procedimientos descritos anteriormente. Sin embargo, se ha identificado que un pH ácido puede no ser suficiente para inactivar completamente la actividad peroxidasa de la hemoglobina libre y se añade un detergente para eliminar substancialmente cualquier actividad peroxidasa de dicha hemoglobina libre. No obstante, no existe ningún sugerimiento en el sentido de que los componentes presentes en el suero de la sangre o en las muestras de plasma puedan afectar la precisión de dicho ensayo.

Entre los objetivos de la presente invención se encuentra el obviar y/o mitigar por lo menos una de las desventajas anteriormente mencionadas.

La presente invención se basa en parte en el descubrimiento por parte de los presentes inventores de que la albúmina y posiblemente otras proteínas presentes en las muestras de sangre tienen un "efecto peroxidasa" indeseable sobre los ensayos del tipo mencionado anteriormente.

Por tanto, la presente invención proporciona un ensayo para la determinación del nivel de haptoglobina en una muestra, tal como se define en la reivindicación 1.

Previamente se ha descrito que la hemoglobina sin formar complejo muestra una actividad peroxidasa a un pH ácido, pero que esta actividad se puede inactivar a un pH de 4,1, Makimura, S. y Suzuki, N. (1982) Jpn. J. Ven. Sci. 44, p.15-21. Sin embargo, la patente US 4695552 sugiere que un bajo nivel de actividad peroxidasa debido a la hemoglobina libre puede permanecer incluso a dicho pH. Por tanto, el presente ensayo se lleva a cabo preferiblemente a un pH de menos de 4,1, por ejemplo, a un pH 3,6-4,0, especialmente a un pH 3,8.

De manera típica, la muestra puede ser una muestra de sangre, generalmente de plasma o suero. La muestra se puede obtener de cualquier animal, en particular de los animales mamíferos, incluyendo los animales roedores, bovinos, ovinos, caninos, felinos, porcinos y equinos, así como los primates incluyendo los humanos. La muestra también puede ser de otros fluidos corporales tales como leche, o fluido ascítico o incluso un medio de incubación in vitro.

Si la concentración de haptoglobina en la muestra se encuentra por encima de aproximadamente 2 g/l, la muestra puede requerir ser diluida, puesto que la concentración de haptoglobina no se puede determinar con precisión debido a la no linealidad de una curva estándar por encima de dichas concentraciones. Sin embargo, la persona experta en la técnica entenderá fácilmente que los protocolos de ensayo podrían desarrollarse con una mejor linealidad para evitar cualquier requerimiento de dilución. Por ejemplo, se puede usar un volumen de muestra menor en unas condiciones apropiadas.

La hemoglobina puede ser del mismo origen que la muestra de sangre que se debe analizar. Es decir, si el animal que se ha de analizar es de origen bovino, se puede emplear hemoglobina bovina. Sin embargo, se ha encontrado de manera ventajosa que el ensayo se puede llevar a cabo usando hemoglobina de una especie diferente de la especie de la que proviene la muestra. Por tanto, el ensayo se puede efectuar en una gran variedad de especies utilizando solamente una única fuente de hemoglobina. De manera preferible, también la hemoglobina es met-hemoglobina, aunque opcionalmente también se puede usar oxi-hemoglobina.

El suero y el plasma de todas las especies contiene albúmina, por tanto, esta proteína se encuentra presente en la muestra a analizar a concentraciones de hasta 40 g/l. Los presentes inventores han encontrado mediante valoración del mejor medio para su uso como la muestra cero, para ser usado como blanco, que existe una significativa interferencia con el ensayo debido a la albúmina. Esta interferencia se ha detectado a concentraciones de albúmina de 1, 5 o 10% (10, 50, 100 g/l).

Se ha observado que la albúmina no tiene una actividad peroxidasa innata. Sin desear que exista una relación de manera teórica, se cree que la albúmina y posiblemente otras proteínas presentes en el suero de la sangre, plasma u otras muestras a analizar, se puede unir a la hemoglobina o posiblemente hematina liberada por la hemoglobina y conservar una actividad peroxidasa incluso a un pH (p.e., pH 3,6-4,0) que generalmente eliminaría cualquier actividad peroxidasa de la hemoglobina libre. Además, esto puede ser una razón de porqué los ensayos espectrofotométricos automatizados para la haptoglobina no se han adoptado hasta ahora de manera general, debido a la incapacidad para obtener un nivel cero de actividad peroxidasa cuando se conoce que la haptoglobina está ausente. Previamente, este "efecto peroxidasa" se puede haber minimizado de manera inadvertida o accidentalmente debido a una gran dilución de la muestra (p.ej. 500 veces) o mediante el uso de un cromógeno no sensible, p.ej. guayacol.

Sin embargo, la presente invención reduce el requerimiento de una gran dilución de la muestra y permite el empleo de cromógenos más sensibles, utilizando por lo menos dos reactivos para la reducción del efecto peroxidasa debido a la albúmina o a cualquier otra proteína presente en la muestra.

Los citados por lo menos dos reactivos para la reducción del efecto peroxidasa debido a la albúmina o a cualquier otra proteína(s) presente(s) en la muestra son a) un inhibidor de la unión a la proteína, y b) un agente reductor efectivo contra los enlaces disulfuro y/o un agente caotrópico.

Los reactivos anteriormente mencionados se usan para reducir cualquier "efecto peroxidasa". Sin embargo, los expertos en la técnica apreciarán que un exceso en cualquiera de los reactivos antes mencionados dará lugar a una inhibición de la reacción haptoglobina/hemoglobina que se debe evitar. Por ejemplo, ensayos realizados utilizando el ácido 8-anilino-1-naftalen sulfónico (ANS) como inhibidor de la unión a la proteína y ditiotreitol como agente reductor efectivo contra los enlaces disulfuro, a concentraciones de aproximadamente 10 mmol/l y 4 mmol/l respectivamente, da lugar a una inhibición casi completa de la actividad peroxidasa del complejo haptoglobina/hemoglobina. Por tanto, el experto en la técnica puede asegurar, mediante controles apropiados, que solamente se reduzca el "efecto peroxidasa" espurio sin afectar de manera substancial la actividad peroxidasa del complejo haptoglobina/hemoglobina.

De manera conveniente, el agente reductor efectivo contra los enlaces disulfuro puede ser ditiotreitol, ditioeritritol, cisteina, mercaptoetanol, glutationa, 4,4'-ditiodipiridina o 5,5'-ditio(ácido 2-nitrobenzoico).

De manera típica, el inhibidor de la unión a proteínas puede ser ANS, protoporfirina, bilirubina, ácidos taurodeoxicólicos (sales biliares), dicumarol o 2-mercaptobenzotiazol.

Típicamente, el agente caotrópico puede ser clorhidrato de guanidina, tiocianato potásico o cloruro sódico.

En el ensayo también se incluye un detergente. Inicialmente, se creía por parte de los presentes inventores que el uso de un detergente era importante para reducir el efecto peroxidasa debido a la albúmina o a cualquier otra proteína presente en la muestra. Aunque pueda parecer que un detergente tenga dicho efecto, se ha observado ahora que el uso de un detergente puede ser importante para asegurar que otros componentes del ensayo permanezcan solubilizados cuando se lleva a cabo el ensayo. Además, se prefieren tan sólo concentraciones bajas del detergente puesto que parece que altas concentraciones (p.e. 25 g/l) aumentan el efecto peroxidasa aparente. Por consiguiente, a la mezcla de reacción se añade un detergente a una concentración total de menos de 20 g/l, más preferiblemente menos de
10 g/l.

De manera típica, el detergente puede ser un tensioactivo no iónico tal como los ésteres de polioxietilen sorbitol (p.e. Tween 20, 40, 60, 80 etc), polioxietilen-p-t-octilfenol (p.e. Triton X-45, X-100, etc); y/o alcoholes de polioxietileno (PEG) (p.e. Brij 35, 36, etc.), o tensioactivos iónicos tales como dodecil sulfato sódico, CHAPS y
cetrimida.

De manera típica, se dejan reaccionar la haptoglobina presente en la muestra y la hemoglobina añadida durante menos de 20 minutos, preferiblemente menos de 10 minutos y más preferiblemente menos de 5 minutos.

Se puede detectar que ya se ha formado el complejo haptoglobina/hemoglobina mediante una actividad peroxidasa innata del complejo ya que la actividad peroxidasa de la hemoglobina se inhibe de manera substancial mediante el pH ácido del ensayo. A continuación se puede correlacionar un nivel de actividad peroxidasa con un nivel de haptoglobina en la muestra mediante referencia a una curva standard generada usando concentraciones conocidas de hapto-
globina.

De manera típica, la citada actividad peroxidasa se puede detectar mediante el uso de un cromógeno y peróxido de hidrógeno, donde la actividad peroxidasa da lugar a un cambio de color del cromógeno, cambio que se puede detectar estectrofotométricamente a una longitud de onda particular. La citada detección de peroxidasa usando substratos cromogénicos resulta bien conocida en la técnica para la determinación de los niveles de hemoglobina, glucosa y previamente para los niveles de haptoglobina cuando la influencia de la albúmina sobre el ensayo no se conocía, ver por ejemplo Bauer K., J. Clin. Chem. and Clin. Biochem., (1981) vol 19, pag. 971-976; Reijic, R. et al., Clin. Chem. (1992), vol 38, pag. 522-525 y Conner, J.G.; Eckersall, P.D., Research in Vet. Sci. (1988), 44, pag.82-88.

Para una persona experta en la técnica resultará inmediatamente evidente que además de los substratos cromogénicos mencionados en las anteriores referencias (es decir, 4-amino fenozona, ácido 2-amino-4-hidroxibencen sulfónico (AHBS) y tetra metil bencidina (TMB), también se pueden usar en el presente ensayo otros substratos cromogénicos tales como diclorhidrato de o-fenilen diamina, o-dianisidina, 2-OH-3,5-diclorobencen sulfonato sódico, 2,2'-azino-di(ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) (ABTS) y ácido 4-aminoantipirina cromotrópico, opcionalmente en co reacción con el ácido 8-anilino-1-naftilen sulfónico (ANS) y 4-iodofenol.

Un ensayo particularmente preferido según la presente invención comprende el inhibidor de la unión a proteínas/co reactivo cromogénico, el ácido 8-anilino-1-naftalen sulfónico (ANS) junto con el substrato cromogénico 4-aminoantipirna y fenol. Se ha observado que el ANS puede complementar el fenol en la reacción de co-oxidación del peróxido de hidrógeno con la 4-aminoantipirina formando un cromógeno azul que absorbe a 600 nm y tiene una mayor absorbancia que el cromógeno rojo producido en las mismas condiciones con sólo fenol como co-reactivo. La combinación de ANS y 4-aminoantipirina ya se ha descrito previamente para la determinación de peróxidos (ver por ejemplo Chung et al., (1993), Talanta 40, pag. 981-988).

La presente invención también proporciona un equipo para su uso en un ensayo de haptoglobina según la presente invención tal como se define en la reivindicación 17.

El equipo también puede comprender componentes adicionales tales como una solución tampón para mantener el pH deseado en el ensayo, y/o soluciones referencia de suero con concentraciones conocidas de haptoglobina. Resulta inmediatamente evidente para los expertos en la técnica que los componentes del equipo se pueden usar para llevar a cabo el ensayo de haptoglobina con equipamientos tales como tubos de ensayo o placas de microvaloración y un espectrofotómetro, así como en analizadores bioquímicos automatizados, tal como se describe en este
documento.

La presente invención se describe a continuación con más detalle mediante referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1 Procedimiento para la determinación automatizada de la concentración de haptoglobina usando el ensayo según la presente invención Reactivos Soluciones stock

0,9% (p/v) NaCl (salino)

Solución stock de hemoglobina (Hb) a 30 g/l preparada según Makimura y Suzuki (1982, Jpn J Vet Sci, 44, 15-21).

Solución tampón de citrato cromógeno: solución stock con 0,5 mol/l de solución tampón de citrato pH 3,8; tiomersalato 0,01%.

Soluciones de trabajo

Solución de trabajo de Hb: Solución stock de Hb diluida 500 veces en suero salino (50 \mul diluidos hasta 25 ml).

Solución tampón de cromógeno de trabajo: solución tampón de citrato cromógeno que contiene 20 mmol/l de fenol; 1,6 mmol/l de 4-aminofenazona (4-aminoantipirina), 1 mmol/l de ácido 8-anilino-1-naftalen sulfónico, 0,39 mmol/l de ditioeritritol, 1% de Tween 20.

Substrato: Peróxido de hidrógeno (H_{2}O_{2}) añadir 100 \mul de H_{2}O_{2} del 30% a 25 ml de H_{2}O.

Standard: suero con haptoglobina, concentraciones de 2,05 g/l diluidas en BSA al 2% hasta 1,03, 0,51, 0,125 y el BSA al 2% como cero.

Muestras: suero o plasma.

Muestras de control: suero con concentraciones conocidas de Hp (altas y bajas) repetidas en cada ensayo.

Calibración: una vez al día.

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Procedimiento para el uso en un analizador MIRA (Roche Diagnostics Ltd). Autoanalizador (MIRA) mantenido a 37ºC.

a): En el bastidor de reactivos, la hemoglobina diluida es el reactivo (20 ml), la solución tampón de cromógeno de trabajo es el reactivo de inicio 1 (10 ml) y el peróxido de hidrógeno es el reactivo de inicio 2 (10 ml).

b): Se mezclan 7,5 \mul de estándar, muestra o control con 200 \mul de hemoglobina.

c): Después de 50 s se añaden 90 \mul de cromógeno.

d): Después de otros 25 s, se añaden 50 \mul de substrato (H_{2}O_{2}) y se mide el aumento de la absorbancia a 600 nm.

e): La diferencia en absorción a lo largo de los siguientes 50 s se usa para calcular los resultados por comparación del cambio de absorbancia en los estándares respecto a la muestra desconocida.

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El ensayo es lineal hasta 2 g/l de haptoglobina, suficiente para la mayoría de las muestras bovinas y ovinas. Para otras especies, se puede requerir dilución para muestras por encima de 2 g/l.

Resultados

En la Tabla 1 se muestran los resultados típicos para un ensayo de haptoglobina en el analizador MIRA con la solución de cromógeno completa descrita en los procedimientos. Un gráfico de las muestras estándar indica una relación lineal entre la concentración de haptoglobina y el cambio de absorbancia a 600 nm (no indicado).

Los resultados también muestran la efectividad de esta solución de cromógeno para eliminar el efecto de la albúmina, ya que tanto el BSA al 5% como el suero de ternero fetal dan resultados que son < 0,01 mg/ml. Esto se puede comparar con los resultados del ejemplo 2 en el que no se ha eliminado la unión a la albúmina.

TABLA 1

1

Se ha elegido el BSA al dos por ciento como medio para diluir los estándares y ser usados como estándar cero para proporcionar una matriz de proteína para esta dilución y este ejemplo confirma que cuando se usa como un blanco del ensayo da lugar a una diferencia mínima en el cambio de OD cuando se compara con el suero salino, siendo la diferencia de 0,004 unidades de absorbancia.

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Referencia ejemplo 2

Usando un reactivo peroxidasa sin inhibición de la unión a la albúmina.

Con el fin de mostrar el efecto que la albúmina tiene sobre el ensayo, se lleva a cabo un ensayo comparativo en el que se omiten los reactivos (es decir, ANS, ditioeritritol y Tween 20) usados para inhibir el efecto de la albúmina.

En este ejemplo el ensayo se lleva a cabo de manera similar a la descrita en el ejemplo 1 con la excepción de que la solución de cromógeno no contiene el ácido 8-anilino-1-naftalen sulfónico, ditioeritritol o Tween 20. El reactivo contiene fenol a 20 mmol/l y 4-aminofenazona (4-aminoantipirina) a 1,6 mmol/l como los co-reactivos del cromógeno, con la absorbancia leida a 500 nm.

Resultados

Tal como se muestra en la Tabla 2, existe un efecto considerable de la albúmina al 5% sobre el cambio de la absorbancia, lo que puede conllevar una lectura errónea de 0,59 mg/ml para la concentración de haptoglobina si este ensayo se ha usado para cuantificar las concentraciones de haptoglobina en una muestra. El suero fetal de ternero también presenta una reacción significativa y da lugar a un resultado positivo indicando de manera falsa la presencia de haptoglobina.

Debe remarcarse también que en este ejemplo el máximo cambio en la absorbancia es solamente de 0,162 AU en comparación con 1,0093 AU cuando se incluye ANS como en el Ejemplo 1.

TABLA 2

2

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Ejemplo 3

Ensayo de Haptoglobina de la presente invención en uso diagnóstico

Usando el procedimiento descrito en el ejemplo 1, se determina la concentración de haptoglobina en el suero de nueve vacas lecheras con mastitis, una infección de las ubres que causa una reacción inflamatoria aguda. También se han analizado, para ver su concentración de haptoglobina, doce muestras de suero de vacas lecheras (a partir de un estudio llevado a cabo en colaboración con el Dr J.L. Fitzpatrick, Departamento de Estudios de Veterinaria Clínica, Universidad de Glasgow, Escuela de Veterinaria) suministradas al laboratorio pero que no padecían la enfermedad infecciosa o inflamatoria.

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TABLA 3 Haptoglobina en ganado lechero con y sin mastitis

4

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La concentración media de haptoglobina en los animales con mastitis es 10 veces la de los animales sin condiciones de inflamación. El amplio margen de concentraciones encontradas en los animales infectados se debe a que proceden de animales en diferentes grados de la infección, que pueden estar en el pico de la fase aguda o procedentes del periodo de recuperación.

La concentración de haptoglobina no es de 0 mg/ml en cada una de las muestras procedentes de animales no infectados y se debe probablemente a que los animales se encontraban en condiciones sub-clínicas aunque aparentemente las condiciones inflamatorias estaban ausentes y ello daba lugar a una concentración ligeramente elevada. Es posible que muchos o la mayoría de los animales fuera de medios libres de patógenos presenten los citados niveles bajos de haptoglobina pero serían necesarios más estudios para clarificar los niveles encontrados en las poblaciones normales. Sin embargo, los ensayos resultan efectivos para demostrar una reacción aguda a la mastitis.

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Ejemplo 4 de Referencia

Ensayo de Haptoglobina sin reactivo para reducir el efecto peroxidasa y sólo con detergente

Con el fin de conocer el efecto de sólo detergente sobre el ensayo de la haptoglobina en el suero en presencia de albúmina, se ha llevado a cabo un ensayo comparativo en el que se usan los reactivos para simular las condiciones recomendadas por Schimitt et al. (Patente US 4695552). En este ejemplo se efectúa un ensayo automatizado en un analizador MIRA con modificaciones en los reactivos y condiciones en el analizador.

Reactivos

Solución de trabajo de Hb: preparada a partir de solución stock de Hb como en el ejemplo 1.

Solución tampón de cromógeno: citrato sódico pH 4,0 0,1 mol/l; 2,2'-azino-di(ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) (ABTS) 0,5 mmol/l; saponina 3 g/l.

Substrato: perborato sódico 32 mmol/l.

Standards: como en el ejemplo 1 con la excepción de que los standards se diluyen en suero salino.

Control de las muestras como en el Ejemplo 1.

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Procedimiento para el uso en el analizador MIRA (Roche Diagnostics Ltd). El auto-analizador se mantiene a 37ºC

a): En el bastidor de reactivos, la hemoglobina diluida es el reactivo (20 ml), ABTS/saponina es el reactivo de inicio 1 (10 ml) y el perborato de sodio es el reactivo de inicio 2 (10 ml).

b): Se mezclan 2,5 \mul de standard, muestra o control con 200 \mul de Hb.

c): Después de 50 s se añaden 90 \mul de cromógeno.

d): Después de otros 25 s, se añaden 20 \mul de substrato (perborato sódico) y se mide el aumento de la absorbancia a 405 nm.

e): La diferencia en absorción a lo largo de los siguientes 50 s se usa para calcular los resultados por comparación del cambio de absorbancia en los estándares respecto a las muestras de control.

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Resultados TABLA 4

5

Tal como se muestra en la Tabla 4, existe un considerable efecto de la albúmina de suero bovino en ambas soluciones del 2 y del 5% (p/v) en el cambio de la absorbancia de este sistema cromógeno/detergente y se indican resultados erróneos de 0,31-0,72 mg/ml de haptoglobina en las muestras de suero que contienen de 20-50 g/l de albúmina pero no contienen haptoglobina. El margen de referencia para la albúmina en muchas especies es del orden de 25-40 g/l para la albúmina y, por tanto, el ensayo para la haptoglobina no está afectado de manera substancial por dichas concentraciones de albúmina.

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Ejemplo 5 de Referencia

Ensayo de Haptoglobina sin un reactivo para reducir el efecto peroxidasa y con concentración de detergente aumentada

Se determina la haptoglobina en suero o plasma efectuando el ensayo como en el Ejemplo 4 (ABTS como cromógeno) con la excepción de que se aumenta la concentración de saponina a 25 g/l. Los resultados se muestran en la Tabla 5.

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TABLA 5 Absorbancia de reacciones con saponina a 25 g/l

6

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Con la saponina aumentada hasta 25 g/l se observa un marcado incremento en el efecto de la albúmina, que dan como resultado niveles aparentemente altos de haptoglobina en los cambios en la absorbancia con albúmina del 2 y 5%.

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Ejemplo 6 de Referencia

Ensayo de Haptoglobina sin reactivos en ausencia de detergente

Se usa el procedimiento descrito en el Ejemplo 1 con la excepción de que se omite en la mezcla de reactivos el detergente tal como Tween 20, el volumen de muestra es de 2,5 \mul y el volumen del reactivo de peroxidasa es de
20 \mul.

TABLA 6 Cambio en la absorbancia a 600 nm sin detergente

7

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En ausencia de detergente se observa que el efecto de la albúmina es aparente en una pequeña extensión en el cambio en la absorbancia a 600 nm, que es mayor en la albúmina al 2 y 5% y en el suero de ternera fetal que en el suero salino sólo. Una inspección visual de las cubetas de reacción después de la reacción revela que ha tenido lugar precipitación en todas las mezclas de reacción. Este hecho se refleja en las lecturas a los 75 s, que son similares en todas las cubetas, y cuyo valor premedio es cuatro veces mayor que en la reacción que tiene lugar en presencia de Tween 20 (Tabla 7).

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TABLA 7 Absorbancia media a 600 nm de las cubetas a los 75 s de reacción

8

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La lectura de la absorbancia a los 75 seg se hace inmediatamente después de la adición de la solución de cromógeno a la mezcla de la muestra más hemoglobina e inmediatamente antes de la adición del peróxido de hidrógeno. Resulta aparente que la mezcla de la solución de cromógeno con la solución de la hemoglobina da lugar a una precipitación que se puede evitar con la presencia de un detergente tal como Tween 20, y que existe una variación considerable en el efecto del precipitado sobre la absorbancia con un margen de 0,1870 a 0,3151. La precipitación tiene lugar incluso cuando la muestra es suero salino y estos resultados indican que el detergente puede ser necesario en el ensayo de la haptoglobina para mantener la solubilidad de los reactivos.

Ejemplo 7

Ensayo de la Haptoglobina de la presente invención en el uso experimental

Utilizando el procedimiento descrito en el Ejemplo 1, se determina la concentración de haptoglobina en el suero de ratas que forman parte de una investigación experimental de la patogenicidad de la bacteria Bordetella pertussis (tos ferina) (de un estudio en colaboración con Dr R. Parton, Instituto de Ciencias Biomédicas y de la Vida, Universidad de Glasgow). Ocho días después de la infección se recogen muestras de suero de las seis ratas infectadas (Sprague-Dawley) y de seis ratas control no infectadas y se guardan a -20ºC hasta su análisis usando el ensayo de la hapto-
globina.

TABLA 8 Haptoglobina en ratas infectadas con B pertussis y en ratas control no infectadas

9

La concentración de haptoglobina, tal como se determina mediante el ensayo descrito en el Ejemplo 1, se aumenta con un factor de unas cuatro veces después de la infección con B. pertussis, lo que demuestra el uso del ensayo para la haptoglobina en estudios experimentales de la respuesta del huésped a la infección.

Ejemplo 8

Procedimiento para la determinación automatizada de la concentración de haptoglobina usando un agente caotrópico para reemplazar un agente reductor del enlace disulfuro

El procedimiento se lleva a cabo en un analizador MIRA, tal como en el Ejemplo 1, con la excepción de que la solución de trabajo de Hb se prepara en solución salina que contiene 0,5 mol/l de clorhidrato de guanidina, que la solución tampón de cromógeno de trabajo es la solución de citrato que contiene 20 mmol/l de fenol; 4-aminofenazona (4-aminoantipirina) 1,6 mmol/l; ácido 8-anilino-1-naftalona sulfónico 1 mmol/l; Tween 20 1% (es decir, se ha omitido ditioeritritol) y el volumen de la muestra es de 2,5 \mul.

TABLA 9

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Los resultados demuestran que un agente caotrópico tal como el clorhidrato de guanidina se puede usar para inhibir el efecto de la albúmina sobre la actividad peroxidasa y que la albúmina hasta un 2% no afecta al ensayo, mientras que hasta el 5% solamente tiene un efecto marginal.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante se incluye solamente para la conveniencia del lector. No forma parte del documento de la patente Europea. Aunque se ha tenido sumo cuidado en la compilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO declina toda responsabilidad en este aspecto.

Documentos que son patentes y que se citan en la descripción

\bullet US 4695552A [0007] [0011] [0047]

Documentos que no son patentes y que se citan en la descripción

\bulletConner J. et al., Research in Vet. Sci., 1988, vol 44, 82-88 [0006]

\bulletMakimura, S. y Suzuki, N., Jpn. J. Ven. Sci., 1982, vol 44, p.15-21, [0011]

\bulletBauer K., J. Clin. Chem. and Clin. Biochem., 1981 vol 19, 971-976, [0027]

\bulletReijic, R. et al., Clin. Chem., 1992, vol 38, 522-525, [0027].

\bulletConner, J.G.; Eckersall, P.D., Research in Vet. Sci. 1988, vol 44, 82-88, [0027]

\bulletChung et al., Talanta, 1993, vol 40, 981-988, [0029].

\bulletMakimura; Suzuki, Jpn J Vet Sci, 1982, vol 44, 15-21, [0033].

\bullet Dr R. Parton, Instituto de Ciencias Biomédicas y de la Vida, Universidad de Glasgow, [0057].

Claims

1. Ensayo para la determinación del nivel de haptoglobina en una muestra, que comprende las etapas de:

a): formación de una mezcla de reacción que comprende la muestra a analizar, un detergente, un inhibidor de la unión a proteínas para la inhibición de la unión de la albúmina y/o cualquier otra(s) proteína(s) presente(s) en la muestra a la hemoglobina o hematina liberada de la hemoglobina, y ya sea un agente reductor efectivo contra los enlaces disulfuro o un agente caotrópico en el que el citado inhibidor de unión a la proteína y el agente reductor o caotrópico no están incluidos en una cantidad que darían lugar a la inhibición de una reacción haptoglobina/hemoglobina:

b): dejar reaccionar los componentes de la mezcla, de manera que se permita la formación de un complejo haptoglobina/hemoglobina; y

c): determinación del nivel de la actividad de la peroxidasa del citado complejo haptoglobina/hemoglobina usando un substrato cromogénico y medios espectrofotométricos, en donde la determinación se lleva a cabo a un pH ácido suficiente para reducir substancialmente o inactivar substancialmente cualquier actividad peroxidasa de la hemoglobina no complejada.

2. Ensayo según la reivindicación 1 en el que el ensayo se lleva a cabo a un pH entre 3,6 y 4,0.

3. Ensayo según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 en el que la muestra es una muestra de sangre.

4. Ensayo según la reivindicación 3 en el que la muestra de sangre es una muestra de plasma o suero.

5. Ensayo según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 en el que la muestra es leche, fluido ascítico o medio de incubación in vitro.

6. Ensayo según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que la hemoglobina se obtiene a partir de un animal de la misma especie de la muestra de la que se está efectuando el ensayo.

7. Ensayo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en el que la hemoglobina se obtiene a partir de un animal de una especie diferente de la muestra de la que se está efectuando el ensayo.

8. Ensayo según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que el agente reductor efectivo contra los enlaces disulfuro se selecciona independientemente entre ditiotreitol, ditioeritritol, cisteina, mercaptoetanol, glutationa, 4,4'-ditiodipiridina o 5,5'-ditio(ácido 2-nitrobenzoico).

9. Ensayo según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que el inhibidor de la unión a la proteína se selecciona independientemente entre el ácido 8-anilino-a-naftilen sulfónico (ANS), protoporfirina, bilirubina, ácidos taurodesoxicólicos (sales biliares), dicumarol o 2-mercaptobenzotiazol.

10. Ensayo según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que el agente caotrópico se selecciona independientemente entre clorhidrato de guanidina, tiocianato de potasio o cloruro sódico.

11. Ensayo según la reivindicación 1 en el que el detergente se añade a la mezcla de reacción a una concentración total de menos de 20 g/l.

12. Ensayo según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que el detergente se selecciona entre un tensioactivo no iónico entre ésteres de polioxietilen sorbitol, de polioxietilen-p-t-octilfenol; y/o alcoholes de polioxietileno (PEG), o tensioactivos iónicos seleccionados entre sulfato dodecil sódico, CHAPS y cetrimida.

13. Ensayo según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que la actividad peroxidasa se detecta mediante el uso de un cromógeno y de peróxido de hidrógeno, en donde la actividad peroxidasa da lugar a un cambio de color del cromógeno que se puede detectar espectrofotométricamente a una longitud de onda particular.

14. Ensayo según la reivindicación 13 en el que el substrato cromogénico se selecciona entre 4-amino fenozona, ácido 2-amino-4-hidroxibencensulfónico, tetra metil benzidina, diclorhidrato de o-fenilen diamina, o-dianisidina, 2-OH-3,5-diclorobencen sulfonato sódico, 2,2'-azino-di(ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) (ABTS) y ácido 4-aminoantipirina cromotrópico.

15. Ensayo según la reivindicación 14 en el que el substrato cromogénico es el ácido 4-aminoantipirina cromotrópico y el ensayo comprende además el ácido 8-anilino-1-naftilen sulfónico (ANS) y 4-iodofenol.

16. Ensayo según la reivindicación 1 que comprende el inhibidor de unión a la proteina/el con reactivo cromogénico ácido 8-anilino-1-naftilen sulfónico (ANS) y el substrato cromogénico 4-aminoantipirina y fenol.

17. Equipo para su uso en un ensayo de haptoglobina según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que el equipo comprende:

i): hemoglobina

ii): un detergente

iii): un inhibidor de la unión a proteínas para la inhibición de la unión de la albúmina y/o otra(s) proteína(s) presentes en una muestra a la hemoglobina o hematina liberada de la hemoglobina;

iv): un agente reductor efectivo contra los enlaces disulfuro o un agente caotrópico; y

v): un cromógeno para su uso en la determinación del nivel de la actividad peroxidasa.