ES2313841B1 - Composiciones para tratamiento anti-fibrinolitico. - Google Patents
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Abstract
Composiciones para tratamiento
anti-fibrinolítico.
La presente invención se refiere al uso de un
anticuerpo neutralizante de la metaloproteinasa de
matriz-10 (MMP-10) en la preparación
de un medicamento útil para el tratamiento
anti-fibrinolítico, así como de hemorragias y
complicaciones hemorrágicas de diversas etiologías.
Description
Composiciones para tratamiento
anti-fibrinolítico.
Esta invención se refiere a la preparación de
composiciones farmacéuticas para el tratamiento
anti-fibrinolítico y de las complicaciones
hemorrágicas asociadas a estados hiperfibrinolíticos o a
procedimientos quirúrgicos.
El sistema hemostático es el encargado de
mantener la fluidez circulatoria y prevenir la hemorragia en
respuesta a una agresión vascular. La hemostasia fisiológica está
controlada tanto por los mecanismos que promueven la coagulación y
la formación de fibrina, como por los que favorecen su degradación
o fibrinolisis. Una activación excesiva de la coagulación o un
defecto de la fibrinolisis desembocan en la formación de coágulos
que obstruyen los vasos sanguíneos (trombosis intravascular),
causando isquemia y necrosis. Sin embargo, una situación general de
hiperfibrinolisis favorecerá la aparición de hemorragias.
Los estados hiperfibrinolíticos causados por
alteraciones congénitas o adquiridas en el sistema de
coagulación-fibrinolisis predisponen a importantes
complicaciones hemorrágicas. Dichos estados se han asociado con el
tratamiento trombolítico, así como con cirugía en órganos ricos en
activadores del plasminógeno, como próstata, útero y pulmón. Por
otra parte, la coagulación intravascular diseminada (CID),
secundaria a numerosos procesos médicos y/o quirúrgicos constituye
el prototipo de estado hiperfibrinolítico asociado con hemorragia
masiva en diversos
órganos.
órganos.
En las enfermedades con una base fisiopatológica
hemorrágica por alteración de la coagulación o aumento de la
fibrinolisis, además de las transfusiones de hemoderivados, las
medidas farmacológicas para su tratamiento suelen ser
anti-fibrinolíticos aunque, el tratamiento fracasa
en aproximadamente el 30% de los casos.
El tratamiento
anti-fibrinolítico busca inhibir la degradación de
la fibrina. Los más utilizados en la práctica clínica son análogos
sintéticos de la lisina, como el ácido
epsilon-aminocaproico (EACA) y el ácido tranexámico
(ANCHA), que compiten con el plasminógeno por los lugares de unión
a la lisina, y la aprotinina, que es un derivado de pulmón bovino
con un amplio espectro de inhibición de proteasas.
Estos compuestos se han mostrado eficaces en
diversas situaciones clínicas médicas y quirúrgicas, como la
hemorragia intracraneal, cirugías con elevado riesgo hemorrágico y
complicaciones derivadas del tratamiento trombolítico.
A nivel quirúrgico, los
anti-fibrinolíticos además de reducir la hemorragia
postoperatoria, pueden constituir una alternativa a la transfusión
de sangre y otros hemoderivados en cirugía cardíaca, hepática y
ortopédica. Sin embargo, el uso de estos preparados no se ha
generalizado, en parte porque no existen suficientes estudios
demostrando su eficacia y además porque pueden aumentar el riesgo
de complicaciones trombóticas (Mangano DT et al. The risk
associated with aprotinin in cardiac surgery. N Engl J Med 2006;
354: 353-365).
Por ejemplo en la cirugía hepática,
fundamentalmente trasplante hepático, el empleo de
anti-fibrinolíticos como aprotinina y AMCHA consigue
una reducción de las complicaciones hemorrágicas, pero puede
asociarse con problemas trombóticos (de Boer MT et al.
Minimizing blood loss in liver transplantation: progress through
research and evolution of techniques. Dig Surg 2005;
22:265-275).
En la hemorragia intracraneal, los
anti-fibrinolíticos tampoco se han incorporado a las
guías de práctica clínica (You H et al. Hemostatic drug
therapies for acute intracerebral haemorrhage. Cochrane Database
Syst Rev 2006; CD005951). En el caso particular de la hemorragia
cerebral primaria o secundaria a tratamiento trombolítico, el uso
del factor VIIa recombinante es el único tratamiento que parece
presentar algún efecto beneficioso en términos de reducción de la
mortalidad (29% en de los pacientes que reciben placebo, frente al
18% de los pacientes que reciben factor VIIa) y de reducción de
secuelas neurológicas [Mayer S.A., Brun N.C. et al.;
"Recombinant Activated Factor VII Intracerebral Hemorrhage Trial
Investigators. Recombinant activated factor VII for acute
intracerebral hemorrhage"; N Engl J Med. 2005; 352:
777-785].
La coagulación intravascular diseminada (CID)
representa otra condición clínica que cursa con hemorragia masiva,
en la que la administración de anti-fibrinolíticos
actuales está contraindicada por favorecer la trombosis generalizada
(Paramo JA. Coagulación intravascular diseminada. Med clin (Barc)
2006; 127:785-9).
La trombolisis con activadores del plasminógeno,
tipo tPA o uroquinasa, es uno de los tratamientos de elección en
el infarto agudo de miocardio y el ictus isquémico, pero su empleo
se asocia con una elevada incidencia de hemorragia mayor que puede
alcanzar el 14% y de hemorragia intracraneal hasta en 4% de los
casos. Además del tratamiento con hemoderivados, los
anti-fibrinolíticos tipo EACA o AMCHA están
indicados cuando se produce una hemorragia excesiva, si bien su
empleo puede favorecer la recurrencia trombótica.
La hemorragia excesiva tras extracción dental es
una de las complicaciones más frecuentes en pacientes con
coagulopatías congénitas, como la hemofilia A. En estas situaciones
el empleo local de agentes anti-fibrinolíticos y
anti-hemorrágicos (ac. tranexámico, desmopresina y
Factor VII) contribuyen a la persistencia del coágulo y a la
prevención de la hemorragia (Franchini M et al. Dental
procedures in adult patients with hereditary bleeding disorders: 10
years experience in three Italian Hemophila Centers. Haemophilia
2005; 11:504-509).
Los anti-fibrinolíticos son,
asimismo, la primera línea de tratamiento en mujeres con menorragia
asociada a coagulopatías congénitas, en combinación con la terapia
hormonal (Demers C et al. Gynaecological and obstetric
management of women with inherited bleeding disorders. J Obstet
Gynaecol 2005; 27:707-732).
La aplicación de medidas tópicas con geles de
fibrina ha supuesto un avance para prevenir la hemorragia
relacionada con la herida quirúrgica, pero su utilidad clínica aún
no se ha establecido (Gabay M. Absorbable hemostatic agents. Am J
Health Syst Pharm. 2006; 63:1244-53).
La aplicación intravenosa o tópica de
inhibidores de MMPs podría restaurar más precozmente la hemostasia
reduciendo las complicaciones hemorrágicas locales o asociadas con
el tPA (Lapchak PA, Araujo DM. Reducing bleeding complications
after thrombolytic therapy for stroke: clinical potential of
metalloproteinase inhibitors and spin trap agents. CNS Drugs. 2001;
15:819-29), favoreciendo la persistencia del
coágulo, la reparación y la cicatrización de heridas quirúrgicas.
Aún constituyendo esta opción una estrategia prometedora, las
mayoría de los ensayos clínicos con inhibidores de MMPs han
fracasado, ya sea por las bajas dosis empleadas (eficacia vs
toxicidad) o por los efectos secundarios observados (síndrome
musculoesquelético). Sería necesario buscar inhibidores más
selectivos que bloqueen únicamente los mecanismos moleculares
asociados a una MMP específica y evitar así efectos adversos
(Peterson JT. The importance of estimating the therapeutic index in
the development of matrix metalloproteinase inhibitors. 2006;
69:677-687).
El objetivo de la presente invención es
proporcionar composiciones terapéuticas alternativas para el
tratamiento anti-fibrinolítico y de complicaciones
hemorrágicas, que inhiban la lisis de los coágulos de fibrina.
Figura 1. Ensayo de turbidimetría del plasma
recalcificado expresado como los valores de absorbancia a 405 nm
frente al tiempo que dura el experimento en minutos. A: La gráfica
recoge las diferencias en la formación del coágulo (absorbancia
máxima) del plasma sólo (control) o en presencia de
MMP-10 (200 nM) ó MMP-3 (200 nM).
B: La gráfica representa la formación y lisis del coágulo de
fibrina del plasma recalcificado en presencia de los activadores
del plasminógeno tPA (30 U/ml) y uPA (135 U/ml) solos, o combinados
con MMP-10 (200 nM) y también en presencia de una
dosis equivalente de MMP-3 (200 nM) combinada con
tPA (30 U/ml).
Figura 2. Placa de fibrina polimerizada en la
que se muestran las áreas de lisis producidas por el tPA (1 U/ml)
y la MMP-10 (200 nM) solas o añadidas
conjuntamente.
Figura 3. Ensayo de actividad de la
MMP-10 (100 nM) en plasma con un sustrato
fluorescente de las estromelisinas. La concentración de anticuerpo
monoclonal (MAb) que inhibe la actividad de la
MMP-10 en plasma se determinó mediante la reducción
en la pendiente en la formación del sustrato. Como control se
utilizó un anticuerpo control de isotipo (IgG).
Figura 4. Western blot con el anticuerpo que
inhibe la actividad de la MMP-10. Marcador de peso
molecular (calle 1), MMP-1 (calle 2),
MMP-3 (calle-3),
MMP-10 (calle 4). El anticuerpo inhibidor de la
actividad MMP-10 únicamente reconoce el proenzima
(55 kDa) y enzima activo (45 kDa) de la MMP-10, sin
mostrar reacción cruzada con otras metaloproteasas.
Figura 5. Ensayo de turbidimetría del plasma
recalcificado con MMP-10 (200 nM) en presencia o
ausencia de un anticuerpo monoclonal (MAb) que inhibe la actividad
de la MMP-10, y de un anticuerpo control de isotipo
(IgG).
Figura 6. Placa de fibrina ilustrando las
diferencias en el área de lisis producida por el tPA (1 U/ml) y la
MMP-10 (200 nM) en presencia o ausencia de un
anticuerpo monoclonal que inhibe la actividad de la
MMP-10 (MAb) y el anticuerpo control de isotipo
(IgG).
En un primer aspecto la invención se refiere al
uso de un anticuerpo neutralizante de la metaloproteinasa de
matriz-10 (MMP-10) en la preparación
de un medicamento para tratamiento
anti-fibrinolítico.
La MMP-10 (Código de Enzima
EC-Number 3.4.24.22) se denomina también como
metalopeptidasa de matriz 10, estromelisina 2 (STMY2), transina 2 o
proteoglicanasa 2. En el hombre, el gen que codifica la
MMP-10 se localiza en el cromosoma 11 (11q22.3;
HUGO Gene Nomenclature Comitee HGNC_ID: 7156;
UniProtKB/Swiss-Prot Accesion Number: P09238).
\newpage
Esta metaloproteinasa la expresan diversos tipos
celulares como las células endoteliales, monocitos y fibroblastos.
Se sabe que puede ser activada por plasmina, calicreína, triptasa,
elastasa y catepsina G y puede degradar un amplio rango de
sustratos de la matriz extracelular, como agrecano, elastina,
fibronectina, gelatina, laminina, tenascina-C,
vitronectina y colágenos tipo II, III, IV, IX, X, XI. Además, la
MMP-10 puede activar otras metaloproteinasas de
matriz, como la proMMP-1, -3, -7, -8 y -9 [Nakamura
H et al.; Eur. J. Biochem., 1998;
253:67-75].
Asimismo es conocido que la
MMP-10 participa en diversos procesos fisiológicos,
como el crecimiento óseo o la cicatrización de heridas. Además, se
halla sobreexpresada en córneas de pacientes con retinopatía
diabética y se ha relacionado con algunos tipos de carcinomas, así
como con tumores linfoides. Diversos estudios in vitro han
demostrado que, en cultivos de queratinocitos, la expresión de
MMP-10 puede inducirse tanto por factores de
crecimiento (factor de crecimiento epidérmico, de queratinocitos o
TGF-beta), como por citocinas proinflamatorias
(TNF-alfa, IL-1beta) [Rechardt O
et al.; J. Invest. Dermatol., 2000;
115:778-787]; [Li de Q et al.; Invest.
Ophthalmol. Vis. Sci. 2003; 44:2928-2936].
Igualmente en divulgaciones anteriores a esta
invención se ha descrito que la MMP-10:
- puede constituir un biomarcador inflamatorio
de riesgo vascular [Montero I et al.; J. Am. Col. Cardiol.,
2006; 47:1369-1378] [Orbe J et al.; J.
Thromb. Haemost.; 2007; 5:91-97];
- se induce en células endoteliales que están
formando capilares en matrices de colágeno 3D y participa en la
regresión de la formación de capilares mediante la activación de la
MMP-1 [Saunders WB et al.; J. Cell Sci.,
2005; 118:2325-2340]; y que
- juega un papel fundamental en el mantenimiento
de las uniones intracelulares que preservan la integridad vascular
en los procesos de remodelado y angiogénesis [Chang S et
al.; Cell, 2006; 126:321-334].
- participa en la cicatrización de heridas
incrementando la migración de queratinocitos y la reorganización de
tejidos que ocurre por la degradación proteolítica de las proteínas
de la matriz [Krampert M, et al.; Mol Biol Cell,
2004;5242-5254].
En la presente invención se ha ensayado el
efecto de la MMP-10 y de la MMP-3
en la formación y lisis de coágulos sobre plasma humano, así como
en otros modelos in vitro de degradación de fibrina
polimerizada.
Los inventores han podido comprobar que la
MMP-10 no tiene una actividad trombolítica directa
y que no es capaz de alterar por si misma la formación del coágulo
ni de degradar la fibrina. Sorprendentemente han comprobado también
que en presencia de agentes activadores de la trombolisis,
particularmente activadores del plasminógeno, la
MMP-10 favorece la disolución de los coágulos de
fibrina y reduce el tiempo de lisis. La MMP-10
actúa, por tanto, como un facilitador o adyuvante de la acción
trombolítica de otros activadores de la trombolisis.
Por el contrario, una metaloproteinasa de matriz
fibrinolítica como la MMP-3, con actividad
proteolítica directa sobre la fibrina y el fibrinógeno, no reduce
los tiempos de lisis del coágulo que por sí solos proporcionan los
activadores de la trombolisis.
Todavía más sorprendentemente, los inventores
han comprobado que la adición de anticuerpos específicos frente a
la MMP-10 es capaz de inhibir el efecto de la
MMP-10, pudiendo llegar a bloquear completamente la
disolución del coágulo, incluso en presencia de activadores de la
fibrinolisis.
En consecuencia, un agente inhibidor de la
MMP-10, p.ej. un anticuerpo, podría suponer un
avance importante en el control de las hemorragias en el ámbito
médico y quirúrgico, así como una alternativa a la transfusión de
sangre en pacientes con hemorragia excesiva causada por una
alteración de la fibrinolisis,
1.- por su capacidad de reducir y bloquear la
lisis del coágulo de fibrina incluso en presencia de activadores
del plasminógeno
2.- por ser una molécula que no altera la
formación del coágulo de fibrina.
La MMP-10 al ser una proteína
que actúa por un mecanismo independiente del sistema hemostático,
no presentaría las complicaciones trombóticas de los
anti-fibrinolíticos convencionales.
Además el bloqueo selectivo de la
MMP-10 no causará los efectos secundarios asociados
a una inhibición de MMPs no-selectiva, como el
síndrome musculoesquelético, en el se han implicado otras MMPs como
la MMP-9 y MMP-14.
En el contexto de la invención el término
"anticuerpo" incluye en primer lugar anticuerpos policlonales,
anticuerpos monoclonales, anticuerpos recombinantes, anticuerpos
quiméricos, anticuerpos humanizados y anticuerpos totalmente
humanos.
Los anticuerpos policlonales son originalmente
mezclas heterogéneas de moléculas de anticuerpos producidas en el
suero de animales que han sido inmunizados con un antígeno.
Incluyen también anticuerpos policlonales monoespecíficos obtenidos
a partir de las mezclas heterogéneas, por ejemplo mediante
cromatografía en una columna con péptidos de un único epítopo del
antígeno de interés.
Un anticuerpo monoclonal es una población
homogénea de anticuerpos específicos para un único epítopo del
antígeno. Estos anticuerpos monoclonales pueden prepararse mediante
técnicas convencionales ya descritas, p. ej. en Köhler and Milstein
[Nature, 1975; 256:495-397] o Harlow and Lane
["Using Antibodies. A Laboratory Manual" de E. Harlow y D.
Lane, Publisher: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, New York; 1998 (ISBN 978-0879695439)].
Un anticuerpo quimérico es un anticuerpo
monoclonal construido mediante clonación o recombinación de
anticuerpos procedentes de distintas especies animales. En una
configuración típica pero no limitativa de la invención, el
anticuerpo quimérico incluye una parte de un anticuerpo monoclonal,
generalmente la región variable (Fv) que incluye los sitios para
reconocimiento y unión al antígeno, y la otra parte correspondiente
a un anticuerpo humano, generalmente la parte que incluye la
región constante y la constante adyacente.
Un anticuerpo humanizado es un anticuerpo
monoclonal construido mediante clonación e injerto de las regiones
hipervariables determinantes de complementariedad (CDR) de un
anticuerpo monoclonal murino en un anticuerpo humano en sustitución
de sus propias regiones hipervariables CDR.
Un anticuerpo totalmente humano es un anticuerpo
o anticuerpos que han sido producidos en animales transgénicos con
sistema inmune humano o por immunización in vitro de células
inmunes humanas (incluyendo tanto inmunización genética como
tradicional con o sin adyuvantes y antígeno puro o no; o mediante
cualquier método de exposición del antígeno al sistema inmune) o
mediante bibliotecas nativas/sintéticas producidas desde células
inmunes humanas. Estos anticuerpos pueden obtenerse y seleccionarse
desde animales transgénicos (p. ej. ratones) en los que se han
clonado genes de las inmunoglobulinas humanas y que son inmunizados
con el antígeno objetivo. Igualmente estos anticuerpos pueden
obtenerse por selección de regiones variables de cadena simple
(scFv) o de unión al antígeno (Fab) humanas presentadas en
bibliotecas de fagos (phage display) y posterior clonación e
injerto en un anticuerpo humano o mediante cualquier otro método de
producción y presentación (display), de las librerías generadas por
clonación de las regiones variables de ambas cadenas y posterior
combinación/mutación de estas para generar librerías de
anticuerpos.
anticuerpos.
Por otra parte, el anticuerpo o anticuerpos de
la invención pueden ser de cualquier clase o subclase de
inmunoglobulinas, y particularmente IgG, IgM, IgA, IgD e IgE.
En una realización particular, los anticuerpos
son anticuerpos completos, que incluyen todas las regiones
funcionales típicas de una inmunoglobulina natural, en particular
las regiones para el reconocimiento y unión específica con el
antígeno.
En segundo lugar el término "anticuerpo"
incluye también un fragmento de anticuerpo, obtenido desde la
proteína o mediante tecnología recombinante, que expresado en
procariotas, levaduras o eucariotas, glicosilado o deglicosilado, y
que puede consistir en las zonas variables de los anticuerpos
unidas entre sí por un péptido de unión (scFv), o la zona variable
junto a la constante CH1 de la cadena pesada (Fd) unida a la
cadena ligera mediante cisteinas o mediante péptidos de unión y
puente disulfuro (scFab), o nuevas variantes, como cadenas pesadas
solas, o cualquier modificación que se haga de estos con el fin de
hacerlos más afines, menos immunogénicos (humanizados) o más
estables en fluidos biológicos y que tengan capacidad de inhibir la
MMP-10 por unión a su centro activo o a cualquier
otro dominio de la proteína que disminuya su actividad.
En el contexto de la invención los términos
anticuerpo "neutralizante" o "antagonista" de la
MMP-10 se refieren indistintamente a un anticuerpo,
definido en los términos ya indicados, que es capaz de reconocer y
unirse específicamente a la MMP-10 con una afinidad
en el rango nanomolar o picomolar. Además, dicho anticuerpo es
capaz de inhibir o bloquear, total o parcialmente, la actividad de
la MMP-10. En particular dicho anticuerpo es capaz
de inhibir o bloquear la acción que ejerce la
MMP-10 como facilitadora de la disolución de los
coágulos de fibrina, reduciendo los tiempos de lisis (actividad
fibrinolítica-trombolítica). En una realización
particular, el anticuerpo neutralizante inhibe la acción adyuvante
que la MMP-10 ejerce sobre los activadores del
plasminógeno (tPA, uPA,
etc).
etc).
\vskip1.000000\baselineskip
Los anticuerpos neutralizantes de la invención
pueden producirse mediante métodos convencionales ya conocidos para
la producción de anticuerpos. Sin que esto suponga limitación
alguna, pueden utilizarse entre otras: técnicas de inmunización en
animales, incluidos animales transgénicos para genes de
inmunoglobulinas humanas, producción de monoclonales mediante
hibridomas, producción mediante librerías de anticuerpos, que
pueden ser nativas, sintéticas o derivadas de organismos
inmunizados frente al antígeno de interés y que podrían ser
seleccionadas mediante muy diferentes métodos de presentación o
"display" (phage display, ribosome display, etc.) y
posteriormente, mediante técnicas de ingeniería genética podrían ser
rediseñadas y expresadas en vectores diseñados para la producción
de anticuerpos recombinantes de diferentes tamaños, composición y
estructura. Una revisión de los principales métodos para la
producción y purificación de los anticuerpos puede encontrarse, por
ejemplo, en:
"Handbook of Therapeutic
Antibodies", de S. Dübel, Publisher:
Wiley-VCH, 2007, Vols: I a III (ISBN
978-3527314539);
"Antibodies: Volume 1: Production and
Purification" de G. Subramanian Ed., Publisher: Springer, 1st
Ed, 2004 (ISBN 978-0306482458);
"Antibodies: Volume 2: Novel Technologies
and Therapeutic Use", de G. Subramanian Ed., Publisher:
Springer, 1st ed, 2004 (ISBN
978-0306483158);
"Molecular Cloning: a Laboratory
manual", de J. Sambrook y D. W. Russel Eds., Publisher: Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 3th edition, 2001 (ISBN
978-0879695774);
En una realización particular, no limitativa de
la invención, un procedimiento para la obtención y producción de
un anticuerpo monoclonal neutralizante de la MMP-10
puede constar de las siguientes etapas:
1.- inmunizar ratones con una solución de
MMP-10 o un fragmento inmunogénico de
MMP-10 o plásmido conteniendo
MMP-10 o derivados.
2.- Seleccionar los animales con respuesta
policlonal frente al antígeno mediante western blot, ELISA o
inmunocitoquímica.
3.- Realizar la fusión de esplenocitos del
animal con células de mieloma (SP2/O-Ag14;
P3X63-Ag8.6.5.3;
P3-NS-1-Ag4-1;
etc.), de modo que se generarán híbridos entre los diversos tipos
celulares: y se seleccionará con medio HAT (de hipoxantina,
aminopterina y timidina) aquellos híbridos de linfocito B del
animal y células de mieloma que producirán anticuerpo y además
serán inmortales en cultivo.
4.- Seleccionar los hibridomas que secreten
anticuerpos que nos interesen, es decir anticuerpos que inhiban la
actividad de MMP-10. Para ello se tomarán muestras
de sobrenadante de todos los pocillos que contengan hibridomas para
someterlos a un inmunoensayo: se realizarán ensayos de ELISA con
placas tapizadas con ng o ug de MMP-10; tras una
incubación de 15 horas a 4ºC y el bloqueo correspondiente con una
proteína adecuada, se añadirán los sobrenadantes de los cultivos,
se realizaran los lavados correspondientes y a continuación se
añadirá un anticuerpo secundario
anti-inmunoglobulina de ratón. De este modo, tras
lavar y revelar con una reacción enzimática, los pocillos en los
que se detecte color o un aumento en la absorbancia podrán contener
clones de hibridomas secretores de anticuerpos frente a
MMP-10.
5.- Seleccionar aquellos hibridomas capaces de
inhibir la actividad de MMP-10 para lo que se
realizará un ensayo con sustrato fluorogénico. Se utilizará una
microplaca tapizada con distintas concentraciones de un anticuerpo
anti-MMP-10 (R&D systems,
Clon110343) y el sustrato fluorogénico de estromelisinas
(MCA-Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nval-Trp-Arg-Lys-[DNP]-NH_{2})
(R&D systems; ES002, Abingdon, UK). La fluorescencia (320 nm
excitación y 405 nM emisión) se medirá en un espectrofluorímetro
(SpectraMAX GeminiXS, Molecular Devices, CA, USA) durante 2 h con
lecturas cada 5 min. En relación a una concentración constante de
MMP-10 activa se seleccionarán aquellos hibridomas
que a menor concentración y preincubados con la proteína 30 min a
37ºC, reducen la actividad de la MMP-10 al menos un
50% (IC50).
Las células productoras de anticuerpos del
pocillo del que proviene el sobrenadante seleccionado se crecerán
y se congelarán en nitrógeno líquido.
6.- Asegurar que cada cultivo de células que
secreta un anticuerpo anti-MMP-10 es
monoclonal. Se aplicarán técnicas de clonaje o dilución límite y se
harán crecer células aisladas en nuevas microplacas de cultivo a
partir del cultivo original o células madre que dieron positivo en
el primer ensayo de ELISA y ensayo de actividad. Una vez que las
nuevas colonias surgidas a partir de una o más células hayan
adquirido el tamaño suficiente, se tomarán de nuevo sobrenadantes
de estas para someterlos a un nuevo ELISA y ensayo de actividad. Se
repetirá el proceso hasta que el 100% de los sobrenadantes
analizados contengan anticuerpos frente a la actividad de la
MMP-10.
7.- Purificar los anticuerpos de los
sobrenadantes mediante cromatografía de líquidos (cromatografía de
inmunoafinidad, de afinidad, de intercambio catiónico, de
hidroxiapatita, de interacción hidrofóbica, de filtración en gel,
etc.) en un equipo ÄKTA FPLC, GE Healthcare
Bio-Science.
8.- Por último, analizar la pureza, la
especificidad, afinidad y actividad fibrinolítica de aquellos que
se han seleccionado.
La pureza del anticuerpo puede determinarse, por
ejemplo, mediante gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)
que se teñirá con azul de Coomassie para corroborar la presencia
de banda única.
\newpage
La especificidad del anticuerpo puede
determinarse mediante western blot frente a otras metaloproteasas
(especialmente la MMP-3 con la que comparte mayor
homología) a concentraciones de ng a g y revelando por
quimioluminiscencia.
La constante de afinidad de los anticuerpos
puede calcularse a partir de la constante de disociación (Kd)
definida como la pendiente que se obtiene al representar los
valores de absorbancia del ELISA tapizado con MMP-10
frente a concentraciones crecientes del anticuerpo analizado.
La capacidad neutralizante de la actividad
fibrinolítica que dicho anticuerpo posee puede analizarse mediante
ensayo de turbidimetría de formación y lisis de coágulos de fibrina
y en ensayo de fibrina polimerizada, por ejemplo mediante los
ensayos descritos en los ejemplos 1 y 2.
Por otra parte, el ácido nucleico que codifica
para el anticuerpo neutralizante de la MMP-10,
podría servir como producto intermedio para la obtención de un
anticuerpo quimérico o humanizado también neutralizante de la
MMP-10.
No obstante lo anterior, el método para la
producción del anticuerpo neutralizante de la MMP-10
no es un aspecto crítico, y por tanto el técnico o experto en la
materia podría fácilmente producir los anticuerpos de la invención
mediante cualquier otro método convencional para la producción de
anticuerpos.
\vskip1.000000\baselineskip
En general el anticuerpo neutralizante de
MMP-10 (o el medicamento que lo contiene) es útil
para el tratamiento anti-fibrinolítico.
En una realización particular, el anticuerpo de
la invención es útil para el tratamiento, preventivo o
terapéutico, de hemorragias o complicaciones hemorrágicas.
En unos casos, las complicaciones hemorrágicas a
tratar se pueden producir en pacientes con estados
hiperfibrinolíticos y defectos en la coagulación, que pueden estar
causados por alteraciones congénitas (hemofilia A, enfermedad de
von Willebrand, deficiencia de PAI-1 o
alfa2-antiplasmina), o también por complicaciones
adquiridas, p. ej. derivadas del tratamiento con agentes
anti-coagulantes, o en pacientes con coagulación
intravascular diseminada CID, algunas cirugías o tumores de tejidos
y órganos ricos en activadores de la fibrinolisis, o en situaciones
de fallo de aclaramiento de los activadores del plasminógeno como
en enfermedad hepática severa, o en leucemia promielocítica aguda
asociada a CID.
Entre estas complicaciones hemorrágicas se
incluyen, entre otras, hemorragia menstrual excesiva (menorragia),
hemorragias gastrointestinales, urinarias, dentales y
particularmente hemorragias en pacientes con defectos en la
coagulación por algunas de las causas ya mencionadas (hemofilia A,
enfermedad de von Willebrand, con tratamiento
anti-coagulante, CID, etc).
En otros casos, las hemorragias y complicaciones
hemorrágicas a tratar pueden producirse en procedimientos
quirúrgicos (cirugías en general, incluidos trasplantes y biopsias),
particularmente cirugía de órganos ricos en activadores del
plasminógeno (próstata, pulmón, útero) y en cirugía sobre pacientes
en estados hiperfibrinolíticos o con defectos en la coagulación
como los ya señalados. En estos casos el objetivo será reducir las
hemorragias derivadas de la cirugía, mediante un tratamiento
(previo, durante y/o posterior a la cirugía) con un medicamento que
comprenda un anticuerpo neutralizante de la
MMP-10.
Asimismo, la aplicación tópica de anticuerpos
anti-MMP-10 podría ser de utilidad
para restablecer la comunicación vascular tras la realización de un
injerto vascular, incluyendo el inhibidor en una formulación tipo
gel de fibrina, para prevenir la hemorragia relacionada con la
herida quirúrgica.
En el contexto de la invención el término
"tratamiento" incluye la administración del medicamento que
contiene el anticuerpo neutralizante de la MMP-10
para prevenir o reducir la aparición de los síntomas,
complicaciones o indicios bioquímicos de un estado
hiperfibrinolítico, y muy particularmente prevenir la aparición de
eventos hemorrágicos. El tratamiento puede ser un tratamiento
profiláctico para prevenir la manifestación de sus síntomas
clínicos o subclínicos. Puede ser también un tratamiento
terapéutico para suprimir o aliviar los síntomas después de que ya
se hayan manifestado y puede constituir una alternativa a la
transfusión de sangre en el caso en el que ésta fuera
necesaria.
necesaria.
\vskip1.000000\baselineskip
Conforme a la invención, los anticuerpos
neutralizantes se emplean en la preparación de una composición
farmacéutica como medicamento para tratamiento
anti-fibrinolítico.
\newpage
Dicha composición farmacéutica comprende al
menos un anticuerpo neutralizante de MMP-10 en un
vehículo farmacéuticamente aceptable.
El anticuerpo o composición farmacéutica de la
invención son particularmente útiles para administración
parenteral, por ejemplo, para administración subcutánea,
intramuscular o intravenosa.
En una realización concreta pero no limitativa
de la invención, la composición farmacéutica contiene una solución
del anticuerpo o anticuerpos neutralizantes de
MMP-10, disuelto en un vehículo aceptable, p. ej. un
vehículo acuoso como agua, agua tamponada, suero salino, glicina u
otro similar. Estas soluciones son estériles y generalmente libres
de partículas. La composición farmacéutica puede contener otros
ingredientes adicionales, como agentes para ajustar el pH,
conservantes, etc.
En otra realización, la composición farmacéutica
sería adecuada para administración local, en forma de gel o pasta
e incluso en forma de ampolla bebible con la que hacer enjuagues en
caso de hemorragias por extracción dental.
Una revisión de las distintas composiciones y
formas farmacéuticas de administración de medicamentos y de los
excipientes necesarios para la obtención de las mismas puede
encontrarse, por ejemplo, en: "Tecnología farmacéutica", de
J.L. Vila Jato, 1997 Vols I y II, Ed. Síntesis, Madrid; o en
"Handbook of pharmaceutical manufacturing formulations", de
S.K. Niazi, 2004 Vols I a VI, CRC Press, Boca Raton.
La cantidad de ingrediente activo (anticuerpos)
que puede combinarse con el material vehiculizante para producir
una única forma de dosificación será generalmente la cantidad que
produce un efecto terapéutico. La preparación de una composición
farmacéutica parenteral en forma de unidades de dosis facilita la
administración y la uniformidad de las dosis, por lo que resulta
muy ventajosa. Estas unidades de dosificación pueden ser preparadas
por el experto en la materia de acuerdo a las técnicas
convencionales, y teniendo en cuenta el efecto terapéutico concreto
que se quiere lograr y la indicación terapéutica concreta.
Las dosis efectivas de la composición
farmacéutica de la invención dependerán de múltiples factores,
incluidos los medios y vías de administración, lugar de acción
objetivo, estado fisiológico del paciente, otra medicación
administrada al paciente, o si se trata de un tratamiento
profiláctico o terapéutico. No obstante, en una realización
particular la unidad de dosis a administrar del anticuerpo
neutralizante de la invención estará comprendida entre 1,0 y 10,0
mg/Kg. Típicamente el régimen de administración incluirá la
administración repetida de la composición con los anticuerpos de la
invención, con intervalos entre cada administración que pueden ser
diarias semanales, mensuales, bimensuales, o cualquier otro que el
farmacólogo establezca atendiendo a las necesidades del paciente
(indicación particular, severidad, etc), y conforme a los
protocolos farmacológicos normalizados habituales.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ejemplos que ilustran los efectos sobre la
actividad fibrinolítica y trombolítica de las metaloproteinasas de
matriz MMP-10 y MMP-3, bien sea
directamente o en combinación con algunos activadores del
plasminógeno: uroquinasa (uPA) y activador tisular del plasminógeno
(tPA).
Para los ejemplos se ha empleado:
- -
- MMP-10 recombinante, obtenida como pro-enzima de 58 kDa con un 20-30% de enzima maduro de 48 kDa (R&D Systems, 910-MP, Abingdon, UK), que fue reconstituida con tampón TCNB (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM CaCl_{2}, 150 mM NaCl, 0,05% Brij35).
- -
- MMP-3 recombinante, obtenida como proenzima de 52 kDa (R&D Systems, 513-MP, Abingdon, UK), suministrada en una solución con 12,5 mM Tris, 5 mM CaCl_{2}, 0,025% Brij35 y 50% de glicerol.
- -
- Uroquinasa (uPA) (Vedim Pharma SA; 628602, Barcelona, España).
- -
- Activador tisular del plasminógeno (tPA) recombinante (Boerhinger Ingelheim; 985937 Actilyse®, Ingelheim, Alemania).
Para la evaluación de la actividad trombolítica
se utilizó un método turbidimétrico para monitorizar la formación
y lisis del coágulo de fibrina sobre muestras de plasma, de acuerdo
con el protocolo descrito previamente por von dern Borne y
colaboradores [Blood, 1995; 86:3035-3042].
Por otra parte, para evaluar la actividad sobre
la lisis de fibrina, realizaron ensayos en placas de fibrina,
siguiendo el procedimiento descrito por Edward [J. Clin. Path.,
1972; 25: 335-337].
\newpage
Ejemplo
1
Como se ha mencionado anteriormente, mediante el
procedimiento descrito por von dern Borne y colaboradores, se
evaluó el efecto de la MMP-10 y de la
MMP-3 sobre el sistema hemostático. En este método
se valoran los cambios de turbidez/absorbancia durante la
formación y lisis de coágulos como indicador en el tiempo de ambos
procesos. La medida de la turbidez se realiza por lectura de la
absorbancia a 405 nm durante las fases de formación y lisis de
coágulos, utilizando un lector fotométrico, en nuestro caso un
lector de ELISA (Fluostar Optima, BMG Labtech). El incremento de
turbidez/absorbancia indica la formación del coágulo de fibrina
mientras que el descenso de este parámetro indica la lisis del
coágulo.
Para la formación del coágulo se mezclaron en un
pocillo de microplaca 75 \mul de plasma citratado, 75 \mul de
tampón HEPES (25 mM HEPES, 137 mM NaCl, 3.5 mM KCl, 6 mM
CaCl_{2}, 1.2 mM MgCl_{2}, y 0.1% BSA, pH=7.5) y 10 \mul de
CaCl_{2} 150 mM. La placa se incubó a 37ºC y se midió la
absorbancia a 405 nm durante 2 h, con lecturas cada 30
segundos.
Para estudiar el efecto de la
MMP-10 en la formación del coágulo, se añadió
MMP-10 activada (50, 100 y 200 nM) a la mezcla
inicial de plasma y tampón HEPES. Antes de su utilización en los
experimentos, la MMP-10 se activó mediante
tratamiento térmico a 37ºC durante 1 h.
En ensayos paralelos, se analizó también el
efecto sobre la formación del coágulo con la MMP-3
(200 nM). En este caso la MMP-3 se activó
previamente con 1 mM de acetato
p-aminofenilmercurio (APMA, 164610, EMD
Biosciences, La Jolla, USA) a 37ºC durante 24 h.
Como se observa en la Figura 1A, la
MMP-10 no indujo cambios ni en la velocidad de
formación del coágulo ni en el máximo de turbidez alcanzada con
ninguna de las dosis empleadas (Tabla 1). Sin embargo, la
MMP-3 indujo un descenso del 50% en el máximo de
absorbancia/turbidez del coágulo formado, probablemente por su
acción proteolitica directa sobre el fibrinógeno.
Estos resultados demuestran que la
MMP-10, a diferencia de lo descrito para la
MMP-3, no altera la tasa de formación del coágulo
por no presentar actividad frente al fibrinógeno.
Posteriormente se estudió la tasa de lisis de
coágulo de fibrina y para ello, como en el apartado anterior, se
empleó plasma recalcificado en tampón HEPES al que simultáneamente
con la MMP-10 (o MMP-3 en su caso)
se añadió un activador del plasminógeno a elegir entre 30 U/ml de
activador tisular del plasminógeno (tPA), o 135 U/ml de uroquinasa
(uPA) al comienzo de la turbidimetría.
Las concentraciones de tPA y uPA a utilizar se
determinaron en estudios previos de dosis-respuesta,
donde la dosis de elección fue aquella que lisaba completamente el
coágulo de fibrina en el plazo de 2 h.
Como se observa en la Figura 1B y tabla 1, la
MMP-10 en ausencia de tPA y uPA no produjo la lisis
del coágulo de fibrina, mientras que en presencia de los
activadores tPA o uPA indujo un aumento significativo en la tasa de
lisis del coágulo de fibrina. Con la máxima dosis de
MMP-10 ensayada (200 nM) el acortamiento del tiempo
de lisis (tiempo al cual se lisa la mitad del coágulo) fue de 15
min (52,9 min vs 68,3 min, p<0.01) en presencia de tPA y
de 5 min en presencia de uPA (42 min vs 47.5 min,
p<0,05). Esta reducción del tiempo de lisis supone un porcentaje
de acortamiento de un 20% en presencia del tPA y de un 10% con el
uPA.
Por el contrario, la MMP-3 no
modificó la tasa de lisis del coágulo en presencia de tPA.
Estos resultados indican que la
MMP-10, a diferencia de la MMP-3,
no es capaz de digerir la fibrina, pero aumenta el efecto
fibrinolítico de los activadores del plasminógeno y de la
fibrinolisis (tPA o uPA). La MMP-10, al no poseer
capacidad para actuar sobre la fibrinolisis endógena, evitaría o
atenuaría la aparición de hemorragias, lo que le convierte en un
buen candidato para su utilización como coadyuvante de la terapia
trombolítica.
Ejemplo
2
De acuerdo con el procedimiento de Edward
mencionado anteriormente, se estudió el efecto sobre la lisis de
fibrina midiendo el halo o área de lisis que se produce en una
placa de fibrina polimerizada.
Las placas de fibrina se preparan a partir de
una solución 6 mg/ml de fibrinógeno humano (Sigma, F3879, Sant
Louis, MO, USA) en tampón veronal (BioWhittaker,
12-624E, Cambrex, MD, USA) a 37ºC, que se filtra y a
la que se añade un volumen igual de CaCl_{2} (50 mM). Esta
solución (6 ml) se mezcla con 1 unidad internacional (NIH units) de
trombina (Enzyme Research Lab; HT1200a, Swansea, UK) y se deja
polimerizar durante 6 h.
Para valorar la capacidad fibrinolítica, sobre
distintas placas de fibrina se añadió: tPA (1 U/ml),
MMP-10 (200 nM), o una combinación de ambos.
Como se observa en la Figura 2, la
MMP-10 sola no produjo lisis sobre la fibrina
polimerizada, mientras que el tPA produjo una marcado halo. Sin
embargo, la combinación de tPA con MMP-10 aumentó
significativamente el área de lisis de fibrina polimerizada
(188,6%), hecho que confirma el efecto facilitador de la
fibrinolisis de la MMP-10 en combinación con
activadores del plasminógeno como agentes fibrinolíticos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
De acuerdo con los resultados de los Ejemplos 1
y 2, se analizó la especificidad del efecto de la
MMP-10 sobre la lisis de fibrina en el coágulo
inducida por tPA añadiendo simultáneamente diferentes dosis de
MMP-10 activa, en presencia (relación 1:2) y
ausencia de un anticuerpo monoclonal que bloquea su actividad
(R&D Systems, MAB9101, Abingdon, UK), o de anticuerpo control
de isotipo murino IgG2B (eBioscience, 16-4732, San
Diego, CA, USA) a la misma concentración.
La relación de enzima:anticuerpo que bloquea la
actividad del enzima se analizó previamente en un ensayo de
actividad para la MMP-10 en una microplaca tapizada
con un anticuerpo anti-MMP-10
(R&D systems, Clon110343) y utilizando el sustrato fluorogénico
de estromelisinas
(MCA-Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nval-Trp-Arg-Lys-[DNP]-NH_{2})
(R&D systems; ES002, Abingdon, UK) [Lombard et al.;
Biochimie, 2005; 87:265-272]. La fluorescencia (320
nm excitación y 405 nM emisión) se midió en un espectrofluorímetro
(SpectraMAX GeminiXS, Molecular Devices, CA, USA) durante 1 h
estableciéndose que la relación 1:2 inhibe completamente la
concentración de enzima activo (Figura 3).
La especificidad del anticuerpo se estudió
mediante western blot para descartar la existencia de reacción
cruzada con otras metaloproteasas (Figura 4). El anticuerpo
inhibidor de la MMP-10 únicamente reconoce ésta
metaloproteasa, por lo que ejerce una inhibición específica de la
misma, pese a la gran homología existente en la familia de las
metaloproteasas y, en particular, con la otra estromelisina
MMP-3.
Los resultados muestran que el efecto
coadyuvante sobre la fibrinolisis es específico de la
MMP-10, ya que se revierte en presencia del
anticuerpo anti-MMP-10. Este efecto
resulta muy destacable cuando dicho anticuerpo es añadido para
bloquear la actividad endógena de la MMP-10
plasmática (Figura 5). Los resultados establecen que la ausencia de
MMP-10 en el plasma impide la lisis del coágulo de
fibrina incluso en presencia de tPA o uPA (Tabla 1).
Estos resultados se corroboraron en los ensayos
sobre placa de fibrina polimerizada. Como se muestra en la Figura
6, en presencia del anticuerpo
anti-MMP-10 se reduce el área de
lisis producido por la combinación tPA:MMP-10
(91,2% vs 188,6%), mientras que el anticuerpo control no
tiene ningún efecto (184,6%). Estos datos confirman que el empleo
de un anticuerpo específico para la MMP-10
neutraliza y bloquea la disolución farmacológica de coágulos de
fibrina.
Claims (7)
1. Uso de un anticuerpo neutralizante de la
metaloproteinasa de matriz-10 MMP-10
en la preparación de un medicamento útil para tratamiento
anti-fibrinolítico.
2. Uso según la reivindicación 1 en la
preparación de un medicamento útil para tratamiento de hemorragias
y complicaciones hemorrágicas.
3. Uso según la reivindicación 2 en la
preparación de un medicamento para tratamiento de hemorragias y
complicaciones hemorrágicas en pacientes con estados
hiperfibrinolíticos causados por alteraciones congénitas.
4. Uso según la reivindicación 2 en la
preparación de un medicamento para tratamiento de hemorragias y
complicaciones hemorrágicas en pacientes que reciben tratamiento
anticoagulante.
5. Uso según la reivindicación 2 en la
preparación de un medicamento para tratamiento de hemorragias y
complicaciones hemorrágicas producidas en pacientes con coagulación
intravascular diseminada.
6. Uso según la reivindicación 2 en la
preparación de un medicamento para tratamiento de hemorragias y
complicaciones hemorrágicas producidas por procedimientos
quirúrgicos.
7. Uso según la reivindicación 2 en la
preparación de un medicamento como alternativa a la transfusión de
sangre en hemorragia aguda.
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